Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биоразнообразие и таксономия аэробных метилобактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Доронина, Нина Васильевна, Пущино

11

1.1 ; ."> и _ ч у-'" ? : -Л ......

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

р)) /]■/ На правах рукописи

; " УДК 579.262.582.232

........../'

ДОРОНИНА НИНА ВАСИЛЬЕВНА

БИОРАЗНООБРАЗИЕ И ТАКСОНОМИЯ АЭРОБНЫХ МЕТИЛОБАКТЕРИЙ

(03.00.07 микробиология)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Пущино - 1999

'■О к/о К*л> н-А^

СОДЕРЖАНИЕ

Введение........................................................................................................................5

Актуальность темы.......................................................................................................5

Состояние вопроса, цель и задачи исследований......................................................7

Научная новизна...........................................................................................................8

Практическая значимость работы...............................................................................9

Апробация работы......................................................................................................10

Публикации.................................................................................................................11

Глава I. Объекты и методы исследования...........................................................12

1.1. Объекты исследования.........................................................................................12

1.2. Среды для культивирования................................................................................13

1.3. Выделение, поддержание и консервация метилотрофных бактерий..............15

1.4. Морфология, культуральные и физиолого-биохимические свойства.............16

1.5. Хемотаксономическая характеристика..............................................................17

1.6. Короткие экспозиции...........................................................................................19

1.7. Уровни ассимиляции углекислоты.....................................................................19

1.8. Идентификация органических осмолитов.........................................................20

1.9. Выделение и очистка препаратов ДНК..............................................................22

1.10. Определение нуклеотидного состава ДНК по температуре плавления........25

1.11. ДНК-ДНК гибридизация....................................................................................25

1.12. Биотест на цитокинины и иммуноферментный анализ..................................29

1.13. Скрининг генов метаболизма цитокининов.....................................................30

1.14. Амплификация и секвенирование гена 16S рРНК..........................................30

1.15. Получение экстрактов клеток и определение активности ферментов..........31

1.16. Полярографические измерения.........................................................................45

1.17. Состав биомассы метилобактерий....................................................................45

1.18. Другие определения...........................................................................................47

1.19. Точность и воспроизводимость измерений.....................................................49

Глава П. Выделение, поддержание и хранение чистых культур.....................50

Глава Ш. Распространение аэробных метилобактерий, их

таксономическое и метаболическое разнообразие............................55

3.1. Метилобактерии, использующие метанол........................................................55

3.2. Пути окисления метанола...................................................................................57

3.3. Метилобактерии, использующие метилированные амины.............................58

3.4. Пути окисления метилированных аминов.........................................................59

3.5. Аэробные деструкторы хлорметана...................................................................61

3.6. Аэробные деструкторы дихлорметана...............................................................64

3.7. Метилобактерии, использующие метилацетат.................................................66

3.8. Окисление формальдегида..................................................................................68

3.9. Окисление формиата...........................................................................................69

3.10. Пути ассимиляции Сгсоединений...................................................................70

3.11. Галофильные метилобактерии..........................................................................77

3.12. Особенности метаболизма галофильных метилобактерий............................78

3.13. Механизмы галоадаптации...............................................................................81

3.14. Новые данные о способности аэробных метилотрофных бактерий

синтезировать цитокинины...................................................................................88

3

Глава IV. Таксономия метилобактерий...............................................................93

4.1. Схема идентификации метилобактерий............................................................93

4.2. Метилобактерии с рибулозомонофосфатным путем........................................96

4.3. Метилобактерии с сериновым путем...............................................................103

4.4. Метилобактерии с рибулозобисфосфатным путем........................................104

4.5. Филогенетическое положение новых метилотрофных изолятов..................106

4.6. Краткое описание новых родов метилобактерий...........................................108

4.7. Атлас новых метилотрофных изолятов...........................................................111

Глава V. Аэробные метилобактерии как объекты биотехнологии...............135

5.1. Биосинтез различных продуктов на основе Ci-субстратов...........................135

5.2. Ферменты............................................................................................................141

5.3. Биодеградация токсичных соединений...........................................................142

Заключение..............................................................................................................148

Выводы......................................................................................................................149

Литература...............................................................................................................151

Введение

Актуальность темы. Аэробные метилотрофные бактерии, использующие метан (метанотрофы) и его окисленные или замещенные производные (метилобактерии) в качестве источников углерода и энергии, составляют особую физиологическую группу микроорганизмов, обладающих уникальной способностью строить все клеточные компоненты из Срсоединений. Метилотрофы окисляют природные и антропогенные Сгсоединения и таким образом участвуют в биогеохимических процессах биосферы. Недавние сообщения указывают, что практически все растения выделяют метанол (MacDonald, Fall, 1993; Fall, 1996) и, следовательно, являются глобальным источником атмосферного метанола, составляющего 40-46% от общего обнаруженного летучего органического углерода. Постулирован биогеохимический цикл метанола, в котором ключевая роль отводится метило-трофным микроорганизмам (Fall, 1996), однако связь их с растениями мало изучена. Метилированные амины образуются различными растениями, морскими животными (Троценко, Логинова, 1979) и являются промежуточными продуктами анаэробного разложения глицин-бетаина в галофильных анаэробных матах (Жилина, 1992), а также одними из продуктов сгорания бытового мусора на специализированных заводах.

Метилсернистые соединения выделяются водорослями (Kelly, Smith, 1990, deZwart, Kuenen, 1992). Галометаны биогенного и антропогенного происхождения весьма канцерогенны, мутагенны и играют отрицательную роль в разложении стратосферного озонового слоя (Dillon, Von Burg, 1995; Kirschner, 1995).

Несмотря на то, что восстановленные С ¡-соединения повсеместно распространены в природе, очевидно, только незначительная часть биоразнообразия ме-

5

тилотрофов известна и охарактеризована. Грамотрицательные метилобактерии экстремальных мест обитания вообще не изучены (Ventosa et al., 1998).

Метилобактерии, обладающие функциональным разнообразием, приобретают все большую экологическую значимость, поскольку на фоне глобального кризиса состояния окружающей среды увеличивается число местообитаний с высоким содержанием токсичных Ci-соединений.

Систематика метилобактерий - объект активной разработки. Идет процесс утверждения новых родов и видов. Актуальным остается поиск дифференцирующих тестов, разработка новых подходов в изучении родства этих культур на уровне родов и видов, новых методов детекции и ускоренной идентификации штаммов не только в чистых культурах, но и составе сообществ. В рамках методологии секве-нирования 16S рРНК проанализированы многие известные метилобактерии (Tsuji et al., 1990; Bratina et al, 1992; Janvier, Grimont, 1995), что позволяет активно использовать этот метод и созданную базу данных при идентификации и определении филогенетического положения новых изолятов.

Один из наиболее эффективных способов сохранения микроорганизмов особо важных для экоценозов и хозяйственной деятельности человека - их поддержание в микробных коллекциях, имеющих значимость для фундаментальных научных исследований и разработки новых биотехнологических производств. Таким образом, повышенный интерес к метилотрофам обусловлен их экологической ролью и перспективами использования для целей биосинтеза, биокатализа и биодеградации, что делает весьма актуальным расширение коллекций этих ценных культур и совершенствование методов их сохранения.

Состояние вопроса, цель и задачи исследований. К началу данной работы (1971г.) было известно несколько штаммов метилобактерий и созданы две коллекции метанотрофов (Whittenbury et al., 1970; Малашенко с соавт., 1971). Виттенбари с коллегами разработали первые схемы классификации метанотрофов. Встал вопрос о том, насколько широко распространена способность к метилотрофии среди различных систематических групп микроорганизмов. Представления о таксономии, физиологии метилобактерий и путях их метаболизма были фрагментарными. На основании исследований нескольких штаммов метилотрофов группой Квейла были предложены сериновый и гексулозофосфатный пути С i-ассимиляции. Значительный прогресс в исследованиях метилотрофии, достигнутый в последние два десятилетия, отражен в монографиях (Малашенко с соавт. 1978; Anthony, 1982; Галь-ченко с соавт., 1986; Large, Bamforth, 1988; Романовская с соавт., 1991; Murreil, Dalton, 1992) и трудах восьми специализированных Ci-симпозиумов.

В первых сообщениях большинство факультативных метилотрофов, использующих метанол или метиламин, но не метан, условно относили к роду Pseudomonas. В этот же род стали относить и облигатных метилобактерий. Однако из-за облигатной зависимости от Сгсубстратов данных микроорганизмов, к ним оказались неприменимыми многие классические методы бактериальной таксономии. Назрела необходимость использования новых подходов, в частности, биохимических, хемо- и геносистематики.

Многие метилотрофные культуры не удавалось поддерживать, хранить и консервировать традиционными методами. В то же время, перспективы использования метилотрофов в биотехнологии требовали поиска надежных способов их

хранения, а также разработки таксономии этой физиологической группы микроор-

ганизмов. Решение этих вопросов возможно только на основе получения разнообразных чистых культур и формирования репрезентативной коллекции с детально охарактеризованными и надежно поддерживаемыми реперными штаммами.

В связи с вышеизложенным представлялось необходимым расширить спектр детально охарактеризованных аэробных культур метилобактерий для выявления их биоразнообразия и разработки таксономии, создать надежно поддерживаемую коллекцию чистых культур и оценить биотехнологический потенциал новых изолятов. Достижение поставленной цели потребовало решения следующих основных задач:

1. Разработать и апробировать различные методы выделения, культивирования, поддержания и консервации метилотрофов.

2. Выделить чистые культуры аэробных метилобактерий из различных биотопов. Создать представительную коллекцию чистых культур аэробных метилобактерий.

3. Исследовать основные морфологические и физиолого-биохимические свойства метилотрофных изолятов.

4. Определить таксономически значимые признаки и разработать схему идентификации аэробных метилобактерий.

5. Выявить перспективные продуценты различных продуктов на основе С1-субстратов и активных биодеструкторов С1 -поллютантов.

Научная новизна. С позиций системного подхода и полифазной таксономии исследованы биоразнообразие и физиолого-биохимические особенности аэробных метилобактерий, получен ряд новых данных, расширяющих и углубляющих представления о разнообразии микробного мира в целом и биологии метилобактерий в частности.

Из различных природных биотопов выделено более 350 чистых культур аэробных грамотрицательных и грамположительных метилобактерий, характеризующихся широким спектром морфотипов и физиолого-биохимических отличий. Из мест с длительным селективным давлением метанола, хлорметана, дихлормета-на, метилацетата выделены соответствующие активные метилотрофы-деструкторы. В местах обитания с повышенным содержанием №С1 обнаружены устойчивые ме-тилотрофные сообщества. Установлено, что галофильные метилобактерии синтезируют осмопротекторы (эктоин, глутамат), обеспечивающие поддержание осмотического равновесия со средой. Обнаружено, что метилотрофы различного таксономического положения симбиотически связаны с растениями, синтезируя фитогормо-ны-цитокинины, витамины, полисахариды и потребляя С]-субстраты, образуемые растениями.

С использованием традиционных, биохимических, хемо- и геносистематиче-ских подходов разработана схема идентификации метилобактерий, предложено более 20 новых таксонов, в том числе 3 узаконенных рода - Ме1ку1огкаЬс1ш, Ме1ку-1орйа, МегкуЪагсиЫ и 19 видов. Для новых типовых культур разравотаны таксономические паспорта и метаболические карты.

Создана наиболее представительная и охарактеризованная отечественная коллекция чистых культур метилобактерий (540 штаммов).

Практическая значимость. Созданная коллекция включает практически все известные типовые культуры аэробных метилобактерий и служит базой референтных штаммов при идентификации новых изолятов, а также для проведения сравнительных физиолого-биохимических исследований и разработки систематики метилобактерий. Показано, что метилобактерии, реализующие разные пути метаболиз-

9

ма, различаются по биотехнологическим показателям: скорости роста, выходу биомассы и ее составу. Отобраны продуценты кормового белка, дегидрогеназ глутама-та, глюкозо-6-фосфата, 6-фосфоглюконата, полисахаридов, поли-(3-гидрокси-бутирата и его сополимера с валератом, витамина Bi2, каротиноидов, эктоина. Разработаны способы биодеградации метанола, формальдегида, метилированных аминов, дихлорметана и метилацетата в промвыбросах. Предложены способы хранения коллекционных и производственных штаммов метилобактерий без потери их исходных свойств.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на отечественных и международных конференциях по регуляции биохимических процессов у микроорганизмов (Пущино, 1978, 1983), Съездах Всесоюзного микробиологического общества (Ереван, 1975; Рига, 1980; Алма-Ата, 1985), IV Международной конференции по коллекциям культур (Брно, 1981), всесоюзных конференциях и школах по микробиологическому использованию С!-соединений (Пущино, 1976, 1986), международных симпозиумах "Bacterial polyhydroxyalcanoates", 1996, "Рост микроорганизмов на Ci-соединениях" (Пущино, 1977; Шеффилд, 1980; Миннеаполис, 1983; Харен, 1986; Геттинген, 1989; Уорик, 1992; Сан-Диего, 1995), "Biochemical principles and mechanisms of biosynthesis and biodégradation of polymers (Мюнстер, 1998), конференциях: "Биотехнология защиты окружающей среды" (Пущино, 1994), "Биосинтез и деградация микробных полимеров" (Пущино, 1995), Международной конференции, посвященной памяти акад. А.А. Баева (Москва, 1998), Конференции памяти акад. Е.Н. Кондратьевой "Автотрофные микроорганизмы" (Москва, 1996), международном INTAS симпозиуме "Microbial ecology and biotechnology (Москва, 1997), Евроконференции по

ю

микробной реакции на стрессы (Сесимбра, 1997), годичных научных сессиях ИБФМРАН 1991, 1993, 1995-1997г.г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 68 статей, 40 тезисов, получено 10 авторских свидетельств.

и

Глава I. Объекты и методы исследования

1.1. Объекты исследования. В работе использовано 350 чистых культур аэробных метилобактерий, выделенных из образцов растений, воды, ила и почв Подмосковья, побережья Черного и Азовского морей, Каховского водохранилища, различных районов Узбекистана, Казахстана, Польши, Финляндии, Швеции, Вьетнама, Северной Америки, активных илов Байкальского и Таллинского целлюлозно-бумажных заводов, промышленного объединения Казмеханобр (Казахстан), станции биологической очистки ПО "Карбид" (Казахстан), районов нефтехимического производства (г. Нижнекамск, Татарстан). Ряд штаммов, использующих дихлорме-тан, изолированы из накопительных культур, предоставленных Th. Leisinger (Институт микробиологии, Цюрих, Швейцария). Им же предоставлены для идентификации несколько чистых культур-деструкторов дихлорметана. 100 штаммов метанотрофов получены от В.Ф. Гапьченко (ИНМИ РАН). Около 50 неидентифи-цированных штаммов облигатных и ограниченно факультативных метилобактерий получены от H. Stolp (Германия), К. Kouno (Япония), L. Zatman (Великобритания), О. Вольфовой (Чехия).

Типовой штамм Methylobacterium organophilum XX АТСС 27886 получен от R. Hanson (США), другие представители рода Methylobacterium - от P.N. Green (Национальная коллекция промышленных и морских бактерий NCIMB, Великобритания), штаммы рода Paracoccus - от K.Suzuki (Японская коллекция микроорганизмов, JCM, Япония), штаммы рода Xanthobacter из немецкой коллекции микроорганизмов (DSM), штаммы родов Methylobacillus и Methylophilus от D. Byrom (ICI, Великобритания), Methylophaga marina АТСС 35842 и Methylophaga thalassica

АТСС 33146 от F. Gasser (Франция), Methylophaga sulfidovorans RB-1 от J.M.M de

12

Zwart (Нидерланды), Acidomonas methanolica IMET 10945 от W.Babel (Германия), Amycolatopsis methanolica NCIB 11946 от L. Dijkhuizen (Нидерланды), Aminobacter aminovorans JCM 7852 от K.Komagata (Япония), Paracoccus solven