Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биодеградация дихлорметана аэробными метилобактериями

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биодеградация дихлорметана аэробными метилобактериями"

На правах

ТОРГОНСКАЯ МАРИЯ ЛЕОНИДОВНА

Б И ОД ЕГРЛДА ЦИЯ ДИХЛОРМЕТАНА АЭРОБНЫМИ МЕТИЛОБАКТЕРИЯМИ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

№

Пущнно -

003460545

Работа выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ю.А. Троценко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Р. Н. Ивановский кандидат биологических наук, А. Ю. Аринбасарова.

Ведущая организация: Институт фундаментальных проблем биологии РАН

Защита состоится « 19 » февраля 2009 г. в 9 30 час. на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, а также на сайте института www.ibpm.ru.

Автореферат разослан « 16 » января 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дихлорметан (ДХМ) - CibCl2 — летучее высокотоксичное, мутагенное и канцерогенное соединение, широко используемое в промышленности в качестве растворителя и хладагента (фреон-30, хладон-30) [Mckay et al., 1993; Van Agteren et al., 1998]. Это преимущественно антропогенный загрязнитель, поскольку его промышленное производство достигает 3-Ю5 т/год, тогда как биогенное образование весьма незначительно [Keene ct al., 1999; Khalil et al., 1999; Harper, 2000; Дембицкий, Толстиков, 2003].

Исследования бактериального дегалогенирования ДХМ ведутся более 20 лет. Получена существенная информация о распространении и таксономии аэробных бактерий-деструкторов СН2С12, путях их первичного и центрального метаболизма, соответствующих генах и ферментах [Троценко, Доронина, 2003]. Однако показанная для дихлорметандегалогеназ (ДХМДГ, DcmA) цитоплазматическая локализация поднимает вопрос о транспорте CII2CI2 в клетки метилобактерий. Кроме того, в отличие от периплазматического метаболизма метанола, процесс деградации ДХМ у метилобактерий зависит от величины пула GSH (кофактора DcmA) и сопровождается образованием в цитоплазме высоких концентраций Н+ и СГ, S-хлорметилглутатиона и СПгО. Эти токсичные реакционноспособные интер-медиаты оказывают летальное действие на клетки, не имеющие соответствующих механизмов защиты [Evans et al., 2000; Kayser ct al., 2000]. О важной роли специфической структурно-функциональной организации штаммов-деструкторов CH2CI2 свидетельствуют и недавние работы по получению трансконъюгантов Methylobacterium chlorometlranicum СМ4 и Methylobacterium extorquens AMI, экспрессирующих ген ДХМДГ (dcmA) из Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4 [Kayser et al., 2002]. Однако до настоящего времени перечисленные аспекты бактериальной деградации ДХМ остаются неизученными (рис. 1).

^Гекотоксичность^

Рис. 1. Нерешенные проблемы деградации днхлорметана аэробными метнлобактериямн

^ [Kayser et al., 2002].

H'CI

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным, целью работы было выявление цитобиохимических особенностей у деструкторов ДХМ Methylo-bacterium dichloromethanicum ДМ4, Methylopila helvetica ДМ6 и Albibacter methylovorans ДМ10, реализующих разные пути первичной ассимиляции Отсоединений. Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:

1. Исследовать цитобиохимические изменения у аэробных метилобактерий при деградации ДХМ.

2. Определить механизмы транспорта ДХМ у аэробных метилобактерий.

3. Изучить механизмы поддержания ионного гомеостаза метилобактериями при дегалогенировании ДХМ.

Научная новизна работы. Впервые показано, что в присутствии ДХМ, а также при повышении солености среды, клетки снижают текучесть мембран, уменьшая относительное содержание ненасыщенных Ci8:i и Сгсы и увеличивая содержание насыщенных Ci6:o, Спя, Ci8:o жирных кислот и фосфатидилхолина. Галотоле-рантности метилобактерий при росте на ДХМ способствует уменьшение доли гидрофобных и возрастание содержания кислых аминокислот, а также накопление осмопротектора пролина и/или отрицательно заряженных фосфолипидов у Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ 10. На клеточной стенке этих деструкторов обнаружены содержащие хлор и фосфор образования, вероятно, служащие для уплотнения барьера проницаемости мембран для экзогенных анионов. Результаты масс-спектрометрического анализа фракционирования изотопов 12/13С и 35/37С1 молекул ДХМ интактными клетками, их экстрактами и очищенными ДХМДГ аэробных метилобактерий дают основание предполагать диффузионный механизм транспорта СН2С12. Однако величина рассчитанных кинетических изотопных эффектов свидетельствуют также о существовании дополнительных энергозависимых механизмов экскреции ДХМ для защиты бактерий от токсического действия этого растворителя.

Ингибиторный анализ выявил, что при минерализации ДХМ аэробными метилобактериями выброс образующихся ионов СГ осуществляется с потреблением энергии химического протонного градиента. Однако, в отличие от трансконъю-ганта Mb. extorquens АМ1/рМЕ8220, штаммы-деструкторы обладают АТФ-зависи-мыми механизмами, связанными с деградацией CH2CI2.

У Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ10, адаптированных к повышенной солености среды, выявлено ускорение индуцируемого ДХМ синтеза ДХМДГ, а также специфичное для солевого стресса сокращение лаг-периода в использо-

вании CH2CI2, не связанное с экспрессией гена dcmА и свидетельствующее о цитобиохимических изменениях, способствующих экскреции ионов С1\ Научно-практическое значение. Данная работа является частью проекта, направленного на решение важной проблемы биодеградации ДХМ, опасного загрязнителя окружающей среды в связи с персистептностыо и большими объемами промышленного производства и применения этого растворителя. Изучение физиолого-биохимических и молекулярных основ метаболизма данного цито- и генотоксиканта значительно расширяет и углубляет знания о бактериальной деградации галометанов. Эти исследования необходимы для разработки современных биотехнологий разложения ДХМ на основе активных штаммов и ферментов, а также для создания процессов, соответствующих промышленным требованиям, нежели природные деструкторы галометанов. Внедрение штаммов, устойчивых к различным физико-химическим факторам, на очистных сооружениях производств, связанных с продукцией или использованием этого поллютанта, перспективно для повышения эффективности биореакторов аэробного разложения ДХМ.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Международных Пущинских школах-конференциях молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004, 2005, 2006), Всероссийском симпозиуме с международным участием памяти акад. РАН Е.Н. Кондратьевой «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2005), конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), школе-конференции молодых ученых ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН (Пущино, 2005), молодежной школе-конференции по масс-спектрометрии (Москва, 2005), международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» ИНМИ им. С.Н. Виноградского РАН (Москва, 2005, 2007), конференции молодых ученых "Современная биотехнология - защите окружающей среды" (Пущино, 2006), международном симпозиуме ISEB-ESEB-JSEB «Environmental biotechnology» (Лейпциг, 2006), российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология - современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино, 2006), 2-м Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием IBSM-2007 "Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ" (Иркутск, 2007), Генеральной ассамблее Европейского Союза Геофизических Исследований "Geosciences is responsibility" (Вена, Австрия, 2008), Гордоновской научной конференции «Molecular basis of microbial one-carbon metabolism» (Льюистон, США, 2008), IV-й

межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2008). Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 13 тезисов. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 364 ссылки, содержит 10 таблиц и 26 рисунков.

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектами исследований служили штаммы аэробных метилобактерий — деструкторов ДХМ, реализующих различные пути Сi-метаболизма: рибулозо-бисфосфатный - Albibacter methylovorcms ДМ10 (ВКМ В-2236, DSMZ 13819) [Doronina et al., 2001] или сериновый - Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4 (ВКМ В-2191, DSMZ 6343) и Methylopila helvetica ДМ6 (ВКМ В-2189, DSMZ 6343) [Doronina et al., 2000], а также полученные на основе Methylobacterium extorquens AMI (NCIMB 9133) и Mb. dichloromethanicum ДМ4 трансконъюганты, экспрессирующие ген dcmA из штамма ДМ4 конститутивно (АМ1/рМЕ8220 и ДМ4/рМЕ8220) или индуцибельно (АМ1/рМЕ8221) [Kayser et al., 2002]. Культуры выращивали на средах «К» (Doronina et al., 2000] и «ММ» [Vuilleumier, Leisinger, 1996] с 120 мМ метанола или 10 мМ ДХМ (в 300 мл колбах Эрленмейера с завинчивающимися крышками с резиновой мембраной (Precision Sampling Corp., Baton Rouge, США)). При выращивании трансконъюгантов для поддержания плазмиды в среду вносили тетрациклин (20 мкг/мл).

Для получения препаратов ДХМДГ типа В использовали трансформант Е. coli BL21(DE3)pLysS/pME1919 [Vuilleumier, Leisinger, 1996], экспрессирующий ген dcmA из штамма М. leisingeri ДМ11 (ВКМ В-2013, DSMZ 6813) [Доронина и соавт., 1994]. Трансформант выращивали на среде Luria-Bertani (LB) при 25°С с добавлением ампициллина (100 мкг/мл), хлорамфеникола (25 мкг/мл) и 0.5 мМ изопропил-р-тиогалактозида (ИПТГ) для индукции экспрессии ДХМДГ. Фосфолипидный, жирнокислотный и аминокислотный состав клеток анализировали стандартными методами [Spackman et al., 1958; Keutmann, Potts, 1969; Toshima, Yoshimura, 1975; Collins, 1985; Говорухина, Троценко, 1989; Doronina et al., 2000]. Ультраструктуру клеток исследовали с использованием описанных методик [Сузина, Фихте, 1986]. Рентгеновский микроанализ элементного состава компартментов клеток проводили на неконтрастированных ультратонких срезах с помощью электронного микроскопа JEM-100CXII ("JEOL",

Япония), снабженного сканирующей приставкой EM-ASID4D и рентгеновским микроанализатором LINK-860 с детектором Е5423 (Link-System, Англия) при увеличении 20000х и напряжении до 60 кВ. Активность глугатионредуктазы и содержание белка в бесклегочных экстрактах определяли спектрофотометри-чески [Schactcrle, Pollack, 1973; Deüdes et al., 1976].

Концснтрацшо ионов хлора определяли спектрофотометрически тиолотолерант-ным методом [Jörg, Bertau, 2004]. Очистку ДХМДГ (К.Ф. 4.5.1.3.) из бесклеточных экстрактов Mb. dichloromethanicum ДМ4 и трансформанта Е. coli BL21(DE3)pLysS/pME19I9 проводили анионообменной хроматографией [Vuillcumier, Leisingcr, 1996] и гель-фильтрацией. Чистоту препаратов ДХМДГ контролировали посредством денатурирующего гель-электрофореза белков в ПААГ (ДСН-ПААГ) стандартным методом [Laemmli, 1970]. Активность ДХМДГ в препаратах определяли но скорости восстановления НАД+ формальдегиддегидрогеназой [Vuillcumier, Leisinger, 1996], в бесклеточных экстрактах - по скорости образования ионов С1" при дегалогенировании ДХМ. В последнем случае реакционная смесь объемом 200 мкл содержала (мМ): КФБ (pH 7.5) - 20, GSH - 2, аскорбиновую кислоту - 2, СН2С12 - 20, экстракт или очищенный фермент.

Для исследования фракционирования изотопов 12/13С и 35Й7С1 СН2С12 очищенными ДХМДГ, целыми клетками Mb. dichloromethanicum ДМ4, Mb. extorquens AMl/pME8220, A. methylovorans ДМ10 и бесклеточными экстрактами Mb. dichloromethanicum ДМ4 герметично закрытые 300 мл колбы Эрленмейера и запаянные 20 мл флаконы со стерильным 20 мМ КФБ (pH 7.5) уравновешивали с ДХМ (10 мМ в 50 мл и 2 мМ в 1.3 мл, соответственно) при 30°С в течение 1 сут на роторной качалке (180 об/мин). Шприцем вносили отмытые буфером клетки с активной ДХМДГ из середины экспоненциальной фазы роста (ОПбоо= 1-0; 64 - 70 мг АСБ) или 1 мМ GSH и экстракт/препарат ДХМДГ (100-130 нмоль/минхмг белка). Реакционные смеси инкубировали при 30°С на роторной качалке (180 об/мин) в течение 0.5 -8 ч. Пробы для определения изотопного состава СН2СЬ, С02 и оценки потребления субстрата отбирали из 5 параллельных реакционных смесей. Контролями служили соответствующие объемы стерильного 20 мМ КФБ (pH 7.5), уравновешенного с 10 мМ ДХМ, и реакционные смеси без добавления ДХМ, содержащие то же количество клеток или фермента. Изотопный состав ШЗС в ДХМ и С02 анализировали с использованием сопряженной системы газового хроматографа и масс-спектрометра GC-C-IRM-MS [Richnow et al., 2003]. Пики СН2С12 и С02 разделяли на колонке "Zebron ZB1" (60 м * 0.32 мм ID) с

размером частиц 1 мкм (Chrompack, Нидерланды) при температуре 70°С. Полученные данные анализировали с помощью штатных программ прибора. Изотопный анализ 35/37С1 в ДХМ проводили на двулучевом изотопном масс-спектрометре МИ-1201 (Россия) с использованием двухканальной системы напуска. Количественными характеристиками содержания изотопов хлора в ДХМ служили интенсивности пиков с m/z 84 (35С12'2С'Н2), 86 (35С137С112С'Н2) и 88 (37С12,2С'Н2) в масс-спектре ДХМ [Зякун и соавт., 2003]. Измерения проводили в трехкратной повторное™. С учетом доли потребления по наблюдаемым изменениям изотопного состава неиспользованного ДХМ в среде относительно исходного уровня рассчитывали коэффициенты фракционирования изотопов |2/|3С и 35,37С1 ДХМ (ас и ас,) [Richnow et al., 2003]. Долю потребления ДХМ в опыте определяли по образованию ионов CI, путем масс-спектрометрического [Зякун и соавт., 2003] и газо-хроматографического количественного анализа СН2С12 [Nicolausz et al., 2005]. Ингибиторный анализ проводили путем добавления к 25 мл суспензий клеток с активной ДХМДГ (ОП600 = 1-2, 65 - 85 мг АСБ) ионофоров - валиномицина (0.2 мМ), нигерицина (0.2 мМ), СССР (50 мкМ), ингибиторов цитохромоксидазы - NaN3 (0.25 мМ)) и FiFo-АТФ-азы - ДЦКД (0.5 мМ). Суспензии клеток инкубировали с ДХМ в течение 9 ч при 29°С на роторной качалке (180 об/мин). Потребление ДХМ определяли по концентрации СГ. Для оценки роли адаптации бактерий к неспецифическим стрессовым воздействиям в потреблении ДХМ клетки, выращенные на среде с метанолом (120 мМ) при 29°С до середины экспоненциальной фазы, подвергали воздействию различных стрессоров: теплового (42°С, 2 ч), осмотического (100 мМ NaCl, 2 или 36 ч) и кислотного (рН 5.0, 2 ч). Отмытые клетки (65 - 85 мг АСБ) переносили в герметично закрытые 300 мл колбы Эрленмейера с 25 мл свежей среды «ММ» и 10 мМ ДХМ. Инкубацию продолжали в течение 24 ч. В пробах культуральиой жидкости измеряли концентрацию С1, экстракты клеток анализировали методом ДСН-ПААГ-электрофореза, определяли активность ДХМДГ. Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Выживаемость клеток исследуемых штаммов при воздействии различных стресс-факторов, ингибиторов электронного транспорта, а также при переходе от метанола к потреблению ДХМ в каждой временной точке определяли методом разведений и высевом на агаризованную среду «ММ», содержащую 120 мМ СН3ОН. Использовали стандартные методы статистической обработки данных [Гланц, 1998].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Структурно-функциональная модификация клеток деструкторов при деградации ДХМ

Анализ профилей жирных кислот Mb. dichloromethanicum ДМ4, Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ 10 при росте на ДХМ выявил увеличение относительного содержания насыщенных жирных кислот (ЖК) за счет возрастающей доли пальмитиновой (Ci6:o) и уменьшения уровней октадеценовых (Ci8:i) и эйкозеновой (СгогО кислот (табл. 1). Это указывает на снижение вязкости мембран деструкторов в присутствии СН2С12. Тем не менее, в присутствии 0.5-1.5% NaCl подобную картину наблюдали только у А. methylovorans ДМ 10, что свидетельствует о преимущественной роли данного механизма в защите клеток от растворителя ДХМ, нежели от повышенной солености среды. У Мр. helvetica ДМ6 и А. methylovorans ДМ10, выращенных в условиях солевого стресса, отмечено также уменьшение доли разветвленных метилированных ЖК и циклопропановой кислоты (С 19;0сус)> что может быть следствием ингибирования хлор-ионами ферментов их синтеза, таких как циклопропан-ЖК-синтетаза [Kuchta, Russell, 1994]. Известно, что типичным ответом клеток на солевой стресс является уменьшение содержания нейтральных (ФЭА, ФХ) и накопление отрицательно заряженных фосфолипидов (KJI, ФГ, ФС, ФК), служащих для баланса зарядов на поверхности мембран и регуляции их проницаемости для внеклеточных ионов [Sutton et al., 1991; Ventosa et al., 1998; Cui et al., 2005]. Однако при анализе фосфолипидного состава клеток только у Мр. helvetica ДМ6 был выявлен подобный эффект как при Mb. dichloromethanicum ДМ4 и A. methylovorans ДМ10 при инкубации с СН2С]2, негативно заряженный фосфатидилглицерин (ФГ) замещался цвиттерионным фосфатидилхолинои (ФХ), а в клетках преобладали нейтральные фосфолипиды, выполняющие структурную функцию и стабилизирующие мембраны в присутствии растворителя. Следовательно, модификация ЖК- и ФЛ-профилей штаммов-деструкторов при росте на CH2CI2 является не только ответом на повышение внутри- и внеклеточной концентрации ионов С1", но и защищает клетки от действия ДХМ как растворителя. При этом для Mb. dichloromethanicum ДМ4 и А. methylovorans ДМ 10 основное значение в процессе минерализации ДХМ, по-видимому, имеет стабилизация мембран в присутствии этого растворителя. Напротив, Мр. helvetica ДМ6 при росте на CH2CI2 больше нуждается в защите клеток при изменениях ионного баланса.

Поскольку при дегалогенировании ДХМ аэробными метилобактериями в среду культивирования выделяются ионы С1 и избыток СНгО, и повышается

Табл. 1. Влияние условий культивирования на состав жирных кислот клеток деструкторов (% от общего содержания).

Жирные кислоты МЬ. ¡ИсМоготеИштсит ДМ4 Мр. ЬеИ'еИса ДМ6 А. тс1ку1оуогат ДМ 10

СН3ОН СНзОН+О.5% N301 СН20 2 СНзОН СНзОН+1.5% N3(31 СН2С12 СН3ОН СНзОН+1.5% N30 СН2С12

С|4:0 0.7 1.3 1.1 0 0 0 0 0 0.2

С15.О 0 0 0.2 0.4 0 0 1.1 1.6 3.4

С|6:0 1.7 1.5 2.5 11.7 10.4 20.2 16.5 39.0 19.8

С16:1 4.7 4.3 5.4 1.6 0.9 1.1 0.8 6.9 0.7

Сп:0 1.2 1.0 0.9 1.8 2.0 1.0 1.1 6.5 2.1

С]7:1 0 0 0 0 0 0 0 2.7 0.2

С18:0 5.1 4.5 4.5 1.0 0 1.0 0.5 2.3 0.7

С18Л 86.6 87.4 70.4 79.3 84.2 75.5 75.3 36.3 68.6

С19;0сус 0 0 0 2.4 0 0 1.2 0 1.4

С20:1 0 0 0 1.8 2.5 1.2 3.1 4.7 2.9

Метилированные: 1.2 1.0 2.8 7.8 5.4 6.1 14.0 7.9 17.1

Насыщенные: 8.7 8.3 9.2 17.3 12.4 22.2 20.8 52.5 27.6

Ненасыщенные: 91.3 91.7 90.8 82.7 87.6 77.8 79.2 47.5 72.4

Табл. 2. Влияние условий культивирования на состав фосфолипидов клеток деструкторов (% от общего содержания).

Фосфолипиды ( МЬ. (ПсЫоготеОгатсит ДМ4 Мр. ЬеН еЧса ДМ6 А. теШу1оуогап5 ДМ10

СН3ОН СНзОН+О.5% N30 СН202 СН3ОН СНзОН+1.5% N30 СН2С12 СНзОН СНзОН+1.5% N30 сн2о2

КЛ 0 0 13.7 0 0 0 0 0 0

ФГ 35.3 31.0 16.0 27.1 30.7 38.9 37.5 32.5 28.9

ФЭЛ 29.8 24.5 21.2 26.8 23.8 26.0 25.7 25.7 25.5

ФХ 23.7 25.9 36.3 28.4 17.7 17.0 11.1 22.6 23.7

ФС 0 11.1 0 6.8 5.7 4.6 4.8 3.6 6.8

ФК 11.2 7.5 12.8 10.9 22.1 13.5 20.9 15.6 15.1

Заряженные: 46.5 49.6 42.5 44.8 58.5 57.0 63.2 51.7 50.8

Незаряженные: 53.5 50.4 57.5 55.2 41.5 43.0 36.8 48.3 49.2

Рис. 2. Ультраструктура клеток Мр. helvetica ДМ6 (а-в) и A. methylovorans ДМ 10 (гс) при различных условиях культивирования: на метаноле при 0.05% NaCl (а, г); на метаноле при 1.5% NaCl {б, д); на дихлорметаие при 0.05% NaCl (в, е). ПГБ -гранулы полигидроксибутирата. ПФ - гранулы полифосфата. Длина масштабной линейки 0.5 мкм.

осмотическое давление, было решено проверить возможность существования морфологических изменений клеток при использовании данного субстрата. Сравнительный анализ ультратонких срезов клеток исследуемых деструкторов не выявил сокращения периплазматического пространства и уплотнения клеточной стенки, наблюдаемых у некоторых грамотрицательных бактерий при солевом стрессе [Ventosa et al., 1998]. Однако на поверхности клеток Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ 10, выращенных на среде с метанолом и 1.5% NaCl, или на ДХМ, были найдены необычные электронно-плотные структуры неизвестной природы и функции (рис. 2). Рентгеновский микроанализ элементного состава компартментов клеток Мр. helvetica ДМ6, выращенных на ДХМ или СН3ОН + 1.5% NaCl показал наличие хлора и фосфора в клеточной стенке и цитоплазме деструктора (рис. 3). Однако особенности данного метода не позволяют достаточно четко разделить исследуемые компартменты, поэтому пока нельзя точно определить, присутствуют ли хлор и фосфор, главным образом, в обнаруженных

поверхностных структурах или внутри клеток. Неизвестным остается механизм связывания С1 и Р с клеточной стенкой изучаемых деструкторов.

Напряжение, кэВ

Рис.3. Спектры рентгеновского микроанализа клеточной стенки Мр. helvetica ДМ6, выращенных на метаноле в присутствии 0.05% (а) или 1.5% NaCi (б) и ДХМ (в).

Роль образуемых ионами поверхностных структур, ранее выявленных у гало-филов, неясна, но считается, что они формируют заряженную плотность, снижающую ионную проницаемость мембран [Rengpipat et al., 1988; Ventosa et al., 1998]. Логично полагать, что связывание ионов С1 на внешней стороне клеточной стенки при солевом стрессе или дегалогенированяи ДХМ также создает отрицательный заряд, защищающий от проникновения анионов в цитоплазму. Таким образом, наряду с изменениями липидного состава мембран, накопление деструкторами на поверхности клеток экскретируемых ионов хлора может служить для поддержания ионного гомеостаза при деградации ДХМ.

Сравнительный анализ уровней аминокислот у Mb. dichloromethanicum ДМ4, Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ10, выращенных на метаноле или ДХМ, выявил относительно высокое содержание глутамата (17-18 %) и глицина (6-7 %), являющихся основными аминокислотными осмопротекторами грамотрицатель-ных бактерий. Однако рост деструкторов на ДХМ не сопровождался усилением синтеза этих аминокислот, что указывает на их незначительную роль в ответе на стрессы, сопутствующие дегалогенированию СН2СЬ. Увеличение относительного содержания пролина (на 1.5 - 4.5 %) у Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ 10 при росте на ДХМ, напротив, свидетельствует о важности данного осмолитика для защиты клеток от продукции НС1 даже при высоких уровнях глутамата и глицина (рис. 4).

У всех исследованных деструкторов при росте на ДХМ также выявлено уменьшение относительного содержания гидрофобных аминокислот (аланина, валина, лейцина), а также гистидина (рис. 4). Наряду с наблюдаемым у штаммов ДМ4 и ДМ6 увеличением уровня аспарагина, этот эффект отражает модификацию белков в условиях солевого стресса, подобную описанной ранее для галофильных аэробных бактерий [Ventosa et al., 1998; Madern et al., 2000; Müller, Oren, 2003]. При минерализации ДХМ в клетках деструкторов также возрастали уровни аргинина, цистеина и ароматических аминокислот - тирозина и фенилаланина (штаммы ДМ6 и ДМ 10). Итак, дегалогенирование СН2С12 у штаммов-деструкторов сопровождается не только изменением состава и свойств мембран, но и модификацией аминокислотного состава клеток для большей устойчивости в условиях

солевого и кислотного стрессов. %

20 16 12 8 4

0

Рис. 4. Влияние условий культивирования на аминокислотный состав клеток деструкторов Mb. dichloromethanicum ДУМ, Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ10 (% от общего содержания аминокислот).

Табл. 3. Влияние условий культивирования на активность глутатионредуктазы в клетках деструкторов (нмоль/мин х мг белка).

Штаммы CIIjCI, CH3OH

Mb. dichloromethanicum ДМ4 31.5 ±2.7 22.3 ± 2.3

Mp. helvetica ДМ6 28.8 ± 0.4 18.3 ± 2.4

A. methylovorans ДМ10 28.5 ±3.6 18.7 ±1.2

Активность глутатионредуктазы существенно возрастала (на ~ 40%) у штаммов-деструкторов при росте на ДХМ (табл. 3), что свидетельствует о функциональной подстройке тиолредуцирующей системы для ускоренного восстановления глута-

His Arg Cys Asp Glu Gly Pro Ala Val Leu Phe Tyr Аминокислоты

CHjC^i

в ДМ4 И ДМ6 и ДМ10

СНзОН: D ДМ4 и ДМ6 s ДМ10

тиона, окисляемого в реакции дегалогенироваиия и, предположительно, участвующего в ответе клеток на сопутствующие стрессы.

2. Механизм транспорта дихлорметана у деструкторов

Ранее на трансформантах Е. coli, экспрессирующих функционально активную ДХМДГ из штамма M. leisingeri ДМ11, было показано, что малые незаряженные молекулы ДХМ могут входить в клетки путем пассивной диффузии [Evans et al., 2000]. Однако, несмотря на наличие косвенных указаний на существование системы активного транспорта ДХМ у Mb. dichloromethanicum ДМ4, механизмы поступления СН2С12 в клетки аэробных метилобактерий не исследовались.

-Н---1---1-■-1-.-1— u-f---1---1-■-1-1-1-.-1---г-

0 2 4 6 8 0 5 10 15 20 25 30

Ввемя инкубации, ч Вюемя инкубации, мин

Рис. 5. Динамика потребления (1) и дегалогенироваиия (2) ДХМ клетками (а) и препаратом ДХМДГ МЬ. сИсМоготеИштсит ДМ4 (б).

Нами показано, что у клеток МЬ. ШсЫоготМкапгсит ДМ4 первоначально (до 3 ч) происходит задержка процесса дехлорирования СН2С12 по сравнению с убылью ДХМ из среды культивирования (рис. 5а). Напротив, при деградации ДХМ очищенной ДХМДГ (рис. 56), или клетками трансконъюганта АМ1/рМЕ8220 потребление из среды СН2С12 и продукция ионов С1 происходили одновременно. Это свидетельствует о функционировании специфичных механизмов активной экскреции токсичного ДХМ.

Для изучения транспорта ДХМ в клетки деструкторов использовали масс-спектрометрический метод анализа фракционирования изотопно разных по углероду и хлору молекул СН2С12. Выявлены изменения изотопного состава углерода и хлора неусвоенного ДХМ в смеси при минерализации СН2С12 клетками и бесклеточными экстрактами МЬ. ЖсМогопшИатсит ДМ4, а также очищенными препаратами ДХМДГ штаммов ДМ4- и ДМ11 подразумевают, что метаболизируется преимущественно ДХМ, содержащий «легкие» изотопы 12С и

35С1. В результате в остаточной фракции субстрата увеличивается доля молекул, содержащих «тяжелые» атомы |3С и 37С1 (рис. 6). Однако не наблюдалось изменений изотопного состава углерода С02, продуцируемого из ДХМ клетками Mb. dichloromethanicum ДМ4, бесклсточными экстрактами и ДХМДГ (рис. 6). Этот эффект может быть следствием одновременного окисления других внутриклеточных компонентов, что косвенно подтверждается ранее обнаруженным увеличением потребления 02 и образования С02 по сравнению с величинами, рассчитанными для процесса деградации ДХМ [Зякун и соавт., 2007]. Коэффициенты фракционирования изотопов (ас и аа) в процессе использования ДХМ, рассчитанные с использованием уравнения Рэлся [Richnow et al., 2003], указывают, что катализируемый ДХМДГ разрыв связи С-С1, как и предполагалось ранее, протекает по механизму нуклеофильного замещения второго порядка Sn2 [Vuilleumier et al., 1996; Eisner et al., 2005]. При этом очевидные различия кинетических изотопных эффектов ас и Oq свидетельствуют о том, что процесс деградации ДХМ очищенными ферментами и бесклеточными экстрактами деструкторов характеризуется меньшими изотопными эффектами, нежели потребление этого субстрата целыми клетками (табл. 4).

Рис. 6. Относительные значения изотопного состава углерода (513С) непотреблеи-ного СП2С12 и С02 при минерализации ДХМ клетками (а) и очищенной ДХМДГ (б) МЬ. ¡ПсЫогопШкатсшп ДМ4. Значения 513С рассчитаны по отношению к Венскому белемнитовому стандарту (УРОВ).

В соответствии с предложенной схемой минерализации ДХМ аэробными метило-бактериями (рис. 7), фракционирование изотопов 12/13С и 35/37С1 в данном случае происходит не только на уровне взаимодействия с ДХМДГ, но и при пассивной диффузии этого субстрата через мембрану. При этом диффузионный транспорт ДХМ в клетки может приводить к образованию промежуточного цитоплазмати-ческого пула, одна часть которого выносится обратно в среду, а другая реагирует

с ДХМДГ. Оказалось, что, в отличие от деградации ДХМ бесклеточными экстрактами, очищенными ДХМДГ и трансконъюгантом АМ1/рМЕ8220, минерализация СН2С12 клетками МЬ. сИсЫоготеЖатсит ДМ4 и А. таку1о\огат ДМ10 сопровождается фракционированием изотопно разных молекул по хлору молекул ДХМ, превосходящим теоретически рассчитанные значения для одностадийного процесса (1.012 для а8б/84[СН2С12] и 1.024 дом а№84[СН2С12]). Наблюдаемый эффект объясним, при условии, что константа скорости взаимодействия СН2С12 с ДХМДГ меньше константы скорости обратного выхода из клеток. Отсутствие фракционирования изотопно разных молекул ДХМ подразумевает активную экскрецию СН2С12.

Табл. 4. Факторы фракционирования изотопов |2/13С и ^5,37С1-содержащих изотопо-меров ДХМ при деградации клетками, бесклеточными экстрактами и препаратами ДХМДГ деструкторов и трансконыоганта.

Объскг исследования ос ОС!

аШ84[СН2СЫ аШ84|СН2СЫ

МЬ. ШсЫоготеЛатсит ДМ4

Целые клетки 1.067 ±0.002 1.013 ±0.002 1.051 ±0.006

Бесклеточный экстракт 1.054 ±0.008 1.010 ±0.001 1.020 ±0.002

ДХМДГ" 1.059 ±0.005 1.010 ±0.001 1.021 ±0.002

А. теЛуШогат ДМ 10

Целые клетки н.о. 1.020 ±0.002 1.045 ±0.003

МЬ. еМогдиею АМ1/рМЕ8220

Целые клетки и.о. 1.011 ±0.004 1.023 ±0.005

М. 1еЫп°еп ДМ11

Целые клетки* 1.065 ± 0.003 н.о. н.о.

ДХМДГ 1.046 ±0.002 н.о. н.о.

* - литературные данные [№ко1ашг е1 а1., 2005].

Рис. 7. Схема этапов возможного ^^хХ"^*"*^ "ч. фракционирования изотонно разных

I ^П молекул при минерализации ДХМ

СН2С12 ( СН2С12 ^ \ | аэробными метилобактериями.

Л V Л 1ДХМДГ / , , ,

И А / / к], к2 и к] - константы скоростей

Л диффузии СН2(Л2 в клетку,

"/Су взаимодействия с ДХМДГ и экспорта

Ц+ С~\-\

п ДХМ в среду, соответственно.

Таким образом, результаты анализа кинетических показателей фракционирования изотопов 12/13С и 35/37С1-содержащих изотопомеров при деградации ДХМ целыми

клетками и ДХМДГ штаммов-деструкторов, свидетельствуют о диффузионном механизме транспорта СН2С1г в бактериальные клетки. Однако для защиты от токсиканта клетки деструкторов активно экскретируют молекулы ДХМ. С использованием разобщителей окислительного фосфорилирования (СССР, валиномицин, нигерицин) продемонстрирована необходимость электрохимического градиента протонов для бактериального дегалогенирования ДХМ как штаммами-деструкторами, так и не растущими на ДХМ трансконъюгантом с активной ДХМДГ (рис. 8). При этом возможно использование энергии протон-движущей силы в процессе дехлорирования СН2С12 для вторично активной экскреции продуцируемых ионов хлора с помощью систем взаимосвязанного переноса С1 и катионов Н+ и К+, таких как прокариотные гомологи хлорных каналов С1С-семейства, обладающие активностью 2СГ/1Н+-антипортера или переносчики К+/СГ, Ш+1К+12С\ [ВаЫш, РиэсЬ, 2004].

АМ1/рМЕ8220 ДМ4/рМЕ8220 ДМ6 ДМ10

Штаммы

Рис. 8. Образование ионов хлора (% от контроля) в процессе потребления ДХМ культурами Mb. extorquens АМ1/рМЕ8220, Mb. dichloromethanicum ДМ4/рМЕ8220, Мр. helvetica ДМ6, A. methylovorans ДМ10 при инкубации с разобщителями окислительного фосфорилирования и ингибиторами электронного транспорта. В качестве контролей (100%) использовали суспензии клеток без добавления ингибиторов.

Наблюдаемая различная эффективность действия валиномицина и нигерицина на клетки деструкторов Mb. extorquens АМ1/рМЕ8220, Mb. dichloromethanicum ДМ4/рМЕ8220, Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ 10 может также

объясняться влиянием модификации состава мембран в присутствии ДХМ на связывание молекул ионофоров. Значительное снижение скорости дегалогени-рования ДХМ (на 40-80%) у клеток деструкторов в присутствии ингибиторов терминального участка дыхательной цепи - азида натрия и НЫ'-дициклогексил-карбодиимида (ДЦКД) указывает на существование у данных штаммов АТФ-зависимых процессов, связанных с деградацией СН2С12 (рис. 8). При этом энергия АТФ может быть использована клетками для активной экскреции токсичного ДХМ и/или внутриклеточно продуцируемых при дегалогенировании ионов Н+ и С1. Отмеченное ранее при масс-спектрометрическом анализе газовой фазы усиленное использование деструкторами кислорода и образование С02 также свидетельствует об использовании клетками запасных веществ для перестройки энергетического метаболизма в направлении более эффективного создания протондвижущей силы цитоплазматической мембране и синтеза АТФ при переходе к росту на ДХМ [Зякун и соавт., 2007]. Меньшая эффективность действия NaN3 и ДЦКД на процесс дехлорирования ДХМ у трансконъюганта Mb. extorquens АМ1/рМЕ8220 по сравнению с таковой у близко-родственного штамма Mb. dichloromethanicum ДМ4/рМЕ8220, вероятно, является следствием отсутствия специфичных для деструктора АТФ-зависимых механизмов и наличия альтернативной цитохромоксидазы.

В первые часы после добавления разобщителей окислительного фосфорили-рования и ингибиторов электронного транспорта не выявлено достоверного уменьшения жизнеспособных клеток исследуемых штаммов, за исключением А. methylovorans ДМ10, инкубированного с СССР. Следовательно, уменьшение и даже полное прекращение потребления ДХМ не является следствием гибели клеток. Вероятной причиной столь высокой устойчивости клеток исследуемых штаммов к метаболическим ядам также может быть модификация химического состава мембран в присутствии ДХМ.

Таким образом, результаты анализа особенностей энергетического метаболизма указывают на наличие у штаммов-деструкторов дополнительных, связанных с деградацией ДХМ, АТФ-зависимых механизмов экскреции СН2С12 и/или продуцируемых СГ и Н+. Однако Mb. dichloromethanicum ДМ4/рМЕ8220, Мр. helvetica ДМ6, A. methylovorans ДМ10 и Mb. extorquens АМ1/рМЕ8220 также могут использовать энергию электрохимического протонного градиента для экспорта ионов С1 против градиента концентрации.

3. Адаптация деструкторов ДХМ к внутриклеточной продукции С1

При переходе Mb. dichloromethanicum ДМ4, Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorcins ДМ10 от роста на метаноле к деградации ДХМ обнаружен лаг-период (0.5 3 ч), обусловленный адаптацией клеток к потреблению CH2CI2 (Табл. 5). В течение этого времени, по-видимому, индуцировалась ДХМДГ, а также синтезировались стрессорные белки в ответ на внутриклеточную продукцию соляной кислоты. По

окончании лаг-периода в среде появлялись экскретируемые клетками Н+ и СГ.

Табл. 5. Длительность лаг-периода в потреблении СН2С12 у штаммов-деструкторов в зависимости от условий культивирования

Штамм Вариант опыта* 120 мМ CHjOH 120 мМ СН3ОН + 100 мМ NaCl

Лаг-нериоЛ) ч

Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4 CH2C12 СНзОН + СН2С12 0.5 I 1 2

Methylopila helvetica ДМб СН2С12 СНзОН + СН2С12 2 2 0 2

Albibacter methylovorans ДМ10 СН2С12 СНзОН + CH2CI2 3 3 1 2

* - использованные концентрации: СНзОН (48 мМ), CII2CI2 (10 мМ)

Табл. 6. Длительность лаг-пернода в потреблении СН2С12 у штаммов-деструкторов, выращенных на метаноле, после воздействия различных стрессоров

Штамм Контроль СНзСООН, рН=5.0 СНзСООН, рН=5.0, NaCl, 32.5 мМ NaCl, 100 мМ t = 42°С

Лаг-период, ч

Mb. dichloromethanicum ДМ4 0.5 15 15 1 9

Мр. helvetica ДМб 2 3 2 1 2

A. methylovorans ДМ 10 3 18 6 1 18

Оказалось, что преадаптация клеток Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ10 к присутствию в среде 100 мМ NaCl приводила к значительному сокращению лаг-периода (на 2 ч) в использовании СН2С12 (Табл. 5). Поскольку у многих прокариот выявлена перекрестная устойчивость к различным стрессорам [Баснакьян, 2003; Воробьева, 2004; Siegele, 2005], был проведен анализ специфичности адаптации к солевому стрессу. Существенное сокращение лаг-периода (на 1 2 ч) в потреблении ДХМ наблюдали у клеток Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ10 в

экспоненциальной фазе роста только после осмотического стресса (Табл. 6). Напротив, после теплового и кислотных шоков длительность лаг-периода у обоих деструкторов увеличивалась. Следовательно, ускоренное начало потребления ДХМ данными деструкторами вызвано перекрестной активацией механизмов галоадаптации, но не связано с неспецифическим ответом клеток на стресс.

0,7-1

а и

5 о,б-„

*гп

6 9

Время инкубации, ч

Рис. 9. Активность дегалогенироваиия (1, 2) и экскреции ионов СГ (3, 4) при инкубации с ДХМ клеток Mb. dichloromethanicum ДМ4 (а), Мр. helvetica ДМ6 (б) и А. methylovorans ДМ10 (в), выращенных па метаноле без NaCl (1,3, 5) и в присутствии 100 мМ NaCl (2,4,6). Используемое количество биомассы в реакции - (5,6).

У Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ10, адаптированных к повышенной солености среды, выявлено более раннее появление активных ДХМДГ при инкубации с ДХМ, нежели у выращенных без NaCl клеток (рис. 9). Однако в отсутствие СН2С12 измерения дегалогеназной активности и электрофоретический

анализ белков в экстрактах клеток не показали наличия ДХМДГ. Следовательно, повышение солености среды само по себе не запускает синтез этого фермента. Быстрое увеличение концентрации ионов С1 в реакционной смеси также не влияло на дегалогеназную активность с ДХМ. В совокупности с ранее обнаруженной регуляторной ролью изменений внутриклеточной концентрации хлора [Jentsch et al., 2002] эти наблюдения свидетельствуют в пользу того, что адаптация Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ10 к повышенной концентрации ионов С1 включает некие механизмы, способствующие ускоренной активации метилен хлоридом транскрипции гена dcmA.

Однако сравнение графиков зависимости активностей ДХМДГ в бесклеточных экстрактах и концентраций ионов С1 в среде от времени инкубации с ДХМ показало, что галоадаптация Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ 10 к потреблению СН2С12 не ограничивается активацией синтеза ДХМДГ. Так, медленный пассивный выход ионов хлора, образующихся при дегалогенировании, в дальнейшем сменяется их ускоренной экскрецией против градиента концентрации. После переноса на ДХМ клеток деструкторов, выращенных на метаноле без NaCl, прирост содержания ионов С1 в среде в течение первого часа после появления активности фермента был незначительным (60 185 нмоль/чхмг АСБ) и лишь затем ускорялся до 470 965 нмоль/ч*мг АСБ (рис. 9). Напротив, у Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ 10, адаптированных к присутствию в среде 100 мМ NaCl, начало эффективного выброса клетками хлор-ионов приближалось или даже совпадало с появлением активности ДХМДГ. Это подразумевает индукцию энергозависимых механизмов выброса С1 у данных штаммов при росте на ДХМ и повышенной солености среды.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о наличии у Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ 10 таких вызываемых галоадаптацией механизмов устойчивости при деградации СН2С12, как ускорение ДХМ-индуцируемой экспрессии гена dcmA и запуск систем активной экскреции хлор-ионов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами получены приоритетные данные о цитобиохимических изменениях клеток аэробных метилобактерий при использовании ДХМ в качестве источника углерода и энергии. Обнаружено, что при этом происходит уплотнение барьера проницаемости клеточных мембран путем существенной модификации жирнокислот-ного и фосфолипидного состава, включающей как типичный ответ клеток на

повышение экзогенной концентрации ионов С1, так и защи ту от самого растворителя. Другим механизмом создания на поверхности клеток отрицательного заряда, препятствующего обратному проникновению анионов в цитоплазму при повышенной солености среды, является связывание на поверхности клеток ионов CI, наблюдаемое при инкубации с СН2С12 только у деструкторов. При росте на ДХМ штаммы-деструкторы также повышали солеустойчивость белков, изменяя их аминокислотный состав, в частности, накапливая осмопротектор - пролиц. Для регенерации кофактора GSH при функционировании ДХМДГ и эффективного ответа на стрессоры, сопутствующие минерализации ДХМ, у деструкторов возрастала активность глутатионредуктазы.

Нами впервые установлено, что ДХМ проникает в цитоплазму посредством пассивной диффузии. При этом клетки деструкторов вынуждены активно экскре-тировать избыток СН2С12 с участием неизвестных переносчиков. Найдено, что деструкторы ДХМ обладают сопряженными с дегалогенированием дополнительными энергозависимыми механизмами, по-видимому, способствующими выбросу протонов Н+-АТФазами при снижении внутриклеточного рН, активному экспорту ионов С1 и удалению из клетки токсичного субстрата. Экскреция внутриклеточно образуемых при дегалогенировании ионов хлора у метилобактерий может происходить также с использованием энергии электрохимического градиента Н+. У Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ10 обнаружены специфичные для адаптации к повышенной солености среды ускорение ДХМ-индуцируемой экспрессии гена dcmA и активация энергозависимых систем экскреции хлор-ионов. Постулируемые нами механизмы адаптации аэробных метилобактерий к минерализации ДХМ нуждаются в дальнейших специальных исследованиях с применением методов геномики и протеомики. Представляя большой интерес в качестве модельных организмов для изучения физиолого-биохимических и молекулярно-генетических основ аэробного метаболизма галометанов, аэробные деструкторы ДХМ перспективны для внедрения на очистных сооружениях целого ряда производств, генерирующих или использующих данный токсикант. Соответственно, знание механизмов устойчивости этих штаммов к сопутствующим дегало-генированию стрессам позволит более рационально реализовать метаболический потенциал метилобактерий в обычных для промстоков экстремальных условиях (повышенная температура, повышенная соленость, сниженные или повышенный рН, высушивание и т.д.) и создать штаммы более эффективные и устойчивые, нежели природные деструкторы галометанов ДХМ.

выводы

1. Обнаружено, что Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4, Methylopila helvetica ДМ6, Albibacter methylovorans ДМ10 снижают текучесть клеточных мембран в присутствии дихлорметана посредством уменьшения относительного содержания ненасыщенных C|8:i и C2oi и увеличения содержания насыщенных С]60, С|8:о жирных кислот или фосфатидилхолина.

2. Основой адаптивного ответа на осмотический стресс при дегалогенировании CH2CI2 клетками Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ 10 является синтез осмопротектора пролина и/или отрицательно заряженных фосфолипидов, снижение количества гидрофобных и повышение доли кислых аминокислот в составе белков. Образование хлор- и фосфорсодержащих поверхностных электронноплотных образований у деструкторов усиливает барьер проницаемости клеточных мембран для экзогенных анионов.

3. Впервые показано, что транспорт дихлорметана в клетки аэробных метило-бактерий осуществляется по механизму пассивной диффузии. Однако у Mb. dichloromethanicum ДМ4 и A. methylovorans ДМ10 найдена энергозависимая экскреция ДХМ, предохраняющая клетки от токсического действия растворителя.

4. У Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ10, адаптированных к повышенной солености среды, выявлены специфичные для солевого стресса ускорение ДХМ-индуцируемой экспрессии дихлорметандегалогеназ и изменения мембранного транспорта, способствующие экскреции ионов С1.

5. Установлено, что при минерализации дихлорметана экскреция ионов С1 против градиента концентрации у Мр. helvetica ДМ6, A. methylovorans ДМ10, Mb. dichloromethanicum ДМ4/рМЕ8220 и Mb. extorquens АМ1/рМЕ8220 осуществляется с использованием энергии химического протонного градиента. В отличие от трансконъюганта Mb. extorquens АМ1/рМЕ8220, у штаммов-деструкторов выявлены связанные с деградацией дихлорметана энергозависимые механизмы выброса ДХМ и/или образуемых С1* и Н+.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи:

1. Фирсова Ю.К, Торгонская М.Л., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Влияние ДНК-повреждающих факторов на аэробные метилобактерии, использующие и неиспользующие дихлорметан //Прикл. биохим. микробиол. 2005. Т.41. №5. С. 547-552.

2.Торгоиская МЛ, Фирсова Ю.Е., Доронина Н.Б., Троценко Ю.А. Адаптация аэробных метилобактерий к деградации дихлорметана // Прикл. биохим. микробиол. 2007. Т. 43. № 1. С. 53-58.

3. Зякун А.М., Фирсова Ю.Е., Торгонская М.Л., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Вариации изотопного состава хлора как показатель бактериального дегалогенирования дихлорметана. // Прикл. биохим. микробиол. 2007. Т. 43, № 6, С. 664-669.

Тезисы:

1. Торгонская М.Л., Фирсова Ю.Е. Сравнительный анализ аэробных метилобактерий, использующих дихлорметан // Биология - наука XXI века: 8-я Международная Пущинская школа - конференция молодых ученых. Пущино, . 17 - 21 мая 2004 г. Сборник тезисов. ОНТИ ПНЦ РАН. 2004. С. 163.

2. Торгонская М. Л., Фирсова Ю. Е„ Зякун А. М. Фракционирование изотопов хлора дихлорметана клетками и бесклеточными экстрактами аэробных метилобактерий. // Биология - наука XXI века: 9-я Международная Пущинская школа - конференция молодых ученых. Пущино, 17 - 18 апреля 2005 г. Сборник тезисов. ОНТИ ПНЦ РАН. 2005. С. 214.

3. Торгонская М.Л. Метаболические аспекты деградации дихлорметана аэробными метилобактериями // Актуальные аспекты современной микробиологии. Тезисы Всероссийской молодежной школы - конференции. 1-3 ноября 2005 г. Москва: «МАКС-Пресс». 2005. С. 108-110.

4. Торгонская М. Л., Баскунов Б. П., Доронина Н. В., Фирсова Ю. £., Захарченко В. Н., Троценко Ю. А., Зякун А. М. Использование 35С1/37С1 для определения микробного дехлорирования дихлорметана // Материалы II Всероссийской конференции «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». 19-23 сентября 2005 г. 2005. Москва. С. МБС-22.

5. Фирсова Ю.Е., Торгонская М.Л., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Деградация дихлорметана аэробными метилобактериями // Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды. Материалы международной конференции. 14-16 сентября 2005 г. Саратов: «Научная книга». 2005. С. 53-54.

6. Фирсова Ю.Е., Торгонская М.Л., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Особенности метаболизма дихлорметана у аэробных метилобактерий // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием. Автотрофные микроорганизмы. Памяти академика РАН Е.Н.Кондратьевой. Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова. 21-24 декабря 2005 г. Москва. С. 75.

7. Торгонская M.JI., Миронова С.А. Транспорт и дегалогенирование дихлорметана аэробными метилобактериями // Биология наука XXI века. 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН. 17-21 апреля 2006 г. Сборник тезисов. Пущино. 2006. С. 215.

8.Yu.E. Firsova, M.L. Torgonskaya, N. V. Doronina, S. Vuilleumier, Yu.A. Trotsenko. Aerobic biodégradation of dichloromethane: enzymatic and genetic aspects. // International Symposium on Environmental Biotechnology ISEB ESEB JSEB 2006. Book of Abstracts. 9-14 July 2006. UFZ Center for Environmental Research LeipzigHalle in the Helmholtz Association. Leipzig, Germany. P. 299.

9. Торгонская M.JI. Аэробная биодеградация дихлорметана: физиолого-биохимические и генетические аспекты // Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология - современные биоаналитические системы, методы и технологии». 28 октября - 3 ноября 2006 г., Пущино. Сборник статей. 2006. С. 16-17.

10. Торгонская М. Л., Фирсова Ю. Е., Доронина Н. В., Троценко Ю. А. Таксономическое и структурно-функциональное разнообразие бактерий-деструкторов дихлорметана. //Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ: материалы 2-го Байкальского Микробиологического Симпозиума с международным участием, Иркутск (Россия), 10-15 сентября 2007 г. Иркутск. Изд-во Института географии им. В. Б. Сочавы СО РАН. 2007. С. 231-232.

11. Торгонская М. Л., Фирсова Ю. Е. Аэробная биодеградация дихлорметана. // III Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Тезисы Всероссийской молодежной школы -конференции. 22-23 ноября 2007 г. Москва. Изд-во: «МАКС-Пресс». 2007. С. 114-115.

12. Torgonskaya M.L., Firsova Yu.E., Zyakun A.M., Richnow H.-H., Vuilleumier S„ Doronina N.V., Trotsenko Yu.A. Compound specific stable isotopes fractionation analysis (CSIA) is an useful approach in studies on the mechanisms involved in dichloromethane degradation by aerobic methylobacteria // European Geosciences Union General Assembly. 13-18 April 2008. Vienna. Austria. Geophysical Research Abstracts. Vol. 10. P. EGU2008-A-09038.

13. Торгонская M. Л. Аэробная биодеградация дихлорметана: новые данные. // IV Межрегиональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия

микроорганизмов с окружающей средой». 14-16 октября 2008 г. Саратов. Материалы конференции. Изд-во: «Научная книга». 2008. С. 38.

Благодарности

Автор искренне признателен сотрудникам, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н. Сузиной Н.Е. за электронно-микроскопическое исследование ультраструктуры клеток, Сорокину В.В. (Институт микро-биологии им. С.Н. Вииоградского РАН, г. Москва) за проведенный рентгеновский микроанализ ультратонких срезов, Лысанской В .Я. за помощь в определении аминокислотного состава клеток, д.б.н. Осипову Г.А. (Академическая группа акад. Исакова Ю.Ф., РАМН, г. Москва) за анализ профилей жирных кислот, д.б.н., проф. Зякуну А. М. и д-ру Рихнову Г.-Г. (Группа изотопной биогеохимии центра исследований окружающей среды (UFZ), г. Лейпциг, Германия) за помощь в масс-спектрометрических исследованиях, проф. Вейюмье С. (Университет Луи Пастера, г. Страсбург, Франция), а также всем сотрудникам лаборатории радиоактивных изотопов (ИБФМ РАН, г. Пущино), UMR CNRS 7156 "Génétique Moléculaire, Génomique et Microbiologie" (Университет Луи Пастера, г. Страсбург, Франция) и Центра исследований окружающей среды (UFZ) (г. Лейпциг, Германия).

Особую благодарность автор выражает своим наставникам и учителям -д.б.н., проф. Троценко Ю.А. и д.б.н. Дорониной Н.В. за постоянное внимание и поддержку.

Подписано в печать: 13.01.2009

Заказ № 25 Тираж -100 экз.

Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Торгонская, Мария Леонидовна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Дихлорметан - антропогенный поллютант из класса галометанов

Глава 2. Микробная деградация дихлорметана

2.1. Особенности биологии аэробных метилотрофных бактерий

2.2. Аэробные метилобактерии - деструкторы дихлорметана

Глава 3. Минерализация дихлорметана аэробными метнлобактерипми

3.1. Этимологические и генетические аспекты дегалогенирования ДХМ

3.2. Адаптация аэробных метилобактернй к минерализации дихлорметана

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Материалы и методы

4.1. Объекты исследований

4.2. Культивирование бактерий

4.3. Исследование ультраструктуры клеток

4.3.1. Получение ультратонких срезов бактериальных клеток и электронная 47 микроскопия

4.3.2. Рентгеновский микроанализ элементного состава компартменюв клеток

4.4. Определение фосфолипидного состава клеток

4.5. Определение состава жирных кислот

4.6. Определение аминокислотного состава

4.7. Определение активности глутатионредуктазы

4.8. Определение концентрации ионов хлора

4.9. Очистка дихлорметандегалогеназ

4.9.1. Получение бесклеточных экстрактов

4.9.2. Высокоскоростная жидкостная хроматография

4.10. Определение активности дихлорметандегалогеназ

4.11. Фракционирование изотопов 12/13с и 35/37С1 при биодеградации ДХМ

4.11.1. Условия эксперимента

4.11.2. Определение изотопного состава дихлорметана и СОг

4.11.3. Определение доли потребления дихлорметана

4.12. Влияние ингибиторов электронного транспорта на биодеградацию ДХМ

4.13. Адаптация клеток деструкторов к присутствию ионов хлора в среде

4.13.1. Оценка длительности лаг-периода в потреблении ДХМ при адаптации к ионам хлора в среде

4.13.2. Влияние стрессоров на длительность лаг-периода в потреблении ДХМ

4.13.3. Определение времени начала экспрессии дихлорметандегалогеназ

4.14. Денатурирующий гель-электрофорез белков в ПААГ

4.15. Оценка выживаемости клеток метилобактерий

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Структурно-функциональная модификация клеток деструкторов при деградации ДХМ

5.1. Изменения состава жирных кислот и фосфолипидов клеток

5.2. Морфология и ультраструктура метилобактерий в присутствии ионов СГ

5.3. Изменения состава аминокислот клеток и активности глутатионредуктазы

Глава 6. Механизмы транспорта ДХМ у деструкторов

6.1. Сравнительный анализ динамики потребления и дегалогенирования ДХМ

6.2. Фракционирование изотопов 12/13С и 35/37С1 при биодеградации ДХМ

6.3. Оценка энергозависимости процесса биодеградации ДХМ

Глава 7. Адаптация деструкторов ДХМ к внутриклеточной продукции СГ

7.1. Экскреция ионов СГ деструкторами при дегалогенировании ДХМ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биодеградация дихлорметана аэробными метилобактериями"

Актуальность проблемы

Исследования дегалогенирования ДХМ ведутся более 20 лет. Получена существенная информация о распространении и таксономии аэробных бактерии-деструкторов CH2CI2, путях их метаболизма и соответствующих ферментах [Троценко, Доронина, 2003]. Тем не менее, наличие довольно ограниченного разнообразия последовательностей дихлорметандегалогеназ (ДХМДГ) у разных штаммов-деструкторов пока не привело к пониманию принципов работы данных ферментов, хотя такая вариабельность может проявляться в тонкой регуляции дегалогеназной активност и /'// vivo. Недавние работы также показали, что важны не только сами дсгалогеназы, по и другие дополнительные ферменты и гены, участвующие в бактериальном метаболизме ДХМ. Трансконъюганты, полученные посредством переноса гена dam А из Mb. dichloromethanicum ДМ4 в Mb. chloromethaniaun СМ4 и Mb. extorquens AMI, активно экспрессировали ДХМДГ, но только трансконъюгант Mb. ch/oromethcmicum СМ4 мог расти на CH2CI2, что свидетельствует о специфической структурно-функциональной организации штаммов-деструкторов галометанов [Kayser et al., 2002]. В связи с этим весьма актуален анализ физиолого-биохимических и молекулярных основ минерализации ДХМ у метилобактерий. Прежде всего, штаммы-деструкторы могут нуждаться в механизмах активного транспорта ДХМ в клетки. С другой стороны, в отличие от первичного метаболизма метанола, процесс деградации ДХМ у метилобактерий зависит от величины пула GSH, а также сопровождается образованием в цитоплазме высоких концентраций Н+ и СГ, S-хлорметилглутатиона и СН2О. Эти реакционноспособные интермедиаты оказывают летальное действие на клетки, не имеющие соответствующих механизмов защиты [Evans et al., 2000; Kayser et al., 2000]. Однако до настоящего времени перечисленные аспекты бактериальной деградации ДХМ остаются неизученными.

Цель и задачи исследования:

В связи с вышеизложенным, целыо работы было выявление цитобиохимичсских особенностей у деструкторов ДХМ Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4, Methylopila helvetica ДМ6 и Albibacter methylovorans ДМ10, реализующих разные пути первичной ассимиляции Ci-соединений. Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:

1. Исследовать цитобнохимические изменения у аэробных метилобактерий деградации ДХМ.

2. Определить механизмы транспорта дихлорметана у аэробных метилобактерий.

3. Изучить механизмы поддержания ионного гомеостаза метилобактериями при дегалогенировании ДХМ.

Научная новизна работы

Впервые показано, что в присутствии ДХМ, а также при повышении солености среды, клетки снижают текучесть мембран, уменьшая относительное содержание ненасыщенных Cis.i и С201 и увеличивая содержание насыщенных Cie.o, Спо, Сш> жирных кислот и фосфатидилхолина. Галотолерантности метилобактерий при росте на ДХМ способствует уменьшение доли гидрофобных и возрастание содержания кислых аминокислот, а также накопление осмопротектора пролина и/или отрицательно заряженных фосфолипидов у Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ 10. На клеточной стенке этих деструкторов обнаружены содержащие хлор и фосфор образования, вероятно, служащие для уплотнения барьера проницаемости мембран для экзогенных анионов.

Результаты масс-спектрометрического анализа фракционирования изотопов 12'пс и 35П7С1 молекул ДХМ интактными клетками, их экстрактами и очищенными ДХМДГ аэробных метилобактерий дают основание предполагать диффузионный механизм транспорта CH2CI2. Однако величина рассчитанных кинетических изотопных эффекте» свидетельствуют также о существовании дополнительных энергозавнеимых механизмов экскреции ДХМ для защиты бактерий от токсического действия этого растворителя.

Ингибиторный анализ выявил, что при минерализации ДХМ аэробными метилобактериями выброс образующихся ионов СГ осуществляется с потреблением энергии химического протонного градиента. Однако, в отличие от трансконъюганга Mb. extorquens АМ1/рМЕ8220, штаммы-деструкторы обладают АТФ-зависимыми механизмами, связанными с деградацией CH2CI2

У Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ 10, адаптированных к повышенной солености среды, выявлено ускорение индуцируемого ДХМ синтеза ДХМДГ', а также специфичное для солевого стресса сокращение лаг-периода в использовании CH2CI2, не связанное с экспрессией гена dcmA и свидетельствующее о цитобиохимических изменениях, способствующих экскреции ионов СГ.

Практическая значимость работы

Данная работа является частью проекта, направленного на решение важной научно-практической проблемы биодеградации ДХМ, опасного загрязнителя окружающей среды в связи с персистентностыо и большими объемами промышленного производства. Изучение физиолого-биохимических и молекулярных основ адаптации аэробных метилобактерий к использованию этого опасного поллютанта значительно расширяет и углубляет знания о бактериальной деградации галометанов. Эти исследования необходимы также для разработки современных биотехнологических процессов разложения дихлорметана на основе активных штаммов и соответствующих ферментов -дегалогеназ, а также для создания штаммов более удобных для применения в промышленных условиях, нежели природные деструкторы галомеганов. Внедрение таких штаммов на очистные сооружения целого ряда производств, связанных с продукцией пли использованием этого поллютанта, позволит создать более эффективные биореакторы для аэробного разложения ДХМ по сравнению с уже существующими [Gälli, 1987; Stucki, 1990; Hartmans, Tramper, 1991; Zuber, 1995; De Best et al„ 2000].

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Между народных Пущинских школах-конференциях молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004, 2005, 2006), Всероссийском симпозиуме с международным участием памяти акад. РАН E.H. Кондратьевой «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2005), конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), школе-конференции молодых ученых ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН (Пущино, 2005), молодежной школе-конференции по масс-спектрометрип (Москва, 2005), международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» ИНМИ им. С.Н. Виноградского РАН (Москва, 2005, 2007), конференции молодых ученых "Современная биотехнология - защите окружающей среды" (Пущино, 2006), международном симпозиуме 1SEB-ESEB-JSEB «Environmental biotechnology» (Лейпциг, 2006), российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология - современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино, 2006), 2-м Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием 1BSM-2007 "Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ" (Иркутск, 2007), Генеральной ассамблее Европейского Союза Геофизических Исследований "Geosciences is responsibility" (Вена, Австрия, 2008), Гордоновской научной конференции «Molecular basis of microbial one-carbon metabolism» (Льюистон, США, 2008), IV-й межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 13 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 130 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 364 ссылки, содержит 10 таблиц и 26 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Торгонская, Мария Леонидовна

выводы

1. Обнаружено, что Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4, Methylopila helvetica ДМ6, Albihacter methylovorans ДМ10 снижают текучесть клеточных мембран в присутствии дихлорметана посредством уменьшения относительного содержания ненасыщенных Cism и Сгол и увеличения содержания насыщенных Cigo, Cixo жирных кислот или фосфатидилхолина.

2. Основой адаптивного ответа на осмотический стресс при дегалогенированин СН2С12 клетками Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ10 является синтез осмопротектора пролина и/или отрицательно заряженных фосфолипидов, снижение количества гидрофобных и повышение доли кислых аминокислот в составе белков. Образование хлор- и фосфорсодержащих поверхностных электронно-плотных образований у деструкторов усиливает барьер проницаемости клеточных мембран для экзогенных анионов.

3. Впервые показано, что транспорт дихлорметана в клетки аэробных метилобактерий осуществляется по механизму пассивной диффузии. Однако у Mb. dichloromethanicum ДМ4 и A. methylovorans ДМ 10 найдена энергозависимая экскреция ДХМ, предохраняющая клетки от токсического действия растворителя.

4. У Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ10, адаптированных к повышенной солености среды, выявлены специфичные для солевого стресса ускорение ДХМ-индуцируемой экспрессии дихлорметандегалогеназ и изменения мембранного транспорта, способствующие экскреции ионов СГ.

5. Установлено, что при минерализации дихлорметана экскреция ионов СГ против градиента концентрации у Мр. helvetica ДМ6, A. methylovorans ДМ 10, Mb. dichloromethanicum ДМ4/рМУЕ8220 и Mb. extorquens АМ1/рМЕ8220 осуществляется с использованием энергии химического протонного градиента. В отличие от трансконъюганта Mb. extorquens АМ1/рМЕ8220, у штаммов-деструкторов выявлены связанные с деградацией дихлорметана энергозависимые механизмы выброса ДХМ и/или образуемых СГ и Н+.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, нами впервые исследованы структурные и функциональные аспекты адаптации клеток аэробных метилобактерий к использованию ДХМ в качестве источника углерода и энергии.

Обнаружено, что при бактериальной деградации ДХМ происходит уплотнение барьера проницаемости клеточных мембран путем существенной модификации жирнокислотного и фосфолипидного состава, включающей типичный отвег клеток на повышение экзогенной концентрации ионов СГ и защиту от самого растворителя. Значение этих защитных механизмов в процессе использования ДХМ у различных деструкторов также различно. Другим механизмом создания на поверхности клеток отрицательного заряда, препятствующего обратному проникновению анионов в цитоплазму при повышенной солености среды, является связывание на поверхности клеток ионов СГ, наблюдаемое при инкубации с СН2СЛ2 только у штаммов-деструкторов.

Выявлено, что при росте па ДХМ штаммы-деструкторы повышают солеустойчивость своих белков, изменяя их аминокислотный состав, а также могут накапливать осмопротектор пролин. Для регенерации кофактора GSH при функционировании ДХМДГ и эффективного ответа на стрессоры, сопутствующие минерализации ДХМ, в клетках деструкторов увеличивается активность глутатионредуктазы.

Нами впервые установлено, что трансмембранный транспорт ДХМ в цитоплазму осуществляется по механизму пассивной диффузии, поэтому штаммы, способные использовать это соединение в качестве ростового субстрата, по-видимому, снижают его токсическое действие путем активного выброса из клеток части молекул ДХМ с участием неизвестных переносчиков.

У Мр. helvetica ДМ6 и A. methy/ovorans ДМ 10 наряду с DcmR-опосредованпой репрессией транскрипции структурного гена дихлорметандегалогеназы dcmA обнаружена активация синтеза ДХМДГ у клеток, адаптированных к повышенной солености среды, что свидетельствует о регуляторной роли изменений внутриклеточной концентрации хлора, неоднократно отмеченной для других микроорганизмов [Jentsch et al., 2002; Miiller, Oren, 2003]. При этом ускоренная адаптация к потреблению ДХМ штаммами Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ 10 лишь отчасти обусловлена более быстрым появлением активных ДХМДГ и указывает на специфичную для солевого стресса «подстройку» мембранного транспорта, способствующую выбросу ионов СГ, образуемых при дегалогеннрованип.

Предполагается, что экскреция внутриклеточно образуемых при минерализации ДХМ ионов СГ против концентрационного градиента происходит у изучаемых метилобактерий по механизму вторично активного транспорта с использованием ионно-электрохимического градиента протонов. Вместе с тем, по-видимому, только штаммы-деструкторы ДХМ обладают сопряженными с дегалогенированием дополнительными энергозависимыми механизмами, расходуя энергию АТФ на стимулируемый снижением внутриклеточного рН выброс протонов Нь-АТФазами, активную экскрецию ионов СГ и удаление из клетки токсичного субстрата. Выявленное при использовании ДХМ бактериальными клетками одновременное окисление других внутриклеточных компонентов, вероятно, также играет определенную роль в энергоснабжении этих транспортных систем [Зякун и соавт, 2007].

Очевидно, что постулируемые нами механизмы адаптации аэробных метилобактерий к стрессам, сопутствующим минерализации дихлорметана, нуждаются в дальнейших специальных исследованиях с применением методов геномики и протеомики В частности, предстоит выяснить молекулярные основы действия эффекторов, регулирующих активность синтеза дихлорметандегалогеназ, и сигнальных систем, запускающих ответные реакции клеток на сопутствующие бактериальной деградации дихлорметана стрессорные воздействия.

Представляя большой интерес в качестве модельных организмов для изучения физиолого-биохнмических и молекулярно-генетических основ аэробного метаболизма галометанов, аэробные деструкторы ДХМ перспективны для внедрения на очистных сооружениях целого ряда производств, генерирующих или использующих данный токсикант. Соответственно, знание механизмов устойчивости этих штаммов к сопутствующим дегалогенированию стрессам позволит более рационально реализовать метаболический потенциал метилобактерий в экстремальных условиях (повышенная температура, повышенная соленость, сниженный или повышенный рН, высушивание и т.д.), обычных для индустриальных процессов, и разработать штаммы более эффективные и удобные для использования в биотехнологических процессах разложения ДХМ, нежели природные деструкторы галометанов.

В целом, полученные нами приоритетные данные в изучении биологии аэробных метилобактерий - деструкторов ДХМ приблизили нас не только к пониманию основ их жизнедеятельности, но и к разработке новых технологий биоремедиацни токсичных галометанов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Торгонская, Мария Леонидовна, Пущино

1. Басиакъян И. А. Стресс у бактерий / Рец. Воробьев А. А., М.: Медицина. 2003. 136 с.1

2. Воробьева Л.И. Стрессоры, стрессы и выживаемость бактерий // Прикл. биохим.микробиол. 2004. Т. 40. № 3. с. 261-269.

3. Гланц С. Медико-биологическая статистика // пер. с англ. M : Практика. 1998. 459 с.

4. Говорухина Н.И., Троцепко ЮА. Фосфолипидный состав метилотрофных бактерий // Микробиология. 1989. Т. 58 № 3. С. 405-411.

5. Дембицкий В.М., Толстиков ГА. Природные галогенированные органическиесоединения // Новосибирск: Изд-во СО РАН, филиал "Гео". 2003. 366 с.

6. Доронина Н.В. Биоразнообразие и таксономия аэробных метилобактерий // Автореф.дисс. докт. биол. наук. Пущино. 1999. 32 с.

7. Доронина Н.В., Краузоса В.И., Троцепко Ю.А. Methylophaga limanica новый видумеренно галофильных аэробных метилобактерий // Микробиология. 1997. Т.66. № 4. С. 528-533.

8. Доронина Н.В., Сахаровский В.Г., Драчук C.B., Троцепко Ю.А. Органическиеосмопротекторы аэробных умеренно галофильных метилобактерий // Микробиология. 1998. Т.67. № 4. С.458-463.

9. Доронина Н.В., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Новый факультативный метилотроф,использующий дихлорметан // Микробиология. 1996. Т. 65 № 2. С. 254-261.

10. Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Выделение и характеристика аэробных деструкторовхлорметана// Микробиология. 1997. Т. 66. № 1. С. 70-77.

11. Ермилова Е.В. Молекулярные аспекты адаптации прокариот // Спб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та. 2007. 299 с.

12. Лакии Г.Ф. Биометрия // 4-е изд., доп. М.: Высш. шк. 1990. 352 с.

13. Pamnep Е.Н., Ушаков В.М., Фихте Б.А. Устройство для экструзионной дезинтеграциимикроорганизмов // Под ред. Фихте Б.А. Пущино. 1972. С. 240-246.

14. Фирсова Ю.Е., Торгонскан М.Л., Доронина Н.В., Троценко Ю.А Влияние ДИК-повреждающих факторов на аэробные метилобактерии, использующие и не использующие дихлорметан //Прикл. биохим. микробиол. 2005. Т.41. №5. С. 547-552.

15. Шишкина В.Н., Трог\енко Ю.А. Уровни ассимиляции углекислоты метанотрофнымибактериями // Микробиология. 1986. Т. 55. № 3. С. 377-382.

16. Abagyan R.A., fíaíalov S. Do aligned sequences share the same fold? // J. Mol. Biol. 1997. V.273. P. 355-368.

17. Accardi A., Kolmakova-Parlensky L, Williams C., Miller C. Ionic currents mediated by aprokaryotic homologue of C1C C12 channels //J. Gen. Physiol. 2004. V. 123. P. 109-119.

18. Ahmed E.A., Anders M.W. Metabolism of dihalomethanes to formaldehyde and inorganichalide // Biochem. Pharmacol. 1978. V 27. P. 2021-2025.

19. Anthony C. The biochemistry of methylotrophs // Academic Press. London. 1982. 251 p.

20. Anthony C. The structure of bacterial quinoprotein dehydrogenases // Int. J. Biochem. 1992.1. V. 24. P. 29-39.

21. Anthony C. Methanol dehydrogenase in Gram-negative bacteria // In: Principles and

22. Application of Quinoproteins (Davidson V.L., Ed. Marcel Dekker). New York. 1993. P. 1745.

23. Anthony C., Zatman L.J. The microbial oxidation of methanol. The methanol-oxidizingenzyme of Pseudomonas sp. M27 //Biochem. J. 1964. V.92. P.614-621.

24. Aravind L, Walker D.R., Koonin E.V. Conserved domains in DNA repair proteins andevolution of repair systems //Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 1223-1242.

25. Armstrong R.N. Structure, catalytic mechanism, and evolution of the glutathione transferases

26. Chem. Res. Toxicol. 1997. V. 10. P. 2-18.

27. Attwood MM Formaldehyde dehydrogenases from methylothrophs // Methods Enzymol. 1990. V. 188. P. 314-324.

28. Allwood MM, Ouayle J.R. Formaldehyde is a central intermediary metabolite ofmethylotrophic metabolism // Microbial growth on Ci compounds. ASM, Washington DC: Crawford RL, Hanson RS (eds). 1984. P. 315-323.

29. Augusto-Pinto L, dct Silva C.G.R., de Oliveira Lopes D., Machado-SUva A., Renato Machado C. Escherichia coli as a model system to study DNA repair genes of eukaryotic organisms // Genet. Mol. Res. 2003. V. 2. № 1. P. 77-91.

30. Babini E., Pusch M A two-holed story: structural secrets about C1C proteins becomeunraveled? // Physiology. 2004. V. 19. P. 293-299.

31. Bader R., Leisinger T. Isolation and characterization of the Methylophilns sp. strain DM11gene dichloromethane dehalogenase/glutathione S-transferase // J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 3466-3473.

32. Balajee A.S., Bohr V.A. Genomic heterogeneity of nucleotide excision repair // Gene. 2000.1. V. 250. P. 15-30.

33. Bartnicki E.W., Castro C.E. Biodehalogenation: rapid oxidative metabolism of mono- andpolyhalomethanes by Methylosinus trichosporiiim OB-3b // Environ. Toxicol. Chem. 1994. V. 13. P. 241-245.

34. Bayles D.O., Wilkinson B.J. Osmoprotectants and cryoprotectants for Listeria monocytogenesII Lett. Appl. Microbiol. 2000. V. 30. P. 23-27.

35. Bentcil M, Pick U., Avron M, Degani H. Metabolic studies with NMR spectroscopy of the alga Dnnaliella salina trapped within agarose beads // Eur. J. Biochem. 1990. V. 188. P. 111-116.

36. Bergmann J.G., Sanik ./. Determination of trace amounts of chlorine in naphtha // Anal.

37. Chem. 1957. V. 29. P. 241-243.

38. Beveridge T.J., Pouwels P., Sära M., Kotiranta A., Launatmaa K. Functions of S-layers // FEMS Microbiol. Rev. 1997. V. 20. №1/2. p. 99-149.

39. Beniner R.R., Te Giffel M.C., Cox L.J., Rom bonis F.M., A bee T. Effect of exogenous proline,betaine, and carnitine on growth of Listeria monocytogenes in a minimal medium //Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. P. 1359-1363.

40. Bishop A.J.R., Schiestl R.H. Homologous recombination as a mechanism for genomerearrangements: environmental and genetic effects I I Human Mol. Genetics. 2000. V. 9. № 16. P. 2427-2434.

41. Blankenborn D., Phillips J., S/onczewski .1.1,. Acid- and base-induced proteins during aerobicand anaerobic growth of Escherichia coli revealed by two-dimensional gel electrophoresis // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 2209-2216.

42. Blocki F.A., Logan M.S.P., Baoli C., Wacketl L.P. Reaction of rat liver glutathione Stransferases and bacterial dichloromethane dehalogenase with dihalomethanes // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 8826-8830.

43. BöckA., Sowers G. Fermentation //.n Neidhardt F.C., Curtiss R. Ill, fngraham J.L., Lin E.C.

44. C., Low K.B., Magasanik B., Reznikoff W.S., Riley M„ Schaechter M„ Umbarger HE. (ed.), Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, 2nd ed. ASM Press, Washington, D.C. 1996. P. 262-282.

45. Boldauf Ct., Kuhn W. Halogenorganische Verbindungen in Grundwasser: Vorkommen,

46. Verbreitung und Aufbereitung II Neue Deliwa Z. 1985. V. 4. P. 121-131.

47. Booth I.R. Regulation of cytoplasmic pH in bacteria II Microbiol. Rev. 1985. V. 49. № 4. P.329.378.

48. Booth LR., EdwardsM.D., Miller S. Bacterial ion channels // Biochemistry. 2003. V. 42. P.10045-10053.

49. BixidfordM.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248354.

50. Brenner S.E., Chothia C., Hubbard T.J. Assessing sequence comparison methods withreliable structurally identified distant evolutionary relationships // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 6073-6078.

51. Brey R.N., Rosen B.P., Sorensen E.N. Cation/proton antiport systems in Escherichia co/i // J.

52. Biol. Chem. 1979. V. 255. P. 39-44.

53. Brunner W., Staub D., Leisinger 1'. Bacterial degradation of dichloromethane // Appl

54. Environ. Microbiol. 1980. V. 40. № 5. P. 950-958.

55. Butler J.H. Better budgets for methyl halides? //Nature. 2000. V. 403. P. 260-261.

56. Butler J.D., Levin S.W., Facchiano A., Miele L., Mukherjee A.B. Amino acid compositionand N-terminal sequence of purified cystine binding protein of Escherichia coli II Life Sci. 1993. V. 52. P. 1209-1215.

57. Byers H.K., Sly L.I. Toxic effects of dichloromethane on the growth of methanotrophic bacteria//FEMS Microbiol. Ecol. 1993. V. 12. P.35-38.

58. Bystrykh, L.V., Govorukhina N.I., Dijkhuizen L., Duine J.A. Tetrazolium-dye-linked alcohol dehydrogenase of the methylotrophic actinomycete Amycolatopsis methanolica is a three-component complex //Eur. J. Biochem. 1997. V. 247. P. 280-287.

59. Carlsson J., Hamilton I.R. Differential toxic effects of lactate and acetate on the metabolism of.Streptococcus mutans and Streptococcus sanguis II Oral. Microbiol. Immunol. 1996. V. 11. P. 412-419.

60. Castanie-Comet M.-P., Penfound T.A., Smith 11, Elliott J.E., Foster J.W. Control of acid resistance in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1999. V. 181. № 11. P. 3525-3535.

61. Chagneau C., Heyde M, Alonso S., Portalier R., Laloi P. External-pH-dependent expression of the maltose regulon and ompF gene in Escherichia coli is affected by the level of glycerol kinase, encoded by glpKII J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 5675-5683.

62. Chang G., Spencer R.H., Lee A.T., Barclay M.T., Rees D.C. Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel // Science. 1998. V. 282. P. 2220-2226.

63. Chesney A., Eaton J.W., Mahoney J.R., Jr. Bacterial glutathione: a sacrificial defense against chlorine compounds//J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 2131-2135.

64. Chistoserdova L. Metabolism of formaldehyde in M. extorquens AMI // In M.T Lidstrom, (ed.), Microbial growth on CI compounds. Kluwer Academic Publishers, Netherlands. 1996. P. 16-24.

65. Chistoserdova L., Vorholt J.A, Thauer R.K., Lidstrom M.E. Ci transfer enzymes and coenzymes linking methylotrophic and methanogenic archaea // Science. 1998. V. 281. P. 99-102.

66. Claes B., Dekeyser R., VUlarroel R., Van den Bulcke M, Bauw G., Van Montagu M., Cap/an A. Characterization of a rice gene showing organ-specific expression in response to salt stress and drought// Plant Cell. 1990. V. 2. P. 19-27.

67. Collier M.L., Levesque P.C., Kenyan J.L., Hume J.R. Unitary CI" channels activated by cytoplasmic Ca2) in canine ventricular myocytes // Circ. Res. 1996. V. 78. P. 936-944.

68. Cotter P.D., Hill C. Surviving the acid stress: responses of gram-positive bacteria to low pH // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67. P. 429-453.

69. Csonka L.N. Physiological and genetic responses of bacteria to osmotic stress // Microbiol. Rev. 1989. V. 53. P. 121-147.

70. Cui S., Huang F., Wang ./., Ma X., Cheng Y., Liu J. A proteomic analysis of cold stress responses in rice seedlings // Proteomics. 2005. V. 5. № 12. P. 3162-3172.

71. Cunningham R.P., Saporito S.M., Spitzer S.G., Weiss B. Endonuclease IV (nfo) mutant of Escherichia coli II J. Bacteriol. 1986. V. 168. P. 1120-1127.

72. Dashper S.G., Reynolds K.C. Lactic acid excretion by Streptococcus niiifans//Microbiology.1996. V. 142. P. 33-39.

73. De Best J.H., Ultee J., Hage A., Doddema H.J., Janssen D.B., Harder W. Dichloromethaneutilization in a packed-bed reactor in the presence of various electron acceptors // Water Res. 2000. V. 34. P. 566-574.

74. Delides A., Spooner R.J., Goldberg D.M., Neal F.E. An optimized semi-automatic ratemethod for serum glutathione reductase activity and its application to patients with malignant disease // J. Clin. Pathol. 1976. V. 29. P. 73-77.

75. De Lisle R.C., Hopfer U. Electrolyte permeabilities of pancreatic zymogen granules:implications for pancreatic secretion // Amer. J. Physiol. 1986. V. 250. P. G489-G496.

76. De Vlies G.E., Kues U., Stahl U. Physiology and genetics of methylotrophic bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 75. P. 57-102.

77. Dechert S. Untersuchungen zum Wirkmechanismus der Mutagenität und Tumorigenität von

78. Dichlormethan und seinen Metaboliten II Dissertation, Universität Würzburg. 1995.

79. Deyhly R.R., Barton L.L. Nicotinamideadenindinucleotide independent phlei II Can. J. Microbiol. 1977. V. 23. P. 125-130.

80. Dhillon S., Von Burg RJ. Toxicology update. Methylene chloride// Appl. Toxicol. 1995. V.15. P. 329-335.

81. Dijkhuizen L, Ar/man N. Methanol metabolism in thermotolerant methylotrophic Bacillussp. // n Andreesen J.R., Bowien B. (ed.), Microbial growth on Ci-compounds. FEMS Microbiol. Revs. 1990. V. 87. P. 215-219.

82. Diks R.M., Ottengraf S.P. Verification studies of a simplified model for the removal ofdichloromethane from waste gases using a biological trickling filter (part II) // Bioprocess. Eng. 1991. V. 6. P. 131-140.

83. Doronina N. V., Trotsenko Y.A. Aerobic methylotrophic bacterial communities of hypersalineecosystems //Microbiology. 1997. V. 66. P. 130-136.

84. Doronina N. V., Trotsenko Y.A., Krausova V.I., SuzinaN.E. Paracoccus methylutens sp. nov.,a new aerobic facultatively methylotrophic bacterium utilizing dichloromethane // Syst. Appl. Microbiol. 1998. V. 21. № 5. P. 230-236.

85. Dotsch P.W., Cunningham R.P. The enzymology of apurinic/apyrimidinic endonucleases // Mut. Res. 1990. V. 336. P. 173-201.

86. Douglas R.M., Roberts J.A., Munro A.W., Ritchie G.Y., LMnib A J., Booth LR. Thedistribution of homologues of the Escherichia coli KefC KT-efflux system in other bacterial species//! Gen. Microbiol. 1991. V. 137. P. 1999-2005.

87. Duine J.A., Frank J., Ruiter L.S. Isolation of methanol dehydrogenase with a functionalcoupling to cytochrome c II J. Gen. Microbiol. 1979. V. 115. P 523-524.

88. Dutzler R., Campbell E.B., MacKinnon R. Gating the selectivity filter in C1C chloridechannels//Science 2003. V. 300. P. 108-112.

89. Edwards P.R., CampbellJ., Milne G.S. The impact of chloromenthane on environment //

90. Chem. ind. 1982. V. 41. P. 619-622.

91. Feldman M.Y. Reactions of nucleic acids and nucleoproteins with formaldehyde // Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1973. V. 13. P. 1-49.

92. Ferguson G.P., McLaggan D., Booth I.R. Potassium channel activation by glutathione-S-conjugates in Escherichia coir, protection against methylglyoxal is mediated by cytoplasmic acidification // Mol. Microbiol. 1995. V. 17. P. 1025-1033.

93. Ferguson G.P., Toetemeyer S., MacLean M.J., Booth I.R. Methylglyoxal production in bacteia: suicide or survival? //Arch. Microbiol. 1998. V. 170. P. 209-219.

94. Fetzner S. Bacterial dehalogenation // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 50. P. 633-657.

95. Fnedberg E.G., Walker G.C., Siede W. DNA repair and mutagenesis // ASM Press, Washington, DC. 1995.

96. Fuller G.M. Calcium-activated chloridc channels // Academic. Curr. Top. Membr. 2002. V. 53. P. 368-387.

97. Gälli R. Optimierung des mikrobiellen Abbaus von Dichloromethan in einem Wirbelschicht-Bioreaktor//ETH-Dissertation No. 7994, Zürich. 1986.

98. Gälli R. Biodegradation of dichloromethane in waste water using a fluidized bed reactor // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. V. 27. P. 206-213.

99. Gälli R, Leisinger T. Specialized bacterial strains for the removal of dichloromethane from industrial waste //Conservation and Recycling. 1985. V. 8. P. 91-100.

100. Gasser K. W., Di Domenico J., Hopfer U. Secretagogues activate chloride transport pathways in pancreatic zymogen granules // Amer. J. Physiol. 1988. V. 254. P. G93-G99.

101. Gerencser G.A., Zhang J. Chloride ATPase pumps in nature: do they exist? // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 2003. V. 78. P. 197-218.

102. Gögelein H. Chloride channels in epithelia // Biochim.Biophys.Acta. 1988.V.947.P.521-547.

103. Goodwin K.D., North W.J., Lidstrom M.E. Production of bromoform and dibromomethane by giant kelp: Factors affecting release and comparison to anthropogenic bromine sources // Limnol. Oceanogr. 1997. V. 42. P. 1725-1734.

104. Goodwin K.D., Varner R.K., Crill P.M., Oremland R.S. Consumption of tropospheric levels of methyl bromide by Ci compound-utilizing bacteria and comparison to saturation kinetics // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. № 12. P. 5437-5443.

105. Goltscha!,/., Morris J.G. The induction of acetone and butanol production in cultures of Clostridium acetobutylicum by elevated concentrations of acetate and butyrate // FEM S Microbiol. Lett. 1981. V. 12. P. 385-389.

106. Gowrishankar ./. Nucleotide sequence of the osmoregulator of proU operon of Escherichia coli II J. Bacterid. 1989. V. 171. P. 1923-1931.

107. Grabow W.O.K., Grauss-Mueller V., Prozesk)> O. IV., Deinhardt F. lnactivation of hepatitis A virus and indicator organisms in water by free chlorine residuals II Appl. Environ. Microbiol. 1983. V. 46. P. 619-624.

108. A2.Green T. Methylene chloride induced mouse liver and lung tumours: an overview of the role of mechanistic studies in human safety assessment// Hum.Exp.Toxicol. 1997. V. 16. P. 3-13.

109. Gross R., Arico B., Rappuoli R. Families of bacterial signal-transducing proteins // Mol. Microbiol. 1989. V. 3. № 11. P. 1661-1667.

110. Hamilton I.R., Buckley N.D. Adaptation by Streptococcus mutans to acid tolerance // Oral Microbiol. Immunol. 1991. V. 6. P. 65-71.

111. Harder W., AttwoodM.M., Ouayle J.R. Methanol assimilation by Hyphomicrobium species Hi. Gen. Microbiol. 1973. V. 78. Pt. 1. P. 155-163.

112. Harder W., Dijkhuizen L. Physiological responses to nutrient limitation // Annu. Rev. Microbiol. 1983. V. 37. P. 1-23.

113. Harper D.B. The global chloromethane cycle: biosynthesis, biodégradation and metabolic role//Nat. Prod. Rep. 2000. V. 17. P. 337-348.

114. Harlmans S., Tramper J. Dichloromethane removal from waster gases with a trickle-bed bioreactor//Bioprocess Eng. 1991. V. 6. P. 83-92.

115. Hayes J.D., Pulford D.J. The glutathione ^-transferase supergene family: regulation of GSTs and the contribution of the isoenzymes to cancer chemoprotection and drug resistance // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1995. V. 30. P. 445-600.

116. Head C.G., Tardy A., Kenney L.J. Relative binding affinities of OmpR and OmpR-phosphate at the ompF and ompC regulatory sites // J. Mol. Biol. 1998. V. 281. P. 857-870.

117. Hektor H.J., Kloosterman H., Dijkhuizen L. Nicotinoprotein methanol dehydrogenase enzymes in gram-positive methylotrophic bacteria // J. Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2000. V. 8. P. 103-109.

118. Heraty L.J., Fuller M.E, Huang L., Abrajano T., Sturchio N.C. Isotopic fractionation of carbon and chlorine by microbial degradation of dichloromethane // Org. Geochem. 1999. V. 30. P. 793-799.

119. Herbert K.C., Foster S.J. Starvation survival in Listeria monocytogenes-, characterization of the response and the role of known and novel components // Microbiology. 2001. V. 147. P. 2275-2284.

120. Hersh B.M., Farooq F.T., Barstad D.N., Blankenhorn D.L., Slonczewski J.L. A glutamate-dependent acid resistance gene in Escherichia coli II J. Bacterid. 1996. V. 178. P. 39783981.

121. Heyde M, Laloi P., Portalier II. Involvement of carbon source and acetyl phosphate in the external-pH-dependent expression of porin genes in Escherichia coli II J. Bactcriol. 2000. V. 182. № 1. P. 198-202.

122. Heyde M, Lazzaroni J.-C., Magnoidoux-Blanc B., Portalier R. Regulation of porin gene expression over a wide range of extracellular pH in Escherichia coli K-12: influence of a tolA mutation // FEMS Microbiol. Lett. 1988. V. 52. P. 59-66.

123. Hiraishi A., Furuhata K., Matsumoto A., Koike K.A., Fukuyama M., Tabuchi K. Phenotypic and genetic diversity of chlorine-resistant Methylobacterium strains isolated from various environments // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 61. № 6. P. 2099-2107.

124. Hiraoka M, Kawano S., Hirano Y., Furukawci T. Role of cardiac chloride currents in action potential characteristics and arrhythmias//Cardiovasc. Res. 1998. V. 40. P. 23-33.

125. Holt B.D., Sturchio N.C., Abradjano T., Heraty L.J. Conversion of chlorinated organic compounds to carbon dioxide and methyl chloride for isotopic analysis of carbon and chlorine// Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 2727-2733.

126. Hopner J., Traatwein A. Pseudomonas oxalaticus: requirement of a cosubstrate for growth on formate// Biochem. J. 1971. V.155. P.234-245.

127. Houghton J.T., Callander B.A. The supplementary report to the IPCC Scientific Assessment. Climate change // Cambridge University Press, Cambridge. 1992. P. 56.

128. Howard P.H. Handbook of environmental fate and exposure data for organic chemicals // Lewis Publishers Inc., Chelsea, Michigan. 1990. V. 3. 684 p.

129. Isidorov V.A. Organic chemistry of the earth's atmosphere // Springer Verlag, Berlin. 1990. 210 p.13Jyer R., Iverson T.M., Accardi A., Miller C. A biological role for prokaryotic C1C chloride channels//Nature. 2002. V. 419. P. 715-718.

130. Janssen D.B. Haloalkane-utilizing Rhodococcus strains isolated from geographically dictinct locations possess a highly conserved gene cluster encoding haloalkane metabolism // J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 2725-2731.

131. Jemth P., Mannervik B. Kinetic characterization of recombinant human glutathione transferase Tl-1, a polymorphic detoxication enzyme // Arch. Biochem. Biophys. 1997. V. 348. P. 247-254.

132. Jorg G., Bertau M. Thiol-tolerant assay for quantitative colorimetric determination of chloride released from whole-cell biodehalogenations // Anal. Biochem. 2004. V. 328. P. 22-28.

133. RO.Kappes R.M., Kempf B., Bremer E. Three transport systems for the osmoprotectant glycine betaine operate in Bacillus subti/is: characterization of OpuD // J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 5071-5079.

134. Kashhvagi K, Yamaguchi V., Sakai Y., Kobayashi H., Igarashi K. Identification of the polyamine-induced protein as a periplasmic oligopeptide binding protein // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 8387-8391.

135. Kayser M/<'., Slumpp M.T., Vuilleumier S. DNA polymerase is essential for growth of Methylobacterium dichloromethanicum DM4 with dichloromethane // J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 5433-5439.

136. S3.Kayser M.F., Ucurum Z., Vuilleumier S. Dichloromethane metabolism and C(l) utilization genes mMethylobacierium strains // Microbiology. 2002. V. 148. P. 1915-1922.

137. Keener W.K., Arp D.J. Kinetic studies of ammonia monooxygenase inhibition in Nitrosomouas europaea by hydrocarbons and halogenated hydrocarbons in an optimized whole-cell assay //Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 2501-2510.

138. Ken-Dror S., Preger R., Avi-Dor Y. Functional characterization of the uncoupler-insensitive Nal pump of the halotolerant bacterium, Bal // Arch. Biochem. Biophys. 1986. V. 244. P. 122-127.

139. Ken-Dror S., Preger R., Avi-Dor Y. Role of betaine in the control of respiration and osmoregulation of a halotolerant bacterium // FEMS Microbiol. Rev. 1986. V. 39. P. 115120.

140. Khali!M.A.K., Rasmussen R.A., Gunawardena R. Atmospheric methyl bromide: trends and global mass balance//J. Geophys. Res. 1993. V. 98. P. 2887-2896.

141. Klecka G.M. Fates and effects of methylene chloride in activated sludge // Appl. Environ. Microbiol. 1982. V. 44. P. 701-707.

142. Ko R., Smith L.T., Smith G.M. Glycine betaine confers enhanced osmotolerance and cryotolerance on Listeria monocytogenes // L Bacteriol. 1994. V. 176. P. 426-431.

143. Ko R., Smith L.T. Identification of an ATP-driven, osmoregulated glycine betaine transport system in Listeria monocytogenes !I Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 4040-4048.

144. Kohfer-Staiib I)., Hartmans S., Gdlli R., Suter F., Leisinger T. Evidence for identical dichloromethane dehalogenase in different methylotrophic bacteria // J. Gen. Microbiol. 1986. V. 132. P. 2837-2843.

145. Kuchta T., Russell N.J. Glycinebetaine stimulates, but NaCl inhibits, fatty acid biosynthesis in the moderately halophilic eubacterium HX//Arch. Microbiol. 1994. V. 161. P. 234-238.

146. La Roche S.IX, Leisinger T. Identification of dcmR, the regulatory gene governing expression of dichloromethane dehalogenase in Methylobacterium sp. DM4 // J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 6714-6721.

147. La Roche S.D., Leisinger T. Sequence analysis and expression of the bacterial dichloromethane dehalogenase structural gene, a member of the glutathione S-transferase supergene family//J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 164-171.

148. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

149. Lambert LA., Abshire K., Blankenhorn D., Slonczewski J.L. Proteins induced in Escherichia coli by benzoic acid//J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 7595-7599.

150. Landi S. Mammalian class Theta GST and differential susceptibility to carcinogens, a review//Mutat. Res. 2000. V. 463. P. 247-283.

151. Lazar S.W., Almiron M., Torino A., Kolter R. Role of the Escherichia coli SurA protein in stationary-phase survival //J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 5704-5711.

152. Le Eevre ERound L.A. A preliminary report upon some halophilic bacteria // J. Bacteriol. 1919. V. 4. P. 177-182.

153. Lidsirom M.E. Aerobic methylotrophic prokaryotes // In Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H., Stackebrandt E. (eds.) The Prokaryotes. 2nd ed. Springer-Verlag, New York. N.Y. 2006. Chapter 1.20. P. 618-634.

154. Machaca K., Hartzell H.C. Asymmetrical distribution of Ca-activated CI channels in Xenopus oocytes // Biophys. J. 1998. V. 74. P. 1286-1295.2\9.Madern D., Ebel C., Zaccai G. Halophilic adaptation of enzymes // Extremophiles. 2000. V. 4. P. 91-98.

155. Maness P.C., Smolimki S., Blake D.M., Huang Z, Wolfrum E.J., Jacoby W.A. Bactericidal activity of photocatalytic Ti02 reaction: toward an understanding of its killing mechanism // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 4094-4098

156. Manley S.L., Goodwin K.D., North W.J. Laboratory production ofbromoform, methylene bromide and methyl iodide by macroalgae and distribution in nearshore southern California waters//Limnol. Oceanogr. 1992. V. 37. P. 1652-1659.

157. Mannervik B., Danielson U.H. Glutathione transferases structure and catalytic activity // CRC Crit. Rev. Biochem. 1988. V. 23. P. 283-337.

158. Maris K.A. The functions and regulation of glutathione S-transferases in plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996. V. 47. P. 127-158.

159. Martin J.L Thioredoxins: a fold for all reasons // Structure. 1995. V. 3. P. 245-250.

160. McKay D., Shin W.Y., Ma K.C. Volatile organic chemicals // Lewis Publishers, Boca Raton 1993. V. 3. P.400-406.

161. McLaggan D., NaprslekJ., Buurman E.T., Epstein W. Interdependence of K+ and glutamate accumulation during osmotic adaptation of Escherichia coli II J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 1911-1917.

162. Merrell D.S., Camilli A. Acid tolerance of gastrointestinal pathogens // Curr. Opin. Microbiol. 2002. V. 5. P. 51-55.

163. Messmer M., Reinhardt S., Wohlfarth G., Diekert G. Studies on methyl chloride dehalogenase and O-demethylase in cell extracts of the homoacetogen strain MC based on a newly developed coupled enzyme assay // Arch. Microbiol. 1996. V. 165. P. 18-25.

164. Meyer D.J., Coles B., Pemble S.E., Gilmore K.S., Eraser G.M., Ketterer B. Theta, a new class of glutathione transferases purified from rat and man // Biochem. J. 1991. V. 274. P. 409-414.

165. Miller D.M.O., Jones J.H., Yopp J.H., Tindall D.R., Schmid W.D. Ion metabolism in a halophilic blue green alga, Aphanothece halophytica II Arch. Microbiol. 1976. V. 111. P. 145-149.

166. Miloshevsky G.V., Jordan P.C. Anion pathway and potential energy profiles along curvilinear bacterial C1C Cl"-pores: electrostatic effects of charged residues // Biophys. J. 2004. V. 86. P. 825-835.

167. Miyoshi A., Rochat T., Gratadeux,/./., Le Loir Y., Oliveira S.C., Langella P., Azevedo V. Oxidative stress in Lactococcus lactis II Genet. Mol. Res. 2003. V. 2. № 4. P. 348-359.

168. Mizuno 7., Mizushima S. Signal transduction and gene regulation through the phosphorylation of two regulatory components: the molecular basis for the osmotic regulation of the porin genes // Mol. Microbiol. 1990. V. 4. P. 1077-1082.

169. Neely M.N., Dell C.L., Olson E.R. Roles of LysP and CadC in mediating the lysine requirement for acid induction of the Escherichia coli cad operon // J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 3278-3285.

170. Nikaido H. Porins and specific diffusion channels in bacterial outer membranes // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 3905-3908.

171. Nikaido H., Vaara M. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability // Microbiol. Rev. 1985. V. 49. P. 1-32.

172. Osier man-Golkar S., Hussain S., Walles S., Anderstam B, Sig\>ardsson K. Chemical reactivity and mutagenicity of some dihalomethanes // Chem. Biol. Interactions. 1983. V. 46. P. 121-130.

173. Ottengraf S., Meesters J., van den Oever A., Rosema H. Biological elimination of volatile xenobiotic compounds in biofilters // Bioprocess Engineering. 1986. V. 1. P. 61-69.

174. PeelB.D., Ouayle J.R. Microbial growth on Ci compounds. Isolation and characterization of Pseudomonas AMI //Biochem. J. 1961. V.81. P.465-469.

175. Piccolo A., Ptisch M. Chloride/proton antiporter activity of mammalian CLC proteins C1C-4 and C1C-5 //Nature. 2005, V. 436 P. 420-423.

176. Plack R.H., Jr., Rosen B.P. Cation/proton antiport systems in Escherichia coli II J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 3824-3825.

177. Poelarends G.J., KulakovL.A., LarkinM.J., Van Hylckama Vleig J.E.T., Janssen D.B. Roles of horizontal gene transfer in gene integration of evolution of 1,3-dibromoethane-degradative pathways // J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 2191-2199.

178. Pomper B.K., Saurel O., Milon A., Vorholt J.A. Generation of formate by the formyltransferase/hydrolase complex (Fhc) from Methylobacterium exlorquens AMI // FEBS Lett. 2002. V. 523. P. 133-137.

179. Pomper B., Vorholt J., Chistoserdova L., Lidstrom M., Thauer R.K. A methenyl tetrahydromethanopterin cyclohydrolase and a methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase in Methylobacterium exlorquens AMI // Eur. J. Biochem. 1999. V. 261. P. 475-480.

180. Pratt L.A., Hsing W., Gibson K.E., Silhavy T.J. From acids to osrnZ: multiple factors influence synthesis of the OmpF and OmpC porins in Escherichia coli II Mol. Microbiol. 1996. V. 20. P. 911-917.

181. Pratt L. A., Silhavy T.J. Porin regulon of Escherichia coli II In Hoch J. A., Silhavy T.J. (ed.), Two-component signal transduction. ASM, Washington, D.C. 1995. P. 105-127.

182. Pries F., van der Ploeg J.R., DolfingJ., Janssen D.B. Degradation of halogenated aliphatic compounds: the role of adaptation // FEMS Microbiol. Rev. 1994. V. 15. №2-3. P. 279-295.

183. Prinz W.A., Aslund F., Holmgren A., Beckwith J. The role of thioredoxin and glutaredoxin pathways in reducing protein disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 15661-15667.

184. A.Rayleigh J.W.S. Theoretical considerations respecting the separation of gases by diffusion and similar processes // Philos. Mag. 1896. V. 42. P. 493-498.

185. Rengpipat S., Lowe S.E., Zeikvs J.G. Effect of extreme salt concentrations on the physiology and biochemistry of Halobacteroides acetoethylicus II J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 30653071.

186. Reynolds E.S.T. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy // J. Cell. Biol. 1963. V. 17. P. 208-212.

187. Richnow H.H., Anmveiler E., Michaelis W., MeckenstockR.U. Microbial in situ degradation of aromatic hydrocarbons in a contaminated aquifer monitored by carbon isotope fractionation // J. Contain. Hydrol. 2003. V. 65. P. 101-120.

188. Rici/lo P.M., Muglia C.I., de Buijn F.J., Roe A.J., Booth I.R., Aguilar Ü.M. Glutathione is involved in environmental stress responses in Rhizobium tropici, including acid tolerance // J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 1748-1753.

189. Rivetta A., Slayman C., Kuroda T. Quantitative modeling of chloride conductance in yeast TRK potassium transporters // Biophys J. 2005. V. 89. № 4. P. 2412-2426.

190. Roe A.J., McLaggan D., Davidson I., O 'Byrne C., Booth LR. Perturbation of anion balance during inhibition of growth of Escherichia coli by weak acids // J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 767-772.

191. Ronson C.W., Nixon B.T., Ausubel F.M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli // Cell. 1987. V. 49. P. 579-581.

192. RubinE., Farber J.L. Patologia// lstedn. Interlivros, Rio de Janeiro 2-30, 1990. 1381 p.

193. Saier M.H., Jr. A functional-phylogenetic classification system for transmembrane solutetransporters // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. V. 64. No. 2. P. 354-411.

194. Saini H.S., Attieh J.M., Hanson A.D. Biosynthesis of halomethanes and methanethiol by higher plants via a novel methyltransferase reaction // Plant Cell. Environ. 1995. V. 18. P. 1027-1033.

195. SancarA. DNA excision repair // Annu. Rev. Biochem. 1998. V. 65. P. 43-81.

196. SaraM„ Sleytr U.B. S-layer proteins // J. Bacteriol. 2000. V. 182. № 4. P. 859-868.

197. Sato K., Suzuki N. The contribution of a Ca2f-activated CI" conductance to amino-acid-induced inward current responses of ciliated olfactory neurons of the rainbow trout // J. Exp. Biol. 2000. V. 203. Pt. 2. P. 253-262.

198. Schanstra J.P., Rink R., Pries F., Janssen D.B. Construction of an expression and site-directed mutagenesis system of haloalkane dehalogenase m Escherichia coli II Protein Expr. Purif. 1993. V. 4. P. 479-489.

199. Schiestl R.H., Chan W.S., Gietz R.D., Mehla R.D., Hastings P.J. Carcinogens induce intrachromosomal recombination in yeast//Carcinogenesis. 1989. V. 10. P. 1445-1455.

200. Schmid-Appert M. Untersuchungen zur Regulation des Dichlormethan-Dehalogenase Gens aus Methylobacterhim sp. Stamm DM4 und Struktur der angrenzenden DNA-Region II F.TH Dissertation Nr. 11646, Zürich. 1996.

201. Schmid-Appert M, Zoller K., Traber H„ Vuilleumier S., Leisinger T. Association of newly discovered IS elements with the dichloromethane utilization genes of methylotrophic bacteria II Microbiology. 1997. V. 143. P. 2557-2567.

202. Scholtz R, Wackett L.P., Egli C., Cook A.M., Leisinger T. Dichloromethane dehalogenase with improved catalytic activity isolated from a fast-growing dichloromethane-utilizing bacterium//J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 5698-5704.

203. Schultze-Lam S., Beveridge T.J. Nucleation of celestite and strontianite in a cyanobacterial S-layer // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. P. 447-453.

204. Schulz B., Frommer W.B., Flügge U.-L, Hummel S., Fischer K., Wilhnitzer L. Expression of the triose phosphate translocator gene from potato is light dependent and restricted to green tissues // Mol. Gen. Genet. 1993. V. 238. P. 357-361.

205. Shishkina V.N., Trotsenko Y.A. Multiple enzymic lesions in obligate methanotrophic bacteria//FEMS Microbiol. Lett. 1982. V. 13. P. 237-242.

206. Sies H. Glutathione and its role in cellular functions // Free Rad. Biol. Medicine. 1999. V. 27. P. 916-921.

207. Singh K.S., Nelson D.E., Kuhn IX, Hasegawa P.M., Bresson R.A. Molecular cloning of osmotin and regulation of its expression by ABA and adaptation to low water potential // Plant Physiol. 1989. V. 90. P. 1096-1101.

208. Skidmore W.D., Entenman C. Two-dimensional thin-layer chromatography of rat liver phosphatides // J. Lipid. Res. 1962. V. 3. № 4. P. 471-475.

209. Sleator R.D., Gahan C.G.M., Ahee 7'., Hill C. Identification and disruption of BetL, a secondary glycine betaine transport system linked to the salt tolerance of Listeria monocytogenes L028 // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 2078-2083.

210. Sleator R.D., Wouters J., Gahan C.G.M., Ahee T., Hill C. Analysis of the role of OpuC, an osmolyte transport system, in salt tolerance and virulence potential of Listeria monocytogenes// Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. № 6. P. 2692-2698

211. Slonczewski J.L., Foster J.W. pH-regulated genes and survival at extreme pH 11 In Neidhardt F.C. et al. (eds.), Escherichia coli and Salmonella typhhnurhmr. Cellular and Molecular Biology, ASM. Washington, DC. 1996. P. 1539-1549.

212. Slonczewski J.L., Rosen B.P., Alger J.R., Macnah RM. pH homeostasis in Lischeriehia coii: measurement by 31P nuclear magnetic resonance of methylphosphonate and phosphate // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981. V. 78. P. 6271-6275.

213. Small P., Blankenhorn D., Welty D., Zinser E., Slonczewski J.L. Acid and base resistance in Escherichia coli and Shigella flexneri: role of rpoS and growth pH 11 J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 1729-1737.

214. Smith D.K., Kassam '/'., Singh B., Elliott J.F. Escherichia coli has two homologous glutamate decarboxylase genes that map to distinct loci // J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 5820-5826.

215. Stancik L.M., Stancik D.M., Schmidt B., Michael Barnhart D., Yoncheva Y.N., Slonczewski J.L. pH-dependent expression of periplasmic proteins and amino acid catabolism in Escherichia coli II J. Bacteriol. 2002. V. 184. № 15. P. 4246-4258.

216. Stock J.B., Ninfa A.J., Stock A.M. Protein phosphorylation and regulation of adaptive responses in bacteria // Microbial Rev. 1989. V. 53. P. 450-490.

217. Strom A.R., Falkenberg P., Land/aid B. Genetics of osmoregulation in E. coli: uptake and biosynthesis of organic osmolytes // FEMS Microbiol. Rev. 1986. V. 39. P. 79-86

218. I.Strom T., Ferenci T., Ouayle J.R. The carbon assimilation pathway of Methylococcus capsulatns, Pseudomonas methanica and Methylosinns trichosporium II Biochem. J. 1974. V. 144. P. 465-476.

219. StroudR.M., Miercke L.J., 0 'Connell J., Khademi S„ Lee J.K., Remis J., Harries W., Robles Y., Akhavan D. Glycerol facilitator GlpF and the associated aquaporin family of channels // Curr. Opin. Struct. Biol. 2003. V. 13. P. 424-43 1.

220. Stucki G. Biological decomposition of dichloromethane from a chemical process effluent // Biodégradation. 1990. V. 1. P. 221-228.

221. Svensàter G., Sjôgreen B., Hamilton i.R. Multiple stress responses in Streptococcus nnitans and the induction of general and stress-specific proteins 11 Microbiology. 2000. V. 146. P. 107-117.

222. Thomas A.D., Booth I.R. The regulation of expression of the porin gene ompC by acid pH // J. Gen. Microbiol. 1992. V. 138. P. 1829-1835.

223. Todt J.C., McGroarty E.J. Acid pH decreases OmpF and OmpC channel size in vivo II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. V. 189. P. 1498-1502.

224. Toshima Y., Yoshimura N. Control of rabbit liver fructose 1,6-diphosphatase activity by magnesium ions// J. Biol. Chem. (Tokyo) 1975. V. 78. P. 1161-1169.

225. Urhahn T., Ballschmiier K. Chemistry of the biosynthesis of halogenated methanes: Cl-organohalogens as pre-industrial chemical stressors in the environment? // Chemosphere 1998. V. 37. P. 1017-1032.

226. Uziel O., Borovok I., Schreiber R., Cohen G., Aharonowitz Y. Transcriptional regulation of the Staphylococcus aureus thioredoxin and thioredoxin reductase genes in response to oxygen and disulfide stress //J. Bacteriol. 2004. V. 186. № 2. P. 326-334.

227. Van Agteren M.H., Keuning S., Janssen D.B. Handbook on biodégradation and biological treatment of hazardous organic compounds//Kluwer. Dordrecht. 1998. Ch. 3. P. 79-91.

228. Van Alphen W., Lugtenberg B. Influence of osmolarity of the growth medium on the outer membrane protein pattern of Escherichia coli // J. Bacteriol. 1977. V. 131. P. 623-630.

229. Van Spanning R.J.M., de Vries S., Harms N. Coping with formaldehyde during Q-metabolism of Paracoccus denitrifwans // J. Mol. Cat. B. Enzymatic. 2000. V. 8. P. 37-50.

230. Vannelli T., Studer A., Kertesz M., Leisinger T. Chloromethane metabolism by Melhylobacterium sp. strain CM4 // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 1933-1936.

231. Ventosa A., Nieto ./.,/., Oren A. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Revs. 1998. V. 62. № 2. P. 504-544.

232. Vorholl J.A. Cofactor-dependent pathways of formaldehyde oxidation in methylotrophic bacteria // Arch. Microbiol. 2002. V. 178. P. 239-249.

233. Vor holt J.A., Chistoserdova L, Lidstrom M.E., Thauer R.K. The NADP dependent methylene H4-MPT dehydrogenase in Methylobacterium extorquens AMI // J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 5351-5356.

234. Vuilleumier S. Bacterial glutathione S-transferases: what are they good for? // J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 1431-1441.

235. VniIIeiimier S. Coping with a halogenated one-carbon diet: aerobic dichloromethane-mineralising bacteria // In Agathos S., Reineke W. (eds), Biotechnology for the environment. Kluwer Academic Publishers. 2001. V. 3.

236. Vuilleumier S., Pagni M. Bacterial glutathione S-transferases: new lessons from bacterial genomes//Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 58. P. 138-146.s

237. Vuilleumier S., Sorribas H., Leisinger T. Identification of a novel determinant of glutathione affinity in dichloromethane dehalogenase/glutathione S-transferases // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 238. P. 452-456.

238. Wackett L.P., Logan M.S.P., Blocki F.A., Bao-li C. A mechanistic perspective on bacterial metabolism of chlorinated methanes // Biodégradation. 1992. V. 3. P. 19-36.

239. Waldegger S., Jentsch T.J. Functional and structural analysis of C1C-K chloride channels involved in renal disease // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 24527-24533.

240. Weretilnyk E.A., Hanson A.D. Molecular cloning of a plant betaine-aldehyde dehydrogenase, an enzyme implicated in adaptation to salinity and drought // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1990. V. 87. P. 2745-2749.

241. Whittington A.T., Vichai V., Webb G.C., Baker R.T., Pearson W.R., Board P.G. Gene structure, expression and chromosomal localization of murine Theta class glutathione transferase mGSTTl-1 //Biochem. J. 1999. V. 337. P. 141-151.

242. Wills N.K., Fong P. C1C chloride channels in epithelia: recent progress and remaining puzzles//News Physiol. Sci.2001.V. 16 P. 161-166.

243. Winterton N. Chlorine: the only green element: towards a wider acceptance of its role in natural cycles // Green chemistry. 2000. V. 2. P. 173-225.

244. World Meteorological Organisation. Scientific assessment of ozone depletion // World Meteorological Organisation. Report № 25. 1991.

245. Yoch D.C., Chen Y.P., Hardin M.G. Formate dehydrogenase from the methane oxidizer Methylosinus trichosporium OB3b // J. Bacteriol. 1990. V. 172. № 8. P. 4456-4463.

246. Zahn J.A., Bergmann D.J., Boyd J.M., Kunz R.C., DiSpirito A.A. Membrane-associated quinoprotein formaldehyde dehydrogenase from Methylococcus capsulatus Bath // J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 6832-6840.

247. Zheng M., Aslund F., Storz G. Activation of the OxyR transcription factor by reversible disulfide bond formation// Science. 1998, V. 279. P. 1718-1721.

248. Zuber L. Trickling filter and three-phase airlift bioreactor for the removal of dichloromethane from air // PhD thesis, ETH Zurich, Switzerland. 1995.