ИК лазерная инактивация клеток и фотоповреждение биотканей, сенсибилизированных плазмонно-резонансными золотыми наночастицами и красителями

Акчурин, Георгий Гарифович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ИК лазерная инактивация клеток и фотоповреждение биотканей, сенсибилизированных плазмонно-резонансными золотыми наночастицами и красителями
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "ИК лазерная инактивация клеток и фотоповреждение биотканей, сенсибилизированных плазмонно-резонансными золотыми наночастицами и красителями"

На правах рукописи

АКЧУРИН ГЕОРГИЙ ГАРИФОВИЧ

ИК лазерная инактивация клеток и фотоповреждение биотканей, сенсибилизированных плазмонно-резоиансными золотыми наночастицами и красителями

03,00.02-биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Саратов - 2009

003487737

Работа выполнена на кафедре оптики и биофотоники в ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»

Научный руководитель: Заслуженный деятель РФ, доктор физико-

математических наук, профессор Тучин Валерий Викторович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Брилль Григорий Ефимович

Кандидат физико-математических наук, доцент Приезжев Александр Васильевич

Ведущая организация: Центр естественно-научных исследований

Института общей физики имени A.M. Прохорова РАН.

Защита состоится « 29 » декабря 2009 г. в 17 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д212.243.05 при Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская 83, корп.З, физический факультет СГУ, аудитория 34.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (Саратов, ул. Университетская, 42)

Автореферат разослан « 28 » ноября 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор физико-математических наук, профессор В.Л. Дербов

1.Общая характеристика работы

Актуальность темы. Использование напотехнологий в медицине является одним из приоритетных направлений в современной науке, которое может дать реальную отдачу уже в самом ближайшем будущем [JI1]. Одно га таких направлений - лазерный фототермолиз опухолей с использованием резонансно-поглощающих наночаспщ [Л2]. Копьюгаты золотых наночастиц с антителами селективно присоединяются к раковым клеткам, а облучение клеток лазерным излучением приводит к эффективной деструкции раковых клеток без повреждения здоровых. Лазерное излучение в ближнем инфракрасном диапазоне, попадающее в «окно прозрачности биотканей» (750-1100нм) при соответствующем уровне мощности не должно вызывать гипертермию (> 42 °С) и соответственно функциональное фотоповреждение нормальных клеток, при этом присутствие плазмонно-резонансных наночастиц в патологических клетках или связанных с их внешней плазматической мембраной вызывает некроз.

Однако с точки зрения ряда перспективных медицинских приложений, связанных с диагностикой и терапией раковых клеток, традиционные сферические золотые наночаегнцы диаметром от 5 до 100 им имеют плазмонный резонанс (520-560 нм), попадающий в полосу поглощения хромофоров клетки, что существенно ограничивает доставку лазерного излучения без повреждения нормальных биотканей. Наночастицы, состоящие из диэлектрического сферического ядра и металлической нанооболочки [ЛЗ], представляют большой интерес для фототермальной терапии [Л4] и оптической визуализации раковых клеток [Л2]. Принципиальным преимуществом золотых нанооболочек перед обычными коллоидными золотыми наносферами является возможность настройки максимумов плазмонного резонанса поглощения и светорассеяния в пужный спектральный диапазон от видимого до ИК за счет изменения размера ядра и толщины оболочки [Л2,Л5], а также благодаря возможности конструирования наночастиц с заданными спектральными коэффициентами поглощения в ближней ИК области, совпадающими с длинами волн наиболее распространенных и недорогих полупроводниковых инжекционных лазеров. Аналогичное спектральное управление возможно реализовать на основе золотых наностержней, изменяя соотношение длина-диаметр [Л2]. Конъюгирование золотых нанооболочек с различными типами биополимеров, позволяет повысить их биодоступность и селективность накопления наночастиц в опухолевых клетках и тканях, при этом экспериментальные данные подтверждают эффективность использования нанооболочек в качестве меток для лазерной гипертермии раковых клеток. Впервые в 2003 г. была продемонстрирована фотодеструкция раковых клеток с помощью золотых наносфер [Л6,Л7] и напооболочек [Л8]. Золотые наностержнп впервые в 2006 г. были апробированы для селективной фототермической терапии (ПФТТ) раковых клеток in vitro в группе El-Sayed [Л9]. Последние достижения по векторной доставке наночастиц и селективному лазерному фототермолизу раковых клеток представлены в обзоре [Л4]. Для селективной лазерной гипертермии клеток в 2003 году был апробирован метод резонансного облучения наносекундными импульсами [Л6], что позволило осуществить интенсивный локальный пространственный нагрев наночастиц и прилегающего объема в пределах характерного размера клеток. Однако, традиционные лазеры, генерирующие нано, пико и фемтосекундные оптические импульсы, работают в режиме синхронизации мод со скважностью более 100 и соответственно малой средней мощностью и энергией, но очень большой пиковой мощностью, что должно вызывать нелинейные термические эффекты при термолизе наночастиц и клеток, поэтому необходимо исследовать воздействие сверхкоротких оптических импульсов на устойчивость таких структур как нанооболочки. Предлагаемые лазерные технологии пока не вышли за рамки «чашечки Пегри». В реальной ситуации при облучении лазерным пучком биотканей, обладающих сильным рассеянием, возникают существенные проблемы доставки излучения с определенной плотностью на заданную глубину [Л 10], а тем более регулирование локальной температуры нагрева биотканей плазмонно-резонапеными наночастицами дм обеспечения некроза или апоптоза клеток. Для разработки управляемого лазерного

фототермолиза биотканей необходимы детальные исследования ИК лазерного нагрева коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и наностержней при различных режимах, наиболее оптимальных для фотодесгрукции биотканей полупроводниковых лазеров (810 нм), в которых реализуется как непрерывный, так и импульсный режимы с милли и микросекундпой длительностью, с регулируемой скважностью для различной концентрации наночастиц. Для разработки технологии управляемой лазерной гипертермии раковых опухолей на основе золотых плазмонно-резонансных наночастпц с контролем температуры необходимо проведение экспериментальных исследований, как на фантомах, так и in vivo на лабораторных животных, а также апробация на спонтанных опухолях.

Появившиеся в 21 веке в медицинских клиниках, в основном офтальмологических, оптические низко-когерентные томографы (ОСТ) позволили получать трехмерные изображения сильно рассеивающих биотканей с пространственным разрешением по глубине среза от 20 до 5 микрон при общей глубине сканирования 1,5-2 мм [ЛИ]. В 2004 году эта технология была применена для идентификации золотых плазмошю-резонанспых нанооболочек, а в 2007 для наностержней [Л12]. В ряде работ предпринята попытка использования золотых нанооболочек в качестве вещества, повышающего контрастность визуализации слоев кожи [Л13]. Для оптимизации технологии ИК лазерного фототермолиза на основе золотых плазмошю-резонансных наночастиц в фантомах и биотканях и оценки их пространственного распределения необходимо апробировать потенциальные возможности ОСТ для различных типов золотых наночастиц, включая нанооболочки и наностержни, эффективно поглощающие и рассеивающие оптическое излучение в ближней ИК области спектра Субклеточного пространственного разрешения позволяет достигнуть конфокальный лазерный томограф, однако в реальных биотканях сильные эффекты оптической неоднородности могут создавать существенные ограничения на идентификацию наночастиц, что требует экспериментального подтверждения.

Для технологии лазерного фототермолиза опухолей коллоидный раствор золотых плазмонно-резонансных наночастиц может вводиться непосредственно в патологическую биоткань или внутривенно для селективного накопления в раковых клетках [Л2,Л4]. При этом возникает серьезная проблема, связанная с динамикой накопления золотых плазмонно-резонапеных наночастиц в различных органах лабораторных животных. Опубликованная в коше 2007 года первая в этом направлении работа голландской группы [Л14] по эффекту накопления наночастиц разных размеров в различных органах лабораторных крыс требует уточнения вследствие образования кластеров наночастиц. Необходимо оценить возможности визуализации наночастиц в гистологических срезах. Кроме того необходим поиск и апробация традиционных методов визуализации in vivo таких как рентгеновская, магниторезонансная томография.

Одним из конкурентных методов интенсивно развиваемого в ведущих биомедицинских центрах ИК лазерному фототермолизу клеток и биотканей на основе технологии золотых плазмонно-резонансных наночастиц является фототермолиз на основе ИК фотосенсибилгоаторов, эффективность поглощепия которых может быть достигнута существенно выше, чем в коллоидном растворе наночастиц. Типичным представителем таких ИК фотосенснбнлизаторов является Индоцианин зеленый (ICG), разрешенный для введения in vivo. Процессы резонансного поглощения лазерного излучения молекулами красителя (ICG), представляющие собой однородную распределенную поглощающую среду в отличие от дискретных центров поглощения и рассеяния для коллоидного раствора наночастиц должны, по-видимому, вызывать различную эффективность фототермолиза клеток и биотканей. Поэтому представляет интерес сравнение эффективности лазерного фототермолиза для этих двух технологий, особенно при импульсных лазерных воздействиях.

(порфиринами, хлоринами, фталоциашшами), которые селективно накапливаются в злокачественных опухолях и генерируют активные формы кислорода [Л15]. Одним из методов определения эффективности фотосенсибилизаторов для фото динамической терапии и исследования клеточно-молекулярных механизмов фотоповреждения клеток является воздействие лазерного излучения на нервные клетки. Исследование импульсной активности медленно адаптирующихся нейронов изолированных рецепторов растяжения речного рака позволило оценить степень фотодинамического воздействия различных типов красителей [Л16]. Однако сложность нелинейно-динамического отклика нейрона, работающего в автоколебательном режиме, не позволяет однозначно интерпретировать механизмы фотодинамического воздействия и лазерного фототермолиза. Для исследования фотодинамического и фототермического отклика на лазерное воздействие нами предлагается классический объект биофизики - соматический нерв лягушки, потенциалы действия в котором возбуждаются в неавтономном режиме. Существование адекватной математической моделп активной плазматической мембраны нейрона [Л17], описывающей возбуждение потенциалов действия должно позволить интерпретировать процессы лазерного фототермолиза и фотодинамического воздействия, а также сравнить с результатами эксперимента.

Целью диссертационной работы являлась разработка управляемого ИК лазерного фототермолиза клеток и биотканей на основе золотых плазмонно-резонансных паночастиц и фотосенсибилизаторов, оценка возможности оптической визуализации наночастяц с помощью конфокального и низко-когерентного томографа, а также исследование механизмов инактивации нейронов при фототермической и фотодинамической терапии.

Задачи исследования

1. Экспериментальное исследование 20 и ЗИ температурных шлей коллоидного раствора золотых нанооболочек и наностержней, имеющих шгазмонный резонанс в ближней ИК области спектра, при облучении лазерным пучком с регулируемым уровнем мощности, временем облучения для установления допустимого уровня лазерной мощности, вызывающей селективное повреждение биотканей, оценка оптимальной концентрации наночастиц и режимов работы лазера (непрерывный, импульсный) для эффективного разрушения биотканей, включая раковые опухоли, а также клетки крови.

2. Апробировать возможность детектирования в коллоидном растворе, а также в фантомах н биотканях отдельных золотых плазмонно-резопаисных наночастиц с помощью лазерного конфокального томографа и оптического низко-когерентного томографа, оценить чувствительность метода и возможность контрастирования.

3. Исследовать особенности резонансного лазерного фототермолиза с использованием ИК фотосенсибилизатора (Индоцианин зеленый) и сравнить с возможностями фототермолиза на основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц для различных режимов облучения (непрерывного, импульсного).

4. Экспериментально исследовать динамический отклик соматического нерва лягушки, прокрашенного ИК фотосенсибилизатором (Индоцианин зеленый) при фототермическом лазерном воздействии, при внеклеточном возбуждении потенциалов действия и установить возможные механизмы инактивации нейронов.

Научная новизна работы

1. Впервые проведено сравнение особенностей ИК лазерного нагрева коллоидного раствора золотых плазмонно-резопаисных наночастиц (дискретная поглощающая и рассеивающая среда) и фототермических сенсибилизаторов (непрерывная поглощающая среда) при одинаковом уровне лазерного воздействия. Экспериментально установлено, что использование импульсных (длительность менее миллисекунды) режимов работы лазеров с различной скважностью по сравнению с непрерывным при одинаковой вводимой оптической энергии позволяют осуществить локальный фототермолиз клеток при

использовании золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и наностержней в отличие от технологии на основе фотосенсибилизаторов (индоцианин зеленый), где степень нагрева в импульсном и непрерывном режиме практически одинакова. Проведена оптимизация импульсных параметров ИК лазеров (длительность импульсов, скважность, средняя мощность) для локального разрушения биотканей.

2. Впервые неинвазивно исследованы 2-D и 3-D температурные пространственные поля при нагреве коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных наночастиц в воде и глицерине при воздействии лазерного излучением ближнего ИК диапазона (810 нм) для различных уровней мощности, режимов работы (непрерывный, импульсный), различной концентрации наночастиц, при этом использование глицерина повышает эффективность нагрева в 1.6 раза по сравнению с водой в соответствии с отношением теплоемкостей. Впервые экспериментально установлены пороговые уровни плотности энергии и лазерной мощности, вызывающие дефрагментациго золотых плазмонно-резонансных нанооболочек в наносекундной и фемтосекувдной области.

3. Проведено детектирование и визуализация золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и наностержней в объемных фантомах и биотканях на основе технологии оптического конфокального и низко-когерентного томографа. Впервые установлена и запатентована возможность определения концентрации паночастиц в объеме и динамика пространственной неоднородности наночастиц, связанной с процессами диффузии в фантомах и биотканях. Обнаружено, что при концентрации наночастиц более 109 см'3, когда в объем когерентности попадает более одной наночастицы, ОСТ позволяет измерить объемный коэффициент отражения и оценить динамику пространственной неоднородности распределения паночастиц, степень кластеризации коллоидного раствора наночастиц и позволяет создавать управляемые фантомы для тестирования ОСТ.

4. Разработана технология резонансного ИК лазерного фототермолиза биотканей и фантомов при использовании различной концентрации фотосенсибилгоаторов (индоцианин-зеленый) при ИК резонансном непрерывном и импульсном лазерном воздействии и измерений локальной температуры с помощью тепловизора.

5. Впервые реализован неинвазивный оптический метод контроля функциональной инактивации эритроцитов цельной крови человека при субклеточном лазерном фототермолизе на основе анализа комбинационного рассеяния, измеренного конфокальным микроскопом.

Впервые обнаружен размерный эффект влияния золотых наночастиц на функциональную активность тромбоцитов.

6. Впервые предложена методика для оценки фотодинамического или фототермпческого воздействия на нейроны на основе анализа динамических (с мишшеекундным разрешением) процессов инактивации соматического нерва лягушки, прокрашенного фотосенспбилизаторами при измерении составного потенциала действия при лазерном облучения как в видимой, так и в ближней ИК области спектра. Проведенные эксперименты и численное моделирование позволили интерпретировать процессы инактивации нейронов при фотодинамическом или фототермическом повреждяшем плазматической мембраны аксонов и мембраны митохондрий, что отражается на функционировании активного транспорта.

Научно-практическая значимость работы:

1. Экспериментально апробирован ИК лазерный фототермолиз клеток и биотканей па основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц и фотосенсибилизаторов. Установлены диапазоны допустимых концентраций наночастиц и фотосеисибилизаторов для достижения заданного уровня температуры и глубины поражения биотканей от уровня лазерного воздействия и режимов облучения (непрерывный, импульсный, средняя мощность, длительность импульса, скважность). Апробация ИК лазерного фототермолиза спонтанных раковых опухолей мелких животных (собаки, кошки, крысы) показала

эффективность лазерной шггсрiсрмии па основе технологии зо.юшх н.шзмонно-рсзонанснмх наиочаспт и фотосснсибилизазорок.

2. Апробированная гсхно.ioi ня субкдс!очного комбинационною рассеяния должна понизить неинвазнвно определять сгснспь функциональною необратимою рафушення клеток, например, крови при 1инср1срмии.

.1. Обнаруженнмн размерный эффект влияния золотых иапочасиш на функциона.тьнуи> активность тромбошпон крови может быть использован и iематкнни для управления процессами свертываемости крови.

4. Использование оптического конфокального п низко-когерентного юмографа позволило бесконтактно детектировать золотые п.тазмонмо-резопансние паночастнцы (панооболочкп и наностсржнн) ло (дубины 1 мм в фантомах из ai ара и определять концентрации наночастиц и их пространственную неоднородность. Предложено использовать коллоидный раствор золотых пдазмоино-рсзоианспых иапооболочек для тестирования ОСТ.

5. Исследование динамического отклика нейронов при возбуждении сомашческот нерпа лягушки с помощью последовательности электрических импульсов позволило обнаружить нелинейные свойства нейронов, проявляющихся в хаотической последовательности потенциалов действия при регулярном внешнем возбуждении, что прпнпппнатыю важно для понимания функционирования живых динамических систем в нейрофизиологии и разработке систем управления в робототехнике.

6. Устаномленныс механизмы инактивации клеток при фото.тнпампчсском и фототермнческом лазерном воздействии позволяет выработать стратегию фотооблучения и соответствующие уровни оптической энергии. а также оценивать эффективность различных фотосенсибилнзаторон.

Достоверность научных результатов:

Достоверность полученных результатов обусловлена использованием и экспериментах стандартной измерительной аппаратуры, подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных, а численные расчеты основаны на общепринятых моделях.

Положения и результаты, выносимые на запит*

1. Управляемый ПК лазерный фототермолиз клеток и биотканей на основе золотых илазмошю-резонансных иапооболочек и ианостсржнсй при концентрации наночастиц в объеме, равной 10' К)4 см \ оптимальном режиме облучения (непрерывный или импульсный, средняя плотность лазерной мощности 10 20 Пт см") и бесконтактном контроле 2-D температурных полей с помощью тепловизора. Технология управляемого резонансного лазерного фототермолиза с помощью золотых наночастиц п ИК фотосснсибилизатора - индоцианина зеленого апробирована на фантомах и спонтанных раковых опухолях мелких животных in vivo.

Реализован неннвазивный оптический метод контроля функционал!,ной инактивации клеток крови при субклеточном лазерном фототермолизе на основе анализа комбинационного рассеяния, измеренного с помощью конфокального микроскопа.

2. ИК лазерное облучение золотых плазмонно-рсзонанснмх иапооболочек и стержней (дискретная поглощающая и рассеивающая среда) и фотосепсибилпзаторов (краситель индопнашш зеленый) (непрерывная ноглошагошая среда) при одинаковом уровне плодимой непрерывной лазерной энергии и соответствующем выборе концентрации позволяет реализовать соизмеримую эффективность разрушения фантомов и биотканей, однако при облучении последовательностью лазерных импульсов с длительностью менее миллисекунды и скважностью более двух, средняя температура фантомов и биотканей с

золотыми наночастицами оказывается холоднее (на единицы - десятки градусов) в отличие от нагрева окрашенных сред.

Установлены допустимые уровни плотности лазерной энергии одиночных лазерных импульсов Е>200 мДж/см2 при длительности 4 наносекунды и б Дж/см2 при длительности 60 фемтосекувд, вызывающие дефрагменташпо золотых плазмонно-резонансных нанооболочек.

3. Однозначное детектирование и определение пространственной неоднородности концентрации золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и наностержней в объемных фантомах и биотканях с помощью ИК низко-когерентного томографа возможно, если в объем когерентности Vc, определяемый произведением длины продольной когерентности излучателя и диаметра фокального пятна зондирующего пучка, попадает не более одной наночастицы. Изменением концентрации золотых наночастиц возможно создание фантомов с управляемым коэффициентом обратного отражения от объемных сред для тестирования ОСТ.

4. Методика оценки степени фототермического и фотодинамического воздействия на нейронные клетки ex vivo на основе измерения амплитуды и формы составного потенциала действия при внеклеточном возбуждении миллисекундными электрическими импульсами соматического нерва лягушки, прокрашенного фотосенсибипизагорами и подверженного воздействию резонансного лазерного излучения. Анализ изменения динамического отклика соматического нерва при лазерном облучении позволяет интерпретировать результаты воздействия как фотоповрезвдение плазматической мембраны аксонов и нарушение функционирования активного транспорта.

Личный вклад диссертапта и результаты, полученные совместно с другими исследователями:

Основные экспериментальные результаты диссертации, прежде всего по фототермической ипактивации нейронов и лазерному фототермолизу клеток крови и биотканей на основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц были проведены лично соискателем. Постановка задач исследования и обсуждепие экспериментальных результатов проведена под руководством профессора, д.ф.-м.н Тучина В.В. Эксперименты in vivo и in vitro по лазерному фоготермолизу опухолей животных на основе плазмонно-резонансных золотых наночастиц проведены совместно с к.в.н. Теренхюком Г.С.(первая ветеринарная клиника), а эксперименты по агрегации тромбоцитов крови с к.м.п. Ивановым А.Н.(СГМУ). Интерпретация .результатов расчета по распространению фотонов в растворе наночастиц, температурных полей и сравнение с экспериментом по лазерному воздействию проведена совместно с д.ф.-м.н Максимовой И.Л., к.ф.-м.н. Ермолаевым И.А., аспирантом Скапцовым A.A. (СГУ). Исследование оптических свойств плазмонно-резонансных золотых наночастиц при воздействии лазерного излучения и интерпретация результатов измерений проводились совместно с профессором, д.ф.-м.н. Хлебдавым Н.Г. и к.ф.-м.н. Хлебцовым Б.Н. (ИБФРМ РАН), а при воздействии фемтосекундных лазерных импульсов совместно с к.ф.-м.н. Р. Р. Летфуллиным (Розе-Халман технологический институт, США). Совместно с к.ф.-м.н. Меглинским И.В. и аспирантом Векслером Б. (Крэнфиддский университет, Англия) проведены исследования визуализации наночастиц на конфокальном оптическом томографе, а исследования на ОСТ проведены совместно с врачом Наумовой О.Г.(Областная офтальмологическая больница г. Саратов) и доцентом, к.ф.-м.н. Акчуриным Г.Г.(СГУ). Эксперименты in vitro по лазерной фотодинамической инактивации нейронов лягушки проведены совместно с к.м.н. Селиверстовым Г-А.(СГМУ).

Работа выполнена на кафедре оптики и биофотоники Саратовского государственного университета им. Н.Г.Чернышевского.

Гранты

Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям Госконгракт №02.512.11.2034, РФФИ, грант 07-02-01434; CRDF BRHE RUXQ-006-SR-06, CRDF

BRHE RUXO-006-SR-06/BP1M06, Grant № 224014 PHOTONICS4LIFE of FP7-1CT-2007-2 (20082013), Тематический плаи НИР С ГУ по заданию федерального агентства по образованию РФ 1.4.09. (2009-2010), Грант президента РФ "Для поддержки ведущих научных школ" - НШ -208.2008.2 (2008-2009), Аналитическая ведомственная целевая программа "Развитие научного потенциала высшей школы" РНП.2.1.1.44.73 (2006-2008), Аналитическая ведомственная целевая программа "Развитие научного потенциала высшей школы" № 2.1.1/4989 (2009-2010), Аналитическая ведомственная целевая программа "Развитие научного потенциала высшей школы" №2.2.1.1/2950 (2009-2010). Апробация

1) Международная школа по лазерной физике, оптике и биофизике в 2001-2008, (Saratov Fall Meeting) - 8 стендовых докладов;

2) Международная конференция "Оптика лазеров" L0*2003 и LOYS'2003 (Санкт-Петербург) - 2 стендовых доклада;

3) Международная конференция "Synchronization of chaotic and stochastic oscillations" SYNCHRO-2002 - стендовый доклад;

4) Всероссийская конференции "Нелинейные дни в Саратове для молодых" -2002, 2003 - 2 стендовых доклада;

5) 4 съезд фотобиологов России, Саратов, 2005, - 2 стендовых доклада;

6) Photonic West, SPIE 2002,2005,2006,2008 - 5 стендовых докладов;

7) Международная конференция "Optics and Photonics 2007" SPIE (San Diego) - устный доклад;

8) 5 съезд фотобиологов России, 2008, Пущино -2 стендовых доклада;

9) Международная конференция "Photonics4 life" 2008 (Belgium) - устный доклад. Публикации по теме диссертации: опубликовано 21 работа, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах РАН и зарубежных журналах из списка рекомендованных ВАК и 14 статей в зарубежных и отечественных периодических изданиях, получены 3 патента РФ. Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 4-х глав, заключения и списка цитируемой литературы, состоящего из 136 наименований.

Диссертация изложена на 154 страницах текста, содержит 91 рисунок. КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы работы, рассмотрена новизна, практическая значимость, сформулирована цель работы, основные задачи исследований, приведены основные положения, выносимые автором на защиту.

Глава 1. Альтернативой фотодинамической лазерной терапии в последние несколько лет стал метод фототермической плазмонной терапии на основе золотых наносфер, апробированный в 2003 [Л6]. Однако у золотых наносфер диаметром от 5до100 нм плазмонный резонанс находится в области 520-560 нм, но в этой зеленой спектральной области наблюдается сильное поглощение излучения естественным хромофором крови - гемоглобином эритроцитов, что приводит к разрушению не только патологических, но и нормальных клеток. Наиболее перспективным является лазерный фототермолиз на основе золотых нанооболочек и наностержней, имеющих плазмонный резонанс в окне прозрачности биотканей (750-1100нм) [Л2, Л5]. В главе представлены детальные экспериментальные исследования нагрева коллоидного раствора золотых нанооболочек (Au/Si02) и наностержней с плазмонным резонансом в спектральной области 750-850 нм, (синтезированных в ИБФРМ РАН в лаборатории проф. Хлебцова Н.Г.) при облучении полупроводниковым лазером с длиной волны 810 нм при уровне мощности 1-5 Вт и диаметре пучка 3-5 мм, работающем как в непрерывном режиме, так и в режиме генерации периодической последовательности импульсов с минимальной длительностью 200 икс и регулируемой скважностью.

Компьютерное моделирование пространственного распределения поглощенных фотонов при распространении ИК электромагнитной волны через систему дискретных поглощающих и рассеивающих золотых нанооболочек (Au/SiOî 15/140 нм) в воде с учетом

многократного светорассеяния осуществлялось методом Монте Карло при расчете траектории 101 фотонов (проф. Максимова И.Л., асп. Скапцов А.А.). На рис.2 (а,б) представлены результаты пространственного распределения поглощенных фотонов и двумерные термограммы коллоидного раствора нанооболочек в воде для двух концентраций 2 (в,г).

(г)

Рис.1. Компьютерное моделирование (а,б) пространственного распределения поглощенной лазерной мощности в коллоидном растворе золотых плазмонно-резонансных нанооболочек (Au/SiCK 15/140 нм) в воде и соответствующий эксперимент (в,г) - 2D термограммы при лазерной мощности 1 Вт время 5 с; (а,в - концентрация наночастиц 5*10' мл"'; б,г 1 * 109 мл'1).

Проведенные расчеты температурных полей, возникающих в результате поглощения энергии лазерного излучения наночастицами, показывают качественное согласие с экспериментом, что позволяет создавать технологии управляемого лазерного фототермолиза. Исследована динамика нагрева и остывания раствора золотых наночастиц при лазерном нагреве, что важно для создания технологии ín vivo на животных. Проведенные исследования нагрева раствора золотых нанооболочек и наностержней показали возможность управления температурными полями как по глубине, так и по уровню пространственного изменения температуры при регулировании концентрации наночастиц и плотности резонансной лазерной мощности.

1 НМ 4WC ПН чях. 1

гЯВш; 1 гуо>с «wc -: ШИШИИ г ШШЫж 1 КЛ-С

(В) (г)

Рис.2. Термограммы ИК лазерного нагрева коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных нанооболочек (Au/SiOj 15/140 нм) в воле для различной концентрации при воздействии резонансного излучения полупроводникового лазера с плот ностью мощност и 10 Вт/см2 в течении 2 мин (120 Дж) (г) - максимальная концентрация N0= 5 109 см"!; (в) N = No/4, (б) N= N„/16, (а) - физраствор Для бесконтактного измерения температуры использовался тепловизор IRISYS 4010 (InfraRed Integrated System Ltd, UK).

30-i •

. ♦ »

• в»

тьиичагурз среды

4 5 0 100 20Э 100 *ЭС 500 5СО TOO 90С

время, сек

(а) (6)

Рис.3. Концентрационные зависимости изменения максимальной температуры коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных нанооболочек ((Au/SiO; 15/140 нм) при облучении непрерывным излучением лазера GaAlAs (810 нм) мощностью 2 Вт в течение 2-х минут (240 Дж) (а); и (б) - динамика температуры в центре области облучения при лазерном нагреве водного раствора золотых плазмонно-резонансных наночастиц. вА - начало лазерного воздействия, «В -выключение лазера.

Впервые в [Л6] апробирован новый метод для селективного повреждения клеток-мишеней. основанный на использовании золотых наночастиц, которые нагреваются наносекундными лазерными импульсами для создания локализованного повреждения клеток. При импульсной лазерном нагреве появляются дополнительные управляющие параметры: длительность оптического импульса, временной интервал между импульсами. В работе представлены сравнительные исследования эффективности резонансного оптического нагрева при облучении коллоидного раствора золотых нанооболочек лазером, работающем в непрерывном и импульсном режиме с длительностью от сотен микросекунд до сотен миллисекунд с регулированной скважностью при одинаковом уровне вводимой оптической энергии (Рис.4).

(») (г)

Рис.4. Сравнительная динамика лазерного нагрева плазмонно-резонансных наночастиц ИК излучением лазера (810 нм), работающего в импульсном (длительность импульса 2 мс, скважность 7) и непрерывном режиме с мощностью 2 Вт при одинаковом уровне вводимой оптической энергии : (а), (в) - импульсный режим; (б), (г) - непрерывный: (а), (б) - 60 Дж; (в), (г)- 240 Дж.

Проведенные экспериментальные исследования показали, что при использовании раствора золотых плазмонно-резонансных наночастиц, подверженного воздействию ИК миллисекундных лазерных импульсов при скважности более 2-х, возможна реализация режима локального нагрева, когда облучаемый объем на 10-20 °С более холодный, чем при непрерывном лазерном воздействии, что получило подтверждение и на биотканях, при этом температурная разница между режимами существенно уменьшается, если при увеличении скважности пропорционально увеличивается пиковая лазерная мощность.

Однако на лазерные импульсные технологии существуют ограничения по длительности и энергии лазерных импульсов. Нами впервые был обнаружен и интерпретирован эффект дефратментации золотых нанооболочек (Аи/ЗЮг 15/140 нм) при облучении одиночными лазерными (Х= 1064 нм) импульсами длительностью т=4 не и плотностью энергии более 200 мДж/см2, что вызывало в лазерном фокусе возникновение золотых наносфер и их кластеров. Значительно больший порог 6 Дж/см2 для дефрагментаиии требуется в фемтосекундной области (ТкБр А.=800нм, т=60фс).

4 СЮ ROO ЯО0 1000 «Vavpienprh [nm|

СП

Рис.5. Дефрагментация золотых нанооболочек (Au/S¡0:;15/140hm) при воздействии одиночных импульсов YAG:Nd 1=1064 нм лазера с энергией 2-Ю мДж: а - коллоидный раствор золотых нанооболочек (Au/SiO, 15/140 нм), b - после воздействия лазерных импульсов, с - изменение спектральных характеристик, приводящем к смещению положения плазмонного резонанса из ИК (900нм) в зеленую (530 нм) область d - ТЕМ изображения отдельных золотых наноболочек до облучения, е- после; [3].

Разработанные технологии ИК резонансного нагрева золотых нанооболочек и наностержней были реализованы при фототермолизе биотканей животных in vivo, включая спонтанные опухоли при интерстициальном и внутривенном введении наночастиц [1,2]. Лазерный фототермолиз поверхностных тканей крысы при внутрикожном, подкожном и внутримышечном введении резонансных наночастиц (800нм) представлен на Рис.6.

Рис.6. Термограммы лазерной гипертермии поверхностных тканей крысы а - ост наночастиц. б - при внутрикожном, в - подкожном и г - внутримышечном введении 0.1 мл физраствора с золотыми плазмонно-резонансными нанооболочками (Au/SiO: 15/140 нм 10'см"') при воздействии резонансным излучением полупроводникового лазера (810 нм) с мощностью 1 Вт в течении 3 мин (180 Дж).

Совместно с первой ветеринарной клиникой Саратова апробированы технологии лазерного фототермолиза с золотыми плазмонно-резонансными наночасгицами различных спонтанных опухолей мелких животных (плоско-клеточный рак, базально-клсточный рак. меланома и др.) и получены положительные результаты, подтвержденные гистологически.

В настоящее время реализованы в основном цитологическеские исследования по лазерному фототермолизу биотканей на основе золотых плазмонно-резонансных частиц [J12], В работе представлены экспериментальные результаты лазерному фототермолизу клеток крови человека при использовании технологии золотых наноболочек и определены уровни мощности

Рис.7. ИК лазерный фототермолиз эритроцитов микрокапли (20 мкл) цельной крови человека при введении золотых плазмонно-резонансных нанооболочек (Аи/5Ю; 15/140 нм) при концентрации 3 10" см"' и облучения препарата непрерывной лазерной мощностью 2 Вт в течении 60 сек при диаметре лазерного пучка в 5 мм: а-темнопольная микроскопия; б- оптическое изображение в проходящем свете.

Для селективного накопления функционализированных моноклональными антителами золотых наночастиц необходимо их внутривенное введение, при этом необходимо исследование влияния наночастиц на гемостаз. Нами впервые обнаружен размерный эффект влияния золотых наночастиц на функциональную активность тромбоцитов крови крыс и человека при использовании лазерного тромбоцитарного агрегометра, который необходимо учитывать при внутривенном введении наночастиц [10].

Рис.8. Блок-схема установки (BIOLA) для измерения динамики АДФ индуцированной агрегации тромбоцитов при введении золотых наночастиц и результаты измерений; 1 - без наночастиц; 2 - золотые нанооболочки (Au/ SiCb 15/140 nm); 3 - золотые наносферы 2-3 нм.

Во второй главе обсуждаются апробированные методы визуализации наночастиц такие как электронная, атоммо-силовая, туннельная микроскопия и экспресс метод диагностики отдельных золотых плазмонно-резонансных наносфер, нанооболочек и наностержией и их кластеров в растворах и в гистологических срезах [J12] на основе оптической темнопольной микроскопии. Приводятся результаты визуализации в объеме золотых нанооболочек и наностержней с плазмонным резонансом в ближней ИК области (800 нм) с помощью низкокогерентного оптического томографа до глубины 2-х мм. Предложен и запатентован способ определения концентрации наночастиц в диапазоне от Ю'/мл-Ю'/мл и их пространственного распределения, причем верхняя граница определяется условием, когда в объем когерентности.

гм»

Рис 10. Двумерный ОСТ скан коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных нанооболочек (Au/SiO¡ 15/140 нм) для трех концентраций: (а)-2-10">/мл,(б)1/2-10|0/мл,(в)1/16-10|°/мл при равномерном распределении наночастиц в объеме (коэффициент отражения закодирован в цвете-шкала справа).

Проведены исследования по визуализизации золотых наночастиц в микронном и субмикронном объеме с помощью конфокальных лазерных томографов, зондирующие излучение которых совпадает с плазмонным резонансом. Эксперименты на фантомах из агара и биотканях in vitro показали наличие существенного уровня оптического шума от оптических неоднородностей.

Для детектирования золотых наночастиц в биотканях in vivo были проведены тестовые измерения с помощью магнито-резонансного и рентгеновского томографа, которые показали возможность визуализации золотых наночастиц при концентрации 109/мл, однако реально такое количество наночастиц в биотканях не накапливается. Для количественной оценки содержания золота в различных биотканях лабораторных крыс впервые использовался атомно-абсорбционный метод на основе спектрофотометра AAS-3 (Карл Цейс, Германия) с лампой типа

определяемый произведением длины продольной когерентности зондируемого излучателя (суперлюминесцентного диода) на размер фокального пятна, попадает не более одной наночастицы. Метод ОСТ позволяет количественно определить величину обратного отражения от отдельных наночастиц и кластеров.

ВаиавШгашшШа шШшщр^шз шл юа

(а) (б)

Рис.9. Двумерный ОСТ скан коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных нанооболочек (Au/Si02 15/140 нм для двух значений концентраций: а-1/32 109см"3 и б- 1/128 10'см'3 , измеренный с помощью OCT (Stratus-3000 Carl Zeiss, длина когерентности 10 мкм, диаметр фокального пятна 20мкм, глубина кюветы 1 мм).

Экспериментально обнаружено, что в коллоидном растворе золотых плазмонно-резонансных наночастиц с концентрацией более 109/мл ОСТ существенно искажает информацию о пространственном распределении наночастиц (Рис.10), что качественно подтверждают результаты компьютерного моделирования процессов поглощения и рассеяния фотонов в такой дискретной наносреде. Предложено использовать коллоидный раствор золотых наночастиц как управляемый фантомный объект для тестирования потенциальных возможностей ОСТ._ __ _

ШШШЯШШЙШШ ПВИНШ НПНН Eodb

JTT-6M с разрядом в полом катоде паров золота. Соизмеримая чувствительность по обнаружению золота (0,01 мкг/мл) в биотканях крысы была достигнуга в работе [ ЛИ ] при использовании индукционно-плазменной масс-спектрометрии (ICP-MS).

Обнаружено, что через сутки максимальная концентрация золотых наночастиц накапливается в печени и селезенке и практически не проникает в мозг.

Третья глава посвящена исследованию фототермической терапии с помощью известного фотосенсибилизатора - индонианина зеленого (ICG-C44H<nN2Of,S2Na), интенсивно поглощающего оптическое излучение в ближней инфракрасной области и сравнению с технологией резонансного лазерного нагрева с золотыми плазмонио-резонансными нанооболочками при управлении соответствующими концентрациями и уровнем лазерного воздействия.

Проведены детальные исследования пространственного нагрева раствора ICG от концентрации и уровня плотности лазерной мощности, как в непрерывном режиме (Рис. 11), так и в импульсном

(е)

Рис. 11.Термограммы резонансного лазерного нагрева раствора ИК фотосенсибилизатора типа Индоцианин зеленый (ICG) для различной его концентрации при воздействии излучения полупроводникового лазера (810нм) с мощностью 1 Вт в течении 3 мин (180 Дж); а-вода; б- ICG 1/128 мкМ/мл; в- ICG 1/64 мкМ/мл; г- 1CG 1/32 мкМ/мл; д- ICG 1/16 мкМ/мл ; е- 1CG 1/8 мкМ/мл .

Как показали исследования по резонансному лазерному нагреву раствора ICG выбором концентрации и уровня лазерной мощности возможно управление локальной температурой и ее пространственным распределением, причем как уровень температуры, так и ее пространственное распределение в объеме может быть соизмеримо с лазерным нагревом золотых плазмонно-резонансных наночастиц (Рис.1.). Проведенные эксперименты по ИК резонансному лазерному фототермолизу при введении ICG лабораторным крысам показали возможность осуществления управляемой локальной гипертермии._

•У. Г ■ Ч * 'л :., * * * , - •■

(в) (г)

Рис.12. Термограмма ИК лазерной гипертермии биотканей лабораторной крысы in vivo при внутрикожном (а), подкожном (б), внутримышечном (в) введении фотосенсибилизатора Индоцианина -J зеленого (1CG 0,78 мг/мл) и контроль (г) при непрерывном облучении лазерным пучком (810 нм, мощностью 1 Вт в течении 1 мин.

Экспериментально проведено детальное сравнение резонансного ИК лазерного нагреву двух принципиально разных сред: коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных^ нанооболочек, представляющей модель дискретной поглощающей и рассеивающей объемной среды и ИК фотосенсибилизатора - Индоцианина зеленого (ICO-модель поглощающей оптически однородной среды. В результате проведенных исследований было установлено, что| выбором концентрации наночастиц и красителя в случае непрерывного резонансного лазерного облучения (810нм) можно получить соизмеримые результаты нагрева как фантомах, так и н^ лабораторных животных in vivo. Однако, в импульсном режиме облучения при одинаковой средней оптической мощности по сравнению с непрерывным режимом, для плазмонно-1 резонансных частиц наблюдается существенно меньший нагрев объемной среды по сравнению! с фотосенсибилизаторами и это отличие возрастает с уменьшением длительности лазерных импульсов и увеличении скважности, что потенциально делает технологию лазерного! импульсного фототермолиза, основанную на плазмонно резонансных частицах наиболее перспективной для локального термолиза патологических клеток (Рис.13).

(Д) *

Рис. 13.Сравнительные термограммы ИК резонансного лазерного нагрева коллоидного раствора золотых1 плазмонно-резонансных наноболочек (Au/Si02 - 30/140 нм с массовым содержанием золота 37мкг/мл) (а,в,д) и ИК фотосенсибилизатора - Индоцианина зеленого (ICG) с концентрацией 78 мкг/мл) (б,г,ж)1 при воздействии на кювету типа Эппендорф излучения полупроводникового лазера(810 нм) со средней

энергией 180 Дж .(а,б)-непрерывный режим; ((г,д)-дпительность импульса 1 мс, скважность 2, (д,ж)-длительность I мс, скважность 4.

Предложен неинвазявный метод оценки функциональной гибели клеток апробированный для эритроцитов цельной крови человека при лазерном фототермолизе, основанный на анализе в реальном времени субклеточного комбинационного рассеяния, измеренного с помощью лазерного конфокального томографа. При воздействии пучка синего лазерного излучения (Х=473 нм), резонансного для молекул гемоглобина и сфокусированного до размера длины волны на поверхности эритроцита достаточно мощности не более 20 мВт и времени воздействия менее 10 секунд для локального фототермолиза с образованием карбонизации (локальная температура >180 °С). Спектры КР одного эритроцита до (а) и после (б) соответствующего лазерного фототермолиза представлены на Рис. 14. (масштаб по оси абсцисс в волновых числах 103см"!)

'А

(а) (б)

Рис.14. Спектры КР одного эритроцита до (а) и после (б) соответствующего лазерного фототермолиза. Предлагаемый метод позволяет исследовать спектры КР любых форменных образований крови, включая лейкоциты и тромбоциты при воздействии лазерного излучения и контролировать необратимый процесс гибели клеток.

Четвертая глава посвящена исследованию процессов инактивации аксонов соматического нерва лягушки, прокрашенного фотосенсибилизаторами при воздействии резонансного лазерного излучения. Предложена методика исследования воздействия лазерного излучения на динамический отклик нейронов с временным разрешением от сотен микросекунд в течении нескольких часов которая позволила исследовать как фототермические процессы инактивации нейронов при использовании ИК фотосенсибилизаторов (ICG), так и фотодинамическое воздействие при использовании фотосенсибилизаторов - метиленового | синего при облучении Не-Не лазером(Х=633 нм) и эритрозина -В при облучении твердотельным YAG Nd лазером с диодной накачкой (Х=532 нм) с плотностью оптической мощности не более 500 мВт/см2.

Результаты резонансного ИК фототермолиза пучка аксонов соматического нерва

) лягушки прокрашенного индоцианином зеленым, представлены на Рис. 15.

«•*•------------------- -----

(а) (б)

Рис.15.Эволюция составного потенциала действия ансамбля аксонов соматического нерва ля1ушки, прокрашенного фотосенсибилизатором-индодианином зеленым (1 мкМ/мл), возбуждаемого яеклеточно последовательностью миллисекундных электрических импульсов и облучаемого

полупроводниковым лазером ( (¡аЛ1Л* , л 810 нм, Р 10 Нг'с\г) в течении IОмни.: а- сразу после воздействия, б-через 30 мни.

Нссдсдоиаине динамического отклика аксонов соматического нерва лягушки как гю время лазерной? облучения. !ак п в течении нескольких часов после воздействия, а также численное моделирование процессов инактивации на основе системы уравнении Холжкина и Хаксли [Л17.Л18], модифицированных для возбуждения последовательностью внешних миллнсскундпых электрических импульсов, позволили предположить, что инактивация нейронов происходи!' вследствие функционального фотоповреждения N3' потешшал-завиеммых канатов. гак и мембраны митохондрий, нарушающий функционирование активного К 'N¡1 транспорта плазматической мембраны аксонов.

Экспериментально обнаружено, что нелинейно-динамический отклик аксонов соматического нерва лягушки проявляется через механизм удвоения периода следования возбуждающих электрических импульсов, когда этот период становится соизмеримым со временем рефрактерное™, что приводит динамическому хаосу, отражающемуся в нерегулярной последовательности составного потенциала действия аксонов и амплитуды ПД и соответственно накладывает ограничения на предложенный электрофизиологический метод диагностики фотосенсибилизаторов (Рис.16).

ТО ООО-

?о осо

10 ООО • 0 ООО

у .10 ОСО

-1Н

•■Л

1«вО

Р»М.1»лсу гчц

$00 ' 700'

5 о

ДГ

ж .......

Ж .-.41»

иг

ОрЧаге I

15 000 •

10 осо ■

"Л.

а.

1710 1720 _Пт» (д»сог)й51

(а.б)

УИЧЩЛЙ МИ

(в.г)

Рис. 16.С'ос1авнон потенциал действия соматического нерва лягушки (а. в.) и соответствующий спектр мощности динамического отклика нерва (б. г) при возбуждении регулярной последовательностью электрических импульсов с различной частотой следования (Г) при фиксированной амплитуде (двойном порш) и длительности (0.1 мс) стимулирующим импульсов: а. б - Г - 89 Гц (регулярная последовательность); в. г - Г 487 Гц (режим динамического хаоса).

ВЫВОДЫ

1. Апробирован управляемый ИК лазерный фототермолиз клеток и биотканей на основе золотых плазмонно-рсзопансных нанооболочек и наностержней при различной концентрации наночаемш и объеме (отЮ'доЮ4 см ) при оптимизации режимов облучения (непрерывный, импульсный при плотности лазерной мощности 10-20 Вт/см2) при бесконтактном контроле 2-И температурных полей с помощью тепловизора.

Реализован нсинвазнвнып оптический метол контроля функциональной инактивации отдельных клеток крови при лазерном фототермолизе на основе анализа комбинационного рассеяния, измеренного с помощью коифокатьного микроскопа.

Обнаружен размерный эффект влияния золотых наночастип на функциональную активность тромбоцитов крови.

2. Экспериментальные исследования температурных полей при одинаковом уровне вводимой лазерной энергии в фантомы с раствором ИК фотосенсибилизатора (Индоцианин зеленый) (модель непрерывной поглощающей среды) и коллоидным раствором золотых плазмошю-резонансных нанооболочек и паностержней (дискретная поглощающая и рассеивающая среда) показали, что выбором концентрации возможно достигнуть сравнимого уровня и пространственного распределения температуры в случае непрерывного режима облучения, в то время как при воздействии последовательностью лазерных импульсов с длительностью менее миллисекунды и скважностью более двух для фантомов и биотканей с золотыми наночастицами реализуется режим лазерного патрева объемной среды на 10-20 градусов °С меньше.

Экспериментально установлены пороговые уровни плотности энергии и лазерной мощности, вызывающие дефрагментацию золотых плазмонно-резонансных напооболочек в наносекундной я фемтосекундной области.

3. Показана возможность детектирование отдельных золотых плазмонно-резонансных напооболочек и наносгержней в коллоидном водном и глицериновом растворе с помощью лазерного конфокального и пизко-когереигаого томографа. Установлена возможность определения с помощью ОСТ концентрации наночастац, когда в объем когерентности попадает одна и менее частиц (менее 109 частиц в мл). Эксперименты по повышению контрастности визуализации слоистых объемных сред при введении наночастиц в фа!ггомы на основе агара при зондировании с помощью лазерного конфокального томографа и ОСТ показали их низкую эффективность вследствие влияния сильного оптического шума, связанного с эффектами рассеяния.

4. Предложена и апробирована методика степени фототермического и фотодинамического воздействия на нейронные клетки ex vivo на основе экспериментальных исследований динамического (с миллисекундным разрешением) отклика соматического нерва лягушки, прокрашенного фотосенсибилизаторами и подверженного воздействию резонансного лазерного излучения при внеклеточном возбуждении потенциалов действия. Анализ изменения пороговых характеристик возбуждения аксонов, числа генерируемых ПД после лазерного воздействия, а также результаты численного моделирования позволяют интерпретировать процессы инактивации аксонов как фотоповреждение плазматической мембраны клеток, а также мембраны митохондрий, что отражается на функционировании активного транспорта, обусловленного работой Na+:K.+ насоса.

Список цитированной литературы: Л1. Niemeyer С.М., Mirkin С.A. Nanobiotechnology: Concepts, Applications, and Perspectives. -Weinheim: Wiley-VCH. 2004.

JI2. Дыкман JI.A., Богатырев B.A., Щёголев С.Ю., Хлебцов Н.Г. Золотые наночастины: синтез, свойства,

биомедицинское применение. М.: Наука. 2008. - 319 С. ЛЗ. Sarah L. Westcott, Steven J. Oldenburg, Т. Randall Lee,Naomi J. Halas.Formation and Adsorption of Clusters of Gold Nanoparticles onto Functionalized Silica Nanoparticle Surfaces // Langmuir. 1998. V. 14.P. 5396-5401.

Л4. Huang X., Jain P.K., El-Sayed LH., El-Sayed M.A. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold

nanoparticles // Lasers Med. Sci. 2008. V. 23. P. 217-228. JI5. Khlebtsov B.N., Zharov V.P., Melnikov A.G., Tuchin V.V., Khlebtsov N.G. Optimization of light-absorbing gold nanostmctures for photothermal therapy of cancer cells // Nanotechnology. 2006. V. 17. P. 5267-5279.

Л6. Pitsillides C.M., Joe E.K., Wei X., Anderson R.R., Lin C.P. Selective cell targeting with light-absorbing microparticles and nanoparticles // Biophys J. 2003. V. 84. P. 4023-4032.

Л7. Zharov V.P., Galitovsky V., Viegas M. Photothermal detection of local thermal effects during selective nanophotothermolysis // Appl. Phys. Lett. 2003. V. 83. P. 4897-4899.

Л.8. Hirsch L., Stafford R. I, Bankson J. A., Sershen S. R., Rivera В., Price R. E., Hazle J. D., Halas N., West J. Nanoshell-mediated near-infrared thermal therapy of tumors under magnetic resonance guidance // Proc. Natl. Acad. Sci. 2003. V. 23. P. 13549-13554.

Л.9. X. Huang, I. II. El-Sayed, W. Qian, and M. A. El-Sayed, Cancer cell imaging and photothermal therapy in the near-infrared region by using gold nanorods//J. Am. Chem. Soc.2006. V. 128. P. 2115-2120. ЛЮ.Оптическая биомедицинская диагностика. Под ред. В.В.Тучина.М: Физматлит. 2007. 953 С. Л11. Руководство по оптической когерентной томотрафии. Под ред. Гладковой Н.Д., Шаховой Н.М., Сергеева А.М. М.: Фгоматлит. Медкнига. 2007.296 С.

Л12.Тгои1тап T.S., Barton J. К., Romanowski М. Optical coherence tomography with Plasmon resonant

nanorods of gold// OPTICS LETTERS. 2007. V. 32. No. 11. P. 1438-1440.

Л13. E.B. Загайнова, M.B. Ширманова, B.A. Каменский, М.Ю. Кирилин, А.Г. Орлова

И.В. Балалаева, Б.Н. Хпебцов, А.М. Сергеев. Исследование контрастирующих свойств золотых

наночастиц для метода ОКТ// Российские Нанотехнологии. 2007. Т.2. № 7-8. С. 135-143.

Л14Ж Н. De Jong , W. I Hagens, P. Krystek , M. C. Burger, A. J.A.M. Sips, R. E. Geertsma. Particle size-

dependent organ distribution of gold nanoparticles after intravenous administration II Biomaterials.2008. V. 29.

P.1912-1919.

Л15. Владимиров Ю. А., Потапенко А. Я. Физико - химические основы фотобиологических процессов. М.: Высш. Шк. 2007. 189 С.

Л16. Uzdensky A.V., Mironov A.F. Photodynamic inactivation of the single crayfish nerve cell: dynamics of electrophysiological responses and comparison of photosensitizes// Laser Med.Sci. 1999. V. 14. P. 185-195. Л17. Ходоров Б. И. Общая физиология возбудимых мембран. М.: Наука. 1975.405 С. Л18. Хухо Ф. Нейрохимия. Основы и принципы.М.:Мир.1990. 384 С.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ!

Статьи:

1. Maksimova I.L, Akchurin G. G., Khlebtsov В. N., Terentyu G. S., Akchurin G. G.Jr., Ermolaev I. A., Skaptsov A. A., Soboleva E.P., Khlebtsov N. G., Tuchin V.V. Near-infrared laser photo thermal therapy of cancer by using gold nanoparticles: computer simulations and experiment // Medical Laser Applications .2007. V.22. P. 199-206.

2. Максимова И.Л, Акчурин Г.Г.Дерентгок Г.С., Хлебцов Б.Н., Акчурин Г.Г.мл., Ермолаев И.А., Скапцов А.А., Ревзина Е.М., Тучин В.В, Хлебцов Н.Г. Лазерный фототермолиз биотканей с использованием плазмонно- резонансных наночастиц. // Квантовая электроника. 2008. Т.38. №6. С.536-542.

3. Garif Akchurin, Boris Khlebtsov, Georgy Akchurin, Valeiy Tuchin, Vladimir Zharov, and Nikolai Khlebtsov. Laser-induced photodestruction of silica/gold nanoshells under single nanosecond pulses // Nanotechnology. 2008. №1. P.41-47.

4. A. Lemelle, B. Velcsler, I.S. Kozhevnikov, G.G. Akchurin, S.A. Piletsky and 1. Meglinski. Application of gold nanoparticles as contrast agents in confocal laser scanning microscopy // Laser Physics Letters. 2009. P.64-71.

5. Акчурин Г.Г., Селиверстов Г.А, Акчурин Г.Г.мл. Нелинейно-динамический отклик ансамбля нейронов, возбуждаемых регулярной последовательностью электрических импульсов // Известия ВУЗов Прикладная Нелилейная Динамика. 2003. № 4. С.74-79.

6. Терентюк Г.С., Акчурин Г.Г.мл., Акчурин Г.Г., Долганова М.В., Иванов А.Н., Киричук В.Ф., Максимова И.Л., Маслякова Г.Н., Трояновская Л.П., Хлебцов Б.Н., Хтебцов Н.Г., Шантроха А.В. Особенности воздействия золотых наночастиц и их конъюгатов на физиологические показатели организма при онкозаболеваниях. //Российский биотерапевтический журнал. 2008. Т.7. Xsl. С.ЗЗ.

7. Акчурин Георгий. Динамические и флукгуационпью процессы при возбуждении ансамбля нейронов последовательностью регулярных электрических импульсов // Сборник трудов конференции " Нелинейные дни в Саратове для молодых - 2002". 2002. С. 98-101.

8. Ахчурин Александр, Акчурин Георгий. Нелинейно-динамический отклик ансамбля аксонов, возбуждаемых регулярной последовательностью электрических импульсов ex-vivo // Сборник трудов конференции "Нелинейные дни в Саратове для молодых — 2003" 2003. С. 120-123.

9. G. G. Akchurin Jr., G. G. Akchurin, V. A.Bogatyrev, 1. L. Maksimova, G.A. Seliverstov, G.S.Terentyuk, B.N.Khlebtsov, N. G. Khlebtsov, V. V.Tuchia Near-infrared laser photothcrmal therapy and photodynamic inactivation of cells by using gold nanoparticles and dyes // Proc. SPIE. 2007. V. 6645. 66451U. 12 pages.

10. Maksimova I.L., Rybukho V.P., Lychagov V.V, Khlebtsov B.N., Khlebtsov N.G., Akchurin G.G. Jr, Rolbenev LO., Maksimov V.Yu., Naumova O.G., Skaptsov A. A, Terentyuk G.S., Tuchin V.V. Dynamic of gold nanoparticles labeling studied on the basis of OCT and backscattering spectra of tissues and phantoms //Proc. SPIE. 2008. V. 6855. 68550K. 10 P.

11. G. G. Akchurin, Akchurin G. G. Jr., A.N.Ivanov, V.F.Kirichuk, G.S.Terentyuk, B. N.Khlebtsov, N. G. Khlebtsov. Influence of gold nanoparticles on platelets functional activity in vitro // Proc.Spie.2008. V. 6869. 68690V. 6 P.

12. Акчурин Г.Г, Селиверстов Г.А, Акчурин Г.Г. мл. Фотодииамическая ииаетивация соматического нерва лягушки ex vivo при воздействии лазерного излучения // Материалы 4 съезда фотобиологов России. Саратов. 2005. С. 182-184.

13. Акчурин Г.Г., Селиверстов Г.А., Акчурин Г.Г. мл., Правдин А.Б., Трофимов А.Ю. Особенности локальной инактивации аксонов соматического нерва лягушки лазерным излучением (337 нм) и низко-когерентным УФА излучением // Материалы 4 съезда фотобиологов России. Саратов. 2005. С. 188-190.

14. G. S. Terentyuk, I.L. Maksimova, Akchurin G. G., Khlebtsov B. N., Akchurin G. G. Jr., Ermolaev I. A., Skaptsov A. A., Khlebtsov B. N., Khlebtsov N. G., Tuchin V.V. Optimization of laser heating with the treatment of spontaneous tumors of domestic animals by use of thermography // Proc.SPIE.2008. V. 6791. 67910Q. 10 P.

15. Garif G. Akchurin, George A. Seliverstov, George G. Akchurin , Svetlana Kudryashova. Photodynamic inactivation of somatic frognerve ex vivo //Proc.SPIE. 2004. V. 5315. P. 143-147.

16. Garif G. Akchurin, George A. Seliverstov, George G. Akchurin. Optical controlling dynamic and fluctuation processes in ensemble of neurons at pulsed electrical excitation ex vivo // Proc.SPIE. 2004. V.5330.P. 194-199.

17. Garif G. Akchurin, George G. Akchurin, George A. Seliverstov, Artyom Yu. Trofimo v. Technology and mechanism of neuron inactivation by N2 laser radiation (X=337 nm), mercury-vapor lamp (Hg X=365 nm) and low-coherence UV-A sun radiation //Proc.SPIE. 2005. V.5686. P. 581-588.

18. Akchurin G.G., Seliverstov G.A., Kamenskih T.G., Akchurin G.G. Jr. Dynamic and fluctuation processes

in ensemble of neurons at pulsed electrical and optical excitation in vivo//Proc.SPIE.2001.V.4707.P307-311. Патенты РФ:

1. Способ лазерного фототермолпза серповидно-клеточных эритроцитов. RU Л» 2345805.

Опубликовано 10.02. 2009. Бюл.№4. Авторы: Акчурин Г.Г., Акчурин Г.Г.ил, Богатырев В.А., Теренгюк Г.С.

2. Способ селективного разрушения меланомы. RU №2347563. Опубликовано 27.02. 2009. Бюл.№ 6. Авторы: Ахчурин Г.Г., Акчурин Г.Г.мл., Богатырев В.А., Максимова И.Л., Маслюкова Г.Н., Теренгюк Г.С., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г., Шантроха А.В.

3. Способ определения концентрации наночастиц. RU № 2361190

Опубликовано 10.07. 2009. Бюл.№ 19. Авторы: Акчурнн Г.Г., Акчурин Г.Г.мл., Колбенев И.О., Максимов В.Ю., Наумова О.Г., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г.

Тезисы докладов:l.G.G.Akchurin, G.A.Seliverstov, G.G.Akchurin Jr. Dynamic and fluctuation processes in ensemble of neurons at pulsed electrical excitation ex vivo I/ International Conference SYNCHRO 2002. Saratov. Book of Abstracts. P.14.

2.Г.Г. Акчурин, Г.Г. Акчурин мл., Б.В. Векслер, И.О. Колбенев, И.ЛМаксимова, И.В. Меглинский, О.Г.Наумова, А.А.Скалцов, Б.Н. Хлебцов, Н.Г. Хлебцов. Детектирование плазмонно-резонансных наночастиц низко-когерентным и конфокальным оптическим томографом для технологии лазерного фототермолиза. Труды V съезда фотобиологов России. Пущино 16-20 июня. 2008. С. 164.

3. Акчурин Г.Г.мл., Акчурин Г.Г., Максимова И.Л., Селиверстов Г., Теренпок Г.С., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г., Тучин В.В. Инфракрасный лазерный фототермолиз и фотодинамическая инактивация клеток при взаимодействии излучения с фотосенсибилизаторами и плазмонно-резонансными наночаспщами. Труды V съезда фотобиологов России. Пущино 16-20 июня. 2008. С. 163.

4. Георгий Акчурин, Гариф Акчурин, Владимир Богатырев, Даниил Браташев, Дмитрий Горин, Ирина Максимова, Сергей Портнов, Георгий Терентюк, Борис Хлебцов, Николай Хлебцов, Валерий Тучин. Управляемый ИК лазерный фототермолиз раковых клеток и клеток крови на основе технологии золотых плазмонно-резонансных наночастиц и фотосенсибилизаторов. Тезисы докладов второго Международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий «RUSNANOTECH-09». Москва. 6 - 8 октября 2009. С. 886-887.

Подписано в печать 25.11.2009. Объем 2,3 печ.л. Тираж 100 экз. Заказ № 55 Отпечатано в типографии ЗАО «КомТехСваб» 410054, г. Саратов, ул. Политехническая, д. 122

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Акчурин, Георгий Гарифович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Исследование ИК лазерного фототермолиза клеток и биотканей на основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц.

Введение.

1.1. Управляемый нагрев коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных наночастиц (наноболочек, наностержней) с помощью непрерывного ИК лазерного излучения.

1.1.1 Пространственное распределение поглощенного лазерного излучения в объемной среде золотых плазмонно-резонансных наночастиц.

1.1.2. Расчет пространственного распределения температурных полей коллоидного раствора золотых наночастиц.

1.1.3. Экспериментальные исследования ИК лазерного нагрева коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных наночастиц.

1.1.4. Динамика лазерного нагрева коллоидного раствора плазмонно-резонансных нанооболочек при воздействии непрерывного ИК лазерного излучения.

1.1.5. Динамика лазерного нагрева коллоидного раствора плазмонно-резонансных наностержней при воздействии непрерывного ИК лазерного излучения.

1.2. Особенности ИК импульсного лазерного нагрева коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных наночастиц.

1.2.1. Сравнение непрерывного и импульсного лазерного ИК нагрева плазмонно-резонансных наночастиц.

1.3. Дефрагментация плазмонно-резонансных нанооболочек при воздействии наносекундных и фемтосекундпых ИК лазерных импульсов.

1.4. Экспериментальное исследование ИК резонансной лазерной гипертермии биотканей лабораторных животных на основе технологии золотых наночастиц.

1.5. Оптический метод определения функциональной активности тромбоцитов крови и влияние золотых наночастиц различного размера на скорость агрегации тромбоцитов.

ГЛАВА 2. Детектирование золотых плазмонно-резонансных наночастиц для технологии лазерного фототермолиза.

Введение.

2.1. Визуализация и детектирование плазмонно-резонансных золотых наночастиц в фантомах и биотканях с помощью оптического низко-когерентного томографа (ОСТ).

2.1.1. Возможность определения концентрации наночастиц.

2.1.2.Проблемы визуализации объемных структур с помощью низко-когерентного оптического томографа: численное моделирование и эксперимент.

2.2. Детектирование плазмонно-резонансных золотых наночастиц в фантомах и биотканях с помощью лазерного конфокального томографа.

2.2.1. Диффузия золотых нанооболочек в кожу человека in vivo.

2.3. УФ резонансный абсорбционный метод определения концентрации золотых наночастиц в биотканях.

2.3.1.Распределение золотых наночастиц по органам и тканям, зависимость от размерности.

ГЛАВА 3. Резонансный лазерный фототермолиз биотканей при использовании ИК фотосенсибилизаторов.

Введение.

3.1. Непрерывная и импульсная ИК лазерная гипертермия фантомов и биотканей на основе фотосепсибилизатора Индоцианина зеленого (ICG).

3.1.1. Спектральные концентрационные зависимости фотосенсибилизатора Индоцианина зеленого (ICG).

3.1.2. ИК лазерный резонансный нагрев водного раствора фотосенсибилизатора -Индоцианина зеленого (ICG).

3.1.3. Особенности пространственной динамика ИК лазерного фотонагрева раствора фотосенсибилизатора Индоцианина зеленого (ICG).

3.1.4. ИК резонансный лазерный фототермолиз биотканей кожи и мышц лабораторных животных in vivo на основе технологии фотосенсибилизатора Индоцианина зеленого.

3.2. Особенности ИК лазерного фототермолиза при резонансном взаимодействии ИК излучения с фотосенсибилизаторами и золотыми плазмонно-резонансными наночастицами.

3.3. Неинвазивный метод контроля функциональной гибели клеток при лазерном фототермолизе.

Глава 4. Лазерная фототермическая и фотодинамическая инактивация нейронов.

Введение.

4.1. Метод исследования фотодинамической и фототермической инактивации нейронов при внеклеточном возбуждении потенциалов действия.

4.2. Нелинейно-динамический отклик аксонов, возбуждаемых регулярной последовательностью электрических импульсов ex vivo.

4.3. Экспериментальные исследования ИК фототермической и фотодинамической инактивации аксонов соматического нерва лягушки.

4.4. Численное моделирование процессов инактивации плазматической мембраны аксона при фото динамическом и фототермическом воздействии.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "ИК лазерная инактивация клеток и фотоповреждение биотканей, сенсибилизированных плазмонно-резонансными золотыми наночастицами и красителями"

Актуальность темы Использование нанотехнологий в медицине является одним из приоритетных направлений в современной науке, которое может дать реальную отдачу уже в самом ближайшем будущем [1]. Одно из таких направлений -лазерный фототермолиз опухолей с использованием резонансно-поглощающих наночастиц [2]. Конъюгаты золотых наночастиц с антителами селективно присоединяются к раковым клеткам, а облучение клеток лазерным излучением приводит к эффективной деструкции раковых клеток без повреждения здоровых. Лазерное излучение в ближнем инфракрасном диапазоне, попадающее в «окно прозрачности биотканей» (750-1 ЮОнм) при соответствующем уровне мощности не должно вызывать гипертермию (> 42 °С) и соответственно функциональное фотоповреждение нормальных клеток, при этом присутствие плазмонио-резонансных наночастиц в патологических клетках или связанных с их внешней плазматической мембраной вызывает некроз.

Однако с точки зрения ряда перспективных медицинских приложений, связанных с диагностикой и терапией раковых клеток, традиционные сферические золотые наночастицы диаметром от 5 до 100 нм имеют плазмонный резонанс (520560 нм), попадающий в полосу поглощения хромофоров клетки, что существенно ограничивает доставку лазерного излучения без повреждения нормальных биотканей. Наночастицы, состоящие из диэлектрического сферического ядра и металлической нанооболочки [3], представляют большой интерес для фототермальной терапии [4] и оптической визуализации раковых клеток [2]. Принципиальным преимуществом золотых нанооболочек перед обычными коллоидными золотыми наносферами является возможность настройки максимумов плазмонного резонанса поглощения и светорассеяния в нужный спектральный диапазон от видимого до ИК за счет изменеиия размера ядра и толщины оболочки [2, 5], а также благодаря возможности конструирования наночастиц с заданными спектральными коэффициентами поглощения в ближней ИК области, совпадающими с длинами волн наиболее распространенных и недорогих полупроводниковых инжекционных лазеров. Аналогичное спектральное управление возможно реализовать на основе золотых наностержней, изменяя соотношение длина-диаметр [2]. Конъюгирование золотых нанооболочек с различными типами биополимеров, позволяет повысить их биодоступность и селективность накопления наночастиц в опухолевых клетках и тканях, при этом экспериментальные данные подтверждают эффективность использования нанооболочек в качестве меток для лазерной гипертермии раковых клеток. Впервые в 2003 г. была продемонстрирована фотодеструкция раковых клеток с помощью золотых наносфер [6,61] и нанооболочек [29]. Золотые наностержни впервые в 2006 г. были апробированы для селективной фототермической терапии (ПФТТ) раковых клеток in vitro в группе El-Sayed [35]. Последние достижения по векторной доставке наночастиц и селективному лазерному фототермолизу раковых клеток представлены в обзоре [4]. Для селективной лазерной гипертермии клеток в 2003 году был апробирован метод резонансного облучения наносекундными импульсами [6], что позволило осуществить интенсивный локальный пространственный нагрев наночастиц и прилегающего объема в пределах характерного размера клеток. Однако, традиционные лазеры, генерирующие нано, пико и фемтосекундные оптические импульсы, работают в режиме синхронизации мод со скважностью более 100 и соответственно малой средней мощностью и энергией, но очень большой пиковой мощностью, что должно вызывать нелинейные термические эффекты при термолизе наночастиц и клеток, поэтому необходимо исследовать воздействие сверхкоротких оптических импульсов на устойчивость таких структур как нанооболочки. Предлагаемые лазерные технологии пока не вышли за рамки «чашечки Петри». В реальной ситуации при облучении лазерным пучком биотканей, обладающих сильным рассеянием, возникают существенные проблемы доставки излучения с определенной плотностью на заданную глубину [7], а тем более регулирование локальной температуры нагрева биотканей плазмонно-резонансными наночастицами для обеспечения некроза или апоптоза клеток. Для разработки управляемого лазерного фототермолиза биотканей необходимы детальные исследования ИК лазерного нагрева коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и наностержней при различных режимах, наиболее оптимальных для фото деструкции биотканей полупроводниковых лазеров (810 нм), в которых реализуется как непрерывный, так и импульсный режимы с милли и микросекундной длительностью, с регулируемой скважностью для различной концентрации наночастиц. Для разработки технологии управляемой лазерной гипертермии раковых опухолей на основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц с контролем температуры необходимо проведение экспериментальных исследований, как на фантомах, так и' in vivo на лабораторных животных, а также апробация на спонтанных опухолях.

Появившиеся в 21 веке в медицинских клиниках, в основном офтальмологических, оптические низко-когерентные томографы (ОСТ) позволили получать трехмерные изображения сильно рассеивающих биотканей с пространственным разрешением по глубине среза от 20 до 5 микрон при общей глубине сканирования 1,5-2 мм [8]. В 2004 году эта технология была применена для идентификации золотых плазмонно-резонансных нанооболочек, а в 2007 для наностержней [9]. В ряде работ предпринята попытка использования золотых нанооболочек в качестве вещества, повышающего контрастность визуализации слоев кожи [10]. Для оптимизации технологии ИК лазерного фототермолиза на основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц в фантомах и биотканях и оценки их пространственного распределения необходимо апробировать потенциальные возможности ОСТ для различных типов золотых наночастиц, включая нанооболочки и наностержни, эффективно поглощающие и рассеивающие оптическое излучение в ближней ИК области спектра. Субклеточного пространственного разрешения позволяет достигнуть конфокальный лазерный томограф, однако в реальных биотканях сильные эффекты оптической неоднородности могут создавать существенные ограничения на идентификацию наночастиц, что требует экспериментального подтверждения.

Для технологии лазерного фототермолиза опухолей коллоидный раствор золотых плазмонно-резонансных наночастиц может вводиться непосредственно в патологическую биоткань или внутривенно для селективного накопления в раковых клетках [2,4]. При этом возникает серьезная проблема, связанная с динамикой накопления золотых плазмонно-резонансных наночастиц в различных органах лабораторных животных. Опубликованная в конце 2007 года первая в этом направлении работа голландской группы [11] по эффекту накопления наночастиц разных размеров в различных органах лабораторных крыс требует уточнения вследствие образования кластеров наночастиц. Необходимо оценить возможности визуализации наночастиц в гистологических срезах. Кроме того необходим поиск и апробация традиционных методов визуализации in vivo таких как рентгеновская, магниторезонансная томография.

Одним из конкурентных методов интенсивно развиваемого в ведущих биомедицинских центрах ИК лазерному фототермолизу клеток и биотканей на основе технологии золотых плазмонно-резонансных наночастиц является фототермолиз на основе ИК фотосенсибилизаторов, эффективность поглощения которых может быть достигнута существенно выше, чем в коллоидном растворе наночастиц. Типичным представителем таких ИК фотосенсибилизаторов является Индоцианин зеленый (ICG), разрешенный для введения in vivo. Процессы резонансного поглощения лазерного излучения молекулами красителя (ICG), представляющие собой однородную распределенную поглощающую среду в отличие от дискретных центров поглощения и рассеяния для коллоидного раствора наночастиц должны, по-видимому, вызывать различную эффективность фототермолиза клеток и биотканей. Поэтому представляет интерес сравнение эффективности лазерного фототермолиза для этих двух технологий, особенно при импульсных лазерных воздействиях.

Фотодинамический эффект, обнаруженный ещё в начале 20 века, в настоящее время является одним из наиболее эффективных методов фотодеструкции опухолей в онкологии при воздействии резонансного лазерного излучения, поглощаемого фотосенсибилизаторами (порфиринами, хлоринами, фталоцианинами), которые селективно накапливаются в злокачественных опухолях и генерируют активные формы кислорода [15]. Одним из методов определения эффективности фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии и исследования клеточно-молекулярных механизмов фотоповреждения клеток является воздействие лазерного излучения на нервные клетки. Исследование импульсной активности медленно адаптирующихся нейронов изолированных рецепторов растяжения речного рака позволило оценить степень фотодинамического воздействия различных типов красителей [13]. Однако сложность нелинейно-динамического отклика нейрона, работающего в автоколебательном режиме, не позволяет однозначно интерпретировать механизмы фотодинамического воздействия и лазерного фототермолиза. Для исследования фотодинамического отклика на лазерное воздействие нами предлагается классический объект биофизики - соматический нерв лягушки, потенциалы действия в котором возбуждаются в неавтономном режиме. Существование адекватной математической модели активной плазматической мембраны нейрона [95], описывающей возбуждение потенциалов действия должно позволить интерпретировать процессы лазерного фототермолиза и фотодинамического воздействия, также сравнить с результатами эксперимента.

Целью диссертационной работы являлась разработка управляемого ИК лазерного фототермолиза клеток и биотканей на основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц и фотосенсибилизаторов, оценка возможности оптической визуализации наночастиц с помощью конфокального и низко-когерентного томографа, а также исследование механизмов инактивации нейронов при фототермической и фотодинамической терапии.

Задачи исследования

1 Экспериментальное исследование 2Б и ЗБ температурных полей коллоидного раствора золотых нанооболочек и наностержней, имеющих плазмонный резонанс в ближней ИК области спектра, при облучении лазерным пучком с регулируемым уровнем мощности, временем облучения для установления допустимого уровня лазерной мощности, вызывающей селективное повреждение биотканей, оценка оптимальной концентрации наночастиц и режимов работы лазера (непрерывный, импульсиый) для эффективного разрушения биотканей, включая раковые опухоли, а также клетки крови.

2. Исследовать возможность детектирования в коллоидном растворе, а также в фантомах и биотканях отдельных золотых плазмонно-резонансных наночастиц с помощью лазерного конфокального томографа и оптического низко-когерентного томографа, оценить чувствительность метода и возможность контрастирования.

3. Исследовать особенности резонансного лазерного фототермолиза с использованием ИК фотосенсибилизаторов и сравнить с возможностями фототермолиза на основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц для различных режимов облучения (непрерывного, импульсного).

4. Экспериментально исследовать динамический отклик соматического нерва лягушки, прокрашенного ИК фотосенсибилизатором (Индоцианин зеленый) при фототермическом воздействии, при возбуждении потенциалов действия и установить возможные механизмы инактивации нейронов.

Научная новизна работы

1. Впервые проведено сравнение особенностей ИК лазерного нагрева коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных наночастиц (дискретная поглощающая и рассеивающая среда) и фототермических сенсибилизаторов (непрерывная поглощающая среда) при одинаковом уровне лазерного воздействия. Экспериментально установлено, что использование импульсных (длительность менее миллисекунды) режимов работы лазеров с различной скважностью по сравнению с непрерывным при одинаковой вводимой оптической энергии позволяют осуществить локальный фототермолиз клеток при использовании золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и наностержней в отличие от технологии на основе фотосенсибилизаторов (индоцианин зеленый), где степень нагрева в импульсном и непрерывном режиме практически одинакова. Проведена оптимизация импульсных параметров ИК лазеров (длительность импульсов, скважность, средняя мощность) для локального разрушения биотканей.

2. Впервые неинвазивпо исследованы 2-Т) и З-Э температурные пространственные поля при нагреве коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных наночастиц в воде и глицерине при воздействии лазерного излучением ближнего ИК диапазона (810 нм) для различных уровней мощности, режимов работы (непрерывный, импульсный), различной концентрации наночастиц, при этом использование глицерина повышает эффективность нагрева в 1.6 раза по сравнению с водой в соответствии с отношением теплоемкостей. Экспериментально установлено, что при лазерном нагреве коллоидного раствора, Впервые установлены уровни плотности энергии и лазерной мощности вызывающие дефрагментацию золотых плазмонно-резонансных нанооболочек в наносекундной и фемтосекундной области.

О ^ биотканях. Обнаружено, что при концентрации наночастиц более 10 см" когда в объем когерентности попадает более одной наночастицы ОСТ позволяет измерить объемный коэффициент отражения и оценить динамику пространственной неоднородности распределения наночастиц, степень кластеризации коллоидного раствора наночастиц и позволяет создавать управляемые фантомы для тестирования ОСТ.

4. Разработана технология резонансного ИК лазерного фототермолиза биотканей и фантомов при использовании различной концентрации фотосенсибилизаторов (индоцианин-зеленый) при ИК резонансном непрерывном и импульсном лазерном воздействии и измерений локальной температуры с помощью тепловизора.

Впервые реализован неинвазивный оптический метод контроля функциональной инактивации при субклеточном лазерном фототермолизе на основе анализа комбинационного рассеяния, измеренного конфокальным микроскопом.

Впервые обнаружен размерный эффект влияния золотых наночастиц на функциональную активность тромбоцитов.

5. Впервые предложена методика для оценки фотодинамического или фототермического воздействия на нейроны на основе анализа динамических (с миллисекундным разрешением) процессов инактивации соматического нерва лягушки, прокрашенного фотосенсибилизаторами при измерении составного потенциала действия при лазерном облучения как в видимой, так и в ближней ИК области спектра. Проведенные эксперименты и численное моделирование позволили интерпретировать процессы инактивации нейронов с фотодинамическим или фототермическим повреждением плазматической мембраны аксонов и мембраны митохондрий, что отражается на функционировании активного транспорта.

Научно-практическая значимость работы:

1. Экспериментально апробирован ИК лазерный фототермолиз клеток и биотканей на основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц и фотосенсибилизаторов. Установлены диапазоны допустимых концентраций наночастиц и фотосенсибилизаторов для достижения заданного уровня температуры и глубины поражения биотканей от уровня лазерного воздействия и режимов облучения (непрерывный, импульсный, средняя мощность, длительность импульса, скважность). Апробация ИК лазерного фототермолиза спонтанных раковых опухолей мелких животных (собаки, кошки) показала эффективность лазерной гипертермии на основе технологии золотых плазмонно-резонансных наночастиц и фотосенсибилизаторов.

2. Проведеные эксперименты по импульсному лазерному фототермолизу спонтанных раковых опухолей при локальном введении золотых плазмонно-резонансных нанооболочек мелким животным и последующем облучении позволили выработать необходимые уровни лазерного излучения и эффективные режимы работы лазера для минимального повреждения нормальных клеток.

3. Апробированная технология субклеточного комбинационного рассеяния должна позволить неинвазивно определять степень функционального необратимого разрушения клеток, например, крови при гипертермии.

4. Обнаруженный размерный эффект влияния золотых наночастиц на функциональную активность тромбоцитов крови может быть использован в гематологии для управления процессами свертываемости крови.

5. Использование оптического конфокального и низко-когерентного томографа позволило бесконтактно детектировать золотые плазмонно-резонансные наночастицы (наносферы, нанооболочки и наностержни) до глубины 1 мм в фантомах из агара и определять концентрации наночастиц и их пространственную неоднородность. Предложено использовать коллоидный раствор золотых плазмонно-резонансных нанооболочек для тестирования ОСТ.

6. Исследование динамического отклика нейронов при возбуждении соматического нерва лягушки с помощью последовательности электрических импульсов позволило обнаружить нелинейные свойства нейронов, проявляющихся в хаотической последовательности потенциалов действия при регулярном внешнем возбуждении, что принципиально важно для понимания функционирования живых динамических систем в нейрофизиологии, кардиологии.

7. Установленные механизмы инактивации клеток при фото динамическом и фототермическом лазерном воздействии позволяет выработать стратегию фотооблучения и соответствующие уровни оптической энергии, а также оценивать эффективность различных фотосенсибилизаторов.

Достоверность научных результатов:

Достоверность полученных результатов обусловлена использованием в экспериментах стандартной измерительной аппаратуры, подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных, а численные расчеты основаны на общепринятых моделях.

Положения и результаты, выносимые на защиту

1. Управляемый ИК лазерный фототермолиз клеток и биотканей на основе золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и наностержней при

7 9 —3 концентрации наночастиц в объеме, равной 10-10 см , оптимальном режиме облучения (непрерывный или импульсный, средняя плотность лазерной мощности

10-20 Вт/см ) и бесконтактном контроле 2-Э температурных полей с помощью тепловизора. Технология управляемого резонансного лазерного фототермолиза с помощью золотых наночастиц и ИК фотосенсибилизатора индоцианина зеленого - апробирована на фантомах и спонтанных раковых опухолях мелких животных in vivo.

Реализован неинвазивный оптический метод контроля функциональной инактивации клеток крови при субклеточном лазерном фототермолизе на основе анализа комбинационного рассеяния, измеренного с помощью конфокального микроскопа.

2. ИК лазерное облучение золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и стержней (дискретная поглощающая и рассеивающая среда) и фотосенсибилизаторов (краситель индоцианин зеленый) (непрерывная поглощающая среда) при одинаковом уровне вводимой непрерывной лазерной энергии и соответствующем выборе концентрации позволяет реализовать соизмеримую эффективность разрушения фантомов и биотканей, однако при облучении последовательностью лазерных импульсов с длительностью менее миллисекунды и скважностью более двух, средняя температура фантомов и биотканей с золотыми наночастицами оказывается холоднее (на десятки градусов) в отличие от нагрева окрашенных сред.

Установлены допустимые уровни плотности лазерной энергии одиночных лазерных импульсов Е>200 мДж/см2 при длительности 4 наносекунды и 6 л

Дж/см при длительности 60 фемтосекунд, вызывающие дефрагментацию золотых плазмонно-резонансных нанооболочек.

3. Однозначное детектирование и определение пространственной неоднородности концентрации золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и паностержней в объемных фантомах и биотканях с помощью ИК низко-когерентного томографа возможно, если в объем когерентности Vc, определяемой произведением длины продольной когерентности излучателя и диаметром фокального пятна зондирующего пучка попадает не более одной наночастицы. Изменением концентрации золотых наночастиц возможно создание фантомов с управляемым коэффициентом обратного отражения от объемных сред для тестирования ОСТ.

4. Методика оценки степени фототермического и фотодинамического воздействия на нейронные клетки ex vivo на основе измерения амплитуды и формы составного потенциала действия при внеклеточном возбуждении миллисекундными электрическими импульсами соматического нерва лягушки, прокрашенного фотосенсибилизаторами и подверженного воздействию резонансного лазерного излучения. Анализ изменения динамического отклика соматического нерва при лазерном облучении позволяет интерпретировать результаты воздействия как фотоповреждение плазматической мембраны аксонов и нарушение функционирования активного транспорта.

Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями:

Основные экспериментальные результаты диссертации, прежде всего по фототермической инактивации нейронов и лазерному фототермолизу клеток крови и биотканей на основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц были проведены лично соискателем. Постановка задач исследования и обсуждение экспериментальных результатов проведена под руководством профессора, д.ф.-м.н Тучина В.В. Эксперименты in vivo и in vitro по лазерному фототермолизу опухолей животных на основе плазмонно-резонансных золотых наночастиц проведены совместно с к.в.н. Терентюком Г.С. (первая ветеринарная клиника), а агрегация тромбоцитов крови с к.м.н. Ивановым А.Н. (СГМУ). Интерпретация результатов расчета по распространению фотонов в растворе наночастиц, температурных полей и сравнение с экспериментом по лазерному воздействию проведена совместно с д.ф.-м.н Максимовой И.Л., к.ф.-м.н. Ермолаевым И.А., аспирантом Скапцовым A.A. (СГУ). Исследование оптических свойств плазмонно-резонансных золотых наночастиц при воздействии лазерного излучения и интерпретация результатов измерений проводились совместно с профессором, д.ф.-м.н. Хлебцовым Н.Г. и к.ф.-м.н. Хлебцовым Б.Н. (ИБФРМ РАН), а при воздействии фемтосекундных лазерных импульсов совместно с к.ф.-м.н. Р. Летфуллиным (Розе-Халман технологический институт, США). Совместно с к.ф.-м.н. Меглинским И.В. и аспирантом Векслером Б. (Крэнфилдский университет, Англия) проведены исследования визуализации наночастиц на конфокальном оптическом томографе, а исследования на ОСТ проведены совместно с врачом Наумовой О.Г.(Областная офтальмологическая больница г.Саратов) и доцентом, к.ф.-м.н. Акчуриным Г.Г. (СГУ). Эксперименты in vitro по лазерной фотодинамической инактивации нейронов лягушки проведены совместно с к.м.н. Селиверстовым Г.А.(СГМУ).

Гранты

Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям Госконтракт №02.512.11.2034, РФФИ, грант 07-02-01434; CRDF BRHE RUXO-006-SR-06, CRDF BRHE RUXO-006-SR-06/BP1M06, Grant № 224014 PHOTONICS4LIFE of FP7-ICT-2007-2 (2008-2013), Тематический план НИР СГУ по заданию федерального агентства по образованию РФ 1.4.09. (2009-2010), Грант президента РФ "Для поддержки ведущих научных школ" - НШ - 208.2008.2 (20082009), Аналитическая ведомственная целевая программа "Развитие научного потенциала высшей школы" РНП.2.1.1.44.73 (2006-2008), Аналитическая ведомственная целевая программа "Развитие научного потенциала высшей школы" № 2.1.1/4989 (2009-2010), Аналитическая ведомственная целевая программа "Развитие научного потенциала высшей школы" №2.2.1.1/2950 (2009-2010).

Апробация Апробация

1)Международной школе по лазерной физике, оптике и биофизике в 2001-2008, (Saratov Fall Meeting) - 8 стендовых докладов;

2) Международная конференция "Оптика лазеров" L0'2003 и LOYS'2003 (Санкт-Петербург)- 2 стендовых доклада;

3) Международная конференция "Synchronization of chaotic and stochastic oscillations" SYNCHRO-2002 - стендовый доклад;

4) Всероссийской конференции "Нелинейные дни в Саратове для молодых -2002, 2003 - 2 стендовых доклада;

5) 4 съезда фотобиологов России, Саратов, 2005, - 2 стендовых доклада;

6) Photonic West, SPIE 2002, 2005, 2006, 2008 - 5 стендовых доклада;

7) Международная конференция "Optics and Photonics 2007" SPIE (San Diego) -устный доклад;

8) 5 съезд фотобиологов России, 2008, Пущино - 1 стендовый доклад;

Диссертация состоит из введения, 4х глав, заключения и списка цитируемой литературы, состоящего из 136 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Акчурин, Георгий Гарифович

Выводы

1. Впервые предложен и апробирован метод и разработана компьютеризированная электрофизиологическая установка для исследования механизмов и оценки эффективности фотодинамического воздействия на основе анализа составных потенциалов действия, возбуждаемых в пучке аксонов соматического нерва лягушки с кратковременным миллисекундным временным разрешением и возможностью исследования долговременных процессов в течение суток.

2. Впервые экспериментально исследована фотодинамическая инактивация пучка изолированных аксонов соматического перва лягушки. При окрашивании пучка аксонов различными типами фотосенсибилизаторовпри их типичной концентрации в единицы мМУл, включая эритрозин-В (eryhtrocin-B) и локальном воздействии излучения второй гармоники лазера на алюмо-иттриевом гранате с неодимом YAG:Nd (1=0.53 мкм, Р = 4 мВт, I < 500 мВт/см ), попадающего в полосу эффективного поглощения красителя, а также индоцианина зеленого (Indocianin green) при воздействии излучением полупроводникового GaAlAs лазера (1=805 nm, I = 0.1-1Вт/ст2 ) и метиленового синего (methylene blue Mb) и облучении ITe-Ne лазера (1=633 нм, Р =20 мВт) наблюдался эффект фотодинамического функционального разрушения нейронов, при этом типичное значение интенсивности лазерного излучения, облучающего пучок нейронов, составила менее 0.5 Вт/см .

3. Проведенные исследования изменения динамических и пороговых характеристик аксонов соматического нерва лягушки при внеклеточном возбуждении потенциалов действия позволяют предложить простой метод оценки эффективности фотодинамических красителей.

4. На основе численной модели Ходжкина-Хаксли впервые проведены расчеты пороговых и динамических характеристик и предложен механизм фотодинамической функциональной инактивации аксонов, связанный с повреждением плазматической мембраны и специфических потенциал-зависимых ионных натрий- калиевых каналов, отражающийся в изменении их проводимости.

5. Впервые обнаружен нелинейно-динамический отклик ансамбля аксонов соматического нерва лягушки при регулярном внеклеточном возбуждении последовательностью электрических импульсов, когда скважность возбуждающих импульсов становится соизмеримой с временем рефрактерности. В частности для пучка мотонейронов лягушки при частоте 200-250 Гц и выше наблюдалась возникновение хаотической последовательности потенциалов действия по сценарию удвоения периода, а также обнаружена нерегулярная последовательность потенциалов действия на пороге возбуждения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Апробирован управляемый ИК лазерный фототермолиз клеток и биотканей на основе золотых плазмонно-резонансных ианооболочек и наностержней при

7 0 4 ^ различной концентрации наночастиц в объеме (от 10 до 10 см" ) при оптимизации режимов облучения (непрерывный, импульсный при плотности лазерной мощности 10-20 Вт/см2) при бесконтактном контроле 2-Б температурных полей с помощью тепловизора.

Реализован неинвазивный оптический метод контроля функциональной инактивации отдельных клеток крови при лазерном фототермолизе на основе анализа комбинационного рассеяния, измеренного с помощью конфокального микроскопа.

Обнаружен размерный эффект влияния золотых наночастиц на функциональную активность тромбоцитов крови.

2. Экспериментальные исследования температурных полей при одинаковом уровне вводимой лазерной энергии в фантомы с раствором ИК фотосенсибилизатора (Индоцианин зеленый) (модель непрерывной поглощающей среды) и коллоидным раствором золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и наностержней (дискретная поглощающая и рассеивающая среда) показали, что выбором концентрации возможно достигнуть сравнимого уровня и пространственного распределения температуры в случае непрерывного режима облучения, в то время как при воздействии последовательностью лазерных импульсов с длительностью менее миллисекунды и скважностью более двух для фантомов и биотканей с золотыми наночастицами реализуется режим лазерного нагрева объемной среды на 10-20 градусов °С меньше.

Экспериментально установлены пороговые уровни плотности энергии и лазерной мощности, вызывающие дефрагментацию золотых плазмонно-резонансных нанооболочек в наносекуидной и фемтосекундной области.

3. Показана возможность детектирование отдельных золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и наностержней в коллоидном водном и глицериновом растворе с помощью лазерного конфокального и низко-когерентного томографа. Установлена возможность определения с помощью ОСТ концентрации наночастиц, когда в объем когерентности попадает одна и менее частиц (менее 109 частиц в мл).

Эксперименты по повышению контрастности визуализации слоистых объемных сред при введении наночастиц в фантомы на основе агара при зондировании с помощью лазерного конфокального томографа и ОСТ показали их низкую эффективность вследствие влияния сильного оптического шума, связанного с эффектами рассеяния.

4. Предложена и апробирована методика степени фототермического и фотодинамического воздействия на нейронные клетки ex-vivo на основе экспериментальных исследований динамического (с миллисекундным разрешением) отклика соматического нерва лягушки, прокрашенного фотосенсибилизаторами и подверженного воздействию резонансного лазерного излучения при внеклеточном возбуждении потенциалов действия. Анализ изменения пороговых характеристик возбуждения аксонов, числа генерируемых ПД после лазерного воздействия, а также результаты численного моделирования позволяют интерпретировать процессы инактивации аксонов как фотоповреждение плазматической мембраны клеток, а также мембраны митохондрий, что отражается на функционировании активного транспорта, обусловленного работой Na:K насоса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Акчурин, Георгий Гарифович, Саратов

1. Niemeyer С.М., Mirkin С.А. Nanobiotechnology: Concepts, Applications, and Perspectives. Weinheim: Wiley-VCH. 2004.

2. Дыкман JT.А., Богатырев В.А., Щёголев С.Ю., Хлебцов Н.Г. Золотые наночастпцы: синтез, свойства, биомедицинское применение. М: Наука. 2008. -319 С.

3. Sarah L. Westcott, Steven J. Oldenburg, T. Randall Lee, Naomi J. Halas, Formation and Adsorption of Clusters of Gold Nanoparticles onto Functionalized Silica Nanoparticle Surfaces // Langmuir. 1998. V. 14. P. 5396-5401

4. Huang X., Jain P.K., El-Sayed I.H., El-Sayed M.A. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles // Lasers Med. Sci. 2008. V. 23. P. 217-228.

5. Khlebtsov B.N., Zharov V.P., Melnikov A.G., Tuchin V.V., Khlebtsov N.G. Optimization of light-absorbing gold nanostructures for photothermal therapy of cancer cells // Nanotechnology. 2006. V. 17. P. 5267-5279.

6. Pitsillides C.M., Joe E.K., Wei X., Anderson R.R., Lin C.P. Selective cell targeting with light-absorbing microparticles and nanoparticles // Biophys J. 2003. v. 84. P. 40234032.

7. Оптическая биомедицинская диагностика. Под.ред. В.В.Тучина.М: Физматлит. 2007. 953 С.

8. Руководство по оптической когерентной томографии. Под ред. Гладковой Н.Д., Шаховой Н.М., Сергеева A.M. M.: Физматлит, Медкнига, 2007. 296 С.

9. Troutman T.S., Barton J. К., Romanowski M. Optical coherence tomography with Plasmon resonant nanorods of gold // Optics Letters. 2007. V. 32. No. 11 P. 143 8-1440.

10. E.B. Загайнова, M.B. Ширманова, B.A. Каменский, М.Ю. Кирилин, А.Г. Орлова И.В. Балалаева, Б.Н. Хлебцов, A.M. Сергеев. Исследование контрастирующих свойств золотых наночастиц для метода ОКТ // Российские Нанотехнологии. 2007. Т.2. № 7- 8.Р. 135-143.

11. W. H. De Jong , W. I. Hagens, P. Krystek , M. C. Burger ,A. J.A.M. Sips, R. E. Geertsma. Particle size-dependent organ distribution of gold nanoparticles after intravenous administration // Biomaterials.2008.

12. Владимиров, Ю. А., Потапенко А. Я. Физико химические основы фотобиологических процессов. М.: Высш. Шк. 2007. 189.С.

13. Uzdensky A.V., Mironov A.F. Photodynamic inactivation of the single crayfish nerve cell: dynamics of electrophysiological responses and comparison of photosensitizes // Laser Med.Sci. 1999. V. 14. P.185-195.

14. T. Kubik, K. Bogunia-Kubik, and M. Sugisaka Nanotechnology on duty in medical applications // Current Pharmaceutical Biotechnology. 2005.V. 6. P. 17-33.

15. D. Pissuwan, S. M. Valenzuela, and M. B. Cortie Therapeutic possibilities of plasmonically heated gold nanoparticles // Trends in Biotechnology.2006.V. 24 (2). P. 62-67.

16. C. Loo, L. Hirsch, M. Lee, E. Chang, J. West, N. Halas, and R. Drezek Gold nanoshell bioconjugates for molecular imaging in living cells // Opt. Lett. 2005. V. 30. P. 1012-1014.

17. N. Harris, M. J. Ford, and M. B. Cortie Optimization of Plasmonic Heating by Gold Nanospheres and Nanoshells // J. Phys. Chem. B. 2006. V. 110. P. 10701-10707.

18. O'Neal, D.P. et al. Photo-thermal tumor ablation in mice using near infrared-absorbing nanoparticles // Cancer Lett. 2004. V. 209. P. 171-176.

19. W.R. Glomm Functionalized gold nanoparticles for application in biotechnology // J. Disp. Sci. Tech. 2005. V. 26. P. 389-414.

20. V. A. Bogatyrev and L. A. Dykman Colloidal gold in solid-phase assays // Biochemistry (Moscow). 1997. V. 62. P. 350-356.

21. J. L. West and N. J. Halas Engineered nanomaterials for biophotonics application: improving sensing, imaging and therapeutics // Annu. Rev. Biomed. Eng. 2005. V. 5. P. 285-292.

22. S. Kalelel, S. W. Gosavil, J. Urban, and S. K. Kulkarni Nanoshell particles: synthesis, properties and applications // Current Nanoscience. 2006. V. 91 (8). P. 10381052.

23. G. F. Paciotti, L. Myer, D. Weinreich, D. Goia, N. Pavel, R. E. McLaughlin, and L. Tamarkin Colloidal gold: A novel nanoparticle vector for tumor directed drug delivery // Drug Delivery. 2004. V. 11. P. 169-183.

24. Khlebtsov N. G., Bogatyrev V. A., Dykman L. A., Melnikov A. G. Spectral extinction of colloidal gold and its biospecific conjugates // J. Colloid Interface Sci. 1996. V.180. P. 436-445.

25. Hirsch L. R., Gobin A. M., Lowery A. R., Tam F., Drezek R. A., Halas N. J., West J. L. Metal 1 Nanoshells //Ann. Biomed. Eng. 2006. V. 34. P. 15-22.

26. West J., Halas N. Applications of nanotechnology to biotechnology // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. V. 11. P. 215-217.

27. Hirsch L., Jackson J. В., Lee M., Halas N., West J. A Whole Blood Immunoassay Using Gold Nanoshells //Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 2377-2381.

28. Oldenburg S. J., Averitt R. D., Westcott S. L., Halas N. Nanoengineering of optical resonances // Chem. Phys. Lett. 1998. V. 288. P. 243-247.

29. Halas N. Playing plasmons: tuning the optical resonant properties of metallic nanoshells // MR Bulletin. 2005. V. 30. P. 362-367.

30. Pham Т., Jackson J. В., Halas N., Randall Lee T. Preparation and Characterization of Gold Nanoshells Coated with Self-Assembled Monolayers // Langmuir 2002. V. 18. P. 4915-4920.

31. Алексеева A.B. Золотые наностержни: синтез и оптические свойства // Коллоидный журнал. 2006. Т. 68(5).

32. Johnson Р. В., Christy R. W. Optical constants of noble metals // Phys. Rev. B. 1972. V. 6. P. 4370-4379.

33. Xiaohua Huang, I. H. El-Sayed, Wei Qian, and M. A. El-Sayed Cancer Cell Imaging and Photothermal Therapy in the Near-Infrared Region by Using Gold Nanorods // JACS. 2006. V. 128. P. 2115-2120.

34. Jain P. К., El-Sayed I. H. and El-Sayed M .A. Au nanoparticles target cancer // Nanotoday. 2007. V. 2(1). P. 1829-1836.

35. Yu Pan, Neuss S., Leifert A., Fischler M., Fei Wen, Ulrich Simon, Schmid G., Brandau W., Jahnen-Dechent W. Size-Dependent Cytotoxicity of Gold Nanoparticles // Small. 2007. V. 3. N. 11. P. 1941 1949.

36. Kuznik B.I. Blood elements, vessel wall, homeostasis and thrombosis. M. Medicine. 1974. 164 P.

37. КиричукВ.Ф. Физиология крови. Саратов. 2005. 102 С.

38. Gabbasov Z.A. New high sensible method of platelet aggregation analysis., Labor. Affair. 1989. V.10.P. 15-18.

39. Rosi N.L., Mirkin C.A. Nanostructures in biodiagnostics // Chem. Rev. 2005. V. 105. P. 1547-1562.

40. Liao H., Nehl C.L., Hafner J.H. Biomedical applications of plasmon-resonant nanoparticles //Nanomedicine. 2006. V. 1. P. 201-208.

41. H. Г. Хлебцов, В. А. Богатырев, JI. А. Дыкман, Б. Н. Хлебцов. Золотые наноструктуры с плазмонным резонансом для биомедицинских исследований. // Российские нанотехнологии. 2007.№3-4. С. 69-86.

42. Кюнель В. Цветной атлас по цитологии, гистологии и микроскопической анатомии. М.:АСТ:Астрель. 2007. 533 С.

43. J F HAINFELD, D N SLATKIN, Т М FOCELLA, and Н М SMILOWITZ. Gold nanoparticles: a new X-ray contrast agent // British Journal Radiology. 2006. V. 79. P. 248-253.

44. Сергеев П.В., Свиридов H.K., Шимановский Н.Л. Контрастные средства. М:Медицина. 1993. 254 С.

45. Мальцев В.П. Оценка морфологических характеристик одиночных частиц по данным светорассеяния в проточной цитометрии. // Известия Академии наук. Сер. хим. 1994. N7. С. 1182-1190.

46. Gelikonov V.M., Gelikonov G.V., Dolin L.S., Kamensky V.A., Sergeev A.M., Shakhova N.M., Gladkova N.D., Zagaynova E.V. // Optical Coherence Tomography: Physical Principles and Applications. Laser Physics. 2003. V.13. №.5. P.692-702.

47. Khlebtsov B.N., Khanadeyev V.A.,Ye J., Mackowski D W., Boris, Khlebtsov N.G. // Phys. Rev B. 2008.V.77.

48. Loo C., Lin A., Hirsch L., Lee M., Barton J., Halas N., West J., Drezek R. // Technology in Cancer Research & Treatment. 2004.V. 3.№1.P. 33-40.

49. Tuchin V. V. Optical Clearing of Tissues and Blood //. Bellingham: SPIE Press. 2005.

50. Wilson B.C. The physics of photodynamic therapy // Phys. Med. Biol. 1986. V. 31. P. 327-360.

51. Anderson R.R., Parrish J.A. Selective photothermolysis: Precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation // Science. 1983. V. 220. P. 524-527.

52. Daniel M.C., Astruc D. Gold nanoparticles: Assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology // Chem. Rev. 2004. V. 104. P. 293-346.

53. Ни M., Chen J., Li Z.-Y., Au L., Hartland G.V., Li X., Marqueze M., Xia Y. Gold nanostructures: Engineering their plasmonic properties for biomedical applications // Chem. Soc. Rev. 2006. V. 35. P. 1084-1094.

54. Moghimi S.M., Hunter A.C., Murray J.C. Nanomedicine: Current status and future prospects // FASEB J. 2005. V. 19. P. 311-330.

55. Liao H., Nehl C.L., Hafner J.H. Biomedical application of plasmon resonant metal nanoparticles // Nanomedicine. 2006. V. 1. P. 201-208.

56. Дыкман JI.A., Богатырев B.A. Наночастицы золота: получение, функционализация, использование в биохимии и иммунохимии // Успехи химии. 2007. Т. 76. С. 199-213.

57. Zharov V.P., Galitovsky V., Viegas M. Photothermal detection of local thermal effects during selective nanophotothermolysis // Appl. Phys. Lett. 2003. V. 83. P. 48974899.

58. El-Sayed I.H., Huang X., El-Sayed M.A. Selective laser photo-thermal therapy of epithelial carcinoma using anti-EGFR antibody conjugated gold nanoparticles // Cancer Lett. 2006. V. 239. P. 129-135.

59. Takeda Y., Kondow Т., Mafune F. Degradation of protein in nanoplasma generated around gold nanoparticles in solution by laser irradiation // J. Phys. Chem. B. 2006. V. 110. P. 2393-2397.

60. Wieder M.E., Hone D.C., Cook M.J., Handsley M.M., Gavrilovic J., Russell D.A. Intracellular photodynamic therapy with photosensitizer-nanoparticle conjugates: Cancer therapy using a 'Trojan horse' //Photochem. Photobiol. Sci. 2006. V. 5. P. 727-734.

61. Chen W. R., Adams R. L., Higgins A. K., Bartels К. E., Nordquist R. E. Photothermal effects on murine mammary tumors using indocyanine green and an 808-nm diode laser: an in vivo efficacy study. // Cancer Lett. 1996. V. 98. P. 169-173.

62. Lucroy M.D., Chen W.R., Ridgway T.D., Higbee R.G., Bartels K.E. Selective laser-induced hyperthermia for the treatment of spontaneous tumors in dogs. // Journal of X-Ray Science and Technology. 2002. V.10. N. 3-4. P. 237-243.

63. Узденский А.Б. Клеточно-молекулярные механизмы фотоповреждения нервных и глиальных клеток лазерным микрооблучением и фотодинамическим воздействием. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. Воронеж-2004.

64. Владимиров Ю. А., Потапенко А.Я. Фотобиология. 2007. 290 С.

65. Баграташвилли В.Н. и др. Структурные изменения в соединительных тканях при умеренном лазерном нагреве // Квантовая электроника. 2002. Т. 32. №10. С. 913-916.

66. Wood D.R. Resonance Raman spectroscopy of red blood cells using ntar-infrared laser excitation // Anal. Bioanal.Chem. 2007. V. 387.P. 1691-1703.

67. Красновский А.А. / / Биофизика.2004.Т.49.В.2.С.305.

68. Henderson B.W., Dougherty T.J. How does Photodynamic Therapy Work? // Photochem. & Photobiol. 1992. V. 55. P.145-157.

69. Uzdensky A.B. Bioelectric changes in single neuron under photodynamic effect: comparison of different photosensitizers // IEEE JSTQE. 1996. V.2. P. 984-988.

70. Uzdensky A.B. Photodynamic nerve cell killing: dynamics of electrophysiological responses and photosensitizers comparison // Proc. SPIE. 1997. V. 3191. P. 130-139.

71. Uzdensky A.V., Mironov A.F. Photodynamic inactivation of the single crayfish nerve cell: dynamics of electrophysiological responses and comparison of photosensitizes // Laser Med.Sci. 1999. V. 14. P. 185-195.

72. Uzdensky A.B., Zhavoronkova A.A., The main types of isolated neuron responses to photodynamic effect of different photosensitisers // Photochem. Photobiol. 1999. V. 69. P.815.

73. Uzdensky A.B., Derkacheva V.M., Dergacheva O.Yu., Zhavoronkova A.A. A single neuron response to photodynamic effects of various aluminum and zinc phthalocyanines // Life Sci. 2000. V. 68. P. 547-555.

74. Узденский А.Б., Жаворонкова A.A., Миронов А.Ф., Кузьмин С.Г. Исследование фотодинамического действия новых фотосенсибилизаторов на изолированную нервную клетку //Изв. РАН. сер. биол. 2000. № 2. С. 230-238.

75. Uzdensky А.В., Zhavoronkova А.А., Kolosov M.S., Bragin D.E. Photodynamic effect on isolated crayfish mechanoreceptor neuron and glial cells // Eur. J. Biophysics. 2000. V. 29. N. 4-5. P. 368.

76. Uzdensky A.B., Bragin D.E., Kolosov M.S., Zhavoronkova A.A. PDT effect of different photosensitizers on a single nerve cell: electrophysiological and pharmacological study // IEEE JSTQE. 2001. V. 7, N. 6. P. 989-995.

77. Uzdensky A.B., Bragin D.E., Kolosov M.S., Dergacheva O., Fedorenko G., Anna Zhavoronkova Photodynamic inactivation of isolated crayfish mechanoreceptor neuron // Photochemistry and Photobiology. 2002. V. 74. P. 431-437.

78. Kolosov M.S., Bragin D.E., Kohany A., Uzdensky A.B. Photodynamic injury of isolated neuron and satellite glial cells: morphological study // IEEE JSTQE. 2003. V. 9. P. 337-342.

79. Kolosov M.S., Bragin D.E., Kohany A., Uzdensky A.B. Neuroglial relationships in the crayfish stretch receptor under photodynamic injury: changes in the nuclear morphology // Proceedings of SPIE. 2003. V. 5068. P. 450-457.

80. Uzdensky A.B., Bragin D.E., Kolosov M.S., Kubin A., Loew H.G., Moan J. Photodynamic effect of hypericin and water-soluble derivative on isolated crayfish neuron and surrounding glial cells. // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 2003. V. 72. P. 27-33.

81. Bragin D.E., Kolosov M.S., Uzdensky A.B. Photodynamic injury of isolated neuron and satellite glial cells: cell death and gliosis // J. Neurochem. 2003. V. 87. P. 57.

82. Bragin D.E., Kolosov M.S., Uzdensky A.B. Signaling mechanisms involved in isolated crayfish mechanoreceptor neuron response to photodynamic impact // J. Neurochem. 2004. V. 88. P. 83.

83. Uzdensky A.B., Dergacheva O.Yu., Zhavoronkova A.A., Reshetnikov A.V., Ponamarev G.V. Photodynamic effect of novel chlorine e6 derivatives on a single nerve cell. // Life Sci. 2004. V. 74. P. 2185-2197.

84. Узденский А.Б., Миронов А.Ф., Лосев А.П. Фотодинамическое действие хлоринов еб и Рб на изолированную нервную клетку, индуцированное лазерным излучением // Ж. Прикл. Спектр. 1999. Т. 66. С. 250-255.

85. Начала физиологии. Ред. А. Д. Ноздрачев. СПб. Лань. 2001.

86. Донских Е.А., Мукумов М.Р., Биофизика мембран. М.: «Наука». 1973

87. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: Высш. шк. 1989

88. Рубин А.Б. Биофизика клеточных процессов. М.:Высш. шк. 1987. 303 С.

89. Антонов В.Ф. Липидные поры: стабильность и проницаемость мембран // Соросовский образовательный журнал. 1998. № 10. С. 10-17.

90. Ходоров Б.И. Общая физиология возбудимых мембран. М.: Наука. 1975.405 С.

91. Конев С.В., Волотовский И.Д. Фотобиология. Минск. Изд. БГУ. 1974. с.34830. Волькенштейн М.И. Биофизика. М.: Наука. 1981. 575 С.

92. Plonsey R., Barr R. Bioelectricity. A quantitative approach. // Plenum Press. New York. 1988.

93. Ходжкин А. Нервный импульс. Мир. M. 1961.

94. Рубин А.Б. Биофизика. // Высшая школа. М.1987.

95. Хухо Ф. Нейрохимия. Основы и принципы. М. Мир. 1990.

96. A.L.Hodgkin, A.F.Huxley A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve // J.Physiol. (Lond.). 1952. V. 117. P. 500-544.

97. Akchurin G.G., Seliverstov G.A., Kamenskih T.G., Akchurin G.G. Jr. Dynamic and fluctuation processes in ensemble of neurons at pulsed electrical and optical excitation in vivo II Proc.SPIE. 2001. V. 4707. P. 307-311.

98. Г.Г.Акчурин, Г.А. Селиверстов, А.Г.Акчурин мл. Нелинейно-динамический отклик ансамбля аксонов, возбуждаемых регулярной последовательностью электрических импульсов ex vivo II Изв.вузов.Прикладная нелинейная динамика. 2003. Т. 11. №4-5. С. 74-79.

99. Lee S., Neiman A., Kim S. Coherence resonance in Hodgkin-Huxley neuron. //Phys.Rev.E. 1998. V. 57. P. 3292-3297.

100. Pikovsky A., Kurths Yu. Coherent resonance in a noise-driven excitable system. // Phys.Rev.Lett. 1997. V. 78. P.775-778.

101. Анищенко B.C., Нейман А.Б., Мосс Ф., Шиманский-Гайер JI. Стохастический резонанс как индуцированный шумом эффект увеличения степени порядка. // УФН. 1999. Т. 169. №1. С. 7-39.

102. Акчурии Георгий. Динамические и флуктуационные процессы при возбуждении ансамбля нейронов последовательностью регулярных электрических импульсов. Сборник трудов конференции " Нелинейные дни в Саратове для молодых 2002". 2002. с. 98-101.

103. E.Mosekilde, Yu.Maistrenko, D.Postnov. Chaotic synchronization.Application to living systems // World Scientific. 2002.

104. Goldman D.E. Potential, impedance and rectification in membranes // J.Gen.Physiol. 1943. V.27. P. 27.

105. Неотложные состояния и экстренная медицинская помощь. Ред. Е.И.Чазов. М.Медицина. 1989.

106. Аритмии сердца. Механизмы, диагностика, лечение. Ред. Мандел В.Дж., М. :Медицина. 1996.

107. Селиверстов Г.А., Акчурин Г.Г., Акчурин Г.Г. мл. Фотодинамическая инактивация соматического нерва лягушки EX VIVO при воздействии лазерного излучения // материалы 4 съезда фотобиологов России. Саратов. 2005. С. 182-184.

108. Green F.J. The Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes and Indicators. Aldrich Company, Inc. Milwaykee, Wisconcin. - 1990. 407 P.

109. Rotermund F., Weigang R., Penzkofer A. J aggregation and disaggregation of indocyanine green in water // Chemical Physics. 1997. V. 220. P. 385-392.

110. J.M. Devoisselle, S. Soulie-Begu, S. Mordon, T. Desmettre, H. Maillos A preliminary study of the in vivo behavior of an emulsion formulation of indocyanine green // Laser Med Sci. 1998. №13. P. 270-282.

111. Джералд В. Лукассен. Спектроскопия инфрокрасного поглощения и комбинационного рассеяния кожи человека in vivo// Оптическая биомедицинская диагностика под редакцией В.В. Тучина. М:ФИЗМАТ. 2007.364 С.

112. Raab о. // Z.Biol. (Muenich). 1900. В39. 524 P.

113. Jodlbauer A., von Tappeiner H. Uber die Wirkung photodynamischer (fluorescierender) Stoffe aufBakterien //Med.Wochenschr. 1904. V.51. P. 1096-1097.

114. Fox J. // Experientia.1971. V.27. P. 295-300.

115. Renat R. Letfullin, Thomas F. George, Galen C. Duree, and Brett M. Bollinger Ultrashort Laser Pulse Heating of Nanoparticles: Comparison of Theoretical Approaches // Advances in Optical Technologies. 2008. Article ID 251718. 8 P.

116. Garif Akchurin, Boris Khlebtsov, Georgy Akchurin, Valery Tuchin, Vladimir Zharov, and Nikolai Khlebtsov. Laser-induced photodestruction of silica/gold nanoshells under single nanosecond pulses // Nanotechnology. 2008 №1. P.41-47.

117. A. Lemelle, B. Veksler, I.S. Kozhevnikov, G.G. Akchurin, S.A. Piletsky and I. Meglinski. Application of gold nanoparticles as contrast agents in confocal laser scanning microscopy // Laser Physics Letters. 2009. P.64-71.

118. Акчурин Александр, Акчурин Георгий. Нелинейно-динамический отклик ансамбля аксонов, возбуждаемых регулярной последовательностью электрических импульсов ex-vivo // Сборник трудов конференции "Нелинейные дни в Саратове для молодых-2003" 2003. С.120-123.

119. G. G. Akchurin, Akchurin G. G. Jr., A.N.Ivanov, V.F.Kirichuk, G.S.Terentyuk, B. N.Khlebtsov, N. G. Khlebtsov. Influence of gold nanoparticles on platelets functional activity in vitro // Proc.Spie.2008. V. 6869. 68690V. 6 P.

120. Garif G. Akchurin, George A. Seliverstov, George G. Akchurin , Svetlana Kudryashova. Photodynamic inactivation of somatic frog nerve ex vivo // Proc.SPIE. 2004. V. 5315. P. 143-147.

121. Garif G. Akchurin, George A. Seliverstov, George G. Akchurin. Optical controlling dynamic and fluctuation processes in ensemble of neurons at pulsed electrical excitation ex vivo // Proc.SPIE. 2004. V.5330. P. 194-199.

122. Способ лазерного фототермолиза серповидно-клеточных эритроцитов. RU № 2345805. Опубликовано 10.02. 2009. Бюл.№4. Авторы: Акчурин Г.Г., Акчурин Г.Г.мл, Богатырев В.А., Терентюк Г.С.

123. Способ селективного разрушения меланомы. RU №2347563. Опубликовано 27.02. 2009. Бюл.№ 6. Авторы: Акчурин Г.Г., Акчурин Г.Г.мл., Богатырев В.А., Максимова И.Л., Маслюкова Г.Н., Терентюк Г.С., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г., Шантроха А.В.

124. Способ определения концентрации наночастиц. RU № 2361190 Опубликовано 10.07. 2009. Бюл.№ 19. Авторы: Акчурин Г.Г., Акчурин Г.Г.мл., Колбенев И.О., Максимов В.Ю., Наумова О.Г., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г.

Информация о работе

Акчурин, Георгий Гарифович
кандидата физико-математических наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

ИК лазерная инактивация клеток и фотоповреждение биотканей, сенсибилизированных плазмонно-резонансными золотыми наночастицами и красителями - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы