Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Визуализация и лазерная гипертермия биологических тканей с применением золотых плазмонно-резонансных наночастиц

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Визуализация и лазерная гипертермия биологических тканей с применением золотых плазмонно-резонансных наночастиц"

на правах рукописи

СИРОТКИНА МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ВИЗУАЛИЗАЦИЯ И ЛАЗЕРНАЯ ГИПЕРТЕРМИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЗОЛОТЫХ ПЛАЗМОННО-РЕЗОНАНСНЫХ НАНОЧАСТИЦ

Специальность 03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 ОКТ 2014

г. Пущино 2014 г.

005552991

Работа выполнена на кафедре биомедицины Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Нижегородский государственный университет имени Н.И. Лобачевского» (ННГУ им. Н.И. Лобачевского)

Научный доктор медицинских наук,

руководитель: Загайнова Елена Вадимовна

Официальные доктор биологических наук

оппоненты: Фельдман Татьяна Борисовна

доцент кафедры Молекулярной физиологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

доктор физико-математических наук, профессор Битюрин Никита Михайлович заведующий лабораторией «Лазерной наномодификации материалов» Института прикладной физики РАН

Ведущее учреждение: Государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра общей и медицинской биофизики

Защита диссертации состоится «¿¡? у> 2014 в -/3 часов Зо мин. на

заседании диссертационного совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук, созданном на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290 г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, д.З, ИТЭБ РАН, Большой конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290 г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, д.З, ИТЭБ РАН и. и^х иТЭБ Р/Ш: Шр://и*/. J4eg.ps». г«

Автореферат разослан «/&* 2014г.

Ученый секретарь диссертационного совета //

кандидат физико-математических наук ^'^¿-¿^ц/Р Ланина Н. Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

За последние десятилетия развитие нанотехнологий достигло больших успехов, в связи с этим открываются новые возможности и перспективы для биологии и медицины. Среди всего разнообразия наноразмерных агентов наибольший интерес для биомедицинских приложений представляют золотые плазмонно-резонансные наночастицы. Это обусловлено, с одной стороны, их уникальными физическими свойствами, а с другой стороны - безопасностью для живых объектов. Уникальность свойств заключается в способности к возбуждению локализованных поверхностных плазмонных резонансов в видимой и ближней ИК-области спектра, что приводит к усиленному поглощению и/или рассеянию лазерного излучения. Оптика наноструктур с плазмонным резонансом широко обсуждается в литературе [Kreibig U. et al 1995, Хлебцов Н.Г. и др. 2008, Матвеевская Н.А. и др. 2006, Haglund R.F. et al 2006].

Золотые плазмонно-резонансные наночастицы используются для оптической визуализации биологических тканей и термического повреждения. Изменяя размер и форму золотых плазмонно-резонансных наночастиц, можно настроить пик резонанса на нужную длину волны в так называемом «терапевтическом окне прозрачности» биологических тканей (700-1300 нм). В этой области основные поглотители биоткани, такие как вода, окси- и дезоксигемоглобин обладают малым коэффициентом поглощения, что позволяет излучению проникать в биоткани на глубину до 10 сантиметров. С другой стороны, современные диодные лазеры также работают в «терапевтическом окне прозрачности», что открывает возможность нагрева биоткани в глубине. Более того, с развитием новых оптических методов прижизненной визуализации биологических тканей появилась возможность неинвазивно контролировать накопление наночастиц внутри биологических тканей, с целью определения времени максимального их накопления в интересующей области для задач лазерной гипертермии.

Гипертермия, как метод термического повреждения биологических тканей, известна еще с древних времен, однако, с появлением современных лазерных систем и развитием нанотехнологий, получила новое развитие. При проведении гипертермии осуществляется нагрев ткани до температуры 41-47°С за десятки минут [Svaasand L.O. et al 1990]. При данной температуре имеет место селективное необратимое повреждение патологических клеток за счет снижения вязкости мембран и денатурации белков (при температуре 47 °С).

Лазерная гипертермия с наночастицами в настоящее время широко апробируется. Предполагается, что наночастицы избирательно накапливаются в патологическом очаге, в том числе в опухоли, поглощают лазерное излучение и усиливают тем самым лазерный нагрев [Lowery A. R. et. al. 2006]. Возможность лазерной гипертермии с применением золотых наночастиц демонстрируется преимущественно на клеточных культурах [Melancon М.Р. et al 2008, O'Neal D.P. et al 2004, Loo C. et al 2005]. На экспериментальных опухолях лабораторных животных повреждающий эффект достигается в основном за счет термоабляции ткани [Diagaradjane P., et al 2008, Terentuk et al 2009, Gobin et al 2007]. В то время как особый интерес представляет умеренный режим воздействия с минимальным повреждением здоровых тканей и индукцией апоптоза. Метод лазерной гипертермии биологических тканей с золотыми плазмонно-резонансными

наночастицами является перспективным, однако требует углубленного изучения и решения ряда вопросов.

Во-первых, не подобрано оптимальное сочетание наночастицы - лазер. Изучение по оптическим спектрам и расчеты по теории рассеяния Ми [O'Neal D.P. et al 2004, Gobin et al 2007] не дают ответа на вопрос, наночастицы с каким поглощением окажутся более эффективными при нагреве. Мы предлагаем на модельных системах изучать поглощающие свойства наночастиц по способности к нагреву, а рассеивающие свойства - по обратному рассеянию методом оптической когерентной томографии (ОКТ).

При использовании наночастиц важно каждый раз перед проведением лазерной гипертермии контролировать накопление наночастиц в биоткани с целью определения времени максимального накопления, что повысит эффективность лазерного нагрева. Для этого подходит метод оптической когерентной томографии, который позволяет по изменению обратного рассеяния биоткани прижизненно и неинвазивно оценить наличие в ней наночастиц. Имеющиеся на сегодняшний день методы количественной оценки содержания наночастиц в биотканях, такие как нейтрон-активационный анализ [James W.D. et al 2007], атомно-абсорбционная спектроскопия [Liu et al 2008, Terentyk G.S. et al 2009], электронная микроскопия применяются только в исследовательских целях, поскольку выполняются post mortem.

Другим важным аспектом проведения лазерной гипертермии является контроль внутренней температуры. Контролируемый нагрев позволит достичь высокого повреждающего эффекта патологической области и избежать при этом некроза здоровой ткани, возникающего при перегреве. Традиционным методом измерения температуры ткани является ИК-термография, обеспечивающая измерение температуры лишь на поверхности объекта. Методы измерения внутренней температуры в основном инвазивны, что является их серьезным недостатком [Van der Zee J et al 1998]. Перспективным решением может стать метод пассивной акустической термографии (ПАТ), основанный на регистрации акустических шумов от нагретого тела на глубину до 2 см. Однако его применимость продемонстрирована только на модельных системах [Субочев П.В. и др. 2010]. Поэтому развитие подходов к неинвазивному контролю температуры внутри ткани также представляет собой актуальную задачу.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы — изучить возможности оптической визуализации золотых плазмонно-резонансных наночастиц в биотканях и оценить эффективность лазерной гипертермии биологических тканей с золотыми плазмонно-резонансными наночастицами.

Для достижения поставленной цели нами решались следующие задачи:

1. Выбрать золотые плазмонно-резонансные наночастицы, обладающие как выраженными поглощающими свойствами для эффективной лазерной гипертермии, так и рассеивающими свойствами для контроля накопления методом оптической когерентной томографии;

2. Изучить возможности метода оптической когерентной томографии для визуализации накопления золотых плазмонно-резонансных наночастиц в биотканях и сопоставить полученные результаты с данными электронной микроскопии и атомно-абсорбционной спектроскопии;

3. Исследовать эффективность лазерной гипертермии с золотыми плазмонно-резонансными наночастицами методом ИК-термографии на поверхности биологической ткани и методом пассивной акустической термографии внутри биоткани;

4. Изучить действие лазерной гипертермии с золотыми плазмонно-резонансными наночастицами на экспериментальной биологической модели локального накопления наночастиц по структурным изменениям биоткани.

Научная новизна

Впервые изучались оптические свойства наночастиц по способности к лазерному нагреву и обратному рассеянию методом OKT.

Впервые на основе многостороннего изучения оптических свойств наночастиц подобраны оптимальные для визуализации накопления в биотканях методом ОКТ и лазерной гипертермии.

Впервые методом оптической когерентной томографии прижизненно в динамике наблюдали накопление золотых наночастиц в биотканях: в агаровом фантоме при поверхностном нанесении и экспериментальной биологической модели локального накопления наночастиц РШМ-5 при внутривенном введении. Установлено время максимального накопления наночастиц в экспериментальной биологической модели РШМ-5 - 4-5 часов.

Впервые предложили и апробировали неинвазивный метод пассивной акустической термографии для изучения изменения внутренней температуры биологической ткани во время лазерной гипертермии и оценки эффективности применения наночастиц для нагрева.

Лазерная гипертермия биологической ткани с плазмонно-резонансными наночастицами впервые выполнена с неинвазивным оптическим контролем накопления наночастиц и мониторингом внутренней температуры.

Научно-практическая значимость

Полученные результаты могут стать основой для дальнейшего изучения и поиска новых неинвазивных или малоинвазивных способов лечения социально-значимых заболеваний на основе лазерного воздействия и плазмонно-резонансных наночастиц. ,

Результаты ОКТ-исследования накопления плазмонно-резонансных наночастиц в биотканях показали, что они могут быть эффективными контрастными агентами для задач диагностики патологических очагов, активно их аккумулирующих.

Предложенная уникальная методика неинвазивного и эффективного контроля внутренней температуры биологических тканей при лазерном воздействии методом ПАТ может быть использована для контроля лечения, связанного с нагревом, независимо от вида излучения (лазерное, СВЧ, магнитное поле).

Основные результаты работы могут быть включены в соответствующие разделы спецкурсов и лекций курса по биомедицине и биофизике.

Научная новизна и практическая значимость исследования подтвернедены патентом:

Сироткина М, Загайнова Е., Ширманова М., Елагин В., Бугрова М., Жеглов А. Способ лечения опухолей лазерной гипертермией. Патент на изобретение №2425701 от 10 августа 2011.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Метод оптической когерентной томографии может визуализировать накопление золотых плазмонно-резонансных наночастиц в биологической ткани по изменению уровня сигнала обратного рассеяния, при условии совпадения пика плазмонного резонанса с длиной волны работы прибора и преобладании рассеивающих свойств наночастиц.

2. Золотые плазмонно-резонансные наночастицы с максимальными поглощающими свойствами демонстрируют наибольшую эффективность для лазерной гипертермии биоткани.

3. При выполнении лазерной гипертермии накопление в биологической ткани золотых наночастиц с соответствующим плазмонным резонансом повышает локальность и эффективность внутреннего нагрева, вызывает выраженные изменения в структуре биоткани.

Апробация работы

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на XII Международной школе молодых ученых и студентов по оптике, лазерной физике и биофотонике (Саратов, 2008); на Международной школе «Биофизика и биоэлектрохимия для медицины» (Румыния, 2009); на конкурсе молодых ученых в рамках II Международного форума по нанотехнологиям (Москва, 2009); на Международном симпозиуме «Topical problems of biophotonics-2009, 2011, 2013» (Нижний Новгород-Самара, 2009, Нижний-Новгород-Санкт-Петербург, 2011, Нижний Новгород-Ярославль, 2013); на VII Всероссийский съезд онкологов (Москва, 2009), где отмечены дипломом I степени; на VII и IX научных сессиях молодых ученых «Современное решения актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новгород, 2008, 2010); на Европейской конференции по биофотонике (Германия, 2009); на VII и VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Нижний Новгород, 2010, 2012); на III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010); на Всероссийской научной конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2008» (Москва, 2008); VIII научной сессии «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новгород, 2009); на Пленуме Научного совета по биологической физике "Биофизика и нанотехнологии. Проблемы и перспективы" (Пущино, 2010); на Европейской фотобиологической школе (Италия, 2010); на Международной Школе по Биофотонике (Швеция, 2011); на 27й ежегодной встрече европейского общества по гипертермии (Дания, 2011); на IV Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 25 работ, из них 10 в изданиях, рекомендованных ВАК. Получен 1 патент на изобретение.

Конкурсная поддержка работы

Проведенные исследования поддержаны проектами Федерального Агентства по Науке и Инновациям (02.512.11.2244, 02.740.11.0713), РФФИ (09-02-00539, 0902-97072, 09-02-12215), грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых № МД-3018.2009.7.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 140 страницах, включает 7 таблиц и 31 рисунок. Список литературы содержит 192 источника, из них 153 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Наночастины

В работе использованы золотые наночастицы, способные генерировать на поверхности плазмонный резонанс в поле плоской электромагнитной волны. Наличие поверхностно-плазмонного резонанса приводит к усиленному (резонансному) поглощению или рассеянию падающего лазерного излучения, частота которого совпадает с собственной частотой колебания электронов на поверхности наночастицы. Наночастицы были синтезированы в Институте химической физики РАН (Москва), в лаборатории проф. Надточенко В.А. Было изучено 19 образцов наночастиц:

1. Наносферы - 3 образца. Размер от 15 до 40 нм.

2. Нанооболочки, состоящие из ядра и оболочки - 5 образцов, в том числе с ядром БЮг и оболочкой Аи (3 образца), с ядром гЮ2 и оболочкой Аи (1 образец) и с ядром ТЮ2 и оболочкой Аи (1 образец). Размер ядер от 25 до 250 нм, размер оболочек от 5 до 25 нм.

3. Бипирамиды неправильной формы с острыми концами - 3 образца. Размер от 180 до 250 нм.

4. Наностержни - 8 образцов. Продольный размер от 50 до 75 нм, поперечный размер от 10-30 нм.

Для уменьшения агрегации все образцы наночастиц покрывали полиэтиленгликолем.

Фантом биотканей

В качестве фантома биотканей был использован агаровый гель с массовой долей агар-агара 0.5%. Для обеспечения диффузии наночастиц в фантоме концентрация агара подбирались так, чтобы размер пор в геле превышал размер наночастиц [Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. М. 1982].

Лабораторные животные

Работа выполнена на мышах линии СВА и СБ-1 обоего пола. Вес мышей 2025 г, возраст 6-8 недель. Общее количество животных - 105.

Изучение поглощающих свойств наночастиц и предварительный подбор режимов лазерного воздействия проводили на здоровых мышах линии CD-I (п=10) с подкожной инъекцией раствора наночастиц.

Для выполнения экспериментов по визуализации накопления золотых плазмонно-резонансных наночастиц в биологических тканях методом оптической когерентной томографии, количественной оценки содержания наночастиц в биотканях методом атомно-абсорбционной спектроскопии и опыты по изучению действия лазерной гипертермии с наночастицами использовали экспериментальную биологическую модель локального накопления золотых наночастиц. Такой моделью служила экспериментальная опухоль мышей рак шейки матки РШМ-5, перевитая мышам линии СВА (п=95).

Выбором модели послужила возможность ее трансплантации поверхностно внутрь кожи, это важно для визуализации методом ОКТ, и накопление в ней наноразмерных частиц из-за наличия кровеносных капилляров синусоидного типа, имеющих стенку с большими фенестрами.

ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Спектры экстинкции наночастиц регистрировали на спектрофотометре SPECORD 250 (Германия) в стандартной кварцевой кювете. Длина оптического пути 10 мм, шаг 2 нм.

Поглощающие свойства наночастиц изучали на модели подкожной инъекции наночастиц. Такая модель, в отличие от нагрева пробирки с раствором наночастиц и желатинового фантома, содержащего наночастицы, наиболее соответствует модели опухоли с наночастицами, поскольку учитывает теплопроводность и процесс отведения тепла кровеносной системой. Раствор наночастиц вводили подкожно. На этот участок воздействовали лазером: длина волны 810 нм, 1,2 Вт/см2, 2 минуты. Контролем служил нагрев кожи без наночастиц. На графике зависимости температуры от времени строили касательную к кривой. Касательная описывалась уравнением прямой:

У-Уо=к(х-хо), где у=Т, у0= Т0 , x=t, х0= to

T-To=k(t-to),

где t0=0

T-T0=kt

k=(T-T0)/t

Затем определяли Д к по формуле: Д к =кгк0(°С/мин)

где ki - скорость нагрева кожи с подкожной инъекцией наночастиц к0 - скорость нагрева кожи без наночастиц

Чем выше значение Д к, тем большим поглощением обладают наночастицы, а значит лучше конвертируют световую энергию в тепловую. Для экспериментов по лазерному воздействию использовали наночастицы с высоким значением Д к.

Для изучения рассеивающих свойств получали ОКТ изображение раствора наночастиц и воды. Находили разность (Д1) между интенсивностью ОКТ-сигнала раствора наночастиц (I) и воды (10). Чем больше значение Д1, тем большим обратным рассеянием обладают наночастицы. Для ОКТ-исследования отбирали наночастицы с наибольшим значением Д1.

Визуализация золотых плазмонно-резонансных наночастиц в биотканях (агаровый фантом и экспериментальная биологическая модель локального накопления наночастиц) выполнена методом OKT. Технические характеристики ОКТ прибора (ИПФ РАН, г. Нижний Новгород): рабочая длина волны 900 нм, пространственное разрешение по глубине 15-20 мкм, сканирование по глубине до 1,5 мм. Скорость получения изображения 2 сек. Размер ОКТ-изображения 200x200 пикселей. Диаметр волоконно-оптического зонда 2,7 мм [Геликонов В.М. и др 2003].

Для ОКТ-исследования на агаровом фантоме растворы золотых наночастиц наносили на поверхность фантома однократно в виде капли объемом 250 мкл. С помощью специального держателя ОКТ-зонд устанавливали в вертикальном положении на расстоянии 0.15-0.2 мм от поверхности геля, что позволило избежать повреждения геля и минимизировало артефакты движения. Наблюдали динамику проникновения наночастиц в пористый гель методом OKT. ОКТ-наблюдение проводили до нанесения раствора наночастиц, затем в течение 7 часов поле нанесения с интервалом 1 час и через 24 часа.

ОКТ-исследование локального накопления наночастиц в экспериментальной биологической модели РШМ-5 выполнено на самках мышей линии СВА. Экспериментальную биологическую модель РШМ-5 перевивали поверхностно в кожу. Раствор золотых плазмонно-резонансных наночастиц вводили в хвостовую вену в дозе 250 мкг/кг всегда в строго фиксированный промежуток времени, для минимизации влияния суточных ритмов животных на кинетику накопления наночастиц внутри биологических тканей. Перед экспериментом животное фиксировали на специальной подставке, предварительно удалив волосяной покров с поверхности исследуемого участка. ОКТ-изображения регистрировали до введения наночастиц, а затем каждые 30 минут в течение 7 часов. Для получения изображения ОКТ-зонд устанавливали на поверхности узла с небольшим дозированным прижимом. В каждой временной точке получали по 3 изображения. Для сравнения ОКТ-изображения получали с соседнего здорового участка кожи (нормальная ткань).

Количественная обработка ОКТ-изображений производилась в программе PresToBar. Поскольку агаровый гель представляет собой однородную прозрачную среду и зондирующее излучение проходит вглубь практически без затухания, то в качестве области усреднения выделяли ОКТ-изображение целиком (рис. 1а). Оценивали возрастание интенсивности сигнала обратного рассеяния после нанесения раствора золотых наночастиц. Всего получено и обработано 66 ОКТ-изображений агарового фантома.

При анализе ОКТ-изображений экспериментальной биологической модели РШМ-5 в верхней части изображения выделяли горизонтально-ориентированную область (рис. 16). Размер и местоположение области были постоянными для всех ОКТ-изображений. Выбор области усреднения обусловлен высоким уровнем полезного сигнала на изображении на глубине до 300 мкм. В программе PrestoBar получали усредненное значение интенсивности сигнала обратного рассеяния в дБ для каждой временной точки. Из полученной интенсивности сигнала обратного рассеяния вычитали исходный уровень сигнала обратного рассеяния (до применения наночастиц). ОКТ-изображения, полученные от одного животного, можно сравнивать между собой, поскольку ОКТ-исследования проводились каждый раз при одних и тех же настройках прибора, после предварительной

калибровки. Описание и численную обработку ОКТ-изображений проводили согласно «Руководству по оптической когерентной томографии» [Гладкова Н.Д. и др., 2007]. Количественно обработаны ОКТ-изображения экспериментальной биологической модели РШМ-5 без наночастиц (п=72) и ОКТ-изображения экспериментальной биологической модели РШМ-5 с наночастицами (п=120).

Для изучения селективности накопления наночастиц в экспериментальной биологической модели РШМ-5 сравнивали возрастание интенсивности сигнала обратного рассеяния экспериментальной биологической модели РШМ-5 и кожи. ОКТ-изображения кожи получали с участка на бедре у животных, которым наночастицы не вводили (кожа без наночастиц) и у животных с введенным внутривенно раствором наночастиц (кожа с наночастицами). Обработано 72 ОКТ-изображения кожи без наночастиц и 120 ОКТ-изображений кожи с наночастицами.

б

Рисунок 1. Пример выделения областей усреднения для количественной оценки: а - для ОКТ-изображений фантома, б - для ОКТ - изображений экспериментальной биологической модели РШМ-5.

Накопление золотых наночастиц в биотканях подтверждали методом трансмиссионной электронной микроскопии. Животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом. Ультратонкие срезы исследовали в электронном микроскопе Morgagni-280D. Образцы экспериментальной биологической модели забирали на анализ через 5 часов и 24 часа. Органы животных: печень, почку, селезенку, мышцу, кожу, а также кровь и мочу для исследования механизмов выведения наночастиц из организма забирали через 5 часов, 24 часа, 7 суток и 14 суток после инъекции наночастиц. Полуколичественную оценку накопления наночастиц в биотканях выполняли следующим образом: подсчитывали количество наночастиц, найденных в 20 полях зрения. Размер 1 поля зрения 37x37 мкм.

Количественную оценку накопления наночастиц в биотканях животных выполнили методом атомно-абсорбционной спектроскопии с электротермической атомизацией. Работа выполнена совместно с сотрудниками кафедры фотохимии и спектроскопии химического факультета ННГУ. Органы и ткани животных (экспериментальную биологическую модель РШМ-5, почку, селезенку, мышцу, кожу) забирали через 5 часов и 24 часа после введения наночастиц (п=3). Органы и ткани животных высушивали при температуре 105-115°С, озоляли в муфельной печи при температуре 700°С в течение 2 часов. Наночастицы золота растворяли смесью азотной и хлористоводородной кислот (2мл, 1:3 об./об.). После этого кислоты выпаривали. Затем приливали по 2 мл раствора хлористоводородной кислоты (1:1 об./об.). Кислоту выпаривали и эту процедуру выполняли еще раз. Образовавшийся при растворении хлорид золота растворяли в 2мл 1% хлористоводородной кислоты. В этом растворе определяли концентрацию наночастиц золота.

Анализ образцов тканей и органов животных выполняли на спектрофотометре Shimadzu АА-6800 с электротермическим атомизатором GFA-6500 на длине волны 242,8 нм. Использовали графитовую кювету с пиропокрытием. Для устранения влияния неселективного поглощения на результаты анализа применяли дейтериевый корректор. Источником излучения служила лампа с полым катодом L-233 (HAMAMATSU PHOTONICS).

Апробация лазерной гипертермии с золотыми плазмонно-резонансными наночастицами выполнена на модели мягких биологических тканей, способных локально накапливать наночастицы, которой является экспериментальная биологическая модель мышиного рака шейки матки РШМ-5.

Исследования начинали, когда одиночный узел был сформирован и достигал 7-10мм. Животных разделили на группы:

Опытная группа I - проводили лазерную гипертермию с золотыми плазмонно-резонансными наночастицами (п=27)

Опытная группа II - проводили лазерную гипертермию без применения золотых плазмонно-резонансных наночастиц (п=27)

Опытная группа III - вводили золотые плазмонно-резонансные наночастицы без выполнения лазерной гипертермии (п=6)

Контрольная группа - интактные животные (п=22)

Каждый раз при выполнении экспериментов по лазерной гипертермии, разнесенных во времени, была сделана своя контрольная группа. Это необходимое условие, позволяющее учитывать сезонные ритмы экспериментальных животных, которые способны оказывать влияние на кинетику роста узла экспериментальной биологической модели РШМ-5.

Предварительно исследовали влияние наночастиц на кинетику роста узла экспериментальной биологической модели РШМ-5 (п=6).

На экспериментальную биологическую модель РШМ-5 воздействовали локально лазерным излучением с плотностью мощности 1.2-1.5 Вт/см2, в зависимости от размера и начальной температуры узла. Лазерный пучок покрывал весь узел и затрагивал немного окружающую здоровую ткань (диаметр лазерного пучка 1-1.2 см). Поверхностную температуру экспериментальной биологической модели РШМ-5 поддерживали на постоянном уровне 44-45 °С в течение 20 минут, варьируя значение выходной мощности лазера. Лазерную гипертермию проводили под непрерывным контролем поверхностной температуры ИК-термографом ИРТИС 2000МЕ (ООО «ИРТИС», Москва). Температурное разрешение 0,02°С, точность измерения ±0,5°С. Время формирования кадра 3,2 сек.

Наблюдение за изменением внутренней температуры экспериментальной биологической модели РШМ-5 во время лазерной гипертермии проводили методом ПАТ. Для этого использовали оригинальный пассивный акустический термометр, разработанный в Институте прикладной физики РАН (Нижний Новгород). Измерительная часть установки состояла из дискового акустического датчика и двух контактных электронных датчиков температуры. Дисковый акустический датчик (апертура 8 мм, рабочая частота 0.5-4.5 МГц) размещался на стороне, противоположной лазерному нагреву и регистрировал интенсивность теплового акустического шума, излучаемого биотканью при лазерном нагреве на глубине до 2 см. Один контактный датчик температуры находился на поверхности биоткани со стороны лазерного воздействия и измерял абсолютную термодинамическую температуру в области максимального нагрева. Второй контактный датчик

размещали с противоположной стороны. Измеренную интенсивность акустического шума пересчитывали во внутреннюю температуру с использованием ранее проделанной калибровки по эталонным однородно нагретым биоподобным объектам [Субочев П.В. и др. 2010]. На основе результатов, полученных методом ПАТ, рассчитывали тепловую дозу по формуле, взятой из работы [Sapareto, S.A., 1984]:

Где TD- тепловая доза, tmax- общее время нагрева, T(t) - зависимость от времени температуры поверхности для тепловой дозы поверхности или зависимость от времени внутренней температуры для внутренней тепловой дозы, R -коэффициент, равный 0,5, в случае если 7"(/)>43°С и 0,25, в случае если T(t)< 43°С.

Влияние золотых плазмонно-резонансных наночастиц на деструктивное действие лазерной гипертермии изучали по кинетике роста узла экспериментальной биологической модели РШМ-5. Поскольку экспериментальная биологическая модель РШМ-5 представляет собой опухолевую ткань, характеризующуюся неконтролируемым активным ростом, то основным критерием положительного действия на нее какого-либо вида воздействия является показатель торможения роста опухоли (ТРО,%) относительно контрольной группы более чем на 50% Размер узла по двум взаимно перпендикулярным направлениям измеряли ежедневно с помощью штангенциркуля. Рассчитывали объем и показатель ТРО, % по формулам:

V(cm3)= a*b2/2, где

а-длина, Ь-ширина

ТРО(%)=( Vk-Vo)/V к* 100, где

Vk- средний объем узла в контрольной группе

Vo- средний объем узла в опытной группе

Верификацию повреждающего действия лазерной гипертермии с наночастицами на структуру биоткани выполнили на экспериментальной биологической модели РШМ-5 методом световой микроскопии. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином и изучали с помощью микроскопа Leica DM 1000. Для морфологического исследования образцы биоткани забирали через разные временные точки после лазерного воздействия: 1, 3, 7 суток. Для количественной оценки морфологических изменений в экспериментальной биологической модели РШМ-5 в ее структуре были выделены три области -плотной жизнеспособной ткани, разрежения и некроза. Количественную оценку изменений биоткани на гистологическом препарате проводили с помощью окулярной стереометрической сетки Автандилова [Автандилов Г.Г. 1990]. При увеличении в 28 раз подсчитывали количество квадратов сетки, занятых плотной жизнеспособной тканью, областью разрежения и участками некроза. На каждой временной точке проанализировано по 5 образцов экспериментальной биологической модели РШМ-5. Из каждого узла анализировали по три гистологических среза, взятых из центра. На каждом срезе было от 10 до 20 полей зрения. Результат выражали в процентах от общего количества квадратов сетки, попавших на срез узла.

о

Статистическую обработку результатов проводили с использованием встроенного пакета статистического анализа MS Excel 2010 и Statistica 6.0. Статистически значимые различия между исходным уровнем интенсивности сигнала обратного рассеяния и уровнем интенсивности сигнала обратного рассеяния в динамике через определенные промежутки времени, а также различия в структурных изменениях после лазерной гипертермии экспериментальной биологической модели РШМ-5 с наночастицами и без наночастиц выявляли с помощью непарного t-теста Стьюдента. В работе определяли средние значения (М) измеряемых величин и стандартные отклонения среднего (±SD). Для выявления различия между объемом узла экспериментальной биологической модели РШМ-5 после лазерного воздействия у разных групп животных использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Определяли медиану, 25- и 75 процентили. Статистически значимыми считали различия при уровне значимости р

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Выбор вида наночастиц для лазерного воздействия и ОКТ-исследования

Наночастицы выбирались для двух задач: для лазерной гипертермии биологических тканей и визуализации накопления наночастиц в биологических тканях методом OKT. Для лазерной гипертермии наночастицы должны усиленно поглощать на длине волны работы лазера (800 нм), а для ОКТ-исследования важно, чтобы золотые наночастицы обладали резонансным рассеянием на длине волны работы ОКТ-прибора (900 нм).

Критериями выбора наночастиц для ОКТ-исследования и лазерной гипертермии служили: пик поверхностного плазмонного резонанса на длине волны 800-900 нм; наибольшее значение А к, большое значение А I.

В результате анализа спектров экстинкции были отобраны те наночастицы, которые имели пик плазмонного резонанса на длине волны 800-900 нм (16 из 19 образцов).

Расчет значений А к, показал, что из 16 образцов поглощающими свойствами обладают 7 образцов. Однако для лазерной гипертермии были отобраны наночастицы с самым большим значением А к: 10.4 °С/мин (наностержни размером 60/15 нм), 7.8 °С/мин (наностержни размером 50/10 нм) и 3.03 °С/мин (бипирамиды размером 200 нм).

Анализ рассеивающих свойств наночастиц методом ОКТ показал, что резонансным рассеянием обладают 2 образца из 16: нанооболочки Si02/Au размером 250/25 нм с AI 25дБ, и бипирамиды диаметром 200 нм с AI 22дБ.

Исходя из спектров экстинкции, данных о нагреве частиц и обратном рассеянии, из 19 проанализированных образцов для дальнейших исследований было отобрано 4. Подробные сведения о выбранных наночастицах представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Характеристика выбранных золотых плазмонно-резонансных наночастиц

Наночастицы Пик экстинкции/ полуширина спектра, нм Размер наночастиц, нм AI, дБ Д к, °С/мин Приложения

Нанооболочки Si02/Äu 850/100 250/25 25 0,35 ОКТ-визуализация

Бипирамиды 800/120 200 22 3,03 1. ОКТ-визуализация 2. Лазерная гипертермия

Наностержни образец №1 850/50 50/10 3 7,8 Лазерная гипертермия

Наностержни образец №2 775/70 60/15 1 10,4 Лазерная гипертермия

Таким образом, изучив поглощающие свойства наночастиц по способности к нагреву и рассеивающие свойства методом ОКТ, обнаружили, что крупные наночастицы (нанооболочки 250/25 нм) преимущественно рассеивают лазерное излучение, мелкие наночастицы (наностержни 50/10 и 60/15 нм) преимущественно поглощают лазерное излучение. У наночастиц среднего размера (бипирамиды 200 нм) вклад в общую экстинкцию вносят и поглощение и рассеяние.

ОКТ-визуализация золотых плазмонно-резонансных наночастиц в фантоме биоткани

На агаровом фантоме изучили возможность визуализации золотых плазмонно-резонансных наночастиц внутри биоткани и процесс диффузии в полужидкую пористую среду. В работе исследовали золотые нанооболочки (250/25нм) и бипирамиды (200 нм), характеризующихся выраженными рассеивающими свойствми на длине волны работы ОКТ-прибора.

На рисунке 2 приведена динамика процесса диффузии золотых нанооболочек и бипирамид в агаровый фантом после поверхностного нанесения. Агаровый фантом до нанесения золотых рассеивающих наночастиц характеризовался однородным низким уровнем интенсивности сигнала обратного рассеяния (рис.

S3 S 5ESSS SS . wSSm

щршиЯ iм мНу?

швшйнна!

б в

г Д

Рисунок 2. ОКТ-визуализация процесса диффузии золотых наночастиц в агаровый фантом с концентрацией агара 0.5% и диаметром пор более 120 нм: а - фангом до нанесения растворов наночастиц; б, в - через 3 и 24 часа после нанесения нанооболочек (250/25нм); г, д - через 2 и 24 часа после нанесения раствора бипирамид (200нм). 1 -поверхность ОКТ-зонда, 2 - пространство между зондом и поверхностью фантома, 3-фантом.

Проанализировав ОКТ-изображения фантомов через разное время после применения золотых наночастиц, и проведя численную обработку ОКТ-

изображений, выявили, что по интенсивности сигнала обратного рассеяния достоверных отличий между разными видами наночастиц нет. Максимальное изменение интенсивности сигнала обратного рассеяния после нанесения нанооболочек составило 4,6 дБ, а после нанесения бипирамид 3,95 дБ. Однако было отмечено, что динамика проникновения наночастиц внутрь агарового геля заметно отличалась друг от друга. Нанооболочки только к 3 часам начали диффундировать внутрь фантома, приводя к повышению уровня сигнала обратного рассеяния (рис. 26). К 24 часам наблюдения на ОКТ-изображении можно было увидеть отдельные яркие области рассеяния как в верхней части ОКТ -изображения, так и в средней, что свидетельствует в пользу того, что нанооболочки до этого времени продолжают оставаться в толще фантома (рис. 2в). В отличие от нанооболочек, скорость проникновения бипирамид в пористый агаровый фантом была значительно больше, что объясняется более мелкими размерами бипирамид (200 нм). К 2 часам наблюдения ОКТ-изображение было однородно заполнено рассеивающими частицами (рис. 2г). Через 24 часа после нанесения бипирамид изменение интенсивности сигнала обратного рассеяния сократилось с 3.95 дБ до 1.1 дБ, следовательно, бипрамиды почти полностью диффундировали в нижнюю часть фантома (рис. 2д).

В результате было сделано заключение, что нанооболчки, так же как и бипирамиды хорошо визуализируются в биотканях методом ОКТ. Однако золотые бипирамиды в виду более мелкого размера быстрее проникают через поры внутрь геля. Более того, они обладают не только рассеивающими, но поглощающими свойствами, поэтому именно золотые бипирамиды выбраны для ОКТ-исследования накопления в биологической ткани.

ОКТ-визуализация накопления золотых бипирамид в экспериментальной биологической модели локального накопления золотых наночастиц.

Установлено, что до введения наночастиц ОКТ-изображение узла экспериментальной биологической модели РШМ-5, характеризовалось средним уровнем интенсивности сигнала обратного рассеяния (рис. За). Накопление наночастиц в биоткани привело к возрастанию уровня интенсивности сигнала обратного рассеяния на ОКТ-изображении. Через 2-2.5 часа после применения наночастиц отмечалось незначительное увеличение - интенсивности сигнала обратного рассеяния. ОКТ-изображения с наибольшим уровнем интенсивности сигнала обратного рассеяния регистрировали через 4-5 часов, что, вероятно, соответствовало максимуму накопления наночастиц в экспериментальной биологической модели РШМ-5 (рис. 36).

а б в

Рисунок 3. ОКТ - изображения экспериментальной биологической модели РШМ-5 через разное время после введения наночастиц: а — 0 часов, 6-4 часа, в - 7 часов. 1-тонкий слой эпидермиса, 2 — опухолевая ткань. Пунктиром показаны области усреднения для численной обработки изображения.

Численная обработка изображений подтвердила нарастание интенсивности сигнала обратного рассеяния в экспериментальной биологической модели РШМ-5

при накоплении наночастиц. Статистически значимые отличия обнаружены между группами экспериментальной биологической модели РШМ-5 с наночастицами и экспериментальной биологической модели РШМ-5 без наночастиц в каждой временной точке. Это свидетельствует о процессе накопления наночастиц в биоткани. Селективность накопления подтверждается тем, что разница в интенсивности сигнала обратного рассеяния экспериментальной биологической модели РШМ-5 с наночастицами и нормальной ткани (кожи) с наночастицами в период от 3 до 5 часов также статистически значима. Наибольшее значение интенсивности сигнала обратного рассеяния в группе «экспериментальная биологическая модель РШМ-5 с наночастицами» отмечено через 4 часа и составило 10,73± 0,99 дБ.

(, ■ опухольс наночастицами

1 ? 3 1 5 6 7

время после инъекциинаночастиц, часы

Рисунок 4. Кинетика изменения интенсивности сигнала обратного рассеяния на ОКТ-изображениях экспериментальной биологической модели РШМ-5 без наночастиц (п=72), экспериментальной биологической модели РШМ-5 с наночастицами (п=120), кожи без наночастиц (п=72) и кожи с наночастицами (п=120). Нулевая точка - это временная точка до применения наночастиц (исходный уровень сигнала). ""-Статистически значимое отличие от группы экспериментальная биологическая модель РШМ-5 без наночастиц, **-статистически значимое отличие от группы кожа с наночастицами. Критерий непарный г-тест Стьюдента. Уровень значимости Р<0.05.

Методом электронной микроскопии наночастицы обнаружены внутри опухолевых клеток: в цитоплазме, в ядре, в аппарате Гольджи, в митохондриях (рис. 5).

Рисунок 5. Электронные микрофотографии экспериментальной биологической модели РШМ-5: а - бипирамиды внутри опухолевой клетки через 5 часов после инъекции.

Ув. 36000; б - бипирамиды внутри митохондрии опухолевой клетки через 24 часа после инъекции. Ув. 18000.

Через 5 часов в 20 полях зрения найдено 7 наночастиц, через 24 часа - 2 наночастицы (табл. 2). Также методом электронной микроскопии установили, что наночастицы практически полностью выводятся из организма к 14 суткам (табл. 2). Выведение наночастиц происходит преимущественно через печень и почки.

Таблица 2.

Полуколичественная оценка биораспределения наночастиц методом электронной микроскопии_

Количество наночастиц в 20 полях зрения, шт.

Органы и ткани 5 ч 24 ч 7 дней 14 дней

Экспериментальная биологическая модель РШМ-5 7 2

печень 2 4 1 -

селезенка 2 - - -

почки 3 - 1 1

мышцы 1 - 1 -

кожа - 1 - -

моча 10 - - -

кровь 10 2 - -

Количественная оценка накопления наночастиц в органах и тканях экспериментальных животных с экспериментальной биологической моделью РШМ-5 атомно-абсорбционным методом подтвердила данные ОКТ-исследования и электронно-микроскопического исследования о том, что через 5 часов после внутривенного введения наночастицы накапливаются в экспериментальном узле (табл.3). Концентрация наночастиц через 5 часов была почти в 2 раза больше, чем через 24 часа. Также была подтверждена селективность накопления наночастиц в экспериментальной биологической модели РШМ-5 по отношению к окружающим нормальным тканям (мышцы и кожа). Атомно-абсорбционным методом наряду с электронно-микроскопическим анализом установлено, что наночастицы выводятся из организма печенью и почками.

Таблица 3.

Концентрация золотых наночастиц в органах и тканях экспериментальных животных по данным атомно-абсорбционной спектроскопии_

Органы и ткани Концентрация наночастиц мкг/г сухого веса

5 часов 24 часа

экспериментальная биологическая модель РШМ-5 0,60±0,19 0,32±0,9

печень 0,25±0,08 0,59±0,16

селезенка 0,29±0,06 0,1±0,01

почки 0,23±0,08 0,28±0,07

мышцы 0,06±0,015 0,01±0,001

кожа 0,09±0,02 0,02±0,001

Таким образом, методом электронной микроскопии и атомно-адсорбционной спектроскопии удалось подтвердить, что золотые наночастицы действительно накапливаются в опухолевой ткани к 5 часам поле внутривенной инъекции. Следовательно, наблюдаемое на ОКТ-изображениях возрастание сигнала

обратного рассеяния было связано с наличием золотых наночастиц в экспериментальной биологической модели РШМ-5. Время максимального накопления наночастиц в экспериментальном узле составляет 4-5 часов. Это время является оптимальным для лазерной гипертермии.

Изучение эффективности лазерной гипертермии с золотыми наночастицами на поверхности биоткани методом ИК-термографии

Методом ИК-термографии зафиксировано изменение температуры экспериментальной биологической модели РШМ-5 и окружающих здоровых тканей во время лазерной гипертермии. На рисунке 6 видно, что во время локального лазерного воздействия на экспериментальный узел происходит нагрев окружающих здоровых тканей. На ИК-термограммах оценивали изменение температуры в центре узла, т.е. в максимально нагретой точке и изменение температуры окружающей нормальной ткани на расстоянии 3 мм от края лазерного пучка (точки показаны на рис.6 стрелками). Такой выбор обусловлен тем, что, с одной стороны, в этом месте исключено прямое попадание лазерного излучения, а с другой стороны, происходит нагрев за счет теплопроводности и оттока тепла кровеносной системой.

Отношение изменения температуры экспериментальной биологической модели РШМ-5 к изменению температуры в нормальной ткани в конце сеанса лазерной гипертермии для опытной группы II (без наночастиц) составляло 2,6±0,3, а для опытной группы I (с наночастицами) - 4,4±1,4. Это свидетельствует в пользу того, что наночастицы являются эффективными термосенсибилизаторами, обеспечивая селективность нагрева, в то время как в отсутствии наночастиц происходит нагрев нормальной ткани.

^ '34.37

'34.95 4*1.29

Рисунок 6. Изменение поверхностной температуры экспериментальной биологической модели РШМ-5 во время лазерной гипертермии: а - опытная группа I (с наночастицами); б - опытная группа II (без наночастиц). Слева направо: до включения лазера; через 1.5 минуты после включения лазера; момент достижения 44°С; конец

воздействия. Пунктирной линией отмечена экспериментальная модель РШМ-5. Диаметр лазерного пучка на 2 мм больше.

Изучение эффективности лазерной гипертермии с золотыми наночастицами внутри биоткани методом пассивной акустической термографии

Методом ПАТ установили, что внутренняя температура экспериментальной биологической модели РШМ-5 в опытной группе I (с наночастицами) в процессе лазерной гипертермии достигла 43-45°С, т.е. была сопоставима с температурой на поверхности. В то время как в опытной группе II (без наночастиц), внутренняя температура не превышала 40°С (рис.7), что не входит в температурный диапазон гипертермии 41-47°С [Зуаавапс! 1_.0. е1 а1 1990].

На основе данных, полученных методом ПАТ, были рассчитаны тепловые дозы, полученные в ходе лазерной гипертермии на поверхности и внутри для биоткани с наночастицами и без наночастиц. Получили, что средняя тепловая доза поверхности в обеих опытных группах (без наночастиц и с наночастицами) практически совпадают и составляют примерно 55 минут. Очевидно, это связано с тем, что лазерную гипертермию проводили при одних и тех же температурных и временных условиях. Однако внутренняя тепловая доза в опытной группе I (с наночастицами) составила 25,2± 5,3 минуты, что почти в 5 раз превысило внутреннюю тепловую дозу для опытной группы II (без наночастиц) - 4,5±1,3 минуты.

а б

Рисунок 7. Мониторинг изменения температуры экспериментальной биологической модели РШМ-5 во время лазерной гипертермии: а - группа без наночастиц, б - группа с наночастицами. Красная линия - температура на поверхности со стороны лазерного излучения (Гтах); синяя линия - поверхностная температура на противоположной от лазерного воздействия стороне (Тт\а); черная линия - внутренняя температура (Га).

Оценка действия лазерной гипертермии с золотыми плазмонно-резонансными наночастицами на экспериментальную биологическую модель локального накопления золотых наночастиц по кинетике роста узла.

Анализ кинетики роста узла экспериментальной биологической модели РШМ-5 в контрольной группе и опытной группе без лазерной гипертермии с введением золотых плазмонно-резонансных наночастиц в течение 7 дней показал, что золотые плазмонно-резонансные наночастицы при внутривенном введении в дозе 250 мкг/кг не влияют на кинетику роста экспериментальной модели РШМ-5

Изучено влияние золотых плазмонно-резонансных наночастиц на повреждающее действие лазерной гипертермии. Анализ кинетики роста узла экспериментальной биологической модели РШМ-5 через 7-14 дней после воздействия показал, что золотые наночастицы, обладающие одновременно хорошими рассеивающими и поглощающими свойствами (бипирамиды 200 нм), не оказывали дополнительного действия. Статистически значимого отличия в кинетике роста узла экспериментальной биологической модели РШМ-5 между опытной группой I (лазерная гипертермия с наночастицами) и опытной группой II (лазерная гипертермия без наночастиц) не обнаружено.

Применение наностержней размером 50/10 нм и значением Дк 7.8°С/мин для лазерной гипертермии привело к торможению роста узла экспериментальной модели на 51% на 7-й день после лазерного воздействия. Статистически значимого отличия от контрольной группы и опытной группы II (лазерная гипертермия без наночастиц) не наблюдали.

Лазерная гипертермия экспериментальной модели РШМ-5 с наностержнями размером 60/15 нм и значением Дк 10.4°С/мин оказало наиболее выраженное положительное действие, что вероятно обусловлено более эффективной конвертацией световой энергии в тепловую. Положительное действие заключалось в достоверном замедлении темпа роста узла экспериментальной биологической модели РШМ-5. Объем узла не менялся на протяжении первых восьми дней после лазерной гипертермии (рисунок 29). На 14-й день после воздействия показатель ТРО составил 72%. В период с 10 по 14 день после воздействия наблюдали статистически значимое отличие от контрольной группы и опытной группы II (лазерная гипертермия без наночастиц).

РШМ-5 после лазерной гипертермии с наностержнями 60/15 нм. Красный график -опытная группа I (лазерная гипертермия с наночастицами); синий график опытная группа II (лазерная гипертермия без наночастиц); черный график -контрольная группа (интактные животные). Каждое значение представлено медианой (25- и 75 процентили). *-статистически значимое отличие от контрольной группы, ** - статистически значимое отличие от опытной группы (лазерная гипертермия без наночастиц). Непараметрический критерий Манна-Уитни. Уровень значимости Р<0.05. п=5.

Оценка действия лазерной гипертермии с золотыми плазмонно-резонансными наночастицами на структурные изменения биологической ткани

Оценка деструктивных изменений биологической ткани после лазерной гипертермии золотыми наночастицами выполнена на экспериментальной биологической модели локального накопления наночастиц рак шейки матки мышей РШМ-5. Структуру биоткани изучали на 1, 3 и 7 сутки после лазерной гипертермии. Наиболее значимые изменения отмечены на 3 сутки. При морфологическом анализе гистологических препаратов экспериментального узла РШМ-5 в ответ на лазерное воздействие количественно оценивали три области опухолевой ткани: плотная жизнеспособная ткань, область разрежения и область некроза (рис.9). Плотная жизнеспособная опухолевая ткань состояла из клеток разной величины с крупными ядрами и слабо базофильной цитоплазмой. В экспериментальной биологической модели РШМ-5 содержатся немногочисленные мелкие тонкостенные сосуды синусоидного типа. В области разрежения опухолевые клетки обособлены друг от друга, уменьшены в размерах, округлой формы. Ядра клеток темноокрашенные, цитоплазма уплотнена, темно-розового цвета, что соответствует некробиотическим изменениям. Некротическая область -это зона погибших опухолевых клеток: очертания клеток сохранены, ядра разрушены (кариолизис).

Рисунок 9. Гистологический препарат экспериментальной модели РШМ-5 на третьи сутки после лазерной гипертермии с наностержнями размером 60/15 нм. Окраска гематоксилин и эозин: 1- плотная жизнеспособная опухолевая ткань, 2 -некроз, 3 - область разрежения опухолевой ткани.

Количественная оценка морфологических изменений показала, что на третьи сутки после лазерной гипертермии опухолевый узел в контрольной группе состоял из плотной жизнеспособной опухолевой ткани на 64,8 %. Лазерное воздействие привело к уменьшению процента плотной жизнеспособной ткани и расширению зоны разрежения. Следует отметить, что применение наночастиц для лазерного воздействия привело к более обширным зонам поражения. Так, зона разрежения

увеличилась почти в 2 раза, статистически значимо увеличилась площадь некрозов, процент жизнеспособной опухолевой ткани составил всего 35,9%, что почти в 2 раза меньше чем в контрольной группе без воздействия (рис. 10).

контрольная группа

группа II без нзночзстиц

время после воздействия, дни

а

Б 35

О а?

3 5*5

1

о 5

■ контрольная группа 0 опытная группа II без наночастиц О опытная группа I с наночастицаму

В

30,4

лЬ

время после воздействия, дни

■ контрольная группа В опытная группа II без наночастиц

время после воздействия, дни

В

Рисунок 10. Сравнительный анализ деструктивных изменений в экспериментальной биологической модели РШМ-5 в контрольной группе, опытной группе I (с применением наночастиц) и опытной группе II (без применения наночастиц) на 1, 3 и 7 сутки после лазерной гипертермии: а - объемная площадь плотной жизнеспособной опухолевой ткани, б - объемная площадь области разрежения опухолевой ткани, в - объемная площадь области некроза. *-

статистически значимое отличие от контрольной группы, ** - статистически значимое отличие от опытной группы II (без применения наночастиц). Критерий непарный t-тест Стыодента. Уровень значимости Р<0.05. п=5.

Заключение

В работе изучены оптические свойства 19 образцов плазмонно-резонансных золотых наночастиц, синтезированных в форме наносфер, нанооболочек, бипирамид и наностержней с целью подбора оптимальных наночастиц для задач оптической визуализации накопления в биотканях и лазерной гипертермии. Оптические свойства изучались путем анализа спектров экстинкции, исследования рассеивающих свойств растворов наночастиц методом ОКТ и изучения поглощающих свойств по кинетике лазерного нагрева биоткани с локальным накоплением наночастиц. На основе полученных данных отобрано 4 вида наночастиц:

- нанооболочки (250/50нм) с резонансным рассеянием на 850 нм для оптической визуализации методом ОКТ накопления наночастиц в биологической ткани;

- бипирамиды (200нм), обладающие как резонансным рассеянием, так и резонансным поглощением на длине волны 800 нм для ОКТ-визуализации динамики накопления наночастиц и лазерной гипертермии экспериментальной биологической модели, локально накапливающей золотые наночастицы (РШМ-5);

- наностержни 60/15 нм и 50/10нм, с резонансным поглощением на длине волны 775 и 850нм соответственно, для лазерной гипертермии экспериментальной модели РШМ-5.

Оптическая визуализация методом ОКТ на агаровом фантоме биоткани показала, что золотые наночастицы диффундируют внутрь фантома, приводя к возрастанию интенсивности сигнала обратного рассеяния, которое было выбрано нами в качестве главного критерия накопления наночастиц в биологических тканях.

Отобранные золотые наночастицы были апробированы в эксперименте in vivo. Была предложена экспериментальная биологическая модель, которая способна за счет особенностей строения кровеносных капилляров локально накапливать частицы нанометрового размера. В качестве модели была использована перевивная модель мышиного рака шейки матки РШМ-5. На данной модели изучили динамику накопления золотых плазмонно-резонансных наночастиц в биотканях для оптимизации времени начала лазерного воздействия, выполнили лазерную гипертермию биоткани с наночастицами и оценили действие гипертермии с наночастицами на структуру биоткани.

Нами впервые проведен неинвазивный динамический оптический мониторинг методом ОКТ накопления наночастиц с резонансным рассеянием в экспериментальной модели РШМ-5 с целью определения времени максимального накопления наночастиц для оптимизации лазерной гипертермии. По увеличению сигнала обратного рассеяния на ОКТ-изображениях определили время максимального содержания наночастиц в экспериментальной биологической модели РШМ-5 (4-5 часов). Методом электронной микроскопии и атомно-абсорбционной спектроскопии подтвердили, что наночастицы накопились в экспериментальной модели.

В работе изучили изменение температуры биоткани на примере экспериментальной биологической модели РШМ-5 на поверхности методом ИК-термографии и внутри новым неинвазивным методом ПАТ во время термического лазерного воздействия. Мы показали, что нагрев биоткани происходит локально при использовании золотых наночастиц. На основе расчета тепловой дозы, полученной на поверхности и внутри биоткани, выявлено, что средняя тепловая доза на поверхности как с наночастицами, так и без них одинакова, в то время как внутренняя тепловая доза в 5 раз выше при наличии наночастиц. Метод ПАТ предложен и апробирован в in vivo эксперименте впервые.

Мы впервые проанализировали кинетику роста узла экспериментальной биологической модели РШМ-5 после лазерной гипертермии в присутствии наночастиц с разными оптическими свойствами. Выяснили, что наночастицы, обладающие одновременно резонансным поглощением и резонансным рассеянием (бипирамиды 200 нм), не оказывают дополнительного повреждающего действия при лазерной гипертермии и не влияют на скорость развития экспериментального узла. Замедление роста узла экспериментальной биологической модели РШМ-5 по сравнению с контрольной группой вызывает лазерная гипертермия с наночастицами, у которых поглощение превалирует над рассеянием (наностержни 60/15 и 50/1 Онм).

В нашей работе впервые была предпринята попытка количественно оценить структурные изменения в экспериментальной модели РШМ-5 после термического воздействия с применением золотых наночастиц. Наблюдаемые структурные изменения были разделены на зоны некроза, разрежения и плотной жизнеспособной ткани на основе работы [Розуменко В.Д. 2003]. Были рассчитаны объемные площади указанных зон в контрольной группе, опытных группах I и II (лазерная гипертермия с золотыми наночастицами и без них), что позволило выявить вклад наночастиц в развитие деструктивных изменений.

На основе полученных экспериментальных данных показано влияние золотых плазмонно-резонансных наночастиц на оптические свойства и лазерный нагрев биологических тканей. Исследуемые наночастицы могут быть использованы как контрастирующие агенты для оптических методов визуализации биологических тканей и эффективными агентами для термических способов воздействия.

Предложенная уникальная методика неинвазивного и эффективного контроля внутренней температуры биологической ткани при термическом воздействии методом ПАТ, может быть использована для контроля лечения, связанного с нагревом, независимо от вида излучения (лазерное, СВЧ, магнитное поле).

Благодарность. Автор выражает особую признательность к.б.н. М.В. Ширмановой, к.ф.-м.н. В.А. Каменскому и д.м.н., проф. Н.Д. Гладковой за ценные советы при выполнении и обсуждении диссертационной работы, В.В. Елагину и к.ф.-м.н. П.В. Субочеву за помощь в проведении экспериментов, д.б.н. Л.Б. Сноповой, к.б.н. H.H. Проданец и к.б.н. М.Л. Бугровой за проведение и описание микроскопических исследований, д.х.н., проф. В.А. Надточенко за предоставление образцов золотых наночастиц, к.х.н. А.Н. Тумановой за исследования методом атомно-абсорбционной спектроскопии, д.м.н. Е.М. Трещалиной за предоставление опухолевого штамма РШМ-5.

Выводы

1. В ряду исследуемых золотых плазмонно-резонансных наночастиц разной формы (наностержни, сферы, нанооболочки, бипирамиды) максимальными поглощающими свойствами на длине волны 810 нм обладают наностержни (50/10 нм и 60/15 нм), максимальными рассеивающими свойствами на длине волны 900 нм обладают нанооболочки (250/50 нм), одновременно поглощающими и рассеивающими свойствами обладают бипирамиды (200 нм) .

2. Метод оптической когерентной томографии позволяет визуализировать накопление золотых плазмонно-резонансных наночастиц в биологических тканях по изменению уровня сигнала обратного рассеяния. Время максимального накопления наночастиц в экспериментальной биологической модели РШМ-5 составляет 4-5 часов после внутривенного введения.

3. Накопление золотых плазмонно-резонансных наночастиц в биологической ткани при проведении лазерной гипертермии на длине волны 810 нм повышает локальность нагрева, что установлено методом ИК-термографии, и способствует повышению внутренней температуры биоткани на 3-4 °С, что установлено методом ПАТ.

4. После проведения лазерной гипертермии наибольшие структурные повреждения биологической ткани в экспериментальной биологической модели РШМ-5 наблюдались при накоплении золотых наностержней.

Публикации по теме диссертации из перечня ВАК РФ

1. E.V. Zagaynova, М.А. Shirmanova, M.Yu. Kirillin, B.N. Khlebtsov, A.G. Orlova, I.V. Balalaeva, M.A. Sirotkina, M.L. Bugrova, P.D. Agrba, V.A. Kamensky. Contrasting properties of gold nanoparticles for optical coherence tomography: phantom, in vivo studies and Monte Carlo simulation. Phys. Med. Biol. 53, 2008 4995-5009

2. Загайнова E.B, Ширманова M.B., Сироткина М.А., Орлова А.Г, Балалаева И.В, Каменский В.А. Повышение информативности оптической томографии с использованием металлических и полупроводниковых наночастиц. Альманах клинической медицины, Т. XVII (2), Москва, 2008, с. 334-338

3. М. Kirillin, М. Shirmanova., М. Sirotkina, М. Bugrova, В. Khlebtsov, Е. Zagaynova. Contrasting properties of gold nanoshells and titanium dioxide nanoparticles for OCT imaging of skin: Monte Carlo simulations and in vivo study. Journal of Biomedical Optics V.14, N2. P. 021017-1-021017-11, 2009

4. Сироткина M.A., Елагин B.B., Макарова A.A., Снопова Л.Б., Проданец H.H., Стриковский A.B., Галка А.Г., Костров A.B., Загайнова Е.В. Изучение сочетанного воздействия энергии СВЧ и золотых наночастиц на опухоли в эксперименте. СТМ 2012-4, стр.30-35

5. Сироткина М.А., Елагин В.В., Ширманова М.В., Бугрова М.Л., Снопова Л.Б., Надточенко В.А., Каменский В.А., Загайнова Е.В. Лазерная гипертермия опухолей с нанотермосенсибилизаторами. СТМ 2010-1, стр. 611

6. Загайнова Е.В., Бугрова М.Л. Снопова Л.Б., Елагин В.В., Сироткина М.А., Ширманова М.В., Денисов H.H., Надточенко В.А. Изучение

биораспределения наночастиц золота в эксперименте на здоровых животных. Российские нанотехнологии 2010, №5 с. 119-124

7. Sirotkina М.А, Elagin V.V, Shirmanova M.V., Bugrova M.L., Snopova L.B., Kamensky V.A., Nadtochenko V.A., Denisov N.N., Zagaynova E. V. OCT-guided laser hyperthermia with passively tumor-targeted gold nanoparticles. J. of Biophotonics 2010, 10, P.718-727

8. M. Sirotkina, M. Sirmanova, M. Bugrova, V.Elagin, P. Agrba, M. Kirillin, V. Kamensky, E. Zagaynova. Continouse optical coherence tomography monitoring of nanoparticle accumulation in biological tissues. Nanoparticles research 2011, 1, P. 283-291

9. Сироткина M.A., Елагин B.B., Субочев П.В., Ширманова М.В., Денисов Н.Н., Загайнова Е.В., Лазерная гипертермия опухолей с золотыми наночастицами под контролем оптической когерентной томографии и акустотермометрии. Биофизика 2011, №5 с. 1142-1146

10. Сироткина М, Елагин В., Бугрова М., Ширманова М, Надточенко В., Загайнова Е. Оптическая диагностика и лазерная гипертермия опухолей с применением плазмонно-резонансных золотых наночастиц. Альманах клинической медицины, 2012, №26 с. 63-67

Другие публикации автора по теме диссертации

11. E.V. Zagaynova, M.V. Shirmanova., A.G. Orlova, I.V.Balalaeva, M.Yu. Kirillin, V.A. Kamensky, M.L.Bugrova, M.A. Sirotkina. Gold nanoshells for OCT imaging contrast: From model to in-vivo study. Proceedings of SPIE, Vol. 6865, 6865 К 2008

12. M.A. Сироткина, M.B. Ширманова, П.Д. Агрба, B.A. Каменский, E.B. Загайнова. Непрерывное наблюдение оптических эффектов в коже при поверхностном нанесении наночастиц методом оптической когерентной томографии. «Нанотехнологии в онкологии 2008» тезисы докладов всероссийской научной конференции с международным участием, Москва, 2008 168стр.

13. M.A. Sirotkina, E.V. Zagaynova, M.V. Shirmanova, P.D. Agrba, V.A. Kamensky. Detection of nanoparticles accumulation in biological tissues by optical coherence tomography in vivo. Proceeding of SPIE V.7188, 71880L, 2009

14. E.V. Zagaynova, M.A. Sirotkina, M.V. Shirmanova, V.V Elagin, M. Kirillin, P.D. Agrba, V.A. Kamensky, V.A. Kamensky Plasmon resonance gold nanoparticles for improving optical diagnostics and photothermal therapy of tumors. Proc. SPIE 7577, Plasmonics in Biology and Medicine VII, 75770P (2010)

15. M.A. Sirotkina, M.V. Shirmanova, E.V. Zagaynova, P.D. Agrba, V.A. Kamensky. Investigation of nanoparticles accumulation in tumor in vivo by optical coherence tomography for controlled laser hyperthermia. International spring school "Biophysics and bioelectrochemistry for medicine". Abstracts Cisnadioara, Romania 2009, P. 19

16. Sirotkina M.A., Shirmanova M.V, Elagin V.V, Agrba P.D, Kamensky V.A, Nadtochenko V.A, Zagaynova E.V. OCT study of passive delivery of gold nanoparticles into tumor in vivo for local laser hyperthermia. Topical problems of Biophotonics 2009 185-186

17. Belyaev R., Volkov G., Krotov E., Mansfel'd A., Subochev P., Sirotkina M., Elagin V., Zagaynova E. Passive acoustic method for noninvasive control of inner tumor temperature during laser hyperthermia. Topical problems of Biophotonics 2009 187-188

18. M. Kirillin, P. Agrba, E. Zagaynova, M. Sirmanova, Sirotkina M., V. Kamensky. Contrast enchancment by nanoagents in OCT imaging of skin: monte carlo versus in vivo study. Topical problems of Biophotonics 2009 47-48

19. E. Zagaynova, M. Sirotkina, M. Sirmanova, V.Elagin, M. Bugrova, L. Snopova, P. Agrba, V. Nadtochenko, S. Deev, A. Mansfel'd, V. Kamensky. Improving optical diagnostics and photothemal therapy of tumor by using gold nanoparticles. Topical problems of Biophotonics 2009 169-170

20. V. Elagin, M. Bugrova, L. Snopova, M. Sirmanova, M. Sirotkina, N. Denisov, V. Nadtochenko, E. Zagaynova The influence of biocompatible gold nanoparticles on healthy mice. Topical problems of Biophotonics 2009 179-180

21. Сироткина M.A., Елагин B.B., Кордюкова A.A., Снопова Л.Б., Галка А.Г., Стриковский А.В., Загайнова Е.В. Предварительное исследование влияния СВЧ энергии на опухоли в присутствии золотых наностержней. Российский биотерапевтический журнал №2, с.48, (2012)

22. Сироткина М.А., Елагин В.В., Макарова А.А., Субочев П.В., Стриковский

A.В., Загайнова Е.В. Сравнение эффективности применения золотых наночастиц для лазерной и СВЧ гипертермии. IV Съезд Биофизиков России. Симпозиум IV «Новые тенденции и методы в биофизике» Материалы докладов 2012, с.85

23. Загайнова Е.В., Сироткина М.А., Елагин В.В., Ширманова М.В., Надгоченко В.А., Снопова Л.Б., Клапшина Л.Г., Балалаева И.В., Каменский

B.А., Стриковский. Новые подходы в онкологии с использованием нанотехнологий. IV Съезд Биофизиков России. Симпозиум IV «Новые тенденции и методы в биофизике» Материалы докладов 2012, с.34

24. Снопова Л.Б., Проданец Н.Н., Сироткина М.А., Стриковский А.В. Влияние СВЧ-гипертермии на структуру опухоли в присутствии наночастиц в эксперименте. Материалы докладов XI Конгресса международной ассоциации морфологов (Самара, 29-31 мая 2012г.) Морфология - 2012, №3, с.145.

25. М.А. Sirotkina, N.N. Prodanets, L.B. Snopova,V.V. Elagin, and E.V. Zagaynova Morphological analysis of the nanoparticles-labeled tumors after laser treatment. IV International Symposium Topical problems of biophotonics - 2013. - P.181-182

26. Сироткина M, Загайнова E., Ширманова M., Елагин В., Бугрова M., Жеглов А. Способ лечения опухолей лазерной гипертермией. Патент на изобретение №2425701 от 10 августа 2011.

Подписано к печати 09.09.2014. Формат 60х90'/16 Бумага офсетная №1. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №50

Отпечатано в типографии ИП Синицын А.Е. 603155 г. Нижний Новгород, ул. Провиантская, 8