Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Психрофильный метанотроф и его спутники

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Психрофильный метанотроф и его спутники"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 579.841.017.6/7

ОМЕЛЬЧЕНКО Марина Владимировна

ПСИХРОФИЛЬНЫЙ МЕТАНОТРОФ И ЕГО СПУТНИКИ

Специальность 03.00.07. — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва— 1994

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук Л. В. Васильева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. Ф. Гальченко доктор биологических наук А. И. Нетрусов

Ведущая организация: кафедра биологии почв факультета Почвоведения Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова.

Защита состоится « ¡5 » цнгня 1994 г. в Ш часов на заседании Специализированного совета Д.002.64.01 в Институте микробиологии РАН. Адрес: 117312, г. Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, кор. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН.

Автореферат разослан « ¡2 » ил а я 1994 г.

Ученый секретарь ^

Специализированного совета, У/у^-кандидат биологических наукх^^^*^ Л. Е. Никитин

Актуальность проблемы. Проблема глобального изменения климата на Земле в большой степени связана с так называемым парниковым аффектом. Он обуславливается изменением газового состава атмосферы, а именно, увеличением концентрации таких газов как углекислота, метан, закись азота.

Россией подписана конвенция по климату, обязывающая составить списки источников и стоков парниковых газов расположенных на ее территории.

Метан является вторым по значимости парниковым газом после углекислоты. Основным его источником служат наземные экосистема, так как в океане цикл метана практически замкнут (cicerone, oremiand 1988; Гальченко 1989; Иванов и др. 1992). Наиболее высокие концентрации метана наблюдаются в Северном полушарии над умеренными широтами (Blake, Rowland, 1989). Именно здесь располагаются увлаженные леса • и болотистые тундры с резко выраженной сезонностью. Среди глобальных источников они занимают

одно из ЕЭЖНЫХ мест (Matthews, Fung 1987; Aselmann, Crut2en 1989; Harriss et.ai. 1992). Болота, расположенные на территории России по разным оценкам могут давать до 13% глобальной продукции метана всех влажных земель (Andronova, Karol 1993).

Большая часть земель России расположена в холодной зоне. 8% ее территории занимают тундры. Средняя температура тундровых болотистых почв на протяжении вегетационного периода составляет 9°С (Паринкина 1989). В настоящее время признается, что в тундре эмиссия метана и его потребление происходят неравномерно, то есть связаны с рельефом местности (Whalen, Reeburgh 1988; 1990; Слободкин и др. 1992; Паников и др. 1992).

Для понимания механизмов, регулирующих эмиссию метана при низких температурах, важно выявление микробных агентов ответственных за этот процесс. Такая задача была поставлена в разделе "Биогенное образование и потребление метана" ГНТП России "Глобальные изменения природной среды и климата".

В соответствии с данной задачей, в чистую культуру недавно, выделен перый метаногенный организм - метаносарцина, которая способна образовывать метан при 6°С (Жилина, Заварзин 1991). По наблюдению за изменением концентраций субстратов и продуктов в анаэробных условиях установлено, что при низких температурах в болотистой почве развивается полноценное метаногенное сообщество. Коне41 км продуктами его жизнедеятельности являются метан и

летучие жирные кислоты (Коцюрбенко и др. 1992; Заварзин и др. 1993).

Однако, поступление метана в атмосферу определяется не только наличием организмов продуцирующих метан. Это результат двух противоположно направленных процессов - скорости метанообразования и скорости метанопотребления. Синтезируясь в анаэробной зоне, метан диффундирует к поверхности, встречая на своем пути метанотрофные организмы, для которых он является субстратом. Несмотря на то, что потребление метана при низких температурах неоднократно регистрировали in situ как в океане, так и в пресноводных наземных экосистемах (Иванов и др. 1992; Whalen et.al.199i; Vecherskaya et.al.1993), ПСИХрОфИЛЬНЫв метанотрофы до сих пор не были выделены и описаны в чистых культурах. Практически ничего не известно и о других психроактивных организмах (метилотрофах и диссипотрофах), которые как и метанотрофы участвуют на конечных стадиях в разложении органического вещества (Намсараев 1973), используя в качестве субстратов продукты окисления метана, другие Cj-соединения и ЛЖК, образуемые метаногенным сообществом, но слабо, либо совсем не потреблящиеся в анаэробной зоне (в частности ацетат, пропионат и бутираг).

Все эти организмы аэробной зоны могут быть названы организмами "бактериального фильтра" для веществ, образующихся в анаэробной зоне.

Изучение аэробных психроактивных метанотрофов, метилотрофэв и диссипотрофов необходимо для понимания глобального цикла метана при низких температурах, оценке его вклада в концентрацию метана в атмосферу, а так же для понимания роли микроорганизмов в разложении органического вещества на конечных стадиях в условиях Севера.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы • , было установление основных видов аэробных бактерий активных при низкой температуре, .образующих "бактериальный фильтр" для веществ, поступающих из анаэробной зоны (главным образом метана и ЛЖК), в болотистой почве тундры.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем: I. Выделение в элективную культуру психрофильного метанотрофного сообщества из дроб болотистой почвы тундры и изучение его экофизиологических свойств.

2. Выделение из сообщества чистой культуры психрофидьного метанотрофа.

3. Описание психрофильного метанотрофа.

4. Выделение психроактивных метклотрофэв к диссипотрофов из метаногрофного сообщества и проб болотистой почвы тундры, изучение юс морфологических и физиологических свойств. Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе в элективную культуру выделено метанотрофное сообщество активно окисляющее метан при низких температурах. Установлено, что при повышении температуры вше 15°С происходит смена основного организма, ответственного за окисление метана в данном сообществе. Впервые выделен в чистую культуру и описан психрофильный облигатный метанотроф. Существование таких микроорганизмов имеет принципиальное значение для ограничения эмиссии метана в атмосферу в северных болотистых почвах России. Выделены 15 штатов психроактивных метилотрофэв и диссипотрофов, изучена их морфология и способность к росту в зависимости от температуры. Таким образом, получен ряд новых результатов, расширяющих представление о многообразии микробного мира. Выделенные организмы (в частности психрофильный метанотроф). могут представлять интерес для биотехнологии. Их можно использовать при разработках сезонных очистных фильтров, а так же в очистных сооружениях в условиях Севера для улавливания метана и жирных кислот.

Апробация, работа. Материалы диссертации докладывались на семинарах в лаборатории микробных сообществ (1991, 1992), на конкурсе научных работ ИНМИ РАН (1993) и на открытом заседании Ученого Совета НИМИ РАН (1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, 2 работы сданы в печать.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на /33 страницах машинописного, текста, включая II таблиц и 4/ рисунков. Список литературы содержит 62 отечественных и !5о иностранных наименований. Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность к.б.н. Н.Д.Савельевой за обучение навыкам работы с газотрофными микроорганизмами, постоянное внимание и помощь в работе, к.х.н. Г.А.Осипову за проведение анализа жирных кислот, д.б.н.

Ю.А.Троценко за предоставленную возможность проведения энзшо логических исследований в его лаборатории, к.б.н. В.Н.ХмэЛениной за обучение методикам определения активностей ферментов и помощь в работе, Л.Л.Иитюшиной за помощь при изучении ультраструктурной организации метакотрофов, к.б.н. А.М.Лысенко за генетический анализ, д.б.н. В.Ф.Гальченко за помощь при проведении ишунофлуоресцентного анализа, К.В.Фегедингу за постоянную поддержку и помощь в проведении работ по белку и выделению плазмидвг, всем сотрудникам лаборатории микробных сообществ, помогавшим автору в повседневной работе. Особую благодарность автор выражает своему научному руководителю д.б.н. Л.В.Васильевой и заведующему лабораторией микробных сообществ, профессору, чл.-корр.РАН, действительному члену АЕН Г.А.Заварзину за общее научное руководство и труд по чтению и редактированию диссертации.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования были выбраны пробы болотистой почвы ерниковой тундры (рН 6.1), отобранные около поселка Хальмер-Ю (68°с.ш., 65°в.д.) в 100 км севернее города Воркуты. Выделение из данных проб накопительных и чистых метанотрофных культур проводили на минеральной среде Виттенбари (км^епьигу et.al. 1970) с добавлением микроэлементов Пфеннига в атмосфере газовой смеси метана с воздухом. Чистые культуры метилотрофов и дассипотрофов выделяли на среде Виттенбари и модифицированной среде АТСС (Васильева 1991). В качестве субстратов 'использовали - метанол, формиат, ММА, ДМА, ТМА, ацетат, пропионат, бутират. Все культуры выделяли при температуре 6°С. При пересевах использовали охлааденные среды и пипетки, а в бокс помещали аккумуляторы холода.

Морфологию клеток культур изучали в световом микроскопе с фазовым контрастом (Атр13.Уа1) и. электронном микроскопе «тем—юос. Ультрагонкие срезы получали стандартным методом (иуъег,

Ке1епЬегдег 1958).

Подсчет общего числа клеток и клеток метанотрофов в накопительных культурах проводили на стеклах с тонким слоем 1% агарозы. Для психрофильного метанотрофа подсчет числа клеток с везикулами проводили на влажных препаратах "раздавленная капля". Наличие капсулы установили путем окраски клеток тушью.

Рост культур • оценивали по оптической плотности на спектрофотометре "specoi zvn (ГДР) при длине волны 600 нм.

Концентрацию метана и кислорода определяли на хроматографе "Газохром 3101"(Россия) с гелием как газом носителем, на колонке с молекулярными ситами БА в качестве сорбента. Метанол анализировали на хроматографе "chrom-s" (ЧССР) с пламенно-ионизационным детектором, в качестве сорбента использовали хромосорб-IOI, газ носитель - аргон. Формиэт определяли ранее описанным методом (Lang 1972). Сродство метанотрофа к метану и дыхание культур определяли - полярографически на полярографе LP7 (ЧССР).

Массу сухих клеток устанавливали после высушивания их на мембранных фильтрах или в бюксах в течение 24 часов при температуре Ю5°С.

Белок определяли шдифицнрованными методами Лоури

(Schacterbe, Pollack 1973) И Бредфэрд (Bredford 1976).

Жирные кислоты анализировали на хроматомасс-спектрометрз НР-5985В Hewlett-Packard.

В экстрактах клеток цс^рофнльного метанотрофа, полученных путем разрушения ультразвуком на аппарате mse определяли активности следующих ферментов: метанолдегидрогеназы (Anthony, Zatraan 1964), ДвГИДрОГвнаЗ формальдегида И формиата (Johnson, Quayle 1964), нддн-дегидрогеназы (Scholes, Smith 1968), гексулозофосфатсинтазы (Lawrence,' Quayle 1970), 6-фОСфОфруКТО-киназы И альдолазы фруктозо-l,6-ДКфОСфата (van Dijken, Quayle 1977), глгакозо-6-фосфатдегидрогеназы и 6-фосфоглюконатдегидро-геназы (Kornberg, Horecker 1955), 6-фосфоглюконатгидратазы и 2-кето-3-деэокси-6-фосфоглюконатальдолазы (wood 1971), глицер-альдегидфосфатдегидрогеназы и 3-фосфоглицераткиназы (Воскресенская, Мануль 1976), пируватдегидрогеназы, «-кетоглутарат-дегидрогеназы и цитратсинтазы (carls, Hanson i97i), изоцитрат-дегидрогеназы и малатдегидрогеназы (Pearce et.ai. 1969), изо-цитратлиазы и малатлиазы (Dixon, Kornberg 1959), малатсинтазы и. фосфорибулокиназы (ornston, orn3ton 1969), сукцинатдегидрогеназы

(Chopra et. al. 1977), ШруВЭТКИНаЗЫ (Stephen, Hamilton 1974),

рибулозобисфосфаткарбоксилазы, пируваткарбоксилазы, ФЕП-карбоксилазы, ФЕП-карбоксикиназы, ФЕП-карбокситрансфорилазы, малик-фермента (Логинова, Троценко 1979), оксипируватредуктазы и сер1шглиокоилатаминотрансферазы (Blakmore, Quayle 1970), глута-

магдегвдрогеназы и аланивдегидрогеназы (Doherty 1970), глутамин-сштетазы (Elliot 1955) , глутаматсинтазы (Meers, Tempst 1970) .

Спектрофотометрические измерения активностей ферментов проводили на "specord uv vis" (ГДР), радиометрические измерения -на жидкостном сцинтилляционном спектрометре sl-ЗО (Франция).

Включение ^-лейцина в ТХУ-нерастворимую фракцию клеток психрофильного метанотрофа определяли на жидкостном сцинтилляционном спектрометре ls 1801 (США).

Электрофореграммы общих белков получали модифицированным методом диск-дсн-гель-электрофореза (Anderson et.al. 1973).

Кммунофлуоресцентный анализ проводили, используя непрямой метод иммунофлуоресценвди, по описанной ранее методике (Гальченко 1989).

Выделение и очистку ДНК проводили по методике Мармура (Marmur 1961). Нуклеотидный состав определяли по температуре плавлешя ДНК (owen 1976). Гибридизацию ДНК проводили методом оптической реассоциации (De Ley et.al. 1970).

Плазмиду выделяли по методике Кадо и Лю (Kado, Liu, i98i).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Психрофильное метанотрофное сообщество из почвы тундры.

1.1. Выделение сообщества в элективные культуры. В пробах болотистой почвы тундры, используемых для исследования, предварительно была изучена динамика метана in situ и намечены места, где наблюдалось его потребление (Слободкин и др. 1992). Для выделения метанотофного сообщества были взяты образцы из аэробной зоны торфяного бугра, сфагнумовой кочки, мочажины, а также проба болотной воды. Образцы были разделены послойно по.: глубине. Описание проб дано в таблице I. Через 1,5 месяца инкубирования при 6°С были получены накопительные метанотрофные культуры из проб всех трех слоев мочажины и пробы болотной воды. Из образцов почвы торфяного бугра и сфагнумовой кочки такие культуры получить не удалось.

1.2. Морфологические характеристики. Для дальнейшего детального изучения были выбраны наиболее активно растущие и потребляющие метан накопительные культуры Х-Г, Х-2 и Х-3. X-I - культура из верхнего слоя мочажины (О-Зсм), Х-2 - аз среднего слоя (3-12 см) и Х-3 - культура из нижнего торфяного слоя мочажины (12-22см). Морфологическое разнообразие бактерий, входящих в данные

б

кетанотрофные сообщества было не велико. Во всех трех слоях мочажины присутствовали крупные кокки и диплококки, они преобладали в количественном отношении по сравнению с другими морфологическими группами, которые были представлены палочками разных размеров и простекобактериямя (в верхнем слое отмечены также грушевидные клетки, а в среднем слое много простейших). Вероятно, основным потребителем метана в данной системе при пониженных температурах является метилококк.

ТАБЛИЦА I. Характеристика исследуемых проб.

Проба, взятая для Глубина Почвенный горизонт Наличие

исследования см метанотрофов

Торфяной криоген- 0-12 Светло-бурый сфагновый

ный бугор торф -

Sphagnum sp. 12-22 Темно-коричневый травя-

Cladonia sp. нистый торф -

22-30 Глина -

Мочажина 0-3 Нижние части растений

Sphagnua sp. (до корней) +

Carex aquatilis 3-12 Торф одернованный с жи-

Carex globularis выми корнями +

Eriophorum 12-22 Моховой торф +

vaginatum

Сфагнумовая кочка 6-S ■ Светло-бурый сфагновый

на границе крио- торф -

генного бугра и 9-20 Темно-коричневый сфагно -

мочажины вый торф -

Болотная вода, рН 6,1 +

1.3. Влияние температуры на рост и потребление метана. Изучение меганотрофных сообществ Х-1, Х-2 и Х-3 на способность к росту за счет окисления метана при температурах 3,5°, 6°, 10°, 15°, 20°, 28°и 37°С позволило установить следующие закономерности: культуры Х-1 и Х-2 из верхних слоев мочажины хорошо росли при температурах 3,5° и 6°С, причем при 3,5°С лучше, чем при 6°С; при Ю°С и более высоких температурах в пределах времени опыта (35 суток) рост отсутствовал. На рис. I представлены кривые роста и потребления

метана для культуры Х-2 которая была наиболее активной. Для-сообщества Х-3 примерно одинаковый рост обнаруживался в диапазоне 3,5 -10 С, хуже при 15°С. Таким образом, все три сообщества не росли при 20°С и выше, то есть являлись истинно психрофилышми. Максимальный урожай клеток зафиксирован для культуры х-2 - 0,16 г/л. На рис.2 даны средние удельные скорости роста и потребления метана для всех трех сообществ в сравнительном аспекте. Наиболее высокие скорости получены при 3,5°С для культура Х-2.

СН4. ы кМ/мл

Рис.I.Рост и потребление СН4 накопительной культурой Х-2 при 3,5°С (1,2); при 6°С (3,4); 1,3- оптическая плотность; .

2, 4 - потребление СН4.

Рис.2.Удельные скорости роста (I, 3, 5) и потребления СН4 (2, 4, 6) соответственно: 1,2 - для Х-1; . 3,4 - для Х-2; 5,6 - для Х-3.

температура

Таким . образом, изоляция из болотистой почвы, тундры психрофильных метанотрофных сообществ, в элективные культуры подтверждает . ОШТЫ in situ (Whalen, Reeburgh 1988, 1990; Слободкин и др. 1992; Паников и др. 1992) в том, что при низких температурах 'может происходить активное биогенное потребление метана. Основным организмом, окисляющим метан в данной системе является метилококк.

1.4. Роль температуры при смене сообществ.

Через полмесяца после окончания опыта по влиянию температуры

на рост психрофильных сообществ был отмечен рост и небольшое потребление метана при 20°С и 28°С для культур X-I и Х-2. Микроскопическое изучение выявило совершенно другую морфологическую картину. Среди микроорганизмов преобладали слегка изогнутые палочки и овальные клетки, отмечены такие разнообразные палочки и простекобактерии. То есть при повышении температура от 15° до 20°С и выше происходит замена основного метанотрофного организма. Доминирующий в этих условиях мезофилызый метанотроф был выделен в чистую культуру, но подробно не изучался.

2. Психроактивные метилотро^ы и диссипотро^, использующие ЛНК.

Основным продуцентом в психрофильном метанотрофном сообществе является метилокоюс. Его спутниками могут быть метилотрофные микроорганизмы, использующие в качестве субстратов продукты окисления метана, а также диссипотрофы, часть из которых в элективной культуре может развиваться за счет экскретируешх веществ и продуктов автолиза (Намсараев 1973). Повидимому в природе они способны использовать достаточно широкий круг мономерных субстратов, образующихся в процессе разложения органического вещества и поступающих как из аэробной, так и из анаэробной зоны (Васильева, Заварзин 1994).

Для изучаемых проб болотистой почвы тундры показано, что в анаэробной зоне при разложении органики образуется ряд веществ слабо или совсем не использующихся анаэробами, в частности это метиламины <ТМА) и ЛЖ (ацетат, пропионат, бутират) (Заварзин и др.1993). Они могут диффундировать по всему профилю и являться субстратами аэробов. Организмы, использующие эти вещества, наряду с метанотрофами, образуют часть функциональной группировки "бактериального фильтра". Они участвуют в разложении органического вещества на конечных стадиях при низких температурах.

Чистые культуры кетилотрофов п диссипотрофов выделяли из метанотрофного сообщества Х-2 и из пробы мочажины. 155 колоний Езолзроваля первоначально на всех субстратах при 6°С: 95 из них на шдзрлаяи более одного пересева, а 60 были выделены в чистые куяьтурн. Из них 19 культур потеряли способность к росту после 34 паресевов, 24 штамма были "психротрофными" (термин употребляется в кавычках, так как его предложено заменить на психроактивный), но не потребляли субстрат, на котором их

выделяли, и слабо росли только .за счет примесей в агаре и стартовых количеств пептона и дрожжевого экстракта в жидкой среде. Оставшиеся 17 штаммов использовали субстрат и оказались психроактишыми, причем один штамм был выделен одновременно на трех субстратах, то есть фактически их было 15 (3 метилотрофа и 12 штаммов, потребляющих ЛЖК), что составляет 9,74 от первоначально выделяемых (табл.2).

Такой низкий процент и то, что фактически все выделенные штаммы являются "психротрофами" (хотя в данных пробах должно быть много психрофилов) можно объяснить сложностью выделения истинных психрофилов. Часто они очень чувствительны к повышению температуры, поэтому основная масса их могла погибнуть при транспортировке пробы, а так же в период кратковременных нагревов при пересевах в боксе.

ТАБЛИЦА 2. Количественные соотношения выделяемых и выделенных чистых культур метило- и диссипотрофов. -

Распределение чистых культур Число пер- Получено мезофилы "Лсихротрофы"

Субстрат воначально выделенных колоний чистых культур потерявшие активность через 3-4 пересева Не использующие субстрат Использующие субстрат

Метанол Формиат ММА ДЕЛА ТМА Ацетат Пропионат Бутират 30, 10 16 20 27 19 . 14 19 6 6 4 5 15 6 5 13 4 2 I I 8 I 0 , : 2 . 2 3 2 4 -6 I , 0 6 0 I I 0 I 4 5. 5

Всего выделено 155 60 19 24 17(15)

% 100 38,7 12,3 15,5 10,9(9,7)

Среди изолированных культур присутствовали палочки разных размеров и каулобактеры. Из элективной метанотрофной культуры было выделено 6 штаммов: 2 метилотрофа - шт.г-ФВ на фюрмиате

ю

(очень слабо использующий данный субстрат) и шт.г-М7 на 1Ш, а так же 4 штамма, использующие ЛЖК (шт.г-А2; г-Ш; г-П5; г-Б4). Из пробы мочажины выделили II штаммов - I метанотроф шт.г-Т24 на ТМА и 10 культур, использующих ЛЖК, при этом 2 штамма (г-А2 и г-Е4) были выделены как из элективной культуры, так и непосредственно из пробы. Все культуры (за исключением штамма, выделенного на ТМА, который не рос при 28°С) росли в диапазоне температур 6°С-28°С. Для них были характерны низкие скорости роста и способность использовать мономерные субстраты в низких концентрациях (0,02-0,1£). Как правило температура 15°С являлась оптимальной. При 28°С клетки быстро лизировались и их уронай обычно был значительно ниже, чем при 15°С и 6°С. При 6°С культуры росли наиболее медленно. Типичные зависимости роста от .температуры представлены на рисунке 3.

СП ею «ч

Рис.3. Рост при разных температурах: а), на МВ!А (штамм г-ул) -I - при 28°С; 2 - при 15°С; 3 - при 6°С,. б). на ацетате (штамм г-а2) - I - при 28°С; 2 - при 20°С; 3 - при 15°С; 4 - при Ю°С; 5 - при 6°С.

: 'Вероятнее всего, большая часть выделенных организмов не. является новыми формами. В настоящее, время это сложно оценить поскольку описанные ранее бактерии как правило не проверяли нз способность к росту ниже комнатной температуры. Однако среди полученных культур есть и новые виды, в частности саи!оьасъег штамм г-аз. Его клетки на определенной фазе цикла размножения заключена з чэхол. Подобные структуры не описаны у известных

ВИДОВ рода Саи1оЬа^ег (РоЪкЗез^ег 1991) .

Выделение психроактивных диссипотрофных и метилотрофных культур является микробиологическим подтверждением того, что в тундре в течение короткого и холодного вегетационного периода в аэробной зоне происходит развитие микроорганизмов, которые могут быть трофически связаны с анаэробным сообществом, то есть являются организмами "бактериального фильтра".

Наиболее важными представителями этой функциональной группировки являются метанотро$ы. Поскольку до настоящего времени не были выделены метанотроЗы, окисляющие метан при низких температурах, наше основное внимание было сосредоточено на выделении и изучении такого организма.

3. Психрофильный метанотроф.

3.1. Выделение чистой культуры. Из метанотрофного сообщества Х-2 впервые был выделен облигатно психрофильный метанотроф штамм г-0021. Чистую культуру получили путем изоляции отдельных колоний, выросших на агаризованной среде в атмосфере метана с воздухом при 6°С. В жидкой среде культура растет в виде гомогенной суспензии серовато-белого цвета, при повышении температуры культивирования появляется легкий розоватый оттенок. Водорастворимый пигмент отсутствует. На агаре штамм г-0021 образует мелкие (а - 0,5-2мм) округлые колонии кремового или слегка розоватого цвета, непрозрачные, с ровным краем, поверхность колоний гладкая, блестящая, выпуклая, консистенция водянистая.

3.2. Морфология штамма г-0021. Вегетативные клетки культуры представляют собой кокки и диплококки 1,0-1,7 х 1,0-1,7 мкм в диаметре, размножаются делением пополам, неподвижные, с тонкой капсулой, другие поверхностные структуры, а также покоящиеся формы не обнаружены. ■ ■•.

Строение клеточной стенки аналогично организации клеточных стенок грамотрицательных бактерий. Молодые делящиеся клетки имеют от I до 4 стопок внутрицитоплазматических мембран 1-го морфотипа, которые занимают почти все цитоплазматическое пространство клетки. При культивировании при 7°С и более высоких температурах внутри клеток образуются газовые везикулы. Они имеют форму цилиндра, заканчивающегося с двух сторон конусами, шириной 80 -100 нм и длиной до 300 нм. Процентное содержание клеток с

везикулами увеличивается с повышением температуры (рис.4). Подобные структуры ранее не были описаны у метанотрофэв (Фихте, Сузина, 1986).

клеток с вванкул&мя

Рис.4. Процентное содержание клеток с везикулами в периодической стационарной культуре в зависимости от температуры.

температура, град.С

3.3. Физиологические свойства штамма г-0021.

3.3.1. Влияние температуры на рост й потребление метана и кислорода. Псюсрофильный метанотрофный штамм хорошо растет в диапазоне температур 3,5°-Г0°С, хуже при 15°С, при 20°С организм практически не активен (рис.5), при 22°, 28° и 37°С рост отсутствовал. Минимальная температура при которой наблюдался рост составляли 1°С, при более низких температурах его оценить не удалось в связи с техническими сложностями. Согласно определению Морита, выделенный организм может быть отнесен к истинным психрофилам (Ког±Ъа 1975).

Рис.5. Рост метанотрофно-го штамма г-0021 при разных температурах: Г - 3,5°С; 2 - 7°С; 3 - .

Ю°С; 4

15°С; 5 - 20°С.

Подобные зависимости наблюдаются также для потребления штаммом г-0021 метана и кислорода, при этом промежуточные продукты окисления метана (метанол и формиат) в среду не выделяются. В таблице 3 представлены некоторые кинетические характеристики штамма г-0021.

ТАБЛИЦА 3.Параметры роста метанотрофного штамма 2-0021 (периодическая культура без качания, газовая фаза 10% метана в воздухе) при разных температурах.

Параметр Температура, град.С

3.5° 7° 1СР 15° 20°

Скорость потребления СН4, мкМ/мл/сут 6,09 7,55 6,23 3,92 3,32

Скорость потребления 02, мкМ/мл/сут 3,89 5,31 4.35 3,67 2,60

Удельныз скорости:

I).Роста, сут-1 0,29 0,30 0,31 0,27 0,13

2).Потребления СН4 г/г.сух.в./сут 0,54 0,56 0,55 0,47 0,46

3).Потребления 02 г/г.сух.в./сут 0,98 0,99 1,10 0,91 0,69

Урожай по СН4 г.сух.в./г СН4 0,54 0,54 0,56 0,57 0,29

Урожай по 02 г.сух.в./г 0% 0,30 0,31 0,28 0,29 0,19

Максимальный сухой вес г/л 0,34 0,34 0,35 0,32 0,06

Длительность !ад-фазы, сутки I X I 3 3

Время удвоения, сутки 2 2 2 ' 3 5

3.3.2. Сродство г-0021 к метану и влияние на рост скорости подачи субстратов. Несмотря на то. что штамм 2-0021 не способен расти выше 20°С, клетки, выращенные при 6°с, хорошо окисляют метан при более высоких температурах. ■ Следовательно, фермент метанмоно-оксигеназа имеет температурный оптимум и максимум своей активности выше 20°С. Субстратная константа для метана уменьшается более чем в 6 раз при понижении температуры пробы с 37°С до 7°С (табл.4), то есть увеличивается сродство организма к метану. При повышении температуры сродство к метану соответственно уменьшается, в то время как его растворимость падает. Поскольку метан и кислород поступают в клетку путем диффузии по градиенту концентрации, то к_, фактически является кщ метанмонооксигеназы для кетапа. Ее уменьшение указывает на то, что при низких температурах данный фермент обладает более высоким сродством к метану и достигает максимума своей активности при

более низких его концентрациях.

ТАБЛИЦА 4.. Субстратная константа для метана у штамма г-0021 при разных температурах

Температура, град.С

Ка х Ю-ЭМ

7 15 25 37

1,11 1,29 5,13 7,09

Скорости роста и потребления субстратов зависят от скоростей их подачи. При 6°С они увеличиваются примерно в 2 раза при активном (100 об/мин) перемешивании (рис.6).

3.3.3. Влияние рН на рост. При температуре 6°С штамм г-0021 растет в диапазоне рН 5,9-7,6 с оптимумом 6,7; при рН 5,5 и 8,0 штамм г-0021 не растет. .

3.3.4. Рост на субстратах. Кроме метана штамм 2-0021 растет на метаноле (рис.7), но значительно хуже, чем на метане. На других исследованных субстратах фэрмиате, ММА, ДМА, ТМА, ацетате, пропионате, бутирате, глюкозе, ГКА и КА роста не обнаружено. Таким образом, культура является облигатным меганотрофом.

3.3.5. Состав жирных кислот мембранных липидов. Для микроорганизмов, растущих при низкой температуре состав жирных кислот имеет важное значение. Для сохранения функциональной целостности

OÍ7 «00 нк

СН4. аг. ЫКН/Ш]

Рис.6.Росу (1,2) и потребление сн4 (3,4) и 02 (5,6) соответственно для стационарной и качалочной культуры при 6°С.

Рис.7.Рост штамма г-0021 при разных концентрациях метанола в среде:

1 - 0.01%;

2 - 0.05%;

3 - 0.1%;

4 - 1%;

мембраны - то есть обеспечения ее текучести, необходимо понижение температуры плавления фосфолипида в целом. Обычно это обеспечивается увеличением количества ненасыщенных жирных кислот (главным образом С16 и С18), укорочением или разветвлением их цепи, увеличением количества циклопропановых групп (Herbert 1986). У штамма г-0021 среди жирных кислот преобладают С16. В зависимости от температуры культивирования в диапазоне 3,5°С-15°С не отмечено каких-либо существенных различий в составе жирных кислот, наблюдается постоянно высокое. содержание ненасыщенной жирной кислоты концентрации сум С16:1транс-д10+11

Cj-g.-j-цис-л ,

также

небольшое уменьшение 1 кислот С16;1цис-д10+11 и увеличение Однако, при сравнении штамма г-0021 с мезофильным Methylococcus capsulatus ВСБ-874, а ТЭК же С ДРУГИМИ метанотрофами с. ВЦМ 1-го морфотипа (Гальченко и др. 1986; Романовская и др. 1991; Bowman et.ai, 1993) обнаружили, что общее содержание ненасыщенных жирных кислот у штамма z-0021 выше, а насыщенных существенно ниже. 3.4.Пути метаболизма.

Энзимологический анализ показал, что штамм г-0021 окисляет метан до COg через метанол, формальдегид и формиат с участием метанмонооксигеназы, ФМС-зависимой ш4-стимулируемой метанолдо-гадрогеназьг (растворимой и мембранно-связанной), ФМС-зависимой в НАД- и глутатионзависимых растворимых дегидрогеназ формальдегида, НАД- и ФМС-зависишх растворимых дегидрогеназ формиата.

Основным путем ассимиляции углерода метана у штамма z-0021 является РЫФ-цикл, о чем свидетельствует высокая активность ключевого фермента - гексулозофосфатсинтазы. Ассимиляция

происходит на уровне формальдегида. В то же время, найдены незначительные активности индикаторных ферментов серинового пути оксивируватредуктазы и серинглиоксилатаминотрансферазы. Активности ключевых ферментов цикла Кальвина - рибулозобисфосфаг-карбоксилазы и фосфорибулокиназы не обнаружены.

Психрофильный штамм реализует два пути синтеза фосфотриоз: через 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазу и фруктозобис-фосфатальдолазу. Наряду с _АТФ-зависимой у 2-0021 обнаружен высокий уровень активности пирофосфатзависимой 6-фосфэфрукто-киназы.

Аналогично другим метанотофам, имеющим мембраны 1-го морфотипа, у психрофильного штамма г-0021 цикл Кребса разомкнут, на уровне а-кетоглутаратдегадрогеназы. Специфические ферменты глиоксилатного шунта - изоцитратлиаза и малатлиаза не обнаружены, изоцитратдегидрогеназа НАД-зависимая.

Определение ферментов фиксации С02 на С3-акцепторах показало, что психрофильный штамм имеет ФЕП-к'арбоксилазу и "малик-фермент", но не обладает активностями пируваткарбоксилазы и ФЕП-карбоксикиназы.

Изучены также пути ассимиляции аммонийного азота. Штамм г-0021 не имеет глутаматдегидрогеназы, но ассимилирует аммонийный азот посредством Восстановительного аминирования пирувага с участием аланивдегидрогеназы, а также через глутаматный цикл, судя по наличию глутаматсинтазы и глутаминсинтетазы.

Таким образом, установили, что по набору ферментов углеродного, метаболизма штамм г-0021 относится к первой группе метанотрофов. На правомерность этого заключения указывает отсутствие рйбулозобисфосфаткарбоксилазы и наличие высокоактивной пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы. В то . же время, для штамма г-0021 характерен ряд признаков сближающих его с метанотрофами группы X, таких как .наличие только НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы и отсутствие глутаматдегидрогеназы. Среди специфических свойств необходимо отметить, что аланиндегидро-геназа у данного организма НАД-зависимая.

С целью установления причины невозможности роста психрофильного метилококка выше 20°С активности ферментов определяли при 5°, 15° и 30°С, Все изученные ферменты существенно снижают активность при понижении температуры от 30° до 5°С, то есть сходны с ферментами мезофилов.

3.5. Влияние температуры инкубации на синтез белка.

^Продолжение попыток установления причин психрофилии, для штамма г-0021 была изучена скорость включения ^-лейцина в Т2У-нерастворимую фракцию в диапазоне 3°-3?°С. Максимальная скорость наблюдалась при Ю°С, при повышении температуры до 22°С она уменьшалась, при 37°С включения не было (рис.8). На основании этих результатов можно предполагать, что в механизме синтеза белка с повышением температуры происходят необратимые изменения и именно этот процесс является "узким местом" данного организма. Чаще всего такие изменения затрагивают этап трансляции. Однако для утверждения этого необходимо получение бесклеточной системы трансляции и проверка ее работы при разных температурах. Данный же опыт не является достаточным доказательством, поскольку вполне возможно, что происходят нарушения в энергетическом метаболизме и как следствие нарушается снабжение синтеза бежа энергией, либо молекулы лейцина не могут связаться с соответствующими белками-переносчиками из-за изменений пространственной организации липидаого бислоя или конформации самих пермеаз.

Рис.8. Включение ^-лейцина в ТХУ-нерастворимув фракцию у штамма г-0021: I - при 3°С; 2 - при Ю°С; 3 - при 15°С; 4 - при 22°С; 5 - при 37°С.

О 6 Ю 16 20 26

ион

3.6. Таксономическое положение психрофильного метанотрофа.

Содержание Г+Ц пар в ДНК метанотрофного штамма 2-0021 довольно низкое - 45,6 мол.£, размер генома 2,9хЮэДа. Штамм имеет одну плазмиду размером около 50 тыс.п.н.

Визуальный анализ электрофзреграмм суммарных белков штамма

2-0021, Mc.capsuJ.atus "Техаз,,Т ((АТСС 19069), Mc.capsul.atv;в 113 Е Ие«1у1оЬас1ег сЬгоосоесит 90 ВЫЯВИЛ ЗНаЧИТеЛЬНЫЙ рЭЗЛИЧИЯ М8ЖДУ

психрофильным метзнотрофом и штаммами, взятыми для сравнения.

4

Реакции иммунофлюоресцентного окрашивания z-0021 ввдоспеци-фИЧНЫМИ антисыворотками к Mb.bovis 89, Mb.chroococcum 90 И Mc.capsuiatus из дали отрицательный результат.

В результате гибридизации с другими метанотрофами имеющими мембраны 1-го морфотила установили, что штамм z-0021 практически не имеет ГОМОЛОГИ {<2%) С Mc.capsuiatus IHT.TexasT, С Methylomonas methanica ШТ.12 имеет В% ГОМОЛОГИИ, С Hb.bovis ET.89^ И

Hb.chroococcum шт.90 - 15 и 17% соответственно.

На основании морфологических, физиологических, биохимических особенностей, данных по гибридизации, с учетом последних уточнений таксономии метанотрофов (Bowman et.al. 1993) ШТЭММ Z-002I выделен в НОВЫЙ ВИД рода Methylobacter. Так как ЭТО-впервые описанный психрофильный метанотроф ,его предложено назвать Mb.psychrophilus.

Диагноз вида Mb.psychrophilus sp. nov. psy.chro.phi.lus. сложное слово, происходящее от двух греческих слов: сущ. "psychros™ - холод, прилег. "phiius" — любящий, обозначающее бактерии любящие холод.

Клетки кокки и диплококки, диаметром от 1,0 до 1,7 мкм, неподвижные, имеют тонкую капсулу, размножается делением пополам, ВШЛ 1-го морфотша. Внутри клеток могут образовываться газовые везикулы. Процент числа .клеток с везикулгми увеличивается при повышений; температуры культивирования. Везикулы имеют форму цилиндра шириной 80-110 нм, длиной до 300 нм, заканчивающегося с двух сторон конусом.

Колонии кремовые или слегка розоватые, округлые, выпуклые, непрозрачные с ровным краем, поверхность гладкая, блестящая, консистенция водянистая.

Водорастворимый пигмент отсутствует.

Хорошо растет в диапазоне температур 3,5°С-10°С, имеет минимальную температуру роста 1°С. или ниже, а максимальную -20°'С, Оптимальный pH среды лежит в нейтральной области.

Аэроб, облигатныЯ метанотроф, в качестве единственных источников углерода и энергии использует метан и метанол. Способен расти на средах с низкими концентрациями метанола (0,05 - 0,1%).

Преобладающие жирные кислоты Cjg.j. Имеет низкое содержание предельных жирных кислот сГ4.0 и С 1б;0 в составе мембранных фосфолипидов.

Имеет рибулозомонофосфатный путь ассимиляции Cj-соединений.

Цикл трикарбоновых кислот разомкнут на уровне o-кетоглутаратдегидрогеназы. Изоцитратдегидрогеназа НАД-специфичная.

Содержание Г+Ц в ДНК - 45,6 мол.%, размер генома -2,9х10эДа. Имеет одну плазмиду.

Местообитание - болотистые почвы тундры.

Типовой штамм z-0021 (Институт микробиологии РАН).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из основных посылок для нашей работы явились результаты но изучению эмиссии метана от болотистых почв тундры

(Svensson 1976; Svensson, Rosswall 1984; Sebasher et.al. 1986; Whalen, Recburgh 1988; Whalen, Reeburgh 1990; СЛОбОДКИН И Др. 1992). Опыты in situ позволили сделать вывод о том, что в этих почвах при низких температурах идут процессы как метанообразования, так и метанопотребленкя.

Наше внимание было сконцентрировано на выделении и изучении микроорганизмов, образующих при низких температурах "бактериальный фильтр" для веществ, синтезируемых в анаэробной зоне (главным образом метана, а также Cj-соединений и ЛЖК). Эти организмы принимают участие в разложении органического вещества на конечных стадиях. В настоящее время, о них известно крайне мало, хотя изучение психрофильных и психроактивных микроогранизмоз является важным для понимания биогехимических процессов протекавдих в частности в почвах России, большая часть территории которой подвержена постоянному или переменному действию низких температур. -

Из проб болотистой почвы тундры в элективную культуру было выделено психрофильное' метанотрофное сообщество, активно окисляющее метан при температурах ниже 15°С.В дальнейшем мы исходили из предположения, что в данной культуре должны присутствовать активные при низких температурах метанотрофы, их спутники - метилотрофы, использующие продукты окисления метана, и диссипотрофы, использующие экскретируемые вещества и продукты автолиза, а в чистых культурах потребляющие более широкий спектр мономерных субстратов как это .было показано в ыезофильном сообществе (Намсараев 1973). Поэтому из элективной культуры , выделяли указанные группы микроорганизмов.

Дне сило трофные и метилотрофные организмы выделяли так же непосредственно из проб почвы мочажины. В качестве субстратов для выделения диссипотрофов использовали органические кислоты, поскольку в данной системе при анаэробном разложении органики происходит накопление ЛЖК (в частности ацетата, пропионата и бутирата), которые очень слабо потребляются анаэробами при низких температурах (Заварзин и др. 1993).

Истинно психрофильных микроорганизмов, кроме метанотрофа, выделить не удалось. Вероятнее всего это объясняется не отсутствием таких организмов в данных пробах, а сложностью их выделения. Многие психрофилы не способны переносить даже кратковременного нагревания.

Психрофильный метанотроф впервые был выделен и описан в чистой культуре. Поскольку именно он являлся наиболее интересным и важным объектом, наше основное внимание было уделено его изучению. Выделение психрофильного метанотрофа является микробиологическим обоснованием аэробного окисления метана при низких температурах в тундровых болотистых почвах. Данный организм способен ограничивать эмиссию метана в атмосферу в Северных широтах.

Среди микроорганизмов, входящих в психрофильное метанотрофное сообщество в виде элективной культуры, не обнаружили метилотрофов, использующих в качестве субстрата метанол и только один организм слабо потребляющий формиат. Однако выделили ряд диссипотрофов (4 штамма), использующих ЛЖК, и организм, растущий на монометиламинв. Возможно мы просто не смогли выделить организмы, активно окисляющие метанол и формиат, вследствие их чувствительности к повышению температуры. Но также может быть, что таких организмов нет в элективной культуре, поскольку при окислении метана чистой культурой психрофильного метанотрофа.метанол и формиат в среду не выделяются. Присутствие в элективной культуре диссипотрофов объясняется их способностью использовать легко доступные растворимые субстраты в низких концентрациях.

Типичных спутников метанотрофов, использующих метанол -гифомикробов, нам не удалось выделить и непосредственно из проб, однако был выделен метилотроф, растущий на триметиламине и ряд доссипотрофэв, использующих ЛЕК (10 штаммов, из них 2 штамма были идентичны штаммам, выделенным из метанотрофного сообщества).

Небольшое количество выделенных в чистые культуры психроактивных организмов может быть следствием не только сложности выделения, но и наличия тесных трофических связей в почвенном сообществе при низкой температуре

При повышении температуры до 20°С и выше в элективной метакотрофной культуре основным потребителем метана являлся мезофильный метанотроф. Он так же был выделен в чистую культуру, но не изучался столь продробно, как психрофильный. В тундре такой метанотроф может потреблять метан в наиболее прогреваемых в вегетационный период участках.

Таким образом, в болотистой почве тундры во время короткого периода вегетации может развиваться группировка микроорганизмов, которая формирует "бактериальный фильтр" для веществ, образуемых метаногешшм сообществом (в частности для метана, (^-соединений и ЛЖК). Организмы этой функциональной группировки способны использовать субстраты в низких концентрациях. Они участвуют на конечных стадиях в разложении органического вещества.

ВЫВОДЫ

I. Из верхних аэробных слоев болотистой почвы тундры в элективную культуру выделено метанотрофное сообщество, активно окисляющее метан при низких температурах. Основным организмом, потребляющим метан в изучаемой системе является психрофильный метилококк. а. Впервые выделен в чистую культуру психрофильный облигатный метанотроф, который на основании морфологических, физиологических, биохимических и генетических критериев отнесен к роду Ме1Ьу1оЬасЬег С образованием нового вида Mb.psychrophi.lus. Таким образом, дано микробиологическое обоснование процесса низкотемпературного аэробного окисления метана.

3. Установлено, что причины, ограничивающие максимальную температуру роста мъ.реусЬгорЬПиз не определяются падением активностей ферментов первичного и центрального метаболизма.

4. Показано, что при повышении температуры до 20°С и выше в изучаемом метанотрофном сообщества происходит замена псшсрофильяого метанотрофа,. и окисление метана осуществляется мезофильными метанотрофами. . .

5. Из метано тройного сообщества и пробы почвы мочажины выделено 15 штаммов психроактивных микроорганизмов. Изучены их

морфологические свойства и рост в диапазоне температур 6°-28°С. Для данных организмов характерны низкие скорости роста, способность использовать низкомолекулярные вещества в невысоких концентрациях, небольшой прирост биомассы и ее быстрый лизис при температуре 28°С.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТИЛЕ ДИССЕРТАЦИИ 1.0мельченко М.В., Савельева Н.Д., Васильева Л,В., Заварзин Г.А. Психрофильное метанотрофное сообщество из почвы тундры. -Микробиология, 1992, Т.61, вып.6, с.1072-1077. 2.0мельченко М.В., Васильева Л.В., ' Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Пути первичного и промежуточного метаболизма у психрофильного, метанотрофа. - Микробиология, 1993, т.62, вып.5, с.849-854. 3.Ornelchenko M.V., Vasilyeva L.V., Zavarzin G.A. Psychrophilic nethanotroph from tundra soil. - Current microbiology, 1993, vol.27, p.255-259.

4.Лысенко A.M., Омельченко M.B., Васильева Л.В.' Нуклеотидный состав ДНК психрофильного метанотрофа и его ДНК-ДНК гомология с рядом метанотрофов I типа. - Микробиология, 1994, т.63, вып.

Ö.Omelchenko M.V., Vasilyeva L.V., Zavarzin G.A. The psychrophilic nethanotroph Methylobacter psychrophilus sp.nov. IJSB, 1994, submitted.

Подписано в печать Otj.O'j, 1994 г. Формат 60X81/16 Пум. офс. Печать офс.

Тираж /ОО Заказ ЛР? МП «ПЕТИТ» 107561, Мог к на, Богатырский Mori, 17, корп. 5