Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологически активные микро- и наночастицы из поли(3-оксибутирата), его сополимеров и композитов

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биологически активные микро- и наночастицы из поли(3-оксибутирата), его сополимеров и композитов"

005533644

е-

на правах рукописи

Яковлев Сергей Георгиевич

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ МИКРО - И ИАНОЧАСТИЦЫ ИЗ ПОЛИ(3-ОКСИБУТИРАТА), ЕГО СОПОЛИМЕРОВ И КОМПОЗИТОВ

03.01.06 - биотехнология (в т.ч. бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 СЕН 2013

Москва 2013

005533644

Работа выполнена в лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н.Баха РАН и на кафедре биоинженерии биологического факультета МГУ им М.В.Ломоносова

Научные руководители: Бонарцева Гарина Александровна

кандидат биологических наук, ИНБИ им. Баха РАН Бонарцев Антон Павлович

кандидат биологических наук, Биологический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова

Официальные оппоненты: Феофилова Елена Петровна

доктор биологических наук, профессор, засл. деятель науки РФ, Институт микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН, лаб. экспериментальной микологии, зав. лабораторией. Сербии Александр Владимирович доктор химических наук, Институт нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева РАН, лаб. химии полиэлектролитов и медико-биологических полимеров, вед. науч. сотр.

Ведущая организация: НИИ биомеднцинской химии им. В.Н.Ореховича

РАМН

Защита диссертации состоится 8 октября 2013 г в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1. Тел. 8(495)939-54-83, эл. почта: npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 7» сентября 2013 года

Ученый секретарь -

диссертационного совета к.б.н. Пнскуикова Нина Федоровна

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Злокачественные новообразования занимают третье место в списке причин смертности от болезней в развитых странах. На сегодняшний день лекарственные препараты в традиционных лекарственных формах для лечения онкологических заболеваний с одной стороны не полностью проявляют терапевтический потенциал заключенных в них биологически активных лекарственных веществ (J1B), а с другой стороны не устраняют их побочного отрицательного действия. Большинство химиопрепаратов, применяющихся в онкологии, обладают высокой токсичностью, что вызывает тяжелые осложнения и снижает качество жизни пациента. Более того, токсичностью нередко обладает сама лекарственная форма, в которую заключено действующее JIB. Например, в широко используемых в клинике традиционных противоопухолевых препаратах Паклитаксела действующее ЛВ, обладающее высокой токсичностью и рядом побочных эффектов, заключено в лекарственную форму на основе полиоксиэтилированного касторового масла, кремафора, который обладает собственной токсичностью: аллергогенностью, нефротоксичностью, кардиотоксичностью, нейротоксичностью. Кроме того, при лечении таких хронических заболеваний, как опухолевые, и при использовании токсичных противоопухолевых препаратов возникает необходимость длительного поддержания определенной системной или локальной концентрации JIB, не превышающей токсический уровень.

Одним из подходов к решению данной проблемы является применение систем пролонгированного высвобождения JIB из полимерных микро- и наночастиц. Связывание JIB с полимерными микро- и наночастицами и пролонгированное высвобождение из них с постоянной скоростью JIB обеспечивает длительное поддержание необходимой концентрации (без превышения токсического уровня) действующего JIB системно или локально в опухоли в течение всего заданного периода терапии заболевания. Тем самым, устраняется необходимость дополнительного многократного введения лекарства, упрощается применение препарата, снижается токсичность и побочные эффекты препарата, улучшается его фармакокинетика, улучшается биодоступность JIB, появляются возможности локализованного направленного лекарственного действия, повышается эффективность препарата, снижается стоимость и длительность лечения. Однако, разрабатываемые и исследуемые в настоящее время лекарственные формы на основе полимерных микро- и наночастиц также нередко обладают существенными недостатками, прежде всего: токсичностью из-за низкой биосовместимости используемых полимеров и неудовлетворительной кинетикой высвобождения JIB и биодеградации микрочастиц, не поддающихся регуляции.

Поэтому в последнее время такие биополимеры микробиологического происхождения, как поли(З-оксибутират) (ПОБ) и его сополимеры привлекают все большее внимание благодаря их способности к биоразложению и высокой биосовместимости, что делает их пригодными для создания новых лекарственных форм. Ранее было показано, что ПОБ обладает высокой биосовместимостью и способностью как к гидролитической и ферментативной деградации in vitro, так и биоразложению в тканях

млекопитающих in vivo. Более того, способность ПОБ к образованию сополимеров и композитов с другими полимерами позволяет варьировать свойства полимерной основы, тем самым, влияя на характер ей взаимодействия с JIB. Это в свою очередь позволяет регулировать кинетику высвобождения JIB из полимерных микро- и наночастиц, изменяя тем самым и их фармакокинетические характеристики. Такой подход позволит создавать препараты на основе полимерных микро- и наночастиц с широким спектром фармакокинетических характеристик, которые важно учитывать при выборе терапии того или иного заболевания. Следует отметить также, что в настоящее время лекарственные препараты пролонгированного действия отечественного производства на основе биоразлагаемых полимеров отсутствуют.

Таким образом, целью данной работы являлось создание и исследование лекарственных систем пролонгированного действия для оптимизации их свойств за счет использования нового сополимера ПОБ, а также композитных добавок к ПОБ в полимерной основе микро- и наночастиц.

В соответствии с целью исследования были сформулированы следующие задачи:

1. Синтез нового сополимера полиоксибутират-ПЭГ и исследование физико-химических свойств и биосовместимости.

2. Изучение влияния различных композитных добавок в полимерной основе на физико-химические и фармакокинетические свойства микрочастиц (на примере частиц с модельным веществом).

3. Разработка эффективного метода получения наночастиц.

4. Получение и изучение физико-химических свойств микро- и наночастиц с противоопухолевыми препаратами с различным составом полимерной матрицы (гомополимер, сополимер и композитные добавки).

5. Исследование биологической активности полученных микро- и наночастиц с противоопухолевыми препаратами in vitro и in vivo.

Научная новизна. В ходе данной работы впервые был разработан метод биосинтеза нового биосовместимого и биоразлагаемого сополимера ПОБ-ПЭГ культурой Azotobacter chroococcum 7Б. Подобраны оптимальные условия для накопления его клетками культуры, изучены его физико-химические свойства. Процесс биосинтеза позволяет регулировать молекулярную массу синтезируемого ПОБ.

Впервые исследовано влияние различных композитных добавок на кинетику высвобождения JIB; определены компоненты, меняющие характер кинетики выхода JIB, что позволяет создавать полимерные лекарственные системы с заданными свойствами.

Впервые разработан эффективный метод получения наночастиц из ПОБ и его сополимеров.

Изучена биологическая активность микро- и наночастиц из ПОБ, содержащих противоопухолевые препараты (паклитаксел и этопозид) на различных культурах клеток (клетки рака груди человека линии MCF-7 и клетки гепатомы мыши линии МН-22а). Показана их бблыпая эффективность по сравнению с традиционными

противоопухолевыми препаратами. Показан эндоцитоз полимерных наночастиц опухолевыми клетками, повышающий их цитостатическую активность.

Показано снижение острой токсичности паклитаксела в полимерных частицах in vivo в сравнении с традиционной лекарственной формой. Впервые показано повышение противоопухолевой эффективности полимерных форм по критерию локального торможения роста опухоли.

Практическая значимость работы. Получен новый биосовместимый и биоразлагаемый сополимер биоматериал - сополимер ПОБ-ПЭГ, пригодный для медицинского применения. Полученные в настоящей работе системы биополимерных частиц из бактериального ПОБ и нового сополимера ПОБ-ПЭГ позволят избежать осложнений, связанных с воспалительной тканевой реакцией при применении полимеров, полученных химическим путем (полилактидов и полигликолидов, традиционно применяемых в медицинской практике). Разработанные биополимерные системы микро- и наночастиц с включением противоопухолевых препаратов обладают пониженной острой токсичностью и ббльшей эффективностью по сравнению с традиционными лекарственными формами . Полученные результаты могут быть использованы для создания новых отечественных лекарственных форм химиотерапевтических препаратов пролонгированного действия.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на Седьмой Международной встрече по фармацевтике, биофармацевтике и фармацевтическим технологиям (Мальта, Валетга, март 2010), на Двадцать шестой ежегодной научной встрече Американского сообщества гипертензии (США, Нью-Йорк, май 2010), на Первой научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, ноябрь 2010), на Международной конференции MipTec (Швейцария, Базель, сентябрь 2010) Четвертой Всероссийской конференции по наноматериалам «НАНО-2011» (Москва, март 2011), на Двадцать седьмой ежегодной научной встрече Американского сообщества гипертензии (США, Нью-Йорк, май 2011), на Второй научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, ноябрь 2011), на Восьмой Международной встрече по фармацевтике, биофармацевтике и фармацевтическим технологиям (Турция, Стамбул, март 2012), на Международной конференции TechConnect World (США, Санта-Клара, июнь 2012), на Международной конференции EuroNanoForum 2013 (Ирландия, Дублин, июнь 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи в журналах из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, 4 статьи в зарубежных рецензируемых журналах, 4 статьи в сборниках статей по материалам конференций (2 отечественные и 2 зарубежные), отражающие основной объем диссертационной работы. Результаты работы также были представлены на 14 международных и всероссийских конференциях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 182 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы, содержащий ссылки на 350 источников. Диссертация иллюстрирована 53 рисунками, содержит 20 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Биосинтез сополимера ПОБ-ПЭГ.

1.1 Условия биосинтеза. В работе использовали штамм-продуцент ПОБ Azotobacter chroococcum 7Б, способный синтезировать до 80 % ПОБ от сухого веса клеток. Штамм выделен из ризосферы пшеницы (дерново-подзолистая почва). Коллекционный штамм Azotobacter поддерживали на среде Эшби. Дня достижения максимального синтеза поли-3-гидроксибутирата, культуру клеток выращивали на среде Берка, содержащей 20 г/л сахарозы, как первичный источник углерода. Для синтеза сополимеров ПОБ в культуральную среду добавляли дополнительный источник углерода. В качестве предшественника оксивалерата в цепи полиоксибутират-оксивалерата (ПОБВ) после 12 часов культивации в среду добавляли 5мМ валериановую кислоту (в виде соли Na). Для регулирования молекулярной массы синтезируемых ПОБ и ПОБВ добавляли ацетат натрия в концентрациях 6,2 г/л (75мМ) и 4.1 г/л (50мМ) соответственно. Такие концентрации были определены, как оптимальные исходя из ранее полученных данных [Мышкина, 2010; Мышкина, 2008]. Для синтеза сополимера ПОБ-ПЭГ аналогично использовали ПЭГ как дополнительный источник углерода. Первоначально к среде был добавлен ПЭГ 300 в концентрации 150 мМ. Было показано, что дальнейшее увеличение концентрации ПЭГ ингибирует рост, снижает синтез ПОА и его молекулярную массу. Таким образом, была использована оптимальная концентрация ПЭГ [Saha, 2006]. Оптическую плотность контролировали нефелометрически. Культивирование проводили в качалочных колбах на 200мл на качалке (180 об/мин) при 37°С в течение 72 часов.

1.2 Выделение поли-3-гидроксибутирата и его сополимеров из бактериальной биомассы. Процесс выделения и очистки полимеров из биомассы A. chroococcum включал следующие стадии: 1) растворение ПОБ в хлороформе на качалке в течение 12 часов при 37°С; 2) отделение раствора полимера от клеточных остатков фильтрованием; 3) выделение ПОБ из раствора хлороформа осаждением изопропанолом; 4) последующее многократное растворение ПОБ в хлороформе и осаждение изопропанолом; 5) высушивание при 60° С.

1.3 Определение молекулярной массы полимера. Молекулярную массу ПОБ, ПОБВ и ПОБ-ПЭГ определяли методом вискозиметрии: вязкость раствора ПОБ в хлороформе измеряли при 30°С на вискозиметре RT RheoTec (Германия); молекулярная масса была рассчитана с использованием уравнения Марка-Куна-Хаувинка [Мышкина, 2008].

1.4 Изготовление полимерных пленок. Пленки из ПОБ, ПОБВ и ПОБ-ПЭГ были получены методом литья 3% раствора полимеров в хлороформе на стеклянную чашку Петри. После медленного испарения хлороформа, оставшийся в пленках растворитель

удаляли путем сушки в вакууме при 50°С в течение двух дней. Толщина полимерных пленок составляла 50 ± 5 мкм.

1.5 Ядерно-магнитный резонанс. Спектры 'Н-ЯМР 1-2% растворов ПОБ и его сополимеров в дейтерированном хлороформе сняты на спектрометре MSL-300 (Bruker, Германия). Рабочая частота - 400 МГц. Химические сдвиги отсчитывали от сигнала остаточных протонов CDCb - 7,20 ррт. Параметры: 1% (вес/объем) раствор полимера в хлороформе-D, 313 К, время 2,5с, ширина спектра4000 Гц. Процентное содержание элементарных звеньев гидроксивалерата в сополимере ПОБВ рассчитывали по соотношению интегральной интенсивности сигнала метальной группы гидроксивалерата (0,89 ррт) к сумме интегральных интенсивностей сигналов метальных групп гидроксивалерата (0,89 ррт) и гидроксибутирата (1,27 ppm) (Bloembergen et al., 1986). Процентное содержание элементарных звеньев ЭГ в сополимере ПОБ-ПЭГ рассчитывали по соотношению суммы интегральных интенсивностей сигнала группы EG-CH2- (3,61; 3,70; 3,66; 3,73; 4,24 ррт) к сумме интегральных интенсивностей сигналов метальной группы гидроксибутирата (1,27 ррт).

1.6 Измерение степени кристалличности биополимеров дифференциальной сканирующей калориметрией (ДСК). Тепловые свойства ПОБ, ПОБВ и ПОБ-ПЭГ были измерены с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии при помощи DSC 204 Fl Phoenix (Netzsch, Германия). Около 1-4 мг полимерной пленки помещали в 25мкл алюминиего тигеля. Образцы нагревали от 25 до 200°С при скорости нагрева 10°С/мин в атмосфере азота. Для точной калибровки температуры и энтальпии в диапазоне температур от -100°С - 600°С в соответствии с инструкциями производителя был использован калибровочный набор Netzsch (образцы высокой чистоты KNO3, In, Bi, Sn, Zn, CsCl, Hg, СбНп). Температура начала и пика изменения теплоемкости были

нач пик

обозначены как точки плавления Тп и Тп . Кристалличность структуры ПОБ (Хс) рассчитана следующим образом [Zheng, 2005]: Хс = (ДНга + ДНГ) / ДНот(ПОБ) * 100%, где ДНГ и ДНт - изменения энтальпии, вызванные рекристаллизацией и плавлением исследуемого образца, соответственно, ДНот(ПОБ) - теоретическое значение для термодинамической энтальпии плавления, которое было получено для 100%-кристаллических образцов ПОБ (146,6 Дж/г) [Barham, 1984]. Все расчеты проводились для первого цикла нагрева [Asrar, 2002; Zheng, 2005].

1.7 Измерение контактных углов. Гидрофильность поверхности полимера оценивали путем измерения контактного угла с водой, образуемого между каплями воды и "гладкой" поверхностью образцов, с помощью измерителя Contact Angle Meter 110 VAC (Cole-Parmer, США). Объем капель 10 мкл. Среднее значение контактного угла было посчитано из 8 измерений на обеих сторонах полимерной пленки при температуре 25°С. Видимый контактный угол также может быть измерен (точность метода составляет 0,1%), но в результате шероховатости образца стандартная статистическая погрешность находится в пределах 1-2% [Zheng, 2005].

1.8 Водопоглощение. Части полимерных пленок площадью 10x10 мм были погружены в деионизированную воду при 37 °С. В заданные интервалы времени гидратированные

образцы были извлечены и взвешены после удаления капель воды с поверхности образцов. Содержание воды затем рассчитывали на основе разницы в весе пленки до и после гидратации. Процент поглощения воды рассчитывается по следующей формуле: водопоглощение (%) = 100 х (Ww - Wd)AV<i,

где Wd и Ww - веса образца пленки до и после погружения в воду, соответственно.

2. Системы пролонгированного высвобождения на основе ПОБ и его сополимеров.

2.1 Материалы. Для получения биополимерных микро- и наночастиц в работе использовали поли-3-оксибутират и его сополимер поли-З-оксибутират-ПЭГ полученные нами микробиологическим путем (способ описан выше). В работе были использованы: ивермектин, дипиридомол (MP Biomedicals, США), паклитаксел (ПТК), этопозид (Biomol, США), хлороформ (Экос-1, Россия), поливиниловый спирт (ПВС) (MP Biomedicals, США). Деионизированная вода была подготовлена системой очистки Milli-Q Millipore (Molsheim, Франция). При получении композитных микрочастиц были использованы следующие вещества (Sigma-Aldrich, Германия): ПЭГ, поливинилпириллидон, ПЭГ-токоферол, ПЭГ-монолауриат; лецитин, дипальматоилфосфотидилхолин, дистеариилфосфотидилхолин, лауриновая кислота.

2.2 Получение микрочастиц из ПОБ. Микрочастицы были получены при помощи метода одноэтапного эмульгирования с последующим выпариванием растворителя [Лившиц, 2009]. Метод был адаптирован для инкапсулирования различных лекарственных веществ (JIB). Раствор ЛВ и ПОБ, молекулярная масса которого варьировалась от 6 до 260 кДа (в различных экспериментах), в соотношении 1:9 в 4 мл хлороформа (оптимальная концентрация полимерной фазы в хлороформе 45-50 мг/мл) постепенно добавляли к 80 мл раствора поливинилового спирта (ПВС) в дистиллированной воде (1,5 % масс./об.) при перемешивании. Перемешивание проводили в течение 2ч при помощи механической верхнеприводной мешалки RZR 2021 (Heidolph, Германия) при 1000 об/мин. После полного испарения органического растворителя микрочастицы отделяли центрифугированием (10 мин при 4400 об/мин) при помощи центрифуги 5702 R (Eppendorf, Германия), а затем 3 раза промывали дистиллированной водой для полного удаления эмульгатора и ПТК с поверхности частиц. Затем микрочастицы высушивали в термостате при 37°С.

Композитные микрочастицы получали по той же методике, добавляя вспомогательный полимерный компонент в раствор ПОБ и ЛВ в хлороформе.

2.3 Получение наночастиц из ПОБ. Полимерные наночасгицы с включением ЛВ были получены методом прямого мембранного эмульгирования. Смесь ЛВ и ПОБ в хлороформе (п. 2.2) пропускали с помощью экструдера Mini-Extruder Avanti (Polar Lipids Inc.) через мембранные фильтры Omnipore (Millipore, Ireland) с диаметром пор 100 нм в водную среду (1,5% р-р ПВС). Полученную эмульсию добавляли по каплям к 40 мл 1,5% р-ра ПВС при перемешивании со скоростью 26000 об/мин. Полученную смесь центрифугировали (15 мин, 14000 об/мин, MiniSpin Eppendorf, Германия) и отмывали

дистилированной водой от остатков ПВС. Очищенный раствор наночастиц лиофилизировали.

2.4 Изучение размера микро- и наночастиц из ПОБ и содержания в них ЛВ. Средний диаметр и стандартное отклонение полученных партий микрочастиц определяли по микрофотографиям, полученных с помощью светового микроскопа Биомед 1 Вар.2 (Биомед, Россия) с цифровым окуляром MYscope ЗООМ (Webbers, Тайвань) с использованием программы ImageJ 1.46. Средние значения и отклонение диаметра микрочастиц каждой партии рассчитаны при измерении более 100 частиц. Диаметр наночастиц и их морфологию определяли по снимкам атомно-силовой микроскопии (см. п.2.5). Распределение размеров наночастиц и их Z-потенциал определяли с помощью Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK).

Содержание JIB в микрочастицах определяли спектрофотометрически после их растворения в хлороформе путем измерения светопоглощения на спектрофотометре DU-650 (Beckman Coulter, США) (максимумы поглощения при 242 и 278 нм для паклитаксела, 245 и 254нм - для ивермектина) при сравнении с контрольным раствором ПОБ в хлороформе и с помощью построения калибровочной кривой с использованием растворов ПОБ и соответствующего ЛВ в хлороформе в различных концентрациях.

2.5 Микроскопия. Первичное определение размеров и морфологии микрочастиц проводили с помощью световой микроскопии (микроскоп Биомед 1 Вар.2 (Биомед, Россия) с цифровым окуляром MYscope ЗООМ (Webbers, Тайвань)). Микрофотографии, сделанные методами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) в электронном и ионном излучениях, получены на микроскопе FEI-SMA-QUANTA 200, и SMA QUANTA FEG. Микрофотографии процесса эндоцитоза микрочастиц получены с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием флуоресцентного микроскопа Axiovert 200М с цифровой камерой AxioCam, обработка изображений проводилась программным обеспечением Zeiss LSM Browser 4.2.0 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Германия). Микрофотографии наночастиц были получены методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) с помощью микроскопа Solver PRO-M (Зеленоград, Россия). Сканирование проводили в полуконтактном режиме с использованием кантилеверов NSG01 (типичная жесткость 5.1 Н/м), частота сканирования составляла 1-3 Гц, размер кадров от 3x3 до 20x20 мкм, изучалась топография и фазовые сигналы. Обработка изображений проводилась с использованием программного обеспечения анализа изображения (NT-MDT, Россия) и ФемтоСкан Онлайн (Центр перспективных технологий).

2.6 Изучение кинетики высвобождения JIB из микрочастиц на основе ПОБ. Эксперимент по высвобождению JIB из микрочастиц in vitro проводили при 37°С в термостате ТС-1/20 (Россия) в 25 мМ калий-фосфатном буфере (pH = 7.4) с небольшим добавлением эмульгатора (0,05% Triton Х-10 по объему): 4 партии микрочастиц по 20 мг микрочастиц в 4 мл буфера перемешивали на шейкере (BioSan, США) при 330 об/мин. При исследовании высвобождения JIB в установленные моменты времени микрочастицы отделяли от буфера центрифугированием при 14000 об/мин на центрифуге MiniSpin, (Eppendorf, Германия) и добавляли 4 мл чистого буфера. Содержание ПТК в буфере

определяли спектрофотометрически, DU-6S0 (Beckman Coulter, США) при сравнении с фосфатным буфером и с помощью построения калибровочной кривой с использованием спирто-водных растворов JIB в различных концентрациях. Остаточное содержание JIB в микрочастицах определяли также спектрофотометрически, растворяя их в хлороформе.

2.7 Изучение in vitro взаимодействия полимерных частиц с культурой клеток. Для оценки биобезопасности микро- и наночастиц in vitro использовали культуру клеток рака молочной железы человека линии MCF-7 и культуру клеток гепатомы мыши линии МН-22а. Клетки культивировали в среде DMEM (Dubecco Modified Eagle Medium, Invitrogen, США) с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл раствора стрептомицина (Invitrogen, США) [Freshney R., 2010]. Клетки инкубировали при 37°С в увлажненной 5% СОг атмосфере с ежедневной сменой сред. Трипсинизировали клетки раствором трипсин-версена (0,05% (об./мас.) трипсина и 0,02% (об./мас.) EDTA в PBS) (Serva, Германия) и подсчитывали Coulter Counter Z1 (Beckman Coulter, США).

Выживаемость клеток под влиянием тестируемого агента, вычисляли по формуле: N% = (кол-во клеток в опыте / кол-во клеток в контроле) х 100%. При этом использовали стандартный ХТТ-тест (аналог МТТ), как наиболее показательный метод при работе с используемыми культурами опухолевых клеток [Freshney R., 2010].

Микро- или наночасгицы, диспергированные в культуральной среде, добавляли в различных концентрациях к культивируемым в 96-луночных планшетах клеткам (5000 клеток/лунку). Предварительно высушенные частицы были стерилизованы при температуре 90°С в течение 10 мин. Исследуемые образцы частиц с включением паклитаксела 10% были испытаны в 6 параллельных измерениях в различных концентрациях. Суспензию биополимерных микрочастиц в концентрациях 3 мг/мл, не содержащих JIB, использовали в качестве отрицательного контроля. Раствор чистого JIB без биополимерных микрочастиц в концентрации 3 мг/мл - в качестве положительного контроля. Измерения проводили через 24, 48 и 72 часа от начала культивации.

2.8 Изучение «острой» токсичности биополимерных частиц in vivo. Изучение острой токсичности биополимерной системы (микрочастиц), содержащей паклитаксел (содержание ПТК в микрочастицах - 10±1%.) при внутрибрюшинном введении проводили на 36 белых мышах-самцах. В опыт брали клинически здоровых животных, после 15-дневного карантина. Статистические группы состояли из 6 животных. Исходный вес животных колебался в пределах 25-28 г. Препарат вводился в брюшину в виде 20% суспензии, приготовленной в стерильном 0,9% физиологическом растворе. Зона введения обрабатывалась этиловым спиртом. Использовались однократные стерильные шприцы. Было испытано 5 доз: по препарату - 6000; 5000; 3000, 2000 и 1200 мг/кг (по действующему веществу - 600; 500; 300, 200 и 120 мг/кг) массы тела. Каждая доза вводилась 6 животным. Контрольным животным вводили в тех же объемах физраствор. Полученные данные использовались для определения параметров смертельного эффекта -ЛД|6, ЛД50 и ЛД84. При этом применялся метод Кербера в модификации В.Б. Прозоровского (пробит-анализ). Стандартная ошибка вычислялась по эмпирической

формуле Гаддама [Беленький М.А., 1983]. Для характеристики степени развития острого смертельного отравления помимо величины ЛД50, указывающей на степень токсичности, использовались некоторые показатели, характеризующие опасность препарата в условиях введения в желудок. Для суждения о скорости развития интоксикации определяли время гибели 50% животных (ТЕ50). При этом также использовались результаты острого опыта. За животными вели наблюдение в течение 2-х недель после введения, отмечая сроки гибели или выздоровления животных.

2.9 Исследование противоопухолевой эффективности биополимерных частиц in vivo на моделях эпителиальных опухолей. Изучение противоопухолевой эффективности проводили на следующих образцах:

- Система полимерных частиц (диаметр - 1 мкм, массовая доля паклитаксела - 10±1%, ПОБ-МЧ-ПТК-1). Концентрация дисперсии микрочастиц 10 мг/мл. Предполагаемая суммарная доза таксола при полном высвобождении — 32 мг/кг. Эмпирическая суточная доза таксола при равномерном высвобождении - 2 мг/кг.

- Система полимерных микрочастиц (диаметр - 25 мкм, массовая доля паклитаксела -10±1%, ПОБ-МЧ-ПТК-25). Концентрация дисперсии 10 мг/мл. Время полувысвобождения таксола 27±6 дня. Предполагаемая суммарная доза таксола при полном высвобождении -32 мг/кг. Суточная доза таксола при равномерном высвобождении - 0,6 мг/кг.

В качестве отрицательного контроля использовали поли-3-оксибутиратные микрочастицы «пустые» (ПОБ-МЧ), концентрация дисперсии 10 мг/мл. Контроль эффективности цитостатика - таксол в дозе 32 мг/кг, равной расчетной суммарной дозе.

Асцитная опухоль Эрлиха (штамм ELD) получена из Банка опухолевых штаммов РОНЦ в ампуле в замороженном виде. Опухолевая взвесь клеток разморожена и имплантирована в брюшную полость мышей-самок линии Balb/c. Для проведения эксперимента мышам в брюшную полость трансплантировали по 1x106 клеток ELD в 0,2 мл питательной среды 199.

Мышей для опыта (40 особей) массой тела 23-27 г разведения ГУ РОНЦ содержали в виварии на брикетированных кормах. После трансплантации опухоли мышей делили на группы (п=6-10), одну из групп оставляли без лечения и считали контрольной (п=10). Остальные группы мышей (п=6) получали различные виды воздействия.

Оценку влияния испытуемых объектов на опухолевый рост проводили по стандартным показателям эффективности: средней продолжительности жизни (СПЖ, дни) и увеличению продолжительности жизни («treatment/control», Т/С%) мышей (СПЖ контроля = 100%), наличию асцита и визуальной верификации опухолевых поражений брюшной полости в сравнении с нелеченным контролем.

О реакции на воздействия судили по состоянию и поведению мышей, а также по визуальной картине при аутопсии павших и умерщвленных после окончания опыта мышей. За мышами наблюдали ежедневно до гибели или в течение 50 дней в случае переживания контроля.

Полученные результаты обрабатывали статистически, рассчитывая доверительные интервалы средних сравниваемых величин, достоверными считали различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сополимер ПОБ-ПЭГ.

Синтез сополимера ПОБ-ПЭГ. В нашей лаборатории разработан эффективный способ получения поли-3-оксибутирата — биосовместимого и биоразлагаемого полимера. Одной из перспективных областей применения таких полимеров является создание на их основе полимерных лекарственных систем пролонгированного высвобождения на основе микро- и наночастиц. Ранее нами уже были исследованы основные их физико-химические свойства и установлены некоторые закономерности. Дальнейшим развитием этого направления является поиск способов направленно изменять свойства таких систем пролонгированного высвобождения и придания им желаемых характеристик.

К изменению характеристик разрабатываемых систем может привести увеличение гидрофильности ПОБ. Поэтому нами было сделано предположение, что этого можно добиться, создав сополимер ПОБ с ПЭГ. В связи с этим, в условия биосинтеза полимера были внесены соответствующие изменения: на определенном этапе к растущей культуре добавляли ПЭГ, который начинал встраиваться в цепь ПОБ, предположительно обрывая его синтез. При этом рост биомассы замедлялся, что показано на рисунке 1. В таблице 1 приведены условия биосинтеза и некоторые характеристики полученного нами сополимера ПОБ-ПЭГ в сравнении с полученными ранее ПОБ и его сополимером с 3-оксивалератом. Как видно из таблицы, встраивание ПЭГ в ПОБ значительно снижает молекулярную массу синтезируемого полимера.

Таблица 1 - Условия синтеза и физико-химические характеристики ПОБ и его сополимеров ПОБВ и ПОБ-ПЭГ.

Условия культивации и характеристики роста

Состав полимера

Молекуляр

Физико-химические свойства

Сахароза (50 ± д /0) + ацетат В N3(75/0)

0.4 4,2

178 1,85 161,0/181,4 68,0

70,5 ± 3,5

0,9

«

О В

Сахароза (50

/0) + ВК(5/ 3,7 ± 68,1 ±

12)+ ацетат 0,3 3,5 N3(50/0)

5,7 0

172 2,04 150,6/175,4 50,0

70,2 ± 2,1 2,8

И —2,2 ± 34,2 ± 52,3 ±

в /0) + ПЭГ ' ' 0 0,33 0,96 160 1,91 157,4/177,8 59,1 ' 30>5

§ 300(150/ 12) ' "

Исследование физико-химических свойств сополимера ПОБ-ПЭГ. Чтобы подтвердить структуру синтезированного нами сополимера, был получен его Н1-ЯМР спектр (рисунок 2), из расшифровки которого, следует, что ПЭГ действительно связан с концевыми группами ПОБ, т.е. встраивается в синтезируемую цепь полимера, обрывая тем самым его синтез и снижая молекулярную массу.

Данные ДСК показали снижение кристалличности ПОБ-ПЭГ, по сравнению с ПОБ, и изменение температуры плавления (таблица 1).

Контактный угол сополимера с водой был ниже, чем у ПОБ, а водопоглощение значительно выше, что говорит о повышении гидрофильных свойств сополимера, что и было одной из основных целей его биосинтеза.

__я 1

см, 9 я е с ' °

{0-СМ-СМГС}0-СНТСН({0-СМГСИЗО-СМГСНТОН

_|Ь с

& О С'-1' '

1 0 6"

^ С.001и • '

о V г > I !

* * н......!

5 4 3 2 1

Сп.тчиЛ 5Л1П гр;л

Рисунок 2 - 'Н-ЯМР спектр сополимера ПОБ-ПЭГ

a) цепь ПОБ: 1- СН,; 2- СН; 3- СН2

b) цепь ПЭГ: а- -0-СН2 (4.24 ррт), Ь- СН2 (3.73), с- общий сигнал от серединных групп [-0-СН2-СН2-] (3.66 ррш), е и с1 - концевые -СН2- (3.70 ррт) и -СНг-ОН (3.61 ррт)

2. Системы пролонгированного высвобождения на основе ПОБ и его сополимеров.

Как говорилось ранее, одним из перспективных применений биополимеров в медицине является создание новых пролонгированных лекарственных форм. Известно, что традиционные лекарственные формы обладают рядом недостатков, таких как повышенная токсичность, нестабильность, неэффективный расход действующего начала.

е

О 10 29 30 40 50

Вр«мя, час

Рисунок 1 - Рост культуры А. сЬгоососсит 7Б без присутствия (сахароза) и в присутствии (сахароза + ПЭГ) ПЭГ в культуральной среде при добалении ПЭГ через 12 часов после начала культивирования.

Это особенно важно учитывать при лечении онкозаболеваний, т.к. противоопухолевые препараты обладают высокой токсичностью, а лечение онкозаболеваний длительно.

Но большинство этих недостатков можно избежать, если использовать системы пролонгированного высвобождения ЛВ. Один из вариантов таких систем основан на полимерных микро и наночастицах с ЛВ. Из смеси полимера и ЛВ формируются частицы, которые постепенно разрушаясь в организме, высвобождают ЛВ.

Полимерные формы обеспечивают длительное поддержание необходимой концентрации ЛВ в организме, без постоянного введения высоких доз препаратов.

Таким образом, разрабатываемые лекарственные формы на основе биополимеров обладают рядом преимуществ перед традиционными формами:

-пролонгированное действие и устранение необходимости многократного введения лекарственного препарата

- снижение токсичности и побочного действия препаратов

- повышение эффективности лекарственных веществ

Получение и характеризация полимерных микрочастиц. В рамках данной работы исследовались частицы с включением 4 различных препаратов. На рисунке 3 показаны изображения световой микроскопии полученных микрочастиц. Непосредственно целевыми препаратами в настоящем исследовании были выбраны 2 противоопухолевых препарата - этопозид (обладающий цитотоксический эффектом, вызывает некроз) и паклитаксел (цитостатическое действие, вызывает апоптоз), как одни из широко применяемых в онкотерапии. Ивермектин и дипиридамол были выбраны как модельные вещества: ивермектин, для изучения влияния различных полимерных композиций в матриксной основе частиц на кинетику высвобождения ЛВ. а дипиридамол в силу своей флуоресценции - для визуализации исследований с применением конфокальной микроскопии.

Все выбранные вещества обладают высокой гидрофобностью, как и сам полимер, поэтому образуют схожие по морфологии микрочастицы. Данные исследования СЭМ показали, что все частицы обладают правильной сферической формой и схожей структурой поверхности (несколько шероховатой, с выраженными полимерными тяжами).

А

Рисунок 3 - Изображения К

микрочастиц из ПОБ с I лекарственными веществами * (световая микроскопия) и структурные формулы этих ^Л веществ: А - дипиридамол, Ц

Также были получены фотографии конфокальной микроскопии микрочастиц с включением флуоресцирующего дипиридамола. На рисунке 4 представлены три ортогональные проекции микрочастиц. Эти данные показывают, что JIB равномерно распределено по всему объему частиц, а частицы по своей структуре однородны.

Рисунок 4 - Микрочастицы на основе ПОБ с инкапсулированным

флуоресцирующим дипиридамолом

(конфокальная микроскопия). Показаны 3 ортогональные проекции

соответствующих срезов изображения (Проекция по линии среза обведена соответствующим линии среза цветом).

Кинетика высвобождения ивермектина in vitro. Далее была исследована кинетика выхода J1B в фосфатный буфер in vitro на примере микрочастиц из ПОБ с включением ивермектина (рисунок 5). Было установлено, что высвобождение JIB можно условно разделить на 2 этапа:

- начальный этап быстрого высвобождения J1B, он аппроксимируется степенной функцией, что говорит о преобладании диффузии J1B. эта стадия длится 10-15 суток.

- и следующий долгий этап постепенного высвобождения J1B, имеющий экспоненциальный характер, что говорит о снижении диффузионных процессов и преобладании гидролитического разрушения полимерной основы частиц.

Такая кинетика выхода ЛВ не всегда удовлетворяет схемам терапии того или иного заболевания, поэтому дальнейшей целью было изменение такой кинетики с помощью композитных добавок в полимерную основу микрочастиц.

Ш АО -

с; ч

О зон -Л

m

-----у = 1 +■ m*exp(-k*x), m~-0.6

Экспоненциальная аппроксимация, преобладает деградация полимерной основы

у = а*хль +- с*х. Ь~0 5

f Степенная аппроксимация, преобладает диффузия ЛВ

Рисунок 5 - Кинетика высвобождения ивермектина во времени из микрочастиц на основе ПОБ 40кДа: включение ЛВ в микрочастицах - 40 ±1%, диаметр микрочастиц - 30±5 мкм Условия высвобождения: 25 мМ фосфатный буфер, рН 7.4. 37°С; продолжительность эксперимента - 120 суток.

Время, сут.

Был предложен ряд биосовместимых добавок, предположительно оказывающих влияние на первую или вторую стадии высвобождения. Так, обладающие гидрофильными свойствами ПЭГ и его модификации, предположительно должны усиливать деградацию частиц на протяжении всего времени эксперимента, повышая диффузию воды в

полимерную матрицу и тем самым увеличивая долговременный выход ЛВ. Липиды же, обладающие структурой гидрофильная «голова» - гидрофобный «хвост», предположительно будут вымываться из полимерной структуры частиц на начальном этапе, усиливая диффузию ЛВ.

Так, были получены партии микрочастиц с ивермектином с 9ю различными добавками в полимерную основу ПОБ (ПЭГ - 50% и 20% в полимерной основе, поливинилпириллидон, ПЭГ-токоферол, ПЭГ-монолауриат; лецитин,

дипальматоилфосфотидилхолин, дистеариилфосфотидилхолин, лауриновая кислота), и исследована кинетика высвобождения ивермектина из полученных образцов в течение 45 суток. Полученные данные оказались весьма разнообразны, но, тем не менее, ряд добавок оказывал необходимое действие на ту или другую стадию высвобождения. Из них были отобраны вещества, наиболее характерно меняющие кинетику выхода ЛВ. Так, лецитин (ЛЦТ, смесь фосфолипидов) значительно усиливает начальный выброс ЛВ из микрочастиц, а добавление ПЭГ усиливает долговременный выход препарата из полимерной основы (рисунок 6).

Таким образом, были определены композитные добавки характерным образом

Рисунок 6 - Кинетика высвобождения ивермектина из микрочастиц на основе ПОБ 40кДа с применением различных добавок, количество

повторностей п=6. Условия высвобождения: 25 мМ фосфатный буфер, рН 7.4, 37°С; включение ЛВ в микрочастицах -40 ± 1%, диаметр микрочастиц -30±5 мкм.

Получение полимерных наночастиц. Помимо микрочастиц, в нашей лаборатории тем же методом одноэтапного эмульгирования получали и частицы субмикронного размера (меньше 0.7 мкм получать не удавалось, из-за ограничений метода). Для получения частиц с размером меньше 0.7 мкм была разработана модификация этого метода с предшествующей фильтрацией (мембранная эмульсификация). Было испробовано много различных вариантов фильтрации и гомогенизации эмульсии, и выбран оптимальный эффективный метод получения наночастиц с использованием экструдера, позволяющий получать частицы диаметром от 50 до 500 нм.

Полученные частицы субмикронного размера с включением ПТК были исследованы различными методами микроскопии. Но если световая микроскопия просто неспособна дать четкие изображения таких частиц, то при применении сканирующей или просвечивающей электронной микроскопии, образец полимерных частиц начинал плавиться от получаемой энергии или не получался достаточно контрастным. Поэтому

изменяющие кинетику выхода ЛВ в ту или иную сторону.

высвобождение ивермектина из полимерных микросфер

—"—Микрочастицы бездобавок

л 20% ПЭГ

8 полимерной матрице

— ЗКв Лецитина С42НзоЫ08Р в полимерной матрице

для изучения таких частиц были использованы методы атомно-силовой микроскопии и динамического светорассеивания, результаты которых показали, что исследуемые частицы имеют распределение размеров от 50 до 700 нм со средним диаметром 216 нм (рисунок 7).

А Распределение частиц

1 10 100 Диаметр, нм

Рисунок 7 - А - распределение наночастиц из ПОБ по диаметру, средний диаметр 21 бнм (динамическое светорассеивание); Б - отдельная наночастица из ПОБ с ПТК (АСМ). Кинетика высвобождения паклитаксела in vitro. На следующем этапе работы были получены микрочастицы с включением паклитаксела (включение 10% по массе, диаметр 15-20 мкм) с различным составом полимерной матрицы. Так, в качестве полимерной основы был взят ПОБ разной молекулярной массы (бкДа, 140кДа, 260кДа), а также синтезированный ранее его сополимер ПОБ-ПЭГ (269кДа); более того, были получены частицы с каждым из этих полимеров с добавлением в полимерную основу определённых ранее добавок (лецитин 35%, ПЭГ 20%). Также были получены наночастицы с паклитакселом (10%, 220±50 нм), и проведено исследование кинетики выхода ЛВ из микро- и наночастиц in vitro. Результаты исследования показали, что микрочастицы из ПОБ различной молекулярной массы (140, 260кДа), а также из сополимера ПОБ-ПЭГ практически не отличаются по кинетике высвобождения ПТК, а микрочастицы из низкомолекулярного ПОБ (6 кДа) высвобождают ЛВ активнее как на этапе диффузии, так и на позднем этапе деградации полимера. Более того, как и предполагалось, применяемые композитные добавки в полимерной основе оказывали ожидаемое влияние, как и в случае частиц с ивермектином: добавление лецитина усиливало начальный выброс ЛВ (диффузионный), а добавление ПЭГ - усиливало долговременное высвобождение ЛВ. Об этом свидетельствует и сравнение изменения скоростей высвобождения ЛВ во времени. Как оказалось, синтезированный ранее сополимер ПОБ-ПЭГ (268кДа) незначительно изменял кинетику высвобождения ЛВ, по сравнению с аналогичным полимером ПОБ (260кДа), не смотря на отличающиеся гидрофильные свойства.

Циготоксичность микро- и наночастиц с противоопухолевыми ЛВ. Затем полученные микро- и наночастицы с противоопухолевыми паклитакселом и этопозидом были исследованы на цитотоксичность на различных культурах клеток (клетки рака груди человека линии MCF-7 и клетки гепатомы мыши линии МН-22а). Так, препарат микрочастиц с паклитакселом оказывал ингибирующее действие на рост опухолевых

клеток даже в небольших концентрациях, подавляя их рост в 5 раз через Зе суток культивации. При этом на поздних этапах культивации он оказывался эффективнее традиционной лекарственной формы (таксола), показывая пролонгированный эффект. То же можно сказать и об эффективности микрочастиц с этопозидом, хотя они и ингибировали рост клеток в меньшей степени (рисунок 8).

О М 38 Т2 0 1. « 72

Время, ч Время, ч

Рисунок S - Влияние различных концентраций микрочастиц биополимерных систем, содержащих паклитаксел (слева) и этопозид (справа) на выживаемость опухолевых клеток рака груди человека линии MCF-7.

Также была исследована цитотоксичность полимерных микрочастиц с ПТК с добавлением ЛЦТ и ПЭГ в полимерную матрицу на культуре клеток гепатомы мыши линии МН-22а. Более того, была изучена цитотоксичность таких микрочастиц как вначале высвобождения ЛВ, так и после 120 дней инкубации их в фосфатном буфере. Результаты не только показали пролонгированный эффект действия микрочастиц и сохранение активности ПТК в течение 120 дней, но и подтвердили данные о кинетике высвобождения ПТК in vitro. Так, полутоксическая концентрация препарата микрочастиц (IC50), рассчитанная на Зй день эксперимента составила для микрочастиц из ПОБ+ЛЦТ 3 мкг/мл на первые 3 дня высвобождения ПТК и 8,5 мкг/мл на 121Й-123Й дни высвобождения ЛВ, т.е. цитотоксичность микрочастиц с добавлением лецитина снизилась почти в 3 раза после 4х месяцев инкубации в фосфатном буфере. Для микрочастиц с добавлением ПЭГ в полимерную матрицу аналогичные показатели составили 15 и 23 мкг/мл соответственно, т.е. цитотоксичность уменьшилась всего в 1,5 раз. Таким образом, исследуемая лекарственная форма препарата продолжает высвобождать небольшие количества ЛВ даже после четырех месяцев инкубации в фосфатном буфере и эффективно подавляет рост опухолевых клеток, при этом добавление лецитина в полимерную основу частиц усиливает диффузионную составляющую высвобождения ЛВ на начальном этапе, а добавление ПЭГ - выход вещества за счет деградации полимерной матрицы, делая высвобождение ЛВ более равномерным.

Помимо микрочастиц, было показано и воздействие на клетки наночастиц из ПОБ и синтезированного ранее ПОБ-ПЭГ с включением ПТК (рисунок 9). Они также показывали пролонгированное ингибирование роста клеток уже в небольших концентрациях, и обладали большей эффективностью, чем таксол. Более того, средняя цитотоксичтость наночастиц из сополимера ПОБ-ПЭГ оказалась ниже (IC50 = 6,5 мкг/мл

на Зй день), чем наночастиц из ПОБ (1Сдо = 3 мкг/мл), тогда как в высоких концентрациях (1 мг/мл) наночастицы из ПОБ-ПЭГ ингибировали рост клеток сильнее, чем наночастицы из ПОБ (рисунок 9).

различных концентраций наночастиц из ПОБ (слева) и из ПОБ-ПЭГ (справа), содержащих паклитаксел.

Эндоцитоз полимерных частиц субмикронного размера. Для визуализации эндоцитоза частиц субмикронного размера, мы снова прибегли к конфокальной микроскопии. На рисунке 10 изображено поглощение клетками линии MCF-7 полимерных частиц субмикронного размера с флуоресцирующим дипиридамолом. Так, через 3 часа культивации клетки уже захватили некоторые частицы, а через 24 часа, уже флуоресцирует вся цитоплазма клетки, что свидетельствует о накоплении и высвобождении JTB прямо в цитоплазму клетки.

Рисунок 10 - Эндоцитоз биополимерных микрочастиц

(диаметр 1±0.3 мкм), содержащих флуоресцирующее ЛВ

дипиридамол, опухолевыми

клетками линии МСР-7 через 3 часа (слева) и 24 часа инкубации (справа).

Исследование острой токсичности /я vivo. Также было проведено исследование острой токсичности препарата микро- и наночастиц с паклитакселом. В таблице 2 приведены значения полулетальных доз (ЛД50) при внутрибрюшинном введении мышам и крысам полимерных частиц (ПОБ бкДа, 10% ПТК) в сравнении с чистым паклитакселом и его традиционной формой Таксолом, в расчете на единицу дозы действующего вещества. Из таблицы видно, что препарат полимерных микро- и наночастиц с паклитакселом на

порядок снижает токсичность действующего вещества (ПТК) и обладает сильно меньшей (в 40 раз) токсичностью, нежели традиционный препарат Таксол.

Таблица 2 - Значения полулетальных доз (ЛД50) различных лекарственных форм паклитаксела при внутрибрюшинном (в/б) введении мышам и крысам в расчете на единицу действующего вещества, в скобках даны значения ЛД5(, в расчете на количество полимерных частиц.

Лекарственная Паклитаксел, Таксол, Микрочастицы, 10% Наночастицы, 10%

форма мг/кг мг/кг ПТК, мг/кг ПТК, мг/кг

Мыши, в/б 22 9 360±45 (3600±450) 385±40,5 (3850±405)

Крысы, в/б 19 8 167±35,5 (1670±355) -

Противоопухолевая активность микро- и наночастиц с паклитакселом in vivo. Кроме того, была проведена оценка противоопухолевой активности таких микро- и наночастиц (частиц субмикронного размера) на моделях эпителиальных опухолей мышей. Не смотря на то, что число полных ремиссий при применении полимерных частиц было меньше, чем при обработке таксолом (таблица 3), рост асцитарных образований подавлялся микрочастицами, а в случае наночастиц с пакпитакселем асцит не бьи обнаружен ни у одной из мышей. Это говорит о противоопухолевой эффективности по критерию локального торможения роста опухоли.

Таблица 3 - Результаты оценки противоопухолевой эффективности биополимерных микро- и наночастиц на моделях эпителиальной опухоли мышей.

Группы и путь введения Размер микрочастиц СПЖ, дни Т/С% Асцит (+.-) Число полных ремиссий

Контроль роста опухоли - 13,4 [12,2-14,6] 100 +++ -

Таксол в/б - 21,0 [5,4-36,6] 157 п=4 +++ п=4 2/6

Таксол в/в - 18,0 [11,8-24,2] 143 п=4 +++ п=4 2/6

ПОБ-МЧ-ПТК-1 в/б 1,0±0,3 мкм 9,4 [5,6-13,2] 70 п=5 - 1/6

ПОБ-МЧ-ПТК-25 в/б 25,0±6,0 мкм 12,2 [6,7-17,7] 91 п=6 2/5 (-) 3/5 (+) 1/6

ПОБ-МЧ в/б 1,0±0,3 мкм 13,0 [нет] 97 +++ 0/6

Таким образом, в работе было показано, что исследуемые новые лекарственные формы противоопухолевых препаратов обладают не только большей эффективностью in vitro, по сравнению с традиционными препаратами, но и вызывают локальное торможение роста опухоли in vivo.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод биосинтеза нового биосовместимого и биоразлагаемого сополимера ПОБ-ПЭГ культурой Azotobacter chroococcum 7Б. Определены условия биосинтеза, позволяющие регулировать молекулярную массу полимера. Сополимер обладает отличными от гомополимера физико-химическими свойствами: повышенной гидрофильностью, меньшей кристалличностью и большей биосовместимостью.

2. Различные композитные добавки в полимерную основу частиц позволяют создавать системы пролонгированного высвобождения лекарственных веществ с заданными свойствами: добавление лецитина в полимерную основу частиц усиливает диффузионную составляющую высвобождения лекарственного вещества, добавление ПЭГ - высвобождение вещества за счет деградации полимерной матрицы.

3. Разработан эффективный метод получения наночастиц из ПОБ и его сополимеров. Морфология и размер наночастиц определены методами атомно-силовой микроскопии и дифференциального светорассеивания.

4. Изучение биологической активности микро- и наночастиц из ПОБ, содержащих противоопухолевые препараты (паклитаксел и этопозид) на различных культурах клеток (клетки рака груди человека линии MCF-7 и клетки гепатомы мыши линии МН-22а) показало их большую эффективность по сравнению с традиционными противоопухолевыми препаратами и сохранение активности свыше 120 суток.

5. Биополимерные частицы с включением паклитаксела обладают меньшей острой токсичностью in vivo в сравнении с традиционной противоопухолевой лекарственной формой (Таксолом). Впервые показано повышение противоопухолевой эффективности по критерию локального торможения роста опухоли на моделях эпителиальных опухолей мышей.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

Статьи в периодических изданиях из списка рекомендованных ВАК Министерства

образования и науки Российской Федерации:

1. Бонарцев А.П., Яковлев С.Г., Филатова Е.В., Соболева Г.М., Махина Т.К., Бонарцева Г.А., Шайтан К.В., Попов В.О., Кирпичников МП. Пролонгированное высвобождение противоопухолевого лекарственного вещества, паклитаксела, из микросфер на основе поли-3-оксибутирата. Биомедицинская химия, 2011 г., т.57, вып.2, стр.232-240. (Biochemistry (Moscow) Supplement Series В: Biomedical Chemistry, 2012, 6(1), 42^47).

2. Жаркова И.И., Бонарцев А.П., Босхомджиев А.П., Ефремов Ю.М., Багров Д.В., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Иванов Е.А., Воинова В В., Яковлев С.Г., Зернов A.JI., Филатова Е.В., Андреева Н.В., Бонарцева Г.А., Шайтан К.В. Влияние модификации поли-3-оксибутирата полиэтиленгликолем на жизнеспособность клеток, культивиируемых на полимерных пленках. Биомедицинская химия, 2012 г. Т.58 вып.5 е..579-591 (Biochemistry (Moscow) Supplement Series В: Biomedical Chemistry, 2013 (in press)).

3. Филатова Е.В., Яковлев С.Г., Бонарцев А.П., Махина Т.К., Мышкина В. Л., Бонарцева Г А. Пролонгированное высвобождение хлорамбуцила и этопозида из полимерных микросфер из поли-3-оксибутирата. Прикладная биохимия и микробиология, 2012, том 48, № 6, с. 662-667. (Applied Biochemistry and Microbiology, 2012, Vol. 48, Iss. 6, pp 598-602).

Статьи в иностранных периодических изданиях:

4. Bonartsev А.Р., Boskhomodgiev А.Р., Voinova V.V., Makhina Т.К., Myshkina V.L., Yakovlev S.G., Zharkova 1.1., Zernov A.L., Filatova E.A., Bagrov D.V., Rebrov A.V., Bonartseva G.A., Iordanskii A.L. Hydrolytic degradation of poly(3-hydroxybutyrate) and its derivates: characterization and kinetic behavior. Chemistry and Chemical Technology, 2012, T.6, N.4, p. 385-392.

5. Bonartsev A.P., Boskhomodgiev A.P., Iordanskii A.L., Bonartseva G.A., Rebrov A.V., Makhina Т.К., Myshkina V.L., Yakovlev S.G., Filatova E.A., Ivanov E.A., Bagrov D.V., Zaikov G.E. Hydrolytic Degradation of Poly(3-hydroxybutyrate), Polylactide and their Derivatives: Kinetics, Crystallinity, and Surface Morphology. Molecular Crystals and Liquid Crystals, 2012, 556(1), 288300.

6. Bonartsev A.P., Yakovlev S.G., Boskhomdzhiev A.P., Zharkova I.I., Bagrov D.V., Myshkina V.L., Mahina Т.К., Charitonova E.P., Samsonova O.V., Zernov A.L., Zhuikov V.A., Efremov Yu.M., Voinova V.V., Bonartseva G.A., Shaitan K.V. The Terpolymer Produced by Azotobacter Chroococcum 7B: Effect of Surface Properties on Cell Attachment. PLoS ONE, 2013, 8(2): e57200. doi: 10.1371/journaI.pone.0057200

7. Bonartsev A.P., Yakovlev S.G., Zharkova I.I., Boskhomdzhiev A.P., Bagrov D.V., Myshkina V.L., Makhina Т.К., Kharitonova E.P., Samsonova O.V., Voinova V.V., Zernov A.L., Efremov Yu.M., Bonartseva G.A., Shaitan K.V. Cell attachment on poly(3-hydroxybutyrate)-poly(ethylene glycol) copolymer produced by Azotobacter chroococcum 7B. BMC Biochemistry, 2013, 14:12. doi:10.1186/1471-2091-14-12.

Статьи в сборниках статей:

1. Яковлев С.Г., Бонарцев А.П., Махина Т.К., Бонарцева Г.А., Зависимость кинетики высвобождения биологически активных веществ из микросфер на основе ПОБ от молекулярной массы полимера; Сборник трудов I Научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (23-26 ноября 2010). Издательство Политехнического университета, Санкт-Петербург, 2010, 3, стр.340-342.

2. Яковлев С.Г., Бонарцев А.П., Махина Т.К., Бонарцева Г.А., Микрочастацы из поли(3-оксибутирата) с противоопухолевым лекарственным веществом - этопозидом; Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине. Сборник статей под ред. А.П.Кудинова, Б.В.Крылова. Издательство Политехнического университета, Санкт-Петербург, 2011,3, стр. 276-278.

3. Bagrov D.V., Bonartsev А.Р., Zhuikov V.A , Myshkina V.L., Makhina Т.К., Zharkova 1.1., Yakovlev S.G., Voinova V.V., Boskhomdzhiev A.P., Bonartseva G.A., Shaitan K.V. Amorphous and semicrystalline phases in ultrathin films of poly(3-hydroxybutirate). TechConnect World Summit, Expo and Showcase 2012, June 18-21, 2012, Santa Clara, California, USA. Session TU7 Nanoscale Characterization: Scanning Probe Microscopy Dynamics and Kelvin Probe, Report # TU7.113, 3:30 pm, June 19. TechConnect World NTSI-Nanotech 2012 Proceedings, ISBN 978-14665-6274-5, 2012, Vol. 1, p. 602-605.

4. Филатова Е.В., Бонарцева Г.А., Яковлев С.Г., Бонарцев А.П.. Малотоксичная лекарственная форма паклитаксела с пролонгированным высвобождением на основе природного биополимера поли-3-оксибутирата. Вестник Волгоградского Государственного Медицинского Университета, изд. ВОЛГМУ, 2012, приложение (Материалы IV Всероссийского научно-практического семинара молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств»), ISSN 1994-9480. стр.76-78.

Тезисы конференций:

1. Bonartsev А.Р., Filatova Е.А., Yakovlev S.G., Soboleva G.M., Mahina Т.К., Myshkina V.L., Bonartseva G.A. Poly(3-hydroxybutyrate) nanoparticles loaded with paclitaxel cause prolonged antiproliferative action. The 27th Annual Scientific Meeting of the American Society of Hypertension, May 21-24, 2011, New-York, USA. The Journal of Clinical Hypertension, 2011, Suppl. 1, Vol. 13, p. A69.

2. Багров Д.В., Бонарцев А.П., Жаркова ИИ, Яковлев С.Г., Иванов Е.А., Босхомджиев А.П., Махина Т.К., Филатова Е.В., Воинова ВВ., Бонарцева Г.А., Шайтан КВ. Изучение морфологии поверхности ультратонких пленок из поли(З-оксибутирата). Пятая международная конференция, Современные достижения бионаноскопии ,15-17 июня 2011, Москва,Физический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, Сборник тезисов стр. 11-12

3. Багров Д.В., Бонарцев А.П., Иванов Е.А., Яковлев С.Г., Филатова Е.В., Босхомджиев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Воинова В В., Жаркова И.И., Бонарцева Г.А., Шайтан КВ. Исследование морфологии поверхности пленок поли(З-гидроксибутирата) нанометровой толщины. IV Всероссийская конференция по наноматериалам «НАНО-2011», 01-04 марта 2011, Москва, Россия, сборник материалов, стр. 575.

4. Iordanskii A.L., Bonartsev А.Р., Yakovlev S.G., Zhulkina A.L., Bonartseva G.A. Invitation lection. The transport impact upon characterization of biodegradable composites based on polyhydroxybutyrates: From synthetic barrier materials to natural Microparticles for drug delivery. Second International Conference on Polymer Processing and Characterization (ICPPC - 2010) 1517. Feb.2010. Сборник тезисов. Керала. Индия.

5. Багров Д.В., Бонарцев А.П., Босхомджиев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Филатова Е.В., Яковлев С.Г., Воинова В В., Бонарцева Г.А., Шайтан КВ. «Исследование структуры и процесса разложения пленок из поли-3-гидроксибутирата и его композитов с лекарственными веществами». Третья Всероссийская конференция «Нанотехнологии в онкологии 2010», Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена, Москва, Россия, 30 октября 2010, сборник тезисов, с. 15-18.

6. Bonartsev А.Р., Filatova E.V., Yakovlev S.G., Ivanov E.A., Makhina T.A., Myshkina V.L., Nadtochenko V.A., Bonartseva G.A., Shaitan K.V. Biopolymer Microspheres Loaded with Antitumor Drugs and Inorganic Nanoparticles. Материалы международной конференции MipTec, Базель, Швейцария, 20-24 сентября 2010 г., Р-157, стр. 79.

7. Филатова Е.В., Бонарцев А.П., Яковлев С.Г., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Бонарцева Г.А., Шайтан К В. Микросферы с инкапсулированными наночастицами оксида железа на основи поли-3-оксибутирата. Сборник тезисов 1-ой Международной научной школы «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах», 29 июня - 4 июля 2009 г., Московская обл., Пансионат "Заря" ГКНПЦ им. М.В. Хруничева.

8. Filatova E.V., Bonartsev A.P., Bonartseva G.A., Mahina Т.К., Myshkina V.L., Yakovlev S.G., Shaitan K.V. Iron oxide nanoparticles incapsulated in microspheres on the base of poly(3-hydroxybutyrate). Материалы международной конференции 7th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, Валетта, Мальта, 8-11 марта 2010 г., стр. 108.

9. Yakovlev S.G., Filatova E.V., T A. Makhina, V.L. Myshkina, G.A. Bonartseva, A P. Bonartsev In vitro anticancer activity of poly(3-hydroxybutyrate) microparticles loaded with antitumor drugs. Материалы международной конференции 7th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, Валетта, Мальта, 8-11 марта 2010 г., стр. 106.

10. Иванов Е.А., Бонарцев А.П., Яковлев С.Г., Махина Т.К., Мышкина B.JL, Бонарцева Г.А. Микро- и нанокапсулы из полигидроксибутирата с включением бычьего сывороточного альбумина и пероксидазы хрена Сборник тезисов 1-ой Международной научной школы «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах», 29 июня - 4 июля 2009 г., Московская обл., Пансионат "Заря" ГКНПЦ им. М.В. Хруничева.

11. Bonartsev А.Р., Filatova Е.А., Yakovlev S.G., Soboleva GM., Mahina Т.К., Myshkina V.L., Bonartseva G.A. Long-term in vitro antiproliferative action of poly(3-hydroxybutyrate) microparticles loaded with paclitaxel. The 26th Annual Scientific Meeting of the American Society of Hypertension, May 21-24, 2010, New-York, USA, PO-21. The Journal of Clinical Hypertension, 2010, Suppl. 1, Vol. 12, p. A27.

12. Yakovlev S.G., Boskhomdzhiev A.P., Filatova E.V., Makhina Т.К., Bonartsev A.P., Bonartseva G.A. In vitro anticancer activity of poly(3-hydroxybutyrate) nanoparticles loaded with antitumor drug Etoposide. 8th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, Стамбул, Турция, 19-22 марта 2012, p. 96.

13. Yakovlev S.G., Bonartsev A.P., Bagrov D.V., Efremov Yu.M., Boskhomdzhiev A.P., Filatova E.V., Ivanov P.V., Makhina Т.К., Bonartseva G.A., In vitro anticancer activity of poly(3-hydroxybutyrate) nanoparticles loaded with antitumor drug Paclitaxe. TechConnect World 2012 Conference and Trade Show, June 18-21, 2012, Santa Clara, California, U.S.A., p. 78.

14. Yakovlev S.G., A.P. Bonartsev, T.A. Makhina, G.A. Bonartseva, Influence of different additives in polymer base of poly(3-hydroxybutyrate) nanoparticles loaded with antitumor drug on drug release kinetics. EuroNanoForum 2013, June 18-20, 2013, Dublin, Ireland.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

JIB - лекарственное вещество ЛЦТ - лецитин ПТК - паклитаксел ПОБ - поли(З-оксибутират)

ПОБВ - сополимер поли(3-оксибутират)-(3-оксивалерат) ПОБ-ПЭГ - сополимер поли(3-оксибутират)-полиэтиленгликоль

Подписано в печать:

05.09.2013

Заказ № 8710 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 vvww.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яковлев, Сергей Георгиевич, Москва

ч

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМЕНИ А.Н. БАХА

04201361406

на правах рукописи

ЯКОВЛЕВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ МИКРО - И НАНОЧАСТИЦЫ ИЗ ПОЛЩЗ-ОКСИБУТИРАТА), ЕГО СОПОЛИМЕРОВ И КОМПОЗИТОВ

03.01.06 — биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н. Г.А. Бонарцева к.б.н. А.П. Бонарцев

Москва — 2013

"Ч

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................7

ЧАСТЬ 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР....................................................................12

Глава 1.1. Биодеградируемые полимеры медицинского назначения...........12

1.1.1. Биоматериалы............................................................................................15

1.1.2. Применение в хирургии............................................................................18

1.1.3. Применение в фармацевтике...................................................................20

1.1.4. Применение в тканевой инженерии........................................................21

Глава 1.2. Полиоксиалканоаты.............................................................................22

1.2.1. Полиоксиалканоаты и их роль в peí енеративной медицине....................22

1.2.2. Поли(З-оксибутират) и поли(З-оксивалерат).............................................25

1.2.2.1. Физико-химические свойства...................................................................25

1.2.2.2. Биосинтез и внутриклеточная деградация............................................27

1.2.2.3. Биосовместимостъ....................................................................................30

1.2.2.4. Биодеградация............................................................................................33

1.2.2.5. Применение в тканевой инженерии........................................................36

Глава 1.3. Противоопухолевые лекарственные формы...................................36

1.3.1. Системы контролируемого высвобождения JIB на основе микрочастиц из биодеградируемых полимеров..........................................................................40

1.3.1.1. Методы получения биополимерных микрочастиц.................................40

1.3.1.2. Морфология полимерных микро- и наночастиц.....................................54

1.3.2. Доклинические исследования противоопухолевых биополимерных

лекарственных форм...............................................................................................58

1.3.2.1. Кинетика высвобождения ЛВ..................................................................58

1.3.2.2. Использование биополимерных систем в терапии опухолевых заболеваний..............................................................................................................65

ЧАСТЬ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...............................72

Глава 2.1. ПОБ и сополимер ПОБ-ПЭГ...............................................................72

2.1.1. Условия синтеза............................................................................................72

2.1.2. Выделение поли-3-гидроксибутирата и его сополимеров из бактериальной биомассы........................................................................................73

2.1.3. Определение молекулярной массы полимера............................................73

2.1.4. Ядерно-магнитный резонанс.......................................................................73

2.1.5. Изготовление полимерных пленок.............................................................74

2.1.6. Измерение степени кристалличности биополимеров дифференциальной сканирующей калориметрией (ДСК)....................................................................74

2.1.7. Измерение контактных углов......................................................................75

2.1.8. Водопоглощение...........................................................................................75

2.1.9. Атомно-силовая микроскопия.....................................................................76

2.1.10. Адсорбция белков.......................................................................................77

2.1.11. Культуры клеток.........................................................................................77

2.1.12. Оценка выживаемости клеток...................................................................78

Глава 2.2. Системы пролонгированного высвобождения на основе ПОБ и

его сополимеров........................................................................................................79

2.2.1. Материалы.....................................................................................................79

2.2.2. Лекарственные вещества, инкапсулируемые в полимерную матрицу ПГБ...........................................................................................................................79

2.2.3. Получение микрочастиц из ПОБ.................................................................82

2.2.4. Получение наночастиц из ПОБ...................................................................82

2.2.5. Определение размера микро- и наночастиц из ПОБ и содержания в них ЛВ.............................................................................................................................83

2.2.6. Микроскопия.................................................................................................83

2.2.7. ИК-спектроскопия........................................................................................84

2.2.8. Изучение кинетики высвобождения ЛВ из микрочастиц на основе ПОБ ...................................................................................................................................84

2.2.9. Изучение in vitro взаимодействия полимерных частиц с культурой клеток.......................................................................................................................85

2.2.10. Изучение острой токсичности биополимерных частиц in vivo.............86

2.2.11. Исследование противоопухолевой эффективности биополимерных частиц in vivo на моделях эпителиальных опухолей..........................................87

ЧАСТЬ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ................................................90

Глава 3.1. Сополимер ПОБ-ПЭГ...........................................................................90

3.1.1. Синтез сополимеров ПОБ-ОВ и ПОБ-ПЭГ................................................90

3.1.2. Исследование физико-химических свойств сополимеров ПОБ..............97

3.1.2.1. Физико-термические свойства сополимеров.........................................97

3.1.2.2. Гидрологические свойства сополимеров.................................................98

3.1.2.3. Морфология поверхности пленок из сополимеров...............................100

3.1.3. Биосовместимость сополимеров ПОБ......................................................102

3.1.3.1. Адсорбция белков.....................................................................................102

3.1.3.2. Биосовместимость полученных полимеров in vitro.............................103

Глава 3.2. Системы пролонгированного высвобождения на основе ПОБ и его сополимеров......................................................................................................106

3.2.1. Получение и характеризация полимерных микрочастиц.......................107

3.2.2. Кинетика высвобождения модельного J1B (ивермектина) in vitro........113

3.2.3. Кинетика высвобождения модельного JIB из композитных частиц из ПОБ с различными добавками (пластификаторами)........................................116

3.2.4. Композитные частицы из ПОБ и его сополимеров, содержащие противоопухолевые JIB........................................................................................119

3.2.5. Получение биополимерных наночастиц..................................................123

3.2.6. Физико-термические характеристики полученных микро- и наночастиц .................................................................................................................................127

3.2.7. Взаимодействие JIB, композитных пластификаторов и полимерной основы частиц........................................................................................................128

3.2.8. Кинетика высвобождения противоопухолевых JIB in vitro...................133

3.2.9. Цитотоксичность микро- и наночастиц с противоопухолевыми ЛВ .... 137

3.2.10. Эндоцитоз полимерных частиц субмикронного размера.....................140

3.2.11. Исследование острой токсичности in vivo.............................................141

3.2.12. Противоопухолевая активность микро- и наночастиц с паклитакселом in vivo......................................................................................................................145

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................................................149

ВЫВОДЫ.....................................................................................................................151

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................................................153

ЛИТЕРАТУРА............................................................................................................154

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Злокачественные новообразования занимают третье место в списке причин смертности от болезней в развитых странах. На сегодняшний день лекарственные препараты в традиционных лекарственных формах для лечения онкологических заболеваний с одной стороны не полностью проявляют терапевтический потенциал заключенных в них биологически активных лекарственных веществ (JIB), а с другой стороны не устраняют их побочного отрицательного действия. Большинство химиопрепаратов, применяющихся в онкологии, обладают высокой токсичностью, что вызывает тяжелые осложнения и снижает качество жизни пациента. Более того, токсичностью нередко обладает сама лекарственная форма, в которую заключено действующее JTB. Например, в широко используемых в клинике традиционных противоопухолевых препаратах Паклитаксела действующее JIB, обладающее высокой токсичностью и рядом побочных эффектов, заключено в лекарственную форму на основе полиоксиэтилированного касторового масла, кремафора, который обладает собственной токсичностью: аллергогенностью, нефротоксичностью, кардиотоксичностью, нейротоксичностью. Кроме того, при лечении таких хронических заболеваний, как опухолевые, и при использовании токсичных противоопухолевых препаратов возникает необходимость длительного поддержания определенной системной или локальной концентрации JIB, не превышающей токсический уровень.

Одним из подходов к решению данной проблемы является применение систем пролонгированного высвобождения ЛВ из полимерных микро- и наночастиц. Связывание ЛВ с полимерными микро- и наночастицами и пролонгированное высвобождение из них с постоянной скоростью ЛВ обеспечивает длительное поддержание необходимой концентрации (без превышения токсического уровня) действующего JIB системно или локально в опухоли в течение всего заданного периода терапии заболевания. Тем самым,

устраняется необходимость дополнительного многократного введения лекарства, упрощается применение препарата, снижается токсичность и побочные эффекты препарата, улучшается его фармакокинетика, улучшается биодоступность JIB, появляются возможности локализованного направленного лекарственного действия, повышается эффективность препарата, снижается стоимость и длительность лечения. Однако, разрабатываемые и исследуемые в настоящее время лекарственные формы на основе полимерных микро- и наночастиц также нередко обладают существенными недостатками, прежде всего: токсичностью из-за низкой биосовместимости используемых полимеров и неудовлетворительной кинетикой высвобождения JIB и биодеградации микрочастиц, не поддающихся регуляции.

Поэтому в последнее время такие биополимеры микробиологического происхождения, как поли(З-оксибутират) (ПОБ) и его сополимеры привлекают все большее внимание благодаря их способности к биоразложению и высокой биосовместимости, что делает их пригодными для создания новых лекарственных форм. Ранее было показано, что ПОБ обладает высокой биосовместимостью и способностью как к гидролитической и ферментативной деградации in vitro, так и биоразложению в тканях млекопитающих in vivo. Более того, способность ПОБ к образованию сополимеров и композитов с другими полимерами позволяет варьировать свойства полимерной основы, тем самым, влияя на характер её взаимодействия с JIB. Это в свою очередь позволяет регулировать кинетику высвобождения JIB из полимерных микро- и наночастиц, изменяя тем самым и их фармакокинетические характеристики. Такой подход позволит создавать препараты на основе полимерных микро- и наночастиц с широким спектром фармакокинетических характеристик, которые важно учитывать при выборе терапии того или иного заболевания. Следует отметить также, что в настоящее время лекарственные препараты пролонгированного действия отечественного производства на основе биоразлагаемых полимеров отсутствуют.

Таким образом, целью данной работы являлось создание и исследование лекарственных систем пролонгированного действия для оптимизации их свойств за счет использования нового сополимера ПОБ, а также композитных добавок к ПОБ в полимерной основе микро- и наночастиц.

В соответствии с целью исследования были сформулированы следующие задачи:

> Синтез нового сополимера полиоксибутират-ПЭГ и исследование физико-химических свойств и биосовместимости.

> Изучение влияния различных композитных добавок в полимерной основе на физико-химические и фармакокинетические свойства микрочастиц (на примере частиц с модельным веществом).

> Разработка эффективного метода получения наночастиц.

> Получение и изучение физико-химических свойств микро- и наночастиц с противоопухолевыми препаратами с различным составом полимерной матрицы (гомополимер, сополимер и композитные добавки).

> Исследование биологической активности полученных микро- и наночастиц с противоопухолевыми препаратами in vitro и in vivo.

Научная новизна. В ходе данной работы впервые был разработан метод биосинтеза нового биосовместимого и биоразлагаемого сополимера ПОБ-ПЭГ культурой Azotobacter chroococcum 7Б. Подобраны оптимальные условия для накопления его клетками культуры, изучены его физико-химические свойства. Процесс биосинтеза позволяет регулировать молекулярную массу синтезируемого ПОБ.

Впервые исследовано влияние различных композитных добавок на кинетику высвобождения JIB; определены компоненты, меняющие характер кинетики выхода ЛВ, что позволяет создавать полимерные лекарственные системы с заданными свойствами.

Впервые разработан эффективный метод получения наночастиц из ПОБ и его сополимеров.

Изучена биологическая активность микро- и наночастиц из ПОБ, содержащих противоопухолевые препараты (паклитаксел и этопозид) на различных культурах клеток (клетки рака груди человека линии MCF-7 и клетки гепатомы мыши линии МН-22а). Показана их большая эффективность по сравнению с традиционными противоопухолевыми препаратами. Показан эндоцитоз полимерных наночастиц опухолевыми клетками, повышающий их цитостатическую активность.

Показано снижение острой токсичности паклитаксела в полимерных частицах гп vivo в сравнении с традиционной лекарственной формой. Впервые показано повышение противоопухолевой эффективности полимерных форм по критерию локального торможения роста опухоли.

Практическая значимость работы. Получен новый биосовместимый и биоразлагаемый сополимер биоматериал - сополимер ПОБ-ПЭГ, пригодный для медицинского применения. Полученные в настоящей работе системы биополимерных частиц из бактериального ПОБ и нового сополимера ПОБ-ПЭГ позволят избежать осложнений, связанных с воспалительной тканевой реакцией при применении полимеров, полученных химическим путем (полилактидов и полигликолидов, традиционно применяемых в медицинской практике). Разработанные биополимерные системы микро- и наночастиц с включением противоопухолевых препаратов обладают пониженной острой токсичностью и большей эффективностью по сравнению с традиционными лекарственными формами. Полученные результаты могут быть использованы для создания новых отечественных лекарственных форм химиотерапевтических препаратов пролонгированного действия.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на Седьмой Международной встрече по фармацевтике, биофармацевтике и фармацевтическим технологиям (Мальта, Валетта, март 2010), на Двадцать шестой ежегодной научной встрече Американского сообщества гипертензии (США, Нью-Йорк, май 2010), на Первой научно-практической

-i "к

конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, ноябрь 2010), на Международной конференции MipTec (Швейцария, Базель, сентябрь 2010) Четвертой Всероссийской конференции по наноматериалам «НАНО-2011» (Москва, март 2011), на Двадцать седьмой ежегодной научной встрече Американского сообщества гипертензии (США, Нью-Йорк, май 2011), на Второй научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, ноябрь

2011), на Восьмой Международной встрече по фармацевтике, биофармацевтике и фармацевтическим технологиям (Турция, Стамбул, март 2012), на Международной конференции TechConnect World (США, Санта-Клара, июнь

2012), на Международной конференции EuroNanoForum 2013 (Ирландия, Дублин, июнь 2013).

Апробация работы состоялась на межлабораторном семинаре лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии РАН 14 марта 2013 г., а также на заседании кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ им М.В.Ломоносова 21 марта 2013 г.

ЧАСТЬ 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Глава 1.1. Биодеградируемые полимеры медицинского назначения

В последние два десятилетия были исследованы многочисленные биоразлагаемые полимеры. С точки зрения применения, биоразлагаемые полимеры делятся на три группы: медицинского, экологического и двойного применения, в то время как с точки зрения происхождения они делятся на две группы: природные и синтетические. В качестве биоразлагаемых в научной литературе упоминают целый ряд полимеров: полиэфиры оксикарбоновых кислот (поли-3-оксиалканоаты, полилактиды, полигликолиды, поликапролактон), полиангидриды, полиалкилцианоакрилаты, полифосфазены, полифосфоэфиры, полиортоэфиры, некоторые полисахариды (хитозан, гиалуроновая кислота, агароза, декстран, альгинаты, хондроитинсульфат) и белки (коллаген, фибрин, фиброин щелка, желатин). Одними из наиболее исследуемых полимеров являются полилактиды, полигликолиды и их сополимеры [Штильман М.И., 2006; Дженкинс М., 2010].

Деградация полимеров обычно происходит в основном за счет разрыва о�