Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез поли-3-гидроксибутирата разной молекулярной массы культурой Azotobacter chroococcum и его биодеградация

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез поли-3-гидроксибутирата разной молекулярной массы культурой Azotobacter chroococcum и его биодеградация"

На правах рукописи

Николаева Дария Александровна

БИОСИНТЕЗ ПОЛИ-3-ГИДРОКСИБУТИРАТА РАЗНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ КУЛЬТУРОЙ ЛЮТОБЛСТЕЯ СНЯООСОССиМ И ЕГО БИОДЕГРАДАЦИЯ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в группе биохимии азотфиксации Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук ГА Бонарцева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Е.П. Феофилова кандидат биологических наук К.Ф. Шольц

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет

Защита диссертации состоится " "_2004 г.

в_часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по

присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119 071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы ББЛ РАН (119 071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1)

Автореферат разослан " "_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Общая характеристика работы Актуальность проблемы Истощение нефтяных ресурсов и необходимость создания специальных полимерных материалов, совместимых с природой, послужили мощным стимулом для разработки принципиально новых полимеров - биоразлагаемых термопластиков, изучение которых является сравнительно молодой областью науки. Поли-3-гидроксибутират и его сополимеры, которые относятся к семейству микробных полигидроксиалканоатов (ПГА), синтезируются в клетках микроорганизмов как запасные вещества. По своим базовым показателям эти полимеры близки к синтетическим термопластикам (полипропилену и полиэтилену), но обладают рядом уникальных свойств, главными из которых являются биосовместимость и биодеградабельность. В отличие от обычных пластиков, ПГА не засоряют окружающую среду, а полностью разлагаются до СО2 и воды. Перспективными областями использования ПГА являются: в промышленности - производство биоразлагаемых пластмасс, упаковок и материалов одноразового пользования; в сельском хозяйстве - создание систем медленного высвобождения удобрений и агрохимикатов; в медицине - изготовление рассасывающихся шовных нитей, хирургических пластин, пленок для покрытия ран, эндопротезов, матриц для лекарственных форм пролонгированного действия и др.

В связи с тем, что для разных целей требуется полимер с определенными технологическими характеристиками, которые, в первую очередь, определяются качественным составом мономеров и молекулярной массой полимера, необходимо уметь управлять процессом биосинтеза с целью получения полимера с заданными свойствами.

Цель и задачи работы Целью нашей работы было изучение влияния условий культивирования на величину молекулярной массы поли-3-гидроксибутирата синтезируемого штаммом-продуцентом Azotobacter скгоососеит 7Б; получение сополимера поли-З-гидроксибутирата-З-гидроксивалерата; изучение влияния условий среды на скорость биодеструкции полученных биопластиков. В связи с этим в работе были поставлены следующие

1. Проследить динамику изменения молекулярной массы поли-3-гидроксибутирата (ПГБ) в процессе биосинтеза;

2. Изучить влияние условий культивирования на молекулярную массу синтезируемого поли-3-гидроксибутирата;

3. Изучить условия синтеза сополимера поли-З-гидроксибутирата-З-гидроксивалерата (ПГБ-ГВ) культурой А. скгоосоесыт 7Б;

4. Проследить скорость биодеструкции ПГБ разной молекулярной массы и изменение физико-механических характеристик полимера в процессе биодеструкции;

5. Изучить влияние молекулярной массы и состава полимера на скорость высвобождения модельного лекарственного вещества из полимерной матрицы.

Научная новизна и практическая ценность работы Впервые разработан способ получения поли-3-гидроксибутирата заданной молекулярной массы путем внесения в среду культивирования Azotobacter скгоососсыт 7Б определенных концентраций дополнительного источника углерода - ацетата натрия. Получен сополимер поли-3-гидроксибутират-З-гидроксивалерат с разным процентным содержанием гидроксивалерата при использовании валериановой и пропионовой кислот как дополнительных источников углерода. С помощью разработанных способов можно получать ПГА с разными физико-химическими и технологическими характеристиками. Впервые выделено и рекомендовано как тест-система для оценки биодеградабельности ПГА сообщество микроорганизмов, способное разрушать ПГА в короткие сроки. Актуальным направлением в медицине является разработка лекарственных форм пролонгированного действия. С этой целью изготовлены модельные матричные системы пролонгированного действия на основе поли-3-гидроксибутирата и поли-3-гидроксибутирата-З-гидроксивалерата с включением модельного лекарственного вещества. Изучена кинетика высвобождения модельного лекарственного вещества из полимерной матрицы в зависимости от

молекулярной массы и состава полимера. ] »*»-г ¡:;:.м :

> м*

Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( источников). Работа изложена на страницах машинописного текста, включая 9 рисунков и 8 таблиц.

Апробация работы Материалы диссертации представлены на:

Workshop "Position of Environmentally Degradable Plastics in plástic waste

management", 4-8 June 2001, Lodz, Poland;

Международной конференции "Биотехнология на рубеже двух тысячелетии", 12-15 сентября 2001, Саранск;

Международной конференции молодых ученых "От фундаментальной науки - к новым технологиям", 25-28 сентября 2001,Тверь;

7Ш FAO/SPEN - Workshop "Anaerobic digestion for sustainability in waste (water) treatment and re-use", 19-11 May 2002, Moscow;

2ом Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 10-14 ноября 2003, Москва.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ (4 статьи, 5 тезисов) и получен один патент.

Материалы и методы исследования Объект исследования В работе использовали штаммы-продуценты ПГБ Azotobacter chroococcum 7Б и Azotobacter chroococcum 35, способные синтезировать до 80 % ПГБ от сухого веса клеток. Штаммы выделены из ризосферы пшеницы (дерново-подзолистая почва). Коллекционные штаммы Azotobacter поддерживали на среде Эшби. Для достижения сверхсинтеза поли-3-гидроксибутирата в клетках культуру азотобактера выращивали на среде Берка в условиях избыточного содержания источника углерода в среде (г/л): MgS047H20 - 0,4; FeS047H20 - 0,01; Na2Mo042H20 - 0,006; цитрат Na - 0,5; СаС12 -0,1; K2HP043H20 - 1,05; KH2P04 - 0,2; сахароза - 40. Выделение поли-3-гидроксибутирата из бактериальной биомассы Процесс выделения и очистки полимера из биомассы Azotobacter chroococcum включал

следующие стадии: - растворение ПГБ в хлороформе путем встряхивания на качалке при 37° С в течение 12 часов; -. отделение раствора ПГБ от клеточных остатков фильтрованием; - выделение ПГБ из раствора хлороформа осаждением изопропиловым спиртом; - последующее многократное растворение ПГБ в хлороформе и осаждение изопропанолом; - высушивание при 60° С. Определение содержания поли-3-гидроксибутирата в клетках по Зевенхаузену Суспензию клеток (20-100 мг сух. биом.) центрифугировали при 5000 g в течение 20 мин. Затем клетки суспендировали в 10 мл воды и гомогенизировали, используя УЗ-обработку (30 сек). К 2 мл суспензии клеток добавляли 2N НС1 и нагревали суспензию при 100° С в течение 2 часов на водяной бане; нерастворимый остаток (гранулы ПГБ) отделяли центрифугированием при 8000 g в течение 20 мин. К полученному остатку добавляли 5 мл хлороформа. Пробирки закрывали герметически и оставляли на ночь при 28°С на качалке. Затем содержимое пробирок центрифугировали и к 0.1 мл чистого хлороформного экстракта, предварительно высушенного воздушным потоком, добавляли 5 мл концентрированной серной кислоты; нагревали при 100°С на водяной бане в течение 10 мин. После охлаждения количество кротоновой кислоты, образующейся в результате кислотного гидролиза ПГБ и последующей дегидратации гидроксимасляной кислоты, определяли на спектрофотометре СФ-2000: длина волны - 235 нм, кювета - 1 см, контроль - H2SO4 концентрированная (Zevenhuizen, 1981).

Определение молекулярной массы полимера Молекулярную массу полимера определяли методом вискозиметрии. Измерения вязкости раствора ПГБ в хлороформе проводили при 30°С. Молекулярную массу вычисляли по уравнению Марка - Хаувинка - Куна, используя следующие коэффициенты [П]=7,7х10"5 хМ0,н (Akitaetal., 1975).

Газохроматографические исследования Содержание летучих жирных кислот в жидкой фазе почвенной суспензии определяли на хроматографе "Chrom 5" с пламенно-ионизационным детектором, в качестве сорбента использовали "Chromosorb-101M. Пробу объемом 2 мкл вводили в стеклянную колонку длиной 1,2 м и диаметром 3 мм, температура колонки 170° С, газ-носитель - аргон.

N2O в газовой фазе определяли на газовом хроматографе "Chrom 5" с детектором по теплопроводности (температура детектора 20° С), на колонке с сорбентом "Porapak Q" ( длина колонки - 12 м, диаметр - 3 мм), газ-носитель -аргон.

Ядерно-магнитный резонанс Спектры 'Н-ЯМР 1-2% растворов ПГБ и П(ГБ-ГВ) в дейтерированном хлороформе сняты на спектрометре MSL-300 "Bruker". Рабочая частота - 300 МГц. Химические сдвиги отсчитывали от сигнала остаточных протонов CDClj - 7,20 ррт. Количество накоплений NS = 40. Процентное содержание элементарных звеньев гидроксивалерата в сополимере П(ГБ-ГВ) рассчитывали по соотношению интегральной интенсивности сигнала метальной группы гидроксивалерата (0,89 ррт) к сумме интегральных интенсивностей сигналов метильной группы гидроксивалерата (0,89 ррт) и метальной группы гидроксибутирата (1,27 ppm) (Bloembeigen et al., 1986).

Рентгеноструктурный анализ Степень кристалличности образцов полимера определяли методом рентгеноструктурного анализа на стандартном дифрактометре (Rigaku Denki, Япония) с использованием 18 кВт -генератора с вращающимся медным анодом. Для фильтрации излучения использовали никелевый фильтр. Степень кристалличности определяли по соотношению интегральных интенсивностей рассеяния кристаллической и аморфной фазы. Механические испытания образцов пленок полимера Механические свойства пленок полимера (прочность, удлинение при разрыве, модуль упругости) определяли на универсальном динамометре Инстрон 1121. Высекали образцы пленок полимера в виде лопаток с длиной рабочей части 10 мм, шириной 3 мм и толщиной 0,03-0,04 мм. Испытания проводили при 20° С, скорость движения траверсы - 5 мм/мин.

Исследование биодеградации пленок из ПГБ Образцы пленки весом 40 мг помещали во флаконы с почвенной суспензией. Почвенная суспензия готовилась на основе 0,1 М калий-фосфатного буфера (соотношение почва-буфер 1:10). Нитраты добавляли в концентрации 5 г/л. Для создания анаэробных

условий флаконы закрывали резиновыми пробками и эвакуировали воздух с помощью масляного насоса. Затем флаконы заполняли аргоном и добавляли 5%

ацетилена (ингибитор N2O- редукгазы). В вариантах с микроаэрофильными условиями эвакуации воздуха не проводили, в закрытые резиновыми пробками флаконы добавляли 5% ацетилена. В аэробных вариантах флаконы закрывали ватными пробками. Инкубацию проводили при 28°С. Для определения потери веса образца, пленки извлекали из почвенной суспензии, тщательно промывали 0,1М фосфатным буфером, высушивали 2 часа при 60°С и взвешивали. Сообщество денитрифицирующих микроорганизмов, способных к разложению ПГБ выделяли следующим образом: кусочки пленки из ПГБ помещали во флаконы с почвенной суспензией, куда были добавлены нитраты (5 г/л). Во флаконах создавались микроаэрофильные условия. Через 60 дней оставшиеся фрагменты пленки извлекали из почвенной суспензии, отмывали в стерильной водопроводной воде и из полученной суспензии производили высев в жидкую среду для денитрифицирующих бактерий (среда Гильтая).

Приготовление пленок ПГА матричного типа с введением модельного лекарственного вещества Для изготовления пленок использовали 4 образца полимера: 1) ПГБ с молекулярной массой 1200 kDa; 2) ПГБ 300 kDa; 3) ЩГБ-ГВ 2%) 880 kDa; 4) ЩГБ-ГВ 17%) 1448 kDa. Пленки изготавливали методом налива раствора полимера в хлороформе (1% w/v) в чашки Петри с последующим выпариванием растворителя при комнатной температуре. Раствор метилового красного в хлороформе смешивали с раствором полимера перед отливом пленок. Содержание метилового красного в пленках ПГБ и ПГБ-ГВ составляло 4% vv/w. Толщина пленок 0,02 мм. Кусочки пленки одинаковой формы весом 20 мг помещали в стеклянные флаконы, содержащие 30 мл калий-фосфатного буфера (рН 7.4). Флаконы помещали на качалку 250 об/мин при температуре 37°С. Динамику высвобождения изучали путем отбора проб раствора и измерения содержания метилового красного в растворе спектрофотометрически при длине волны 430 нм на спектрофотометре DU-650 "Beckman".

Результаты исследований и их обсуждение Динамика изменения молекулярной массы ПГБ в процессе роста культуры

Соотношение реакций синтеза и распада ПГА в бактериальной клетке определяется потребностями клетки в каждый отдельный момент. Известно, что эти процессы могут происходить в одно и то же время (Doi et а1., 1990; Taidi et э1., 1995). Из данных, представленных на рис. 1 следует, что рост и синтез ПГБ культурой AzotoЪacter скгоосоесыт 7Б идут параллельно, достигая максимальных значений к 48 час. культивирования. Средневязкостная молекулярная масса полимера также постепенно увеличивается с увеличением содержания ПГБ в клетках и достигает максимума к 26 час. (1900 кСа), а затем, начиная с 30 час. начинает снижаться, хотя содержание ПГБ в клетках в это время продолжает расти. К концу ферментации (48 час.) значение средневязкостной молекулярной массы ПГБ составляет 1500 Ша (рис.2). Очевидно это связано с тем, что на определенной стадии аккумуляции ПГБ в клетке А. скгоососсыт 7Б включаются механизмы активации внутриклеточной деполимеразы, что приводит к снижению средневязкостной молекулярной массы. В дальнейшем, говоря о молекулярной массе поли-3-гидроксибутирата, мы будем иметь в виду молекулярную массу ПГБ, полученного в конце ферментации (48 час).

Время, час

Рис.1 Рост культурыAzotoЪacierскгоососстп 7Б (1) и синтез поли-3-гидроксибутирата(2)

Рис. 2 Динамика изменения молекулярной массы поли-3-гидроксибутирата в процессе роста культурыAzotobacterскюосоесыт 7Б

Влияние условий культивирования на молекулярную массу синтезируемого ПГБ

В экспериментах по изучению влияния условий культивирования на молекулярную массу синтезируемого полимера варьировали следующие факторы

• концентрация дополнительного источника углерода,

• рН среды,

• температура,

• уровень аэрации

Ранее было замечено, что добавление органических кислот к сахаросодержащей среде снижает молекулярную массу синтезируемого полимера. Поэтому были поставлены эксперименты с варьированием концентрации ацетата натрия в среде культивирования. Опыты проводили с двумя штаммами бактерий рода Azotobacter. Результаты приведены в таблице 2 и 3. Увеличение концентрации ацетата № в среде от 2 до 5 г/л на фоне основного источника углерода (сахароза - 40г/л) приводило к снижению молекулярной массы ПГБ, синтезированного клетками обоих штаммов Azotobacter: А. скгоососсыт 7Б иА. скгоососсыт 35.

Таблица 1. Влияние дополнительного источника углерода (ацетата натрия) на молекулярную массу ПГБ, синтезируемого А. скгоосоесыт 7Б

Концентрация ацетата, г/л Выход биом. г/л Содержание ПГБ в клетке, % от C.B. Выход ПГБ, г/л Характеристическая вязкость, дл/г Средне-вязкостная молекулярная масса, kDa

0 5,1 78,3 4,0 9,00 1515

2 5,1 79,5 4,1 6,93 1100

3 4,3 72,0 3,1 3,19 427

5 4,0 67,5 2,7 2,19 270

Таблица 2. Влияние дополнительного источника углерода (ацетата натрия) на молекулярную массу ПГБ, синтезируемого А. скгоососсыт 35

Концентрация ацетата,г/л Выход биом. г/л Содержание ПГБ в клетке, % от C.B. Выход ПГБ, г/л Характеристическая вязкость, дл/г Средне-вязкостная молекулярная масса, kDa

0 3,1 76,1 2,4 7,49 1210

2 3,2 75,7 2,4 6,12 946

3 2,7 69,1 1,7 4,72 690

5 2,1 65,3 1,4 3,76 523

Вероятно, при повышении внутриклеточной концентрации ацетильных групп возрастает активность кетотиолазы и ацетоацетил КоА-редуктазы, вследствие чего повышается концентрация гидроксибутирил-КоА, который является субстратом ПГБ-синтазы. При высоких концентрациях ацетата образуется большее количество центров полимеризации и большее количество начальных фрагментов полимерных цепей, что приводит к синтезу ПГБ с более низкой молекулярной массой (Suzuki et al., 1988).

Что касается влияния рН среды на степень полимеризации синтезируемого ПГБ, то полимер с наиболее высокой степенью полимеризации получен при оптимальном для роста культуры нейтральном рН среды (1485 kDa). Как при кислых так и при щелочных значениях рН молекулярная масса ПГБ снижалась. Таким образом, изменяя рН среды культивирования также можно получать ПГБ с разной молекулярной массой. Однако, такой способ не подходит для применения на практике, т.к. эти условия не являются оптимальными для роста культуры.

С целью изучения влияния температуры на степень полимеризации синтезируемого ПГБ был поставлен опыт по культивированию Azotobacter chroococcum 7Б при разных температурах от 20°С до 37°С. Показано, что в пределах диапазона 30 - 37°С температура культивирования практически не влияет как на общее содержание ПГБ в клетке, так и на молекулярную массу синтезируемого ПГБ (73,4% ПГБ, 1670 kDа и 75,2% ПГБ, 1450 kDa соответственно), однако рост A. chroococcum 7Б при высокой температуре подавляется.

Еще один возможный способ регулировать молекулярную массу синтезируемого полимера - изменение уровня аэрации в процессе роста культуры. Учитывая, что Azotobacter chroococcum является облигатным аэробом, в первые 12 часов роста во всех вариантах поддерживался высокий уровень аэрации, что давало возможность получить количество биомассы, достаточное для дальнейших анализов. Через 12 часов роста условия аэрации изменяли по вариантам. При снижении уровня аэрации на второй стадии культивирования молекулярная масса возрастала от 1480 до 2215 Ша. Очевидно, это связано с

тем, что высокое внутриклеточное соотношение восстановленных и окисленных пиридиннуклеотидов (НДДН/НДД+), возникающее при лимитировании по кислороду, ингибирует ферменты катаболизма глюкозы и цикла Кребса, снижая скорость окисления ацетил-КоД через ЦТК и направляя его на синтез ПГБ.

Таким образом, путем варьирования таких факторов как рН среды, уровень аэрации и концентрация ацетата может быть получен ПГБ определенной молекулярной массы в диапазоне от 270 до 2215 kDa. Получение сополимера поли-З-гидроксибутирата-З-гидроксивалерата при использовании в качестве продуцентаAz.otobaclerchroococcum 7Б

Кроме 3-гидроксимасляной кислоты, около 100 различных гидроксиалкановых кислот обнаружено в качестве компонентов ПГД (Steinbüchel, Valentin, 1995). Коммерческую ценность представляют в основном поли-3-гидроксибутират и его сополимер с 3-гидроксивалератом (ПГБ-ГВ),, Введение 3-гидроксивалерата (3-ГВ) в ПГБ существенно улучшает физико-химические свойства сополимера. ПГБ-ГВ обладает большей прочностью и эластичностью (уменьшается модуль Юнга с увеличением фракции 3-ГВ в ПГБ-ГВ) по сравнению с гомополимером ПГБ (Anderson, Dawes, 1990). Как правило, для получения сополимера путем микробиологического синтеза, в качестве либо основных, либо дополнительных источников углерода используют органические кислоты или спирты с нечетным числом атомов углерода (Gross, 1994).

С целью получения термопластиков с различными физико-химическими свойствами была поставлена задача исследовать возможность получения сополимера поли-3-гидроксибутирата-З-гидроксивалерата на штамме Azotobacter chroococcum 7Б. В качестве предшественников звеньев гидроксивалерата в цепи ПГБ использовали валериановую и пропионовую • кислоты. При выращивании культуры на сахарозе с добавлением валериановой кислоты был получен сополимер с содержанием ГВ 17% (в молярном соотношении). Необходимо отметить, что добавление валериановой кислоты приводит к ингибированию роста культуры, так урожай биомассы составлял 3,2 г/л при концентрации валерата 20 тМ, тогда как в контрольном варианте при росте культуры на сахарозе урожай биомассы составлял 5,6 г/л. В отличие от

валериановой кислоты пропионат у А. скгоососсыт 7Б не вызывает включения большого количества гидроксивалерата в состав сополимера. Так, при концентрации пропионовой кислоты 20 тМ в состав полимера включается лишь небольшое количество гидроксивалерата (2,5%). На рис. 3, 4 и 5 представлены спектры 'Н-ЯМР сополимера ЩГБ-ГВ 17%), ЩГБ-ГВ 2,5%) и гомополимера ПГБ соответственно. На рис. 3 и 4 в спектре присутствует сигнал метильной группы 3-гидроксивалерата при величине химического сдвига 0,89 ррт, тогда как в спектре гомополимера ПГБ (рис. 5) этот сигнал отсутствует. Таким образом, нами получен сополимер поли-З-гидроксибутират-З-гидроксивалерат с содержанием гидроксивалерата 17 % и 2,5% при использовании валериановой и пропионовой кислот в качестве дополнительных источников углерода.

-СН,(8)НВ

-СН,(Ь)

-СН (Ь)

80 71 70 а 60 II 10

45 40 15 30 15 30 15 10 01 00

НВ - ЬуёгохуЫйуМе; НУ - Ьуёгохуа1ега1е; (й) - боковая цепь; (Ь) - основная цепь полимера Рис. 3 Спектр 'Н-ЯМР сополимера ПГБ-ГВ с содержанием гидроксивалерата 17%.

Биодеструкция ПГБ разной молекулярной массы

Наряду с биосинтезом полимера целью работы было исследование биодеградации образцов ПГБ разной молекулярной массы. Необходимо отметить, что большинство работ по биодеструкции посвящено изучению этого процесса в аэробных условиях, работ по анаэробной деградации полимера крайне мало. Мы в своей работе исследовали этот процесс в разных условиях аэрации в присутствии и отсутствии нитрата.

Рис.6 Степень биодеградации пленок ПГБ в зависимости от содержания нитратов в среде и концентрации кислорода в газовой фазе (продолжительность эксперимента - 2 месяца)

1 - анаэробные условия

2 - микроаэрофильные условия

3 - аэробные условия

Известно, что нитрат может быть использован микробным сообществом не только как источник азота для роста микроорганизмов, но и как альтернативный кислороду акцептор электронов при аноксии (Tiedje, 1988). Сначала опыты проводились в модельных условиях почвенного сообщества. Показано, что добавление нитрата заметно повышает скорость биодеградации пленок ПГБ при всех заданных уровнях кислорода в газовой фазе (рис. 6). Максимальная скорость биодеструкции наблюдалась в аэробных условиях с добавлением нитратов.

Таблица 3. Динамика восстановления Ы03* в N2 О в процессе

биоразложения ПГБ

Содержание Ы20 в газовой фазе мкмоль/ флакон

N п/п Варианты 20 дней 30 дней 60 дней

1 02 0% Ы03" 5 г/л пленка ПГБ 82,3 114,4 128,5

02 0% Шз" 5 г/л Контроль без пленки 28,1 40,2 56Д

2 0210% Шз' 5 г/л пленка ПГБ 178,7 271,0 259,0

02 10% Шз" 5 г/л Контроль без пленки 8.0 16,1 12,0

3 ' 02 20% "N03" 5 г/л пленка ПГБ не опр не опр не опр

02 20% N03" 5 г/л Контроль без пленки не опр не опр не опр

Получены результаты, свидетельствующие о сопряжении двух процессов -деградации ПГБ и восстановления нитратов. Из таблицы 3 видно, что микроаэрофильные условия более благоприятны для биодеградации ПГБ и развития денитрификаторов, чем анаэробные (количество выделившегося М20 в анаэробном варианте в два раза ниже по сравнению с вариантом, где содержание кислорода составляло 10%).

Было изучено изменение молекулярной массы, степени кристалличности и механических свойств полимерной пленки в процессе биодеградации. Показано, что в процессе биодеградации пленки в почвенной суспензии молекулярная масса ПГБ снижалась во всех вариантах опыта по сравнению с контрольной пленкой, не подвергавшейся биодеградации. В аэробных условиях с добавлением нитрата (табл.4, вариант 6), где визуально наблюдаемая степень биодеградации была наибольшей, значение средневязкостной молекулярной массы полимера на 60-е сутки после начала опыта составляло 780 кЭа, что почти вдвое меньше, чем молекулярная масса полимера, не подвергшегося биодеструкции. Можно отметить прямую корреляцию между степенью биодеградации пленки и снижением молекулярной массы полимера (рис.6 и табл.4). Так, при одинаковом уровне содержания кислорода в газовой фазе в вариантах с добавлением нитрата пленка не только быстрее теряет в весе, но и молекулярная масса полимера снижается быстрее по сравнению с вариантами без внесения нитрата. Интересно отметить, что низким значениям молекулярной массы полимера в вариантах 4 и 6 (табл.4) соответствуют наиболее высокие значения степени кристалличности (75,2 и 76,2% соответственно). Так как структура полимера предполагает наличие аморфных и кристаллических областей, а аморфные области подвергаются гидролизу и микробной деградации в первую очередь (8рую et а1., 1997), очевидно, что при последовательном разрушении аморфных областей повышается степень кристалличности.

Таблица 4. Изменение молекулярной массы, степени кристалличности и механических характеристик пленок ПГБ в

процессе биодеструкции (продолжительность эксперимента - 60 дней)

Nn/n Варианты Степень биодеструкции (% от начального веса пленки) Молекулярная масса, kDa Степень кристалличности % Напряжение при разрыве, мПа Удлинение при разрыве, % Модуль упругости, мПа

Исходная пленка 100 1 490 72,9 31,3 4,0 1660

1 02 0% 96 1 310 73,9 36,6 3,2 2010

2 о2 0% +Ж)3 83 1 330 74,1 31,2 3,4 1965

3 02 10% 83 1 080 74,2 26,0 3,7 1695

4 Ог 10% +N03 38 980 75,2 12,1 3,0 840

5 Ог 20% 53 1 110 73,9 13,2 3,8 825

6 02 20% +Ш3 5 780 76,3 не опр* не опр* не опр*

* пленка разрушена практически полностью

На элективной среде для денитрификаторов была получена накопительная культура микроорганизмов, способных утилизировать ПГБ пленку за короткий срок (3 -7 дней) в микроаэрофильных условиях. Показано, что доминирующими видами в этой накопительной культуре были бактерии рода Pseudomonas.

В процессе биодеградации полимера в накопительной культуре также наблюдалась корреляция снижения веса пленки и снижения молекулярной массы ПГБ. Показано, что скорость биодеструкции зависит от исходной молекулярной массы полимера. Пленка ПГБ молекулярной массы 1540 Ша весом 6 мг полностью разрушалась за 7 суток. Пленка того же веса, но из ПГБ молекулярной массы 890 kDa разрушалась за 4 суток. Средневязкостная молекулярная масса последовательно снижалась у обоих исследованных полимеров: у более высокомолекулярного - от 1540 до 580 kDa , у полимера с меньшей молекулярной массой - от 890 до 612 kDa (рис. 7, 8). Как видно из представленных результатов, биодеструкция менее высокомолекулярного полимера начинается практически сразу - через сутки (через 48 час. наблюдается 27% потеря веса пленки, средневязкостная молекулярная масса снижается от 890 до 727 kDa ), тогда как деградация высокомолекулярного полимера начинается только на 3 сутки (через 48 час. отмечена только 5% потеря веса пленки, молекулярная масса практически не меняется).

Известно, что деструкция деполимеразой полимерной цепи по "экзо" типу, т.е. последовательное отщепление концевых групп, идет с большей скоростью, и, следовательно, вносит основной вклад в изменение средней молекулярной массы полимера, чем деструкция по "эндо" типу, т.е. случайный разрыв полимерных цепей в месте связывания фермента Однако, атака полимерной цепи по "эндо" типу играет важную роль при инициации процесса биодеградации, так как изначально лишь небольшое число полимерных цепей ориентированы так, что их концы доступны действию фермента (Hocking et al, 1996). Возможно, сокращение периода биодеструкции для более низкомолекулярного полимера, в массе своей имеющего большее число концевых групп, связано с тем, что деструкция полимерных цепей с концов по "экзо" типу у него происходит активнее, чем у высокомолекулярного полимера.

Выделенное сообщество может быть использовано как тест-система при оценке биодеградабельности ПГА и изделий из них.

Рис. 7 Скорость биодеструкции пленки ПГБ 1540 kDa (1) и ПГБ 890 Ша (2) в накопительной культуре денитрифицирующих бактерий.

Молекулярная масса Му (ХЮ3)

О -1-1-1-1-1-1-1

0 1 2 3 4 5 6 7

время, суг.

Рис. 8 Изменение молекулярной массы образцов полимера в накопительной культуре денитрифицирующих бактерий: 1 - ПГБ 1540 kDa; 2 - ПГБ 890 kDa.

Кинетика высвобождения модельного лекарственного вещества из полимерной матрицы

Наиболее перспективной областью применения полигидроксиалканоатов является медицина, в частности, ПГА могут быть использованы в качестве матричного материала для изготовления лекарственных форм пролонгированного действия. Нами были изготовлены модельные пленочные матричные системы пролонгированного действия на основе поли-3-гидроксибутирата и поли-3-гидроксибутирата-З-гидроксивалерата с включением модельного лекарственного вещества (метилового красного).

Метиловый красный (2-[[4 -(диамино)фенил]азо]-бензойная кислота) был выбран как модельное лекарственное вещество по следующим причинам:

1) метиловый красный хорошо растворим в хлороформе;

2) по своим физико-химическим характеристикам может служить моделью умеренно липофильного лекарственного вещества;

3) выход метилового красного из полимерной матрицы легко может быть определен спектрофотометрически.

Прослежена кинетика высвобождения модельного лекарственного вещества из пленок во внешнюю среду in vitro в буферной системе в зависимости от молекулярной массы и химического состава полимерной матрицы. Массоперенос модельного лекарственного вещества из пленок поли-3-гидроксибутирата и поли-3-гидроксибутирата-З-гидроксивалерата в раствор был двухфазным. Первоначально высокая скорость высвобождения затем снижалась (пологий участок кривой на рис. 9). Так как гидролиз ПГБ и ПГБ-ГВ происходит достаточно медленно (Pouton et al., 1988), эрозия полимерной матрицы вследствие гидролиза, по-видимому, не влияет на выход модельного лекарственного вещества во внешнюю среду в рассматриваемые здесь сроки. Высвобождение лекарственного вещества из полимерной матрицы происходит путем диффузии через водные каналы или формирующуюся сеть пор (Siegel et al, 1989).

Ранее было показано, что кинетика высвобождения лекарственного

100 90 ВО 70

Я

1 60 О

2 50 Л со

5 40

30 20 10 0

Время, час

—ПГБ1210М>а

-«— ПГБ300 кШ

-*—ПСГЕ-ГВ 2^'/.) 880к0а П/ГБ-ГВ 17%) 1380 к1)я

- • —ПГБШОкБа

- • — ПГБ300Ю>а

-* — П(ГБ-ГВ 2,5 % ) 880кБ«

- • — П(ГБ-ГВ 17%) 1380 кБя

Рис.9 Кинетика высвобождения модельного лекарственного вещества (метилового красного) из полимерной матрицы в зависимости от молекулярной мещерв? сйЗтДйепЩЪйоравнешнюю среду зависит от внутренней морфологии полимера (ЛкЫаг й а1., 1991). Поли-3-гидроксибутират и его сополимеры кристаллизуются из расплава и раствора, образуя структуру, состоящую из сферолитов. Сферолиты не являются единичными кристаллами, они представляют собой комплекс ламелей, расходящихся от центрального ядра. Морфология полимера на уровне сферолитов является сложной функцией таких характеристик полимера как молекулярная масса, температура кристаллизации и состав (для сополимеров).

Из рис. 9 видно, что состав полимера в большей степени влияет на скорость высвобождения метилового красного, чем молекулярная масса чистого ПГБ. Важно отметить, что даже при небольшом количестве гидроксивалерата в

составе сополимера (2,5%), скорость высвобождения метилового красного в раствор заметно возрастает по сравнению со скоростью высвобождения из гомополимера ПГБ. Возможно, это связано с тем, что введение сомономера в гомополимер приводит к снижению степени кристалличности (LшzierД992) и уменьшению размера сферолитов (Barham, 1990), вследствие чего вода быстрее проникает внутрь полимерной матрицы по аморфным участкам, т.е. увеличивается скорость набухания полимера.

Таким образом, показано, что кинетика высвобождения модельного лекарственного вещества во внешнюю среду зависит от состава сополимера и от молекулярной массы гомополимера, при этом наличие в составе полимера звеньев гидроксивалерата значительно увеличивает скорость высвобождения модельного лекарственного вещества во внешнюю среду по сравнению со скоростью высвобождения из образцов гомополимера ПГБ.

Выводы:

1. Показана возможность варьирования степени полимеризации ПГБ путем изменения условий культивирования: рН среды, температуры, уровня аэрации, внесения в среду культивирования дополнительного источника углерода - органических кислот.

2. Разработан и запатентован способ получения ПГБ заданной молекулярной массы при внесении в среду определенной концентрации дополнительного источника углерода - ацетата натрия.

3. Показано, что ПГБ легко подвергается биодеструкции сообществами почвенных микроорганизмов. Впервые выделено сообщество микроорганизмов, которое может быть рекомендовано как тест-система для оценки биодеградации ПГА.

4. Получен сополимер поли-З-гидроксибутират-З-гидроксивалерат с разным процентным содержанием гидроксивалерата при использовании валериановой и пропионовой кислот как дополнительных источников углерода.

5. Показано, что скорость высвобождения модельного лекарственного вещества из полимерной матрицы в большей степени зависит от мономерного состава полимерной цепи и в меньшей степени от молекулярной массы полимера.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Бонарцева ГА., Мышкина В.Л., Николаева Д.А., Ребров А.В., Герасин В А., Махина Т.К. Биодеградация поли-Р-оксибутирата в модельных условиях почвенного сообщества: влияние условий среды на скорость процесса и физико-механические характеристики полимера// Микробиология. 2002. т. 71, № 2, стр. 258-263.

2. Мокеева В.Л., Чекунова Л.Н., Мышкина В.Л., Николаева Д.А, Герасин ВА., Бонарцева Г.А.. Биодеструкция поли-Р-гидроксибутирата микроскопическими грибами: испытания полимера на грибостойкость и фунгицидные свойства// Микология и фитопатология, 2002. т.Зб, № 5, стр. 59-63.

3. Bonartseva G.A., Myshkina V.L., Nikolaeva D.A., Kevbrina M.V., Kallistova A., Gerasin VA., Iordanskii AX. and Nozhevnikova A.N. Aerobic and Anaerobic Microbial Degradation of Poly-p-Hydroxybutyrate Produced by Azotobacter chroococcum// Applied Biochemistry and Biotechnology, 2003, v. 109, Iss. 1-3, pp. 285-302.

4. Фурина Е.К., Николаева Д.А., Бонарцева Г.А., Мышкина В.Л., Львов Н.П. Восстановление нитратов культурами Azotobacter indicum и Azotobacter chroococcumll Прикладная биохимия и микробиология, 2002, т.38(6), стр. 649-652.

5. Бонарцева ГА., Мышкина В.Л., Загреба Е.Д., Николаева Д.А. Способ получения полиоксибутирата заданной молекулярной массы. Патент на изобретение № 2201453 от 18 октября 2001 г.

6. Bonartseva GA., Myshkina V.L and Nikolaeva D.A. Biosynthesis of poIy-3-hydroxybutyrate of different molecular weight by Azotobacter chroococcum 7Б and its biodegradation under model conditions of soil microbial community // Proc. of workshop "Position of Environmentally Degradable Plastics in plastic waste management", Lodz, Poland, 4-8 June 2001, p. 20.

7. Бонарцева ГЛ., Мышкина В.Л., Николаева Д.А. Биосинтез поли-3-гидроксибутирата разной молекулярной массы культурой A., chroococcum 7Б и его биодеградация в модельных условиях почвенного сообщества // Тез. Международной научной конференции "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий", Саранск 12-15 сентября 2001, Изд-во Мордовского университета, стр. 219-220.

8. Николаева Д.А. Влияние аэрации на молекулярную массу поли-3-гидроксибутирата, синтезируемого Azotobacter chroococcum И Тез. международной конференции молодых ученых, Тверь, 25-28 сентября 2001, стр. 135-136.

9. Bonartseva G.A., Myshkina V.L., Nikolaeva D.A., Gerasin V.A., and Makhina Т.К. Biodegradable plastic poly-3-hydroxybutyrate produced by Azotobacter chroococcum on food industry waste // Proc. of 7th FAO/SPEN - Workshop "Anaerobic digestion for sustainability in waste (water) treatment and re-use", Moscow, 19-11 May 2002, pp. 378385.

10. Бонарцева Г.А., Иорданский А.Л., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Николаева Д.А., Фурина Е.К. Получение и перспективы применения полиоксиалканоатов -экологически чистых биоразлагаемых термопластичных биополимеров// Материалы 2го Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 10-14 ноября 2003, Москва, ч.1, стр. 261.

Типография ИМАШ РАН. г Москва, М Харитоньевский

Лиц ПД № 00492 от 12 04 2000

Зак №/3 от 5 „л« 20 04 тир /¿>0экз

Ц06 3 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Николаева, Дария Александровна

Введение

Часть 1. Литературный обзор

Глава 1. История изучения полигидроксиалканоатов

Глава 2. Физико-химические свойства полигидроксиалканоатов

2.1. Строение ПГБ. Гранулы ПГБ.

2.2. Вариабельность мономерного состава ПГА.

2.3.Физико-химические свойства поли-3-гидроксибутирата и поли-З-гидроксибутирата-З-гидроксивалерата

Глава 3. Физиологические функции ПГА

3.1. Распространенность ПГА среди прокариот.

3.2. Условия, способствующие накоплению ПГБ в клетках. ПГБ как резервное вещество для запасания углерода и энергии

3.3. ПГБ как депо восстановительных эквивалентов

3.4. Низкомолекулярный ПГБ в составе клеточных мембран

Глава 4. Пути синтеза и распада ПГБ

4.1. Синтез поли-3-гидроксибутирата

4.2. Внутриклеточная деградация ПГБ

Глава 5. Влияние условий культивирования на молекулярную массу ПГА 34 5.1. Влияние разных факторов на молекулярную массу ПГБ, синтезируемого метилотрофными и водородоокисляющими бактериями 35 5.2. Влияние разных факторов на молекулярную массу и выход ПГБ у бактерий рода Azotobacter

5.3. Использование неочищенных субстратов для биосинтеза ПГБ бактериями рода Azotobacter

5.4.Синтез сополимера поли-З-гидроксибутирата-З-гидроксивалерата бактериями рода Azotobacter

Глава 6. Внеклеточная биодеградация ПГА

6.1. Исследование биодеградации ПГБ в природных условиях и в модельных системах

6.2. Микроорганизмы, способные к внеклеточной деградации ПГА. ПГА-деполимеразы.

Глава 7. Применение ПГА в медицине

Часть 2. Материалы и методы исследования

1. Объекты исследования

1.1. Культурально - морфологические признаки штаммов

Azotobacter chroococcum 7Б и Azotobacter chroococcum 35.

1.2. Физиолого-биохимические признаки.

2. Получение высокоочищенного ПГБ из бактериальной массы

3. Определение содержания поли-3-гидроксибутирата в клетках по Зевенхаузену

4. Определение молекулярной массы полимера

5. Газохроматографические измерения

6. Исследование состава полимера методом ядерно-магнитного резонанса

7. Определение степени кристалличности образцов полимера методом рентгеноструктурного анализа

8. Механические испытания образцов пленок полимера

9. Электронная микроскопия

10. Исследование биодеградации пленок ПГБ в почвенной суспензии

11. Изучение биодеструкции пленок ПГБ в накопительной культуре денитрифицирующих бактерий

12. Изготовление пленок ПГА матричного типа с включением модельного лекарственного вещества метилового красного)

Источники углерода, используемые в качестве ростовых субстратов

Часть 3. Результаты и их обсуждение

Глава 1. Влияние разных источников углерода и условий культивирования на степень полимеризации поли-3-гидроксибутирата синтезируемого культурой Azotobacter chroococcum. Получение сополимера поли-3-гидроксибутирата- 3-гидроксивалерата (ПГБ-ГВ)

1.1. Биосинтез поли-3-гидроксибутирата и динамика изменения молекулярной массы ПГБ в процессе периодического культивирования Azotobacter chroococcum 7Б

1.2. Влияние условий культивирования на степень полимеризации ПГБ 68 1.2.1. Влияние разных источников углерода на молекулярную массу ПГБ

1.2.2. Влияние дополнительного источника углерода (ацетата натрия) на молекулярную массу ПГБ, синтезируемого A. chroococcum 7Б и A. chroococcum

1.2.3. Влияние рН среды на молекулярную массу синтезированного ПГБ

1.2.4. Влияние уровня аэрации

1.2.5. Влияние температуры

1.3. Условия синтеза сополимера поли-3-гидроксибутирата-3-гидроксивалерата при использовании в качестве продуцента A. chroococcum 7Б.

Глава 2. Биодеградация ПГБ . Изменение физико-химических характеристик полимера в процессе биодеградации.

2.1. Биодеградация ПГБ в модельных условиях почвенного сообщества

2.2. Биодеструкция ПГБ сообществом денитрифицирующих микроорганизмов

2.3. Биодеструкция ПГБ микроскопическими грибами

Глава 3. Кинетика высвобождения модельного лекарственного вещества (метилового красного) из полимерной матрицы ПГБ и ПГБ-ГВ в зависимости от физико-химических характеристик полимера

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтез поли-3-гидроксибутирата разной молекулярной массы культурой Azotobacter chroococcum и его биодеградация"

Истощение нефтяных ресурсов и необходимость создания специальных полимерных материалов, совместимых с природой, послужили мощным стимулом для разработки принципиально новых полимеров - биоразлагаемых термопластиков, изучение которых является сравнительно молодой областью науки. Поли-З-гидроксибутират и его сополимеры, которые относятся к семейству микробных полигидроксиалканоатов (ПГА), синтезируются в клетках микроорганизмов как запасные вещества. По своим базовым показателям эти полимеры близки к синтетическим термопластикам (полипропилену и полиэтилену), но обладают рядом уникальных свойств, главными из которых являются биосовместимость и биодеградабельность. В отличие от обычных пластиков, ПГА не засоряют окружающую среду, а полностью разлагаются до СС>2 и воды. Перспективными областями использования ПГА являются: в промышленности - производство биоразлагаемых пластмасс, упаковок и материалов одноразового пользования; в сельском хозяйстве - создание систем медленного высвобождения удобрений и агрохимикатов; в медицине -изготовление рассасывающихся шовных нитей, хирургических пластин, пленок для покрытия ран, эндопротезов, матриц для лекарственных форм пролонгированного действия и др.

В связи с тем, что для разных целей требуется полимер с определенными технологическими характеристиками, которые, в первую очередь, определяются качественным составом мономеров и молекулярной массой полимера, необходимо уметь управлять процессом биосинтеза с целью получения полимера с заданными свойствами.

Целью нашей работы было изучение влияния условий культивирования на величину молекулярной массы поли-3-гидроксибутирата синтезируемого штаммом-продуцентом Azotobacter chroococcum 7Б; получение сополимера поли-З-гидроксибутирата-З-гидроксивалерата; изучение влияния условий среды на скорость биодеструкции полученных биопластиков.

Часть 1. Литературный обзор Глава 1. История изучения полигидроксиалканоатов

Суданофильные, липидоподобные включения впервые были отмечены в клетках Azotobacter chroococcum в начале прошлого столетия (Meyer, 1903). Стап (Stapp, 1924) обнаружил растворимость "жира" из клеток Azotobacter в хлороформе, но ему не удалось установить химическую природу этого вещества. Состав вещества был открыт Лемуанем в 1926 г. благодаря случайному наблюдению, что в анаэробных условиях происходит подкисление суспензии Bacillus megaterium. Образовавшаяся кислота была идентифицирована как Р-гидроксимасляная, а вещество - источник этой кислоты как поли-{5-гидроксибутират (Lemoigne, 1926). ПГБ не привлекал к себе широкого внимания исследователей вплоть до конца 50х гг., когда была опубликована работа, посвященная синтезу ПГБ у бактерий рода Bacillus, в которой было показано, что в клетках синтезируется тем больше ПГБ, чем больше соотношение C/N в среде культивирования, а внутриклеточная деградация ПГБ происходит в отсутствие экзогенного источника углерода (Macrae and Wilkinson, 1958). Авторы сделали вывод, что ПГБ является резервным веществом для запасания углерода и энергии, которое задерживает лизис клетки в период голодания. Кроме того, в работе была описана процедура выделения гранул ПГБ щелочным гипохлоритом, благодаря чему стало возможным быстро выделять ПГБ из клеток. Начиная с этого времени, интерес к поли-3-гидроксибутирату резко возрос. В последующие пятнадцать лет интенсивно изучались такие аспекты, как распространенность ПГБ среди микроорганизмов, в частности среди бактерий рода Pseudomonas ( Doudoroff, Stanier, 1959; Delafield et al., 1965), Azotobacter

Stockdale et al., 1968), Hydrogenomonas (Schlegel et al., 1961), Chromatium (Schlegel, 1962), цианобактерий (Jensen, Sicko, 1971), и многих других (в обзоре Dawes, Senior, 1973); физические и химические свойства ПГБ (Lundgren et al., 1965); влияние разных методов экстракции ПГБ на молекулярную массу полимера (Alper, Lundgren, 1963); кристаллическая структура ПГБ (Alper, Lundgren, 1963; Wilkinson, Munro, 1967; Cornibert, Marchessault, 1972); морфология и свойства гранул ПГБ (Merrick, Doudoroff, 1961; Boatman, 1964; Lundgren et al., 1964; Merrick et al., 1965; Griebel et al., 1968); новые методы качественного и количественного определения ПГБ (Norris, Greenstreet, 1958; Williamson, Wilkinson, 1958; Law, Slepecky, 1961); регуляция биосинтеза ПГБ (Slepecky, Law, 1961; Kominek, Halvorson, 1965; Ritchie, Dawes, 1969; Senior, Dawes, 1971; Senior et al., 1972; Dawes, Senior, 1973; Oeding, Schlegel, 1973); энзимология биосинтеза ПГБ (Kominek, Halvorson, 1965; Griebel et al., 1968; Griebel, Merrick, 1971; Ritchie et al., 1971; Dawes, Senior, 1973; Oeding, Schlegel, 1973; Senior, Dawes, 1973); внутриклеточная и внеклеточная деградация ПГБ, энзимология этих процессов (Chowdhury,1963; Merrick, Doudoroff, 1964; Delafield et al., 1965; Gavard et al., 1966; Lusty, Doudoroff, 1966; Merrick, Yu, 1966; Griebel et al., 1968; Griebel, Merrick, 1971; Senior, Dawes, 1973). К концу 60x гг. накопилось достаточное количество исследований, свидетельствующих о том, что синтез этого резервного полимера - широко распространенное явление среди грамотрицательных бактерий. В обзоре, опубликованном в 1973 г. и посвященном роли и регуляции метаболизма резервных полимеров в микроорганизмах, поли-3-гидроксибутират рассматривался в широком аспекте,

1900

Обнаружение суданофильных включений в кпетках прокариот

Изучение функций П(ЗГБ) в клетке Определение свойств гашвного П(ЗГБ) в гранулах Описание других 3-гндроксиалканоатов

Синтез ПГА, содержащих 3-, 4-, н 5- гидроксналканоаты Промышленное производство П(ЗГБ ■ ко ■ ЗГВ) Клонирование генов биосинтеза ПГА

Синтез ПГА рекомбинатнымн бактериями Изучение П(ЗГБ) m vivo методом ЯМР

Продукция ПГА в трансгенных растениях Биосинтез ПГА ш vitro Выявлене путей, связывающих биосинтез ПГА с центральными метаболическими путами

История изучения ПГА в XX столетни как бактериальное резервное вещество, функционально аналогичное крахмалу и гликогену у эукариот (Dawes and Senior, 1973).

Поли-З-гидроксибутират более полувека оставался единственным известным видом бактериальных полигидроксиалканоатов. В дальнейшем было обнаружено, что, кроме бутирата, ряд других гидроксипроизводных кислот (валериановой, гексановой, октановой и др.) могут входить в состав бактериальных ПГА. В начале 70х гг. полиэфир, обнаруженный в активированном иле был проанализирован методом газовой хроматографии. Полиэфир, подобный, но не идентичный ПГБ по своим химическим и физическим свойствам, содержал С4 и Cs-мономеры как основную фракцию и Сб и С7-мономеры как минорные компоненты (Wallen, Rohwedder, 1974). Затем список ПГА, отличных от ПГБ пополнился благодаря открытию поли-3-гидроксиоктановой кислоты, которую синтезирует Pseudomonas oleovorans при росте на октане (De Smet et al., 1983). Полиэфиры, содержащие 3-гидр оксидекановую и 3-гидроксидодекановую кислоты были обнаружены у других псевдомонад (Haywood et al.,1990; Timm and Steinbuchel, 1990). К настоящему времени известно около 100 различных гидроксиалканоатов, входящих в состав биосинтетических ПГА. Был проведен скрининг природных и генетически модифицированных микроорганизмов на наличие и состав ПГА, однако ПГА, включающих в себя мономеры с длиной цепи больше, чем Ci6, не обнаружено (Steinbuchel and Valentin, 1995).

Следующим этапом в изучении бактериальных ПГА было клонирование и описание генов, участвующих в биосинтезе резервных полиэфиров. В конце 80х гг. клонированы гены Ralstonia eutropha (прежнее название - Alcaligenes eutrophus), кодирующие ферменты биосинтеза ПГА, и получены рекомбинантные штаммы Esherichia coli с функционально активным комплексом этих генов (Slater et al., 1988; Schubert et al., 1988; Peoples and Sinskey, 1989). Ключевым в биосинтезе ПГА является фермент, ответственный за реакцию полимеризации и названный ПГА-синтазой. К настоящему времени клонировано около 38 структурных генов ПГА-синтазы из более чем 32 разных видов бактерий. Успешное клонирование генов биосинтеза ПГА сделало возможным создание трансгенных растений, которые рассматриваются как возможные продуценты ПГА в будущем (Poirier et al., 2002; Lossl et al., 2003).

До 70-х гг. интерес к ПГБ в основном определялся его физиологической ролью в микроорганизмах, возможному использованию этого природного полимера для нужд человека уделялось мало внимания, хотя в 60-х гг. появились первые патенты по получению ПГБ путем микробной ферментации (Baptist, 1962а), выделению ПГБ из бактериальной биомассы (Baptist, 1962b) и др. Резкое повышение цен на нефть в середине 70-х гг. послужило импульсом к разработке технологии промышленного производства ПГБ путем микробиологической ферментации. Пионером в этой области была английская компания ICI (Imperial Chemical Industries). В качестве продуцента использовалась водородоокисляющая бактерия Ralstonia eutropha. Компанией ICI были получены патенты на разные способы производства ПГБ (Powell et al., 1980; Hughes, Richardson, 1981; Richardson, 1984), экстракции полимера из бактериальной биомассы (Holmes et al., 1980; Holmes, Jones, 1981; Barcham, Selwood, 1982; Stageman, 1984), изготовление композитов ПГБ с другими полимерами (Holmes et al., 1981), а также на технологию производства бактериальных сополимеров 3-гидроксибутирата и ряда других мономеров, включая 3-гидроксивалерат (Holmes et al., 1982). В настоящее время лидерами в развитии промышленного производства ПГА за рубежом являются компании Monsanto и Metabolix Inc. (Madison, Huisman, 1999).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Николаева, Дария Александровна

107 Выводы

1. Показано, что при росте на разных источниках углерода Azotobacter chroococcum 7В синтезирует полигидроксибутират разной молекулярной массы. Максимальная степень полимеризации полигидроксибутирата отмечена при росте на сахарозе.

2. Показана возможность варьирования степени полимеризации ПГБ путем изменения условий культивирования: рН среды, температуры, уровня аэрации, внесения в среду культивирования дополнительного источника углерода - органических кислот.

3. Впервые разработан способ получения ПГБ заданной молекулярной массы при внесении в среду определенной концентрации дополнительного источника углерода - ацетата натрия. Способ запатентован.

4. Прослежена динамика изменения молекулярной массы ПГБ в процессе роста Azotobacter chroococcum: молекулярная масса ПГБ постепенно увеличиваясь, достигает максимума к 26 ч культивирования (1900 kDa), а к концу ферментации снижается до 1500 kDa.

5. Показано, что ПГБ легко подвергается биодеструкции разными сообществами почвенных микроорганизмов. Активной биодеградации способствуют аэробные условия и дополнительное обеспечение среды нитратами.

6. Впервые выделено и рекомендовано как тест-система для оценки биодеградации ПГА сообщество микроорганизмов, способное разрушать ПГБ в короткие сроки (3-7 дней). Показана зависимость скорости биодеструкции пленок полимера от его исходной молекулярной массы.

7. Показано, что скорость высвобождения модельного лекарственного вещества из полимерной матрицы ПГБ зависит от молекулярной массы полимера: чем меньше молекулярная масса ПГБ, тем выше скорость высвобождения.

8. Получен сополимер полигидроксибутират-со-гидроксивалерат с содержанием гидроксивалерата 17 % и 2,5% при использовании соответственно валериановой и пропионовой кислот в качестве дополнительных источников углерода.

9. Показано, что скорость высвобождения модельного лекарственного вещества зависит от мономерного состава полимерной цепи: скорость высвобождения из полимерной матрицы П(ГБ-ГВ) выше, чем из гомополимера ПГБ и зависит от процентного содержания гидроксивалерата в составе сополимера.

В заключение хочу выразить большую благодарность своему научному руководителю кандидату биологических наук Гарине Александровне Бонарцевой за внимательное руководство на протяжении всего времени выполнения работы.

Выражаю искреннюю благодарность кандидату биологических наук Вере Леонидовне Мышкиной и сотруднику Института микробиологии РАН кандидату биологических наук Марине Владимировне Кевбриной за существенную помощь в экспериментальной работе.

Хочу также поблагодарить заведующего группой биохимии азотфиксации Института биохимии им. А.Н. Баха РАН доктора биологических наук Алексея Федоровича Топунова и всех сотрудников лаборатории за доброжелательное отношение ко мне и моей работе.

Хочу поблагодарить сотрудников Института нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН Виктора Анатольевича Герасина, кандидатов химических наук Александра Васильевича Реброва и Марину Юрьевну Горшкову за помощь в работе.

Также хочу поблагодарить кандидата биологических наук Надежду Эдуардовну Петрову и сотрудника Института нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН Татьяну Константиновну Махину за дружеское участие, помощь и поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Николаева, Дария Александровна, Москва

1. Биосовместимость. Под ред. В.И. Севастьянова// Москва: "Информационный центр ВНИИ геосистем", 1999, 368 с.

2. Волова Т.Г., Беляева О.Г., Плотников В.Ф., Пузырь А.П. Исследование биодеградации микробных полиоксиалканоатов// Докл. АН, 1996, т. 350, с. 707-711.

3. Волова Т.Г., Луковенко С. Г., Васильев А.Д. Получение и исследование физико-химических свойств микробных полиоксиалканоатов// Биотехнология, 1994, № 1, с. 19-22.

4. Кабанов В.А. Практикум по высокомолекулярным соединениям// Москва: Химия, 1985, 224 с.

5. Козловский А.Г., Желифонова В.П., Винокурова Н.Г., Антипова Т.В., Иванушкина Н.Е. Изучение биодеградации полигидроксибутирата микроскопическими грибами//Микробиология, 1999, т.68(3), с. 340-346.

6. Короткова Н. А., Доронина Н. В., Троценко Ю.А. Биосинтез сополимера 3-гидроксибутирата/3-гидроксивалерата Methylobacterium extorquens: метаболизм пропанола, пропионата, пентанола и валерата// Микробиология, 1999, т. 68(3), с. 347-355.

7. Краткий определитель бактерий Берги. Под ред. Дж. Хоулта. 8-е изд./ Москва: Мир, 1980,495 с.

8. Платэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры/ Москва: Химия, 1986, 294 с.

9. Пхакадзе Г.А. Биодеструктивные полимеры/ Киев: Наукова думка, 1990, 143 с.

10. Ю.Рафиков C.P., Будтов В.П., Монаков Ю.Б. Введение в физико-химию растворов полимеров/ Москва: Наука, 1978, 328 с.

11. П.Ребров А.В., Дубинский В.А., Некрасов Ю.П., Бонарцева Г.П., Антипов Е.М., Stamm М.М. Структурные особенности высокоориентированного полигидроксибутирата при его упругой деформации// Высокомол. Соед., сер. А, 2002, т. 44, с. 1-5.

12. Семчиков Ю.Д. Высокомолекулярные соединения/ Москва Н. Новгород: Изд-во НГУ, "Академия", 2003, 368 с.

13. Троценко Ю.А., Белова Л.Л. Организация и регуляция биосинтеза полигидроксибутирата/валерата у бактерий// Микробиология, 2000, т. 69(6), с. 753-763.

14. Abe Н., Doi Y. Structural effects on enzymatic degradability for poly(R )-3-hydroxybutyric acid. and its copolymers: mini-review// Int. J. Biol. Macromol., 1999, v. 25, pp. 185-192.

15. Akhtar S., Pouton C.W., Notarianni L.J. The influence of crystalline morphology and copolymer composition on drug release from solution cast and melt-processed P(HB-HV) copolymer matrices// J. Controlled Release, 1991, v. 17, pp. 225-234.

16. Akhtar S., Pouton C.W., Notarianni L.J. Crystallisation behaviour and drug release from bacterial polyhydroxyalkanoates// Polymer, 1992, v. 33(1), pp. 117-126.

17. Akita S., Einada Y., Miyaki Y., Fugita H. Properties of poly(P-hydroxybutyrate) as a solution// Macromol., 1976, v. 9, pp. 774-780.

18. Alper R., Lundgren D.G. Properties of poly-P -hydroxybutyrate. I. General considerations concerning the naturally occuring polymer// Biopolymers, 1963, v. 1, pp. 545-556.

19. Anderson A. J., Dawes E.A. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates// Microbiol. Rev., 1990, v. 54(4), pp. 450-472.

20. Asrar J., Gruys K.J. Biodegradable Polymer (Biopol®)// In Series of Biopolymers in 10 vol. Ed. A. Steinbuchel. Wiley-VCY Verlag GmbH, 2002, v. 4, pp. 55-86.

21. Atkins T.W., Peacock S.J. In vitro biodegradation of polyhydroxybutyrate-hydroxyvaleate microcapsules exposed to Hank's buffer, newborn calf serum, pancreatin and synthetic gastric juice// J. Microencapsulation, 1997, v. 14, pp. 35-49.

22. Ballard D.G.H., Holmes P.A., and Senior P.J. In: Recent Advances in Mechanistic and Synthetic Aspects of Polymerization, v. 215// Reidel (Kluwer) Publishing, 1987, pp. 293-314.

23. Baptist J.N. Process for preparing poly-P-hydroxybutyric acid. 1962a. US Patent N 3,036,959.

24. Baptist J.N. Process for preparing poly-P-hydroxybutyric acid. 1962b. US Patent N 3,044,942.

25. Barcham P.J., Selwood A. Extraction of poly(beta-hydroxybutyric acid). 1982. European Patent N 58,480.

26. Barnard G.N., Sanders J.K., The poly-P-hydroxybutyrate granule in vivo. A new insight based on NMR spectroscopy of whole cells// J. Biol. Chem., 1989, v. 264(6), pp. 3286-91.

27. Biedermann J., Owen A.J., Schloe K.T, Gassner F., Susmuth R. Interaction between poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate and a denitrifying Pseudomonas strain // Can. J. Microbiol., 1997, v. 43, pp. 561 -569.

28. Boatman E.S. Observation on the fine structure of spheroplasts of Rhodospirillum rubrum// J. Cell Biol., 1964, v. 20, pp. 297-311.

29. Brandle H., Bachofen R., Mayer J., Wintermantel E. Degradation and application of polyhydroxyalkanoates // Can. J. Microbiol. 1995. V. 41 . P. 143-153.

30. Brandl H., Puchner P. Biodegradation of plastic bottles made from "Biopol" in an aquatic ecosystem under in situ conditions// Biodegrasdation, 1992, v. 2, pp. 237-243.

31. Braunegg G., Bogensberger B. Zur Kinetik des Wachstums und der Speicherung von Poly-D(-)-3-hydroxybutersaure bei Alcaligenes latusll Acta Biotechnol., 1985, v. 4, pp. 339-345.

32. Braunegg G., Lefebvre G., Genser K.F. Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and engineering aspects// J. Biotechnol., 1998, v.65, pp. 127-161.

33. Budwill K., Fedorak Ph.M., Page W.J. Anaerobic microbial degradation of poly(3-hydroxyalkanoates) with various terminal electron acceptors// J. Environ. Polym. Degrad., 1996, v. 4, pp. 91-102.

34. Byrom D. Polymer synthesis by microorganisms: technology and economics// Trends Biotechnol., 1987, v. 5, pp. 246-250.

35. Byrom D. Production of poly-p-hydroxybutyrate: poly-P-hydroxyvalerate copolymers// FEMS Microbiol. Rev., 1992, v. 103, pp. 247-250.

36. Cammas S., Bear M.M., Moine L., Escalup R., Ponchel G., Kataoka K., Guerin Ph. Polymers of malic and 3-alkylmalic acid as synthetic PHA in the design of biocompatible hydrolisable devices// Int. J. of Biol. Macromol., 1999, v. 40, pp. 6821-6830.

37. Choi J., Lee S.Y. Process analysis and economic evaluation for Poly(3-hydroxybutyrate) production by fermentation// Bioprocess Engineering, 1997, v. 17, pp. 335-342.

38. Choi M.H., Yoon S.C. Polyester biosynthesis characteristics of Pseudomonas citronellis grown on various carbon sources, including 3-methyl-branched substrates// Appl. Environ. Microbiol., 1994, v. 60, pp. 3245-3254.

39. Cornibert J., Marchessault R.H. Physical properties of poly-P-hydroxybutyrate. IV. Conformational analysis and crystalline structure// J. Mol. Biol., 1972, v. 71, pp. 735-756.

40. Davis J.B. Cellular lipids of a Nocardia grown on propane and n-butane// Appl. Microbiol., 1964, v. 12, pp. 301-304.

41. Dawes E.A., Senior P.J. The role and regulation of energy reserve polymers in microorganisms//Adv. Microb. Physiol., 1973, v. 10, pp. 135-266.

42. Delafield F. P., Doudoroff M., Palleroni N.J., Lusty C.J., Contopoulos R. Decomposition of poly-P-hydroxybutyrate by Pseudomonas// J. Bacteriol., 1965, v. 90, pp. 1455-1466.

43. DeSmet M., Eggink G., Witholt В., Kingma J. Characterization of intracellular inclusions formed by Pseudomonas oleovorans during growth on octane// J. Bacteriol., 1983, v. 154, pp. 870-878.

44. Doi Y., Microbial Polyesters// VCH, New York, 1990, pp. 89-98.

45. Doi Y., Segawa A., Kawaguchi Y., Kunioka M. Cyclic nature of poly(3-hydroxybutyrate) metabolism in Alcaligenes eutrophus // FEMS Microbiol. Lett., 1990a, v. 67, pp. 165-170.

46. Doi Y., Segawa A., Kunioka M. Biosynthesis and characterization of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) in Alcaligenes eutrophusll Int. J. Biol. Macromol., 1990b, V. 12(2), pp. 106-111.

47. Doi Y., Kanesawa Y., Kunioka M. Biodegradation of microbial copolyesters: poly(3 -hy droxybutyrate-co-3 -hydroxyvalerate) and poly(3 -hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)//Macromolecules, 1990c, v. 23, pp. 26-31.

48. Doi Y., Kanesawa Y., Tanahashi N., Kumagai Y. Biodegradation of microbial polyesters in the marine environment// Polym. Degrad. Stab., 1992, v. 36, pp. 173177.

49. Doi Y., Kunioka M., Nakamura Y., Soga K. Biosynthesis of copolyesters in Alcaligenes eutrophus HI 6 from 13C-labeled acetate and propionate// Macromolecules, 1987, v. 20, pp. 2988-2991.

50. Doi Y., Tamaki A., Kunioka M., Soga K. Production of copolyesters of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyvalerate by Alcaligenes eutrophus from butyric and pentanoic acids// Appl. Microbiol. Biotechnol., 1988, v. 28, pp. 330-334.

51. Doudoroff M., Stanier R.Y. Role of poly-p-hy droxybutyriс acid in the assimilation of organic carbon by bacteria//Nature, 1959, v. 183, pp. 1440-1442.

52. Duarte M.G., Brunnel D., Gil M.H., Schacht E. Microcapsules prepared from starch derivatives// J/ Mater. Sci: Mater. In Medicine, 1997, v. 8, pp. 321-323.

53. Findlay R.H., White D.C. Polymeric beta- hydroxyalkanoates from environmental samples and Bacillus megateriumlf Appl. Environ. Microbiol., 1983, v. 45, pp. 7178.

54. Fritzsche K., Lenz R.W., Fuller R.C. Production of unsaturated polyesters by Pseudomonas oleovoranslt Int. J. Biol. Macromol., 1990a, v. 12, pp. 85-91.

55. Fritzsche K., Lenz R.W., Fuller R.C. Bacterial polyesters containing branched poly(p-hydroxyalkanoate) units// Int. J. Biol. Macromol., 1990b, v. 12, pp. 92-101.

56. Galego N., Miguens F.C., Sanchez R. Physical and functional characterization of PHAscl membranes// Polymer, 2002, v. 43, pp. 3109-3114.

57. Gangrade N., Price J.C. Poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) microspheres containing progesterone preparation, morphology and release properties// J. of Microencapsulation, 1991, v. 8, pp. 185-202.

58. Gavard R., Dahinger A., Hauttecoeur В., Reynaud C. Degradation du lipide P-hydroxybutyrique par un extrait enzymatique de Bacillus megaterium I. depolymerase AM C.R. Acad. Sci. Paris, 1966, v. 263, pp. 1273-1275.

59. Genser K.F., Renner G., Schwab H. Molecular cloning, sequencing and expression in Escherichia coli BL21 (DE3) of the poly(3-hydroxyalkanoate)-synthesis genes of Alcaligenes latus DSM 1124// J. Biotechnol., 1998, v. 64, pp. 123-135.

60. Gilkes N.R., Henrissat В., Kilburn D.G., Miller R.C.J., Warren R.A.J. Domains in microbial p-l,4-glycanases: sequence conservation, function and enzyme families// Microbiol. Rev., 1991, v. 55, pp. 303-315.

61. Gordeev S.A., Nekrasov Y.P. Processing and mechanical properties of oriented poly(P-hydroxybutyrate) fibers// J. Mater. Sci. Lett., 1999, v. 18, pp. 1691-1692.

62. Gordeev S.A., Nekrasov Y.P., Shilton .J. Processing of gel-spun poly(P-hydroxybutyrate) fibers// J. Appl. Polym. Sci., 2001, v. 81, pp. 2260-2264.

63. Gross R. A. Bacterial Polyesters: Structural Variability in Microbial Synthesis. In: Biomedical Polymers: Designed-to-Degrade Systems, ed. S. Shalaby// Hanser Publishers, NY, 1994, pp. 173-188.

64. Griebel R., Merrick J.M. Metabolism of poly-P-hydroxybutyrate, effect of mild alkaline extraction on native poly-P-hydroxybutyrate granules// J. Bacteriol., 1971, v. 108, pp. 782-789.

65. Griebel R., Smith Z., Merrick J.M. Metabolism of poly-P-hydroxybutyrate. I. Purification, composition and properties of native poly-P-hydroxybutyrate granules from Bacillus megateriumll Biochemistry, 1968, v. 7, pp. 3676-3681.

66. Gursel I., Hasirci V. Properties and drug release behavior of poly(3-hydroxybutyric acid) and various poly(3-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate) copolymer microcapsules//J. Microencapsulation, 1995, v. 12, pp. 185-193.

67. Harrison S.T., Chase H.A., Amor S.R., Bonthrone K.M., Sanders J.K. Plasticization of poly(hydroxybutyrate) in vivo// Int. J. Biol. Macromol., 1992, v. 14(1), pp. 50-56.

68. Haywood G.W., Anderson A.J., Dawes E.A. The importance of PHB-synthase substrate specificity in PHA synthesis by Alcaligenes eutrophusll FEMS Microbiol. Lett., 1989, v. 57, pp. 1-6.

69. Hocking P.J., Marchessault R.H., Timmins M.R., Lenz R.W., Fuller R.C. Enzymatic degradation of single crystals of bacterial and synthetic poly(P-hydroxybutyrate)// Macromolecules, 1996, v. 29, pp. 2472-2478.

70. Holland S.J., Jolli A.M., Yasin M., Tighe B.J. Polymers for biodegradable medical devices. II. Hydroxybutyrate-hydroxyvalerate copolymers: hydrolytic degradation studies// Biomaterials, 1987, v.8, pp. 289-295.

71. Holmes P.A. Biologically produced ( R)-3- hydroxyalkanoate polymers and copolymers. In: Basset D.C., ed. Developments in crystalline polymers, v.2// London: Elsevier, 1998, pp. 1-65.

72. Holmes P.A., Newton A.B., Willmouth F.M. Polymer blends. 1981. European Patent N 52,460.

73. Holmes P.A., Wright L.F., Collins S.H. Copolyesters and process for their production. 1982. European Patent N 69,497.

74. Holmes P.A., Jones E. Extraction of poly(beta-hydroxybutyric acid). 1981. European Patent N 46,335.

75. Hrabak O. Industrial production of poly-p-hydroxybutyrate// FEMS Microbiol. Rev., 1992, v. 103, pp. 251-256.

76. Hughes L., Richardson K.R. Fermentation process. 1981. European Patent N46,344.

77. Huisman G.W., Wonink E., de Koning G., Preusting H., Witholt B. Synthesis of poly(3-hydroxyalkanoates) by mutant and recombinant Pseudomonas strains// Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, v.38, pp. 1-5.

78. Huang R., Reusch R.N. Poly(3-hydroxybutyrate) is associated with specific proteins in the cytoplasm and membranes of Escherichia colill J. Biol. Chem., 1996, v. 271(36), pp. 196-202.

79. Jackson F.A., Dawes E.A. Regulation of the tricarboxylic acid cycle and poly-(3 -hydroxybutyrate metabolism in Azotobacter beijerinkiill J. Gen. Microbiol., 1976, v. 97, pp. 303-312.

80. Jendrossek D., Handrick R. Microbial degradation of polyhydroxyalkanoates // Annual Review of Microbiology, 2002, v.56, pp. 403-432.

81. Kassab A.C., Xu К., Denkbas E.B., Dou Y., Zhao S., Piskin E. Rifampicin carrying polyhydroxybutyrate microspheres as potential chemoembolization agent// J. Biomater. Sci. Polymer Edn, 1997, v. 8, pp. 947-961.

82. Kawaguchi Y. and Doi Y., Kinetics and mechanism of synthesis and degradation of poly(3-hydroxybutyrate) in Alcaligenes eutrophusll Macromolecules, 1992, v. 25, pp. 2324-2329.

83. Kichise Т., Fukui T.,Yoshida Y., Doi Y. Biosynthesis of polyhydroxyalkanoates (PHA) by recombinant Ralstonia eutropha and effects of PHA synthase activity on in vivo PHA biosynthesis// Int. J. Biol. Macromol., 1999, v.25, pp. 69-77.

84. Kim B.S., Chang H.N. Production of poly(3-hydroxybutyrate) from starch by Azotobacter chroococcumll Biotechnol. Lett., 1998, v. 20(2), pp. 109-112.

85. Kizlo Z., Savenkova L., Gercberga Z., Kalnins M. Polyhydroxybutyrate biosynthesis by Azotobacter chroococcum 23 from renewable unrefined carbon sources// Proc. of the Latvian Academy of sciences, 1999, v. 53, pp. 117-120.

86. Kominek L.A., Halvorson H.O. Metabolism of poly-(5 -hydroxybutyrate and acetoin in Bacillus cereusll J. Bacterid., 1965, v. 90, pp. 1251-1259.

87. Kumagai Y., Kanesawa Y., Doi Y. Enzymatic degradation of microbial poly(3 -hydroxybutyrate) films// Macromol. Chem., 1992, v. 193, pp. 53-57.

88. Kusaka S., Abe H., Lee S.Y., Doi Y. Molecular mass of poly(R)-3-hydroxybutyrate. produced in a recombinant Escherichia colill Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997, v. 47, pp. 140-143.

89. Lauzier C., Revol J.F., Marchessault R.H. Topotactic crystallization of isolated poly(P-hydroxybutyrate) granules from Alcaligenes eutrophall FEMS Microbiol. Rev., 1992, v. 103, pp. 299-310.

90. Law J. H., Slepecky R.A. Assay of poly-P-hydroxybutyric acid// J. Bacterid., 1961, v. 82, pp. 33-36.

91. Lee I.Y., Stegantseva E.M., Savenkova L., Park Y.H. Effects of nitrogen and oxygen supply on production of poly-beta-hydroxybutyrate in Azotobacter chroococcum!I J. Microbiol. Biotechnol., 1995, v. 5(2), pp. 100-104.

92. Lee S.Y., Choi J., Wong H.H. Recent advances in polyhydroxyalkanoate production by bacterial fermentation: mini-review// Int. J. Biol. Macromol., 1999, v. 25(1-3), pp. 31-36.

93. Lemoigne M. Produit de deshydratation et de polymerisation de 1'acide P-oxybutyrique// Bull. Soc. Chim. Biol., 1926, v. 8, pp. 770-82.

94. Liebergesell M., Hustede E., Timm A., Steinbushel A., Fuller R.C., Lenz R.W, Schlegel H.G. Formation of poly(3-hydroxyalkanoates) by phototrophic and chemolithotrophic bacteria // Arch, of Microbiology, 1991, v.155(5), pp. 415-421.

95. Luizier W.D. Materials derived from biomass/biodegradable materials// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, v. 89, pp. 839-842.

96. Lundgren D.G., Alper R., Schnaitman C., Marchessault R. M. Characterization of poly-P -hydroxybutyrate extracted from different bacteria// J. Bacteriol., 1965, v. 89, pp. 245-251.

97. Lundgren D.G., Pfister R.M., Merrick J.M. Structure of poly-P -hydroxybutyric acid granules// J. Gen. Microbiol., 1964, v. 34, pp. 441-446.

98. Luo S., Netravali A.N. Characterization of henequen fibers and the henequen fiber/ poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) interface// J. Adhesion Sci. Technol., 2001, v. 15, pp. 423-437.

99. Lusty C.J., Doudoroff M. Poly-P -hydroxybutyrate depolymerase of Pseudomonas lemoigneill Biochemistry, 1966, v. 56, pp. 960-965.

100. Madison L.L., Huisman G.W. Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates): From DNA to plastic// Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1999, v.63, pp. 21-31.

101. Macrae R.M., Wilkinson J.R. Poly-P-hydroxybutyrate metabolism in washed suspensions of Bacillus cereus and Bacillus megateriumll J. Gen. Microbiol., 1958, v. 19, pp. 210-222.

102. Manchak J., Page W.J. Control of polyhydroxyalkanoate synthesis in Azotobacter vinelandii strain UWD// Microbiology, 1994, v. 140, pp. 953-963.

103. Matavulj M., Molitoris H.P. Fungal degradation of polyhydroxyalkanoates and a semiquantitative assay for screening their degradation by terrestrial fungi // FEMS Microbiol. Rev., 1992, v. 103, pp. 323-332.

104. Maulding H. V. Prolonged delivery of peptides by microcapsules// J. Controlled Release, 1987, v. 6, pp. 167-176.

105. Mergaert J., Anderson C., Wouters A., Swing J. Microbial degradation of poly(3-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co- hydroxyvalerate) in compost// J. Environ. Polym. Degrad., 1994, v. 1, pp. 177-183.

106. Mergaert J., Wouters A.,Anderson C., Swing J. In situ biodegradation of poly(3-hydroxybutyrate) and poly(3 -hydroxybutyrate-co- hydroxyvalerate) in natural waters// Can. J. Microbiol., 1995, v. 41, pp. 154-159.

107. Merrick J.M., Doudoroff M. Enzymatic synthesis of poly-P-hydroxybutyric acid in bacteria//Nature, 1961, v. 189, pp. 890-892.

108. Merrick J.M., Doudoroff M. Depolymerization of poly-p-hydroxybutyrate by an intracellular enzyme system// J. Bacteriol., 1964, v. 88, pp. 60-71.

109. Merrick J.M., Lundgren D.G., Pfister R.M. Morphological changes in poly-P-hydroxybutyrate granules associated with decreased susceptibility to enzymatic hydrolysis// J. Bacteriol., 1965, v. 89, pp. 234-239.

110. Merrick J.M., Yu C.J. Purification and properties of a D(-)-P-hydroxybutyric acid dimer hydrolase from Rhodospirillum rubrumll Biochemistry, 1966, v. 5, pp. 35633568.

111. Meyer A. Praktikum der botanischen bakterienkunde// Jena, 1903.

112. More G.S., Sauders S.M. Advances in biodegradable polymer// UK, Kapra. Shropshire, 1998, 1000 p.

113. Muller В., Jendrossek D. Purification and properties of poly(3-hydroxyvaleric acid) depolymerase from Pseudomonas lemoigneill Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993, v. 38, pp. 487-492.

114. Muller H.M., Seebach D. Polyhydroxyalkanoates: a fifth class of physiologically important organic biopolymers?// Angew Chem., 1993, v.32, pp. 477-502.

115. Nojiri M., Saito T. Structure and function of poly(3-hydroxybutyrate) depolymerase from Alcaligenes faecalis T1 // J. Bacteriol., 1997, v. 179, pp. 69656970.

116. Page W.J. Suitability of commercial beet molasses fractions as substrates for polyhydroxyalkanoate production by Azotobacter vinelandii UWD// Biotechnol. Lett., 1992, v. 14(5), pp. 385-390.

117. Page W.J., Bhanthumnavin N., Manchak J., Ruman M. Production of poly(p-hydroxybutyrate-P-hydroxyvalerate) copolymer from sugars by Azotobacter salinestris/f Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997, v. 48, pp. 88-93.

118. Page W.J., Cornish A. Growth of Azotobacter vinelandii UWD in fish peptone medium and simplified extraction of poly-P-hydroxybutyrate// Appl. Environ. Microbiol., 1993, v. 59(12), pp. 4236-4244.

119. Page W.J., Manchak J., Rudy B. Formation of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) by Azotobacter vinelandii strain UWD// Appl. Environ. Microbiol., 1992, v.58, pp. 2866-2973.

120. Page W.J., Manchak J. The role of P-oxidation of short-chain alkanoates in polyhydroxyalkanoate copolymer synthesis in Azotobacter vinelandii UWD// Can. J. Microbiol., 1995, v.41(Suppl. 1), pp. 106-114.

121. Page W.J., Knosp O. Hyperproduction of poly-P -hydroxybutyrate during exponential growth of Azotobacter vinelandii UWD// Appl. Environ. Microbiol., 1989, v. 55, pp. 1334-1339.

122. Poirier Y., Erard N., Petetot J.M.C. Synthesis of polyhydroxyalkanoate in the peroxisome of Pichia pastoris// FEMS Microbiology Letters, 2002, v.207(l), pp. 97102.

123. Pouton C.W., Akhtar S. Biosynthetic polyhydroxyalkanoates and their potential drug delivery//Adv. Drug Deliv. Rev., 1996, v. 18, pp. 133-162.

124. Powell K.A., Collinson B.A, Richardson R. Microbiological process for the production of poly(beta-hydroxybutyric acid) and micriorganisms for use therein. 1980. European Patent N 15,669.

125. Quagliano J. C., Miyazaki S.S. Effect of aeration and carbon/nitrogen ratio on the molecular mass of the biodegradable polymer poly-a-hydroxybutyrate obtained from Azotobacter chroococcum 6B// Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997, v. 48, pp. 662664.

126. Ramsay B.A., Lomaliza K., Chavarie C., Dube В., Bataille P., Ramsay J.A. Production of poly(p-hydroxybutyric-co-p-hydroxyvaleric) acids// Appl. Environ. Microbiol., 1990, v. 56, pp. 2093-2098.

127. Repaske R., Repaske A.C. Quantitative requirements for exponentional growth of Alcaligenes eutrophusll Appl. Environ. Microbiol., 1976, v. 32, pp. 585-591.

128. Reusch R.N. Low molecular weight complexed poly(3-hydroxybutyrate): a dynamic and versatile molecule in vivo// Can. J. Microbiol. (Suppl), 1995, v. 41(1), pp. 50-54.

129. Reusch R.N., Sadoff H.L. Putative structure and functions of a poly-P-hydroxybutyrate/ calcium polyphosphate channel in bacterial plasma membranes// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v. 85, pp. 4176-80.

130. Richardson K.R. Production of beta-hydroxybutyrate polymers. 1984. European Patent N 114,086.

131. Salman M.A., Sahin A., Onur M.A., Oge K., Kassab A., Aypar U. Tramadol encapsulated into polyhydroxybutyrate microspheres: in vitro release and epidural analgesic effect in rats// Acta Anaesthesiol. Scand., 2003, v.47, pp. 1006-1012.

132. Savenkova L., Gercberga Z., Kizhlo E., Stegantseva E. Effect of phosphate supply and aeration on poly-P-hydroxybutyrate production in Azotobacter chroococcum// Process Biochemistry, 1999, v. 34, pp. 109-114.

133. Savenkova L., Gercberga Z., Nikolaeva V., Dzene A., Bibers I., Kalnin M. Mechanical properties and biodegradation characteristics of PHB-based films// Process Biochemistry, 2000, v. 35, pp. 573-579.

134. Schirmer A., Jendrossek D., Schlegel H.G. Degradation of poly(3-hydroxyoctanoic acid) P(3HO). by bacteria: purification and properties of a P(3HO) depolymerase from Pseudomonas fluorescens GK13// Appl. Environ. Microbiol., 1993, v. 59, pp. 1220-1227.

135. Schneider F., Steinmuller H. Raw material. Strategies Economical Problems// In: Biotechnology, v. 6, 2-nd edn., VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, pp. 47-56.

136. Sendil D., Gursel I., Wise D.L., Hasirci V. Antibiotic release from biodegradable PHBV microparticles// J. Controlled Release, 1999, v. 59, pp. 207-217.

137. Senior P.J., Beech G.A., Ritchie G.A.F., Dawes E.A. The role of oxygen limitation in the formation of poly-P-hydroxybutyrate during batch and continuous culture of Azotobacter beijerinkiill Biochem. J., 1972, v. 128, pp. 1193-1201.

138. Senior P.J., Dawes E.A. Poly-P-hydroxybutyrate biosynthesis and the regulation of glucose metabolism in Azotobacter beijerinkiill Biochem. J., 1971, v. 125, pp. 5566.

139. Senior P.J., Dawes E.A. The regulation of poly-P-hydroxybutyrate metabolism in Azotobacter beijerinkiill Biochem. J., 1973, v. 134, pp. 225-238.

140. Sim S.J., Snell K.D., Hogan S.A., Stubbe J., Rha C., Sinskey A.J. PHA synthase activity controls the molecular weight and polydispersity of polyhydroxybutyrate in vivo//Nat. Biotechnol., 1997, v.15, pp.63-67.

141. Siegel R.A., Kost J., Langer R. //J. Controlled Release, 1989, v. 8, pp. 223-229.

142. Schlegel H.G. Die Speicherstoffe von Chromatium okeniill Arch. Mikrobiol., 1962, v. 42, pp. 110-116.

143. Schlegel H.G., Gottschalk G., Bartha R. Formation and utilization of poly-P-hydroxybutyric acid by knallgas bacteria (Hydrogenomonas)// Nature, 1961, v. 191, pp. 463-465.

144. Stockdale H., Ribbons D.W., Dawes E.A. Occurence of poly-p-hydroxybutyrate in the Azotobacteriaceae//J. Bacteriol., 1968, v. 95, pp. 1798-1803.

145. Sudesh K., Abe H., Doi Y. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters// Prog. Polym. Sci., 2000, v. 25, pp.1503-1555.

146. Sudesh K., Fukui Т., Taguchi K., Iwata Т., Doi Y. Improved production of poly(4-hydroxyalkanoates) by Comamonas acidovorans and its freeze-fracture morphology// Int. J. Biol. Macromol., 1999, v.25, pp.79-85.

147. Suzuki Т., Deguchi H., Yamane Т., Shimizu S., Gekko K. Control of molecular weight of poly-P-hydroxybutyric acid produced in fet-batch culture of Protomonas extorquensll Appl. Microbiol. Biotechnol., 1988, v. 27, pp. 487-491.

148. Swift G. Biodegradability of polymers in the environment: complexities and significance of definitions and measurements // FEMS Microbiol. Reviews, 1992, v. 103, pp. 339 -346.

149. Taidi В., Mansfield D.A., Anderson A J. Turnover of poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) and its influence on the molecular mass of the polymer accumulated by Alcaligenes eutrophus during bath culture// FEMS Microbiol. Lett., 1995, v. 129, pp.201-206.

150. Tiedje J.M. Ecology of denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium// In: Biology of anaerobic microorganisms. Ed. Zehnder A.J.B., J. Willy&sons Inc., New York, 1988, pp. 179 244.

151. Timm A., Steinbuchel A. Formation of polyesters consisting of medium-chain-length 3-hydroxyalkanoic acids from gluconate by Pseudomonas aeruginosa andother fluorescent pseudomonads// Appl. Environ. Microbiol., 1990, v. 56, pp. 33603367.

152. Unverdorben M., Spielberger A., Schywasky M., Labahn D. et al. A polyhydroxybutyrate biodegradable stent: Preliminary experience in the rabbit// Cardiovasc. Intervent. Radio., 2002, v. 25, pp. 127-132.

153. Wallen L.L., Rohwedder W.K. Poly-P-hydroxyalkanoate from activated sludge// Environ. Sci. Technol., 1974, v. 8, pp. 576-579.

154. Wang M., Chen L.J., Weng J., Yue C.Y. Manufacture and evaluation of bioactive and biodegradable materials and scaffolds for tissue engineering// J. Mater. Science: Materials in medecine, 2002, v. 12, pp. 856-860.

155. Ward A.C., Rowley B.I., Dawes E.A. Effect of nitrogen and oxygen limitation on poly-P-hydroxybutyrate biosynthesis in ammonium-grown Azotobacter beijerinkiill J. Gen. Microbiol., 1977, v. 102, pp. 61-68.

156. Wilkinson J.F., Munro A.L.S. The influence of growth limiting conditions on the synthesis of carbon and energy storage polymers in Bacillus megateriumll In:

157. Microbial physiology and continuous culture (Eds. Powell E.O., Evans C.G.T., Strange R.E., Tempest D.W.) H.M.S.O., London, 1967, pp. 173-185.

158. Williams S.F., Martin D.P., Horowitz D.M., Peoples O.P. PHA application: addressing the price performance issue. I. Tissue engineering// Int. J. of Biol. Macromol., 1999, v. 25, pp. 11-121.

159. Williams S.F., Martin D.P. Applications of PHAs in medicine and farmacy// in Series of Biopolymers in 10 vol. Ed. A. Steinbuchel, Wiley-VCY Verlag GmbH, 2002, v. 4, pp. 91-121.

160. Williamson D.H., Wilkinson J.F. The isolation and estimation of poly-P-hydroxybutyrate inclusions of Bacillus species// J. Gen. Microbiol., 1958, v. 19, pp. 198-209.

161. Yamane H., Terao K., Hiki S., Kawahara Y., Kimura Y., Saito T. Processing melt spun polyhydroxybutyrate fibers// Polymer, 2001, v. 42, pp. 3241-3249.

162. Yang X., Zhao K., Chen G.Q. Effect of surface treatment on the biocompatibility of microbial polyhydroxyalkanoates//Biomaterials, 2002, v. 23, pp. 1391-1397.

163. Yeom S.H., Yoo Y.J. Effect of pH on the molecular weight of poly-3-hydroxybutyric acid produced by Alcaligenes sp.// Biotechnol. Lett., 1995, v. 17(4), pp. 389-394.

164. Zevenhuisen L.P. Cellular glycogen, P-l,2-glucan, poly-P-hydroxybutyric acid and extracellular polysaccharides in fast-growing species of Rhisobium// Antonie van Leeuwenhoek, J. Microbiol, and Serol., 1981, v. 47, pp. 481-497.