Регуляторные аспекты биосинтеза эктоина у аэробных метилотрофных бактерий

Мустахимов, Ильдар Ильдусович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляторные аспекты биосинтеза эктоина у аэробных метилотрофных бактерий
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляторные аспекты биосинтеза эктоина у аэробных метилотрофных бактерий"

На правах рукописи

МУСТАХИМОВ ИЛЬДАР ИЛЬДУСОВИЧ

РЕГУЛЯТОРНЫЕ АСПЕКТЫ БИОСИНТЕЗА ЭКТОИНА У АЭРОБНЫХ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2009

003484238

Работа выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов Учреждения Российской Академии Наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ю.А. Троценко

Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор JI.A. Головлева

кандидат биологических наук, A.M. Бутанаев

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г, Москва.

ЗО

Защита состоится « » Ноус|у? 2009 г. в {У_час. на заседании

Диссертационного совета Д 002.121.01 в Учреждении Российской Академии Наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино.

Автореферат размещен на сайте института http://www.ibpm.ru/. Автореферат разослан «_ » оу<- | 5>~ о>Р9 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

В.М. Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рост галофильных и галотолерантных микроорганизмов при повышенных концентрациях NaCl в среде сопровождается накоплением в клетках органических осмопротекторов в концентрациях, уравновешивающих внешнее осмотическое давление. Из (гипер)соленых и щелочных водоемов выделены галофильные и галотолерантные аэробные метилотрофы (Khmelenina et al., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001; Doronina et al., 2003), использующие в качестве источников углерода и энергии метан (метанотрофы) или его окисленные и замещенные производные (метилобактерии). Установлено, что облигатный метанотроф Methylomicrobium alcaliphilum 20Z и метилобактерии Methylophaga thalassica и Methylophaga alcalica при росте на среде с повышенной концентрацией NaCl синтезируют циклическую иминокислоту - экгоин (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидин карбоксилат) в качестве основного осмопротектора (Khmelenina et al., 1999; Doronina et al., 2003). Детальное изучение регуляции биосинтеза экгоина галофильными бактериями обусловлено практическими задачами получения эктоина - полифункционального биопротектора, перспективного для использования в медицине и косметике, а также в научной практике в качестве водоудерживающего средства и стабилизатора биомолекул и целых клеток (Graf et al., 2008).

Биосинтез эктоина у галофильных бактерий начинается реакцией трансаминирования L-аспартилполуальдегида с последующим ацетилированием образующегося Ь-2,4-диаминобутирата (ДАБ) и завершается циклизацией Л'-ацетил-Ь-2,4-ДАБ в экгоин (Galinski, 1995). Эти реакции катализируются специфическими ферментами - ДАБ-ацетилтрансферазой (EctA), ДАБ-аминотрансферазой (EctB) и эктоинсинтазой (EctC). Недавно было показано, что у Mm. alcaliphilum 20Z, М. alcalica, М. thalassica последовательность реакций биосинтеза эктоина идентична таковой у галофильных гетеротрофов, а гены, кодирующие ферменты биосинтеза эктоина, сцеплены в ectABCask оперон, с дополнительным геном аспартаткиназы (ask) (Решетников и др., 2006).

Поскольку накопление осмолитов бактериями - процесс, зависимый от внешней солености, логично полагать, что существует специфическая регуляция биосинтеза эктоина на биохимическом и генетическом уровнях. Однако, несмотря на интенсивные исследования физиологии и биохимии продуцентов эктоина, ферменты, катализирующие реакции биосинтеза эктоина, частично охарактеризованы только у гетеротрофной бактерии Halomonas elongata (Ono et al., 1999), а сведения о факторах, влияющих на уровень транскрипции соответствующих генов, отсутствуют. В связи с вышеизложенным представлялось актуальным исследовать метаболические и генетические аспекты регуляции биосинтеза эктоина у метанотрофов и метилобактерий - свойства ферментов биосинтеза эктоина (на примере EctA) для

выявления эффекторов, влияющих на их активность, а также регуляцию транскрипции оперона ес1АВСа$ку гало(алкало)фильныхметилотрофных бактерий.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - изучение регуляции биосинтеза эктоина аэробными гало(алкало)фильными метано- и метилотрофными бактериями на уровне активности ферментов биосинтеза эктоина и транскрипции ес1АВСа$к оперона.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить и охарактеризовать рекомбинантные ДАБ-ацетилтрансферазы (ЕйА) из метанотрофа Мт. акаИрИИит 2(К и метилобактерий М. акаНса и М йа/оу.я'ся.

2. Определить нуклеотидные последовательности генов ес/Л, кодирующих предполагаемые транскрипционные регуляторы еМАВСсак оперонов у Мт. акаПрИНит М. акаИса и М. ЛЫаязка.

3. Определить промоторные области еЫАВСазк оперонов и генов ес/Д у Мт. а1саИрЫ1ит 20Ъ и М. йа/а-шса.

4. Выделить и охарактеризовать предполагаемые транскрипционные белки-регуляторы ЕйЯ из Мт. а1саИрЫ1ит 202 и М. МаШязка.

Научная новизна. Получены и охарактеризованы рекомбинантные ДАБ-ацетилтрансферазы. Показано, что свойства ДАБ-ацетилтрансферазы коррелируют с экофизиологическими особенностями изучаемых бактерий.

Впервые установлено, что регуляция биосинтеза эктоина у изучаемых метилотрофных бактерий происходит на уровне транскрипции еМАВСаяк оперона. Определено, что оперон есМВСаяк у Мт. акаИрИИит 202 и М. ¡Шс&ька транскрибируется с двух промоторов (Р1 и Р2).

Выше ес/-оперона обнаружены гены (ес/Л), кодирующие белки, гомологичные белкам-регуляторам семейства МаЖ. Получены и охарактеризованы гомогенные препараты белков ЕйЯ, показана их способность обратимо связываться с Р1 промоторной областью ес/-оперона в пределах предполагаемой -10 последовательности. Уровень экспрессии с промотора Р1 регулируется белком Ее®, и увеличивается в условиях высокой осмолярности среды, тогда как с промотора Р2 осуществляется низкая конститутивная экспрессия генов биосинтеза эктоина, не регулируемая продуктом гена ес/Я.

Найдено, что у Мт. акаИрЫЫт ТАЪ, в отличие от М. ЛаЬхзка, транскрипция гена ее//? осуществляется с единственного промотора Рк, расположенного между промоторами Р1 и Р2 есг-оперона. Предполагается, что транскрипция гена еоШ у Мт. акаИрЫЫт ЮЪ контролируется собственным продуктом, т.е. ЕсЙ1 является ауторегу лятором.

Практическое значение работы. Данная работа расширяет наши представления о регуляции биосинтеза эктоина и создает предпосылки для эффективной реализации биотехнологического потенциала гало(алкало)фильных метанотрофов и метилобактерий, как возможных продуцентов биопротектора эктоина.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2003-2007гг), на 8-, 9- и 10-ой международных школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2004-2006 гг.), на Всероссийской молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2005 и 2007), на международной научной конференции "Современные проблемы микробиологии и биотехнологии" (Одесса, 2007), на международной научной конференции "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии" (Минск, 2008), на школе-конференции "Биология: традиции и инновации в 21 веке" (Казань, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, глава в книге "Adaptation to Life at High Salt Concentration in Archae, Bacteria and Еикагуа"и 7 тезисов.

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов в рамках плана научно-исследовательских работ УРАН ИБФМ РАН по теме «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы» (№ Госрегистрации 01.2.00708221).

Благодарности. Автор благодарен сотрудникам УРАН ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению и написанию данной диссертационной работы: д.б.н. Дорониной Н.В., к.х.н. Шляпникову М.Г., к.б.н. Ивашиной Т.В., к.б.н. Захаровой М.В., ст.лаб. Вотевой Г.В., а также сотрудникам УРАН ИБ РАН к.б.н. Ксензеко В.Н. и Глухову A.C. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям - д.б.н., проф. Троценко Ю.А., д.б.н. Хмелениной В.Н. и к.б.н. Решетникову A.C.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 96 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 199 ссылок, содержит 4 таблицы и 29 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили чистые культуры аэробных метано- и метилотрофных бактерий: Methylomicrobium alcahphilwn 20Z (VKM В-2133), Methylophaga alcalica (VKM B-2251) и Methylophaga thalassica (VKM B-2057). Mm. akaliphilum 20Z выращивали на минеральной среде "П" (pH 9.0) содержащей

1-6% NaCl, в атмосфере СИ4 и воздуха (1:1). М. alcalica выращивали на среде "М" (pH 9.0), содержащей 3% NaCl. Для создания щелочного значения pH (9.0) в среду дополнительно вносили Na-карбонатный буфер. М. thalassica выращивали на среде "К", содержащей 1-6% NaCl (Доронина, 1999). Escherichia coli XLl-Blue, BL21(DE3) выращивали на жидкой или агаризованной среде "LB" с добавлением при необходимости селективных антибиотиков [канамицина (Km) - 50 мкг/мл, ампициллина (Amp) - 100 мкг/мл или хлорамфеникола (Cm) - 25 мкг/мл].

Молекулярно-биологические методы. ДНК выделяли модифицированным методом (Marmur, 1961). ПЦР-амплификацию проводили в термоциклере Hybaid (Англия) или Eppendorf (Германия). РНК выделяли модифицированным методом (Chomczynski and Sacchi, 1987). Лигирование в кольца фрагментов хромосомной ДНК, инвертированную ПЦР, синтез кДНК, выделение плазмидной ДНК, получение компетентных клеток и их трансформацию, определение стартовой точки транскрипции, защиту ДНК от ДНКазы I проводили стандартными методами (Sambrook and Russell, 2001). Секвенирование ДНК проводили с помощью "Big Dye Terminator Ready Reaction Kit" ("Applied Biosystems", США) на автоматическом секвенаторе "DNA Sequencer ABI PRISM 310" ("Applied Biosystems", США) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Анализ нуклеотидных последовательностей, их трансляцию в аминокислотные последовательности, определение сайтов рестрикции и открытых рамок считывания (ОРС) осуществляли при помощи программ GeneRuner 3.00, VectorNTI®Advance v.9.0, DNAStar v.4.04 и Clone Manager 5. Аминокислотные последовательности выравнивали программой ClustalX (vl.62b) (Thompson et al., 1997) и GeneDoc. Филогенетический анализ проводили с помощью пакета программ PHYLIP v.3.6, используя программы seqboot, protpars и consense (Felsenstein, 2004).

Клонирование и экспрессия генов. Гены ectA и ectR амплифицировали из геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20Z , М. alcalica, М. thalassica и клонировали в векторе рЕТ22Ь+. Полученные рекомбинантные плазмиды pETect4-20Z, рЕТес/Л-МТ, рЕТес/Л-М8, pETeci/?-20Z и рЕТес/Д-МТ трансформировали в Е. coli BL21(DE3). Экспрессию генов индуцировали добавлением ИПТГ. Рекомбинантные белки EctR и EctA из Е. coli выделяли с помощью металл-хелатной хроматографии на колонке с N 12+-ЫТА-агарозой, согласно протоколу фирмы " Qiagen" (Германия). Чистоту белковых препаратов и молекулярные массы (м.м.) белков определяли электрофорезом в 12% ДСН-ПААГ модифицированным методом Лэммли (Laemmli, 1970). Молекулярные массы нативных EctA и EctR определяли методом гель-фильтрации на колонках с Ultrogel АсА54 и АсА44, соответственно (Pharmacia, Швеция). Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури (Schacterle and Pollack, 1973).

Характеристика ДАБ-ацетилтрансфераз. Активность фермента определяли по образованию 5-тио-2-нитробензойной кислоты (£412= 13.6 мМ"' см'') в результате взаимодействия 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) (ДТНБ) с образующимися в ходе реакции сульфгидрильными группами КоАБН (Бгеге, 1969). Для определения активности ДАБ-ацетшпрансфераз при различных значениях рН использовали 100 мМ буферные растворы: натрий-фосфатный буфер (рН 7.0-8.0), Трис-НС1 буфер (рН 7.5-9.5), натрий-карбонатный буфер (рН 9.5-10.5). Константы Михаэлиса (К„) определяли по уравнению Михаэлиса-Ментен, используя программу вщтаРкЛу.в.О.

Получение штамма Мт. акаИрИИит 20Z с делецией гена ес(Я. Фрагменты ДНК, фланкирующие ген ес1Я, были амплифицированы и клонированы в конъюгативном векторе рСМ184, содержащем ген устойчивости к канамицину. Для конъюгации использовали штамм-донор Е. соИ 817-1, который предварительно трансформировали полученной плазмидой. В качестве реципиента использовали культуру Мт. а1саИрЫ1ит 202. После конъюгации устойчивые к канамицину рекомбинанты Мт. акаИрИИит 2(К выращивали на селективной среде "П" (рН 9.5), содержащей 100 мкг/мл канамицина. Инсерцию и делецию гена ес1Я проверяли методом ПЦР с использованием праймеров, специфичных нуклеотидной последовательности вставки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Клонирование генов ес(А, экспрессия и характеристика ДАБ-ацетилтрансфераз

Ранее нами была определена полная нуклеотидная последовательность генов биосинтеза эктоина у метанотрофа Мт. акаИрИИит 20Ъ (ОепВапк № DQ016501), метилобактерий М. акаИса (ОепВапк № ЕШ15063) и М. (ИаЬзака (ОепВапк № ЕШ15062) (Решетников и др., 2006). Для изучения регуляции биосинтеза эктоина на уровне активности ДАБ-ацетилтрансферазы (ЕЛА), гены, кодирующие этот фермент, клонировали в экспрессирующем векторе рЕТ22Ь+. Полученными плазмидами рЕТес1А-202, рЕТсйА-МТ и рЕТес1А-М8 трансформировали клетки Е. соН ВЬ21(ОЕЗ). Аффинной хроматографией на №2+-МТА агарозе были получены гомогенные препараты ферментов Е^Агог-Кэб, ЕйАмг^б и ЕйАм^Н^б (рис. 1) с удельной активностью 200, 220 и 170 Е/мг белка, соответственно.

Методом ДСН гель-электрофореза и гель-фильтрации показано, что изучаемые ДАБ-ацетилтрансферазы являются гомодимерами, с м. м. субъединиц около 20 кДа, что близко значению м. м. ДАБ-ацетилтрансферазы из Н. е1о^Ша (табл. 1).

ДАБ-ацетшпрансфераза из нейтрофила М. //гд/ои/са проявляла максимальную активность при рН 8.5-9.0, причем активность резко уменьшалась при повышении рН

<А> М 1 2 (Б> М кДа кДа __

116.0 — 116.0 —*

66.2 —- 66.2 —

45.0 — 45.0 —*

35.0 *"*"* 35.0 *""*'

25.0 — 25.0 ,

18.4 — 18.4 —•

14.4 — 14.4 —

Рис. 1. Электрофорез ДАБ-ацетилтрансфераз в 12.5%-ном ДСН-ПААГ.

(А) 1 - из М. //ю/гга/са; 2 - из М. акаИса; (Б) из Мт. а1саИрШ1ит 20Ъ\ М - маркерные белки.

реакционной смеси или смене Трис-НС1 буфера на натрий-карбонатный. Напротив, ферменты из алкалофилов М. акаИса и Мт. акаИрИИит 20Ъ имели оптимумы при рН 9.5 и не ингибировались натрий-карбонатным буфером (табл. 1), в то время как ЕйА из Н. elongata был наиболее активен при рН 8.2 (Опо & а1., 1999).

Таблица 1. Свойства ДАБ-ацетилтрансфераз различных галофильных бактерий.

Свойства М. thalassica М. alcalica Mm. alcaliphilum Н. elongata'

Оптимум pH 9.0 9.5 9.5 8.2

Оптитум темпратуры, "С 30-35 30-35 20 20

Молекулярная масса 20 кДа 20 кДа 20 кДа н.о.

(SDS-ПААГ электрофорез)

Молекулярная масса 40 кДа 40 кДа 40кДа 45 кДа

(гель фильтрация)

К„ (ДАБ) 0.365 мМ 0.375 мМ 0.465 мМ н.о.

К„ (ацетил-КоА) 76мкМ 30 мкМ 36.7 мкМ н.о.

Ингибиторы (1 мМ) Zn2+Cd2+Cu2+ Zn2+Cd2+Cu2+ Zn2+Cd2+ и.о.

Оптимальная концентрация 0 0 0.25 н.о.

КС1,М

Оптимальная концентрация 0 0 0.1-0.2 0.4

NaCl, М

Стабильность Стабилен 6 Стабилен 6 Стабилен6 Нестабилен

а - Опо et all., 1999; б - препараты фермента (0.5 мг/мл) стабильны в 50 мМ Трис-НС1 буфере (рН 8.5) в течение месяца при 4 или -70°С; н.о. - не определяли.

Корреляция между оптимальными значениями рН для активности ДАБ-ацетилтрансфераз и физиологическими особенностями метилотрофных бактерий

(алкалофилов Мт. акаИрИИит 202, М. акаИса и нейтрофила М. 1/га1аз$1са), а также различное влияние карбонат-ионов на активность ферментов из метилотрофов, выделенных из содовых озер с высокими концентрациями карбоната (Мт. акаНрИИит 202, М. акаИса) или из хлоридно-натриевых источников (Л/. ¿/¡а/ам/сд), возможно, свидетельствуют о том, что адаптация галофильных бактерий к экофизиологическим условиям обитания включала модификацию ферментов синтеза эктоина.

Максимальная активность ДАБ-ацетилтрансферазы из Мт. акаПрЫЬт 202 проявлялась при значениях №С1 и КС1, соответственно, 0.15 и 0.25 мМ, тогда как, ферменты из метилобактерий были наиболее активны в отсутствии ЫаС1 или КС1 (табл. 1). Стимулирующее влияние №С1 или КС1 на активность ДАБ-ацетилтрансфераз может косвенно свидетельствовать о "галофильной" природе данного фермента пути биосинтеза эктоина у Мт. акаНрИИит 202 и Н. екщМа. Напротив, ингибирующее влияние солей на ферменты метилобактерий, возможно, объясняется их приспособлением к относительно постоянной внутриклеточной ионной силе, достаточно эффективно поддерживаемой в клетках штаммов, использующих метанол в качестве источника энергии.

Глутамат натрия в концентрации до 0.5 М не влиял на активность ДАБ-ацетилтрансфераз из метилотрофных бактерий. Логично предположить, что ингибирующим действием обладают хлорид-ионы (наряду с ингибированием высокой ионной силой). Высокие уровни внутриклеточного глутамата ранее сообщались для ряда галотолерантных метилобактерий (Богошпа е1 а1., 1998, 2003), однако концентрации хлорид-ионов в цитоплазме данных бактерий не измерялись.

Зависимость скорости реакции ДАБ-ацетилтрансфераз изучаемых метилотрофных бактерий от концентраций субстратов (ДАБ и ацетил-КоА) подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. Значения Км для ЕйА из Мт. акаНрИИит 202, М. ¡Ьа/аяяка и М. акаИса представлены в таблице 1.

Катионы меди в реакционной смеси ингибировали активность ДАБ-ацетилтрансферазы из метилотофов М. акаИса (на 98%) и М. Макака (47%). Однако активность данного фермента из метанотрофа Мт. акаИрИИит 202 в присутствии Си2+ уменьшалась на 30%. Эти различия в действии меди коррелируют с физиологическими особенностями бактерий. В частности, в окислении метана метанмонооксигеназой участвует медь (МиггеН е1 а1., 2000), поэтому рост и активность метанотрофов строго зависит от присутствия данного катиона в среде.

2. Идентификация генов ес1К у метилотрофных бактерий

При анализе нуклеотидной последовательности генов биосинтеза эктоина у М. акаИса (вепБапк № ЕШ15063) на расстоянии 268 п.н. от ес14ВСа$к оперона

была обнаружена полноразмерная ОРС, продукт которой проявлял сходство с известными транскрипционными регуляторами Мат-семейства: PecS (Reverchon et al., 1994), Hpr (Perego and Hoch, 1988), HpcR (Roper et al., 1993), MarR (Cohen et al., 1993). Исследование нуклеотидной последовательности есМшерона у Mm. alcaliphilum 20Z выявило наличие 5'-концевого участка ОРС, транслированная аминокислотная последовательность которого также проявляла сходство с известными транскрипционными регуляторами MarR-семейства.

-ectR —| ectA

ectB

Alcanivorax borkumensis (AM286690), Planctomyces maris (NZ_ABCE01000010), Reinekea sp. (NZ_AAOEO1000012), Roseobacter sp. (NZ_AANB01000001).

Bordetella bronchiseptica (NC_002927), Bordetella pertussis (BX470248), Limnobacter sp. (NZ_ABCT01000019), Nitrobacter sp. (NZ_AAMY01000005), Oceanospirillum sp. (AAOWO1000022).

—<\ ectR *T ecfB ectC ask

Aurantimonas sp. (AAPJ01000003), Oceanicola balsensis (AAM001000001), Oceanicola granulosus (NZ_AAOTO1000012), Oceanobacter sp. (NZ_AAQH01000019), Rhodobacterales bacterium (ААМТ01000006), Roseovarius sp. (AAMV01000008), Saccharophagus degradans (CP000282), Sagittula stellata (AAYA01000015), Silicibacter sp. (CP000377 и NC 008044), Vibrio flscheri (NC 006841).

—<^ecfff ~fectA ^>1 ecfB ^-|ecfC ectD ask

Acidiphilium cryptum (CP000697), Hyphomonas neptunium (CP000158), Roseovarius nubinhibens (NZ_AALY01000001), Sphingomonas sp. (NZ_AAQG01000003), Sphingopyxis alaskensis (NC 008048).

Рис. 2. Организация генов биосинтеза эктоина у галотолерантных бактерий (на основе полученных и депонированных в GenBank нуклеотидных последовательностей). Гены кодируют: ectA - ДАБ-ацетилтрансферазу, ectB - ДАБ-аминотрансферазу, ectC -экгоинсинтазу, ectD - эктоингидроксилазу, ask - аспартаткиназу и marR - предполагаемый транскрипционный регулятор

Мы предположили, что обнаруженная у М. а!саНса полноразмерная ОРС (обозначенная нами как ген ес/Д) кодирует транскрипционный регулятор генов биосинтеза эктоина (ес1АВСазк). Соответственно, найденная у Мт. а1саИрЫ1ит 20Z неполная ОРС является частью гена ес1Я.

Однако анализ фрагмента ДНК длиной 500 п.н., расположенного выше генов биосинтеза эктоина у М. Ла1а$81са, не выявил наличие ОРС или ее фрагмента,

проявляющего сходство с ОРС из Мт. а1саИрЫ1ит 202. и М. акаНса. Для идентификации полной последовательности гена ес!Я Мт. акаНрИИит ЮЪ и М. /Ла/аотса был использован подход, основанный на ПЦР методологии. Обнаружено, что ген ес/Л у данных метилотрофных бактерий располагается в дивергентном направлении от гена ес1А, на расстоянии 327 п.н. (Мт. акаНрИИит 202) и 630 п.н. (М. /Аа/аи/са). Сравнение выведенных аминокислотных последовательностей генов ес1Я показало, что белок Ее® из М. акаИса проявляет высокое сходство с белками из Мт. акаНрИИит 202 (73% идентичности) и М. ¡Иа1а$$1са (60 % идентичности).

Поиск в базе данных СепВапк ОРС, гомологичных генам ес1Я метилотрофов, выявил их присутствие в геномах ряда галофильных бактерий (рис. 2). У большинства бактерий эти ОРС (обозначенные нами как ОРСртя), располагаются непосредственно перед генами биосинтеза эктоина в дивергентном направлении, аналогично генам ес(К у метилотрофов. Такое расположение генов, кодирующих белки-регуляторы, относительно регулируемых оперонов характерно для транскрипционных регуляторов Маг!1-семейства.

3. Определение функции белка Е^ЛМ/я. акаНрИИит 20Ъ

Для определения роли обнаруженного нами гена есхЯ в регуляции есМшерона у Мт. акаНрИИит 20Ъ был получен штамм Мт. акаНрИИит 202 с делецией гена еаК, обозначенный как ЕВРК01.

Для определения уровня экспресии генов биосинтеза эктоина в штамме ЕВРШ)1 был использован репортерный ген ^р. Предполагаемую промоторную область ес1-оперона (ес1Ар) амплифицировали и клонировали в вектор рТЭОех. Полученная плазмида, несущая ген %[р под контролем промотора ес/-генов, была перенесена коньюгацией в штамм ЕВРШЛ и дикий тип Мт. акаНрИИит 202.

Таблица 2. Флуоресценция йРР и активность ДАБ-ацетшпрансферазы в клетках дикого типа и мутанта по гену ес/И

Концентрация №С1 в среде Относительная флуоресценция СЕР (X 405/509 нм) Дикий тип | ЕВРМ! Активность ДАБ-ацетилтрансферазы (нмоль мин"1 мгбелка) Дикий тип | ЕВРК01

1%ЫаС1 22±2.3 65±9 5±1.2 33±5.3

3% №С1 40+5 95±15 57±7 200±23

6%ЫаС1 130±25 220+22 83+11 150±18

Измерение флуоресценции показало более высокую активность ес1Ар промотора в штамме ЕВРЯ01 с нокаутом гена ес1К при росте на среде, содержащей 1, 3 и 6%

NaCl, по сравнению со штаммом дикого типа. Кроме того, активность ДАБ-ацетилтрансферазы в штамме EBPR01 была в 2-6 раз выше, по сравнению с клетками дикого типа (табл. 2), что указывает на повышенный уровень транскрипции.

Следовательно, у Mm. alcaliphilum 20Z белок EctR является репрессором транскрипции ес/-оперока. Большинство белков МагЛ-семейства также являются транскрипционными репрессорами, сайты связывания которых расположены в промоторных областях регулируемых оперонов (Tropel and Meer, 2004).

4. Определение стартовой точки транскрипции ес/-опсронов и генов ectR у Mm. alcaliphilum 20Z и М. thalassica 4.1. Определение стартовой точки транскрипции ес/-оперона

Для определения промоторной области генов биосинтеза эктоина был использован метод удлинения праймера (primer extension experiment). У Mm. alcaliphilum 20Z и M. thalassica транскрипция ес(-оперона осуществляется с двух стартовых точек (G/A и А/А, соответственно) (рис. 5). Следовательно, у данных бактерий транскрипция генов биосинтеза эктоина осуществляется с двух промоторов Р1иР2.

Предполагаемые -35 (TGGACA) и -10 (ТАСТАТ) последовательности промотора Р1 у Mm. alcaliphilum 20Z проявляют высокое сходство с соответствующими последовательностями ©'"-зависимого промотора Е. coli (TTGACA-16-18n.H.-ТАТААТ) (рис. 5). Наличие TG мотива в положении -14, как продолжение -10 последовательности, также указывает на сходство промотора Р1 с а70-зависимым промотором. В нуклеотидной последовательности Р1 промотора у М. thalassica обнаружены последовательности (TGGACA) и (ТАСТАТ), аналогичные предполагаемым -35 и -10 областям промотора Р1 у Mm. alcaliphilum 20Z.

Предполагаемые последовательности -35 (CAGAAT) и -10 (ТААААА) промотора Р2 Mm. alcaliphilum 20Z, также как -35 (CCGAAT) и -10 (ТТТАТТ) последовательности Р2 промотора М. thalassica, проявляют низкое сходство с соответствующими последовательностями о70-зависимого промотора Е. coli (рис. 5). Мотив TG выше -10 последовательности обнаружен только в Р2 промоторе М. thalassica.

Поскольку последовательности промотора Р1 наиболее близки каноническим, возможно, что экспрессия ес/-оперона с этого промотора эффективнее, чем с промотора Р2. При этом транскрипция с более сильного промотора Р1 вероятно регулируется осмолярностью среды, а с промотора Р2 осуществляется слабая конститутивная транскрипция ect-генов.

А СС Т

$' ' 1

* м,"

А С I А А А А

А<=!

А Т А

А С С Т

| ¡8,

► V .....

'¡¿1§

Мт. акаИрМЫт 20Ъ

М. Отктка

Мт. акаНрЛНшп Ж

„1 Г—,

§** * \

Й** '! 1»

. «Г £

.И /Ыашса

/л

/ с ; с

N20 С Т Т Т

Т<=з

N15 т

А Т

Афп

! С

5 I

(В)

БсШ

МеМуЬписгоЫит акаИрИИит 207.

ТТТССАТТСАТСАССААТСАТТСААА - N 100 - СОТССТССОССССОСССАТССТАОООСеСТАССОАААТТТСААСТТСОА

-35 Р1 -10 Р1 +1 г-► -35 Р2

ассссссстссасатттаааттатттастстастатататтатСТТТТТСААТСААСССАСААТАТТССТССТСАТССССАТАА

-10 Р2 4-1. » __+1-<-1

ААААТСААШИИессс8есттАТТСАСТТАШЗ^ЕА(зттААТТССАСА6АААТСТАААТААТАОАСТТАТТТАТАТСТеС -10РК -35 Рк ЕйА-*

МехНу1ор}и1^а Лаккяка

ЕсШ +1"*-1 -10 РяЗ -35 ркз

САТААТТТТССА - N 60 - Т6ССАТАСАТАСС0СТСААТСТАТ{ЯЯГ|ССТСТАСАС6ТАСС6С!7Я!Я{АТСТТ6ТАААТСС

-»-»1 -10 Рк2 »1-*-1 -35 Р„1 -10 РН1 -35 Р„1

ассаасстааТТТТСАССА^П^^ЯСААСАСТААТАССААСТА^^ЯУД^^ИТААТТТ^АТААТААТДАПЗТЯ^ЙЙТГ^СТС

-35 Р1 -10 Р1 +1.->-

АТСЮССТСА - N 217 -ТСТТбТСАТСТААСАТСТСОбССТСОАСААТАТААТТАТТТАСТСТАСТАТАТАТАТТАААТСААТА

-35 Р2 -10 Р2 +11-<-

АСАССССбААТТАТТТАТАСААСТТеСТОТТТАТТАТОААТТАТААб- N 55 -АСААТАОАССТАТТТАСАТААТСЗАСТААСА

Ес1А-^

Рис. 5. Определение стартовой точки транскрипции есЬ4ВСй»А оперона и генов ес1Я у Мт. а1саИрЫ1ит 202 и М. ¡ИаЬкзка. 32Р-меченные праймеры, комплементарные генам еаЛ (А) и ес1Я (Б), были использованы в качестве затравки для реакции обратной транскрипции. Продукты данной реакции и реакции секвенирования ДНК-субстрата разделяли в 6% ПААГ, содержащем 8 М мочевину. Белой стрелкой обозначен +1 нуклеотид. (В) - Схематическое представление результатов картирования. Предполагаемые -10 и -35 последовательности промоторов есг-оперона подчеркнуты, генов ес/Д выделены черным фоном. Стрелками обозначены +1 нуклеотиды.

Транскрипция генов биосинтеза эктоина с промоторов, проявляющих сходство с а70-зависимым промотором Е. coli или оА-зависимым промотором Bacillus subtilis, характерна для галофильных микроорганизмов. У Marinococcus halophilus, Chromohalobacter salexigens, Bacillus pasteurii и Salibacillus salexigens гены ectABC экспрессируются с промоторных областей, содержащих сайты, гомологичные -10 и -35 последовательностям о70/сА - зависимых промоторов (Bestvater and Galinski, 2002; Calderón et al., 2004; Kuhlmann and Bremer, 2002; Bursy et al., 2007). Однако у ряда перечисленных галофильных прокариот в промоторных областях генов ectABC присутствуют -10 и -35 последовательности, сходные с (/-зависимым промотором Е. coli (Bestvater and Galinski, 2002; Calderón et al., 2004), что подразумевает регуляцию транскрипции генов ectABC посредством смены сигма-факторов.

В промоторных областях ectABCask оперона у метилотрофных бактерий не обнаружены последовательности, гомологичные (/-зависимому промотору Е. coli. Поэтому логично полагать, что регуляция экспрессии оперона ectABCask у метилотрофов в условиях изменения осмолярности среды осуществляется механизмом, не связанным со сменой сигма-факторов.

4.2. Определение уровня экспрессии генов биосинтеза эктоина с промоторов PI и Р2

Для определения уровня экспрессии генов биосинтеза эктоина с промоторов PI и Р2 при различной осмолярности среды использовали метод обратной транскрипции. Тотальную РНК выделяли из клеток Mm. alcaliphilum 20Z, выращенных в присутствии 1% или 6% NaCl, а также в присутствии 1% NaCl и затем подвергнутых осмотическому шоку (посредством увеличения концентрации NaCl до 6%).

1 2 3

Рис. 6. Электрофореграмма продуктов обратной транскрипции с использованием 32Р-меченного праймера, комплементарного гену ес(А, и РНК, выделенной из клеток Мт. а!саИрЫ1ит 20ZJ выращенных в присутствии 1% №С1 (1); 1% №С1 и подвергнутых осмотическому шоку (2) или выращенных в присутствии 6%ИаС1 (3).

В результате было показано, что количество мРНК, транскрибируемой с промотора Р1, максимально в клетках, подвергнутых осмотическому шоку, и минимально в клетках, выросших при низкой концентрации соли в среде, тогда как

транскрипция с промотора Р2 поддерживалась в этих условиях на постоянном уровне (рис. 6). Таким образом, из двух промоторов (Р1 и Р2) ectABCask оперона Mm. alcaliphilum 20Z только промотор Р1 является осморегулируемым. 4.3. Определение стартовой точки транскрипции генов ectR

Методом удлинения праймера показано, что у Mm. alcaliphilum 20Z транскрипция гена ectR осуществляется с единственного промотора PR. Анализ промоторной области Pr выявил наличие последовательности (TCGAAT), расположенной на расстоянии 8 п.н. от стартовой точки транскрипции, и проявляющей сходство с -10 последовательностью о70- зависимого промотора у Е. coli. Однако последовательность, гомологичная -35 области данного промотора, не обнаружена.

Напротив, у М. tha/assica транскрипция гена ectR осуществляется с трех промоторов (рис. 5), причем +1 нуклеотидами для промоторов PrmjI, Prmt2 и Prmt3 являются соответственно А, А и Т. Предполагаемые -10 и -35 последовательности промотора PrmtI (GATAAT и GTCACA) гомологичны каноническим последовательностям -10 и -35 а70-зависимого промотора у Е. coli, тогда как соответствующие последовательности промоторов Prmt2 (GCTTAG и AGTCGA) и Prmt3(TATGGT и АААААТ) вырождены. Наличие TG мотива в положении -14, как продолжение -10 последовательности, также указывает на сходство промотора PrmtI с о70-зависимым промотором Е. coli.

Таким образом, у Mm. alcaliphilum 20Z промоторная область (PR) гена ectR находится между промоторами Р1 и Р2 ес/-оперона, свидетельствуя о том, что транскрипция с промотора Pr может контролироваться собственным продуктом -белком EctR. Данный белок у метанотрофа, по-видимому, является ауторегулятором, подобно некоторым представителям транскрипционных регуляторов МатЯ-семейства (Wilkinson et all., 2004; Evans et al., 2001).

Напротив, у M. thalassica промоторы Prmt1> Prmt2 и Prmt3 гена ectR не перекрываются с промоторной областью ес/-оперона. Сайт связывания для белка EctR в промоторных областях гена ectR не найден. Вероятно, транскрипция гена ectR у М. thalassica осуществляется конститутивно, но на низком уровне.

5. Сравнительный анализ белков EctR галофильных бактерий

Как отмечалось выше, белки EctR гало(алкало)фильных метилотрофных бактерий проявляют низкую гомологию (12-20% идентичности) с транскрипционными регуляторами MarR-семейства. Так, EctR Mm. alcaliphilum 20Z имеет максимальное сходство с регулятором OhrR (20.5% идентичности, GenBank № 034777) и минимальное с HpcR (13% идентичности, GenBank № ААВ25801).

Бр.Б. З.а1а А. сгу Н. пер Я.пиЬ 0.bat

.5.

О.дга Иу.д.

К.Ьас Аи.Б .

2ог ме

ОЬ.г. Яе-Б.

мт

Э . сЗед А. Ьог N .осе Оэ. Б. Р.шаг В .Ьго В .рег

г^е

ЬЬ.Е. М.Па У.^г МагИ

НТН мотив

мт 98:1

Б . с!ед 73:! ■

А. Ьог 89:1

N.006 73:1

ОБ .Б . 73:1

Р. шаг 76:!

В. Ьго 105:!

В.рег 105:; кс8

Б^е 7з=;

ЪЬ.Е. 73:1

М.г1а 88:!

У.^Е 78: ьо'Х'Ц

14а г Р. 80: ксмИ

"Боковая лопасть" 1

)1пА—октгсЙлтс пЯв—СвОЦМК!

ю—ОА||

&----ЫААК

ТаШБ ТЭГ.НЗ У.

; тыл.', < ;

I ■

КоВнА]

;.ЗГОМ(2Е Е

шпямвяЯ

>|31А1йб|ОЯ

к—ОХАРЩТС

к—¡^рЯм: IX—ЛбёЕЮК II—А'.З-И ■

(А—ОЫРСХЙРС

■ккагша:

■РОЫО 81

Рис. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей EclR белков и продуктов обнаруженных ОРСртл, проявляющих гомологию с белком MarR. Последовательности, использованные для сравнения: 20Z - Mm. alcaliphilum 20Z, МТ - М. thalassica, MarR - Е. colt, М8 - М. alcalica, Ni.s. - Nitrobacter sp., Sp.s. - Sphingomonas sp., S.ala - Sphingopyxis alaskensis, A.cry - Acidiphilium cryptum, H.nep - Hyphomonas neptunium, R.nub - Roseovarius nubinhibens, O.bat - Oceanicola batsensis, Si.s. - Silicibacter sp., O.gra - Oceanicola granulosus, Rv.s. -Roseovarius sp., Rb.s. - Roseobacter sp., R.bac - Rhodobacterales bacterium, Au.s. - Aurantimonas sp., Ob.s. - Oceanobacter sp., Re.s. - Reinekea sp., S.deg - Saccharophagus degradans, A.bor -Alcanivorax borkumensis, N.oce - Nitrosococcus oceani, Os.s. - Oceanospirillum sp., P.mar -Plancomyces maris, B.bro - Bordetella bronchiseptica, B.per - Bordetella pertussis, S.ste -Sagittula stellata, Lb.s. - Limnobacer sp., M.fla - Mycobacterium jlavescens, V.fis - Vibrio fischeri. Элементы вторичной структуры выделены закрашенным прямоугольником (а-спирали), стрелкой (Р-листы), или не закрашенным прямоугольником (петли). Символом (#) обозначены аминокислоты, участвующие в формировании гидрофобного ядра в ДНК-связывающем домене.

Белки EctR М. thalassica и М. alcalica проявляют наибольшую гомологию (19.5 и 18%, соответственно) с белком PecS (GenBank № Р42195) и наименьшую (12%) с белком SlyA (GenBank № NP_460407). Следует отметить, что низкая степень гомологии (менее 25% идентичности) характерна для регуляторов MarR-семейства, хотя они подобны по четвертичной структуре белка (Tropel and Meer, 2004).

Анализ аминокислотных последовательностей белков EctR метилотрофных бактерий выявил в них мотивы "НТН" и "боковая лопасть", аналогичные соответствующим мотивам (IPR000835 и IPR011991; база данных "InterPro") транскрипционных регуляторов MarR-семейства (рис. 7). Для белков MarR-семейства показано, что мотивы НТН и "боковая лопасть" образуют ДНК-связывающий домен (Alekshun et al., 2001; Hong et al., 2005). Кроме того, при анализе белков EctR метилотрофов найдены аминокислоты (у Mm. alcaliphilum 20Z - Leu64, Leu65, Leu68, Leu74, Ile76, Ile79, Val90, Leu94, Leu97, Ile93, Leul02, Vall03, Vail 17, Metll9), гомологичные аминокислотам, формирующим гидрофобное ядро в белке MarR Е. coli (Alekshun et al., 2001).

Итак, полученные результаты определенно указывают на сходство структурной организации белков EctR метилотрофных бактерий и транскрипционных регуляторов MarR-семейства.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей, выведенных из обнаруженных нами OPCPTR галофильных бактерий, и белков EctR, показал, что OPCptr кодируют белки, доменное строение которых аналогично белкам EctR метилотрофных бактерий (рис. 7). Кроме того, обнаружено, что предполагаемая аминокислотная последовательность НТН мотива EctR Mm. alcaliphilum 20Z проявляет около 80% идентичности с соответствующей областью в белках из галофильных бактерий Reinekea sp. и Oceanobacter sp.

Mm. alcaUphilum 20Z

M. alcalica

M. thalassica1

Reinekea sp.

Oceanobacter sp. Oceanospirillum sp. Nitrosococcus oceani

■Alcanivorax borkumensis

Roseovarius sp. „

\ Saccharophagus OceanicolaJ\ degradans granulosus

Rhodobaderales bacterium■

Roseovarius sp.

Roseovarius nubinbibens

Silicibacter sp

Roseobacter sp.

Aurantimonas sp.-

Nitrobacter sp:

Sphingomonas sp.

Sphingopyxis Addiphilium alaskensis cryptum

Apr '

(B. subtilis)

CbaR

(C. lestosteroni)

Mycobacterium flavescens

HcaR

(E.coli)

PrsR

(E.coli)

EmrR

Hyphomonas neptunium

BadR SlyA

(R. palustris) y(E faecahs)

HpcR

(Ecoh)

MexR

(Я aeruginosa)

OhrR

(8. subtilis)

MarR

(E.coli)

NhhD

(R. rhodochrous)

PecS

(£ Chrysanthen«) HucR

(E.coli) (D. radiodurans)

Рис. 8. Филогенетическое дерево предполагаемых транскрипционных регуляторов БсЖ галофнльных бактерий и регуляторов МагК-ссмейства. Дерево построено на основании аминокислотных последовательностей белков ЕсЖ метилотрофов, продуктов ОРСртя У галофильных бактерий и транскрипционных регуляторов МагК-семейства.

Возможно, обнаруженная высокая идентичность НТН мотивов белков Ее® метилотрофов и ОРСрге других галофильных бактерий свидетельствует о консервативности последовательности участка ДНК, необходимого для связывания белков ЕйЯ. Таким образом, на основании сходства аминокислотных последовательностей и доменного строения продуктов генов ес!Я метилотрофов и ОРСртя, расположенных у некоторых галофильных бактерий перед ес/-опероном, можно предположить, что эти OPCj.tr также кодируют транскрипционные регуляторы генов биосинтеза эктоина.

Примечательно, что белки ЕсЖ. галофильных бактерий разных таксономических групп, проявляющие гомологию с регулятором МагЯ-семейства, формируют отдельный кластер на филогенетическом дереве (рис. 8).

6. Очистка и первичная характеристика транскрипционного репрессора EctR из Meíhylomicrobium alcaliphilum 20Z

Гены ectR, кодирующие транскрипционные регуляторы из Mm. alcaliphilum 20Z и М. thalassica, клонировали в экспрессионном векторе рЕТ-22Ь(+), позволяющем синтезировать рекомбинантный белок с дополнительными 6 His на С-конце. Полученными плазмидами (pETec//?-20Z и рЕТес/Я-МТ) трансформировали клетки Е. coli BL21(DE3). В результате аффинной хроматографии были получены гомогенные препараты рекомбинантных белков EctR20z-His6 и EctRMT-His6. ДСН-ПААГ электрофорез показал, что EctR из метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z имеет м.м. 22 кДа, что согласуется с рассчитанной на основе аминокислотной последовательности (22.4 кДа) с учетом 6 His. Белок EctR из М. thalassica имел электрофоретическую подвижность, соответствующую м. м. - 23 кДа, которая также хорошо согласуется с теоретически рассчитанной на основе аминокислотной последовательности (23.75 кДа).

На основании того, что (1) у большинства транскрипционных регуляторов MarR-семейства сайты связывания с ДНК находятся в промоторных областях регулируемых генов (Tropel and van der Meer, 2004) и (2) экспрессия гена ectR Mm. alcaliphilum 20Z в клетках E. coli репрессирует транскрипцию с промоторной области ecí-оперона, мы предположили, что сайт связывания белка EctR перекрывается с осморегулируемым промотором PI.

Меченный фрагмент ДНК (пкмоль) 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Немеченный фрагмент ДНК (пкмоль) - - - - - - 1 5 10

EctR (пкмоль) - 20 40 60 80 160 80 80 80

mm mm IMN| iMt*

ШШ****'

Рис. 9. Анализ комплексов Ес1К-ДНК методом задержки в геле.

Используя 32Р-меченные праймеры Н и RT20Z, был получен ПЦР-фрагмент, содержащий промоторную область ее/-оперона Мт. а1саИрЫ1ит 20Z. Данный ПЦР-фрагмент и белок EctR2oz-His6 использовали в экспериментах по образованию комплексов Е^-ДНК. Установлено, что добавление рекомбинантного белка ЕйК приводит к уменьшению электрофоретической подвижности ПЦР-фрагмента в

присутствии гетерологичной ДНК (рис. 9). Следовательно, ЕЛЛ специфично связывается с промоторной областью ес/-оперона.

(А) Верхняя цепь Нижняя цепь

I ЕсК

(В)

5'-

:::::. + 1

'-3'

31 - (5АС С ТвТАААТТ ТААТАААТ САСД^ЗАТАТАТААТАС АА- 5'

Рис. 10. Картирование границ сайта узнавания белка Е^Кэдг-Швб с помощью ДНКазы I. (А) - Р-меченный по одной из цепей (верхней или нижней) ДНК-субстрат или его комплекс с ЕсЖ инкубировали с ДНКазой I. Продукты этих реакций и реакций секвенирования ДНК-субстрата (А+в) разделяли в 8% ПААГ, содержащем 8 М мочевину. (В) - Схематическое представление результатов картирования. Защищаемая область выделена черной линией, палиндром - стрелками. Предполагаемые -35 и -10 последовательности промотора Р1 расположены на черным фоне.

Картирование сайта узнавания белка ЕсЖ проводили с помощью ДНКазы I. Показано, что ЕсЖ Мт. а/саИрИИит 20Х защищает ДНК по верхней цепи от положения +1 до положения -26 относительно стартовой точки транскрипции ес?-оперона с промотора Р1 (рис. 10). Левая граница сайта узнавания по нижней цепи была локализована в положении -30, а правая - в положении -4. Таким образом, ЕсЖ связывается с протяженным асимметричным участком ДНК, длина которого составляет 31 п.н., что приблизительно равно трем виткам двойной спирали ДНК.

В пределах защищаемой белком ЕсЖ нуклеотидной последовательности можно выделить псевдопалиндром, состоящий из вырожденного инвертированного повтора (плеча) длиной 8 п.н. (б'-ТА'ПТАОТ-З') и расположенный от -5 до -22 нуклеотида относительно стартовой точки транскрипции с промотора Р1. Наличие палиндрома или псевдопалиндрома в сайте связывания с ДНК типично для

транскрипционных регуляторов семейства MarR, однако нуклеотидная последовательность сайта связывания специфична для каждого представителя данного семейства (Tropel and Meer, 2004).

Рис. 11. Определение молекулярной массы EctR2oz-His« и его комплекса с ДНК на Ultrogel АсА 44.

Присутствие псевдопалиндрома в сайте связывания белка EctR Mm. alcaliphilum 20Z указывает на то, что белок ассоциирован с ДНК как димер. Причем сайтами связывания для каждой субъединицы являются инвертированные повторы. Различие в длине защищаемой от ДНКазы I последовательности и псевдопалиндрома, возможно, объясняется большим размером молекулы ДНКзы I, не позволяющим проводить гидролиз ДНК на расстоянии 3-5 нуклеотидов от сайта связывания (Sambrook and Russell, 2001). Для определения м. м. белка EctR2oz-His6 в свободном и связанном с ДНК состоянии (комплексы EctR-ДНК получены с использованием пары взаимно комплементарных олигонуклеотидов длиной 31 п.н.) проводили гель-фильтрацию на колонке с Ultrogel АсА44. Показано, что EctR из Mm. alcaliphilum 20Z как в свободном (м. м. 44 - 45 кДа), так и в связанном с ДНК состоянии (м. м. 50 - 55 кДа) является димером (рис. 11).

Таким образом, можно предположить, что при низкой ионной силе среды роста ес/-оперон Mm. alcaliphilum 20Z транскрибируется конститутивно со слабого промотора Р2. Транскрипция с сильного осморегулируемого промотора PI репрессирована белком EctR, который стерически ингибирует связывание РНК-полимеразы с -10 последовательностью промотора PI. При увеличении осмолярности среды комплекс EctR-ДНК диссоциирует, делая промотор PI доступным для РНК-полимеразы (рис. 12).

ес(К

Р1

-П5

Р2

-361 -ю М ес{-оперон

Увеличение осмолярности среды

Р1

ес*К

Р2

-351-ю й-361-ю |Ц есЕ-оперон >//-

Рис. 12. Транскрипционная регуляция генов биосинтеза эктоина у Мт. акаИрЫШт 207..

Поскольку предполагаемая -10 последовательность промотора Р1 у Мт. а1саИрЫ1ит 20Z идентична таковой у М. Лакэяка, а ЕсЖмт-Шэб специфически связывается с фрагментом ДНК, содержащим промотор Р1 Мт. а1саИрЫ1ит 20Z, можно предположить, что у данной метилобактерии транскрипционная регуляция биосинтеза эктоина также осуществляется репрессором ЕсЖ.

Анализ участков ДНК, фланкирующих гены есЫ галофильных бактерий, выявил у М. акаИса, Яетекеа эр. и ОсеапоЬаМег ер. последовательности, аналогичные сайту связывания белка ЕсЖ Мт. акаИрЫШт 20Ъ (рис. 13). При этом аминокислотные последовательности предполагаемых ДНК-связывающих НТН-мотивов в белках ЕсЖ Летекеа эр. и ОсеапоЬаиег ер. проявляют высокую идентичность (около 80%) с соответствующим мотивом белка ЕсЖ метилотрофных бактерий.

:тссзс у

202 162: ТАСвСОЗО

МТ 174:А|СТС1

Ие. б . 154 гтеттвст.

ОЬ. г. 181: СТТ&ЗТТ.

М8 167:СКТ(5ТСАТТ

-АТ®..Т—Т АТ-^А—Я

й-тстеа-¡А-сте^и^)

^ТААТаСАТр-"

109 123 101 125 111

Рис. 13. Сравнительный анализ промоторных областей генов биосинтеза эктоина галофильных бактерий. 20Z - Мт. а1саИрЫ1ит 20Z, М8 - М. акаИса, МТ - М. (йа/скл'са, ОЬ.5. - ОсеапоЬаШг зр., Ре.Б. - Яетекеа ер. Идентичные нуклеотиды расположены на черном фоне. Нумерация нуклеотидов дана относительно первого нуклеотида гена ес/А. Инвертированный повтор в сайте связывания белка ЕсЖ Мт. а1саИрЫ1ит 20Z выделен

Полученные данные позволяют предположить участие белка ЕсЖ в регуляции транскрипциии генов биосинтеза эктоина у галофильных бактерий, в зависимости от уровня осмолярности среды, по крайней мере, у ОсеапоЪасгег ер. и Яетекеа ер. Неясно, как осмолярность среды регулирует экспрессию генов биосинтеза эктоина посредством белка-регулятора ЕсЖ. Логично предположить, что регуляция

транскрипции ес/-оперона происходит за счет изменения ДНК-связывающей активности EctR, которая, в свою очередь, зависит от внешней солености. Однако данная активность белка EctR напрямую не может регулироваться концентрацией соли в среде, так как экспрессия ес/-оперона у Mm. alcaliphilum 20Z происходит и при низкой осмолярности среды.

Для ряда белков MarR-семейства характерен механизм регуляции, основанный на связывании низкомолекулярного эффектора с белком-регулятором, что приводит к конформационньм изменениям в молекуле белка, в результате чего он теряет способность связываться с ДНК (Wilkinson and Grove, 2006). Резонно предположить, что транскрипционная регуляция биосинтеза эктоина осуществляется за счет посттрансляционной модификации EctR, например, посредством фосфорилирования/ дефосфорилирования, что приводит к изменению его конформации и, соответственно, ДНК-связывающей активности. Аналогичная регуляция в зависимости от осмолярности среды показана для Kdp и OmpC/OmpF транспортных систем (Wood, 1999).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами впервые показано, что синтез эктоина, основного осмопротектора галофильных аэробных метилотрофных бактерий, регулируется на уровне активности ферментов и транскрипции генов. Регуляция транскрипции генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у этих метилотрофов, происходит с участием транскрипционного репрессора EctR, который связывается с Р1 промоторной областью оперона ectABCask и осуществляет негативный контроль экспрессии.

Обнаружение в геномах ряда синтезирующих эктоин галофильных бактерий ОРС, гомологичных генам ectR изучаемых метилотрофов, позволяет предполагать, что по крайней мере у некоторых галофилов биосинтез эктоина также контролируется транскрипционными белками-регуляторами EctR.

Регуляторы эктоинового оперона галофильных бактерий относятся к MarR-семейству транскрипционных регуляторов и формируют на филогенетическом дереве отдельный кластер. Белки EctR имеют более высокую идентичность предполагаемых ДНК-связывающих НТН мотивов, по сравнению с НТН мотивами у регуляторов MarR-семейства. Следовательно, белки EctR галофильных бактерий образуют обособленное подсемейство транскрипционных регуляторов. Несмотря на низкую идентичность аминокислотных последовательностей, транскрипционные регуляторы MarR-семейства и EctR имеют близкую пространственную структуру и участвуют в контроле процессов, связанных с адаптацией бактерий к неблагоприятным факторам внешней среды.

Полученные результаты позволили приблизиться к пониманию того, каким образом происходило приобретение метилотрофами способности синтезировать эктоин. Высокая гомология и организация ес<-генов, наличие гомологичных генов ес/Д, кодирующих транскрипционные репрессоры, одинаковая организация промоторных областей ес/-оперонов, содержащих сайты связывания для белков ЕсЖ у таксономически далеких групп прокариот, включая метанотрофов и метилобактерий, свидетельствуют о горизонтальном переносе генов биосинтеза экгоина от общего для данных микроорганизмов "донора".

Наши данные о регуляции биосинтеза эктоина на уровне активности ферментов и транскрипции генов у гало(алкало)фильных метилотрофов создают предпосылки улучшения процесса получения этого биопротектора на основе новых эффективных штаммов-продуцентов путем целенаправленного генно-инженерного конструирования, в том числе посредством увеличения дозы генов биосинтеза эктоина в хромосоме.

Осмоадаптация гало(алкало)фильных метилотрофов, кроме синтеза осмопротекторов (эктоина, глутамата и сахарозы), включает существенные структурно-функциональные изменения (КЬте1ешпа е1 а1., 1999). В настоящий момент не представляется возможным описать весь регуляторный каскад, начиная от восприятия клеткой сигналов об изменениях осмотических условий и заканчивая структурно-функциональными перестройками. Предложенная модель транскрипционой регуляции биосинтеза экгоина является первым этапом в исследовании механизмов, составляющих суть феномена бактериальной осмоадаптации. В дальнейшем предстоит выяснить природу первичного сигнала, определить осмосенсоры и механизмы передачи сигнала с клеточной мембраны на транскрипционые регуляторы Ес1Я. Наконец, крайне важно определить другие осморегулируемые гены, а также выявить связи между системами ответа на различные стресс-факторы (такие как температура, осмолярность, рН и др.), что позволит понять и расшифровать сложный механизм адаптации бактерий к изменяющимся условиям окружающей среды.

выводы

1. Очищены и охарактеризованы рекомбинантные ДАБ-ацетилтрансферазы из Мт. а1саНрЫ1ит 202, М. акаИса и М. йгаШхка. Показано, что свойства ДАБ-ацетилтрансфераз коррелируют с экофизиологическими особенностями метилотрофных бактерий. Активность фермента из нейтрофила М. г/гй/ает'са ингибируется карбонат-ионами, у Мт. акаИркПит 202, в отличие от М. акаНса и М. Ла1азвка, стимулируется в присутствии 0,3 М КС1 и ЫаС1.

2. Обнаружено, что оперон еаАВСазк Мт. а1саИрЫ1ит 202 и М. 1ка1аззка транскрибируется с осморегулируемого Р1 и конститутивного Р2 промоторов. У данных метилотрофных бактерий предполагаемые -10 и -35 последовательности промотора Р1 идентичны.

3. Выше еЫАВСаьк оперона у Мт. акаПрИНит 202, М. акаИса и М. 11ш1а$з:са расположен ген ес1К, кодирующий белок, проявляющий гомологию с регуляторными белками Маг11-семейства. Открытые рамки считывания, гомологичные генам еаИ, обнаружены у ряда галофильных гетеро- и автотрофных бактерий.

4. Впервые показано, что ЕсЖ Мт. акаИркИит 202 является транскрипционным репрессором, блокирующим экспрессию оперона ес/ЛВСсиА посредством связывания с предполагаемой -10 последовательностью промотора Р1.

5. Последовательности, аналогичные сайту связывания белка Ес1Я Мт. а1саНрЫ1ит 202, обнаружены у М. 1ка1аз5ка, М. акаНса, Летекеа Бр. и ОсеапоЬас1ег ер., что свидетельствует об участии белка ЕйЯ в регуляции транскрипциии генов биосинтеза эктоина у данных галофильных бактерий.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи:

1. Решетников А.С., Мустахимов И.И., Хчеленина В.Н., Троценко Ю.А. Клонирование, очистка и характеристика диаминобутиратацетилтрансферазы из галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z // Биохимия. 2005, Т.70, №8, с.1063-1069.

2. Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., Mustakhimov. П., Ryzhmanova Y. V, Trotsenko Y.A. Genes and enzymes of ectoine biosynthesis in the haloalkaliphilic obligate methanotroph "Methylomicrobium alcaliphilum 20Z". In: Adaptation to Life at High Salt Concentration in Archae, Bacteria and Eukarya. N. Gunde-Cimerman, A. Oren, A. Plemenitas (Eds.) Springer Science + Business Media B.V. Dordrecht, The Netherlands. 2005, V.9. P. 329-338.

3. Mustakhimov I.I., Rozova O.N., Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., Murrell J.C., Trotsenko Y.A Characterization of the recombinant diaminobutyric acid acetyltransferase from Methylophaga thalassica and Methylophaga alcalica. IIFEMS Microbiol Lett. 2008 V.283. p.91-96.

Тезисы:

1. Решетников A.C., Мустахимов И.И., Рыжманова Я.В. Этимологические и генетические апекгы биосинтеза экгоина-основного осмопротектора у галоалкалофильных метанотрофов. / 8-ая Пущинская конференция молодых ученых "Биология-наука XXI века" Пущино, 2004. с. 159.

2. Решетников А.С., Мустахимов И.К, Рыжманова Я.В., Шулепко М.А. Клонирование, очистка и характеристика диаминобутиратацетилтрансферазы из галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphium 20Z. / 9-ая Пущинская конференция молодых ученых "Биология-наука XXI века" Пущино, 2005. с. 87.

3. Решетников А.С., Рыжманова Я.В., Мустахимов И.И., Шулепко М.А. Биосинтез осмопротектора эктоина у аэробных метилотрофных бактерий: энзимологические и генетические аспекты. Тезисы Всероссийской Молодежной школы-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" Москва, ИНМИ им. С.Н.Виноградского РАН, 2005, с.78.

4. Мустахимов И.И., Рыжманова Я.В., Шулепко М.А., Решетников А.С. Биохимические и генетические аспекты синтеза эктоина - основного биопротектора метилотрофных бактерий. / 10-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология-наука XXI века" Пущино, 2006. с. 203.

5. Mustakhimov 1.1. and Reshetnikov A.S. Ectoine biosynthesis gene and enzymes of halotolerant and halophilic methylotrophic bacteria / Modern problems of microbiology and biotechnology, Odessa, May 2007, P. 31.

6. Мустахимов И.И., Решетников А.С. Регуляторные аспекты биосинтеза эктоина у галотолерантного алкалофильного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphium 20Z. Тезисы Всероссийской Молодежной школы-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" Москва, ИНМИ им. С.Н.Виноградского РАН, 2007, с.82.

7. Мустахимов И.И., Решетников А.С., Хмеленина В.Н. Транскрипционная регуляция генов биосинтеза эктоина у галоалкалофильного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphium 20Z. II Школа-конференциия "Биология:традиции и иновации в 21 веке" Казань, 2008, с.22.

Подписано в печать:

13.10.2009

Заказ № 2693 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мустахимов, Ильдар Ильдусович

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Галофильные микроорганизмы.

1.1. Осмоадаптация.

1.2. Гиперосмотический шок.

1.3. Спектр совместимых растворимых веществ.

ГЛАВА 2. Биосинтез эктоипа и гидроксиэктоина.

2.1. Гены и ферменты биосинтез эктоина и гидроксиэктоина.

2.2. Регуляция биосинтеза эктоина.

ГЛАВА 3. MarR-семейство транскрипционных регуляторов.

3.1. Транскрипционные регуляторы MarR-семейства.

3.1.1. Регуляторы ответа на стресс и факторов вирулентности.

3.1.2. Регуляторы генов катаболизма ароматических соединений.

3.2. Структурная организация белков семейства MarR.

3.3. Механизм транскрипционного контроля экспрессии генов белками MarR-семейства.

ГЛАВА 4. Осмоадаптация аэробных метилотрофных бактерий.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. Материалы и методы исследования.

5.1. Культивирование бактерий.

5.2. Выделение геномной ДНК.

5.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

5.4. Очистка фрагментов ДНК.

5.5. Лигирование фрагментов ДНК.

5.6. Получение компетентных клеток и их трансформация.

5.7. Выделение плазмид из рекомбинантных клонов.

5.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и создание праймеров.

5.9. Определение и анализ последовательностей нуклеотидов.

5.10. Клонирование и экспрессия генов ectA и ectR.

5.11. Очистка и определение молекулярной массы рекомбинантных белков.

5.12. Определение активности и характеристика ДАБ-ацетилтрансфераз.

5.13. Делеция гена ectR у метанотрофа Methylomicvobium alcaliphilum 20Z.

5.14. Выделение РНК.

5.15. Метод удлинения праймера.

5.16. Анализ образования комплексов EctR - ДНК методом задержки в геле.

5.17. Защита ДНК белком от воздействия ДНКазы 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 6. Очистка и первичная характеристика рекомбинантных

ДАБ-ацетилтрансфераз метилотрофных бактерий.

ГЛАВА 7. Идентификация и определение функциональной активности генов ectR метилотрофных бактерий.

7.1. Идентификация генов ectR у метилотрофных бактерий.

7.2. Определение функциональной активности белка EctR Methylomicrobium alcaliphilum 20Z.

ГЛАВА 8. Определение стартовых точек транскрипции ес.7-оперона и гена ectR у Methylomicrobium alcaliphilum 20Z и Methylophaga thalassica.

8.1. Определение стартовой точки транскрипции ес/-оперона.

8.2. Определение стартовой точки транскрипции генов ectR.

ГЛАВА 9. Очистка и характеристика транскрипционных регуляторов EctR метилотрофных бактерий.

9.1. Сравнительный анализ белков EctR галофильных бактерий.

9.2. Очистка и первичная характеристика транскрипционных регуляторов EctR из Methylomicrobium alcaliphilum 20Z и Methylophaga thalassica.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляторные аспекты биосинтеза эктоина у аэробных метилотрофных бактерий"

Актуальность проблемы. Рост галофильных и галотолерантных микроорганизмов при повышенных концентрациях NaCl в среде сопровождается накоплением в клетках органических осмопротекторов в концентрациях, уравновешивающих внешнее осмотическое давление. Из (гипер)соленых и щелочных водоемов выделены галофильные и галотолерантные аэробные метилотрофы (Khmelenina et al., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001; Doronina et al., 2003), использующие в качестве источников углерода и энергии метан (метанотрофы) или его окисленные и замещенные производные (метилобактерии). Установлено, что облигатный метанотроф Methylomicrobium alcaliphilum 20Z и метилобактерии Methylophaga thai ass ic а и Methylophaga alcalica при росте на среде с повышенной концентрацией NaCl синтезируют циклическую иминокислоту - эктоин (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидин карбоксилат) в качестве основного осмопротектора (Khmelenina et al., 1999; Doronina et al., 2003). Детальное изучение регуляции биосинтеза эктоина галофильными бактериями обусловлено практическими задачами получения эктоина — полифункционального биопротектора, перспективного для использования в медицине и косметике, а также в научной практике в качестве водоудерживающего средства и стабилизатора биомолекул и целых клеток.

Биосинтез эктоина у галофильных бактерий начинается реакцией трансаминирования L-аспартилполуальдегида с последующим ацегилированием образующегося Ь-2,4-диаминобутирата (ДАБ) и завершается циклизацией А-ацетил-L-2,4-ДАБ в эктоин (Galinski, 1995). Эти реакции катализируются специфическими ферментами - ДАБ-ацетилтрансферазой (EctA), ДАБ-аминотрансферазой (EctB) и эктоинсинтазой (EctC). Недавно было показано, что у Mm. alcaliphilum 20Z, М. alcalica, М. thalassica последовательность реакций биосинтеза эктоина идентична таковой у галофильных гетеротрофов, а гены, кодирующие ферменты биосинтеза эктоина, сцеплены в ectABCask оперон, с дополнительным геном аспартаткиназы (ask) (Решетников и др., 2006).

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить и охарактеризовать рекомбинантные ДАБ-ацетилтрапсферазы (EctA) из метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z и метилобактерий М. alcalica и М. thalassica.

2. Определить нуклеотидные последовательности генов ectR, кодирующих предполагаемые транскрипциоиные регуляторы ectABCask оперонов у Mm. alcaliphilum 20Z, М. alcalica и М. thalassica.

3. Определить промоторные области ectABCask оперонов и генов ectR у Mm. alcaliphilum 20Z и М. thalassica.

4. Выделить и охарактеризовать предполагаемые транскрипционные белки-регуляторы EctR из Mm. alcaliphilum 20Z и М. thalassica.

Впервые установлено, что регуляция биосинтеза эктоина у изучаемых метилотрофных бактерий происходит на уровне транскрипции ectABCask оперона. Определено, что оперон ectABCask у Mm. alcaliphilum 20Z и М. thalassica транскрибируется с двух промоторов (Р1 и Р2).

Выше ect-оперона обнаружены гены (ectR), кодирующие белки, гомологичные белкам-регуляторам семейства MarR. Получены и охарактеризованы гомогенные препараты белков EctR, показана их способность обратимо связываться с Р1 промоторной областью ес^-опсрона в пределах предполагаемой -10 последовательности. Уровень экспрессии с промотора Р1 регулируется белком EctR и увеличивается в условиях высокой осмолярности среды, тогда как с промотора Р2 осуществляется низкая конститутивная экспрессия генов биосинтеза эктоина, не регулируемая продуктом гена ectR.

Найдено, что у Mm. alcaliphilum 20Z, в отличие от М. thalassica, транскрипция гена ectR осуществляется с единственного промотора Pr, расположенного между промоторами

PI и P2 ес^-оперона. Предполагается, что транскрипция гена ectR у Mm. alcaliphilum 20Z контролируется собственным продуктом, т.е. EctR является ауторегулятором.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 7 тезисов.

Благодарности. Автор благодарен сотрудникам УРАН ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению и написанию данной диссертационной работы: д.б.н. Дорониной Н.В., к.х.н. Шляпникову М.Г., к.б.н. Ивашиной Т.В., к.б.н. Захаровой М.В., ст.лаб. Вотевой Г.В., а также сотрудникам УРАН ИБ РАН к.б.н. Ксензеко В.Н. и Глухову А.С. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям - д.б.н., проф. Троценко Ю.А., д.б.н. Хмелениной В.Н. и к.б.н. Решетникову А.С.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 96 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 199 ссылкок, содержит 4 таблицы и 29 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мустахимов, Ильдар Ильдусович

выводы

1. Очищены и охарактеризованы рекомбинантные ДАБ-ацетилтрансферазы из Mm. alcaliphilum 20Z, М. alcalica и М. thalassica. Показано, что свойства ДАБ-ацетилтрансфераз коррелируют с экофизиологическими особенностями метилотрофных бактерий. Активность фермента из нейтрофила М. thalassica ингибируется карбонат-ионами, у Mm. alcaliphilum 20Z, в отличие от М. alcalica и М. thalassica, стимулируется в присутствии 0,3 М КС1 и NaCl.

2. Обнаружено, что оперон ectABCask Mm. alcaliphilum 20Z и М. thalassica транскрибируется с осморегулируемого Р1 и конститутивного Р2 промоторов. У данных метилотрофных бактерий предполагаемые -10 и -35 последовательности промотора Р1 идентичны.

3. Выше ectABCask оперона у Mm. alcaliphilum 20Z, М. alcalica и М. thalassica расположен ген ectR, кодирующий белок, проявляющий гомологию с регуляторными белками MarR-семейства. Открытые рамки считывания, гомологичные генам ectR, обнаружены у ряда галофильных гетеро- и автотрофных бактерий.

4. Впервые показано, что EctR Mm. alcaliphilum 20Z является транскрипционным репрессором, блокирующим экспрессию оперона ectABCask посредством связывания с предполагаемой -10 последовательностью промотора Р1.

5. Последовательности, аналогичные сайту связывания белка EctR Mm. alcaliphilum 20Z, обнаружены у М. thalassica, М. alcalica, Reinekea sp. и Oceanohacter sp., что свидетельствует об участии белка EctR в регуляции транскрипции генов биосинтеза эктоина у данных галофильных бактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Регуляторы эктоинового оперона галофильных бактерий относятся к MarR-семейству транскрипционных регуляторов и формируют на филогенетическом дереве отдельный кластер. Белки EctR имеют более высокую идентичность предполагаемых ДНК-связываюгцих НТН мотивов, по сравнению с НТН мотивами у регуляторов MarR-семейства. Следовательно, белки EctR галофильных бактерий образуют обособленное подсемейство транскрипционных регуляторов. Несмотря на низкую идентичность аминокислотных последовательностей, транскрипционные регуляторы MarR-семейства и EctR имеют близкую пространственную структуру и участвуют в контроле процессов, связанных с адаптацией бактерий к неблагоприятным факторам внешней среды.

Полученные результаты позволили приблизиться к пониманию того, каким образом происходило приобретение метилотрофами способности синтезировать эктоин. Высокая гомология и организация ес/-генов, наличие гомологичных генов ectR, кодирующих транскрипционные репрессоры, одинаковая организация промоторных областей ес/-оперонов, содержащих сайты связывания для белков EctR у таксономически далеких групп прокариот, включая метанотрофов и метилобактерий, свидетельствуют о горизонтальном переносе генов биосинтеза эктоина от общего для данных микроорганизмов "донора".

Осмоадаптация гало(алкало)фильных метилотрофов, кроме синтеза осмопротекторов (эктоина, глутамата и сахарозы), включает существенные структурно-функциональные изменения (Khmelenina et al., 1999). В настоящий момент не представляется возможным описать весь регуляторный каскад, начиная от восприятия клеткой сигналов об изменениях осмотических условий и заканчивая структурно-функциональными перестройками. Предложенная модель транскрипционной регуляции биосинтеза эктоина является первым этапом в исследовании механизмов, составляющих суть феномена бактериальной осмоадаптации. В дальнейшем предстоит выяснить природу первичного сигнала, определить осмосенсоры и механизмы передачи сигнала с клеточной мембраны на транскрипционые регуляторы EctR. Наконец, крайне важно определить другие осморегулируемые гены, а также выявить связи между системами ответа на различные стресс-факторы (такие как температура, осмолярность, рН и др.), что позволит понять и расшифровать сложный механизм адаптации бактерий к изменяющимся условиям окружающей среды.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мустахимов, Ильдар Ильдусович, Пущино

1. Андреищева Е.Н., Звягильская Р.А. (1999) Адаптация дрожжей к солевому стрессу. // Прикладная биохимия и микробиология. 35(3):243-256.

2. Гальченко В.Ф., Абрамочкина Ф.Н., Безрукова Л.В., Соколов Е.Н., Иванов М.В. (1988) Видовой состав аэробной метанотрофной микрофлоры Черного моря. // Микробиология. 57(2):305-311.

3. Дарбре А. (1989) Практическая химия белка. // Москва, Изд. "Мир", с.275-285.

4. Калюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Старостина Н.Г., Баранова С.В., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. (1998) Новый умеренно галофильный метанотроф рода Methylobacter. // Микробиология. 67(4):532-539.

5. Калюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Сузина Н.Е. Лысенко A.M., Троценко Ю.А. (1999) Новые метанотрофные изоляты из щелочных озер Южного Забайкалья. // Микробиология. 68(5):689-697.

6. Кашнер Д. (1981) Жизнь микробов в экстремальных условиях // Москва, Изд. "Мир", 520с.

7. Решетников А.С. (2006) Синтез эктоина аэробными метилотрофными бактериями: биохимические и генетические аспекты. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. ИБФМ РАН, Пущино.

8. Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. (2002) Особенности биологии и осмоадаптации галоалкалофильных метанотрофов. // Микробиология. 71(1): 149-159.

9. Хмеленина В.Н., Старостина Н.Г., Цветкова М.Г., Соколов А.П., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. (1996) Метанотрофные бактерии соленых водоемов Украины и Тувы. //Микробиология. 65(5):696-703.

10. Alekshun M.N. and Levy S.B. (1997) Regulation of chromosomally mediated multiple antibiotic resistance: the mar regulon. // Antimicrob. Agents Chemother. 41:2067-2075.

11. Alekshun M.N., Levy S.B., Mealy T.R., Seaton B.A. and Head J.F. (2001) The crystal structure of MarR, a regulator of multiple antibiotic resistance, at 2.3 A resolution. // Nature Struct. Biol. 8:710-714.

12. Bayles D.O. and Wilkinson B.J. (2000) Osmoprotectants and cryoprotectants for Listeria monocytogenes. II Letters Appl. Microbiol. 30:23-27

13. Bernard Т., Jebbar M„ Rassouli Y., Himidi-Kabbab S., Hamelin J., and Blanco C. (1993) Ectoine accumulation and osmotic regulation in Brevibacterium linens. // J. Gen. Microbiol. 139(1):129-136.

14. Bestvater T. and Galinski E.A. (2002) Investigation into a stress-inducible promoter region from Mcirinococcus halophilus using green fluorescent protein. // Extremophiles 6(1): 1520.

15. Boch J., Kempf В., and Bremer E. (1996) Synthesis of osmoprotectant glycine betaine in Bacillus subtilis: characterization of the gbsAB genes. // J. Bacteriol. 178(17):5121-5129.

16. Bordelon Т., Wilkinson S.P., Grove A., and Newcomer M.E. (2006) The crystal structure of the transcriptional regulator HucR from Deinococcus radiodurans reveals a repressor preconfigured for DNA binding. // J. Mol. Biol. 360:168-177.

17. Brown A.D. (1976) Microbial water stress. // Bacteriol. Rev. 40(4):803-846.

18. Buenger J. and Driller И. (2004) Ectoin: an effective natural substance to prevent UVA-induced premature photoaging. // Skin Pharmacol Physiol. 17(5):232-237.

19. Bursy J., Pierik A.J., PicaN., and Bi-emer E. (2007) Osmotically induced synthesis of the compatible solute hydroxyectoine is mediated by an evolutionarily conserved ectoine hydroxylase. //J. Biol. Chem. 282(43):31147-31155.

20. Canovas D., Borges N., Vargas C., Ventosa A., Nieto J.J., and Santos H. (1999) Role of A,r/-acetyldiaminobutyrate as an enzyme stabilizer and an intermediate in the biosynthesis of hydroxyectoine. // Appl. Environ. Microbiol. 65(9):3774-3779.

21. Caumette P., Cohen Y., and Matheron R. (1991) Isolation and characterization of Desulfovibrio halophilus sp. nov., a halophilic sulfate-reducing bacterium isolated from Solar Lake (Sinai). // Syst. Appl. Microbiol. 14:33-38.

22. Chomczynski P. and Sacchi N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal. Biochem. 162(1): 156-159

23. Cohen S.P., Haechler H., and Levy S. B. (1993). Genetic and functional analysis of the multiple antibiotic resistance {mar) locus in Escherichia coli, II J. Bacterid. 175:484-492.

24. Cohen S.P., Levy S.B., Foulds J., and Rosner J.L. (1993) Salicylate induction of antibiotic resistance in Escherichia coli: activation of the mar operon and a mar-independent pathway.// J. Bacteriol. 175(24):7856-62.

25. Desmarais D., Jablonski P.G., Fedarko N.S., and Roberts M.I. (1997) 2-sulfotrehalose, a novel osmolyte in haloalkaliphilic archaea. // J. Bacteriol. 179(10):3146-3153.

26. Desplats P., Folco E., and Salerno G.L. (2005) Sucrose may play an additional role to that of an osmolyte in Synechocystis sp. PCC 6803 salt-shocked cells. // Plant Physiol. Biochem. 43:133-138

27. Egland P.G. and Harwood C.S. (1999) BadR, a new MarR family member, regulates anaerobic benzoate degradation by Rhodopseudomonas palustris in concert with AadR, an Fnr family member. // J. Bacteriol. 181:2102-2109.

28. Empadinhas N., Albuquerque L., Costa J., Zinder S.H., Santos M.A.S., Santos H., and da Costa M.S. (2004) A gene from the mesophilic bacterium Dehalococcoides ethenogenes encodes a novel mannosylglycerate synthase. // J. Bacteriol. 186(13):4075-4084.

29. Evans K., Adewoye L. and Poole K. (2001) MexR repressor of the mexAB-oprM multidrug efflux operon of Pseudomonas aeruginosa: identification of MexR binding sites in the mexA-mexR intergenic region // J. Bacteriol. 183(3):807-812.

30. Felsenstein J. (2004) PHYLIP: Phylogeny inference Package Version 3.6.: University of Washington, Seattle.

31. Frings E., Kunte H. J., and Galinski E.A. (1993) Compatible solutes in representative of the genera Brevibacterium and Corynebacterium: occurrence of tetrahydropyrimidines and glutamine. // FEMS Microbiol. Lett. 109(l):25-32.

32. Fuangthong M. and Helmann J.D. (2002). The OhrR repressor senses organic hydroperoxides by reversible formation of a cysteine-sulfenic acid derivative. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6690-6695.

33. Fuangthong M., Atichartpongkul S., Mongkolsuk S. and Helmann J. D. (2001) OhrR is a repressor of ohrA, a key organic hydroperoxide resistance determinant in Bacillus subtilis.// J. Bacteriol. 183:4134-4141.

34. Gajiwala K.S. and Burley S.K. (2000) Winged helix proteins. // Curr. Opin. Struct. Biol. 10:110-116.

35. Galan В., Kolb A., Sanz J.M., Garcia J.L., and Prieto M.A. (2003) Molecular determinants of the hpa regulatory system of Escherichia coli: the HpaR repressor. // Nucleic Acids Res. 31:6598-6609.

36. Galinski E.A. (1995) Osmoadaptation in bacteria. // Adv. Microb. Physiol. 37:273-328.

37. Galinski E.A. and Truper H.G. (1994) Microbial behaviour in salt-stressed ecosystems. // FEMS Microbiol. Rev. 15(2-3):95-108.

38. Galinski E.A., Pfeiffer H.P., and Truper H.G. (1985) l,4,5,6,-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylie acid, a novel cyclic acid from halophilic phototrophic bacteria of the genus Ectothiorhodospira. // Eur.J.Biochem. 149(1):135-139.

39. Gilboa H., Kogut M., Chalamish S., Regev R, Avi-Dor Y., and Russell NJ. (1991) Use of

40. Na nuclear magnetic resonance spectroscopy to determine the true intracellular concentration of free sodium in a halophilic cubacterium. // J. Bacteriol. 173(21):7021-7023.

41. Gon9alves L.G., Huber R. da Costa M.S., and Santos H. (2003). A variant of the hyperthermophile Archaeoglobus fulgidus adapted to grow at high salinity. // FEMS Microbiol. Lett. 218:239-244.

42. Goude R., Renaud S., Bonnassie S., Bernard Т., and Blanco C. (2004) Glutamine, glutamate, and alpha-glucosylglycerate are the major osmotic solutes accumulated by Erwinia chrysanthemi strain 3937. // Appl. Environ. Microbiol. 70(11):6535-6541.

43. Gouesbet G., Blaca C., Hamelin J., and Bernard T. (1992) Osmotic adjustment in Bevibacterium ammoniagenes: pipecolic acid accumulation at elevated osmolalities. // J. Gen. Microbiol. 138:959-965.

44. Gouffi К., Bernard G., and Blanco C. (2000) Osmoprotection by pipecolic acid in Sinorhizobium meliloti-. specific effects of D and L isomers. // Appl. Environ. Microbiol. 66(6):2358-2364.

45. Grant W.D. (2004) Life at low water activity. // Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 359:12491267.

46. Hanson R.S. and Hanson Т.Е. (1996) Methanotrophic bacteria. // Microbiol. Rev. 60(2):439-471.

47. Heermann R. and Jung K. (2004) Structural features and mechanisms for sensing high osmolarity in microorganisms. // Curr. Opin. Microbiol. 7(2): 168-174.

48. Helmann J.D. (1995) Compilation and analysis of Bacillus subtilis oA-dependent promoter sequences: evidence for extended contact between RNA polymerase and upstream promoter DNA. //Nucleic Acids Res. 23:2351-2360

49. Hershkovitz N., Oren A., and Cohen Y. (1991) Accumulation of trehalose and sucrose in cyanobacteria exposed to matric water stress. // Appl. Environ. Microbiol. 57(3):645-648.

50. Holtmann G., Bakker E.P., Uozumi N. and Bremer E. (2003) KtrAB and KtrCD: two K+ uptake in Bacillus subtilis and their role in adaptation to hypertonicity. // J. Bacteriol. 185(4): 1289-1298.

51. Hong M., Fuangthong M., Helmann J. D., and Brennan R.G. (2005). Structure of an OhrR-ohrA operator complex reveals the DNA binding mechanism of the MarR family. // Mol. Cell. 20:131-141

52. Ikai H. and Yamamoto S. (1997) Identification and analysis of a gene encoding L-2,4-diaminobutyrate: 2-ketoglutarate 4-aminotransferase involved in 1,3-diaminopropane production pathway in Acinetobacter baumannii. II J. Bacteriol. 179(16):5118-5125.

53. Imhoff J.E. (1986) Osmoregulation and compatible solutes in eubacteria. // FEMS Microbiol. Rev. 39(l-2):57-66.

54. Janvier M., Frehel C., Grimont F., and Gasser F. (1985) Methylophaga marina gen. nov., sp. nov. and Methylophaga thalassica sp. nov., marine methylotrophs. // Int. J. Syst. Bacteriol. 35:131-139.

55. Jebbar M., Champion С., Blanco С., and Bonnassie S. (1998) Carnitine acts as a compatible solute in Brevibacterium linens. II Res. Microbiol. 140(3):211-219.

56. Jebbar M., Talibart R., Gloux K., Bernard Т., and Blanco C. (1992) Osmoprotection of Escherichia coli by ectoine: uptake and accumulation characteristics. // J. Bacteriol. 174(15):5027-5035.

57. Jones, D.T. (1999) Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices. J. Mol. Biol. 292: 195-202.

58. Kaatz G.W., DeMarco C.E. and Seo S.M. (2006) MepR, a repressor of the Staphylococcus aureus MATE family multidrug efflux pump MepA, is a substrate-responsive regulatory protein// Antimicrob. Agents Chemother. 50(4): 1276-1281.

59. Kawano M., Abuki R., Igarashi K. and Kakinuma Y. (2000) Evidence for Na+ influx via the NtpJ protein of the Ktrll K+ uptake system in Enterococcus hirae. // J. Bacteriol. 182(9):2507-2512.

60. Kawano M., Igarashi K., and Kakinuma Y. (1999) Two major potassium uptake systems, Ktrl and Ktrll, in Enterococcus hirae. IIFEMS Microbiol.Lett. 176(2):449-453.

61. Kempf B. and Bremer E. (1995) OpuA, an osmotically regulated binding protein-dependent transport system for the osmoprotectant glycine betaine in Bacillus subtilis. 11 J. Biol. Chem. 270(28):16701-16713.

62. Kempf B. and Bremer E. (1998) Uptake and synthesis of compatible solutes as microbial stress responses to high-osmolality environments. // Arch. Microbiol. 170 (5):319-330.

63. Kenney L.J. (2002) Structure/function relationships in OmpR and other winged-helix transcription factors. // Curr. Opin. Microbiol. 5:135-141.

64. Kets E.P.W., Galinski E.A., de Wit M., de Bon J.A., and Heipieper H.J. (1996) Mannitol, a novel bacterial compatible solute in Pseudomonas putida SI2. // J. Bacteriol. 178(23):6665-6670.

65. Khmelenina V.N, Kalyuzhnaya M.G., Sakharovsky V.G., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., and Gottschalk G. (1999) Osmoadaptation in halophilic and alkaliphilic methanotrophs. // Arch. Microbiol. 172(5):321-329.

66. Kraegeloh A. and Kunte H.J. (2002) Novel insights into the role of potassium for osmoregulation in Halomonas elongata. II Extremophiles 6:453-62.

67. Kuhlmann A.U. and Bremer E. (2002) Osmotically regulated synthesis of the compatible solute ectoine in Bacillus pasteurii and related Bacillus spp. // Appl. Environ. Microbiol. 68(2):772-783.

68. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 227(5259):680-685.

69. Lai M.-C, Sowers K.R., Robertson D.E., Roberts M.F., and Gunsalus R.P. (1991) Distribution of compatible solutes in halophilic methanogenic archaebacteria. // J. Bacteriol. 173(17):5352-5358.

70. Lamosa P., Martins L. O., da Costa M. S., and Santos H. (1998) Effects of temperature, salinity and medium composition on compatible solute accumulation by Thermococcus spp. //Appl. Environ. Microbiol. 64:3591-3598.

71. Lee E.-H., Rouquette-Loughlin C., Folster J.P., and Shafer W.M. (2003) FarR regulates the farAB-encoded efflux pump of Neisseria gonorrhoeae via an MtrR regulatory mechanism. //J. Bacteriol. 185:7145-7152.

72. Lim D., Poole K., and Strynadka N.C. (2002) Crystal structure of the mexR repressor of the mexRAB-oprM multidrug efflux operon of Pseudomonas aeruginosa. II J. Biol. Chem. 277:29253-29259.

73. Lomovskaya O., Lewis K., and Matin A. (1995) EmrR is a negative regulator of the Escherichia coli multidrug resistance pump EmrAB. // J. Bacteriol. 177:2328-2334.

74. Loomis W.F., Kuspa A., and Shaulsky G. (1998) Two component signal transduction systems in eukaryotic microorganisms. // Curr. Opin. Microbiol. 1:643-648.

75. Louis P. and Galinski E.A. (1997) Characterization of genes for the biosynthesis of the compatible solute ectoine from Marinococcus halophilus and osmoregulated expression in Escherichia coli. //Microbiology (UK) 143(4):1141-1149.

76. Machado M.C., Lopez C.S., Heras H., and Rivasa E.A. (2004) Osmotic response in Lactobacillus casei ATCC 393: biochemical and biophysical characteristics of membrane. // Arch, of Biochem. Biophys. 422:61-70.

77. Mackay M.A., Norton R.S., and Borowitzka L.J. (1984) Organic osmoregulatory solutes in cyanobacteria. //J. Gen. Microbiol. 130:2177-2191.

78. Malm G. and Lapidot A. (1996) Induction of synthesis tetrahydropyrimidine derivatives in Streptomyces strain and their effect on Escherichia coli in response to osmotic and heat stress.//J. Bacteriol. 17S(2):385-395.

79. Martin D.D., Ciulla R.A., and Roberts M.F. (1999) Osmoadaptation in archaea. // Appl. Environ. Microbiol. 65(5):1815-1825.

80. Martin R.G. and Rosner J.L. (1995) Binding of purified multiple antibiotic resistance repressor protein (MarR) to mar operator sequences. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5456-5460.

81. Martin R.G. and Rosner J.L. (2004) Transcriptional and translational regulation of the marRAB multiple antibiotic resistance operon in Escherichia coli. II J. Mol. Microbiol. 53:183-191.

82. Martins L.O. and Santos H. (1995) Accumulation of mannosylglycerate and di-myo-inositol-phosphate by pyrococcus furiosus in response to salinity and temperature // Appl. Environ. Microbiol. 61:3299-3303.

83. Martins L.O., Carreto L.S., da Costa M.S., and Santos H. (1996) New compatible solutes related to di-myo-inositol-phosphate in members of the order Thermotogales.il J. Bacteriol. 178:5644-5651.

84. Martins L.O., Huber R., Huber H., Stetter K.O., da Costa M. S., and Santos H. (1997) Organic solutes in hyperthermophilic Archaea И Appl. Environ. Microbiol. 63:896-902.

85. Marx C.J. and M.E. Lidstrom (2002) Broad-host-range cre-lox system for antibiotic marker recycling in gram-negative bacteria // Biotechniques. 33: 1062-7

86. Mattison K. and Kenney L. (2002) Phosphorylation alters the interaction of the response regulator OmpR with its sensor kinase EnvZ. // J. Biol. Chem. 277:11143-11148.

87. McLaggan D., Naprstek J., Buurman E.T., and Epstein W. (1994) Interdependence of K+ and glutamate accumulation during osmotic adaptation of Escherichia coli. II J. Biol. Chem. 269(3):1911-1917.

88. Murrell J.C., McDonald I.R., and Gilbert B. (2000) Regulation of expression of methane monooxygenases by copper ions. // Trends Microbiol. 8:221-225.

89. Nagata S., Adachi K., and Sano H. (1996) NMR analyses of compatible solutes in a halotolerant Brevibacterium sp. // Microbiology (UK) 142:3355-3362.

90. Nagata S., Adachi K., and Sano H. (1998) Intracellular changes in ions and organic solutes in halotolerant Brevibacterium sp. strain JCM 6894 after exposure to hyperosmotic shock // Appl. Environ. Microbiol. 64:3641-3647.

91. Nagata S., Adachi K., Shirai K. and Sano H. (1995) 23Na NMR spectroscopy of free Na+ in the halotolerant bacterium Brevibacterium sp. and Escherichia coli. II Microbiolology (UK) 141(3):729-736.

92. Nakamura Т., Yamamuro N., Stumpc S., Unemomoto Т., and Bakker E.P. (1998) Cloning of the trkA II gene cluster and characterization of the Trk K-uptake system of Vibrio alginolyticus. //Microbiology (UK) 144(8):2281-2289.

93. Neves C., da Costa M. S., and Santos H. (2005) Compatible solutes of the hyperthermophile Palaeococcus ferrophilus: osmoadaptation and thermoadaptation in the order Thermococcales. // Appl. Environ. Microbiol. 71:8091-8098.

94. Nunes O.C., Manaia C.M., da Costa M.S., and Santos H. (1995) Compatible solutes in the thermophilic bacteria Rhodothermus marinus and Therrnus thermophilus.il Appl. Environ. Microbiol. 61:2351-2357.

95. Nyyssola A., Kerovuo J., Kaukinen P., von Weymarn N. and Reinikainen T. (2000) Extreme halophiles synthesize betaine glycine by methylation. // J. Biol. Chem. 275(29):22196-22201.

96. Onraedt A., De Muynck C., Walcarius В., Soetaert W., and Vandamme E. (2004) Ectoine accumulation in Brevibacterium epidermis. // Biotechnol. Lett. 26:1481-1485.

97. Oren A. (1999) Bioenergetic aspects of halophilism. 11 Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63(2):334-348.

98. Oscarsson J., Mizunoe Y., Uhlin B.E., and Haydon D.J. (1996) Induction of haemolytic activity in Escherichia coli by the slyA gene product. // Mol. Microbiol. 20:191-199.

99. Page-Sharp M., Behm C.A., and Smith G.D. (1999) Involvement of the compatible solutes trehalose and sucrose in the response to salt stress of a cyanobacterial Scytonema species isolated from desert soils. // Biochem. Biophys. Acta. 1472(3):519-528.

100. Park H.S. and Kim H.S. (2001) Genetic and structural organization of the aminophenol catabolic operon and its implication for evolutionary process // J. Bacteriol. 183:50745081.

101. Perego M. and Hoch J.A. (1988) Sequence analysis and regulation of the hpr locus, a regulatory gene for protease production and sporulation in Bacillus subtilis. II J. Bacteriol. 170:2560-2567.

102. Peters R., Galinski E.A. and Truper H.G. (1990) The biosynthesis of ectoine. // FEMS Microbiol. Lett. 71(1-2):157-162.

103. Pflughoeft K.J., Kierek K., and Watnick P.I. (2003) Role of ectoine in Vibrio cholerae osmoadaptation//Appl. Environ. Microbiol. 69(10):5919-5927.

104. Poolman B. and Glaasker E. (1998) Regulation of compatible solutes accumulation in bacteria. // Mol. Microbiol. 29(2):397-407.

105. Poolman В., Blount P., Folgering J.H., Friescn R.H., Мое P.С., and van der Heide T. (2002) How do membrane proteins sense water stress? // Mol. Microbiol. 44(4):889-902.

106. Prabhu J., Schauwecker F., Grammel N., Keller U., and Bernhard M. (2004) Functional expression of the ectoine hydroxylase gene (thpD) from Streptomyces chrysomallus in Halomonas elongata. // Appl. Environ. Microbiol. 70(5):3130-3132.

107. Praillet Т., Reverchon S., and Nasser W. (1997) Mutual control of the PecS/PecM couple, two proteins regulating virulence-factor synthesis in Erwinia chrysanthemi. // Mol. Microbiol. 24:803-814.

108. Pratt L.A. and Silhavy T.J. (1996) From acids to osmZ: multiple factor influence synthesis of the OmpF and OmpC porins in Escherichia coli. II Mol. Microbiol. 20:911-917.

109. Prieto M.A. and Garcia J.L. (1997) Identifcation of a novel positive regulator of the 4-hydroxyphenylacetate catabolic pathway of Escherichia coli. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 232:759-765.

110. Prieto M.A., Diaz E., and Garcia J.L. (1996) Molecular characterization of the 4-hydroxyphenylacetate catabolic pathway of Escherichia coli W: engineering a mobile aromatic degradative cluster. // J. Bacteriol. 178:111-120.

111. Providenti M.A. and Wyndham R.C. (2001) Identification and functional characterization of CbaR, a MarR-like modulator of the сЬа/ШС-encoded chlorobenzoate catabolism pathway. // Appl. Environ. Microbiol. 67(8):3530-3541.

112. Rao D.R., Hariharan K., and Vijayalakshmi K. R. (1969) A study of the metabolism of L-ay-diaminobutyric acid in a.Xanthomonas species. //J. Biochem. 114(1): 107-115.

113. Reed R.H., Borowitzka L.J. Maekay M.A., Chudek J.A., Foster R., Warr S.R.C., Moore D.J., and Stewart W.D.P. (1986) Organic solute accumulation in osmotically stressed cyanobacteria. // FEMS Microbiol. Rev. 39(l-2):51-56.

114. Reed R.H., Richardson D.L., Warr S.R.C., and Stewart W.D.P. (1984) Carbohydrate accumulation and osmotic stress in cyanobacteria. // J. Gen. Microbiol. 130:1-4.

115. Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., and Trotsenko Y.A. (2006) Characterization of the ectoine biosynthesis genes of haloalkalotolerant obligate methanotroph "Methylomicrobium aIcaliphilum20Z''// Arch. Microbiol. 184:286-297

116. Reverchon S., Nasser W., and Robert-Baudouy J. (1994). pecS: a locus controlling pectinase, cellulase and blue pigment production in Erwinia chrysanthemi.il Mol. Microbiol 11:1127-1139.

117. Reverchon S., Rouanet C., Expert D., and Nasser W. (2002) Characterization of indigoidine biosynthetic genes in Erwinia chrysanthemi and role of this blue pigment in pathogenicity. IIS. Bacterid. 184:654-665.

118. Rezuchova B. and Kormanec J. (2001) A two-plasmid system for identification of promoters recognized by RNA polymerase containing extracytoplasmic stress response sigma(E) in Escherichia coli I I J. Microbiol. Methods 45:103-111

119. Roberts M.F. (2004) Osmoadaptation and osmoregulation in archaea: update. // Front. Biosci. 9:1999-2019.

120. Roberts M.F. (2005) Organic compatible solutes of halotolerant and halophilic microorganisms.// Saline Systems. VI:5.

121. Romeo Y., Bouver J., and Gutierrez C. (2007) Osmotic regulation of transcription in Lactococcus lactis: ionic strength-dependent binding of the BusR repressor to the busA promoter. //FEBS Lett. 581:3387-3390.

122. Roper D.I., Fawcett Т., and Cooper R.A. (1993). The Escherichia coli С homoprotocatechuate degradative operon: hpc gene order, direction of transcription and control of expression. // Mol. Gen. Genet. 237:241-250.

123. Ross W., Gosink K.K., Salomon J., Igarashi K., Zou C., Ishihama A., Severinov K., and Course R.L. (1993) A third recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the a-subunit of RNA polymerase. // Science 262:1407-1412.

124. Rouaxiet С., Nomura К., Tsuyumu S., and Nasser W. (1999) Regulation of pelD and pelE, encoding major alkaline pectate lyases in Erwinia clvysanthemi: involvement of the main transcriptional factors. // J. Bacteriol. 181:5948-5957.

125. Saito K., Akama II., Yoshihara E., and Nakae T. (2003). Mutations affecting DNA-binding activity of the MexR repressor of mexRmexA-mexB-oprM operon expression. // J. Bacteriol. 185:6195-6198.

126. Sambrook J. and Russell D.W. (2001) Molecular cloning: a laboratory manual. // 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NewYork

127. Santos H. and da Costa M.S. (2002) Compatible solutes of organisms that live in hot saline environments. //Environ. Microbiol. 4(9):501-509.

128. Saum S.H and Miiller V. (2008) Regulation of osmoadaptation in the moderate halophile Halobacillus halophilus: chloride, glutamate and switching osmolyte strategies. // Saline Systems 4:4

129. Seoane A.S. and Levy S.B. (1995) Characterization of MarR, the repressor of the multiple antibiotic resistance {mar) operone in Escherichia coli. // J. Bacteriol. 177:3414-3419.

130. Severin J., Wohlfarth A., and Galinski E.A. (1992) The predominant role of recently discovered tetrahydropyrimidines for the osmoadaptation of halophilic eubacteria. // J. Gen. Microbiol. 138(8): 1629-1638.

131. Shi Y., Latifi Т., Cromie M.J., and Groisman E.A. (2004) Transcriptional control of the antimicrobial peptide resistance ugtL gene by the Salmonella PhoP and SlyA regulatory proteins. // J. Biol. Chem. 279:38618-38625.

132. Sieburth J.N., Johnson P.W., Eberhardt M.A., Sieracki M.E., Lidstrom M.E., and Laux D. (1987) The first methane-oxidizing bacterium from the upper mixing layer of the deep ocean: Methylomonaspelagica sp.nov. // Curr. Microbiol. 14(5):285-293.

133. Silva Z., Alarico S., Nobre A., Horlacher R., Marugg J., Boos W., Mingote A.I., and da Costa M.S. (2003) Osmotic adaptation of Thermus thermophilus RQ-1: lesson from a mutant deficient in synthesis of trehalose. // J. Bacteriol. 185(20):5943-5952.

134. Sleator R.D. and Hill C. (2001) Bacterial osmoadaptation: the role of osmolytes in bacterial stress and virulence. // FEMS Microbiol. Rev. 26(1):49-71.

135. Smith L.T. and Smith G.M. (1989) An osmoregulated dipeptide in stressed Rhizobium meliloti. И J. Bacteriol. 171(9):4717-4717.

136. Smith L.T., Smith G.M., and Madkour M.A. (1990) Osmoregulation in Agrobacterium tumefaciens: accumulation of a novel disaccharide is controlled by osmotic strength and glycine betaine. // J. Bacteriol. 172(12):6849-6855.

137. So-Young, Jung-Ho Shin, and Jung-Hye Roe (2007) Dual role of OhrR as a repressor and an activator in response to organic hydroperoxides in Streptomyces coelicolor. И J. Bacteriol. 189(17):6284-6292.

138. Spory A., Bosserhoff A., von Rhein C., Goebel W., and Ludwig A. (2002) Differential regulation of multiple proteins of Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium by the transcriptional regulator SlyA. // J. Bacteriol. 184:3549-3459.

139. Srikumar R., Paul C.J., and Poole K. (2000) Influence of mutations in the mexR repressor gene on expression of the MexA-MexB-oprM multidrug efflux system of Pseudomonas aeruginosa. II J. Bacteriol. 182:1410-1414.

140. Stapleton M.R. Norte V.A., Read R.C., and Green J. (2002) Interaction of the Salmonella typhimurium transcription and virulence factor SlyA with target DNA and identification of members of the SlyA regulon. // J. Biol. Chem. 277:17630-17637.

141. Strovas T. J. and M. E. Lidstrom (2009) Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AMI // Microbiology 155: 2040-2048

142. Sulavik M.C., Dazer M., and Miller P.F. (1997) The Salmonella typhimurium mar locus: molecular and genetic analyses and assessment of its role in virulence. // J. Bacteriol. 179(6): 1857-66

143. Toney M.D., Hohenester E., Keller J.W., and Jansonius N. (1995) Structural and mechanistic analysis of two refined crystal structures of the pyridoxal phosphate-dependent enzyme dialkylglycine decarboxylase. // J. Mol. Biol. 245(2):151-179.

144. Tropel D. and van der Meer J.R. (2004) Bacterial transcriptional regulators for degradation pathways of aromatic compounds. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68:474—500.

145. Trotsenko Y.A. and Khmelenina V.N. (2002) Biology of extremophilic and extremotolerant methanotrophs. //Arch. Microbiol. 177(2):123-131.

146. Triiper H.G. and Galinski E.A. (1986) Concentrated brines as habitats for microorganisms. // Experientia. 42:1182-1187.

147. Ventosa A. and Nieto J J. (1995) Biotechological applications and potentialities of halophilic microorganisms. // World J. Microbiol. Biotechnol. 1 l(l):85-94.

148. Ventosa A., Nieto J.J., and Oren A. (1998) Biology of moderately halophilic aerobic bacteria. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(2):504-544.

149. Welsh D.T. (2000) Ecological significance of compatible solute accumulation by microorganisms: from single cells to global climate. // FEMS Microbiol. Rev. 24(3):263-290.

150. Wilkinson S.P. and Grove A. (2004) HucR, a novel uric acid-responsive member of the MarR family of transcriptional regulators from Deinococcus radiodurans. II J. Biol. Chem. 279(49):51442-51450.

151. Wilkinson S.P. and Grove A. (2005) Negative cooperativity of uric acid binding to the transcriptional regulator HucR from Deinococcus radiodurans. II J. Mol. Biol. 350:617— 630.

152. Wilkinson S.P. and Grove A. (2006) Ligand-responsive transcriptional regulation by members of the MarR family of winged helix proteins. // Curr. Issues Mol. Biol. 8(1):51-62.

153. Wohlfarth A., Severin J., and Galinski E.A. (1990) The spectrum of compatible solutes in heterotrophic halophilic eubacteria of the family Halomonadaceae. II J. Gen. Microbiol. 136:705-712.

154. Wood J.M. (1999) Osmosensing by bacteria: signals and membrane-based sensors // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63(l):230-262.

155. Wood J.M., Bremer E., Csonka L.N., Kramer R., Poolman В., van der Heide Т., and Smith L.T. (2001) Osmosensing and osmoregulatory compatible solute accumulation by bacteria. // Сотр. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 130(3):437-460.

156. Wosten M.M.S.M. (1998) Eubacterial sigma-factors. // FEMS Microbiol. Rev. 22(3):127-150.

157. Wu R.Y., Zhang R.G., Zagnitko O., Dementieva I., Maltzev N., and Watson J.D. (2003). Crystal structure of Enterococcus faecalis SlyA-like transcriptional factor. // J. Biol. Chem. 278:20240-20244.

158. Xiong A., Gottman A., Park C., Baetens M., Pandza S., and Matin A. (2000) The EmrR protein represses the Escherichia coli emrRAB multidrug resistance operon by directly binding to its promoter region. // Antimicrob. Agents Chemother. 44(10):2905-2907.

159. Yancey P. H. (2005) Organic osmolytes as compatible, metabolic and counteracting cytoprotectants in high osmolarity and other stresses // The Journal of Experimental Biology 208:2819-2830

160. Zhilina T.N. and Zavarzin G.A. (1990) Extremely halophilic, methylotrophic, anaerobic bacteria. // FEMS Microbiol. Rev. 87(3-4):315-322.

Информация о работе

Мустахимов, Ильдар Ильдусович
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Регуляторные аспекты биосинтеза эктоина у аэробных метилотрофных бактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Регуляторные аспекты биосинтеза эктоина у аэробных метилотрофных бактерий ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляторные аспекты биосинтеза эктоина у аэробных метилотрофных бактерий"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мустахимов, Ильдар Ильдусович

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляторные аспекты биосинтеза эктоина у аэробных метилотрофных бактерий"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мустахимов, Ильдар Ильдусович

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мустахимов, Ильдар Ильдусович, Пущино

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляторные аспекты биосинтеза эктоина у аэробных метилотрофных бактерий
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия