Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адаптивные реакции и пределы толерантности Triticum aestivum и Allium cepa к наночастицам меди и железа

ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Адаптивные реакции и пределы толерантности Triticum aestivum и Allium cepa к наночастицам меди и железа"

На правах рукописи

ДЕРЯБИНА ТАТЬЯНА ДМИТРИЕВНА

АДАПТИВНЫЕ РЕАКЦИИ И ПРЕДЕЛЫ ТОЛЕРАНТНОСТИ TRITICUM AESTIVUMW ALLIUM СЕРА К НАНОЧАСТИЦАМ МЕДИ И ЖЕЛЕЗА

Специальности: 03.02.01 - ботаника 03.02.08 - экология

1 АПР 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005566524

ОРЕНБУРГ - 2015

005566524

Работа выполнена в лаборатории агроэкологии техногенных наноматериалов ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Миро пшиков Сергей Александрович

Официальные оппоненты: Кулагин Андрей Алексеевич,

доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории лесоведения ФГБУН Уфимский институт биологии

Гайсина Лира Альбертовна, доктор биологических наук, доцент кафедры биоэкологии и биологического образования ФГБОУ ВПО Башкирский государственный педагогический университет им. М.Акмуллы

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования Пермский государственный национальный исследовательский университет

Защита диссертации состоится «28» апреля 2015 г. в 11:00_ на

заседании диссертационного совета Д 212.180.02 при ФГБОУ ВПО Оренбургский государственный педагогический университет по адресу: 460844, г. Оренбург, ул. Советская, 19; тел. (факс) (3532) 77-24-32. E-mail: ospu@ospu.ru:

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБОУ ВПО Оренбургский государственный педагогический университет; http://www.ospu.ru

Автореферат разослан «_»_2015 г.

Ученый секретарь ; ~

диссертационного совета У/ /М, Мушинская Наталья Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Дисперсные системы, содержащие минеральные нано-частицы, являются естественным компонентом большинства природных экосистем (Lead, Wilkinson, 2006). О типичности подобной ситуации свидетельствуют данные, согласно которым 1 м3 атмосферного воздуха содержит до 1 млн взвешенных частиц диаметром от 0,001 до 1000 мкм, их концентрация в пресной и морской воде достигает 5-6 млн/дм3, а наиболее существенно дисперсные системы представлены в почве (Yushkin, 2007; Kzavchyshyn, 2010). Кроме того, ожидаемый рост производства и использования наночастиц создает дополнительные риски их поступления в антропогенно-измененные экосистемы (Gottschalk et al., 2009). Однако, с позиций факториальной экологии, изучающей воздействие факторов окружающей среды на живые организмы, наночастицы оказываются еще относительно слабо охарактеризованными объектами, интерес к исследованию которых в ближайшее время будет только возрастать. Таким образом, складывается ситуация, свидетельствующая об актуальности экологической аттестации наночастиц металлов, в том числе закономерностей их поступления, распределения и накопления в компонентах биоты, а также выявления разнообразия обусловленных этим биологических эффектов и механизмов их формирования.

Степень разработанности темы. Среди живых систем, потенциально подвергающихся воздействию наночастиц, важное место занимают растения, традиционно используемые в различных системах биоиндикации и биотестирования (Kahru et al, 2008). При этом особый интерес к растениям обусловлен их базовым положением в структуре пищевых цепей, а также позитивным опытом использования в системе биологической ремедиации, что в обоих случаях связано со способностью к накоплению разнообразных химических элементов. Адекватность подобного подхода для оценки биологической активности наночастиц и наноматериалов находит подтверждение и в ряде современных исследований (Lin, 2007; Musante, White, 2010), позволивших оценить характер воздействия наночастиц ряда металлов и оксидов металлов на рост и развитие модельных растений. В Российской Федерации подобный подход закреплен в МУ 1.2. 263510 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов» (2010), а также в ряде других нормативно-методических документов. Между тем, задача оценки толерантности растений к действию наночастиц металлов, равно как и изучение механизмов их адаптации к присутствию подобных наночастиц в среде обитания, пока полностью не решены и требуют своего дальнейшего исследования.

Целью работы явилось изучение адаптивных реакций и пределов толерантности Triticum aestivum L. и Allium сера L. к условиям среды, содержащей наночастицы меди и железа, а также оценка механизмов биологической активности данных наночастиц в отношении растительных организмов.

Для достижения обозначенной цели были поставлены следующие задачи:

1. Дать сравнительную оценку толерантности растений к наночастицам Си и Fe в тестах прорастания семян Triticum aestivum в сравнении с чувствительностью к ионам и микрочастицам этих металлов.

2. Изучить особенности роста и развития растений (на моделях Triticum aestivum и Allium сера) при культивировании в среде с наночастицами Си с идентификацией механизма их действия в отношении живых систем.

3. Охарактеризовать особенности адаптации Triticum aestivum к условиям среды, содержащей субтоксические концентрации наночастиц Fe.

Научная новизна работы состоит в том, что в ней впервые определены особенности роста и развития растений Triticum aestivum и Allium сера при культивировании в среде содержащей нано-, микрочастицы и ионы железа или меди. Для организмов различного уровня организации показано согласованное изменение значений верхнего предела толерантности, прогрессивно убывающего в ряду «микрочастицы —> наночастицы —» ионы», а также более высокая толерантность к соединениям железа в сравнении с соединениями меди. Установлено, что растения преимущественно реагируют на подобное воздействие нарушением образования корневой системы. Показана возможность поступления наночастиц меди из среды культивирования в ткани корня растений через систему межклеточных контактов. Зафиксировано формирование окислительного стресса в клетках, взаимодействующих с наночастицами меди, следствием которого является повреждение присутствующей в них ДНК. Представлены данные о деградации ДНК и подавлении митотической активности в корневой системе растений при их проращивании в контакте с наночастицами меди, объясняющем природу развивающегося фитотоксического эффекта. Продемонстрирован умеренно выраженный стимулирующий эффект субтоксических концентраций наночастиц железа на рост и развитие Triticum aestivum.

Теоретическая и практическая значимость работы состоит в развитии и совершенствовании методического аппарата для анализа биологической активности вновь синтезируемых наночастиц и наноматериалов с обоснованием оптимального алгоритма проведения подобных исследований, в том числе с использованием взаимодополняющих биотестов. Полученные результаты могут быть использованы в системе обоснования допустимых уровней загрязнения растительных экосистем и агроценозов, существенным компонентом которых являются металлические дисперсии. Ростостимулирующий эффект субтоксических концентраций некоторых наночастиц расширяет показания к их использованию при предпосевной обработке семян, а также при выращивании кормовых и сельскохозяйственных растений методами аэропоники или гидропоники.

Методология и методы исследования. При проведении исследований использованы базовые подходы экспериментальной ботаники, а также дополняющие их биотесты с использованием люминесцирующих микроорганизмов, применение которых при исследовании биологической активности наночастиц одобрено действующими национальными нормативами. Спектр конкретных методов включал тест прорастания семян Triticum aestivum, классический и модифицированный варианты Allium-теста, микроскопические и электронно-микроскопические наблюдения, метод атомно-адсорбционной спектрометрии, бактериальные биотесты для оценки окислительного стресса, а также генетические тесты оценки повреждения ДНК. Все эксперименты выполнены в нескольких повторностях, а полученный фактический материал обработан с использованием методов статистического анализа.

Положения, выносимые на защиту:

1. Толерантность растений к наночастицам металлов превосходит таковую к их ионным формам, но уступает микрочастицам, при этом данные организмы более толерантны к соединениям железа, нежели к соединениям меди.

2. Низкая адаптивная способность растений Triticum aestivum и Allium сера к условиям среды обитания со значительным содержаниями наночастиц меди может быть связана с повреждением ДНК растительных клеток, следствием чего является митотоксический эффект (подавление размножения клеток до вхождения в митоз), а его итоговым проявлением — фитотоксический эффект, заключающийся в нарушении роста корневой системы растений.

3. Включение в среду культивирования наночастиц железа в определенном диапазоне концентраций стимулирует рост Triticum aestivum .

Личный вклад автора. Автором самостоятельно осуществлена постановка цели и определены основные задачи диссертационной работы, выбраны и обоснованы необходимые для их достижения методы исследований. Анализ присутствия металлов в тканях модельных растений проведен совместно с сотрудниками ЦКП «Институт микро- и нанотехнологий» ОГУ. Электронно-микроскопические исследования выполнены на базе ЦКП «Симбиоз». Автором лично выполнена основная часть экспериментов, проведена их математическая обработка, анализ и обобщение полученных результатов. Подготовка к печати научных работ, отражающих результаты диссертации, осуществлялась самостоятельно или при участии соавторов. Основной блок работ проводился в 2011-2014 годах в период обучения в очной аспирантуре и работе в ФГБНУ «ВНИИМС» РАН.

Организация исследований. Отдельные фрагменты работы выполнены при финансовой поддержке Государственного задания на проведение научных исследований по теме «Исследование прямых и отдаленных эффектов влияния наночастиц металлов на биологические системы, обеспечивающие разработку функциональных трофических субстратов» (per. № 4.2979.2011 / 1.8.11), а также гранта РНФ «Исследование по проблемам агроэкологии техногенных наномате-риалов, обеспечивающих улучшение условий жизни и среды обитания человека» (проект №14-36-00023).

Степень достоверности и апробация работы. Научные положения и выводы обоснованы и базируются на воспроизводимых экспериментальных данных, степень достоверности которых доказана путем статистической обработки. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на V и VI Всероссийских научно-практических конференциях «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2011, 2013); III съезде Российского общества медицинской элементологии (Москва, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований, получен 1 патент РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов, включает 123 страницы, 9 таблиц и 14 рисунков. Список литературы представлен 175 наименованиями, из них 71 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ДИСПЕРСИИ МЕТАЛЛОВ В ЕСТЕСТВЕННЫХ И ТЕХНОГЕННО-ИЗМЕНЕННЫХ ЭКОСИСТЕМАХ. РЕАКЦИЯ РАСТЕНИЙ И МИКРООРГАНИЗМОВ НА ВОЗДЕЙСТВИЕ НАНОЧАСТИЦ МЕТАЛЛОВ

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Рассмотрены риски поступления наночастиц в окружающую среду с накоплением в абиотических средах и компонентах биоты, в том числе входящих в состав основных трофических цепей (Тимофеев с соавт., 2008; Gottschalk et. al., 2009). Проанализированы основные методические подходы к исследованию биологической активности наночастиц (Онищенко, 2011; Kahru et al., 2008) и обобщены ранее полученные данные их практического использования (Stampoulis et al., 2009; Ghosh et al., 2010; Atha et al„ 2012; Faisal et al„ 2013). Результатом обзора литературы явилось обоснование актуальности изучения приспособительных реакций растений и микроорганизмов к присутствию в среде обитания наночастиц и наноматериалов с оценкой пределов их толерантности и механизмов реагирования на подобные воздействия.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве основных объектов исследования использованы семена мягкой яровой пшеницы Triticum aestivum L. (сорт «Учитель»), соответствующие 1 классу, а также луковицы Allium сера L. (сорт «Штутгартен») массой 10-20 г и диаметром 1,5-2 см.

Микробные объекты были представлены сенсорным штаммом Escherichia coli К12 TGI, конститутивно экспрессирующим luxCDABE-гены морской бактерии Photobacterium leiognathi 54D10 и выпускаемым под коммерческим названием «Эколюм» (НВО «Иммунотех», Россия). Второй группой микробных объектов являлись репортерные штаммы на основе E.coli К12 MG1655, несущие плазмиды с генными слияниями soxS::lux, katG::lux, recA::lux и любезно предоставленные д.б.н. И.В.Мануховым (ГосНИИгенетика, Россия). В результате подобной генетической организации названные штаммы характеризовались относительно низким уровнем свечения и специфично отвечали его индукцией при воздействии супероксид-аниона, перекиси водорода или повреждении ДНК несущих их клеток.

В качестве инструмента воздействия использованы наночастицы Си и Fe, полученные левитационно-струйным методом Гена-Миллера и любезно предоставленные д.б.н. Н.Н. Глущенко (ИЭПХФ РАН). Предварительная аттестация данных частиц на электронном микроскопе JSM 7401F («JEOL», Япония) характеризовала их как сферические образования размером 80±15 нм и 103±2 нм соответственно (рисунок 1). Использование методов рентгеновской дифрактомет-рии и мессбауровской спектроскопии идентифицировало на поверхности наночастиц оксидную пленку из РезС>4, а -ГегОз и у- FejCh или СиО, составляющую 15% и 4% от их массы. В качестве сравниваемых соединений использованы соли FeS04x7H20 и CuSOjxSlhO категории ч.д.а. («Ленреактив», Россия), а также сферические микрочастицы железа («Aldrich», Германия) и меди («Alfa Aesar», Германия) с частотой 99,5-99,9% и размерами 10 мкм и 40 мкм соответственно.

Рисунок 1. Типичные электронно-микроскопические изображения наноча-стиц железа и меди, полученные методом ПЭМ (слева) и СЭМ (справа).

Перед исследованием влияния нано- и микрочастиц или солей Си и Fe их навески в количестве, соответствующем концентрациям 100 ммоль/л, помещали в стеклянные емкости, куда вносили по 10 мл химически чистой дистиллированной воды, после чего диспергировали путем обработки ультразвуком частотой 35 кГц в источнике ванного типа «Сапфир ТТЦ» (ЗАО ПКФ «Сапфир», Россия) в течение 30 мин. На основе полученных суспензий или растворов готовили 4-кратные разведения с концентрациями от 100 до 0.39 ммоль/л в пересчете на Си или Fe.

В качестве субстрата для выращивания Triticum aestivum и Allium сера использовали кварцевый песок, который промывали и просеивали для получения фракции 0.5-2.0 мм. С целью удаления примесных элементов песок замачивали в 10% растворе НС1 в течение 24 ч, после чего 20-кратно промывали дистиллированной водой до достижения нейтрального значения рН, контролируемого с использованием анализатора жидкости «Эксперт-001» (ООО «Эконикс-эксперт», Россия). Песок повторно высушивали и просеивали, после чего прокаливали в сушильном шкафу при температуре 130° С в течение 1 часа. Навески песка увлажняли лиозолями наночастиц или суспензиями микрочастиц, растворами солей Fe и Си до полной влагоемкости. определенной по ГОСТ 12038-84. В качестве контролен использовали образцы песка, увлажненные тем же количеством дистиллированной воды. На поверхность песка в трех повторностях помещали по 30 семян Triticum aestivum или 6 луковиц Allium сера, которые заглубляли на 5 мм вглубь субстрата. Опытные и контрольные пробы проращивали в термостате при температуре 20±2°С и влажности воздуха 80±5%. Биометрические исследования растений осуществляли общепринятыми методами, выполняя прямые измерения, а также фотографирование через лупу «Микромед» МС-1 (Россия-Китай) с последующим проведением измерений на полученных изображениях.

При проведении тестов ингибирования или индукции бактериальной биолюминесценции разведения исследуемых соединений железа и меди вносили в ячейки 96-луночных планшетов из непрозрачного пластика, используя в качестве контроля ячейки, заполненные тем же объемом дистиллированной воды. В каждую ячейку вносили суспензии сенсорного или репортерного штаммов E.coli,

после чего планшет помещали в измерительный блок люминометра LM-01T («Immunotech», Чехия), динамически регистрируя интенсивность свечения в течение 90 мин. Изменение интенсивности биолюминесценции рассчитывали по

формуле I д lko D1о. t где Ik и ¡о — относительные величины свечения контрольных

"" ¡кп D Уо0

и опытных проб на 0-ой, а также 30, 60 и 90-й минутах измерения.

При анализе поступления и распределения железа и меди в Triticum aestivum отрезки корней и побегов высушивали до постоянной массы, после чего проводили пробоподготовку с использованием концентрированной азотной кислоты. Количественное определение содержания Fe и Си выполняли с использованием атомно-абсорбционного спектрометра с электротермической атомизацией «Лю-мекс» МГА-915 (Россия) на длинах волн 248,3 и 324,7 нм при температуре 2400 -2200° С и времени атомизации 1,7 - 1,5 с. Полученные значения пересчитывали на сухую массу исследуемых образцов.

Для световой микроскопии концевые фрагменты корней Allium сера длиной 1 см обрабатывали фиксатором Кларка, промывали в 70% растворе этанола, после чего окрашивали 2 % ацетоорсеином. Фрагменты меристем помещали на предметное стекло в каплю 45 % уксусной кислоты, накрывали покровным стеклом и раздавливали до клеточного монослоя. Временные давленные препараты просматривали и фотографировали при увеличении х400 на тринокулярном микроскопе «Альтами 136Т» (Россия) с цифровой окулярной камерой 8 МП, после чего на основании учета не менее 1000 клеток осуществляли расчет митотического индекса, а также оценивали морфологию клеточных ядер.

При проведении электронно-микроскопических исследований концевые отрезки корней Triticum aestivum фиксировали в 2,5 % глутаровом альдегиде, промывали натрий-фосфатным буфером (0,1Н, рН 7,2), после чего пост-фиксировали 1 % OsC>4 и дегидратировали в восходящих концентрациях этанола. Полученные образцы пропитывали смолой и окисью пропилена, помещали в капсулы Бима и ставили на полимеризацию. Срезы получали на ультромикротоме «Reichert-Jung» (Германия), контрастировали в 2% водном растворе уранилаце-тата и дополнительно окрашивали цитратом свинца по Рейнольдсу, после чего просматривали на электронном микроскопе JEM-100 (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении х 15000.

Выделение ДНК из концевых отрезков корней Allium сера проводили с использованием набора «ДНК-экстран-4» («Синтол», Россия). Электрофоретическое разделение выделенных молекул проводили в 0.8% агарозном геле в присутствии 0, 5 мкг/мл этидиум бромида при силе тока 100 мА и напряженности электрического поля 5 В/см, используя в качестве контроля HindIII-рестрикты ДНК фага X длиной от 250 до 10000 н.п. («СибЭнзим», Россия). Результат миграции ДНК оценивали на УФ-трансиллюминаторе «Vilber Lourmat» (Франция) при 254 нм, а полученные цифровые изображения обрабатывали с использованием программы «ImageJ».

Все эксперименты выполнены не менее чем в трех повторностях и обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета компьютерных программ «Statistlca» V8 («StatSoft Inc.», США).

ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ТОЛЕРАНТНОСТИ РАСТЕНИЙ (В ТЕСТЕ ПРОРАСТАНИЯ СЕМЯН TRITICUM AESTIVUM) И МИКРООРГАНИЗМОВ (В ТЕСТЕ ИНГИБИРОВАНИЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ESHERICHIA COLI) К ВОЗДЕЙСТВИЮ НАНОЧАСТИЦ, МИКРОЧАСТИЦ И СОЛЕЙ ЖЕЛЕЗА И МЕДИ

Иикубация семян Triticum aestivum в контакте с ионами железа в концентрации 100 ммоль/л полностью подавляла их пророст, в концентрации 25 ммоль/л снижала частоту прорастания до 13,3±6,8% против 98,3±2,6% в контроле (Р<0,001), в то время как дальнейшее снижение присутствия данного фактора полностью снимало указанный эффект. Более выраженные изменения были констатированы при анализе размерных характеристик побегов и корней проростков. Так концентрация ионов железа 25 ммоль/л полностью блокировала развитие корневой системы, одновременно почти десятикратно сокращая длину побега: до 7,0±1,1 мм против 66,3±4,6 мм в контроле (Р<0,05). В свою очередь концентрация ионов железа 6,25ммоль/л снижала длину корней до 16,0±0,1 мм против 221,4±21,3 мм, а длину побега в два раза по сравнению с соответствующим контролем: до 38,6±2,5 мм (Р<0,05). Рассчитанные на данной основе значения ЕС50, (таблица 1) соответствующие подавлению результативного параметра на 50% от контрольных значений и тем самым характеризующие верхний предел толерантности к ионам железа, свидетельствовали об увеличении выраженности токсического эффекта в ряду «всхожесть семян (17 ммоль/л) —♦ длина побега (6,3 ммоль/л) —»длина корня (3,3 ммоль/л)».

Таблица 1. Значения верхнего предела толерантности (параметр ЕС50), определенные в тесте прорастания семян ТгШсит аезСюит в среде, содержащей различные формы Ре и Си (ммоль/л)

Металлы и их исследуемые формы Параметры эффекта

Подавление всхожести семян Уменьшение длины побега Уменьшение длины корня

Fe ИОНЫ 17,0 6,3 3,3

наночастицы >100 >100 >100

микрочастицы >100 >100 >100

Си ионы 4.0 3.5 0,2

наночастицы >100 >100 1,7

микрочастицы >100 >100 6,7

На этом фоне использование идентичных концентраций нано- и микрочастиц Ре достоверно не сказывалось на частоте прорастания семян, в подобных случаях составившей 90,0-93,3% и 96,7-100,0% соответственно. Сходный результат получен и при исследовании размерных характеристик побегов и корней, в используемом диапазоне концентраций даже имеющих некоторую тенденцию к увеличению. Сказанное позволило констатировать высокий уровень толерантности ТгШсит аезНчит к железу в нано- и микроструктурированной формах, что нашло свое отражение при расчете соответствующих величин ЕС50.

Проведение аналогичных исследований с использованием нано-, микрочастиц и ионов меди свидетельствовало о более низкой толерантности ТгШсит аеяНуит к воздействию этого металла. В частности, анализ морфологии проростков ТгШсит аеяНуит, инкубированных в присутствии наночастиц Си, позволил констатировать статистически значимое изменение ряда биометрических параметров, преимущественно относящихся к корневой системе данного растения. Так наночастицы меди хотя достоверно и не изменяли частоту прорастания семян, но в максимальной использованной концентрации 100 ммоль/л негативно влияли на длину побегов, а наиболее выражено подавляли формирование корневой системы (ЕС5о=1,7 ммоль/л). Помимо этого результатом воздействия наночастиц меди на ТгШсит аеьйуит являлось уменьшение массы, увеличение диаметра образующихся корней, а также их необычное ветвление по типу «куриной лапки» (рисунок 2).

Рисунок 2. Морфология корневой системы ТгШсит аеьТыит в контроле (слева) и при проращивании в среде с содержанием наночастиц меди 6,25 моль/л (справа); верхний ряд - без увеличения, нижний ряд - увеличение х 8.

На этом фоне еще меньшая толерантность была зарегистрирована к ионной форме меди, выражено подавляющей частоту всхожести семян ТгШсит аеьШит (ЕС5о=4 ммоль/л), а также достоверно уменьшающей длину формирующихся побегов (ЕС5о=3,5 ммоль/л) и корней (ЕС5о=0,2 ммоль/л), что в 2-4-16 раз превышало аналогичные значения для ионов железа. В свою очередь микрочастицы Си, не оказывающие достоверного угнетающего влияния на частоту прорастания семян и длину побегов, все-таки подавляли формирование корневой системы, что характеризовалось значением ЕС5о=6,7М моль/л (таблица 1).

Исследование пределов толерантности живых объектов к воздействию соединений железа и меди было продолжено в отношении рекомбинантного люми-несцирующего штамма Escherichia coli, что позволило более полно охарактеризовать динамику развивающегося эффекта, а также подтвердить его зависимость от природы исследуемых металлов, их действующих форм и концентраций.

Так контакт Е. coli с возрастающими концентрациями ионов меди в растворе соли в диапазоне от 100 до 0,78 ммоль/л вел к развивающемуся в первые 15-60 минут выраженному токсическому эффекту - полному подавлению бактериального свечения (рисунок За).

Время, мин. Время, мин. Время, мин.

Рисунок 3. Динамика свечения Е. coli К12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами Р. leiognathi при контакте с ионами (А), нано- (Б) и микрочастицами (В) меди, использованными в концентрациях 100 (1); 50 (2); 25 (3); 12,5 (4); 6.25 (5); 3.12 (6); 1.56 (7); 0.78 (8); 0,39 (9); 0,19 (10) и 0,09 (11) ммоль/л; контроль (к). По оси абсцисс - время контакта, мин; по оси ординат - регистрируемые значения интенсивности свечения.

В свою очередь для формирования аналогичного эффекта ионов меди в концентрации 0,39 ммоль/л требовалось уже 170 мин. а еще более низкие дозировки обуславливали лишь относительную ингибицию бактериальной биолюминесценции до 10-70 % от контрольных значений. Сходный результат зафиксирован при тестировании возрастающих концентраций ионов железа, по своим динамическим и количественным характеристикам существенно не отличающийся от такового для ионов меди. На этом фоне наночастицы меди также обуславливали ингибиро-вание бактериальной биолюминесценции, количественные характеристики которого, однако, имели ряд существенных отличий. Первым из них было замедленное формирование токсического эффекта, развивающегося только со 120-й минуты контакта. Второй особенностью стало то, что для достижения подобного эффекта требовались значительно более высокие концентрации наночастиц меди - от 12,5 до 100 ммоль/л (рисунок 36).

Еще в большей степени толерантность бактерий была выражена в отношении наночастиц железа, в стандартных условиях не проявляющих токсического эффекта, а в отдельной серии экспериментов, предусматривающей выращивание Е. coli в среде с тестируемыми соединениями, все-таки вызывающих подавление бактериального свечения, но только в максимальной использованной концентрации 100 ммоль/л и только при высокой продолжительности воздействия. На этом фоне микрочастицы Си и Fe проявляли себя как наиболее биологически инертные образцы, среди которых способность к ингибированию бактериальной биолюминесценции проявляли только микрочастицы меди в максимальной использованной концентрации (рисунок Зв).

Приведенные данные явились основой для построения зависимостей «доза-эффект» для каждого из исследуемых соединений, а также расчета величин ECso, отражающих верхний предел толерантности бактерий и соответствующих молярным концентрациям Си и Fe, вызывающим 50% ингибирование бактериальной биолюминесценции по сравнению с контролем при различной продолжительности воздействия (таблица 2).

Таблица 2. Значения верхнего предела толерантности (параметр ECso) реком-бинантного штамма Е. coli К12 TGI с клонированными luxCDABE-veumu P.leiognathi к воздействию различных форм Fe и Си (ммоль/л)

Металлы и их исследуемые формы Продолжительность воздействия, мин

60 120 180

Fe ИОНЫ 0,070 0,065 0,060

наночастицы >100 >100 >100

микрочастицы >100 >100 >100

Си ионы 0,083 0,068 0,058

наночастицы >100 58,0 1,5

микрочастицы >100 96,0 75,0

На этом фоне особенностью исследованных соединений железа явилась способность к ингибиции бактериальной биолюминесценции только у его ионной формы, вновь развивающейся уже на ранних сроках воздействия. В то же вре-мяиспользование технологии биолюминесцентного биотестирования не позволило зафиксировать токсических свойств как у нано-, так и у микрочастиц Ре, что подтвердило как высокий уровень толерантности к ним живых объектов, так и представления о высоком уровне биосовместимости подобных соединений.

Таким образом, результаты первого этапа исследований позволили получить развернутые представления о значениях верхнего предела толерантности модельных растений и бактерий к препаратам железа и меди, закономерно снижающейся в ряду «микрочастицы —► наночастицы —> ионы» и нарастающей от меди к железу. При этом детали подобного эффекта заключались в определении корневой системы растений как основной «мишени» для воздействия металлических наночастиц, формирующем основу для продолжения исследований в заданном

направлении для выявления механизмов регистрируемого фитотоксического эффекта. Кроме того, микроорганизмы оказывались более чувствительными к действию исследуемых соединений металлов чем растения, однако, существенный параллелелизм результатов исследования биологической активности ионов, нано- и микрочастиц в растительном биотесте и тесте ингибирования бактериальной биолюминесценции определил возможность последующего использования данных о тонких механизмах токсичности названных соединений, получаемых с использованием бактериальных моделей, и для объяснения характера их действия в отношении высших растений.

ГЛАВА 4. АДАПТИВНЫЕ РЕАКЦИИ РАСТЕНИЙ К ПРИСУТСТВИЮ В СРЕДЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НАНОЧАСТИЦ МЕДИ

Приспособление ТгШсит аеъИх'ит к присутствию в среде культивирования наночастиц меди в первую очередь проявлялось в изменениях корневой системы модельных растений (таблица 3). При этом наиболее выраженные реакции заключались в нарушении роста первичного корня, компенсаторном увеличении количества боковых корней, рост которых, однако, также оказывался существенно подавлен.

Таблица 3. Характеристика корневой системы ТгШсит аейНуит при культивировании в среде, содержащей различные концентрации наночастиц меди

Концентрация на- Длина первичного Количество прида- Длина придаточ-

ночастиц ммоль/л корня, мм точных корней, шт ных корней, мм

Контроль 98,9±5,54 2,13±0,06 76,5±4,12

100 2,46±0,61*** 3,7±0,34* 2,25±0,18***

25 3,6±1,6*** 4,2±0,2* 2,41±0,22***

6,25 15,1±2,34** 4,1±0,27* 5,69±0,66***

1,56 45,9±4,54* 2,79±0,19 25,71 ±1,77*

0,39 95,9±9,08 2,26±0,16 71,77±4,82

Обозначения: * - Р<0,05; ** - Р<0,01; *** - Р<0,001

Указанное обстоятельство определило интерес к углубленному изучению механизмов и последствий взаимодействий в системе «корень-наночастицы», реализованному с использованием микроскопических и генетических методов анализа.

Электронно-микроскопическое исследование контрольных образцов апикальной части корней ТгШсит ае$!т/т выявляло у визуализированных клеток сходные и характерные для меристемы черты ультраструктуры (рисунок 4). При этом исследованная зона корня состояла из плотно расположенных изодиаметри-ческих клеток размером от 6><14 до 10x25 мкм с плотной цитоплазмой и относительно крупными ядрами диаметром от 1,5 до 2 мкм. В их цитоплазме обнаруживались свободные рибосомы и короткие профили эндоплазматического ретику-лума, единичные пластиды, а также более многочисленные митохондрии длиной до 1,7 мкм и шириной около 0,25 мкм с характерной морфологией.

Рисунок 4. Фрагменты ультраструктуры клеток корня ТгШсит аеайшт в контроле (слева) и при проращивании в среде с наночастицами меди 6,25 ммоль/л (справа). Обозначения: кс - клеточная стенка; мх - митохондрия; в - вакуоли; нч -наночастицы. Стрелкой указано место предполагаемого прохождения наночастиц меди через плазмодесму.

Кроме того, в клетках присутствовал в различной степени развитый вакуо-лярный аппарат, представленный округлыми образованиями диаметром 100-200 нм с электронно-прозрачным содержимым. Клетки контрольных образцов корня были окружены плотно прилегающими клеточными стенками толщиной 246±45 нм, при этом использованный метод контрастирования не визуализировал в них заметного количества плазмодесм.

В свою очередь, электронно-микроскопическое исследование корней пшеницы. выращенной в присутствии наночастиц меди, позволило констатировать ряд ультраструктурных изменений, в частности, затрагивающих характер организации клеточных стенок. При этом в них обнаруживались многочисленные плазмо-десмы. визуализируемые как электронно-плотные полосы, пересекающих клеточные стенки на расстоянии 0,5-2 мкм друг от друга (рисунок 4).

В использованном экспериментальном контексте (в отсутствие дополнительного контрастирования) формирование электронной плотности на участках плазмодесм могло быть следствием прохождения через них наночастиц, оставляющих за собой «следы» из дислоцировавших с поверхности кластеров меди. Дополнительными аргументами в пользу данного предположения являются сопоставимость диаметра плазмодесм (до 70 нм) и использованных наночастиц. а

также регистрируемая на некоторых электроннограммах ассоциированность последних с местами открытия плазмодесм в цитозоль растительных клеток. Кроме того, важной особенностью оказывалось более чем двукратное (684±120 нм, Р<0,01) утолщение клеточных стенок в корнях, выросших в присутствии наночастиц меди. Данный факт, с одной стороны, может рассматриваться как одно из проявлений реакции тканей растения на проникновение и распространение наночастиц меди, а с другой — объяснять природу утолщения корней пшеницы при подобном воздействии по сравнению с соответствующим контролем.

Другим важным результатом электронно-микроскопического исследования являлась визуализация в цитоплазме клеток опытных образцов корня ТгШсит аеьСмит многочисленных электронно-плотных образований округлой формы, по своим характеристикам полностью соответствующих заявленным параметрам использованных наночастиц. Сказанное свидетельствует в пользу возможности поступления меди в ткани растений в исходной наноструктурированной форме, где предполагаемой движущей силой данного процесса является градиент концентраций наночастиц в системе «среда культивирования - ткань корня», а механизмом распространения - межклеточный перенос вглубь корня через систему плазмодесм.

В продолжение анализа распределения наночастиц меди в тканях модельных растений количественное содержание этого элемента с пересчетом на сухую биомассу ТгШсит аеяНтт было исследовано методом атомно-адсорбционной спектроскопии (таблица 4).

Таблица 4. Количественное содержание Си в проростках ТгШсит аайшт (в пересчете на сухую биомассу, мкг/г), инкубированных в присутствии различных концентраций наночастиц меди

Исследуемые части ТгШсит ае.Шх'ит Концентрация наночастиц меди в среде культивирования, мкг/мл Контроль

6350 1587,5 396,9 99,2 24.8

Побеги 291,32 ±64,09 *** 150,99 ±33,22 *** 36,05 ±7,93 ** 18,18 ±4.00 * 7,86 ±2,59 5,19 ±1,71

Корни н/о н/о 287,91 ±63,34 * ** 46,34 ±10,19 ** 6,91 ±2,28 4.78 ±1,57

Обозначения: * - Р<0,05; ** - Р<0,01; *** - Р<0,001; н/о - не определяли

При этом если присутствие меди в контрольных образцах описывалось величинами 4,78±1,57 мкг/г в корневой системе проростка и 5,19±1.71 мкг/г в его зеленом побеге, то инкубация в контакте с наночастицами сопровождалась значительным нарастанием этого элемента.

Так при культивировании семян пшеницы в среде с содержанием наночастиц меди от 0,78 ммоль/л (=24.8 мкг/мл) до 6.25 ммоль/л (=396,9 мкг/мл) вело к выраженному накоплению данного металла в формирующейся корневой системе: от 6.91 ±2,28 до 287,91 ±63,34 мкг/г. что соответствовало достаточно высоким показателям эффективности его извлечения из среды культивирования. В свою очередь присутствие меди в зеленых частях проростков ТгШсит аеэНшт во всем используемом диапазоне воздействующих концентраций возрастало от 7.86±2,59 до 291,32±64,09 мкг/г, что в сопоставимых пробах в 2,5-7,9 раза уступало ее содержанию в тканях корня. Тем самым полученные результаты демонстрируют возможность пропорционального воздействующей концентрации наночастиц меди поступления и распространения данного металла в тканях проростков пшеницы с преимущественным накоплением в корневой системе, что развивает положение о последней как основной «мишени» для реализации биологической активности металлических наночастиц.

Исследование непосредственных механизмов фитотоксичности наночастиц Си было проведено в модифицированном варианте АШит-теста. При этом проведенный анализ контрольных образцов позволил выявить типичную для меристе-матических тканей корня лука картину, характеризующуюся присутствием 7,48±1.10 % клеток, находящихся на различных стадиях митоза (рисунок 5).

Рисунок 5. Митотоксическое действие наночастиц меди в модифицированном варианте АШит-теста: а - контроль; б - опыт (проращивание в присутствии 6.25 ммоль/л наночастиц меди. Обозначения: м - клетки, находящиеся на разных стадиях митоза; кпя - кариопикнотические ядра.

В свою очередь культивирование луковиц Allium сера в присутствии нано-частиц меди позволило констатировать уменьшение средней длины образующихся корней (ЕС50 = 10,5 мМ), что в сравнении с аналогичными результатами на Triticum aestivum свидетельствовало о несколько большей толерантности этого растения к подобному воздействию, но по своей направленности хорошо согласовывалось с аналогичными результатами на проростках пшеницы. В свою очередь микроскопическое исследование корней, пророщенных в контакте с наночасти-цами свидетельствовало о полном подавлении пролиферативной активности со стремящимися к нулю значениями митотического индекса, сохраняющем клетки в интерфазном состоянии и делающем технически невозможным регистрацию митоз-модифицирующих или мутагенных эффектов. Дополнительным проявлением подобного митотоксического эффекта наночастиц меди являлись деструкция и конденсация хроматина (рисунок 5) что соответствовало процессу пикно-тического разрушения ядра и являлось одним из признаков гибели растительных клеток. С целью выяснения природы регистрируемых явлений в отдельной серии экспериментов действие наночастиц меди было оценено в оригинальном варианте Allium-теста, подразумевающем контакт их суспензии с предварительно проро-щенной корневой системой лука. При этом электрофоретическое разделение ДНК, выделенной из концевых отрезков корней после 3-часовой инкубации в среде с наночастицами меди, позволило констатировать существенную и дозоза-висимую деградацию данного биополимера (рисунок 6).

Рисунок 6 Электрофореграмма ДНК, выделенной из концевых отрезков корней Allium сера (слева) и основанный на этом расчет соотношения длинноцепо-чечных и корогкоцепочечных фрагментов ДНК (справа). Обозначения: м -маркеры электрофоретической подвижности ДНК; к - контроль; 1,2,3 - корни, инкубированные в контакте с наночастицами Си в концентрациях 100; 25 и 6,25ммоль/л, соответственно; темная часть столбчатой диаграммы - доля фрагментов размером >1000 н.п., светлая часть - доля фрагментов размером < 1000 н.п.

Так, если электрофоретическая подвижность выделенной их контрольных образцов ДНК характеризовала ее как достаточно протяженные полимерные молекулы, основная доля которых представлена участками > 10 тысяч н.п., то результатом воздействия наночастиц меди оказывалось существенное укорочение изолированных фрагментов ДНК. В частности, результатом воздействия максимальной (100 ммоль/л) концентрации наночастиц меди являлась экстремально выраженная деградация ДНК с превращением 80 % данного биополимера в короткоцепочечные фрагменты < 1000 н.п. Снижение воздействующей концентрации наночастиц до 25 ммоль/л сохраняло до двух третей ДНК в длинноцепо-чечной форме, в то время как 35 % по-прежнему имели размер < 1000 н.п. Наконец понижение присутствия наночастиц меди до 6,25 ммоль/л переводило в короткоцепочечную форму не более 10 % изолированных фрагментов ДНК.

В качестве вероятной причины происходящих событий было выдвинуто предположение о взаимодействии наночастиц меди с внутриклеточными цепями переноса электронов, для проверки которого была проведена серия экспериментов с клетками Escherichia coli, являющимися близкими аналогами митохондрий эукариот. При этом в качестве объектов иследования в данной серии экспериментов выступали репортерные люминесцирующие штаммы на основе E.coli К12 MG1655, несущие плазмиды с генными слияниями pSoxS::lux, pKatG::lux или recA::liix, реагирующие развитием свечения при возникновении окислительного стресса или повреждения ДНК, соответственно.

Полученные результаты позволили констатировать, что контакт бактериальных клеток с наночастицами меди в диапазоне концентраций 6,25 - 50 ммоль/л вел к образованию в них активных форм кислорода, регистрируемому на основе специфически запускаемой с промоторов PsoxS и PkatG транскрипции кассеты репортерных luxCDABE-генов как реакции на супероксиданион и перекись водорода соответственно (рисунок 7а,б).

При этом более выраженная максимальная индукция генноинженерной конструкции soxS::lux (/„,„,= 9.23±0.46) по сравнению с katG::lux (Г,,,,„= 6.49±0.33) может быть интерпретирована как свидетельство первичности образования супероксиданиона, потенциально возникающего при переносе электрона через электропроводящую наночастицу меди на молекулярный кислород и в дальнейшем спонтанно дисмутирующего в перекись водорода.

С другой стороны, представленные данные свидетельствуют о том, что способность к индукции окислительного стресса не является исключительным свойством наночастиц меди, но присуща и иным соединениям этого металла. При этом значимые особенности подобной активности заключались в том, что в присутствии ионов Си2+ транскрипция генов-репортеров с промоторов PsoxS и PkatG запускалась при более низких (0.02 - 1.25 ммоль/л), а в присутствии микрочастиц при более высоких (5 - 10 ммоль/л) концентрациях, с достижением максимальной кратности индукции свечения в 1.5-3 меньше таковой при использовании наночастиц. Тем самым полученные данные свидетельствуют в пользу универсальности механизма биологической активности сравниваемых соединений, одновременно хорошо согласуясь с описанными выше изменениями уровня толерантности к меди в ряду «микрочастицы —► наночастицы —» ионы».

В завершение данной серии экспериментов с использованием репортерного штамма Е.соИ рНесА::1их, отвечающего индукцией свечения при развитии 808-ответа, установлено подобное следствие воздействия наночастиц меди на бактериальные клетки-мишени как результата повреждения их ДНК образующимися в процессе окислительного стресса активными формами кислорода (рисунок 7в).

Рисунок 7. Кратности индукции свечения (1и,„>) репортерных штаммов Е.соН К12 МС1655 с плазмидами рБохБуАих (а), рКаЮ::1их (б) и pR.ecА: Лих (в) при контакте с наночастицами (1), ионами (2) и микрочастицами (3) меди.

При этом развитие свечения регистрировалось в широком диапазоне концентраций (1.25 - 5 ммоль/л) и характеризовалось наиболее высокими кратностями индукции (/„,«> = 15.54±0.77), что позволяло рассматривать ДНК-повреждающее действие в качестве ведущего механизма токсичности наночастиц меди.

Таким образом, полученные данные демонстрируют возможность поступления и идущего через систему межклеточных контактов распространения наночастиц меди в тканях модельных растений, а также обуславливаемое этим глубокое повреждение ДНК. С использованием бактериальных моделей показана индукция окислительного стресса в присутствии наночастиц, обуславливающих образование активных форм кислорода, которые, в свою очередь, повреждают ДНК. Тем самым результаты проведенного исследования объясняют низкую толерантность и невозможность приспособления растений к условиям среды обитания со значительным содержаниями наночастиц меди, обусловленное воздействием которых повреждение ДНК ведет к развитию митотоксического эффекта (подавлению размножения клеток до вхождения в митоз), а его итоговым проявлением является фитотоксический эффект, заключающийся в нарушении роста корневой системы Triticum aestivum и Allium сера.

ГЛАВА 5. АДАПТИВНЫЕ РЕАКЦИИ ТЛ1Т1СиМ АЕБТ1У1/М К ПРИСУТСТВИЮ В СРЕДЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НАНОЧАСТИЦ МЕДИ

В эксперименте с внесением различных форм железа в деминерализованный песочный субстрат было показано, что в отличие фитотоксического эффекта ионной формы, нано- и микрочастицы данного металла не изменяли частоту прорастания семян ТгШсит аеяйуит, а наночастицы оказывали на развитие формирующихся растений умеренно выраженное стимулирующее воздействие, нелинейно зависящее от концентрации данного соединения в среде культивирования (таблица 5).

Таблица 5. Параметры развития растений ТгШсит аевйуит, выращенных в присутствии наночастиц железа

Анализируемые параметры Концентрация наночастиц железа в среде культивирования, ммоль/л Контроль

100 25 6,25 1,56 0,39

Скорость роста побегов (мм/ч) 0,47 ± 0,03 0,52 ± 0,04* 0,51 ± 0,03* 0,48 ± 0,04 0,48 ± 0,03 0,47 ± 0,03

Скорость роста корней (мм/ч) 1,22 ± 0,10 1,77 ± 0,12* 1,80 ± 0,11** 1,72 ± 0,10* 1,63 ± 0,12 1,50 ± 0,09

Длина первичного корня, мм 83,7 ± 8,68 114,7 ± 8,29* 99,5 ± 8,74 97,5± 8,52 109,3± 7,41 98,96 ± 5,54

Кол-во придаточных корней, шт 2,30 ± 0,18 2,20 ± 0,17 2,2 ± 0,18 2,2 ± 0,15 2,33 ± 0,14 2,13 ± 0,09

Длина придаточных корней, мм 74,6 ± 4,65 88,2 ± 4,79* 89,4 ± 7,45** 87,1 ± 4,75 74,3 ± 3,88 76,5 ± 4,12

Обозначения: * - Р<0,05; ** - Р<0,01

Так значимое увеличение скорости роста побегов (на 8,5-10,6 % выше контрольных значений; Р<0,05) было зафиксировано в диапазоне воздействующих концентраций наночастиц железа от 25 до 6,25 ммоль/л. В свою очередь в максимальной использованной концентрации наночастицы железа все-таки несколько снижали скорость роста корневой системы ТгШсит aestivum, а ее наиболее выраженное увеличение (до 1,80±0,11 мм/ч против 1,50 ± 0,09 мм/ч в контроле; Р<0,01) фиксировалось при концентрации наночастиц железа в среде культивирования 6,25 ммоль/л с сохранением эффекта на статистически значимом уровне в концентрациях 25 ммоль/л и 1,56 ммоль/л. При этом отдельным аспектом полученного результата являлось наиболее выраженная стимуляция роста придаточных корней, по своей длине становящихся сопоставимыми с длиной первичного корня.

Присутствие наночастиц железа в среде культивирования также сопровождалось интенсивным поступлением и существенным накоплением данного металла в тканях ТгШсит аеэ^уит, по своим абсолютным значениям, значимо превышающим аналогичные значения в тканях контрольных растений, выращенных на деминерализованном песочном субстрате (таблица 6).

Таблица 6. Количественное содержание Бе в проростках ТгШсит аеъйхит (в пересчете на сухую биомассу, мкг/г), инкубированных в присутствии различных концентраций наночастиц железа__

Исследуемые части ТгШсит ае.,;11\'ит Концентрация наночастиц железа в среде культивирования, мкг/мл Контроль

5585 1396,2 349,1 87,2 21,8

Побеги 52,24 ± 11,49** 71,45± 15,72** 39,95± 8,79* 27,31± 4,80 25,9± 4,00 9,22 ±3,04

Корни 181,53± 39 9з*** 102,99± 22,66*** 75,09± 16,52*** 35,79± 7,87** 25,18± 5,54** 4,48 ±1,48

Обозначения: * - Р<0,05; ** - Р<0,01; *** - Р<0,001

Так преимущественное накопление железа регистрировалось в корневой системе модельных растений с максимумом 181,53±39,93 мкг в 1 г сухого веса растительной биомассы при проащивании в среде с содержанием 100 ммоль/л (=5585 мкг/мл) соответсвующих наночастиц, что более чем трехкратно превышало содержание железа в тканях побега. Однако, эффективность извлечения железа из среды культивирования в данном случае оказывалась минимальной, прогрессивно увеличиваясь с 1,94 % до 19,9 % при уменьшении воздействующих концентраций наночастиц со 100 до 0,39 ммоль/л (=21,8 мкг/мл). Сказанное свидетельствует о существовании определенных ограничений поступления и распространения наночастиц железа в тканях модельных растений, предположительно вовлеченных в систему их адаптивных реакций при проращивании в условиях интенсивного контакта с наночастицами минерального происхождения.

Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о выраженных различиях адаптивной реакции растений на воздействие железа в ионной и металлической (нано- и микро-) формах, продемонстрированных на модели проращивания семян ТгШсит ае51тт. При этом наночастицы железа не проявляют выраженного токсического действия, но напротив, в определенных диапазонах концентраций стимулируют рост и развитие проростков ТгШсит аея/мит, что сопровождается накоплением в тканях модельных растений значительных количеств воздействующего металла. Подобный результат определяет перспективу использования наночастиц железа при предпосевной обработке семян, а также в системе выращивании кормовых и сельскохозяйственных растений методами аэропоники или гидропоники, ожидаемым следствием чего явится не только повышение выхода биомассы, но и ее обогащение биологически доступным железом, востребованным при коррекции микронутриентной обеспеченности человека и животных.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительная оценка толерантности растений (Triticum aestivum) и микроорганизмов (Escherichia coli) в тестах прорастания семян и ингибирования бактериальной биолюминесценции демонстрирует снижение способности данных организмов к сохранению жизнеспособности при культивировании в среде, содержащей медь и железо, при нарастании негативных эффектов в ряду «микрочастицы —» наночастицы —► ионы металлов».

2. Растения по сравнению с микроорганизмами более устойчивы к токсическому действию меди и железа, при воздействии которых выраженность фитоток-сического эффекта возрастает в ряду проявлений «всхожесть семян —» длина побега —> длина корня».

3. Особенностью роста и развития растений (Triticum aestivum и Allium сера) при культивировании в среде, содержащей наночастицы меди в концентрациях более 1,5 ммоль/л, является нарушение роста и развития корневой системы растений, в т.ч. уменьшение длины первичного корня; увеличение числа придаточных корней и снижение их длины.

4. Наночастицы металлов поступают и распространяются в тканях корневой системы растений через систему межклеточных контактов (плазмодесм). Присутствие в среде культивирования наночастиц меди и железа сопровождается пропорциональным накоплением данных металлов преимущественно в корневой системе растений, повышение концентраций этих веществ в побегах менее значимо.

5. Низкая адаптивная способность растений Triticum aestivum и Allium сера к условиям среды культивирования со значительным содержаниями наночастиц меди обусловлена повреждением (фрагментацией) ДНК растительных клеток, следствием чего является митотоксический эффект (подавление размножения клеток до вхождения в митоз), а его итоговым проявлением - фитотоксический эффект, заключающийся в нарушении роста корневой системы растений

6. Взаимодействие наночастиц меди с бактериальными клетками (на примере Escherichia coli) ведет к развитию у них состояния окислительного стресса, результатом которого является повреждение ДНК.

7. Присутствие наночастиц железа в среде культивирования Triticum aestivum в диапазоне концентраций от 25 до 6,25 ммоль/л сопровождается развитием ростостимулирующего эффекта, выражающегося в увеличении скорости линейного роста образующихся проростков пшеницы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Дерябина, Т.Д. Оценка безопасности ионов, нано- и микрочастиц железа и меди в тесте прорастания семян Triticum aestivum / Т.Д. Дерябина // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2011. - №12(131). - С.386-389.

2. Дерябин, Д.Г. Биологическая активность ионов, нано- и микрочастиц Си и Fe в тесте ингибирования бактериальной биолюминесценции / Д.Г. Дерябин, Е.С. Алешина, Т.Д. Дерябина, Л.В. Ефремова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2011. - №6. - С. 31—36.

3. Кондакова, К.С. Влияние ионов, нано и микрочастиц железа на люминесценцию и рост рекомбинантного штамма Escherichia coli с клонированным lux-опероном Photobacterium leiognathi в тесте острой и хронической токсичности / К.С. Кондакова, Т.Д. Дерябина // Нанотехника. — 2012. — № 4 (32). — С. 47-52.

4. Дерябин, Д.Г. Исследование механизмов антибактериальной активности наночастиц меди в тестах на люминесцирующих штаммах Escherichia coli., Д.Г. Дерябин, Е.С. Алешина, А.С. Васильченко, Т.Д. Дерябина, Л.В. Ефремова, И.Ф. Каримов, Л.Б. Королевская // Российские нанотехнологии. - 2013. - Т.8. - №5-6. -С. 113-118.

5. Дерябина, Т.Д. Анализ механизмов биологической активности наночастиц меди в тестах на Triticum aestivum и Allium сера / Т.Д. Дерябина, И.В. Грязева, Л.В. Ефремова, Д.Б. Косян, А.А. Кульсарин // Технологии живых систем. - 2014. -Т.П.-№5.-С. 17-25.

6. Дерябина, Т.Д. Особенности роста и развития Triticum aestivum при культивировании в среде, содержащей ионы, нано- и микрочастицы железа / Т.Д. Дерябина, Е.А. Сизова // Перспективы науки. - 2014. - №11(62). - С. 18-23.

Статья в рецензируемом журнале:

1. Дерябина, Т.Д. Токсичность ионов, нано- и микрочастиц меди в биотестах различного уровня организации / Т.Д. Дерябина // Микроэлементы в медицине. -2013.-№ 14 (2).-С. 47-49.

Патент на изобретение:

1. Мирошников С.А., Дерябина Т.Д., Салынская Е.Ю., Бондарь Е.А., Павлов Л.Н., Рогачев Б.Г., Щетинина Г.Р., Мангутов Р.Ф. Способ выращивания зеленых гидропонных кормов // Патент РФ на изобретение №2429592. — опубл. 27.09.2011. - Бюл. №27.

Подписано в печать 11 марта 2015г. Формат 60x84 1/6 Усл.печ.л.12. Тираж 100 экз. Заказ № 11

Издательство ИП Востриков П.В., 460000 г. Оренбург, ул. Рыбаковская, 100