Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка системы биотехнологических методов, направленных на ускорение селекционного процесса овощных культур

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Разработка системы биотехнологических методов, направленных на ускорение селекционного процесса овощных культур"

На правах рукописи

ШМЫКОВА Наталья Анатольевна

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ, НАПРАВЛЕННЫХ НА УСКОРЕНИЕ СЕЛЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА

ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР

Специальности: 06.01.05. — селекция и семеноводство 03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук

МОСКВА - 2006

Диссертационная работа выполнена'в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур» в 1991-2005 гг.

Научный консультант: доктор сельскохозяйственных наук, академик РАСХИ В.Ф. Пивоваров

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук

М.И. Мамедов

доктор биологических наук A.B. Поляков

доктор биологических наук Ю.В. Чесноков

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии

Защита диссертации состоится .гГ октября 2006 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.019.01 при ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур по адресу: 143080, Московская обл., Одинцовский р-н, п/о Лесной городок, пос. ВНИИССОК.

Факс:(095)599-22-77; Е-та!1:упм$50к@таН.ги.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур.

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 220. 019.01

доктор с.-х. наук, профессор

Е. Г. Доб руцкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Центральным вопросом селекции является репродукция (воспроизводство) растительного материала. Селекционеры используют половую и вегетативную репродукцию на различных этапах селекционного процесса, включая создание исходного материала, отбор, поддержание и размножение перспективного сортолинейного материала или сортов и гибридов сельскохозяйственных растений.

В связи с этим методы культуры тканей, направленные на размножение исходного материала, приобретают большое значение для построения рациональных систем создания гибридных семян в селекции овощных культур. Важными предпосылками экономически выгодного использования методов культуры тканей являются высокие коэффициенты размножения при сохранении генетической стабильности, а также экономия времени при размножении in vitro, что дает возможность включать их в селекционный процесс.

С другой стороны, репродуктивная фаза жизненного цикла растений представляет своеобразную природную систему «генетической инженерии», в которой новые комбинации генов, собранные в гаметах, проверяются в системах гаметофитного отбора. Гаплоидное же состояние генома в отличие от диплоидного позволяет обнаружить редкие рецессивные аллели, а получение дигаплоидных растений из микроспор и клеток зародышевого мешка - реализовать гаметоклональную изменчивость в индивидуальные растения и ускорить процесс получения гомозиготного материала в несколько раз.

Необходимо отметить, что основой селекционного процесса является понимание того, как влияют способы репродукции на изменчивость растений, как происходит развитие репродуктивной системы у растений. Ограниченность знаний о репродуктивных особенностях растений - основная причина недостаточного использования процессов гаметогенеза. В естественных условиях отбор мужских гаметофитов представляет собой широко распространенное явление у высших растений.

Таким образом, приведенные аргументы со всей очевидностью показывают, что для ускорения селекционного процесса необходимы научные исследования, направленные на детальное изучение процессов микроспороге-неза, микрогаметогенеза, опыления, андрогенеза, гиногенеза и клонального микроразмножения ценных овощных культур.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось теоретическое и экспериментальное обоснование использования современных биотехнологических методов в селекции овощных культур, направленных на ускорение селекционного процесса.

Для достижения этой цели необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить особенности развития пыльников и пыльцы у овощных культур; . разработать принципы оптимизации питательных сред для определения жизнеспособности пыльцы.

2. Определить морфологические признаки цветков и цитологические особенности развития пыльников у овощных растений с мужской стерильностью.

3. Выявить действие биотических и абиотических факторов на жизнеспособность пыльцы овощных культур; определить принципы методики гаметного отбора.

4. Оценить и усовершенствовать методику получения дигаплоидных растений в культуре неопыленных семяпочек лука репчатого.

5. Изучить проблемы методов получения дигаплоидных растений в культуре пыльников и микроспор/пыльцы овощных культур, выявить перспективы их использования в селекции.

6. Разработать основные элементы технологии клонального микроразмножения овощных культур (состав питательных сред, типы эксплантов) и изучить влияние индуцирующих факторов на морфогенез.

Научная новизна. Разработана система биотехнологических методов и показана их перспектива в ускорении селекционного процесса у овощных культур. Рассмотрены принципы и проблемы разработки таких методов, как гаметная селекция, андрогенез, гиногенез, клональное микроразмножение.

При изучении индукции акдрогснсча выявлено, что у овощных растений в культуре пыльников преобладает соматический эмбриогенез из эндотеция (морковь, огурец, капуста), средних слоев (томат, перец) и паренхимных клеток связника (огурец, укроп, капуста). Каллус и эмбркоиды не могут развиваться из клеток тапетума овощных растений, так как уже в период микроспорогенеза наблюдается его деградация, которая резко ускоряется при культивировании пыльников in vitro.

Установлено, что в большинстве случаев получение пыльцевых дигап-лоидов заканчивается на этапах каллусогенеза и раннего эмбриогенеза, что свидетельствует о нескольких уровнях детерминации, контролирующих этапы перехода на спорофитный путь развития.

Показано специфическое действие регуляторов роста производных фе-нилмочевины (тидиазурона и CCPU) на меристематические ткани овощных культур. Впервые выявлено индуцирующее действие бора на побегообразование у капусты при клонапыюм микроразмножении, позволяющее увеличить коэффициент размножения.

Практическая ценность. Разработаны искусственные питательные среды для проращивания пыльцы у огурца, капусты, редиса, дай кона, перца, которые могут быть использованы для предварительной оценки жизнеспособности пыльцы, а также при разработке методов гаметного отбора, позволяющих ускорить селекционный процесс.

Разработана схема селекционного процесса с использованием мужского гаметофита на устойчивость к бактериозу у лука репчатого.

Усовершенствована методика получения дигаплоидов лука в культуре неопыленных семяпочек.

Для получения растений-регенерантов из микроспор с гаметоклональной изменчивостью у моркови предложено использовать методику культуры пыльников in vitro (Тюкавин, Шмыкова, 2000).

Разработаны элементы технологий клонального микроразмножения капусты, огурца, редиса, которые могут быть использованы для размножения

селекционно ценных генотипов.

Положения, выносимые на защиту: Система биотехнологических методов, позволяющая ускорить селекционный процесс у овощных культур.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на: международных симпозиумах и научных конференциях: «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология» (Алматы, 1993 г.); «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 1995 г.); «Гетерозис сельскохозяйственных растений и перспективы их использования» (Москва, 1997 г.); « Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда»( Москва, 1997 г.); «Plant Biotecnology and In Vitro Biology the 21 st Century» (Jerusalem, 1998 г.); IV Съезд общ. физиологов растений России (Москва, 1999 г.); «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2000 г.); «Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке» (Москва, 2003 г.); «Биотехнология и генетическая инженерия микроорганизмов, растений и животных» (Ольштын, 2004 г.); «Современное состояние и перспективы развития селекции и семеноводства овощных культур» (Москва, 2005 г.).

По материалам докторской диссертации опубликована 71 научная работа, в том числе 7 методических указаний и статьи в международных и отечественных сборниках научных трудов и журналах, из них 7 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах компьютерного текста и состоит из введения, 8 глав, выводов, практических рекомендаций; включает 73 таблицы, 128 рисунков и список используемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В работе использован селекционный материал из рабочих коллекций селекционных лабораторий ВНИИССОК. Исследования проводили с 1991 по 2005 г. в лаборатории биотехнологии института.

Донорные растения, в зависимости от времени года, выращивали в открытом грунте, пленочной теплице и в вегетационной камере при освещенности 7-8 кЛк и 1 б часовом периоде.

Цитологический анализ пыльников, микроспор, пыльцы и определение жизнеспособности проводили по методике З.П.Паушевой (1988).

Клональное микроразмножение, культивирование неопыленных семяпочек, пыльников и микроспор проводили по общепринятым методам работы с культурами растительных тканей (Бутенко, 1984).

Биологические опыты проводили в шестикратной повторности. Статистическую обработку экспериментальных данных выполняли по Б.А.Доспехову (1985) с помощью прикладных программ Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Развитие пыльника и образование пыльцы у овощных растений

Проводимые нами исследования направлены на обобщение литературных данных и изучение особенностей развития пыльников и образование фертиль-ной пыльцы у целого ряда овощных культур. Знание закономерностей развития мужского гаметофита служит основой для создания методов, ускоряющих селекционный процесс и способствующих увеличению генетического разнообразия исходного материала, а также понимания проявления мужской стерильности у растений.

Развитие пыльника может быть разделено на два больших периода. В конце первого периода пыльник содержит большинство специализированных клеток и тканей и тетрады микроспор, находящиеся в микроспорангиях. В течение второго периода микроспоры дифференцируются, развиваются пыльцевые зерна. Дифференцированный пыльник имеет несколько высокоспециализированных тканей: эпидерму, эндотеций, средние слои и тапетум. По мере развития микроспор и пыльцы они претерпевают изменения. В период раскрытия пыльника стенки его чаще всего состоят из эпидермы и эндотеция. Клетки средних слоев у моркови, капусты, огурца уплощаются и лизируются вместе с тапетумом, а в стенках клеток эндотеция образуются фиброзные

утолщения. У томата, напротив, клетки средних слоев сохраняются, а в клетках эндотеция не наблюдается фиброзных утолщений.

Микроспоры, образующиеся после распада тетрад, как правило, имеют ядро, расположенное в центре клетки, плотную цитоплазму и тонкую оболочку. По мере развития микроспоры в ней образуется крупная вакуоль и состоящая из двух слоев (интины и экзины) оболочка. На последнем этапе развития микроспоры ядро смещается в пристеночную позицию, вакуоль занимает центральное положение. На этой стадии микроспора завершает свое существование и вступает в асимметричный (дифференцирующий) митоз, в результате которого образуется новая структура - пыльцевое зерно. Оно состоит из вегетативной и генеративной клеток. Вскоре после первого митоза у ряда растений (морковь, капуста, редис) генеративная клетка вступает во второй митоз и образуются два спермия (трехклеточное пыльцевое зерно). У огурца, томата, перца, лука, спаржи пыльца двухклеточная, второй митоз наступает при прорастании пыльцы. На протяжении всего периода существования пыльцевого зерна происходит его подготовка к прорастанию и оплодотворению.

Развитие цветка управляется взаимодействием гомеотических генов. Тычиночные примордии появляются после того, как появились примордии чащелистиков и лепестков, но до инициирования плодолистиков. Эта взаимосвязь в развитии частей цветка сохраняется на протяжении всего периода его жизни, поэтому по морфологическим признакам одних частей можно косвенно

судить о степени развития других (табл.1, 2).

Таблица 1

Стадии развития микроспор и пыльцевых зерен у огурца

Длина, мм Стадии развития микроспор и пыльцы

чашечки венчика

4.0 - 5.0 2,0 тетрады, распад тетрад

6.0 2.5 начало вакуолизации микроспор, ядро в центр«

6.0 3,0 вакуолизнрованнме микроспоры, с пристеночно расположенным ядром

6.0 4.0 образование вегетативной и генеративной клеток

8.0 10.0 двухклеточная. сильно эакуолизированна» пыльца

8.0 П.О уменьшение вакуоли

10.0 15,0 то же

12.0 18.0 исчезновение вакуоли

13.0 20,0 зрелые пыльцевые зерна

14.0 22.0 то же

15.0 25,0 то же |

Таблица 2

Стадии развития микроспор и пыльцевых зерен у лука репчатого, сорт Штуттгартер - ризен

Длина, мм Стадии развития микроспор и пыльцы

бутона тычинки пестика

1.5 1.2 1,0 тетрады

2.0 1.5 1,2 ранние микроспоры

2,5 1,7 1,2 микроспоры с двумя большими вакуолями

3,0 2,0 и микроспоры в канун первого митоза, часть их находится в фазе митоза

3,5 2.1 1,4 двухклеточная пыльца, генеративная клетка округлой формы

3.8 2.3 1,8 двух клеточная пыльца, генеративная клетка смещена к радиальной стенке

4.0 3,0 1,8 двухклеточная пыльца, генеративная клетка приобретает линзовидную форму

4.5 3,5 2,0 двухклеточная пыльца, генеративная клетка вытянутой лин-зовидной формы, удалена от стенки

Например, коэффициент корреляции между размером бутона и стадией развития мужского гаметофита у капусты составляет 0,85 - 0,94.

Для успешной оценки и отбора генотипов на микрогаметофитном уровне необходимо быстро и эффективно определять жизнеспособность пыльцы. В научной литературе почти для каждой культуры можно найти несколько прописей состава питательных сред для оценки жизнеспособности пыльцы. Основными компонентами этих сред являются сахароза, борная кислота, соли кальция и магния. Сахароза создает осмотическое давление и может служить компонентом стенки пыльцевой трубки. По литературным данным в системе рыльце — завязь существуют градиенты концентрации ионов кальция, бора и водорода. Концентрация этих компонентов в репродуктивных органах у разных генотипов индивидуальна, отсюда и индивидуальная концентрация их в средах.

Это хорошо прослеживается на пыльце лука. В популяции пыльцы присутствуют отдельные пыльцевые зерна способные прорастать при концентрации сахарозы 1% и 30%, однако основная масса пыльцевых зерен прорастает при оптимальной для этого сорта концентрации (рис. 1 а,б).

; 20 10 0

пШ!

-П-1

1 3 5 10 15 20 25 30 концентрация сахарозы, %

Рис. 1 а. Прорастание пыльцы лука репчатого (сорт Штуттгартер ризвм) in vitro на питательных средах с различным содержанием сахарозы

II

60 60 40 30 ■20 -10 о I а

Off

1 3 S 10 15 20 25 концентрация сахарозы, %

30

Рис. 1 0. Прорастание пыльцы лука репчатого (сорт Даниловский 301 Jin vitro на питательных средам с различным содержанием сахарозы

Из рисунка 2 видно, что потребность в сахарозе у пыльцы различных видов и сортов капусты разная. На способность пыльцы прорастать влияет не • только концентрация сахарозы, но и значение рН среды. Несколько меньше доля влияния рН среды у представителей семейства капустные из рода НарЬапиэ, но доля влияние концентрации сахарозы велика и изменяется от 50 до 85%.

Образцы перца сильно различаются по способности пыльцы прорастать при разных значениях рН среды (рис.3). Одни лучше прорастают в нейтральной среде, а другие в щелочной. При скрещивании таких сортообразцов можно ожидать низкую завязываемость семян.

60

IdpHN

I конц. сахарозы '

"ортообраэцы

2 3 4- 5 6 7

Рис.2. Доля влияния рН среды и концентрации сахарозы на прорастание пыльцы капусты in vitro {1 - Белоруская 455, 2 - Слава 1305, 3 - Малиновка. 4 -Тонус, 5 - Номер первый грибовский 147, капуста китайская №939, 7 - капуста китайская №954)

* 5 г». -

к о I мл , —

* 1 4

в

10 219 223 Сортообраэцы

221 214 216 218

1У1

Рис.3. Прорастание пыльцы перца овощного ю уйго на питательных средах с различными значениями рН

□ рН=7

■ рН=8

□ рН=9

Таким образом, для определения жизнеспособности пыльцы у овощных культур необходимо индивидуально для каждого сортообразца подбирать состав питательной среды, включающей бор, ионы кальция и магния, сахарозу и имеющей оптимальное значение рН .

Явление мужской стерильности представляет большой интерес для получения гибридов. В основе морфологических нарушений в пыльниках стерильных растений лежат биохимические изменения, обусловленные генетическими особенностями растений, обладающих мужской стерильностью.

Дайкон. Нами проведено морфологическое и цитологическое изучение проявления мужской стерильности у выращиваемых в Московской области стерильных растений дайкона МБ Сепэике.

У стерильных растений дайкона (форма МЭ Сенечке) нарушения проявляются после распада тетрад, процесс вакуолизации опережает формирование клеточной стенки. Микроспоры слипаются, образуя конгломераты, которые не контактируют со стенками пыльника. При утолщении стенки микроспор не образуется характерный скульптурный рисунок. Патологические изменения наблюдаются и в соматических тканях пыльника, клетки тапетума имеют в несколько раз меньшие размеры (рис.4).

Мужская стерильность у овощных растений

Рис. 4. Клетки тапетума в пыльниках дайкона фертильных (а) и мужских стерильных растениях (б) на стадии развития микроспор Деструктурирование их начинается на стадии тетрад, а образовавшаяся из них неклеточная структура сохраняется до момента раскрытия пыльника. • Тапетум в пыльниках фертильных растений сохраняется до образования двух-, трехклеточной пыльцы с последующим разрушением клеток, и в период раскрытия пыльника он отсутствует. Пыльники стерильных растений сильно отличаются от пыльников фертильных растений по окраске и размерам. Различия прослеживаются по отношению высоты пестика к высоте тычинок ещё в нераскрывшихся бутонах. У стерильных растений высота пестика значительно больше высоты тычинок по сравнению с фертильными. В цветках этот признак сохраняется.

Перец. В пыльниках перца изменения в тапетуме наступают на стадии мейоза. Вместо тапетума секреторного типа образуется периплазмодиальный тип тапетума, то есть тапетум стерильных растений утрачивает клеточную структуру (рис. 5). Это затрудняет контакт с микроспорами.

Рис.5. Клетки тапетума в пыльниках перца фертильных (а) и мужских стерильных растениях (б) на стадии развития микроспор

Все первоначальные нарушения происходят на стадии мейоза, образуются монады, диады. На этой стадии их развитие останавливается, не наблюдается увеличение полости пыльцевого гнезда, как у пыльников фертильных растений, и не происходит образование фиброзных утолщений у стенок клеток эндоте-ция; такие пыльники не растрескиваются.

Лук. Цитологические исследования показали, что процесс распада тетрад у стерильных форм происходит в течение более длительного периода. Он сопровождается перерождением клеток тапетума, тогда как у фертильных пыльников тапетум сохраняет клеточную структуру, а все изменения сводятся к усилению процесса вакуолизации клеток, с последующим их лизисом к моменту первого митоза и образования двухклеточной пыльцы (рис.б).

Рис.6. Клетки тапетума в пыльниках лука фертильных (а) и мужских стерильных растениях (б) на стадии развития микроспор. В отличие от лука, в пыльниках чеснока наблюдается ранний лизис клеток тапетума. Они разрушаются уже на стадии тетрад, поэтому при распаде тетрад образуются тонкостенные микроспоры с остатками цитоплазмы и ядра, превращающиеся в пустые оболочки микроспор

Морковь. В популяциях встречается масса переходных форм, отражающая последовательность цитологических отклонений от нормы, которым подвержены пыльники стерильных растений.

Исследования проводили на соцветиях моркови сорта НИИОХ 336. Мы наблюдали разную степень перерождения пыльника в лепесток: от почти нормального пыльника, содержащего в стенке микроспорангия эпидермис, слабо дифференцированный эндотеций, клетки среднего слоя и тапетум до лепестка.

Как правило, вследствие недостаточно дифференцированного эндотеция такой пыльник не растрескивается, лизис клеток тапетума задерживается, в конечном итоге не образуется полноценная фертильная пыльца. При небольших отклонениях в дифференцировке пыльника он приобретает сердцевидную или лопатковидную форму и имеет четыре микроспорангия, как нормальный пыльник. Основные изменения отмечаются в клетках тапетума. В отличие от нормы клетки тапетума увеличены. В цитоплазме образуются мелкие вакуоли. Часть клеток имеют по одному ядру.

Чем больше нарушений в дифференцировке тканей, тем более выраженными становятся признаки лепестков.

Таким образом, характерными признаками пыльников стерильных растений являются не только аномалии в развитии спорогенной ткани, но и нарушения нормального функционирования и аномальное развитие тапетума. Это выражается либо в преждевременной дегенерации и лизисе тапетума, или в длительном его сохранении, или активном разрастании уже после образования микроспор..

Гаметная селекция овощных растений

Благодаря мейозу природные популяции диплоидных организмов далеко неоднородны. В основе гаметного отбора лежит генетическая неравноценность пыльцевых зерен к воздействию абиотических и биотических факторов среды. Искусственный селектирующий отбор позволяет отобрать микроспоры или пыльцевые зерна с определенными генотипическими признаками. Для этого, в свою очередь, необходимо изучить влияние на жизнеспособность пыльцы тех факторов, на устойчивость к которым проводится селекционный процесс.

Метод гаметной селекции включает в себя несколько этапов: выбор селектирующего фактора и методики оценки его воздействия, подбор дифференцирующей концентрации, позволяющей отселектировать пыльцевые зерна с устойчивым генотипом и, наконец, непосредственно сам селекционный процесс.

Для определения наличия реакции у пыльцы лука репчатого использовали непосредственный контакт её с суспензией трехсуточной культуры ЕпгШш сагогохога в концентрации 10° клеток. Эта концентрация полностью подавляла способность пыльцы к прорастанию. Для дифференциации пыльцы по устойчивости к воздействию бактерий использовали ряд разведений: исходная суспензия (10+7); 9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 4:6; 3:7; 2:8; 1:9; дистиллированная вода.

У различных образцов наблюдалась зависимость изменения жизнеспособности пыльцы от бактериальной нагрузки: чем выше концентрация бактерий в суспензии, тем меньше число проросших микроспор (табл.3). По характеру этих изменений сорта можно разделить на устойчивые и восприимчивые. К устойчивым относятся сорта Штуттгартер ризен, Одинцовец, последний отличается большой гетерогенностью, к восприимчивым относятся Даниловский и Стригуновский.

Таблица 3

, ... Жизнеспособность пыльцы лука репчатого под действием бактериальной нагрузки {Егм1ма сагаюуога)

Концентрация бактерий (суспензия : вода) Проросшая пыльца, %

Штуттгартер ризен Даниловский Стригуновский Одинцовец Сквирский Арзамасский

Контроль (дистиллированная вода) 68,7+12,3 61,5±10,5 53,0±153 40,7±22.3 22.2+7,5 48,4±11.5

1:9 67.7+7.4 64.3±П,2 42,3± 13.7 27,2±|9.4 23 Л ±1.9 41.4±20.5

2:8 70.4+10,8 25,2+10.9 24,5±)6,б 322±11.3 5.411.2 32.0+14.0

3:7 54.9*12,5 23.0±17.4 9.8+8,9 14.3+10.8 8.9+4.7 7.5±6.8

4:6 29,7±П,9 14,2+11.5 10.7+2.2 19.2+7,9 15.8±4,7 11.9±8,9

5:5 13.0+4.6 2,2±1,2 4,7+3,8 11,2±7.0 13,3+6.6 25.6115.3

6:4 9,9+6.6 4.7±3,7 4.9+2.5 19,7±8,5 0.0±0.0 3.1 ±2.0

7:3 12.0+5.5 5.3+4,2 0.5+0.0 19.516.4 3.5±3,3 6.2±4.3

8:2 5,7+1,5 1,8±2,5 1.7+1,9 10,1 + 10.2 11,4+9.4 3.4±3.1

9:1 0,5 ±0,4 0.6+1,3 5.6±5.2 4.6+4.2 3.1 ±2.8 5.3±2.6

Исходная сус-! пензия 10*' кл. 3,4+2.1 0.5+1.6 0,0+0.0 0.0+0.0 2.4±2.6 2.9+2.7

Однако использовать суспензию из живых бактерий в качестве барьера при опылении растений лука невозможно, так как будет происходить заражение цветков лука, соответственно и будущих семян. Для этого была разработана методика, которая заключалась в следующем. Молодые листья лука устойчивого сорта заливали бактериальной суспензией и оставляли на трое суток. Это приводило к выделению пектолитических ферментов в среду и мацерации листьев. Полученную суспензию фильтровали первоначально через бумажный фильтр, а затем стерилизовали путем фильтрации через бактериальный фильтр. Из фильтрата готовили разведения, концентрацию которых контролировали по способности подавлять прорастание пыльцы лука устойчивого сорта

Раствор, при действии которого на пыльцу оставалось 3-4 проросших пыльцевых зерен, использовали для предварительной обработки пыльцы перед опылением. Количество завязавшихся семян зависело от устойчивости сорта и концентрации раствора (табл.4).

Таблица 4

Завязываемость семян в зависимости от концентрации в растворе _метаболитов Егичта саго(тгога (1993-1994 гг.)_

Сорт Завязываемость семян в процентах к контролю

Разведение в 40 раз Разведение в 100 раз

Штуттгартер ризен 6,2 20,7

Арзамасский 0 21.3

Одинцовец 0 6.2

Даниловский 0 3,4

Мячковский 0 4,1

Таким образом, на основании проведенных исследований предложена схема селекционного процесса на устойчивость к бактериозу с использованием мужского гаметофита (рис.7).

Рис. 7. Схема селекционного процесса на устойчивость лука репчатого к бактериозу с использованием мужского гаметофита.

Одной из задач селекции является создание новых холодоустойчивых или менее требовательных к теплу сортов и гибридов огурца. Для изучения холодоустойчивости сортов и гибридов необходимы простые, эффективные и надежные методы оценки растений, позволяющие её прогнозировать. В онтогенезе растений выделяется два периода, когда растение наиболее чувствительно к пониженным температурам. Это фазы развития проростков и бутонизации.

Материалом исследований служила пыльца различных сортообразцов огурца из лаборатории селекции и семеноводства тыквенных культур.

Пыльца линий №№ 2, 5 и 10 за сутки почти достигла контрольных показателей, то есть микрогаметофит этих линий менее чувствителен к пониженной температуре, тогда как линия 9 имела всего 50-60 % проросших пыльцевых зерен от контроля.

Анализ экспериментальных данных, полученных при оценке проростков этих же линий на холодоустойчивость, показал, что существуют различия между ними. Из четырех инцухт-линий наибольшей холодоустойчивостью обладала линия № 10, у которой наблюдался наибольший процент проросших семян.

Для большей эффективности отбора температура в опыте была понижена до +12... 14" С. Такое снижение положительной температуры позволило выявить гетерогенность линии № 10 по холодоустойчивости. При пониженной температуре у этого образца прорастало всего 10 -20% семян при 100% всхожести. Для дальнейших исследований внутри этой линии отобрали холодоустойчивые формы, которые прорастали при температуре +12...14°С, и нехолодоустойчивые, прораставшие при +23...25°С. Из этих проростков получили взрослые растения, которые различались между собой размерами цветка - у холодоустойчивых форм цветок был меньше, а пыльца была более крупных размеров (рис. 8). При анализе размеров пыльцы следующего поколения видно, что у холодоустойчивых форм увеличилась доля пыльцы с более крупными размерами. Характер кривой показывает, что популяция холодоусточивых генотипов

неоднородна. У теплолюбивых генотипов сохранилась популяция пыльцы с прежними размерами.

холодоустойчивые холодонеустойчивые

5 6 7 8 9 10 11 12 13

Диаметр пыльцевого зерна

-холодоустойчивые - холодонеустойчивые

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Диаметр пыльцевого зерна

ь

Рис.8. Влияние отбора проростхов огурца Л-20 при пониженной температуре на размеры пыльцевых зерен; А - после первого ;

отбора; Б - после второго отбора (1992-1994г.) :

Однако при оценке на холодоустойчивость коллекции огурца, выращиваемой в весенне-летнем обороте, когда температура в дневные часы превышала +30° С. Воздействие пониженных температур в этом случае не подавляло прорастание пыльцы, а напротив стимулировало его. Подобную закономерность наблюдал целый ряд авторов на различных культурах таких, как кукуруза, японская репа, томат (Лях, Сорока, 1993; Степанов, 1998; Салто-нович, 1998; Козлова, 1999).

Известно, что влияние высоких температур, приходящееся на последующие стадии микроспорогенеза, приводит к замене асимметричного митоза на

обычный и синтезу белков теплового шока (Telmer et al. 1995), а на стадии мик-рогаметогенеза к изменениям углеводного обмена (Aioni et al., 2001).

С другой стороны, период, предшествующий рассеиванию пыльцы, сопровождается интенсивным углеводным обменом. Углеводы являются главными питательными веществами, из которых идет образование клеточной стенки пыльцы, в том числе и пыльцевой трубки (Pacini, 1996).

Таким образом, для достоверной оценки генотипов на холодоустойчивость по мужскому гаметофиту необходимым условиям является выращивание растений при пониженных температурах или близких к ним оптимальных.

Культура неопыленных семяпочек лука in vitro

В современной селекции одной из важнейших задач является быстрое достижение константности селекционного материала. Наиболее остро эта проблема возникает при создании гетерозисных гибридов, для которых требуются гомозиготные линии с высокой комбинационной способностью. В традиционной селекции шмозиготность достигается путем инбридинга в ряде поколений. В современной биотехнологии предложен альтернативный метод ускоренного получения гомозиготных линий через культуру неопыленных семяпочек и культуру пыльников и микроспор.

Получение гаплоидных растений в культуре in vitro неопыленных семяпочек является результатом перехода клеток зародышевого метка с гаметофитного пути развития на слорофитный с образованием из них эмбриои-дов или морфогенного каллуса. Па процесс индукции гиногенеза влияет большое число факторов таких, как генотип растения, стадия развития женского гаметофита, состав питательных сред, условия выращивания донорных растений.

Наши исследования показали, что 2,4 Д влияет на разрастание интегумен-тов семяпочек лука репчатого. Семяпочки достигают размера полностью сформированного семени, однако клетки нуцеллуса часто отмирают, и внутри

образуется полость. На питательных средах с БАП или без гормонов происходит менее интенсивное разрастание покровов семяпочек, клетки нуцеллуса сохраняются, а при высоких концентрациях БАП наблюдается разрастание нуцеллуса. Проростки могут быть получены как на среде с гормонами, так и без них. Наиболее определяющим фактором исхода эксперимента является стадия развития семяпочки. Для культивирования неопыленных семяпочек лука оптимальными являются бутоны длиной 5 мм. При этом можно выделить несколько типов реакции:

- формирование структур подобных семенам, развивающихся из опыленных семяпочек, с черно-коричневой кожурой без формирования зародыша;

- прорастание семяпочек, развитие проростков;

- семяпочки с лизированными зародышевыми мешками.

Для индукции гиногенеза в культуре неопыленных семяпочек лука in vitro был проведен сравнительный анализ следующих способов культивирования завязей:

- на питательной среде БДС с 2 мг/л 2,4 Д и БАП до полного формирования побегов;

- на питательной среде, вышеуказанного состава, в течение первых двух месяцев с последующим переносом на среду БДС с 2 мг/л НУК и 4 мг/л БАП;

- на питательной безгормональной среде БДС в течение двух недель с последующим переносом на среду БДС с 2 мг/л ИМК, 0,12 мг/л БАП, 3,5 мг/л ГК до формирования побегов.

В каждом варианте было заложено по 250 завязей лука сорта Штуттгар-тер ризен и по 25-60 завязей межвидовых гибридов. Анализ изменений, протекающих в завязях и семяпочках (разрастание, образование структур подобных семенам, каллуса, проростков), проводили через неделю в течение первых двух месяцев, а затем с интервалом в один месяц.

Из 2150 завязей или 12600 семяпочек, культивируемых in vino и относящихся к 19 генотипам, образование единичных эмбриоидов наблюдалось лишь

у межвидовых гибридов №1, №2, №9, №12, № 14, № 17 и сорта Штутгартер ри-зен.

Полученные результаты показали, что наиболее значимым фактором в культуре неопыленных семяпочек является генотип растения.

Культивирование пыльников и микроспор in vitro овощных растений

Накопленный опыт культивирования пыльников и микроспор разнообразных объектов позволяет выявить их общее свойство: низкий выход гаплоидных растений по отношению к общему количеству высеваемой пыльцы - в большинстве случаев он не превышает 0,5 % (Sunderland, 1978). Разработка методики получения гаплоидов в культуре пыльников или микроспор требует проведения индивидуальных исследований для каждого вида или даже сорта растения.

Пыльца, способная к образованию эмбриоидов, каллусов в условиях in vitro у многих видов по морфологическим признакам отличается от нормальной пыльцы, реализующей гаметофитную программу. Микроспоры, прошедшие по спорофитному пути развития, претерпевают равное или неравное деление, образуя при этом аномальные пыльцевые зерна. Но такие зерна могут образовываться из микроспор, детерминированных к гаметофитному пути развития, даже из двухклеточной пыльцы, приступившей к отложению запасных веществ, но не завершившей его (Ермаков, Матвеева, 1986).

Полученные нами результаты культивирования пыльников и микроспор овощных культур показали, что критической фазой для перехода с гаметофит-ного пути развития на спорофитный у исследуемых растений является стадия развития микроспор, предшествующая первому гаплоидному митозу (морковь, капуста, томат) и ранняя стадия двухклеточной пыльцы (капуста, огурец, томат). Однако наряду с этим возможен переход и на стадии тетрад у томата (рис.9).

ш ifpj;

1 2 3 4

Рис, 9. Развитие микроспор и пыльцы у овощных растений по спорофитнаму п>ти в культуре in vitro (1 - морковь, 2 - капуста, 3 - томат, 4 - огурец).

Изменение тканей стенки пыльника у ряда овощных растений в культуре in vitro Пыльник представляет собой целостную интегрированную систему. Развитие соматических тканей пыльника и репродуктивных клеток происходит взаимосвязано. Это отражается на процессах, происходящих при культивировании пыльников in vitro. Проведенный цитологический анализ показал типы изменений, протекающие в культуре пыльников in vitro у наиболее распространенных овощных культур, таких как капуста, томат, огурец, лук, морковь.

Капуста. На период оптимальной стадии для индукции андрогенеза, соматические ткани стенки пыльника слабо дифференцированы (рис.Ю). При культивировании таких пыльников возможно образование эмбриоидов из клеток зндотеция и паренхимных клеток связника.

Морковь. Отклонения от гаметофитного пути развития начинаются на стадии поляризации микроспоры, предшествующей митозу. В этот период ткани стенок пыльника моркови сорта Нантская 4 достаточно дифференцированы (рис. 11). Как правило, такие соматические ткани пыльника каллус не образуют. Однако степень дифференциации зависит от генотнпа растения. Например, у сортотипа Флакки эндотеций во время, предшествующее митозу, недостаточно дифференцирован, поэтому при культивировании пыльников этого сорта мож-

но наблюдать образование каллуса. Развитие каллуса можно было увидеть при культивировании пыльников отдельных трансгенных растений моркови сорта Нантская 4 с репортерным геном GUS.

Рис. 10. Схема развития пыльцы и стенок пыльника капусты; А-В - стадии развития микроспор; Г- Е - стадии развития пыльцы

Эп.

Рис. 11. Схема развития пыльцы и стенок пыльника моркови - эпидермис; Эн. - эндотеций: Ср.сл. - средний слой: Т.- таиетум; А- Д развития микроспор; Е-Ж - с тадии развития пыльцы

— стадии

■ . 24

Огурец. Образование каллуса из вегетативной клетки у огурца происходит на ранней вакуолизированной стадии пыльцы, стенки пыльника слабо дифференцированы (рис. 12). Образование каллуса наблюдается, как из стенок пыльника, так и клеток связника.

С |

д

■V,'. «Ч

Рис. 12. Схема развития пыльцы и стенок пыльника огурца; А-В - стадия микроспор:

Г-Е - стадия пыльцы;

Перец и томат. Стенки пыльников перца и томата в отличие от выше описанных овощных культур имеют несколько рядов клеток среднего слоя, которые сохраняются в течение длительного отрезка времени. При культивировании пыльников происходит интенсивное развитие каллуса из клеток средних слоев.

Лук и спаржа. При культивировании пыльников лука независимо от степени дифференциации тканей стенок пыльника мы никогда не наблюдали образование каллуса из них. Совершенно противоположная картина прослеживалась при культивировании пыльников спаржи. Каллус развивался как из

слабо дифференцированных клеток эндотеция, так и из сильно вакуолизиро-ванных клеток, имеющих фиброзные утолщения.

Из вышеизложенного следует, что при культивировании пыльников in vitro наряду с андрогенными эмбриоидами возможно развитие каллуса и соматических эмбриоидов из тканей стенок пыльника. Чаще всего образование каллуса происходит из клеток эндотеция или средних слоев в зависимости от вида растения, но, как правило, каллус никогда не развивается из клеток тапетума, так как в период микроспорогенеза он уже подвергается лизису.

Определение зависимости между размерами бутона и стадией развития микроспор/пыльцы Многочисленные исследования, проводимые на культивируемых in vitro микроспорах и пыльце, показали, что имеются определенные дискретные окна в их развитии, когда под внешним воздействием возможен переход на споро-фитный путь развития (Cheryl et al, 1992; Zarski, 1992; Binarova et al, 1993). Морфологические исследования, проведенные на рапсе, выявили, что эмбриогенез может быть индуцирован на поздней стадии развития микроспор и ранней стадии двухклеточной пыльцы (Fan et al, 1988; Telmer et a], 1992; Hause et al, 1993). Pechan и Keller (1988) определили, что промежуток времени, в течение которого возможен переход с гаметофитного пути развития на спорофитный, составляет менее 8 часов в цикле развития микроспоры. Главная проблема в создании технологии культивирования изолированных микроспор касается способности исследователя точно идентифицировать те бутоны, которые содержат потенциально эмбриогенные микроспоры. Обычно для этой цели используют множество характеристик бутона: длина бутона, длина пыльника, длина цветоножки, положение бутона в соцветии и отношение длины лепестка к длине тычинки. Задачей наших исследований являлось - найти наиболее информативный показатель характеристики бутона.

Для выявления информативности морфологических параметров органов цветка капусты, указывающих на стадию развития микроспор и пыльцы были промерены их длина у различных бутонов брокколи гибрида Аркадия и опре-

делена доля микроспор (табл.5). Полученные данные показали, что все параметры цветка изменяются более или менее синхронно. Всегда можно предвидеть, что у более длинного бутона будут более длинные тычинки, лепестки и пестик. В пыльниках более крупных бутонов микроспоры и пыльца также будут находиться на более поздних стадиях.

Таблица 5

Доля микроспор в пыльниках бутонов брокколи гибрида Аркадия разной длины

Длина бутона, мм Соотношение длины лепестка к длине тычинки Доля микроспор, % Доля двух-, трехклеточной пыльцы, %

2.0 0.63 100,0 0

2.5 0.65 100,0 0

3.0 0.77 97,0 3.0

3.5 0.89 77,0 23,0

.4.0 1.00 66,7 33,3

4.5 1,02 10,8 89,2

5,0 1,20 0.9 99.1

. Однако не всегда бутоны одного размера имеют одинаковые по длине тычинки и лепестки, в большей степени изменению подвержено соотношение длины лепестка к длине тычинки. Для того, чтобы выявить наиболее информативный показатель, из соцветия одного растения были выделены бутоны одинаковой длины, но с разным соотношением длины лепестков и тычинок (табл. 6). При длине бутона 3,0 мм отношение длины лепестка к длине тычинки изменялось от 0,90 до 1,04, соответственно, доля микроспор в пыльниках составляла от 32,0% до 97,1%, а пыльцы от 2,9 до 68,0%. По данным Pechan и Keller (1988) норма удлинения бутона рапса в сутки составляет 0,75 ± 0,02 мм, а время, в течение которого микроспора у рапса является способной к прохождению эмбриогенеза, приблизительно равно 8 часам. Это период между стадией Gj перед митозом и стадией 0|ПОСле митоза (Cheryl et al, 1992), поэтому определить оптимальную стадию развития бутона для культивирования микроспор, ориентируясь только на его размер, проблематично.

Таблица 6

Доля микроспор в пыльниках бутонов брокколи гибрида Аркадия длиной Змм при разном соотношении длины лепестка к длине тычинки

№ бутона Отношение длины лепестка к длине тычинки Доля микроспор, % Доля двух-, трехклеточной пыльцы. %

1 0,90 97.1 2.9

2 0,93 89.2 10.8

3 0,95 88.9 11.1

4 1.04 32,0 68.0

Однако при культивировании первого бутона следует ожидать, что образуется большое количество стерильной пыльцы, так как большинство микроспор находится на ранних стадиях развития. Оптимальными для культивирования микроспор являются 2 и 3 бутоны, соотношение длины лепестка к длине тычинки у них составляет 0,93 - 0,95, фракция микроспор, находящихся перед митотическим делением, будет у них значительной, так как доля пыльцы приближается к 11%.

У моркови цветки, а тем более бутоны мелкие, проводить их измерения без специального оборудования невозможно, поэтому необходимо найти такой морфологический признак, который бы позволял без специальных измерений визуально выбрать необходимый бутон. На основании проведенного анализа зонтичков моркови мы пришли к заключению, что таким признаком является размер завязи (табл. 7).

Таблица 7

Стадии развития мужского и женского гаметофита у моркови, сорт Нантская 4

Длина, мм Количество проанализированных бутонов, шт. Стадия развития мужского гаметофита Стадия развития женского гаметофита

завязи семяпочки

0.15 0,10 20 двухклеточная пыльца мегаспора

0,15 0,13 35 двухклеточная пыльца мегаспора

0.20 0.18 40 трехклеточная пыльца вакуолизация, митоз, формирование зародышевого мешка, увеличение объёма

0,40 0,30 35

0,50 0.40 30

0.60 0.50 25

Так, например, при исследовании зонтичка 54 % бутонов, не имеющих четко выраженную нижнюю завязь, содержали в пыльниках одноядерные микроспоры, 6% бутонов с небольшой завязью до 1,5 мм были с двухклеточной пыльцой, и остальные бутоны, завязь у которых превышала 2 мм, имели трех-клеточную пыльцу. Количество бутонов в зонтичках с двухклеточной пыльцой у моркови всегда незначительно, так как эта стадия развития пыльцы занимает очень короткий промежуток времени.

Влияние генотипа растения на эмбриогенез в культуре пыльников

Были проанализированы 45 образцов различных видов капусты. Для индукции андрогенеза использовали 17 вариантов индукционных сред, разнообразные обработки и условия культивирования. Анализ способности генотипов к андрогенезу оценивали по доле пыльцевых зерен с нарушенным асимметричным митозом. Среди исследованных генотипов способность к индукции андрогенеза была выявлена: у шести генотипов брокколи (Тонус, Аркадия Fi, Лазер F(, Emerald F|, Green Valiant, Бр-21), 2 генотипов капусты белокочанной (К-124-0, К-221-9), 2 генотипов капусты цветной (Цв-1 и Цв-4) и у капусты китайской сорта Ласточка.

Исследования по влиянию генотипа индивидуального растения было проведено на 56 растениях брокколи сорта Тонус, выращенных в условиях открытого грунта. По доле делящихся микроспор на седьмые сутки культивирования судили о процессе индукции спорофитного развития в культуре пыльников in vitro. Только у 14 из 56 растений были обнаружены развивающиеся по спорофитному пути микроспоры. Это составляет лишь одну четвертую часть от общего количества исследованных растений данного сорта. Кроме того, доля индуцированных микроспор колебалась в широких пределах (от 0,3до 31,2 %). Таким образом, эмбриогенная способность микроспор/ пыльцы может сильно различаться между растениями одного сорта.

Количество эмбриоидов, образующихся в'культуре пыльников моркови на среде МСм с 0,2 мг/л 2,4 Д по разработанной нами методике может достигать до 544/100 пыльников (Тюкавин и др., 1999).

Эта методика была апробирована в лаборатории биотехнологии на целом ряде сортообразцов моркови европейского происхождения, таких как НИИОХ 336, Витаминная, Московская зимняя А-515, Лосиноостровская 13, Леандр, Шантанэ 2461, сортотип Амстердамская, Напе, Рондо, гибридах Fi Каратан, Ка-листо. Среди растений-регенерантов, полученных в культуре пыльников, прослеживалась гаметоклональная изменчивость. Визуально это можно увидеть по окраске и форме листовой пластинки и корнеплодов растений-регенерантов, и также подтверждено результатами RAPD- анализа (Тюкавин и др., 2000).

Однако при культивировании пыльников моркови гибрида F| Scarlet wonder, относящегося к восточному подвиду, растения-регенеранты не были получены. Чтобы найти различия между двумя контрастными по способности к андрогенезу генотипами моркови, мы исследовали действие растворов 2,4 Д на соцветия. У обоих сортообразцов наблюдали нарушения асимметричного митоза, только процесс образования стерильной пыльцы у гибрида Scarlet wonder происходил быстрее (табл. 8,9)

Таблица 8

Развитие микроспор и пыльцы в соцветии моркови сорта Нантская 4. помещенном в раствор 2,4 Д (1998-1999 гг.)

Время воздействия Стадии развития микроспор и пыльцы

1| 2 | 3 ! 4 | 5 | 6 | 7 I 8

Крайние ряды бутонов в зонтичке

исходное состоян ие 0 !.3±0.6 93,4±1,4 3,7± 1,3 0 0 0.6Ю.4 0,9±0.5

1 сутки 0 0 50,613,3 19.8±2.1 0,1 ±0.6 0 26.412.1 З.ОЛ.О

3 суток 0 0 14,212,9 4,б± 1,0 6,812,1 0 50.8±3.3 23,5±2.9

3—4 ряды бутонов в зонтичке

исходное состояние 3,5±1,4 74,0+4,7 21,6±5.3 0 0 0 0 0.9±0.9

1 сутки 0 11.317.5 86,4±7.7 0,3±0.3 0 0 1.6±0.9 0.410.0

3 суток 0 0 16,4±2.5 5.412.6 2.2±0.8 0 56.3±3,5 19.7Ю.5

5 -6 ряды бутов в зонтичке

исходное состояние 97.7±5,1 2,3±0.1 0 0 0 0 0 0

1 сутки 5,9± 1.1 63,3±4.1 9.5+1,7 5,3±1.8 0 0 1,810.3 14.2+3.4

3 суток 0 19.5±2,8 25.2±3.2 3,4±0.9 0.2±0.2 0 0.5±0.3 46.815.4

I — тетрады; 2 — распад тетрад; 3 — микроспора с ядром, расположенным в центре, и двумя крупными вакуолями; 4- микроспора с ялром. смещенным к полюсу; 5 - двухклеточная пыльна; 6-трехклеточная пыльца: 7- с нарушенным асимметричным митозом: 8 — стерильная пыльца.

Таблица 9

Развитие микроспор и пыльцы в соцветии моркови гибрида Fi Scarlet wonder, помещенном в раствор 2,4Д (1998-1999 гг.)

Время воздействия Стадии развития микроспор и пыльцы

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6

Крайние ряды бутонов в зонтичке

исходное состояние 10 7+?3 8.5Ю.9 24,3±3,2 28.2±2.5 0,6±0.4 0.9±0.5

1 сутки 0 0 1,3±0,2 75.5±4,3 2,1±1.0 21,1+3,3

3 суток 0 0.2±0.2 0 84.2±2.0 2.0Ю.З 13.8±1.7

3—4 ряды бутонов в зонтичке

исходное состояние 34.8±1,4 30,8±2.4 18,6±1,5 1,7+0.6 9,6+1,3 5,3+1,3

1 сутки 0.5±0.3 0.1±0.1 8.9±3,6 49.4±5.7 20.812,8 20.3±2,3

3 суток 0 0.4±0.3 2,1±1,1 81,8±3.5 1.7±0.5 13.9+2,7

Центральные ряды бутонов в зонтичке

исходное состояние 56,4±1,5 43,6±1,5 0 0 0 0

1 сутки 2,3+0,9 2.3±0.8 14,9+1.1 8.7+3,0 28,9+2.0 32,2±2,0

3 суток 3,4+1.1 . 4,4+1,6 6,7±1,5 34.9±3.2 3,7±1.0 46,8+2.4

1 — микроспора с ядром, расположенным в центре; 2- микроспора с ядром, смещенным к полюсу: 3 - двухклеточная пыльца; 4 - трехклеточная пыльца; 5 - с нарушенным асимметричным митозом; б - стерильная пыльца.

По литературным данным 2,4 Д может подавлять соматический эмбриогенез у некоторых видов семейства сельдерейные, поэтому пыльники обоих сортообразцов были прокультивированы на средах, содержащих ИУК. Здесь также проявилось нарушение асимметричного митоза, как у моркови сорта Нантская 4, так и у гибрида Scarlet wonder, но развитие эмбриоидов не происходило (табл.10). При клональном микроразмножении гибрида Fj Scarlet wonder соматический эмбриогенез не наблюдался, проявлялось лишь побегообразование.

Это указывает на то, что 2,4 Д индуцирует у сортообразцов моркови европейского происхождения все этапы эмбриогенеза. ИУК индуцирует лишь первый этап у сортобразцов этого подвида.

Иная картина наблюдается у гибрида Fi Scarlet wonder, когда оба регулятора роста индуцируют лишь первый этап - нарушение асимметричного митоза. Аналогичные изменения наблюдались при культивировании пыльников укропа, петрушки и сельдерея.

Таблица 10

Нарушения асимметричного митоза в культивируемых in vitro пыльниках моркови сорта Нантская 4 и гибрида Fi Scarlet wonder на средах, содержащих ИУК (1998-1999 гг.)

Концентрация ИУК в среде мг/л Микроспоры : Пыльца

с нормальным развитием с нарушен ной двухклеточная стерильная морфогенная, тип деления

вакуолизацией неравный равный

Сорт Нантская - 4

1 37,015.8 2.8+0,5 1,3 ¿0.4 8.911.6 35,314.3 14.2±1,9

2 40,8+4.4 0 0 6,1+1,6 37,411,5 15,6±3.1

3 28.312.9 0.1+0,1 КЗ ±0,6 13.1 ±3.4 53,8+2.7 3.010.9

4 18.612,8 5.211,3 6,5±1,4 9,0±2,6 48.313.6 11.2+1.6

5 20.114,0 2.511.4 0.5±0,1 26.613.7 43.314.8 4.811,0

Гибрида F| Scarlet wonder

1 27,8±2,1 0 0 7.7±2.3 54,9+2.3 9,612,0

2 20,6±5.0 0,4+0.2 1,2±0,3 7.812.1 50.514.4 19,3+2.2

3 36,0+3,1 0 0 12.211,7 47.712.6 3,311,3

4 46.3+3.6 0 0 14.3 ±2,7 35.711.3 6,012,6

5 61,5+2,3 0 0 6.611.0 29.7+2.1 1,9±0,7

Как по литературным данным, так и в наших опытах большая часть попыток получения пыльцевых гаплоидов заканчивается на разных этапах каллусо -или эмбриогенеза. Можно полагать, что в основе этого лежат объективные причины, отражающие существование нескольких уровней детерминации, специфически связанных со спорофитным развитием. Таким образом, получение гомозиготных линий в культуре пыльников возможно лишь у отдельных генотипов овощных культур, у которых возможен переход микроспор/пыльцы с гаметофитного пути развития на спорофитный.

Полученный в лаборатории биотехнологии исходный материал с применением культуры пыльников моркови in vitro передан в селекционные лаборатории в ВНИИССОК, НИИОХ, Западно-сибирскую овощную опытную станцию. Использование этого материала на Западно-сибирской овощной опытной станции позволило создать сорт моркови Соната (Ткжаоин я др., 2005).

Клональное микроразмножение овощных растений

Получение гибридов является основой для интенсивной технологии возделывания овощных культур. Значительную роль в этом процессе могут играть биотехнологические методы. Они облегчают и ускоряют традиционный селекционный процесс в создании новых форм и сортов растений. Важная область применения биотехнологических методов — это поддержание растений с мужской стерильностью или самонесовместимостью путем вегетативного размножения с целью получения генетически идентичных клонов для их использования в гетерозисной селекции.

Важную роль в клональном микроразмножении играют выбор исходного экспланта и гормональный состав сред, индуцирующих побегообразование.

Капуста. В исследованиях использовали стерильные проростки капусты белокочанной сортов Подарок, Слава 1305, Амагер 611, Зимовка 1474, Московская поздняя 15, Номер первый грибовский 147. В качестве экспланта брали фрагменты семядолей пятисуточных проростков.

При подборе среды, индуцирующей побегообразование, составили 12 вариантов, содержащих различные цитокинины и ауксины. Во всех вариантах при использовании в качестве экспланта фрагментов семядолей через две недели культивирования наблюдали образование каллусных тканей с последующей регенерацией корней. Наиболее интенсивное корнеобразование происходило на средах, содержащих НУК и ИУК, развитие побегов было единичным.

При анализе результатов опытов с использованием в качестве эксплантов участков гипокотилей было отмечено, что образование каллуса в первую очередь происходит из коровой части. Это рыхлый каллус светлой или слегка буроватой окраски, из которого развиваются корни. В ряде случаев образуется каллус из клеток сердцевины. Он также рыхлый, светлой окраски, но кз него не наблюдалось регенерации ни корней, ни побегов. Наибольший интерес представляет каллус зеленого цвета, плотный с незначительным приростом, образующийся на границе флоэмы и ксилемы, то есть на месте нахождения камбия. Из него, как правило, образуются дополнительные побеги.

Большое значение имеет местоположение фрагмента гипокотиля в проростке. У фрагментов, выделенных из верхней части гипокотиля, наблюдается развитие многочисленных побегов. Если эксплантом служит средняя часть гипокотиля, то происходит образование единичных побегов. У эксплантов, выделенных из нижней части гипокотиля, наряду с появлением каллуса из коровой части развиваются корни. Экспланты из верхней части гипокотиля частично захватывают ткани эпикотиля, которые детерминированы на развитие побега. Побегообразование в этом случае происходит как из апикальной, так и из периферической меристем.

Из двенадцати использованных вариантов сред оптимальными являются среды со следующими сочетаниями регуляторов роста: по 0,2 мг/л 2,4 Д и СРРи и по 0,2 мг/л НУК и СРР1! (табл. 11).

Таблица 11

Каллусогенез и органогенез у экснлантов капусты белокочанной _сорта Номер первый грибовский 147 (2001- 2002 гг.)_

Цитокинины Ауксины

НУК ИУК 2,4 Д

1 2 1 2 1 2

Тидиазурон Каллус, корнеоб- разование Каллус, побегообразование Каллус. корнеоб- разование Каллус с небольшим приростом Каллус, корнеоб- разование Каллус побегообразование

2 — ¡р Тоже Каллус, корнеобра- зование Тоже Каллус, корнеобра- зование То же Каллус. корнеоб- разование

(Си нети и То же То же То же Тоже То же То же

БАП То же Каллус, побегообразование То же То же То же То же

1 - эксплантом служили сегменты семядолей; 2 - эксплантом служили сегменты гипокотиля

Использование в качестве экспланта частей бутона позволяет клонально размножать стерильные' или же с низкой завязываемостью-семян самонесовместимые растения ' капусты, выделенные в период цветения растений. Эффективность такой методики, была показана для размножения стерильных растений Вгатка гарсг Ь.(Уагщ е1 а1., 2000). '""

Разработку клонапьного микроразмножения с использованием различных

частей бутона проводили на капусте брокколи сорта Тонус. Варианты питательных сред были составлены по аналогии работы Yang с соавторами (2000). Для индукции каллусообразования - среда МСм с 1-6 мг/л 2,4 Д и 0,1 мг/л кинетика и побегообразования - среда МСм с 1-5 мг/л БАП и 0,2 мг/л НУК. В качестве экспланта использовали пестик с остатками цветоложа.

На всех средах независимо от концентрации 2,4 Д происходило образование каллуса. При переносе каллуса на регенерационные среды, несмотря на его глобулярную структуру, развитие побегов не наблюдалось. Из каллуса, перенесенного со среды с высоким содержанием 2,4 Д, появлялись корневые волоски через две недели культивирования, при более низких концентрациях 2,4 Д— позднее.

В следующей серии опытов мы использовали для индукции каллусообразования среду МСм с 0,2 мг/л 2,4 Д и тидиазурона по аналогии с предыдущими нашими опытами и для сравнения среду МСм с 3 мг/л 2,4 Д и 0,1 мг/л кинетина. Наличие в среде тидиазурона индуцировало образование плотного зеленого каллуса. К концу культивирования из крайних тканей цветоложа произошло образование белого рыхлого каллуса. Для гистологического анализа происхождения каллусных тканей был сделан срез с цветоложа. На срезе прослеживаются тяжи камбиальных тканей у основания частей околоцветника, где наблюдалось развитие зеленого каллуса, и рыхлые паренхимные ткани на месте появления белого каллуса (рис.13). При культивировании пестиков ти-диазурон инициировал развитие зеленого каллуса из меристематических клеток цветоложа, так же. как в опытах с эпикотилем.

Рис. 13. Развитие почек из каллусных тканей, образовавшихся из клеток камбия в основании охолоцветника капусты.

Для индукции побегообразования испытывали следующие среды: МСм с 0,2 мг/ л НУК и тидиазурона, 0,2 мг/л БАП и тидиазурона и в качестве контроля с 3 мг/л БАП и 0,2 мг/л НУК (табл.12).

Таблица 12

Органогенез в каллусных тканях, полученных из пестиков бутонов капусты брокколи __сорта Тонус (2002-2003 гг.)_

Варианты регенерационных сред Варианты сред, индуцирующих каллусообразование

МСм с 0,2 мг/л 2,4 Д и тидиазурона МСм с 3 мг/л 2.4 Д и 0,1 мг/л кинетика

МСм с 0,2мг/л НУК и 3 мг/л БАП Единичные побеги из зеленого каллуса, ризогенез из светлого каллуса, побурение каллусных тканей через 4 недели культивирования. Разрастание светлых каллусных тканей, ризогенез.

МСм с 0,2 мг/л НУК и тидиазурона Единичные побеги из зеленого каллуса, ризогенез из светлого каллуса, разрастание каллусных тканей. Разрастание каллусных тканей, появление светло зеленыч участков, ризогенез.

МСм с 0,2 мг/л БАП и тидиазурона Множественные побеги из зеленого каллуса, ризогенез из светлого каллуса. Разрастание каллусных тканей, образование темно зеленых участков каллуса, ризогенез.

В течение первых двух недель наблюдали появление единичных побегов из зеленых участков каллуса на средах с БАП и тидиазуроном и на средах с БАП и НУК. Ризогенез происходил на всех средах из светлого каллуса. Однако к концу четвертой недели процессы регенерации на средах с БАП и НУК прекратились, началось побурение каллусных тканей. На средах с НУК и тидиазуроном одновременно происходил прирост, как светлого каллуса, так и зеленого, но формирование глобулярных структур и почек не наблюдалось, единичные побеги появились лишь через 4 недели культивирования. На среде, содержащей тидиазурон в комплексе с БАП, к концу четвертой недели индуцировалось образование побегов из зеленого каллуса (рис. 13), а из светлого каллуса развивались корни. Из каллуса, полученного на среде с высоким содержанием 2,4 Д, на всех регенерационных средах образовывались корни.

Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности использования тидиазурона как для индукции каллусообразования, так и для инициации побегообразования у эксплантов капусты.

Редис. Изучение морфогенетической активности у различных типов экс-плантов на примере редиса сорта Фея показало, что органообразовательной и регенерационной способностью обладали только фрагменты гипокотилей, выделенные из верхней их части, и захватывающие ткани эпикотиля с высокой меристематической активностью. Клетки семядольных эксплантов были детерминированы только на ризогенез (13,6%), а морфогенетическая активность корневых сегментов и нижних участков гипокотелей вообще не обнаружена.

Огурец. Для индукции каллусообразования, побегообразования и эмбриогенеза использовали среду МСм с 30 г/л сахарозы с различными комбинациями регуляторов роста: 1 — 0,5 мг/л БАП; 2 — 2 мг/л кинетина; 3 — 2 мг/л 2,4Д и 0,5 мг/л кинетина; 4 - 0,8 мг/л 2,4Д и 2ip; 5 - 1 мг/л НУК. 2,4Д и 0,5 мг/л БАП. Данные представлены в таблице 13, из которой видно, что почти во всех вариантах происходит ризогенез. Перенос каллуса, полученного из семядолей, на регенерационные среды (1 - 1 мг/л НУК и 0,5 мг/л БАП; 2 — 10мг/л НУК и 0,5 мг/л БАП; 3 - 1 мг/л ИУК и 0,5 мг/л БАП) положительных результатов не дал.

Таблица 13

Каллусогенез и органогенез у эксплантов огурца линии Л-42 (2002-2003 гг.)

Регуляторы роста Тип экспланта

Гипокотиль Семядоли

0,5 мг/л БАП У 50% эксплантов - побегообразование Семядоли не использовались

2,0 мг/л кинетина У 30% эксплантов - побегообразование То же

2,0 мг/л 2.4Д и 0,5 мг/л кинетика У 25% эксплантов - корнеобразо-вание; у 12% - образование каллуса по поверхности среза Скручивание, образование светлого каллуса по поверхности среза, прирост незначительный

0,8мг/л 2.4Д и 2ip У 50% эксплантов - корнеобразо-вание; и у всех образование бурого каллуса по поверхности среза У всех эксплантов развитие каллуса с последующим ризогенезом

1,0 мг/л НУК, 1.0 мг/л 2.4 Д и 0.5 мг/л кинетина Каллусообразование с последующим ризогенезом Каллусообразование, каллус рыхлый с глобулярной структурой, ризогенез

Однако нами было отмечено, что культивирование верхних участков ги-

покотиля на средах с цитокининами индуцирует побегообразование и

способствует образованию дополнительных почех. На основании этого нами были составлены следующие варианты сред: 1-1,0 мг/л 2 ¡р; 2 — 1,0 мг/л БАП; 3-1,0 мг/л кинетина; 4 - 0,2 мг/л СРРи.

При культивировании верхних отрезков гипокотиля на этих средах проявилась зависимость числа побегов от положения экспланта на среде. При помещении экспланта точкой роста вниз (точка роста в этом варианте оказывается погруженной в питательную среду) происходит образование дополнительных побегов. При появлении первого листочка и соприкосновении его верхней стороны со средой, содержащей 0,2 мг/л СРР1), индуцируется закладка многочисленных почек. Однако если листочек контактирует со средой нижней стороной, то образование почек не происходит. Предположительно, это связано с транспортом регуляторов роста, так как только при прямом контакте мы наблюдаем положительный эффект.

Регенерационную способность можно повысить, воздействуя различными соединениями, индуцирующими организованный рост в дедифференцирован-ной ткани.

Бор - один из наиболее важных для растений микроэлементов. В нем наиболее нуждаются двудольные растения. Среди них выделяется ряд семейств, у которых это явление выражено в большей степени. К ним относится семейство капустные. Бор необходим для нормальной деятельности верхушечных меристем.

Предобработка эксплантов раствором борной кислоты стимулировала процесс побегообразования у сорта Номер первый грибовский 147 в два раза уже после двух недель культивирования. У сорта Амагер 611 эффект влияния борной кислоты был меньше. Вследствие этого было изучено влияние различных концентраций растворов борной кислоты, используемых для предобработки эксплантов у разных сортов капусты белокочанной. Полученные результаты свидетельствуют о том, что экспланты сортов капусты белокочанной различаются по потребности в боре, она изменяется от 1мг/мл до 2 мг/мл.

Аналогичные результаты были получены при культивировании частей бу-

тона. Наилучший эффект получен при двойной обработке эксплантов раствором борной кислоты и пониженной температурой (табл. 14).

Таблица 14

Регенерация побегов капусты брокколи сорта Тонус на среде МСм с 0,2 мг/л БАП и тидиачурона из каллуса, полученного на среде МСм с 0,2 мг/л 2,4 Д и тидиаэурона (20022004 гг.)

№ п/п Тип морфогенети-ческих изменений Контроль Обработка

раствором борной кислоты пониженной температурой раствором борной кислоты и пониженной температурой

1 Тип каллуса а). Светлый с ризогенезом б). Зеленый без побегообразования а). Светлый с ризогенезом б). Зеленый без побегообразования а). Светлый с ризогенезом б). Зеленый без побегообразования а). Светлый с ризогенезом б). Зеленый без побегообразования

2 % эксплантов с кор-необразованием 100 100 100 100

3 % эксплантов с побегообразованием 37,5 28,5 50,5, 100

4 Число побегов на эксплант 0-4 0-3 0-5 10-30

Итак, при работе с эксплантами капусты, редиса, огурца прослеживалось

избирательное действие регуляторов роста производных фенилмочевины на меристематические ткани, которые детерминированы на побегообразование. Это в свою очередь позволяет успешно разрабатывать технологии клонального размножения капусты с использование СРРи и тидиаэурона.

При использовании разработанных элементов технологии для размножения самонесовместимых и стерильных образцов капусты белокочанной и брокколи удалось повысить число побегов, образующихся на одном экспланте до 50-60 штук. Весь период размножения от выделения экспланта и посадки растения-регенеранта в почву составляет 2,5-3,0 месяца, что способствует ускорению селекционного процесса. Применение этой технологии позволило размножить самонесовместимые и стерильные формы капусты белокочанной, капусты броколли, капусты декоративной, которые используются в селекционном процессе в лаборатории селекции и семеноводства капустных культур ВНИИССОК.

39

ВЫВОДЫ

1. Разработана система биотехнологических методов, способствующая ускорению селекционного процесса у овощных культур за счет использования клонального микроразмножения, культуры пыльников и неопыленных семяпочек in vitro и гаметного отбора.

2. Цитологическое исследование пыльников у овощных культур, относящихся к разным семействам, показало общие принципы их развития при некоторых индивидуальных отличиях. У всех овощных культур асимметричному митозу предшествует поляризация цитоплазмы с образованием крупной центральной вакуоли. Процесс развития пыльцевого зерна сопровождается деструкцией тапетума, клеток средних слоев и образованием фиброзных утолщений эндотеция. Специфично развитие стенки пыльника у томата. У него наблюдаются лишь незначительные фиброзные утолщения стенок эндотеция, и по мере отмирания тапетума клетки средних слоев сохраняются.

3. Оптимальные концентрации углеводов, ионов кальция и бора в питательных средах для проращивания пыльцы являются индивидуальными и могут изменяться в определенных границах для каждого отдельного генотипа. Для представителей семейства капустные наибольшее значение имеют концентрация сахарозы и рН среды. В зависимости от генотипа изменяются в пределах 10-25% содержание сахарозы и значения рН от 7-9. Пыльца генотипов перца наиболее требовательна к значениям рН среды. Для большинства генотипов лука репчатого концентрация сахарозы 15% - оптимальна. Однако пыльца лука не способна прорастать на жидких питательных средах.

4. У исследуемых овощных культур с мужской стерильностью проявляются сходные отклонения в развитии вегетативных тканей стенок пыльников, ведущих к мужской стерильности. Всегда отмечаются нарушения функций тапетума (перерождение, ранняя деструкция, снижение функциональной активности). Влияние измененного тапетума приводит к нарушению обменных процессов между этой тканью и микроспорами, что подтверждает важную роль гаметофитно-спорофитного взаимоотношения в процессе микроспорогенеза.

5. Оценка генотипов на холодоустойчивость по мужскому гаметофиту находится в зависимости от условий выращивания растений. В пыльце, сформированной на фоне повышенных температур, воздействие низких температур вызывает неадекватную реакцию.

6. Бактерии Erwinta carotovora снижают способность пыльцы лука репчатого прорастать на искусственных питательных средах; степень влияния бактерий на пыльцу зависит от концентрации бактериальной суспензии и устойчивости сорта к бактериальным гнилям. Наличие такой зависимости делает возможным проведение отбора устойчивых к Erwinta carotovora мужских гамет.

7. Критической фазой для перехода с гаметофитного пути развития на спорофитный у исследуемых овощных культур является стадия развития микроспор, предшествующая первому гаплоидному митозу (морковь, капуста, томат) и ранняя стадия двухклеточной пыльцы (капуста, огурец, томат). Наряду с этим возможен переход и на стадии тетрад (томат).

8. При культивировании пыльников in vitro наряду с андрогенными эм-бриоидами возможно развитие каллуса и соматических эмбриоидов из тканей стенок пыльников. Чаще всего образование каллуса происходит из клеток эндо-теция (капуста, морковь, спаржа, огурец) или средних слоев (томат) в зависимости от вида растения, и каллус никогда не развивается из клеток тапе-тума, так как в период микроспорогенеза они уже подвергаются лизису.

9. В большинстве случаев получение пыльцевых дигаплоидов у овощных культур заканчивается на этапах каллусогенеза или раннего эмбриогенеза. Существует несколько уровней детерминации, контролирующих определенные этапы перехода на спорофитный уровень развития. В культуре пыльников моркови in vitro возможно получение растений-регенерантов, среди которых прослеживается гаметоклональная изменчивость.

10. Влияние регуляторов роста, температурной обработки, индуцирующих переход с гаметофитного пути на спорофитный, сортоспецифично и зависит от генотипа. Предварительная оценка эффективности воздействия по-

вышенных температур, регуляторов роста на соцветия in vivo позволяет ускорить процесс подбора оптимальных условий культивирования.

11. Во время индукции клетки разных тканей одного и того же органа приобретают детерминацию к специфическому органогенезу (побегообразование, корнеобразование, каллусообразование или эмбриогенез). Клетки коровой паренхимы капусты, редиса, дайкона, огурца детерминированы на ризогенез, а клетки меристематических тканей на побегообразование.

12. Избирательное действие на меристематические ткани эксплантов овощных культур оказывают регуляторы роста производные фенилмочевины, индуцирующие из них побегообразование. Это могут быть латеральные меристемы, или остатки маргинальных меристем молодых листочков. Индуцирующий эффект регуляторов роста для капусты можно усилить, используя предобработку эксплантов пониженными температурами или раствором борной кислоты.

Практические рекомендации

Для предварительной оценки жизнеспособности пыльцы у таких культур, как капуста, редис, перец рекомендуется использовать питательные среды с учетом значения рН. Пыльцу лука можно проращивать in vitro только на плотных агаризованных средах. Концентрация сахарозы может быть индивидуальной для сортообразиов капусты, редиса, лука.

При проведении селекции лука на устойчивость к бактериозу с использованием мужского гаметофита в качестве селектирующего барьера рекомендуется использовать смесь пектолитических ферментов, выделившихся в среду при мацерации листьев лука бактериальной суспензией Erwinia caroto-vora.

Оценку генотипов овощных культур на холодоустойчивость по мужскому гаметофиту можно проводить лишь на растениях, выращиваемых при пониженной и нормальной температуре, так как в пыльце, сформированной на фоне повышенных температур, воздействие низких температур вызывает неадекватную реакцию.

Для получения дигаплоидов лука в культуре неопыленных семяпочек можно использовать питательные среды, содержащие 2мг/л НУК и 4мг/л БАП или НУК и тидиазурон.

Для предварительного определения стадии развития микроспор у растений капусты рекомендуется использовать соотношение длины тычинок к лепесткам, а у моркови длину завязи.

Сократить количество вариантов предобработок пыльников капусты можно путем предварительной оценки эффективности воздействия повышенных температур, регуляторов роста на изолированные соцветия ш vivo.

Для получения растений-регенерантов моркови из микроспор с гамето-клональной изменчивостью рекомендуется использовать методику культивирования пыльников моркови ш vitro (Тюкавин, Шмыкова,2000).

При размножении самонесовместимых и стерильных линий капусты и редиса для индукции каллусообразования и побегообразования рекомендуется использовать тидиазурон или CPPU, а для увеличения количества образующихся побегов использовать предобработку эксплантов положительными пониженными температурами и 0,1 - 0,2 % раствором борной кислоты.

Для индукции побегообразования при клональном микроразмножении огурца рекомендуется использовать 0,2 мг/л тидиазурона или CCPU.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шмыкова Н.А. Титова И.В. культура in vitro неопыленных завязей межвидовых гибри дов лука // Биология культивируемых клеток растений и биотехнология: Тез. докл. 11 Междунар. конф. 28 сент.- 2 опт. 1993. - Алматы, 1993. - Т.1. - С. 154.

2. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Каллусо- и эмбриогенез огурца in vifro И Конференция по генетике соматических клеток в культуре : Тез. докл. - М.. 1993. - С. 44.

3. Shmikova N. A., Tjukavin G.B. Culture of unpollinated ovaries and ovules in bulb onion, carrot and cucumber // Plant biotechnology and genetic engineering: Abst. Int. Svmp. Ukraine, October 3 -6, 1994. - Kiev, 1994. - P. 114.

4. Shmikova N. A. Anther culture of Allium сера L. // Plant biotechnology and genetic engineering: Abst. Int. Symp. Ukraine. October 3 -6. 1994. - Kiev, 1994. - P. 113.

5. Gavrilenko T.A.. Dorokhov D.B.,Pavlov A.V.. Sochanova N.M., Shmikova N.A. A cytoge-netical. phenotypic, biochemical and molecular characterization of intergeneric somatic hybrids of tomato Lycopersicon esculentum Mill, and non-tuberous potato species from

Etuberosa series // Plant biotechnology and genetic engineering: Abst. Int. Symp. Ukraine. October 3 -6, 1994. - Kiev, 1994. - P. 52.

6. Настенко H.B., Шмыкова H.A., Балашова H.H., Кушнерева В. П. Разработка способа предварительной оценки растений огурца на устойчивость к фузариозу // Селекция овощных культур: Научные труды ВНИССОК. - М., 1994,- Вып. 34. -С.75-79.

7. Настенко Н.В., Шмыкова Н.А. Совершенствование методики определения жизнеспособности огурца // Селекция овощных культур: Научные труды ВНИССОК. - М.,

1994.- Вып. 34. -С.47-50.

8. Шмыкова Н.А., Хомякова Е.М. К вопросу получения гибридов спаржи // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования // Труды 1 Междунар. симп. 1 -5 августа 1995. - Пущино, 1995. - С. 333 -334.

9. Настенко Н.В., Шмыкова Н.А.. Балашова Н.Н., Кушнерева В.П. Селекция огурца к корневым гнилям//Труды ВНИИССОК(к 75-летию).- М„ 1995.-С. 31 -40.

10. Шмыкова Н.А., Агафонов А.Ф., Шкляр С.Н. Перспективы использования мужского гаметофита а селекции лука репчатого // Труды ВНИИССОК (к 75 - летию).- М..

1995.-С. 170-175.

11. Балашова Н.Н., Игнатов А.Н., Самохвалов А.Н., Рогачев Ю. Б., Шмыкова Н.А. Жизнеспособность микрогаметофита белокочанной капусты под влиянием возбудителей бактериозов и килы//С.-х. биология. - 1995.- №5.- С. 115-118.

12. Самохвалов А.Н., Рогачев Ю.Б., Шмыкова Н.А., Настенко Н.В., Перова Т.П. Фитоток-сическое действие грибов рода Fusarium // Научные труды по селекции и семеноводству. М., 1995.-Т. 1. -С 124- 125.

13. Шмыкона Н.А. Культура пыльников, неопыленных завязей и семяпочек лука репчатого // Научные труды по селекции и семеноводству. М., 1995. - Т. 1. - С 164 - 170.

14. Настенко Н.В., Шмыкова Н.А., Кушнерева В.П. Разработка методов селекции огурца на устойчивость к корневым гнилям с использованием мужского гаметофита // Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса, экономика, эффективность, экономичность. // Сб. докл. Всерос. съезда по защите растений. -Санкт - Петербург, 1995. - С. 224..

15. Балашова Н.Н., Шмыкова Н.А., Шкляр С.Н., Агафонов А.Ф. Использование мужского гаметофита в селекции репчатого лука на устойчивость к бактериальной гнили Н Зашита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса, экономика, эффективность, экономичность. И Сб. докл. Всерос. съезда но защите растений. - Санкт- Петербург, 1995. - С. 158.

16. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Культура неопыленных завязей и семяпочек моркови -путь ускоренного получения стерильных линий гетерозисной селекции // Селскшя овочевых i баштанних культур на гетерозис : Тез. допов. Мгжнар. наук конф. - ХарИв.

1996. С. 82 -83.

17. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б. Использование культуры пыльников ин витро для получения гомозиготных линий моркови // Гетерозис сельскохозяйственных растений: Материалы докл.и сообщ. Междунар. симп. 1-5декабря I997.-M.. 1997.-С. 174-175

18. Тюкавин Г.Б.. Шмыкова Н.А. Разработка методов андро- и гиногенеза для создания лигаплоидных линий в селекции F1 гетерозискых гибридов овощных культур // Гетерозис сельскохозяйственных растений: Материалы докл.и сообщ, Meждvнap. симп. 15 декабря 1997.-М.. 1997. - С. 161 -162.

19. Агафонов А.Ф., Шмыкова Н.А. Использование мужского гаметофита в селекции лука репчатого на устойчивость к бактериозу // Методические указания по селекции луковых культур. - М. 1997. - С. 28 - 31.

20. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А Методы ускоренного получения линий моркови для гетерозисной селекции // Гетерозис сельскохозяйственных растений: Материалы докл.и сообщ. Междунар. симп. 1-5 декабря 1997.-М.. 1997. - С. 163-164.

21. Монахова М.А., Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Фенотип интерфазного ядра в клеточной селекции моркови // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: Тез. докл. VII Междунар. конф. 25-28 ноября 1997. - М., 1997,-С. 223.

22. Шмыкова H.A., Тюкавин Г.Б. Изучение потенциального эмбриогенеза микроспор моркови // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: Тез. докл. VII Междунар. конф. 25-28 ноября 1997. - М„ 1997. - С. 185.

23. Шмыкова H.A., Тюкавин Г.Б. Влияние регуляторов роста на развитие тканей пыльников моркови // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. Четвертой Междунар. конф. 24-26 июня 1997. - M., 1997. - С. 319.

24. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Гормональная регуляция каллусо- и органогенеза моркови // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. Четвертой Междунар. конф. 24-26июня 1997.-М., 1997.-С. 321.

25. Настенко Н.В., Шмыкова H.A., Кушнерева В.П. Новый подход в селекции огурца на устойчивость к фузариозу // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования. Материалы симп. Пушино, 1997. - Т 4. - С. 469 -470.

26. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Использование методов культуры пыльников и неопло-дотворенных семяпочек для создания константных линий моркови // Использование биотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем: Сб. докл. и сооб. XVIII Мичуринских чтений 27-29 октября 1997 г. - Мичуринск, 1998. - С. 71 -74.

27. Шмыкова H.A., Тюкавин Г.Б. Альбинизм в культуре пыльников моркови in vitro и его возможные механизмы // 11 Всероссийский съезд фотобиологов (Пущино. 8-12 июня 1998 .): Материалы съезда. - М., 1998. - С. 152.

28. Tjukavin О.В.. Shmykova N.A. Anther culture and unpollinated ovules of carrot // Plant Biotecnology and In Vitro Biology in the 21s' Century: Absl. IX Inl Cong, on Plant Tissue and Cell Culture/ Israel. June 14-19, 1988. Jerusalem, 1998. - P. 115.

29. Monahova M.A., Tjukavin G.B.. Shmykova N.A. Change of ploidy during formation regenerated plants from androgenous and gynogenous embryos of carrot in vitro // Plant Biotecnology and In Vitro Biology in the 21s' Century: Abst. IX lnt Cong, on Plant Tissue and Cell Culture/Israel, June 14-19, 1988. Jerusalem, 1998.-P. 180.

30. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Разработка методов биотехнологии растений для создания исходного материала в селекции овощных, малораспространенных и цветочных культур во ВНИИССОК // Материалы докладов, сообщ. Международного симп. но селекции и семеноводству овощных культур I - 4 марта 1999. - М., 1999. - С. 362 -371.

31. Домблидес A.C.. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Влияние регуляторов роста на образование эмбриогенных структур в зародышевых мешках неопыленных семяпочек моркови // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. Пятой Международной конф. 29 июня - 1 июля 1999.-М., 1999. - 4.2. -С.318 -319.

32. Шмыкова H.A., Тюкавин Г.В. Влияние предобработки соцветий моркови регуляторами роста на образование «эмбриогенной» пыльцы // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. Пятой Международной конф. 29 июня - 1 июля 1999. - М.. 1999. - 4.2. - С. 354 - 355.

33. Шмыкова H.A., Тюкавин Г.В. Влияние регуляторов роста на образование «эмбриогенной пыльцы в культивируемых in vitro пыльниках различных генотипов моркови // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. Пятой Международной конф. 29 июня - 1 июля 1999.-М., 1999. - 4.2. - С. 353- 354.

34. Хомякова Е.М., Шмыкова H.A.. Панфилов А.Г.. Циунель М.М. Методические указания по использованию культуры in vitro при сортоподдержании и размножении ревеня. М,- 1998.-41 с.

35. Заячковский В.А., Шмыкова H.A., Старцев В.И. Цитологическое изучение особенностей микроспорогенеза в пыльниках у стерильной формы столовой свеклы //111 Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования: Труды 111 Ме-ждунар. симп.21 -25 июня 1999-Пущино, 1999,- Т.З. - С.478 -480.

36. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Монахова М.А. Цитология эмбриогенеза в культуре пыльников моркови // Физиология растений.- 1999 - Т.46. - №6. - С. 876 - 883.

37. Домблидес Е.А., Шмыкова H.A. Попытка идентификации потенциальной эмбриоген-ной способности микроспор у представителей рода Brassica // IV съезд Общ. Физиол. Раст. России, «Физиология растений- наука 111 тысячелетия»: Тез. докл. Междунар. науч. конф. 4-9 октября, 1999. - М„ 1999. - Т.2. - С. 570.

38. Домблидес Е.А., Шмыкова H.A. Влияние обработки регуляторами роста соцветий на развитие микроспор представителей рода Brassica in vivo //Селекция и семеноводство овошных культур в XXI веке: Междунар. научно-практическая конференция 24-27 июля 2000. М., - Т.2.- С. 392-393.

39. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А.Биотехнология в селекции овощных культур // Селекция и семеноводство . - 2000. - №1. - С. 42 - 44.

40. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Культура неопыленных семяпочек моркови // Селекция и семеноводство овошных культур в XXI веке: Международная научно - практическая конф. 24 - 27 июля 2000. М. 2000. - С. 275 - 277

41. Тюкавин Г.Б., Домблидес A.C., Шмыкова H.A. Гиногенез моркови in vitro II Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке: Международная научно - практическая конф. 24 - 27 июля 2000. М.. 2000. - С.277- 279.

42. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Методические рекомендации по получению дигаплои-дов моркови методом андрогенеза - М. 2000. - 56 с.

43. Шмыкова I I.A., Тюкавин Г.Б. Диморфизм пыльцы и андрогенез в культуре пыльников моркови (Daueus carola L.) Н Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. II Международной научной конференции 18-19 октября 2000. - М., 2000. - С.55 - 56.

44. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А.Методы получения дигаплоидов моркови in vitro // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. II Международной научной конференции 18-19 октября 2000. - М., 2000. - С. 120 - 121.

45. Домблидес A.C., Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Получение гиногенных растений моркови in vitro с использованием тидиазурона // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. II Международной научной конференции 18-19 октября 2000.-М., 2000.-С. 154- 155.

46. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Культура пыльников моркови // Доклады ТСХА.. М.:2000,- Вып. 272 - С. 55 - 60.

47. Шмыкова H.A., Тюкавин Г.Б. Диморфизм пыльцы и оценка эмбриогенной способности микроспор различных генотипов моркови //Сельскохозяйственная биология. — 2001.-№5.-53-61.

48. Тюкавин Г.Б., Супрунова Т. П., Шмыкова H.A., Домблидес A.C.. Дорохов Д.Б.. Клы-гина Т. Э. Изучение гаметоклональной изменчивости у моркови сорта Нантская 4 //Овощеводство - состояние, проблемы, перспективы: Научные труды (к 70 - летига ВНИИО) В 2 т.. - М.. 2000,- Т.1. - С.157 - 161.

49. Кушнерева В.П., Гладышко С.Н., Шмыкова H.A. Исходный материал для селекции огурца партенокарпического типа для открытого грунта. // В сб.: Итоги и перспективы развития плодоводства и овощеводства. Международная конференция, посвященная 90-летию со дня рождения профессора А.Н. Ипатьева Тез. докладов. Горки. 2001. - С. 74-79.

50. Домблидес Е.А., Шмыкова H.A. Развитие пыльников капусты in vivo и при культивировании in vitro.// Селекция и семеноводство овощных культур. Сборник научных трудов ВНИИС'СОК - М.. 2001. - Вып. 37. - С.

51. Кушнерева В.П., Гладышко С.Н., Шмыкова II.А. Оценка огурца на холодоустойчивость // Селекция и семеноводство овощных культур. Сборник научных трудов ВНИИССОК - М„ 2001. Вып. 37. - С. 93 -100.

52. Домблидес А.С., Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б. Цитологическое изучение модификации дифференциации тканей пыльников моркови сорта НИИОХ 336 с петалоидным типом стерильности // Овощеводство - состояние, проблемы, перспективы: Научные труды (к 70 - летию ВНИИО). - М„ 2002,- Т. 1. - С.75 - 79.

53. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Технология получения удвоенных гаплоидов моркови // Материалы научной генетической конференции, посвященной 100 - летию со дня рождения Л.П.Жебрака и 70 -летию образования кафедры генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А.Тимирязева. М.: Изд - во МСХА, 2002. -С.327 -329.

54. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б. Морфогенетические изменения в культивируемых /и W-по пыльниках моркови //. Доклады ТСХА. - М.: Изд -во МСХА, 2002. - Вып. 274. -С.511 -516.

55. Domblides Е.А., Shmykova N.A. Embryogenesis in culture of ¡solated microspore of Broccoli (Brasstca olerácea var/ ilalica) in vi/ro // Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources: Abst. Int. Symp. Ukraine, May 26 -31, 2002. - Yalta, 2002. - P. 29.

56. Шмыкова H.A., Тюкавин Г.Б. Особенности морфогенетических изменений в культивируемых in vitro пыльниках моркови // Биотехнология. - 2002. - №5. - С.65 - 69.

57. Балашова Н.Н., Балашова И.Т., Супрунова Т.П., Музыкантов В.П., Козарь Е.Г.. Скворцова Р.В., Гуркина Л.К., Добруцкая Е.Г., Домблидес А.С.. Шмыкова Н.А.. Тюкавин Г.Б., Пивоваров В.Ф. Применение методов молекулярного анализа и селекционных программах (овощные культуры) // lnginerie genetica si biotehnologii moderne: Materialele Simpozionului al II - lea National cu participare Internationala. -Chisinau. 2002. - C. 7-12

58. Иванушкина Т. В., Шмыкова Н.А., Бунин М.С. Разработка метода клонального микроразмножения культур вида Raphanm sutiviu. // Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке: Междунар. Научно-практическая конф. 15-18 декабря 2003 г. - М., 2003. - С.376-379.

59. Бунин М.С, Шмыкова Н.А, Иванушкина Т. В. Методические рекомендации по определению жизнеспособности пыльцы культур вида Raphanus satívus. - М.- 2003. - 34 с.

60. Беспалько А.В., Козарь Е.Г., Шмыкова Н.А., Балашова Н.Н. // Методические особенности оценки жизнеспособности пыльцы перца сладкого in vitro // Сб. Междунар. научно-практ. конф. по пасленовым культурам. — Астрахань, 2003. - С. 45.

61. Бунин М.С., Шмыкова Н.А., Степанов В. А., Старцев В.И.. Бондарева Л.Л. Методы репродуктивной биологии в селекции овощных культур рода Brassica L. — М. 2003. -52 с.

62. Иванушкина Т. В., Шмыкова Н.А., Бунин М.С. Влияние нитрата серебра на процесс побегообразования из гипокотильных эксплантов растений вида Raphanus saiivu.4 т vitro. // Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур. Сборник научных трудов международной научно-практической конференции (22 - 25 марта 2004 г.) - М„ 2004. - С. 206 - 211.

63. Иванушкина Т. В., Шмыкова Н А., Бунин М.С. Цитологическое изучение особенностей развития пыльника растений вида Raphanus salivas с ЦМС - Ogura. // Доклады ТСХА.-М.: Изд-во МСХА. - 2004. - В. 276.-С. 461 -465.

64. Бунин М.С., Шмыкова Н.А., Бочариикова Н.И:, Пышная О.Н.. Джое Е.А. Методические рекомендации по определению жизнеспособности пыльцы вида Capskum аппиит L. - М., 2004. - 32 с.

65. Шмыкова Н.А.. Бочарникова Н.И., Пышная О.Н., Джое Е.А. Искусственная питательная среда япя определения жизнеспособности пыльцы перца Capsicum аппиит I.

//Проблемы научного обеспечения овощеводства юга России. Материалы международной научно - практической конференции (4-7 августа). Краснодар, 2004. - С.209

66. Бунин М.С., Шмыкова Н.А. Использование биотехнологических методов для получения исходного материала капусты - М., 2004. - 42 с.

67. Tyukavin G. В., Shmykova N.A. Embryogenesis in cullured carrot anthers // Innovation Towards Modemized Agriculture. Book of Abstracts of AGRICONGRESS 2004. - Malaysia 2004,-P. 184 - 186.

68. Левко Г.Д., Шмыкова H.A., Грубиянова M. И. Определение жизнеспособности пыльцы у разных видов из рода Чина (Lathyrus L.) // Доклады ТСХА. - М.: Изд-во МСХА. - 2004. - В. 276.- С. 491 - 496.

69. Шмыкова Н.А. Разработка методов репродуктивной биологии для селекции овощных культур // Современное состояние и перспективы развития селекции и семеноводства овощных культур: Материалы Международного симпозиума.- 9-12 августа 2005г. М.. 2005.-Т.1.-С.383-390.

70. Шмыкова Н.А. Перспективы использования клонального микроразмножения в селекции овощных культур // Вестник РАСХН. 2005. - №4. - С. 48-49.

71. Тюкавин Г.Б., Рыбалко А.А., Шмыкова Н.А., Селянин И.Г. Андрогенез in vitro - метод ускоренного получения сорта столовой моркови Соната // Состояние и проблемы научного обеспечения овощеводства защищенного грунта: Материалы II Международной конференции.- 21-23 ноября 2005 г. М. 2005. -C.144-I47.

-213.

Верстка, печать ООО "Полиграф Плюс ОК" г. Одинцово, ул. Комсомольская, 9, т/ф: 593-20-01 Заказ № 172. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, доктора сельскохозяйственных наук, Шмыкова, Наталья Анатольевна

Введение.

1 .ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Основные этапы развития пыльника и пыльцы.

1.2. Мужская стерильность.

1.3. Факторы, влияющие на гиногенез в культуре неопыленных семяпочек in vitro.

1.4. Гаметная селекция сельскохозяйственных растений.

1.5. Факторы, влияющие на андрогенез в культуре пыльников и микроспор in vitro.

1.6. Способы регенерации растений.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Развитие пыльника и образование пыльцы у овощных растений.

3.2. Мужская стерильность у овощных растений.

3.3. Гаметная селекция овощных растений.

3.4. Культура неопыленных семяпочек лука in vitro.

3.5. Культивирование пыльников и микроспор овощных растений in vitro.

3.6. Клональное микроразмножение овощных растений.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Разработка системы биотехнологических методов, направленных на ускорение селекционного процесса овощных культур"

Репродукция (воспроизводство) растительного материала является центральным вопросом селекции. Генетики, селекционеры и семеноводы используют половую и вегетативную репродукцию на различных этапах селекционного процесса, включая создание исходного материала, отбор, поддержание и размножение перспективного сортолинейного материала или сортов и гибридов сельскохозяйственных растений.

В современной селекции овощных культур сформировалось и получило приоритетное направление создание гибридов Fb которые отличаются от сортов высокой урожайностью, выравненностью растений по срокам созревания, размерам и качеству продуктивных органов. Основой селекционного процесса при создании гибридов является выведение родительских линий, в результате скрещивания которых получают гибридные семена. Непрерывность производства таких семян обеспечивается размножением родительских линий. Наиболее сложным звеном в этом процессе является создание родительских линий. Основой для создания родительских линий служит мужская стерильность или самонесовместимость. Ограничением в получении и поддержании таких линий является процесс их размножения. В связи с этим методы культуры тканей приобретают большое значение для построения рациональных систем создания гибридных семян в селекции овощных культур. Важными предпосылками экономически выгодного использования методов культуры тканей являются высокие коэффициенты размножения при сохранении генетической стабильности, а также экономия времени при размножении in vitro, что дает возможность включать их в селекционный процесс.

С другой стороны, репродуктивная фаза жизненного цикла растений представляет своеобразную природную систему «генетической инженерии», в которой новые комбинации генов, собранные в гаметах, проверяются в системах гаметофитного отбора. Затем отселектированные гаметы собираются в новые индивидуальности, представляющие собой предмет для процессов отбора на спорофитном уровне.

Понимание того, как влияют способы репродукции на изменчивость растений, как происходит развитие репродуктивной системы у растений, является основой генетического процесса. Известно, что мейоз растений объединяет воспроизводительные и преобразовательные функции. Ограниченность знаний о репродуктивных особенностях растений - основная причина недостаточного использования процессов гаметогенеза. В естественных условиях отбор мужских гаметофитов представляет собой широко распространенное явление у высших растений.

Исследования репродуктивного цикла растений тормозятся микроскопическими размерами клеток, их расположением и быстрым развитием. Пока предметом коммерции и науки не стали рекомбинация, мужская стерильность, самонесовместимость и апомиксис, технология их изучения отсутствовала. Толчком к усиленному изучению репродуктивных клеток в последние годы послужило то, что, во-первых, они являются превосходной моделью для многих аспектов клеточного развития, то есть целое поколение может изучаться на пыльцевых зернах.

Мужской гаметофит имеет два преимущества перед спорофитным поколением - это микроскопические размеры и гаплоидный генотип. Первые дают возможность в лабораторных условиях проводить исследования, и анализу может быть подвергнуто большое количество генотипов.

Гаплоидное же состояние генома в отличие от диплоидного позволяет обнаружить редкие рецессивные аллели, а получение дигаплоидных растений из микроспор и клеток зародышевого мешка - реализовать гаметоклональную изменчивость в индивидуальные растения.

Основой успешной разработки методов оценки и отбора генотипов на микрогаметофитном уровне является способность пыльцы прорастать и расти на искусственной питательной среде, что дает возможность быстро и эффективно оценить как жизнеспособность пыльцы, так и реакцию мужского гаметофита на стрессовое воздействие.

Вопросы опыления-оплодотворения играют основную роль в практической работе по гибридизации и семеноводству. Успех скрещивания зависит от знания поведения пыльцевых зерен на рыльцах пестиков, закономерности взаимоотношения пыльцевых зерен с секреторной деятельностью рыльца. В селекционной работе большое значение имеет возможность предварительной оценки жизнеспособности пыльцы, используемой в скрещиваниях, особенно в тех случаях, когда растение выращивали в стрессовых условиях (повышенная или пониженная температура, недостаток или избыток влаги и т.д.) и при опылении пыльцой, хранившейся в течение какого- либо промежутка времени. Кроме того, оценка на уровне пыльцы представляет самостоятельный интерес, так как в значительной степени характеризует чувствительность к тому или иному фактору внешней среды самой репродуктивной системы растения.

Таким образом, приведенные аргументы со всей очевидностью показывают, что необходимы научные исследования, направленные на детальное изучение процессов микроспорогенеза, микрогаметогенеза, опыления, андрогенеза, гиногенеза и клонального микроразмножения ценных овощных культур.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Шмыкова, Наталья Анатольевна

ВЫВОДЫ

1 .Разработана система биотехнологических методов, способствующая ускорению селекционного процесса у овощных культур за счет использования клонального микроразмножения, культуры пыльников и неопыленных семяпочек in vitro и гаметного отбора.

2.Цитологическое исследование пыльников у овощных культур, относящихся к разным семействам, показало общие принципы их развития при некоторых индивидуальных отличиях. У всех овощных культур асимметричному митозу предшествует поляризация цитоплазмы с образованием крупной центральной вакуоли. Процесс развития пыльцевого зерна сопровождается деструкцией тапетума, клеток средних слоёв и образованием фиброзных утолщений эндотеция. Специфично развитие стенки пыльника у томата. У него наблюдаются лишь незначительные фиброзные утолщения стенок эндотеция, и по мере отмирания тапетума клетки средних слоев сохраняются.

3. Оптимальные концентрации углеводов, ионов кальция и бора в питательных средах для проращивания пыльцы являются индивидуальными и могут изменяться в определенных границах для каждого отдельного генотипа. Для представителей семейства капустные наибольшее значение имеют концентрация сахарозы и рН среды. В зависимости от генотипа изменяются в пределах 10-25% содержание сахарозы и значения рН от 7 - 9. Пыльца генотипов перца наиболее требовательна к значениям рН среды. Для большинства генотипов лука репчатого концентрация сахарозы 15% -оптимальна. Однако пыльца лука не способна прорастать на жидких питательных средах.

4. У исследуемых овощных культур с мужской стерильностью проявляются сходные отклонения в развитии вегетативных тканей стенок пыльников, ведущих к мужской стерильности. Всегда отмечаются нарушения функций тапетума (перерождение, ранняя деструкция, снижение функциональной активности). Влияние измененного тапетума приводит к нарушению обменных процессов между этой тканью и микроспорами, что подтверждает важную роль гаметофитно-спорофитного взаимоотношения в процессе микроспорогенеза.

5. Оценка генотипов на холодоустойчивость по мужскому гаметофиту находится в зависимости от условий выращивания растений. В пыльце, сформированной на фоне повышенных температур, воздействие низких температур вызывает неадекватную реакцию.

6. Бактерии Erwinia carotovora снижают способность пыльцы лука репчатого прорастать на искусственных питательных средах; степень влияния бактерий на пыльцу зависит от концентрации бактериальной суспензии и устойчивости сорта к бактериальным гнилям. Наличие такой зависимости делает возможным проведение отбора устойчивых к Erwinia carotovora мужских гамет.

7. Критической фазой для перехода с гаметофитного пути развития на спорофитный у исследуемых овощных культур является стадия развития микроспор, предшествующая первому гаплоидному митозу (морковь, капуста, томат) и ранняя стадия двухклеточной пыльцы (капуста, огурец, томат). Наряду с этим возможен переход и на стадии тетрад (томат).

8. При культивировании пыльников in vitro наряду с андрогенными эмбриоидами возможно развитие каллуса и соматических эмбриоидов из тканей стенок пыльников. Чаще всего образование каллуса происходит из клеток эндотеция (капуста, морковь, спаржа, огурец) или средних слоев (томат) в зависимости от вида растения, и каллус никогда не развивается из клеток тапетума, так как в период микроспорогенеза они уже подвергаются лизису.

9. В большинстве случаев получение пыльцевых дигаплоидов у овощных культур заканчивается на этапах каллусогенеза или раннего эмбриогенеза. Существует несколько уровней детерминации, контролирующих определенные этапы перехода на спорофитный уровень развития. В культуре пыльников моркови in vitro возможно получение растений-регенерантов, среди которых прослеживается гаметоклональная изменчивость.

10. Влияние регуляторов роста, температурной обработки, индуцирующих переход с гаметофитного пути на спорофитный, сортоспецифично и зависит от генотипа. Предварительная оценка эффективности воздействия повышенных температур, регуляторов роста на соцветия in vivo позволяет ускорить процесс подбора оптимальных условий культивирования.

11. Во время индукции клетки разных тканей одного и того же органа приобретают детерминацию к специфическому органогенезу (побегообразование, корнеобразование, каллусообразование или эмбриогенез). Клетки коровой паренхимы капусты, редиса, дайкона, огурца детерминированы на ризогенез, а клетки меристематических тканей на побегообразование.

12. Избирательное действие на меристематические ткани эксплантов овощных культур оказывают регуляторы роста производные фенилмочевины, индуцирующие из них побегообразование. Это могут быть латеральные меристемы, или остатки маргинальных меристем молодых листочков. Индуцирующий эффект регуляторов роста для капусты можно усилить, используя предобработку эксплантов пониженными температурами или раствором борной кислоты.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для предварительной оценки жизнеспособности пыльцы у таких культур, как капуста, редис, перец рекомендуется использовать питательные среды с учетом значения рН. Пыльцу лука можно проращивать in vitro только на плотных агаризованных средах. Концентрация сахарозы может быть индивидуальной для сортообразцов капусты, редиса, лука.

При проведении селекции лука на устойчивость к бактериозу с использованием мужского гаметофита в качестве селектирующего барьера рекомендуется использовать смесь пектолитических ферментов, выделившихся в среду при мацерации листьев лука бактериальной суспензией Erwinia carotovora.

Оценку генотипов овощных культур на холодоустойчивость по мужскому гаметофиту можно проводить лишь на растениях, выращиваемых при пониженной и нормальной температуре, так как в пыльце, сформированной на фоне повышенных температур, воздействие низких температур вызывает неадекватную реакцию.

Для получения дигаплоидов лука в культуре неопыленных семяпочек можно использовать питательные среды, содержащие 2мг/л НУК и 4мг/л БАП или НУК и тидиазурон.

Для предварительного определения стадии развития микроспор у растений капусты рекомендуется использовать соотношение длины тычинок к лепесткам, а у моркови длину завязи.

Сократить количество вариантов предобработок пыльников капусты можно путем предварительной оценки эффективности воздействия повышенных температур, регуляторов роста на изолированные соцветия in vivo.

Для получения растений - регенерантов моркови из микроспор с гаметоклональной изменчивостью рекомендуется использовать методику культивирования пыльников моркови in vitro (Тюкавин, Шмыкова,2000).

При размножении самонесовместимых и стерильных линий капусты и редиса для индукции каллусообразования и побегообразования рекомендуется использовать тидиазурон или СРРи, а для увеличения количества образующихся побегов использовать предобработку эксплантов положительными пониженными температурами и 0,1 - 0,2 % раствором борной кислоты.

Для индукции побегообразования при клональном микроразмножении огурца рекомендуется использовать 0.2 мг/л тидиазурона или ССРЫ.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, доктора сельскохозяйственных наук, Шмыкова, Наталья Анатольевна, Москва

1. Алаторцева Т.А. Культура завязей кукурузы в связи с апомиксисом: Автореф. дис. канд. биол. наук. СПб., 1994. -18 с.

2. Алимова Г.К. Микроспора. В кн.: Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепция под ред. Батыгиной Т.Б. СПБ.: «Мир и семья», 1994.-Т.1. - С. 52-56.

3. Банникова В.П., Плющ Т.А. Слияние ядер гамет и полярных ядер у цветковых растений //Цитология и генетика. 1990. - Т.24. - №1. - С.62 -64.

4. Банникова В.П., Хведынич O.A. Основы эмбриологии растений. Киев: Наук, думка, 1982.- 163 с.

5. Батыгина Т.Б. Зародышевый мешок: сформированный и зрелый. В кн.: Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Под ред. Т.Б.Батыгиной. С -Петербург: Мир и семья, 1994. -Т.1. С. 188.

6. Батыгина Т.Б. Микроспорогенез и развитие пыльцевого зерна у пшеницы // Докл. АН СССР. 1962. - Т. 142. - № 5. - С. 1205 - 1208.

7. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. (Атлас). Л.: Наука, 1987. 102 с.

8. Батыгина Т.Б., Жукова Г.Я. Синергида. В кн.: Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Под ред. Т.Б. Батыгиной. С -Петербург: Мир и семья, 1994. Т.1. С. 188.

9. Батыгина Т.Б., Эмбриология пшеницы. Л.: Колос, 1974. 206 с. Ю.Брежнев Д.Д. Проблемы гетерозиса в овощеводстве. В кн. «Объединеннаянаучная сессия по проблемам гетерозиса» под. ред. Брежнева Д.Д. Л., 1966.-С. 3-10.

10. Бугара A.M., Русина JI.B. Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек in vitro как способ получения гаплоидных растений // Физиология и биохимия культурных растений. 1988. - Т. 20. - №5. - С. 419 -430.

11. З.Буренин В.И., Храпалова И.А., Артемьева A.M. Источники и доноры селекционно ценных признаков овощных культур. В кн.: Идентифицированный генофонд растений и селекция. Санкт - Петербург, 2005.-С. 419-443.

12. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М., «Наука», 1964. 272 с.

13. Бхандари H.H. Микроспорангий // В кн. Эмбриология растений под ред. И.П.Ермакова. Москва: «Агропромиздат», 1990. С. 66 147.

14. Виллемс М.Т.М., Дж. J1. ван Вент Женский гаметофит. // В кн.: Эмбриология растений: использование в генетике, селекции, биотехнологии Под ред. И.П. Ермакова, М.: Агропромиздат, 1990. Т. 1. С. 184 - 217.

15. П.Внучкова В.А. Методические указания по культуре ткани томатов. М., 1985. -16 с.

16. Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение растений // В кн. Культура клеток растений и биотехнология. Под ред. Бутенко Р.Г. М.: Наука, 1986. -С.91-102.

17. Галеев Г.С., Цветкова В.И. Нормализация биохимических процессов в пыльниках при восстановлении фертильности у растений кукурузы с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) // Докл. ВАСХНИЛ. -1969.- №7.-С. 15-19.

18. Герасимова Навашина E.H. Двойное оплодотворение поркрытосеменных и некоторые теоретические аспекты // Проблемы эмбриологии. - Киев: Наук, думка, 1971.-С. 113-152.

19. Герасимова Навашина E.H., Гуляев В.А. Некоторые данные об ультраструктуре клеток зародышевого мешка Crépis capillaris (L.) Wallr. после опылени // Бюл. Гл. ботан. сада АН СССР - 1973. - № 89. - С. 14 - 20.

20. Голубинский И.Н. Биология прорастания пыльцы. Киев, - 1974. - 368 с.

21. Горбатенко И. Ю. Микроразмножение различных генотипов томата in vitro II Докл. ВАСХНИЛ- 1980.-№ 12.-С. 12- 18.

22. Данвелл Дж. М. Культуры гаплоидных клеток // В кн. Биотехнология растений: культура клеток./ Пер. с англ. Под ред. Р.Г. Бутенко. М.: Агропомиздат, 1989. С. 33-51.

23. Егорова H.A., Резникова С.А. Исследование культуры изолированных пыльников кориандра в связи с индукцией андрогенеза // Физиология растений.- 1982.-Т. 29. С. 142-149.

24. Ермаков И.П., Матвеева Н.П. Диморфизм пыльцы и андрогенез в культуре пыльников и микроспор // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16. Биология. 1986. -№3.-С. 28-40.

25. Ермаков И.П., Матвеева Н.П., Старостенко Р.И., Андреюк Д.С. Индукция спорофитного развития в культуре in vitro высокомолекулярными внеклеточными факторами из микроспор табака // Доклады Академии Наук. 1996.-Т. 351.- С. 423-424.

26. Жукова Г .Я. Пластиды гамет и зародыша цветковых растений // Ботанический журнал. 1993. - Т.78. - №4 - С. 18 -35.

27. Жукова Г.Я. Ультраструктура клеток зрелого зародышевого мешка цветковых (черты сходства, различия). В сб.: Материалы Всесоюз. симпозиума. Телави, 1984. - С. 22-23.

28. Жукова Г.Я. Ультраструктурные и функциональные особенности яйцеклетки цветковых. В сб.: Проблемы гаметогенеза, оплодотворения и эмбриогенеза. Материалы VIII Всесоюз. совещ. по эмбриологии растений. -Ташкент, 1983. С. 30-31.

29. Жукова Г.Я. Яйцеклетка. В кн.: Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Под ред. Т.Б.Батыгиной. С -Петербург: Мир и семья, 1994. Т. 1. С. 195- 197.

30. Жукова Г.Я., Батыгина Т.Б. Антиподы. В кн.: Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Под ред. Т.Б.Батыгиной. С -Петербург: Мир и семья, 1994. -Т.1. - С. 199 - 202.

31. Казакова A.A. Использование стерльных форм при получении гибридных семян лука. В кн. «Объединенная научная сессия по проблемам гетерозиса» под. ред. Брежнева Д.Д. Л., 1966. - С. 40-43.

32. Камелина О.П. Семейство Marantaceae. В кн.: Сравнительная эмбриология цветковых растений. Л.: Наука, 1990. - С. 247 - 254.

33. Козлова В.М. Использование идентифицированной генетической коллекции мутантных форм томата для создания исходного селекционного материала по признаку холодостойкость: Автореф. дис. канд. с-х. наук. М., 1999. - 23 с.

34. Комформе Ч.С. Изучение гаплоидного апомиксиса и комбинационной способности автодиплоидных линий кукурузы: Автореф. дис. канд. биол. наук. Краснодар, 1985. - 23 с.

35. Кравченко А.Н., Лях В.А., Тодераш Л.Г. и др. Методы гаметной и зиготной селекции томатов. Кишинев: Штиница.- 1988.- 152 с.

36. Кривенко A.A. Цитологическое исследование чеснока (Allium sativum L.) II Биол. журн. 1938. - Вып. 7. - №1. - С. 47 - 68.

37. Литвинова М.К. Анатомо- морфологические особенности строения растений моркови с признаком ЦМС и их семенная продуктивность // Научно-технический бюлл. ВИР. -Л., 1989. № 162. - С.

38. Литвинова M.K. Морковь (Dauern carota L) Биологические особенности, селекция и семеноводство, агротехника возделывания. Пенза. 2001. - 143 с.

39. Литвинова М.К. Подбор и изучение гибридных комбинаций моркови // Тр. Плодоовощного ин-та им И.В. Мичурина.- Мичуринск, 1961. Т. XII. - С. 35-37.

40. Литвинова М.К. Результаты изучения стерильных форм моркови : Сб. тез. Всесозного симп. по эмбриологии растений, посвященного 70-летию открытия двойного оплодотворения акад. С. Г. Навашиным. Киев: Наукова думка, 1968.-С. 124-125.

41. Лях В.А. Генетические основы микрогаметофитного отбора кукурузы: Автореф. дис. д-ра биол. наук. С - Петербург, - 1992. - 48 с.

42. Лях В.А. Изменение состава и спектра расщепляющихся популяций при воздействии на пыльцу межвидовых гибридов Fi томатов различными факторами: Автореф. дис. канд. биол. наук Минск, - 1989. - 25 с.

43. Лях В.А., Сорока А.И. Эффективность микрогаметофитного отбора на устойчивость кукурузы к температурному фактору // С.-х. биология. 1993. -№3.-С. 38-44.

44. Лях В.А., Сорока А.И. Эффективность микрогаметофитного отбора на устойчивость кукурузы к температурному фактору // С.-х. биология. 1993. -№3. - С. 38-44.

45. Магешвари П. Эмбриология покрытосеменных.- М.: Иност. лит., 1954.-439 с.

46. Макаров A.A. Цитоплазматическая пыльцевая стерильность репчатого лука // Известия ТСХА. Сельхозгиз, 1960. С. 209-211.

47. Марьяхина И.Л. К ранней диагностике мужской стерильности у кукурузы. В кн.: Морфогенез растений. М., 1961. - Т. 1. - С. 511- 513.

48. Марьяхина И .Я. Характер морфогенеза и размножения кочанной капусты в культуре ткани при использовании различных стимуляторов роста // С.- X. биология. -1981. №2. - С.246 - 252.

49. Милиян Л.Г., Балашова Н.н. Метод пыльцевой селекции растений на устойчивость к фитопатогенам (на примере томатов) // С.-х. биология. -1994. -№1.-С. 121-129.

50. Монахос Г.Ф., Крючков A.B., Пачурия Д.В., Воробьева H.H., Лежнина A.A., Харламов Д.М., Суденко В.Г. Методические рекомендации по созданию и технологии размножения линий капусты с цитоплазматической мужской стерильностью. М., 2003. - 22 с.

51. Монахос Г.Ф., Монахос С.Г. Использование межвидовой гибридизации при создании линий пекинской капусты с цитоплазматической стерильностью . В сб.: Памяти Грегора Менделя. -М., 2001. С. 88 -89.

52. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений, М.: Агропромиздат, 1988,-271с.

53. Пирев М.Н. Гистохимическое исследование пыльников фертильных и стерильных по пыльце форм подсолнечника. В кн.: Биология оплодотворения и гетерозис культурных растений. Кишинев, 1966. -Вып. 4. - С. 94- 116.

54. Поддубная Арнольди В.А. Цитоэмбриология покрытосеменных растений. Основы и перспективы. - М.: Наука, 1976. - 507 с.

55. Полевой В.В. Физиология растений: Учебник для биологических специальностей вузов. М.: Высшая шк. - 1989. - С. 244-379.

56. Резникова С.А. Цитология и физиология развивающегося пыльника. М.: Наука, 1984.-266 с.

57. Романов И.Д. Особенности развития пыльцы злаков и значение их для некоторых генетических исследований // Генетика. 1970. - Т. 6. - № 10. - С. 11-25.

58. Савченко Л.Ф., Резникова с.А. Некоторые особенности ЦМС у шалфея мускатного // Тр. по прикл. ботанике, генетике и селекции. 1975. - Т. 54. -№2.-С. 250-254.

59. Сазонова Л.В., Литвинова М.К., Жидкова H.H. Генетика моркови // Генетика культурных растений. С-Петербург, 1998. С.

60. Салтанович Т.Н. Влияние абиотических факторов на мужской гаметофит и зародыш томатов, отбор устойчивых генотипов: Автореф. дис. канд. биол. наук. Кишинев, 1998. - 42 с.

61. Сенин И.В., Балашова H.H., Тимин Н.И. Изменчивость и наследуемость некоторых признаков семенного растения моркови. В сб. Науч. тр. по селекции и семеноводству (к 75 летию ВНИИССОК) - М., 1995. - Т. 1. - С. 263 - 269.

62. Сечкарев Б.И. Характеристика семейства зонтичных Apiaceae Moris (Umbelliferae) II Культурная флора СССЗ. Л.: Колос, 1971. Т. XIX. - С. 268 -368.

63. Симоненко В.К. Влияние микроспороцитов и образование «гиганской « пыльцы у ЦМС форм сорго // Науч техн. бюл. ВСГИ. - Одесса, 1974. -Вып. 23.-С. 31 -39.

64. Симоненко В.К. Исследования микроспорогенеза кукурузы с цитоплазматической мужской стерильностью. // Изв. АН МССР. 1964. - № 10. -С.51-58.

65. Степанов В.А. Исходный материал для селекции и семеноводства репы японской в условиях Центрального Нечерноземья: Автореф. дис. канд. с-х наук. М., 1998.-22 с.

66. Тимин Н.И. Генотипы инбредных линий моркови. В сб. материалов международной научно-практической конференции «Приоритетныенаправления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке. М., 2003. - С. 225-227.

67. Тимин Н.И. Инбридинг, ЦМС, гетерозис моркови. В сб. материалов международного симпозиума «Гетерозис сельскохозяйственных растений». -М., 1997.-С. 63-64.

68. Тимин Н.И., Тимина JI.T., Кривошеев С.М., Кан Л.Ю. Дикие виды и подвиды моркови как генетические источники устойчивости к альтернариозу // Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке. -М.: ВНИИССОК, 2000. С.

69. Тиссера Б. Эмбриогенез, органогенез и регенерация растений // В кн. Биотехнология растений: культура клеток. / Пер с англ. Под ред. Р.Г.Бутенко М.: Агропомизда, 1989. С. 97-128.

70. Турбин Н.В. Генетика гетерозиса и методы селекции растений на комбинационную способность // Генетические основы селекции растений. М.: Наука, 1971. С. 112 - 155.

71. Турбин Н.В., Палилова А.Н. Генетические основы цитоплазматической мужской стерильности у растений. Минск: Наука и техника, 1975. - 184 с.

72. Тырнов B.C. Гаплоидия и апомиксис // Апомиксис у растений: состояние, проблемы и перспективы исследований: Тр. Междунар. симпоз. Саратов, 1994.- С. 141-142.

73. Тырнов B.C. Гаплоидия у растений: научное и прикладное значение. М., 1998.-53 с.

74. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А, Монахова М.А. Цитология эмбриогенеза в культуре пыльников моркови // Физиология растений. 1999. - Т. 46. - С. 876-883.

75. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Методические рекомендации по получению дигаплоидов моркови методом андрогенеза. М., 2000. - 56 с.

76. Фотев Ю.В. Исходный материал для селекции томата с устойчивостью к стрессовым температурам и болезням: Автореф. дисс. на соиск. степ. канд. с.-х. наук. М., 1992. -21 с.

77. Френкель Р., Галун Э. Механизмы опыления, размножения и селекция растений. М. «колос», 1982. - 383 с.

78. Чабан И.А. Электронномикроскопическое исследование эндосперма у Reseda lutea L. В кн.: Актуальные вопросы эмбриологии покрытосеменных, -М.: Наука, 1979.-С. 58-69.

79. Чеботарь A.A. Тапетум: ультраструктурные аспекты. В кн.: Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепция под ред. Батыгиной Т.Б. -СПБ.: «Мир и семья», 1994. Т. 1. - С. 52 - 56.

80. Чумак Н.В. Получение и выделение макроклинных и андрогенных гаплоидов кукурузы: Автореф. дис. канд. биол. наук. J1., 1977. - 18 с.

81. Шевченко C.B. Спорогенная ткань. В кн.: Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепция под ред. Батыгиной Т.Б. СПБ.: «Мир и семья», 1994.-T. 1.-С. 69.

82. Ширяева Э.И., Ярмолюк Т.И. Цитоэмбриологические и гистохимические особенности цитоплазматической и генной мужской стерильности у сахарной свеклы. В кн.: Цитоплазматическая мужская стерильность и селекция растений. Киев: Наук, думка, 1979. С. 182 - 185.

83. Школьник М.Я. Микроэлементы в жизни растений. JI., 1974. 324 с.

84. Юдин Б.Ф., Хватова М.Н. К познанию и использованию гаплоидии и полиплоидии в селекции кукурузы // Генетика 1966. - №3. - С. 60 - 67.

85. Юркова Г.Н., Сирант JI.B., Труханов В.А. Прямая регенерация растений из мезофильных клеток растений // Цитология и генетика 1989. - Т.23. - №1. -С. 68-69.

86. Abdul-Baki A.A., Stommel J.R. Pollen viability and fruit set of tomato genotypes under optimum and hing temperature regimes // HortScience. V. 30. P. 115-117.

87. Albertsen M.C., Palmer R. G. A comparative light and electromicroscopic study of microsporogenesis in male sterile (MS) and male fertile soybeans (Glicine Max (L.) Merz) II Amer. J. Bot. 1979. - V. 66. - P. 253 - 265.

88. Anderson M. A., Harris P. J., Boning I., Clarke A. E. Immuno-goid localization of a-L-arabinofuranosyl residues in pollen tubes of Nicotiana alata Link et Otto. Planta. 1987. - V. 171. - P. 438-442.

89. Arekal G.D. Contribution to the embryology of Chelone glabra II Phytomorphology. 1963. - V. 13. - P. 376-388.

90. Arnhold Schmitt B. Physiological aspects of genome variability in tussue culture. II. Growth phase dependent quantitative of repetitive BstNi fragments of primary cultures of Daucus carota L. // Theor. appl. Genet. - 1995. - V. 91. - P. 809 -815.

91. Arnhold Schmitt B. Rapid changes in amplification and methylation pattern ^ of genomic DNA in cultured carrot root explants (Daucus carota L.). // Theor.appl. Genet. 1993. - V. 85. - P. 792 - 800.

92. Arnison P. G., Donaldson P., Ho L.C.C. and W.A. Keller The influence of various physical parameters on anther culture of broccoli (Brassica oleracea var.1.italica) II Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1990. - V. 20. - P. 147- 135.

93. Arroyo R.,Revilla M.A. In vitro plant regeneration from cotyledon and hypocotyl segments in two bell pepper cultivars // Plant Cell Rep. 1991. V. 10. -P. 414-416.

94. Atanassova B. Functional male sterility (ps-2) in tomato {Lycopersicon esculentum Mill.) and its application in breeding and hybrid seed production // Euphytica- 1999. -V. 107.- P. 13-21.

95. Atanassova B. Functional male sterility in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) and its application in hybrid seed production // Acta physiologiae plantarum -2000. -V. 22.-P.221 -225.

96. Atanassova B., Georgiev Hr. Investigation of tomato male sterile lines in relation to hybrid seed production // Acta Horticulture 1986.- V. 190. - P. 553557.

97. Attfield E. M., Evans P.K. Developmental pattern of root and shoot organogenesis in cultured leaf explants of Nicotiana tabacum cv. Xanthi nc. // J. exp. Bot. 1991. - V. 42.-P. 51 -57.

98. Attfield E. M., Evans P.K. Stages in the initiation of root and shoot organogenesis in cultured leaf explants of Nicotiana tabacum cv. Xanthi nc. // J. exp. Bot. 1991. - V. 42. - P. 59 - 63.

99. Attfield E.M., Evans P.K. Developmental pattern of root and shoot organogenesis in cultured leaf explants of Nicotiana tabacum cv. Xanthi nc. // J.exp. Bot. 1991. - V.42. - P. 51 -57.

100. Baillie A.M.R., Epp D. J., Hutcheson D., Keller W.A. In vitro culture of isolated microspores and regeneration of plants in Brassica campestris II Plant Cell Reports. 1992. - V. 11. - P. 234 - 237.

101. Bamberg J.B. Screening potato (Solanum) species for male fertility under heat stress // American Potato Journal. 1995. - V. 72. - P. 23 - 35.

102. Banga O., Petiet J. Dreeding male sterile lines of Dutch onion varieties as a preliminaiy to the breeding of hybrid varieties // Euphytica. 1958. - V. 7. - P. 21 -30.

103. Barclay I.R. High frequencies of haploid production in wheat (Triticum aestivum) by chromosome elimination. // Nature. 1975. - Vol. 256. - P. 410 — 411.

104. Barham W.S. and Munger H.M. The stability of male sterility in onions.// Proc. Am. Soc. hort. Sci. 1950. - V. 56. - P. 401 - 409.

105. Barloy D. and Beckert M. Improvement of regeneration ability of androgenetic embryos by early anther transfer in maize // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1993-V. 33.- P. 45-50.

106. Barloy D., Denis L. and Beckert M. Comprason of the aptitude for anther culturein some androgenic doubled haploid maiz lines. // Maydica. 1989. - V. 33.-P. 303-308.

107. Barnabas B. and Fridvalszky L. Adhesion and germination of differently treated maize pollen grains on the stigma //Acta Bot. Hungar. 1984. - V. 30. - P. 329-332.

108. Barnabas B., Fransz P.F.,Schel J.H.N. Ultrastructure studies on pollen embiyogenesis in maize (Zea mays L.)ll Plant Cell Reports. 1987- V.6. - P. 212 -215.

109. Barnabas B., Kovacs G., Perspectives of pollen and male gamete selection in cereals // Plant sperm cell as tools for biotechnology. Wageningen Pudoc, 1988 -P. 136- 150.

110. Bassi P. Quantitative variations of nuclear DNA during plant development: a critical analysis. Biol. Rev. - 1990.- V. 65. - P. 185 - 225.

111. Beaville M.A. Obtention d'haploides in vitro a partir d' ovaries non fecondes de Riz (Oriza sativa L). C.R.Acad. Sci. -1980. V.290. - P. 489 - 492.

112. Bedinger P. A. The remarkable biology of pollen. // Plant Cell. 1992. - V. 4. -P. 879-887.

113. Bedinger P. A., Edgerton M. D. Developmental staging of maize microspores reveals a transition in developing microspore proteins. // Plant Physiol. 1990. -V. 92.-P. 474-479.

114. Benki R.M., Lesley S. M. In vitro plant regeneration from leaf explants of Lycopersicon esculentum (tomato) // Can. J. Bot. 1976 V. 54. - N 21. - P. 2409 -2414.

115. Bergervoet J.H.W., van der Mark F., Custers J.B.M. Organogenesis versus embryogenesis from long term suspension cultures of cucumber (Cucumis sativus L.) //Plant Cell Rep. - 1989. - V. 8. - P. 116 - 119.

116. Berniger E. Contribution a l'etude de la sterilite male de l'oiynon (Allium cepa L.)ll Ann. Amelior. Plantes. -1965. V. 15.-P. 183- 199.

117. Bhandari N.N, Bhargava M., Geier T. A persisting cellulosie wall of microspore mother cells during microsporogenesis in Allium tuberosum Rott.l and Cyclamen persicum Mill. II Ann. Bot. -1981. V. 48. - P. 425 - 431.

118. Bhandari N.N, Kishori R., Natesh S. Ontogeny, cytology, and histichemistry of anther tapetum in relation to pollen development in Negella damascena II Phytomorphology. 1976. - V. 26. - P. 46 - 59.

119. Bhandari N.N, Nanda K. Studies in the Viscaceae. I. Morphology and embryology of the Indian dwarf mistletoe Areuthobium minutissimum // Phytomorphology. - 1968. - V. 18. - P. 435-450.

120. Bhandari N.N. Embryology of the Magnoliales and comments on their relationships // J Arnold Arbor Harv Univ. -1971. V. 52. - P. 285 - 304.

121. Bhandari N.N., Khosla R. Development and histochemistry of anther in Triticale cv. Tri -1. Some new aspects in early ontogeny // Phytomorphology. -1982.-V. 32.-P. 18-27.

122. Biddle J.A. Anther and pollen development in garden pea and cultivated lentil // Can. J. Bot. -1979. V. 57. - P. 1883 - 1900.

123. Binarova P., Straatman K., Hause B., Hause G., Van Lammeren A.A.M. Nuclear DNA synthesis during the induction of embryogenesis in cultured microspores and pollen of Brassica napus L. II Theoretical and Applied Genetics. 1993 - V. 87.-P. 9-16.

124. Blakeslee A.F., Bellng J. Chromosomal mutations in the Jion weed, Datura stramonium //J. Heredity. 1924. - Vol. 15. - P. 195 - 206.

125. Bohanec B., Jakse M., Ihan A., Javornik B. Studies of gynogenesisin onion (Allium cepa L.)\ induction procedures and genetic analysis of regenerants.// Plant Science.- 1995.-V. 104. P. 215-224.

126. Borchers E.A. Characteristics of a male sterile mutant in purple cauliflower (Brassica oleracea L.) // Proc. Amer. Soc. Hort. Sci. 1966. - V. 88. - P. 406 -410.

127. Bordes J., Dumas de Valux R., Lapierre A. and Pollacsek M. Haplodiploidization of maize ( Zea mays L.) through induced gynogenesis assisted by glossy markers and its use in breeding // Agronomie. 1997. - Vol. 17. - P. 291 -297.

128. Brewbaker J. L. and Kwack B. H. The essential role of calcium ion in pollen germination and pollen tube growth. // American Journal of Botany. 1963. - V. 50.-P. 859-865.

129. Brewbaker J. L. The distribution and phylogenetic significance of binucleate and trinucleate pollen grains in the angiosperms // Amer. J. Bot. 1967. - V. 54. -P. 1069-1083.

130. Brooks J., Grant P.R., Muir M.D., Gizel P. van, Shaw G. Sporopollenin // Academic Press, London. 1971.

131. Brooks J., Shaw G. Chemical structure of the exine of pollen walls and a new function for carotenoids in nature // Nature. 1968. - V.219. - P. 532 - 533.

132. Bruins M B.M. and Snijders C.H.A. Inheritance of anther culture derived green plantlet regeneration in wheat (Triticum aestivum L.).ll Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1995 - V. 43 - P. 13 - 19.

133. Buiatti M., DNA amplification and tissue cultures. In: Reinert J., Bajaj Y. P.S. (ed): Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Springer Verlag, Berlin - Heidelberg - New York - 1977. - P. 358 - 374.

134. Burnett L., Arnoldo M., Yarrow S., Huang B. Enhancement of shootregeneration from cotyledon explants of Brassica rapa ssp. oleifera throughpretreatment with auxin and citokinin and use of ethylene inhibitors // Plant Cell

135. Tissue Organ Cult. 1994. - V.37. - P. 253 - 256.

136. Burnett L., Yarrow S., Huang B. Embryogenesis and plant regeneration from isolated microspores of Brassica rapa L. ssp. oleifera II Plant Cell Reports. -1992.-V. 11.-P. 215-218.

137. Burns D.R., Search R., Mcvettr P.B.E. Temperature and genotipic effects on the expression of Pol cytoplasmic male sterility in summer rape // Can. J. Plant Sci .-1991.-V.71.-P. 655-661.

138. Buter B., Pescitelli S.M.,Berger k an(j Stamp P. Autoclaved and filter sterilized liquid media in maize anther culture: significance of activated charcoal // Plant Cell Reports. -1993 V. 13 - P. 79 - 82.

139. Cade R. M., Wehner T.C. and Blazich F.A Somatic embryos derived from cotyledons of cucumber// J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1990. V. 115. - P. 691 - 696.

140. Cade R. M., Wehner T.C. and Blazich F.A. Embryogenesis from cotyledon -derived callus of Cucumis sativus L // Cucumbit Genet. Coop. Rep. 1988. - V. 11.-P.3-4.

141. Campbell W.F., Cotner S.D. and Pollock B.M. Preliminary analysis of the onion seed (Allium cepa L.) production problem, 1966 growing season// Hort Sci. 1968.-V.3.-P.40-41.

142. Campion B., Alloni C. Induction of haploid plants in onion (Allium cepa L.) by in vitro culture unpollinated ovules.// Plant Tiss. Org. Cult. 1990. - V.20. - P.l-6.

143. Campion B., Azzimonti M.T., Vicini E., Schiavi M., Falavigna A. Advances in haploid plant induction in onion (Allium cepa L.) through in vitro gynogenesis.// Plant Science. -1992. V.86. - P. 97 -104.

144. Campion B., Bohanec B., Javornik B. Gynogenic lines of onion (Allium cepa L.y. evidence of their homozygosity // Theor Appl. Genet. 1995. - V. 91. - P. 598 -602.

145. Cao Q. M., Li J., Liu F. and Dore C. Embryogenesis and plant regeneration of pakchoi {Brassica rapa L. ssp. chinensis) via in vitro isolated microspore culture // Plant Cell Reports. -1994. V. 13. - P. 447 -450.

146. Castillo A.M., Cistue L. Production of gynogenetic haploids of Hordeumvulgare L. // Plant Cell Reports. -1993. Vol. 12. - P. 139 - 143.

147. Chalak L., Legave J.M. Effects of pollination by irradiated pollen in Hayward kiwifrit and spontaneous doubling of induced parthenogenetic trihaploids // Scientia Horticulturae. 1997. - Vol. 68. - P. 83 -93.

148. Chalyk S.T. Properties of maternal haploid maize plants and potential application to maize breeding // Euphytica 1994. - Vol. 79. - P. 13-18.

149. Chang W.N. and Struckmeyer B.E. Influence of temperature, time of day? and flower age on pollen germination, stigme receptivity, pollen tube growth, and fruit Set of Allium cepa LJIJI Amer. Soc. Hort. Sci. 1976. - V. 101. - N1. - P. 81 - 83.

150. Chase S. S. Monoploid frequencies in a commercial double cross hybrid maize, and its component single cross hybrids and inbred lines // Genetics. 1949. - Vol. 34.-P. 328-332.

151. Chauvin J. E., Yang Q., Jeune B. Le, Herve Y. Obtention d'embryons par culture d'antheres chez le chou-fleur et le brocoli et evaluation des potentialites du materiel obtenu pour la creation varietale // Agronomie. 1993. - V. 13. - P. 579 -590.

152. Chee P.P. High frequency of somatic embryogenesis and recovery of fertile cucumber plants // HortSci. 1990. - V. 25. - P. 792 - 793.

153. Cheng P.C., Greyson R. I., Walden D.B. Comparison of anther development in genie male sterile (msi0) and in male - fertile corn {Zea mays) from light microscopy. // Canad. J. Bot. - 1979. - V. 57. - P. 578 - 596.

154. Chi G. L., Pua E. C. Ethylene inhibitors enhanced de novo shoot regeneration from cotyledons of Brassica campestris ssp/ Chinensis (Chinensse cabbage) in vitro II Plant Sci. 1989. - V.64. - N.2. - P. 243 - 250.

155. Chi G.L., Barfield D.G., Sim G.E., Pua E.C. Effect of Ag N03 and amino ethoxyvinilglycine on in vitro shoot and root organogenesis from seedlingexplants of recalcitrant Brassica genotypes // Plant Cell Rep. 1990. - V. 9. - P. 195- 198.

156. Chibi F, Angosto T.,Matilla A. Variatons of the patters of abscisic acid and proline during maturation of Nicotiana tabacum pollen grains // J. Plant Phys. -1995. V. 147. - N 3 - 4. - P. 355 - 358.

157. Cho M.S. and Zapata F.J. Callus formation and plant regeneration in isolated pollen culture of rice (Oryza sativa L. cv. Taipei 309). Plant Science. 1988 - V. 58.-P. 239-244.

158. Cho M.S. and Zapata F.J. Plant regeneration from isolated microspore of indica rice // Plant cell physiology. 1990 - V. 31. - P.881 - 885.

159. Chopra R.N. In vitro culture of ovaries of Althaea rosea Cav. In: Maheshwari P. (ed) Proc. Seminar Mod. Dev. Plant Physiol., 1958. P. 87 - 89.

160. Cistue L. Ziauddin A., Simion E., Kasha K.J. Effects of culture conditions on isolated microspore response of barley cultivar Igri. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1995 - V. - 42 - P. 163 - 169.

161. Clapham D. Haploid induction in cereals // In: Reinert J., Bajaj Y.P.S.(eds) Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue and organ culture. Springer, Berlin Heidelberg New York. 1977. - P. 279 - 340.

162. Claussen P. Uber das Verhalten des Antherentums bei einigen Monocotylen und Ranales // Bot. Arch. 1927. - V. 18. - P. 1 - 27.

163. Clayberg C.D. A linked seedling marker for ms 15 // Rep. Tomato Genet Coop 1965. V. 15.P.29.

164. Cole K. Inheritance of mail sterility in green sprouting broccoli // Can. J. Genet. Cytol. 1959. - V.l. - P. 203 - 207.

165. Cordewener J.H.G., Busink R., Traas J.A., Custers J.B.M., Dons H.J.M., Van Lookeren Campagne M.M. Induction of microspore embryogenesis in Brassica napus L. is accompanied by specific in protein synthesis. // Planta. 1994 - V. 195 - P. 50-56.

166. Courcel A de, Veder F. and Boussac J. DNA polymorphism in Allium cepa cytoplasms and its implications concirning the origin of onions. // Theor. Appl. Genet. -1989. V. 77. - P. 793 - 798.

167. Cresti M. and Tiezzi A. Germination and pollen tube formation. In microspores: Evolution and Ontogeny, S. Blackmore and R. B. Knox, eds (London: Academic Press), 1990. P. 239-263.

168. Cresti M., Pacini E., Clampolini F., Safatti G. Germination and early tube development in vitro of Lycopersicum peruvianum pollen: Ultrastructural features.// Planta. 1977. - V. 136. - P. 239-247.

169. Custers J.B.M., Cordewener J.H.G, Nollen Y., Dons H.J.M, Van Lookeren Campagne M.M Temperature controls both gametophytic and sporophytic development in microspore cultures of Brassica napus.ll Plant Cell Reports. -1994 V. 13. -P 267-271.

170. Czapik R. Theoretical aspects of apogamety in angiosperms // Bulletin of the Polish Academy of Sciences, Biological Sciences. 1997. - Vol. 45. - P. 57 - 64.

171. Datta S.K. and Wenzel G. Isolated microspore derived plant formation via embryogenesis in Triticum aestivum L. II Plant Science. 1987 - V. 48 - P. 49 -54.

172. Davey M.R., Mackenzie I. A., Freeman G.G., Short K.C. Studies of some aspects of the growth, fine structure and flavour production of onion tissue grown in vitro // Plant Science Letters. 1974. - V. 3. - N 2. - P. 113-120.

173. Davis G.L. Systematic embryology of the angiosperms // Wiley, New York. 1966.

174. De Klerk G.J., Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R., Neumann K. H. Regeneration of roots, shoots and embryos: physiological, biochimical and molecular aspects // Biologia Plantarum. 1997. - V. 39. - P. 53-66.

175. Deepu M. In vitro shoot and root morphogenesis from cotyledon and hypocotyl explants of hot pepper cultivars Byadagi Dabbi and Arka Lohit // Capsicum and Eggplant Newsletter 2002. - V. 21. - P. 69 - 72.

176. Dhruva Bharati, Ramakzishnan T., Vaidyanathan C.S. Regeneration of hybrid tomato plants from leaf callus // Curr. Sci. (India). 1978. V. 47.- N 13. - P. 458 -460.

177. Dickson M.H. A temperature sensitive male sterile gene in Broccoli, Brassica oleracea L. var. Italica II J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1970.- V.95. - P. 13 - 14.

178. Dieu P., Beckert M. Further studies of androgenetic embryo production and plant regeneration from in vitro cultured anthers in maize (Zea mays L.) II Maydica. 1986 - V. 31 - P. 245 - 259.

179. Duhrssen E.,Lanzendorfer M., Neuman K.H. Comparative investigations on DNA organisation of some varieties of Daucus carota L. // Z. Pflanzenphysiol. -1984. -V. 113.-P. 223-229.

180. Dunemann F., Grunewaldt J. Identification of monogenic dominant male sterility mutant in broccoli (Brassica oleracea var. italica Plenck) II Plant breeding-1991.- V.106.-P. 161 -163.

181. Dunwell G.M. In vitro regeneration from excised leaf discs of three Brassica species // J. Exp. Bot. 1981 - V. 32. - N 129. - P.789 - 799.

182. Durand Y. Relationship between marker genes aa and Wo and male sterility gene ms 35 // In : Compt Rend du Gr travail Eucarpia , Avignon, 18 -21, V, 1981. -1981.-P. 225 -228.

183. Eady C., Lindsey K., Twell D. The significance of microspore division and division symmetry for vegetative cell-specific transcription and generative cell differentiation // Plant Cell. 1995. - V. 7. - N.l. - P. 65 - 74.

184. Eames A.J. Morphology of the angiosperms. McGraw Hill. New York. 1966.

185. Ebida Aly I.A., Hu C.Y. In vitro morphogenetic responses and plant regeneration from pepper (Capsicum annuum 1. cv. Early California Wonder) seedlings explants//Plant Cell Rep. 1993.-V. 13.-P. 107-110.

186. Echlin P., Godwin H. The ultrastructure and ontogeny of pollen in Helleborus foetidus L. 1. The development of the tapetum and Ubisch bodies // J. Cell. Sci. -1968.-V.3.-P. 161-174.

187. Engelke T., Hulsmann S., Tatlioglu T. A comparative study of microsporogenesis and anther wall development in different types of genetic and cytoplasmic male sterilities in chives// Plant Breeding. 2002. - V. 121. - P. 254 -258.

188. Erickson H.T. and Gabelman W.H. The effect of distance and direction on cross- pollination in onions // Proc. Fv. Soc. hort. Sci. 1956. - V. 68. - P. 351 -357.

189. Esau K. Anatomy of seed plants. New York: e. a.: J. Wiley and sons., 1977. -500 p.

190. Fan Z., Amstrong K.C. and Keller W. A. Development of microspores in vivo and in vitro in Brassica napus L. II Protoplasma. 1988. - V. 147. - P. 191-199.

191. Fari M., Czako M., Relationship between position and morphogenetic response of pepper hypocotyl explants cultured in vitro // Scientia Hort. 1991. - V. 15. -P. 207-213.

192. Faure J.F., Aldon D., Rougier M., Dumas C. Emerging data on pollen tube growth and fertilization in flowering plants // Protoplasma. 1996. - V. 193. - N. 1-4.-P. 132- 143.

193. Feder W.A., Predicting species response to ozone using a pollen screen. In: D.L. Mulcahy, G.B. Mulkahy and E. Ottaviano (Eds), Biotechnology and Ecology of Pollen, Springer Verlag, New York, 1986. - P. 89 - 94.

194. Fernander Munoz, Gonazlenz R. J.J., Fernander J., Cuartero E. Genetics of the viability of pollen grain at lower temperature in Lycopersicon esculentum Mill. Euphytica. 1995. -V. 84. - P. 139 - 144.

195. Ferrant V., Bouharmont J. Origin of gynogenetic embryos of Beta vulgaris L. II Sexual Plant Reproduction. 1994. - Vol. 7. - P. 12 - 16.

196. Ferrie A.M.R. Epp.D.J. and Keller W.A. Evalution of Brassica rapa L. genotypes for microspore culture response and identification of a highly embryogenic line // Plant Cell Reports. 1995. - V. 14. - P.580 - 584.

197. Finnie S.J., Powell W., Dyer A.F. The effect of carbohydrate composition and concentration on anther culture response in barley (Hordeum vulgare L.). II Plant Breeding.- 1989-V. 103.-P. 110 118.

198. Flawell R. A. Model for the mechanism of cytoplasmic male sterility in plants with special reference to maize // Plant Sci Lett. 1974. - V. 3. - P. 259 - 263.

199. Flinn B. S., Webb D.T., Newcomb W. The role of cell clusters and promeristemoids in determination and competence for caulogenesis.by Pinus strobus cotyledons in vitro // Can. J. Bot. 1988. - V. 66. - P. 1556 - 1567.

200. Fobert Pierre R., Webb David T. Effects of polyamines, polyamine precursors, and polyamine biosynthetic inhibitors on somatic embryogenesis from eggplant (Solanum melongena) cotyledons // Can. J. Bot. 1988. - V. 66. - N 9. - P. 1734 -1742.

201. Francis R.R., Bernis W.P. Acytomorphological study of sterility in mutant of Cucurbita maxima Duch. II Econ. Botan. 1970. - V.24. - P.325 - 352.

202. Freeman G.G., Whenham R. J., Mackenzie I. A., Davey M.R. Flavour components in tissue cultures of onion (Allium cepa L.) // Plant Science Letters. -1974. V. 3. - N 2.-PI21 - 125.

203. Fridborg G. Growth and organogenesis in tissue cultures of Allium cepa var. Proliferum. // Physiol. Plantarum. 1971. - V. 25. - P.436 - 440.

204. Fujieda K., Matsuoka N., Fujita Y. Vegetative multiplication of onion, Allium cepa L., through tissue culture // J/ Japan. Soc. Hort. Sci. 1979. - V. 48. - N2. -P. 186-194.

205. Gambley R.L., Dood W.A. Effect of hypocotyl length on morfogenesis of explants of cucumber (Cucumis sativus L.) in vitro // Aust/ J/ Plant Physiol. -1992-V. 19.-P. 165- 169.

206. Gaspar T., Kevers C., Hausman J.F., Berthon J. Y., Ripetti V. Practical uses of peroxidase activity as a predictive marker of rooting performance of micropropagated shoots // Agronomie 1992. - V. 12. - P. 757 - 765.

207. Gauch H. G., Dugger W. M. Jr. The physiological action of Boron in Higher Plants: A review and interpretation. College park: Univ. Md., Agric. Exp. Stn., 1954.

208. Gavish H., Vardi A., Fluhr R. Extracellular proteins and early embiyo development in Citrus nucellar cell cultures. // Plant Physiol. 1991. - V. 82. P. 606-611.

209. Genovesi A.D. Collins G.B. In vitro production of haploid plants of corn via anther culture. // Crops Science. 1982 - V. 22. - P. 1137 - 1142.

210. George L., Rao P. S. In vitro regeneration of mustard plants {Brassica juncea var. RAI 5) on cotyledon explants from non- irradiated, irradiated and mutagen treated seed // Ann. Bot. - 1980. - V. 46. - N 1. - P. 107 - 112.

211. Gibson M. Dihaploid plant product from ovule culture sugar beet // Proc. N. D. Acad. Sci. Diol. Sei. 1988. - V. 36. - P. 171 - 175.

212. Gleddie S., Keller W., Setterfield G. Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf explants and cell syspensions of Solanum melongena (eggplant) // Can. J. Bot., 1983. - V. 88. - N. 3. - P. 656 - 666.

213. Glenk H. O., Wagner W., Schimmer O. Can Ca ions act as a chemotropic factor in Oenothera fertilization? In Pollen Development and Physiology. (Ed-by J. Heskop-Harrison). Butterworths. London, 1971. P. 255-261.

214. Golaszewska B., Bednarska E., Narbutt O. Immunocytochemical localization of calmodulin in fertile and sterile anther of Allium cepa L. II Acta Biologica Cracoviensia, series Botanica. 2000. - V. 42. - P. 37 - 45.

215. Goldberg R. B., Beals T. P., Sanders P. M. Anther development: basic principles and practical applications. // The Plant Cell. 1993. - V. 5. - № 10. - P. 1217-1229.

216. Gorman S.W., McCormick S. Male sterility in tomato // Crit. Rev. Plant Sci -1997. V 16.-P.31 -53.

217. Goska M., Jassem B. Histological observations of sugar beet ovules in vitro cultures. // Bulletin of the Polish Academy of Sciences, Biological Sciences. -1988.-Vol. 36.-P. 171 175.

218. Gu Z. P., Cheng K.C. In vitro induction of haploid plantlets from unpollinated young ovaries of lily and its embryological observations // Acta botanica Sinica. -1983.-Vol. 25.-P. 24-28.

219. Guha S., Maheshwary S.C. Cell division and differentiation of embryos in the pollen grains of Datura in vitro. II Nature. 1966. - V. 206. - P. 97 - 98.

220. Guha S., Maheshwary S.C. In vitro production of embryos from anther of Da tura. II Nature. 1964. - V. 204. - P. 497.

221. Guha S.,John B.M. In vitro development of ovary and ovule of Allium cepa L. II Phytomorfology. 1966. - V. 16. - P. 353 - 364.

222. Guha S.,John B.M. In vitro development of ovary and ovule of Allium cepa L. II Phytomorfology. 1966. - V. 16. - P. 353 - 364.

223. Gunay A.I., Rao P.S. In vitro regeneration from hypocotyl and cotyledon explants of red pepper (Capsicum) plant // Sci Lett 1978. - V. 11. - P. 365 -372.

224. Gunay A.L., Rao P.S. In vitro propagation of hybrid tomato plants (Lycopersicon esculentum L.) using hypocotyl and cotyledon explants //Ann. Bot. 1980. - V.45. - N 2. - P. 205 - 207.

225. Guo Y D, Pulli S. In vitro pollen culture and the regeneration of Brassica campestris L. plants. Agricultural Science in Finland. - 1995 -V. 4 — P — 513 — 518.

226. Guri Asaf, Izhar Shamay Improved efficiency of plant regeneration from protoplasts of eggplant (Solanum melongena L.) // plant Cell Repts 1984. - V. 3. -N6.-P. 247-249.

227. Gustafson V.D., Baenziger P.S., Wright M.S., Stroup W.W., Yen Y. Isolated wheat microspore culture. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1995 - V. 42. -P. 207-213.

228. Hansche P.E., Gabelman W.H. Phenotypic stability of pollen sterile carrots Daucus carota L. II Proc. Amer. Soc. hort. Sci. 1963. - P.82.

229. Hansen N.J.P., Andersen S.B. Efficient production of doubled haploid wheat It plants by in vitro treatment of microspores with trifluralin or APM // Plant Breed.- 1998.-V. 117.-P.401 -405.

230. Hatanaka T., Sawabe E., Azuma T., Uchida N., Yusuda T. The role of ethylene in somatic embryogenesis from leaf discs of Coffea canephora. // Plant Sci. -1995. V. 107.-P. 199-204.

231. Hause G., Hause P., Pehan P.,van Lammeren A.A.M. Cytoskeleton changes and induction of embryogenesis in microspore and pollen cultures of Brassica1 napus L. //Cell Biol. Int. 1993. - V. 17. - P. 153 - 166.

232. Havel L., Novak F.J. Meristem tip culture of Allium cepa L. // Scientia Hortic- 1985. V. 27.-P. 209-214.

233. Havey M. A putative donor of S cytoplasm and its distribution among open -pollinated of onion. // Theor. Appl. Genet. 1993. - V. 86. - P. 128 - 134.

234. Havey M. Cytoplasmic determinations using the polymerase chain reaction to aid in the extraction of maintainer lines from open- pollinated populations ofonion. // Theor. Appl. Genet. 1995. - V. 90. - P. 263 - 268.

235. Heberle Bors E. In vitro haploid formation from pollen: a critical revue. // Theoretical and Applied Genetics. - 1985 - V. 71. - P. 361 - 374.

236. Heberle Bors E., Stoger E., Touraev A., Zarsky V., Vicente O. In vitro cultures: progress and perspectives // Pollen biotechnology. L.: Chapman and Hall, 1996. P. 85- 109.

237. Hendrychova-Tomkova J. and Nguyen T.H.B. The persistence and lignin like appearance of the primary cell wall of microsporocytes in the male-sterile (CMS)1.sweet pepper, Capsicum annuum L. Anatomy of microsporogenesis. // Biol Plant

238. Prague). 1982. - V. 24. - P. 440 - 445.

239. Heslop Harrison J. Origin of exine // Nature.- 1962. - V. 195. - P. 1069 -1071.

240. Hill R.A., Tuskan G.A., Boe A.A. In vitro propagation of Hosta sieboldiana using excised ovaries from immature florets // Plant Celll Tiss. Org. Cult. 1989. -V. 17.-P.71-75.

241. Hirosa T., Fujime Y., Studies on the hybrid seed production by using a new male sterile line in Pepper (Capsicum annuum L.) II. On the process of pollen4 degeneration.// J. Jpn. Hortic Sei. -1981. V. 50. - P. 66 - 70.

242. Hirose T., Fujime Y.A. a new male sterility in pepper // Hort Science. 1975. -V. 10.-P. 314.

243. Hodgkin T., MacDonald M.V. The effect of a phytotoxin from Alternaría brassicicola on Brassica pollen. // New Phytol. 1986. - V. 104. - P. 631 - 636.

244. Hoefert L.L. Pollen grain and sperm cell ultrastructure in Beta. . In: Heslop -Harrison J. (ed) Pollen: Development and physiology. Butterworth, London, 1971.- P.68 -69.

245. Hoekstra F. A., Bruinsma J. Reduced independenc of the male gametophyte in angiosperm development. // Ann. Bot. 1978. - V. 42. - P. 759-762.

246. Hoekstra S., Van Zijderveld M.H., Heidekamp F., Van Der Mark F. Microspore culture of Hordeum vulgare L. the influence of density and osmolality. // Plant Cell Reports. 1993 - V. 12. - P. 661 - 665.

247. Holford P.J., Croft J., Newbury H. Differences between and possible origins of the cytoplasms found in fertile and male sterile onions (Allium cepa L.) // Theor.

248. Appl. Genet. 1991. - V. 82. - P. 737 - 744.

249. Holm P.B., Knudsen S., Mouritzen P., Negri D., Olsen F. L., Roue C. Regeneration of fertile barley plants from mechanically isolated protoplasts of the fertilized egg cell. // Plant Cell. 1994. - V. 6. - P. 531 - 543.

250. Honkanen J., Aapola A., Seppanen P., Tormala T., Wit J. C., Esendam H.P., Stravers L. J. M., De Wit J.C. Production of doubled haploid Gerbera clones // Acta Horticultural. -1992. V. 300. - P. 341 - 346.

251. Hopt N., Plesofsky Vig N., and Brambl R. The heat shock response of pollen and other tissues of maize // Plant Mol. Biol. - 1992. - V. 19. - P. 623 - 630.

252. Horeau N., Arora R., Bhojwani S. S. A comparative study of in vitro shoot regeneration from cotyledon and root explants of four varieties of Brassica oleracea L. II Curr. Sci. 1988. - V. 58. - N. 24. - P. 1349 - 1351.

253. Horner H.T. A comparative light- and electronmicroscopic study of microsporogenesis in male fertile and cytoplasmic male-sterile sunflover (Helianthus annuus) II Amer J. Bot. 1977. - V. 64. - P. 745 - 759.

254. Horner H.T.Ir. and Roger M.A. A comparative light and electron microscopic study of microsporogenesis in male fertile and cytoplasmic male sterile pepper

255. Capsicum annuunm). Can. J. Bot. 1974. - V. 52. - P. 435 - 441.

256. Horner J.A., Roges M.A. A comparative light and electron microscopic study of microsporogenesis in male fertile and cytoplasmic male sterile pepper (iCapsicum annuum) II Can. J. Botany. - 1974. - V. 52. - P. 435 - 441.

257. Hoseman D., Bossoutrot D. Iduction of haploid plants from in vitro culture of unpollinated beet (Beta vulgaris L.) // Z. Pflanzenzucht. 1983. - V. 91. - P. 74 -77.

258. Huang Q.F. Yang H.Y., Zhou C. Embryological observations on ovary culture of unpollinated young flowers in Hordeum vulgare L. II Acta Botanica Sinica. -1982.-Vol. 24.-P. 299-300.

259. Hulskamp M., Schneitz K., Pruitt R. E. Genetic evidence for a long range activity that directs pollen tube guidance in Arabidopsis II Plant Cell. - 1995. - V. 7. - N. 1. - P. 57-54.

260. Hussey G. In vitro propagation of the onion Allium cepa by axillary and adventitious shoot proliferation // Scientia Hortic 1978. V. 9. P. 227 - 236.

261. Hussey G. In vitro release of axillary shoots from apical dominance in monocotyledonous plantlets // Ann. Bot. 1976. V. 40. - P. 1323 - 1325.

262. Hussey G., Falavigna A. Origin and production of in vitro adventitious shoots in the onion, Allium cepa L. // Journal of Experimental Botany. 1980. - V. 31. -P. 1675 -1686.

263. Ilic-Grober K., Attree S.M., Fowke L. C. Comparative morphological study of zigotic and microspore derived embryos of Brassica napus L. as revealed by scanning electron microscopy//Ann. Bot. - 1998. - V. 82. - P. 157- 165.

264. Illg Rolf Dieter, Siqueira Walter Jose High frequency of plant regeneration from leaf explant in six Lycopersicon esculentum Mill, cultivars // Rev. bras. bot. 1984.- V. 7.-N1.-P.1-4.

265. Iqbal M.S.M., Mollers C., Robbelen G/ Increase embryogenesis after colchicine treatment of microspore cultures of Brassica napus L. II Journal of Plant Physiology. 1994 - V. 143. - P. 222 - 226.

266. Iwahori S. High temperature injuries in tomato. IV. Development of normal flower buds and morphological abnormalities of flower buds treated-with high temperature // J. Jpn Soc Hortic Sci. 1965. - V. 34. - P. 33 - 41.

267. Iwahori S. Takahashi K. High temperature injuries in tomato. III. Effect of high temperature on flower buds of different stages of development // J. Jpn Soc Hortic Sci. 1964. - V. 33. - P. 67 - 74.

268. Izhar S., Frankel R. Duration of meiosis in petunia anthers in vivo and in floral bud culture. // Acta Bot. Neerl. 1973. - V. 22. - P. 14 - 22.

269. Jackson J. F. Borate control of energy-driven protein secretion from pollen and interaction of bofate with auxin or herbicide a possible role for boron in membrane events. // See Ref. - 1991. - V. 99. - P. 221 - 229.

270. Jahne A., Lorz H. Review article Cereal microspore culture. Plant Science. -1995.-V. 109.-P 1 - 12.

271. Jain R.K., Brune U., Friedt W. Plant regeneration from in vitro cultures of cotyledon explants and anthers of Sinaps alba and its implications on breeding of crucifers // Euphytica. 1989. - V. 43. - N 1 - 2. - P. 153 - 163.

272. Jain R.K., Sharma D.R., Chowdhury J. B. Hing frequency regeneration and heritable somaclonal in Brassica juncea II Euphytica 1989. - V. 40 - N. 1 -2. - P. 75-81.

273. Jakse M., Bohanec B., Ihan A. Effect of media components on the gynogenic regeneration of onion (Allium cepa L.) cultivars and analysis of regenerants. // Plant Cell Reports. 1996. - V. 15. - P. 934- 938.

274. Jauh G. Y., Eckard K.J., Nothnagel E.A., Lord E.M. Adhesion of lipy pollen tubes on an artificial matrix // Sex. Plant Reprod. 1997. - V. 10. - N. 3. - P. 173 -180.

275. Jauh G. Y., Lord E.M. Localisation of pectins and arabinogalactan proteins in lily (Lilium longiflorum L.) pollen tube and style, and their possible roles in pollination // Planta. - 1996. - V. 199. - N. 2. - P. 251- 261.

276. Jia S.R., Fu J.J., Lin Y. Embryogenesis and plant regeneration from cotyledon protoplast culture of cucumber (Cucumis sativus L.) // J/ Plant Physiol. 1986. V. 124.-P. 393-398.

277. Johnson A.G. Male sterility in Brassica // Nature 1958. - V. 182. - P. 1523.

278. Johri B. M., Vasil I. K. Physiology of pollen. // Bot. Rev. 1944. - V. 27. - P. 325-381.

279. Johri B.M., Bhatnagar S.P. A contribution to the morphology and life history of Aristolochia II Phytomorphology. 1955. - V. 5. - P. 123 - 137.

280. Jones D., Stinson H., Khoo U. Transmissible variations in the cytoplasm within species of higher plant. // Proc. Nat. Acad. Sci. Us. 1957. - V. 43. - P. 598 - 602.

281. Jones H.F. and Clarke A.E. Inheritance of male sterility in the onion and the prodction of hybrid seed // Proc. Am. Soc. hort. Sci. 1943. - V. 43. - P. 189-194.

282. Jones H.F. and Emsweller S.L. A male sterile onion. // Proc. Am. Soc. Hort. Sei. 1936.-V.34.-P. 582 -585.

283. Jones H.F. and Mann L.K. Onions and their allies. London, 1963. - 23p.

284. Jourden C., Simmonneaux D., Renald M. Selection of pollen for linolenic acid content in rapeseed Brassica napus L. II Plant Breed. 1996 - V. 155. - P. IIIS.

285. Julliard J., Sossountzov I., Habricot Y., Pelletier G. Hormonal requirement and tissue competency for shoot organogenesis in two cultivars of Brassica napus. // Physiol plant. 1992. - V. 84. - P. 521 - 530.

286. Julliard J., Sossountzov L., Habricot Y., Pelletier G. Hormonal requirement and tissue competency fjr shoot organogenesis in two cultivars of Brassica napus II Physiol. Plant. 1992. - V. 84. - P. 521 - 530.

287. Kahane R. et al. Long term multiplication of onion (Allium cepa L.) by cyclic shoot regeneration in vitro // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 1992. -V.-28.-P. 281 -288.

288. Kaminski P., Gorecka K., Krzyzanowska D. Diversity of androgenic plants of head cabbage (Brassica oleracea var. capitata L.) derived from the polish cultivar Kamienna Glova using anther culture // Vegetable crops research. 1999. - Bui. 50.-P. 13-19.

289. Karnath K.A., Bhat P.K., Arekal D.A. Tapetum like anther epidermis in Zeuxine longilabris (Lindl.) Benth. ex HK. (Orchidaceae) II Curr. Sei. - 1979. - V. 48.-P. 542-553.

290. Kaul M.L.H. Male Sterility in Higher Plants. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New-York. 1988. 1005 p.

291. Keller E. R. I., Korzun L. Ovary and ovule culture for haploid production. In: Jain S.M., Sopory S.K. and Veilleux R.E. eds. In vitro haploid production inhigher plants. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands, 1996. Vol. 1. - P. 217-235.

292. Keller E.R.I. Sucrose, cytokinin, and ethylene influence formation of in vitro bublets in onion and leek // Genetic Resources and Crop Evolution. 1993. - V. 40. P. 113-120.

293. Keller I. Culture of unpollinated ovules, ovaries and flower buds in some species of the genus Allium and haploid induction via gynogenesis in onion {Allium cepa L.)l II Euphytica. -1990. V. 47. - P. 241 - 247.

294. Keller W.A. and Armstrong K.C. Production of haploids via anther culture in Brassica oleracea var. italica I I Euphytica. 1982. - V. 32. - P. 151 - 159.

295. Keller W.A., Amstrong K.C. Stimulation of embryogenesis and haploid production in Brassica campestris anther cultures by elevated temperature treatments // Theor. Appl. Genet. 1979. - V. 55. - P.65-67.

296. Kevers C., Coumans M., Coumans Gilles M., Caspar T. Physiological and biochemical events leoding to vitrification of plant cultured in vitro II Physiol Plant.- 1984.-V.61.-P. 69-74.

297. Khox R.B., Friederich E. Tetrad pollen grain development and sterility in Leschenaultin formasa ( Goodeniaceae) II New Phytol. 1974. - V. 73. - P. 251 -258.

298. Kieffer M., Fuller M.P., Chauvin J.-E. and Schlesser A. Anther culture of kale (Brassica oleracea L. convar. acephala(DC) Alef.) II Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1993. - V. 33. - P. 303 - 313.

299. Kim Y.H. and Janick J. Somatic embryogenesis and organogenesis in Cucumber. // HortSci 1989. - V. 24. - P. 702.

300. Kirti P.B., Chopra V.L. A simple method of inducing somatic embryogenesis in Brassica juncea (L) Czern and Coss // Plant Breed. 1989. - V. 102. - N.I. - P. 73-78

301. Knudsen S., Due I.K., Andersen S.B. Components of response in barley anther culture. // Plant Breeding. 1989. - V. 103. - P. 241 - 246.

302. Kobabe G. Entwicklungsgeschichtliche und genetishe Untersuchungen an neuen mannlich sterilen Mutanten der Kuchenzwiebel (Allium cepa L.) II Z.Pflanzenz. 1958. - V. 40. - P. 353 - 384.

303. Kojima A., Kawaguchi T. Dihaploids derived from unpollinated ovule culture of Chines chives. // Proc. 4th Allium Symp. Wellesbourne, 1988. - P. 212 - 217.

304. Konvicka O. Mutaci zeli (Brassica oleracea L. var. capitata) baz voskoveho naletu ojmeni/a j eli vyuziti I I Rostlinna vyroba. 1965. - R. 11. - N. 2. - S. 189 -194.

305. Kott L.S., Polsoni L., Ellis B., Beversdore W.D., Autotoxicity in isolated microspore cultures of Brassica napus. II Canadian Journal of Botany.- 1988. -V. 66.-P. 1665- 1670.

306. Kuang A., Musgrave M.E. Dynamics of vegetative cytoplasm during generative cell formation and pollen maturation in Arabidopsis thaliana II Protoplasma. 1996. - V. 194. - N. 1 -2. - P. 81 - 90.

307. Kubalakova M., Dolezel J., Lebeda A. Ploidy instability of embryogenic cucumber (Cucumis sativus L.) callus culture // Biologia Plantarum 1996. - V. 64.- P. 475 - 480.

308. Kuginuki Y., Nakamura K., Hida K., Yosikawa H. Varietal differences in embryogenic and regenerative ability in microspore culture of Chinese cabbage (Brassica rapa I ssp. pekinensis). // Breeding Science. 1997. - V. 47. — P. 341 — 346.

309. Kuo C.S. The preliminary studies on culture of unfertilized ovary of rice in vitro II Acta Botanica Sinica. 1982. - V. 24. - P. 33 - 38.

310. Kuranouchi T., Kawaguchi K., Tanaca M. Male sterility in sugar beet induced by cooling treatment and its application to cross- pollination for breeding // Breeding Science. 2000. - V. 50. - P. 283 - 289.

311. Kuztz Sharon Maraffa, Linebergen R. Daniel Genotypic differences in morphogenic capacity of cultured leaf explants of tomato // J. Amer/ Soc. Hort Sci. 1983. - V. 108. - N. 5. - P. 710 - 714.

312. Ladyman J.A.R. and Girard B. Cucumber somatic embryo development on various gelling agents and carbohydrate sources // HortSci 1992. - V. 27. - P. 164- 165.

313. Landi P., Frascaroli E., Tuberosa R., Conti S. Comparison between responses of gametophytic and sporophytic recurrent selection in maize (Zea mays L.) II Theor Appl Genet. 1989. - V. 77. - P. 761 - 767.

314. Lapushner D., Frankel R. Practical aspects and the use of male sterility in the production of hybrid tomato seed // Euphytica 1967. - V. 16. - P. 300 -310.

315. Larson D.A. Fine structural changes in the cytoplasm of germinating pollen //Amer. J. Bot. - 1965. - V.52. - P. 139 - 154.

316. Laser K.D., Lersten N.R. Anatomy and cytology of microsporogenesis in cytoplasmic male sterile angiosperms // Botan. Rev. 1972. - V. 38. - P. 425 -454.

317. Laurain D., Chenieux J.C., Tremouillaux Guiller J. Direct embryogenesis from female haploid protoplasts of Ginkgo biloba L., a medicinal woody species // Plant Cell Repts. - 1993. - V. 12. - P. 656 - 660.

318. Laurie D.A., Bennett M. D. Early post pollination events in hexaploid wheat maize crosses // Sexual Plant Reproduction. - 1990. - Vol. 3. - P. 70 - 76.

319. Lazzeri P.A., Dunwell J. M. In vitro shoot regeneration from seedling root segments of Brassica napus cultivars // Ann. Bot. 1984 - V. 54. - N.3. - P. 341 — 350.

320. Ledo H.D. Anikeenko V.S., Voronina M.V. Examination of five CMS lines in Capsicum annuum L. in Hungary. Eucarpia VHIth Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum and Eggplant (Rome, Italy), 1992. P. 66-68.

321. Lee H.S.,Karunanandaa B., McCuibin A., Gilroy S., Kao T. PRKI, a receptor -like kinase of Petunia inflata, is essential for postmeiotic developent of pollen // Plant J. 1996. - V. 9. - N5. - P. 613 - 624.

322. Lee S.L.J., Warmke M.E. Organelle size and number in fertile and T -cytoplasmic male sterile corn // Amer. J. Bot. - 1979. - V. 66. - P. 141 -148.

323. Leike H., Wieczorec G. In vitro Vermehrung bei Kopfkohl (Brassica oleracea L. var. capitata) II Arch. Zuchtungsforsch. 1982. - V. 12. - N. 6. - S. 375 - 383.

324. Lentini Z., Reyes P., Martinez C.P., Roca W.M. Androgenesis of highly recalcitrant rice genotypes with maltose and silver nitrate.// Plant Science. 1995. -V. 110.-P. 127- 138.

325. Li G.M., Yang H.Y. Further embryological studies on the in vitro apogamy in Oryza sativa L. II Acta Botanica Sinica. 1986. - Vol. 28. - P. 229 - 234.

326. Li T., Neumann K.H. Embryogenesis and endogenous hormone content of cell cultures of some carrot varieties (Daucus carota L.). // Ber. bot. Ges. 1985. - V. 60.-P. 227-235.

327. Lichter R. and Mundler M. Untersuchungen über die Pollen Sterilität der Kuchenzwiebel (Allium cepa L.) ins besondere über den Einfluss von Witterung und genetischer Kostitution. II Z. Pflanztnz. -1961. V. 45. - S. 393 - 405.

328. Lichter R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus.ll Zeitschrift fur Pflanzenphysiologie. 1982. - V.- 105. - P. 211 -221.

329. Liu C.M., Xu Z. H., Chua N.H. Auxin polar transport is essential plant embryogenesis.// Plant cell. 1993. - Vol. 5. - P. 621 - 630.

330. Lobanova L., Enaleeva N. The development of embryo sacs in in vitro ovaries of Nicotiana tabacum L. // Plant Science. 1988. - Vol. 62. - P. 191 - 202.

331. Locy R.D. Callus formation and organogenesis by explants of six Lycopersicon species // Can. J. Bot. 1983.- V. 61. N. 4. - P. 1072 - 1079.

332. Lou H. and Kako S. Role of high sugar concentrations in inducing somatic embryogenesis from cucumber cotyledons // Scientia Horticulturae 1995. - V. 64.-P. 11-20.

333. Lou H. and Kako S. Somatic embryogenesis and plant regeneration in cucumber // Hortscience 1994. - V. 29. - P. 906 - 909.

334. Luckett D.J., Smithard R.A. Barley anther culture using membrane rafts. // if Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1995. - V. 42. - P. 287 - 290.

335. Lyakh V.A., Soroka A. J. Influence of low temperature treatment of maize microgametophytes in Fj on the structure and cold tolerance of resulting populations // Maydica. 1993. - V.38. - P. 67 - 71.

336. Macchia F., Scaramuzzi F., Porcelli S. Organogenesis e propagazione " in vitro" di ibridi F1 di Solanum melongena L. da espianti vegetativi // G. bot. ital. -1982. V. 116. N 1. - P. 117-118.

337. Malepszy S, Niemirowicz Szczytt K. and Wiszniewska J. Cucumber (Cucumis sativus L) somatic embryogenesis in vitro // Acta Biol. - 1982. V. 10. -P. 218-220.

338. Malepszy S. and Nadolska Orczyk A. In vitro culture of Cucumis sativus L. 1. regeneration of plantlets from callus formed by leaf explants // Z. Pflanzenphysiol. - 1983. - Bd. 111. S. 273 - 276.

339. Mandaron P., Niogret M. F., Mache R., Moneger F. In vitro protein synthesis ^ in isolated microspores of Zea mays at several stages of development. // Theor.

340. Appl. Genet. 1990. - V. 80. - P. 134-138.

341. Mann L.P. and Woodbury G.W. The effect of flower age, time of day and variety on pollen germination of Onion, Allium cepa II J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1969. - V. 94.-P. 102-104.

342. Mansfield S.G., Briarty L.G., Erni S. Early embryogenesis in arabidopsis thaliana. I. The mature embryo sac// Can. J. Bot. 1991. - Vol 69. - N3. - P. 447 -460.

343. Mariami C., De Beuckeller M., Truettner J.,Leemons J.,Goldberg L. Induction of male sterility in plants by a chimeric ribonuclease gene // Nature. 1990. - V. 347.-P. 737- 741.

344. Marrewijk G. V. Cytoplasmic male sterility and restoring fertility in the garden petunia // Thesis Univ. of Wageningen. -1969. P. 129.

345. Marshner H. Mineral nutrition of higher plants. London etc.: Acad. Press, 1995.- 889 p.

346. Martin J. and Grawford J.H. Several types of sterility in Capsicum frutescens // Proc. Am. Soc. Hortic. Sci. 1951. - V. 57. - P. 335 -338.

347. Mascarenhas J. P. and Machlis L. Chemotropic response of the pollen of

348. Antirrhinum majus to calcium. // Plant Physiology. 1964. - V. 39. - P. 70 - 77.

349. Mascarenhas J. P. and Mermelstein J. Messenger RNAs: Their utilization and degradation during pollen germination and tube growth // Acta Soc. Bot. Polon. -1981.-V. 50.-P. 13-20.

350. Mascarenhas J. P. Anther and pollen - expressed genes. // In Temporal and Spatial Regulation of Plant Genes D.P.S. Verma and R. B. Goldberg, ed (New York: Springer - Verlag), 1988. - P. 97 - 115.

351. Mascarenhas J. P. Gene activity during pollen development. // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1990. - V. 41. - P. 317-338.

352. Mascarenhas J. P. Ribonucleic acid and proteins in pollen germination.// Proc. 1V Intl. Palynol. Conf., Lucknow, India, 1978. V. 1. - P. 400 - 406.

353. Mascarenhas J. P. The biochemistry of angiosperm pollen development //Bot. Rev. 1975.-V.41.-P. 259-314.

354. Mascarenhas J.P., Machlis L. Chemotropic response of the pollen of Antirrhinum majus to calcium. I I Plant Physiology. 1964. V. 39. - P. 70 - 77.

355. Masuda K., Kikuta Y., Okazawa Y.A. Revision of the Medium for Somatic Embryogenesis in Carrot Suspension Culture // J. Fac. Agr. Hokkaido Univ. -1981.- Vol. 60.-P. 183-193/

356. Mathur S.L. Development of the male and female gametophytes of Calycanthus fertilis Walt. II Proc. Natl. Inst. India Part В Biol. Sci. 1968. - V. 34.- P. 323 -329.

357. Maytshwari S.C., Rashid A., Tyagi A.K. Yaploids from pollen grains: retrospect and prospect.// American Journal of Botany. 1982. - V. 69. - P. 865 -879.

358. McCormick S. Molecular analysis of male gametogenesis in plants // Trend. Genet.-1991 -V.7.-P. 298-303.

359. Meer Q.P. Van Der and Van Bennekom J. L. Effect of temperature on the occurence of male sterility in Onion (Allium сера L.)JI Euphytica. 1969. - V. 18.- P. 389 394.

360. Mezei S., Kovacev L. In vitro gynogenesis of inbred sugar beet lines // Selekcija i Semenarstvo. -1994. - V. 1. - P. 99 - 102.

361. Mezgnani N. Jemmali A. and Tarchoun N. Implication of the cambial tissue in the essential callus formation on hot pepper (Capsicum annuum L.) petiole explants cultured in vitro // Capsicum and Eggplant Newsletter 2004. - V. 23. -P. 89-92.

362. Michalczuk L., Cooke T. J., Cohen J.D. Auxin levels at different stages of carrot somatic embryogenesis. // Phytochemestry. 1992. V. 31. - P. 1097 -1103.

363. Mogensen H. L. Ультраструктура вегетативной клетки.// В кн. Эмбриология цветковых растений. Под ред. Т.Б. Батыгиной. С.-Петербург: Мири Семья, 1994. Т. 1. - С. 93 - 94.

364. Mogensen Н. L. Ультраструктура генеративной клетки.// В кн. Эмбриология цветковых растений. Под ред. Т.Б. Батыгиной. С.-Петербург: Мир и Семья, 1994. Т. 1. - С. 91 - 92.

365. Mohamed Yassen Y., Splittstoesser E.W. Regeneration of onion (Allium сера) bulbs in vitro. // PGRSA Quaterly. - 1992. - V. 20. - N2. - P. 76 - 82.

366. Mohamed Yassen Y., Splittstoesser E.W., Litz R.E. In vitro bulb "formation and plant recovery from onion inflorescence // HortScience. - 1993. - V. 28. - P. 1052.

367. Mol R. In vitro gynogenesis in Melandrium album: from parthenogenetic embryos to mixoploid plants. // Plant Science 1992. - Vol. 81. - P. 261 - 269.

368. Mol R. Embryo sac development during the culture of placenta attached ovules of Melandrium album. II Biologia Plantarum 1993. - Vol. 35. - P. 25- 30.

369. Mol R. Embryological aspects of in vitro gynogenesis in plant organ Cultures. // Acta Biologica Cracoviensia, Series Botanica 1999. - Vol. 41. - P. 67 - 74.

370. Mol R. Isolation of protoplast from female gametophytes of Torenia fourneri II Plant Cell Repts. 1986. - V. 5 - P. 202 - 206.

371. Msikita W., Skirvin R.M., Juvick J.A. and Splittstoesser W.E. In vitro regeneration and flowering of cucumber cultivars and lines cultured from excised seed. // Cucurbit Genet. Coop. Rep. 1988. - V. 11. - P. 5 - 7.

372. Mukhambetzhanov S. K. Culture of nonfertilized femile gametophythes in vitro. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1997. - Vol. 48. - P. 111 - 119.

373. Murashige Т., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures // Physiol. Plant. 1962.- Vol. 15. -P. 473-497.

374. Muren R.M. Haploid plant induction from unpollinated ovaris in onion. // Hort Science. 1989. V.24. P. 833 -834.

375. Murty N.S.R. and Lakshmi N. Male sterile mutant in Capsicum annuum L. II Curr. Sci. -1979.- V. 48.-P. 312.

376. Musial K., Przywara L. Influence of irradiated pollen on embryo and endosperm development in kiwifruit. Annals of Botany. 1998. - Vol. 82. P. 747- 756.

377. H¡ 405. Nadolska Orczyk A., Malepszy S. Cucumber plant regeneration from leaf expiants. Selected characteristics. // Bull. Polish Acad, Sei. Biol. Sc. - 1984 - V. 32.-p. 423-428.

378. Nadolska Orczyk A., Malepszy S. In vitro culture of Cucumis sativus L. VI. Histological analysis of leaf expiants cultured on media with 2,4 D or 2,4,5 - T //Acta Soc. Bot. Pol. - 1987. - V. 56. - P. 55 - 60.

379. Nakamura N. Physiological studies on the pollen growth of Camellia japónica • L. in vitro // J. Yokohama City Univ. Biol Ser. 1978. - V. 5. - P. 1 - 10.

380. Nanda K., Gupta S.C. Malfunctioning tapetum and callóse wall behaviour in Allium cepa microsporangia //Beitr. Biol Pflantz. 1974. - V. 50. - P. 465 - 472.

381. Nemeth G. Lippay Janos emlekules es tud ulesszak eljadas // Kot. 1/ Budapest.- 1982-P. 147-150.

382. Neumann K. H. Pflanzliche Zell und Gewebekulturen - Ulmer Verlag. Stuttgart, 1995.

383. Neumann K.H Pflanzen Zell und Gewebekulturen. - Ulmer Verlag, Stuttgart- 1995.

384. Neumann K.H., Grieb B. Somatische Embryogenese bei höheren Pflanzen: Grundlagen und practische Anwendung // Wiss. Z. Humboldt Univ. Berlin, R. Mathematic/Naturwiss. - 1992. - V. 41. - S. 63 - 80.

385. Nitsch C., Norreel B. Effect d'un cyjc thermique sur le pouvoir embryogene du pollen de Datura innoxia culture dans l'anthere on isole de l'anthere. // Comptes Rendus de 1' Academie des Sciences de Paris. 1973. - 276D. - P. 303 -306.

386. Nitta T., Takahata Y., Kaizuma N. Scanning electron microscopy of microspore embryogenesis in Brassica spp. // Plant Cell Reports. 1997. - V. 16. -P. 406-410.

387. Novak F., Betlach J. and Dubovsky J. Cytoplpasmic male sterility in sweet pepper (Capsicum annuum L.). I. Phenotype and inheritance of male sterile character. // Z. Pflanzenzucht. -1971. V. 65. - P. 129 - 140.

388. Obermeyer G., Kriechbaumer P., Strasser D., Maschessing A., Bentrup F.W. Boric acid stimulates the plasma membrane H+ ATpase of ungerminated lily pollen grains // Physiol Plant. - 1996. - V. 98. - N. 2. - P. 281 - 290.

389. Ogura H. Studies on the new male sterility in Japanese radish, with special• reference to the utilization of this sterility towards the practical raising of hibridseeds// Mem. Fac. Agr. Kagoshima Univ. 1968. - N.6. - P. 39 -78.

390. Ohki Shizuka, Bigot Claude, Mousseau Jean Analysis of shoot forming capacity in vitro in two lines of tomato (Lycopersicon esculentum Mill) and their hybrids // Plant and Cell Physiol. - 1978. - V. 19. - N 1, - P. 27 - 42. '

391. Olesen P., Buck E., Keimer B. Structure and variability of embryos, endosperm and perisperm during in vitro culture of sugar beet, Beta vulgaris ovules. // In:

392. H Cresti M., Cori P., Pacini E. eds., Sexual reproductionin hinger plants.

393. Proceedings of the 10th International Symposium on Sesual Reproduction of Hinger Plants, Springar Berlin, Heidelberg, 1988.-P. 107-112.

394. Olsen F. L. Isolation and cultivation of embryogenic microspores from barley (Horden vulgare L). II Hereditas. 1991. - V. 115. - P. 255 - 266.

395. Osolnik B., Bohanes B., Jelaska S. Stimulation of androgenesis in white cabbage (Brassica oleracea var. capitata) anthers by low temperature and anther dissection // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1993. - V. 32. - P. 241 - 246.

396. Ottaviano E., Mulcahy D.L. Genetics of angiosperm pollen // Adv. Genet. -1989- V. 26.-P. 1-64.

397. Ottaviano E., Sari Gorla M, Mulcahy D.L Pollen selection, efficiency and monitoring. In: Z. Odita and Market C.L. (Eds) Isozymes: Structure, Function and Use in Biology and Medicine, - Wiley - Liss Inc. New York, 1990. - P. 575 - 588.

398. Ottaviano E., Sari Gorla M. Gametophytic and sporophytic selection. In: M.D. Hoyward, Basemark N.D. and I. Romagosa (Eds). Plant Breeding Principles and Prospects. Chapman and Hall. - London, 1993. - P. 333 - 352.

399. Ottaviano E., Sari Gorla M., Pe E. Male gametophytic selection in maize // Theor. and Appl. Genet. - 1982. - V. 73. - P. 249 - 254.

400. Overman M.A., Warmke H.F. Cytoplasmic male sterility in Sorghum. II. Tapetal behavior in fertile and sterile anthers // J. Heredity. 1972. - V. 63. - P. 227-234.

401. Ozaki Y., Tushiro T., Kurahashi T. and Okubo H. Variation of pollen viability storability in Asparagus (Asparagus officinalis L.) cultirars // J. Fac. Agr. Kyushu.

402. Univ. -1999. V. 44. - N. '/2. - P. 1 - 8.

403. Pacini E. Types and meaning of pollen carbohydrate reserves // Sex Plant Repord. -1996. V. 9. - P. 362 - 366.

404. Pacini E., Juniper B.E. The ultrastructure of the formation and development of the amoeboid tapetum in Arum italicum Miller II Protoplasma. 1983. - V. 117.-P. 116-129.

405. Palmer C. E. and Keller W.A. Pollen embryos // In Pollen Biotechnology for Crops Production and Improvements (ed K.R. Shivanna and V.K. Sawhney). Cambridge University Press. Cambridge., 1997. P. 392 - 422.

406. Palmer R. Cytological studies of a meiotic and normal maize with reference to premeiotic pairing//Chromosoma (Berlin). 1971. - V. 35. - P. 233 -246.

407. Palmgren G., Mattsson 0., Okkels T. Specific levels of DNA methylation in various tissues, cell lines and cell types of Daucus carota L. // Plant Physiol. -1991.-V.95.-P. 174- 178.

408. Pareddy D.R. and Petolino J.F. Maturation of maize pollen in vitro // Plant Cell ^ Reports. 1992.-V. 11.-P. 535-539.

409. Pearson O.H. Study of the life history of Brassica oleracea.// Bot. Gaz. 1933. -V93.-N3.

410. Pechan P.M. and Keller W.A. Identification of potentially embryogenic in Brassica napus II Physiologia Plantarum. 1988. - V. 74. - P. 377 - 384.

411. Pederson S., Simonsen V., Loeschcke V. Overlap of gametophyte and sporophytic gene expression in barley // Theor. and Appl. Genet. 1987 - V. 75. -P. 200-206.

412. Periasamy K., Swamy B.L.G. Morphology of the anther tapetum inangiosperms // Curr. Sci. 1966. - V. 35. - P. 427 - 430.

413. Pescitelli S.M., Petolino J.F. Microspore development in cultured maize anthers // Plant Cell Reports. 1988. V. 7. - P. 441 -444.

414. Peterson P.A. Cytoplasmically inherited male sterility in Capsicum // Amer. Nat. 1958. - V.92. - P. 111-119.

415. Petolino J. F. and Thompson S.A. Genetic analysis of anther culture responsein maize. // Theoretical and Applied Genetics. 1987. - V. 74. - P. 284 - 286.

416. Petoloni J.F., Jones A.M., Thompson S.A. Selection for increased anther culture response in maize.// Theoretical and Applied Genetics. 1988. - V. 76. P. 157- 159.

417. Petters A.J.M., Gerads W., Barendse G.W.M., Wullems G. J. In vitro flower bud formation in tobacco: interaction of hormones. // Plant Physiol. 1991. - V. 97. - P. 402 - 408.

418. Phillips C.G, Luteyn K.J. Effects of picloram and other auxins in onion tissue cultures // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1983. -V. - 108. - N 6. - P. 948 - 953.

419. Phillips C.G., Hubstenberger J.F. Plant regeneration in vitro of selected Allium species and interspecific hybrids // HortScience. 1987. - V. 22. P. 124- 125.

420. Philouze J. Genes marqueur lies aux genes de sterilite male ms-32 et ms -35 chez la tomate // Ann Amelior Plantes 1974. - V. 24.- P. 77 - 82.

421. Picard E., Crambes E., Liu C. S., Mihamou Ziyyat A. Evolution of haplodiploidisation methods and prospects for plant breeding // Comptes Rendusj|i des Seances de la Societe de Biologic et de ses Filiales, 1994. P. 109-141.

422. Pike L.M., Yoo K.S. A tissue culture technique for the clonal propagation of onion using immature fliver buds // Sci Horticulturae. 1990. - V. 45. - P. 31 -36.

423. Plader W., Malepszy S., Burza W., Rusinowski Z. The relationship between the regeneration system and genetic variability in the cucumber (Cucumis sativus L) // Euphytica 1998. - V. 103. - P. 9 - 15.

424. Polowick P.L., Sawhney V.K. Ultrastructure of the tapetal cell wall in the stamenless 2 mutant of tomato (Lycopersicon esculentum): correlation between structure and male-sterility // Protoplasma. - 1995. - V. 189. - N. 3 - 4.- P. 249 -255.

425. PonitkaA., Slusarkiewicz Jarzina A. Induction of gynogenesis in selected plant species from the family Papiolionaceae. II Genetica Polonica. - 1987. - Vol. 28. - P. 329.

426. Prabhudesai V. and Bhaskaran S. A continuous culture system of direct somatic embryogenesis in microspore-derived embryos of Brassica juncea II Plant Cell Reports. -1993. V. 12. - P. 289 - 292.

427. Pua E.C., Chi G.L. De novo shoot morphogenesis and plant growth of murstard (Brassica juncea) in vitro in relation to ethylene // Physiol Plant. 1993: - V. 88. -P. 467-474.

428. Punij Z.K., Tang F.A. and Sarmento G.G. Isolation, culture and regeneration from cotyledon and mesophyll protoplasts of two pickling cucumber (Cucumis sativus L.) genotypes // Plant Cell Rep. 1990. - V. 9. - P. 61 - 64/

429. Purnhauser L., Medgyesy M., Czenko P.J., Marton L. Stimulation of shoot regeneration in Triticum aestivum and Nicotiana plumbaginifolia Viv tissue culture using the ethylene inhibitor AgN03 // Plant Cell Rep. 1987. - V. 6. - P. 1 -4.

430. Quesada M., Windsor J. A. and Stephenson A. G. Effects of pollen competition on the reproductive performance in cucurbit hybrids (Cucurbitaceae):Fi and back cross generations. // Can. J. Bot. 1996. - V 74. - N 7. - P. 1113 - 1118.

431. Ragan T.C. Ovary, ovule and nucellus culture. In:Johry B.M. (ed) Exp. Embryol. Vascular Plants., 1982. - P. 105 - 129.

432. Raghavan V. Role of the generative cell in androgenesis in hebane. // Science. 1976. -V. 191. - P. 388-389.

433. Rajasekaran K., Mullins M.G., Nair Y. Flower formation in vitro by hypocotyl explants of cucumber (Cucumis sativus L.)//Ann. Bot. 1983. - V. 52. - P. 417420.

434. Rajora O. P., Zsuffa L. Sporophytic and gametophytic gene expression in Populus deltoides Marsh., P. nigra L. and P. maximowiezii Henry //-Cañad. J. Genet. Cytol. 1986 - V. 28. - P. 476 - 483.

435. Ravikumar R.L and Chikkodi S.B. Association between sporophytic reaction to Alternaría helianthi and gametophytic tolerance to pathogen culture filtrate in sunflower (Helianthus annuus L.) // Euphytica. V. 103. - P. 173 - 180.

436. Ravikumar R.L. Effects of Alternaría helianthi toxin on sunflower pollen // Helia. 1977. - V. 20. - N 26. - P. 29 - 34.

437. Ray S.M., Park S.S., Ray A. Pollen tube guidance by the female gametophyte // Develpment. 1997. - V. 124. - N. 12. - P. 2489 - 2498.

438. Reynolds T. L. Pollen embryogenesis. // Plant Molecular Biology. 1997. - V. 33.-P. 1-10.

439. Reznickova S.A., Willemse M.T.M. Formation of pollen in the anther of Lilium. II. The function of the surrounding tissue in the formation of pollen and pollen wall // Acta Bot. Neerl. -1980. V. 29. - P. 141 - 156.

440. Rick C. M. Genetics and development of nine male sterile tomato mutants // Hilgardia. -1948. V. 15. - P. 599 - 633.

441. Rick C.M. and Boynton E.D. A temperature sensitive male- sterile mutant of the tomato. // Am. J. Bot. - 1967. - V. 54. - P. 601 - 611.

442. Rick C.M. Field identification of genetically male sterile tomato plants to use in producing F. tomato seeds // Proc Am Soc Hort Sci 1945. -V. 46. - P. 277283.

443. Rick C.M., Butler L. Cytogenetics of the tomato // Advan. Genet. 1956. - V. 8.-P. 267-382.

444. Riggs C.D., Chrispeels M.J. The expression of phytohemagglutinin genes in• Phaseolus vulgaris is associated with organ specific DNA methylation patterns. // Plant mol. Biol. - 1990. V. 14. - P. 629 - 632.

445. Robbertse P. J., Lock J.J., Stoffberg E., Coetzer L.A. Effect of boren on directionality of pollen tube growth in Petunia and Agapanthus II South. Afr. J. Bot. 1990. - V. 56. - N. 4. - P. 487 - 492.

446. Roberts Oehlschlager S., Dunwell S.M. Barley anter culture; pretreatment on manitol stimulates production of microspore - derived embryos. // Plant Cell,

447. Tissue and Organ Culture. 1990 - V 20. - P. 235 - 240

448. Rosellini D., Vorenes F., Falcinelli M. Recurrent selection of microgametophytic vigour in alfa alfa and correlated response at the sporophytic level // Crop Sci. - 1994. - V. 34. - N 4. - P. 933 - 936.

449. Rosen W. J. Ultrastructure and physiology RosenW. J. Ultrastructure and physiology of pollen. //Annual review of Plant Physiology. 1968. - V. 19. -P.435-462.

450. Ross J. H.E., Murphy D. J. Characterization of anther expressed genes encoding a major class of extracellular oleosin - like proteins in the poleen coat of Brassicaceae II Plant J. - 1996. - V. 9. - P. 625 - 724.

451. Ruffio Chable V., Bellis H., Herve Y A dominant gene for sterility in cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis): phenotype expression, inheritance, and use in F1 hybrid production // Euphytica - 1993. - V. 67. - P. 9 -17.

452. Sachar R.C.,Kapoor M. Influence of kinetin and gibberellic acid on the test -tube seeds of Cooperia pendunculata Herb. Naturwissenschaften. 1958. - V. 45.-P. 552-553.

453. Sacher R.F., Mulcahy D.L., Staples R.C. Developmental selection during self pollination of Lycopersicon x Solanum F| for salt tolerance of F2 // Proc. Symp. Pollen: Biol, and Implic. Plant Breed. New - York, 1983. - P. 329 - 334.

454. San Noeum L. H. In vitro induction of gynogenesis in higher plants. Proceedings of the Conference on Broadening Genetic Base of Crops. Pudoc, Wageningen, 1979. P. 327-329.

455. San Noeum L.H. Haploides d' Hordeum vulgare L. par culture in vitro d' ovaries non fecondes. // Ann. Amelior. Plant. 1976. - V. 26. - P. 751 - 754.

456. Sari Gorla M., Frova C., Binelli G., Ottaviano E. Extent of haplo - diploid gene expression in maize // Maize Genet. Cooper. News Leet. - 1983 - V. 58. - P. 145-146.

457. Sato S., Peet M.M., Thomas J.F. Physiological factors limit fruit set of tomato (Lycopersicon esculentum Mill) uder chronic mild heat stress // Plant Cell Environ. 2000. - V. 23. - P.719 - 726.

458. Satoh Y., Nagai M., Kinoshita T. The use of mitochondrial DNApolymorphism in the classificaton of individual plants by cytoplasmic genotypes.

459. Theor. Appl. Genet. 1993. - V. 86. - P. 345 - 348.

460. Sawhney V.K. Genetic male sterility in tomato and its manipulation in breeding // In: E.G. Williams et al. (Eds), Genetic control of Self-incompatibility and Reproductive Development in Flowering Plants. Kluwer Acad Publ., 1994. -P. 443-458.

461. Sax K. Effects of variations in temperature on nuclear and cell division in Tradescantial // Amar. J. Bot. 1937. - V. 24. - P. 218-225.

462. Scarcy K.B. and Mulcahy D.L. Comprasion of the response to aluminium toxityin gametophyte and sporophyte of four tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) cultivars // Theor. Appl. Genet. -1990. V. 80. - N3. - P. 289 - 295.

463. Schafer F., Grieb B., Neumann K.H. Morphogenetic and Histological events during somatic embryogenesis in intact carrot plantlets. // Bot. Acta. 1988. - V. 101. P. 362-365.

464. Scheel J. H.N., Kieft H., Van Lammeren A.A.M. Interactions between embryo and endosperm during early developmental stages of maize carypses (Zea mays) II Can. J. of Botany.- 1984. V. 63. - P. 2842 - 2853.

465. Schrauwen J.A.M., Groot P.F.M., de, Herpen M.M.A., van et al. Stage-related expression of mRNAs during pollen development in lily and tobacco // Planta. -1990.-V. 182. N. 2.-P. 298-304.

466. Schutze Reinhard, Wieczorrek Gerde Investigations into tomato tissue cultures. 4» I.Shoot regeneration in primary explnts of tomato // Arch. Zuchtungsforsch1987.-V. 17. N. 1.-P.1-15.

467. Searcy K.B., Mulcahy D.L. Poleen selection and the gametophytic expression of metal tolerance in Selene dioica (Caryophyllaceae) and Mimulus guttatus (Scrophulariaceae) II Amer. J. Bot. 1985 - V. 72. - P. 1700 - 1706.

468. Selby C., Collin H.A. Clonal variation in growth and flavour production in tissue cultures of Allium cepa L. // Annals of Botany. 1976. - V. 40. - P. 911ft 918.

469. Shifriss C. and Guri A. Variation in stability of cytoplasmic male sterility in Capsicum L. II J. Am. Soc. Hortic Sci. -1979. V. 104. - P. 94-96.

470. Shiga T. Male sterility and cytoplasmic differentiation // Brassica crops and wild allies. Tokyo: JSSP, 1981. - P. 205 - 221.

471. Shiga T., Baba S. Cytoplasmic male sterrility in oilseed, Brassica napus L. and its utilization to breeding // Jpn. J. Breed. 1973. - V.23. - P. 187 - 197.

472. Shivanna K. R., Jaiswal V. S., Mohan Ram H. Y. Effect of cyclohexemide on ^ cultured pollen grains of Trigonella foenumgraecum. // Plant Sci. Lett. 1974.1. V. 3. P. 335 - 339.

473. Shukla S., Mishra S.K. In vitro multiple plantlet regeneration in khol (Brassica oleracea L. var caulorapa) II Curr. Sci. 1989. - V. 58. - N. 4. - P. 205 - 207.

474. Simmonds D., Keller W. Significance of preprofase bands of microtubules in the induction of microspore embryogenesis of Brassica napus L. //Planta. 1999.- V. 208.-P. 383 -391.

475. Sing S. In vitro plantlet from internode and inflorescence axis of Brassica oleracea var. botrytis II Curr. Sei. 1988 - V. 57. - N 13. - P. 730 - 732.

476. Singh S., Chandra N. Morphogenesis and plantlet formation in callus and suspen sion cultures of cauliflower (Brassica oleracea var Botrytis) II Beitr. Biol. Pflanz 1985. - V. 60. - N. 2. - P. 191 - 198.

477. Singh S., Ranu S., Pareek L.K., Chandra N. Morphogenesis in organ, tissue and cell cultures of some species of Brassica II Plant cell Cult. Crop Improv. Proc/ Int. Symp., Calculta 6- 10 Dac., 1981. New York; London, 1983. P. 441 -444.

478. Singh S.P., Rhodes A.M. A morphological and cytological study of male sterility in Cucurbita maxima I I Proc. Am. Soc. Hort. Sei. 1961. - V. 78. - P. 375 -378.

479. Sitbon M. Production of haploid Gerbera jamesonii plants by in vitro culture unfertilized ovules//Agronomic.-1981.-V. 1. P. 807-812.

480. Skucinska B., Miszke W., Kruczkowska H., Pawlowska H. Mikrorozmnazanie kapusta brukselskiej dla celow hodowlanych // Acta agr. et silv. Ser agr. 1988 - N 27. - P. 101 - 118.

481. Smith B.M., Godwin R.M., Harwey E., Werner C.P. Gynogenesis from whole flower buds in bulb onions (Allium cepa L.) and leeks (Allium porrum L.). II Journal Genetics and Breeding. -1991. V. 45. - P.353 -358.

482. Sondheimer E. and Linskens H. F. Control of germination and tube extension of Petunia hybrida pollen // Proc. Konin. Neder. Acad. Wetensch. 1974. - 77C. -P. 116-124.

483. Songstad D.D., Duncan D.R., Whdholm J.,M. Effect of 1 aminocyclopropane- 1 carboxylic acid< silver nitrate and norbornadiene on plant regeneration from maiz callus cultures // Plant Cell Rep. 1988. - V. 7. - P. 262 - 265.

484. Soniya E.V. and Nair G.M. Multiple shoot regeneration and indirect organogenesis in Chilli pepper (Capsicum annuum L.) // Capsicum and Eggplant Newsletter 2004. - V. 23. - P. 93 - 96.

485. Sreenivasa Swamy M., Christopher T., Subhash K. Multiple shoot formation in embryo culture of Solanum melongena // Curr Sci (India) 1988. - V. 57. - N 4. -P.197 - 198.

486. Sripichitt P., Nawatta E., Shigenaga S. In vitro shoot -forming capacity of cotyledon explants in red pepper (Capsicum annuum L. cv Yatsufusa) // Jpn. J. Breed. 1987. - V. 37. - P. 133 - 142.

487. Steer M. W., and Steer J. M., Pollen tube tip growth. // New Phytol. 1989. -V. 111.-P. 323 -358.

488. Steer M.W. Differentiation of the tapetum in Avena. The cell surface IIJ. Cell Sci. 1977.-V. 25.-P. 125- 138.

489. Stewens M.A., Rick C.M. Genetics and breeding. In: J.G. Atherton and J.Rudich (Eds), The Tomato Crop. Chapman and Hall, 1986. P. 80 -85.

490. Subranmanyam N.C., Kasha K. J. Selective chromosomal elimination during haploid formation in barley following interspecific hybridization. // Chromosoma. 1973.-Vol. 42.-P. Ill -125.

491. Sunderland N. Pollen and anther culture. In: Street HE ed., Plant tissue and cell culture. University of California Press, Berkeley. 1973. - P. 205 - 239.

492. Sunderland N., Collins G.B., Dunwell J.M. The role of nuclear fusion in pollen embryogenesis of Datura innoxia Mill. II Planta. 1974. - V. 117. - P. 227 - 241.

493. Sunderland N., Evans L.J. Multicellular pollen formation in cultured barley anthers. II. The A pathway, B - pathway and C - pathway. // Journal of Experimental Botany. - 1980. - V. 31. - P. 501 - 514.

494. Sunderland N., Wicks F. Embryoid formation in pollen grains of Nicotiana tabacum IIJ Exp. Bot. -1971. -V. 22. P. 213 - 226.

495. Swamy B.G.L., Krishnamurthy K.V. From flower to fruit // Tata McGraw -Hill, New Delh,. 1980.

496. Szasz A., Nervo G and Fari M. Screening for in vitro shoot forming capacity of seedling explants in bell pepper (Capsicum annuum L) genotypes and efficient plant regeneration using thidiazuron //Plant Cell Rep. 1995 - V. 14 - P. 666 -669.

497. Takanata Y. and Keller W.A. High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore culture of Brassica oleracea L. // Plant Science. -1991. V. 74. - P. 235 - 242.

498. Tanaca 1. Differentiation of generative and vegetative cells in angiosperm pollen // Sex plant Repord. 1997. - V. 10. - N. 1. - P. 1 - 7.

499. Tang Z.L., Li J.N., Chen L., Zeng T.T., Zhang X.K. Temperature influence on sterility of CMS lines and their F1 rapeseed (Brassica napus) // J. Southwest Agric Univ. 1997. - V. 19. - P. 421 - 430 .

500. Tanksley S.D., Zamer D. and Rick C.M. Evidence or extensive overlap of sporophytic and gametophytic gene expression in Lycopersicon esculentum II Science 1981 - V. 213. - P. 453 - 456.

501. Tanksley S.D., Zamer D. Double tagging of male sterile gene in tomato using a morphological marker gene // Hort Sci 1988. - V. 23. - P. 387-388.

502. Telmer C.A., Simmonds D., Newcomb W. Determination of devejopmental stage to obtain high frequenciens of embryogenic microspores in Brassica napus L. II Sex Plant Reprod. -1992. V. 84. - P. 417 - 424.

503. Telmer T.A., Newcomb W., Simmonds D.H. Cellular changes during heat shock induction and embryo development of cultured microspores of Brassica napus sv. Topas. // Protoplasma. 1995. - V. 185. - P. 106 - 112.

504. Thompson D.I. Studies of the heritanse of male sterility in carrot Daucus carota L. var. sativa II Proc. Amer. Soc. hort. Sci. 1962. - P. 78.

505. Thompson K.F. Cytoplasmic male-sterility in oilseed rape // Heredity. 1972. -V. 29.-P. 253 -257.

506. Tian H.G., Yang H.G. Haploid embryogeny and plant regeneration in unpollinated ovary culture of Allium tuberosum. II Acta Biologica Experientia Sinica. 1989. - Vol. 22. - P. 139 - 147.

507. Tian H.G., Yang H.G. Synergid apogamy and egg cell anomalous division in cultured ovaries of Oryza sativa L. II Acta Botanica Sinica. 1983. - Vol. 25. - P. 403-408.

508. Tomson D.L. Production in haploid plants marrowa to kale // Nature. 1956. Vol. 28. - N.3. - P. 406-407.

509. Tronickova E., Spirytova N. Production of hybrid seeds from the tomato cultivar Start S-Fl using functional sterility // Rostl Vyr. -1981. V. 27. P. 865 -872.

510. Trottier M.C., Collin J., Comena A. Comparison of media for their aptitude in wheat anther culture. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1993. - V. 35. - P. 59-67.

511. Truong Andre I. Dermarly. Obtaining plants by in vitro culture of unfertilized maize ovaries {Zea mays L.) and preliminary studies on the progeny of gynogenetic plant // Z. Pflanzenzucht. - 1984. - V. 92. - P. 309 - 320.

512. Tsay H.S., Miao S.H., Widholm J.M. Factors affecting haploid plant regeneration from maize anther culture. // Journal of Plant Physiology. 1986. -V. 126.-P. 33-40.

513. Tupy J., Rihova L., Capcova V.,Zarsky V. Differentiation and maturation of tobacco pollen in situ and in suspension culture // Angiosperm pollen and ovules. N. Y. ets.: Springer Verlag, 1992. - P. 309-314.

514. Twell D. The deversity and regulation of gene expression in the pathway of male gametophyte development // Molecular and cellular aspects of plant reproduction. Soc. Exptl. Biol. Seminar Ser. 55. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1994.-P. 83- 135.

515. Uwate W. J., Lin J. Cytological zonation of Prunus avium L. pollen tubes in vivo I I J. Ultrastruct. Res. 1980. - V. 71. - P. 173- 184.

516. Valera Montero L.L., Ochia - Alejo N. A novel approach for chilli pepper (Capsicum annuum 1.) plant regeneration. Shoot induction in rooted hypocotyls // Plant Sci. - 1992. - V. 84. - P. 215 - 219.

517. Van der Meer Q.R. Chromosomal monogenic dominant male sterility in Chinese cabbage (Brassica rapa subsp. pekinensis (Lour.) Hanelt) II Euphytica -1987.-V. 36.-P. 927-931.

518. Vasil I.K. Physiology and cytology of anther development // Biol. Rev. 1967. - V.42.-P. 327-373.

519. Verma Yu. L., Virk D.S. and Chahal G.S. Heterosis breeding in crops plants -theory and application.// Short communications Symp Ludhiana. India. 1993. P.

520. Wagner V.T., Sohg , Matthys R.E., Dumans C. Observation on the isolated embryo sac of Zea mays L. It Plant Sci. 1989. - V. 59. - P. 127 - 132.

521. Wang Hua, Tang Xiao Hua, Zhao Ji Xian Study of the application of the ecotype GMS line of rapeseed (Barssica napus L.) // J. of Mountain Agriculture and Biology. 2001. - V. 20. - P. 321-324.

522. Wann S.R., Becwar M.R., Nagmani R.P., Johnson M.A. Biochemical differences between embryogenic and non- embryogenic calli of conifers. // Trees. -1989. V. 3. - P. 173-178.

523. Warmke H.E., Overman M. A. Cytoplasmic male sterility in Sorghum. I. Callose behaviour in fertile and sterile anthers. // J. Heredity. 1972. - V. 63. - P. 103- 108.

524. Wei Z. Y. , Yang H.Y. Histochemical studies on in vitro parthenogenesis in Helianthus annum L. II Acta Botanica Sinica 1986. Vol. 28. P. 117 122.

525. Weterings K., Reijnen W., Schrauwen J., Herpen M., Van Groot P., de, Oldenhof M., Wullems G. Pollen specific expression during development and germination in tobacco // Angiosperm pollen and ovules. N.Y. ets.: Springer -Verlag, 1992.-P. 139- 143.

526. Whelan E.D. P. A cytogenetic study of a radietion induced male sterile mutant of cucumber. // J. Am. Soc. Hort. Sci. 1972. - V. 97. - P. 596 - 598.

527. Wilhelmi L.K., Preuss D. Self sterility in Arabidopsis due to defective pollen tube guidance // Science. - 1996. - V. 274. - N. 5292. - P. 1535 - 1537.

528. Willing R.P. and Mascarenhas J. P. Analysis of the complexity and diversity of mRNAs from pollen and shoots of Tradescantia. // Plant Physiol. 1984. - V. 75. P. 865-868.

529. Willing R.P., Bashe D. and Mascarenhas J. P. Analysis of the quantity and diversity of messenger RNAs from pollen and shoots of Zea mays // Theor. Appl. Genet. 1988. - V. 75. - P. 751 - 753.

530. Willing R.P., Mascarenhas J.O. Analysis of the complexity and diversity of mRNKs from poleen and shoots of Tradescantia. // Plant Physiol. 1994. - V. 75. -P. 865-868.

531. Woong Yu. L. Inheritance of cytoplasmic male sterility in pepper (Capsicum annuum L.) // Kyung HU University, South Korea. M.Me. thesis. 1985. - P. 1-43.

532. Worrall D., Twell D. Pollen maturation: Where ubiquitin is not required? // Bioassays. 1994. - V. 16. - N. 12. - P. 873 - 875.

533. Yan H., Yang H.Y., Jensen W. An ultrastructural study on in vitro parthenogenesis in Helianthus annuus. II American Journal of Botany 1989. Vol. suppl.- P. 38.

534. Yang D.G.,Tarja N., Unto T., Seppo P. Maintenance of male sterile germplasm in Brassica rapa by in vitro propagation // Agricultural and food Science in Finland. 2000. - V. 9. - P. 231 - 238.

535. P 566. Yang G.S., Fu T.D. Environment effects on the cytoplasmic male-sterility of rapeseed (B. napus and B, campestris) // China Oil Crops. 1987. - V. 3. - P. 15 -19.

536. Yang H.Y., Yan H., Zhou C. In vitro production of haploids in Helianthus. // In: Bajaj Y.P.S. ed., Biotechnology in agriculture and forestry. Springer- Verlag, Berlin, Heidelberg, 1990. Vol. 10. P. 472-483.

537. Yang H.Y., Zhou C. In vitro induction of haploid plants from unpollinated ovaries and ovules // Theor. Applied. Genetica. -1982. V. 63. - P. 97 - 104.

538. Yoffe M.D. On the embryolodgy of Trochodendron aralioides. Embryo and endosperm development. In: Yakovlev M.S. (ed) Flower morphology andy reproductive processes in angiosperms. Nauka. Leningrad, 1965. P. 177 - 185.

539. Young R., Kaul v., Williams E. G. Clonal propagation in vitro From immature embryos and flower buds of Lycopersicon peruvianum and L. esculentum // Plant Sei, 1987. V. 53. - N 3. - P. 237 - 242.

540. Yu H.-S., Russel S.D. Populations of plastids and mitochondria during male reproductive cell maturation in Nicotiana tabacum L.: A cytological basis for occasional biparental inheritance // Planta. 1994. - V. 193. - N.l. - P. 115 - 122.

541. Zaki M.A.M. and Dickinson H.G. Microspore derived embryos in Brassica: the significanceof division symmetry in pollen mitosis I to embryogenic development. // Sexual Plant Reproduction. - 1991. - V. 4. - P. 48 - 55.

542. Zaki M.A.M. and Dickinson H.G. Structural changes during the first division of embryos resulting from anther and free microspore culture in Brassica napus. // Protoplasma. 1990. - V. 156. - P. 149 - 162.

543. Zenkteler M. Microsporogenesis and tapetal development in normal and male sterile carrots (Daucus carota). // Amer. J. Bot. 1962. - V. 49. - P. 341 - 348.

544. Zenkteller M., Nitzsche W. In vitro culture of ovules of Triticum aestivum at early stages of embryogenesis // Plant Cell Repts. -1985. V. 4. - P. 168 - 171.

545. Zhang F.L., Takahata Y., Xu J.-B. Vtdium and genotype factors influencing shoot regeneration from cotyledonary explants of Chinese cabbage (Brassica campestris L. ssp. pekinensis) II Plant Cell Reports 1998. - V. 17. - P. 780 - 786.

546. Zhang L.G., Hao D.F. Investigation on the sterility changeover of male sterility Line CMS7311 in heading Chinese cabbage // Acta Botanica Sinica 2001. - V. 43. P. 1 123-1128.

547. Zhao J., Simmonds D., Newcomb W. High frequency production of doubled haploid plants of Brassica napus cv. Topas derived from colhicine-indused microspores embryogenesis without heat-shock // Plant Cell Rep.- 1996. V. 15. -P. 668-671.

548. Zhao J.-P., Simmonds D.H., Newcomb W. Induction of embryogenesis with colchicine instead of heat in microspores of Brassica napus L. cv. Topas. // Planta. 1996. - V. 198.-P. 433-439.

549. Zhou C., Yang H.Y. In vitro induction of haploid plantlets from unpollinated young ovaries of Oryza sativa L. // Acta Genetica Sinica. 1980. - V.7. - P. 287 -288

550. Zhou C., Yang H.Y. Inducton of haploid rice plantlets by ovary culture. // Plant Science Letters. 1981. - Vol. 20. - P. 231 -237.

551. Zhu Z.C., Liu Z. Y., Wu H.S., An Q.K. Development of embryoid from the unpollinated ovary of Nicotiana tabacum cultred in vitro. II Acta Botanica Sinica. -1981.-Vol. 23.-P. 499-501.

552. Zhu Z.C., Wu H.S. In vitro induction of haploid plantlets from unpollinated ovaries of Triticum aesticum and Nicotiana tabacum II Acta Genetica Sinica. -1979.-V.6.-P. 181-184.

553. Zorzoli R., Cointry E.L., Prado E.A., Mroginski L.A., Picardi L.A. Regeneración de plantas de tomate (Lycopersicon esculentum) por cultivo in vitro de foliolos // Turrialba 1988. - V. 38. N. 4. P. 332 - 336.