Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Регенерация растений колонновидных слаборослых генотипов яблони из эксплантов различного происхождения

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Регенерация растений колонновидных слаборослых генотипов яблони из эксплантов различного происхождения"

На правах рукописи

Ван-Ункан Надежда Юрьевна

РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ КОЛОННОВИДНЫХ СЛАБОРОСЛЫХ ГЕНОТИПОВ ЯБЛОНИ ИЗ ЭКСПЛАНТОВ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Мичуринск-наукоград РФ

005554457 I 2014

005554457

Диссертационная работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина Россельхозакадемии

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик РАН Савельев Николай Иванович

Атрощенко Геннадий Парфенович,

доктор сельскохозяйственных наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный аграрный университет», доцент кафедры плодоовощеводства и декоративного садоводства

Шорников Денис Геннадьевич,

кандидат сельскохозяйственных наук, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт садоводства им. И.В. Мичурина Россельхозакадемии, заведующий отделом размножения плодовых культур

Ведущая организация:

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт селекции плодовых культур Россельхозакадемии (ВНИИСПК, г. Орел)

Защита диссертации состоится 3 октября 2014 г. в 13 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 220.041.01 при ФГБОУ ВПО «Мичуринский государственный аграрный университет» по адресу: 393760, Тамбовская обл., г.Мичуринск, ул. Интернациональная, 101, зал заседаний диссертационных советов, тел./факс (47545) 5-32-13, E-mail: dissov@mgau.ru

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Мичуринский государственный аграрный университет» и на официальном сайте: http://www.mgau.ru, с авторефератом - на официальном сайте ВАК Минобразования и науки РФ: www.vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан 25 августа 2014 г.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные и скрепленные гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь ¿г

диссертационного совета Д 220.041.01 -

кандидат с.-х. наук, доцент С-^г З.Н. Тарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Колонновидные слаборослые генотипы яблони занимают особое место в современном плодоводстве, так как имеют большие биологические преимущества по сравнению с обычными сортами - небольшую высоту и особый тип кроны - без боковых ответвлений, раннее вступление в плодоношение и высокую продуктивность, в 5-6 раз превышающую обычные сорта (Кичина, 2006). В связи с этим изучение их биотехнологических особенностей является весьма актуальным.

В селекционно-генетических исследованиях, проводимых в настоящее время с плодовыми растениями, все шире применяются современные биотехнологические методы и приемы, в том числе и такие, как культура in vitro изолированных пыльников, листовых эксплантов, меристем. Их использование позволяет успешнее решать многие как фундаментальные, так и прикладные задачи. Культура изолированных пыльников (метод андрогенеза in vitro) является одним из распространенных методов получения гаплоидных, а на их основе гомозиготных растений. Использование таких растений в селекционно-генетической практике ускоряет процесс получения новых сортов, повышает эффективность генетических исследований, расширяет существующий генофонд. Это показано на ряде овощных и зерновых культур, у которых с использованием метода культуры пыльников уже получены новые высокоэффективные сорта (Орлов, 1998; Анапиляев, 2000; Бобков, 2002; Шмыкова, 2006; Муравлев, 2007). Однако у плодовых культур, в частности яблони, андрогенез in vitro мало изучен. Лишь у отдельных генотипов получены андрогенные каллусы, эмбриоиды и растения-регенеранты с небольшой частотой (Хамукова, 1994; Высоцкий, 1998, 2005; Hofer, 1999, 2004). У колонновидных слаборослых генотипов яблони такие исследования не проводились.

В настоящее время в биотехнологической работе используется также культура in vitro листовых эксплантов. Этот метод применяется в области генной инженерии, для выделения изолированных протопластов из мезофилла и гибридизации соматических клеток, для изучения действия физиологически активных веществ, механизма перехода клеток к дедифференциации, в системах микроразмножения и оздоровления ценных генотипов. Для этого необходимо наличие надежных методов регенерации растений из листовых эксплантов. В связи с этим данное направление исследования также является актуальным для колонновидных слаборослых генотипов яблони.

Метод клонального микроразмножения служит для оздоровления и быстрого размножения ценных генотипов растений. Основными преимуществами данного метода являются возможность получения необходимого числа растений из небольшого количества исходного материала и сокращение сроков его получения до одного года, в то время, как при использовании традиционных вегетативных способов размножения у плодовых растений требуется обычно более 3 лет. Имеется ряд исследований по клональному микроразмножению яблони (Верзилин, Иванов и др., 1998; Самусь, Семенас, 2006; Матушкина, 2008). Однако для колонновидных слаборослых генотипов яблони метод кло-

нального микроразмножения разработан недостаточно.

Цель и задачи исследований. Цель работы - разработать эффективные методы получения регенерантов из эксплантов различного происхождения ко-лонновидных слаборослых генотипов яблони в культуре in vitro.

Задачи исследований:

1. Изучить влияние генотипа, состава питательных сред, стадии развития пыльцы, холодовой предобработки пыльников на андрогенез in vitro.

2. Выделить генотипы с высоким андрогенетическим потенциалом.

3. Подобрать условия успешной стерилизации листовых эксплантов в культуре in vitro.

4. Индуцировать в культуре листовых эксплантов морфогенетические процессы.

5. Определить факторы культивирования, обеспечивающие высокую эффективность микроклонального размножения.

6. Разработать условия для активного размножения и укоренения in vitro.

7. Определить морфогенетический потенциал колоновидных слаборослых генотипов яблони

8. Усовершенствовать условия адаптации растений-регенерантов к открытому грунту.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Приемы индукции каллусо- и морфогенеза в культуре in vitro изолированных пыльников колонновидных слаборослых генотипов яблони.

2. Условия получения регенерантов в культуре листовых эксплантов.

3. Микроклональное размножение, укоренение и адаптация к условиям in

vivo.

Научная новизна. Впервые для колонновидных слаборослых генотипов яблони разработаны биотехнологические приемы получения первичных андро-генных новообразований, а также регенерантов из листовых эксплантов и почек.

Выявлены генотипы с высокой, более 40%, способностью образования андрогенных каллусов. Определена наиболее благоприятная продолжительность холодовой предобработки пыльников (6 и 9 суток), которая оказывает положительное влияние на выход андрогенных образований. Установлено, что стадия микроспоры является лучшей для индукции андрогенеза in vitro у колонновидных слаборослых генотипов яблони.

Подобраны оптимальные сочетания физиологически активных вешеств, и на этой основе разработаны питательные среды, эффективные для высокого выхода каллусов и растений-регенерантов из листовых эксплантов и апикальных почек. Разработаны условия для активного размножения и укоренения in vitro колонновидных слаборослых генотипов яблони.

Подобраны условия успешной адаптации in vivo регенерантов колонновидных слаборослых генотипов яблони.

Практическая значимость. Для практического использования в селекционно-генетической и биотехнологической работе рекомендуются колонно-

видные слаборослые генотипы яблони - IV, VII, VIII, обладающие способностью к андрогенезу in vitro, регенерации в культуре листовых эксплантов и микроклональному размножению. Разработана методика получения регенеран-тов колонновидных слаборослых генотипов яблони из эксплантов различного происхождения.

Апробация работы. Результаты исследований были поддержаны Фондом содействия развития малых форм предприятий в научно-технической сфере (СТАРТ-2011) в виде гранта в 2011 году. Основные результаты исследований были доложены на конференции «Молодежное инновационное предпринимательство ЦФО» (Липецк, 2011). Там же в рамках заседания Общественного Совета при Полномочном Представителе Президента Российской Федерации в ЦФО награждена грамотой, как победитель Конкурса инновационных стартап-компаний, созданных молодежью ЦФО.

Публикация материалов исследований. По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ к защите кандидатских диссертаций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 132 листах компьютерного текста и состоит из введения, 8 глав, выводов, рекомендаций производству, списка используемой литературы из 226 наименований (157 отечественных и 69 иностранных). Диссертация иллюстрирована 27 рисунками и содержит 13 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методика проведения исследований

Работа проводилась в 2008-2012 годах в Государственном научно-исследовательском учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и селекции плодовых растений им И.В Мичурина.

В качестве исходных объектов были использованы растения 8 перспективных колонновидных форм яблони, полученных на основе гибридизации высокозимостойких форм селекции ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина (32-26, 18-9) производных от Якутской-1 с колонновидными формами селекции В.В. Кичины - КВ-25, КВ-5, а также со слаборослыми карликовыми формами (7-22, 9-26, 5-24).

Культивирование эксплантов, стерилизацию материала и инструментов, приготовление питательных сред, введение in vitro изолированных пыльников, листовых эксплантов, апикальных почек, их культивирование проводили по общепринятым методикам Р.Г. Бутенко (1983), Ф.Л. Калинина с соавторами (1980), О.С Жукова с соавторами (1994). Для определения стадии развития пыльцы проводили цитологический контроль путем приготовления временных ацетокарминовых давленых препаратов (Паущева, 1974).

При культивировании эксплантов применяли модифицированные среды с минеральной основой и витаминами по прописи Мурасиге-Скуга (1962), которые дополнительно включали физиологически активные вещества (ауксины,

цитокинины) в различных концентрациях и соотношениях.

Для стимуляции андрогенетических процессов при культивировании пыльников в инициальные питательные среды в качестве ауксинов вводили ИМК, 2,4-Д, ИУК, НУК в концентрациях от 0,5 до 3,0 мг/л. Из цитокининов применяли 6-БАП, кинетин - 1,0-4,0 мг/л. Концентрация сахарозы во всех средах составляла 20,0 г/л, агара 5,6-5,8 г/л. Всего было испытано 7 вариантов инициальных питательных сред для индукции андрогенных новообразований. Пробирки с посеянными пыльниками содержали в темноте при температуре +24...+26°С и относительной влажности воздуха 60-70%. Оценку интенсивности пролиферации каллусной массы проводили по пятибалльной шкале на инициальных питательных средах, применяя методику В.Г. Леонченко с соавторами (2007).

Холодовую предобработку проводили до их инокуляции из бутонов, которые содержали в чашках Петри в холодильнике при температуре +3...+5°С.

На этапе морфогенеза использовали среды, которые содержали ауксины ИУК или ИМК в концентрации 1,0 мг/л а также цитокинины 6-БАП, кинетин от 0,5 до 8,0 мг/л. Всего было испытано 7 сред для индукции морфогенетических процессов в андрогенных каллусах.

Проводили исследования с листовыми эксплантами, для их стерилизации использовали гипохлорит натрия («Белизна»), его раствор готовили путем соединения со стерильной дистиллированной водой в объемном соотношении 1:1,5 и 1:1, а также применяли 6% гипохлорит кальция Са(С10)г и 0,1% раствор хлорида ртути (сулема). Экспозицию обработки определяли эмпирически в зависимости от размера и возраста экспланта. Растительный материал держали в растворе стерилизатора от 40 секунд до 8 минут.

Для индукции каллусогенеза в листовых эксплантах использовали среду, которая включала: ИУК 0,5 мг/л, 2,4-Д 1,0 мг/л, НУК 0,5 мг/л, кинетин 0,5 мг/л, сахарозу 20 г/л. Было испытано 3 морфогенные среды, они содержали: ИУК 0,7-1,0 мг/л, ИМК 0,5-1,0 мг/л, БАП 2,0-6,0 мг/л, сахарозу 20,0-40,0 г/л. Как и пыльники, листовые экспланты содержали вначале в темноте, а после образования первичных структур (каллусов и почек) их выставляли на свет интенсивностью 1500-2000 люкс при 16-ти часовом фотопериоде. Через 3-4 недели полученные новообразования переносили на среду с 1,0 мг/л ИУК и 2,0-3,0 мг/л 6-БАП).

При введении в культуру in vitro апикальных и латеральных почек использовали молодые побеги, вышедшие из состояния глубокого покоя (февраль-март), а также их брали с вегетирующих растений в весенний период (конец апреля - начало мая). Для культивирования почек было испытано 2 среды, которые включали: 6-БАП 0,5-2,0 мг/л, ИУК 0,5-1,0 мг/л. Пробирки с почками помещали в условия 16-ти часового фотопериода, с интенсивностью освещения 1500-2000 люкс. Через 20-30 дней при образовании регенерантов их пересаживали на среду размножения с 1,0 мг/л ИУК и 2,0 мг/л 6-БАП.

Этап адаптации микрорастений осуществляли в малогабаритных пленочных теплицах с воздушно-капельным орошением, проводили учет выживших растений и рассчитывали частоту адаптации (в процентах).

Полученные экспериментальные данные обрабатывали с применением методов статистической обработки (Доспехов, 1985), а также с помощью программы Microsoft Office Excel 2003.

Влияние различных факторов на процесс культивирования in vitro

пыльников яблони

Проведенные исследования показали, что развитие пыльников у всех изученных генотипов яблони происходило по пути образования каллусной ткани, т.е. отмечен косвенный андрогенез, образование эмбриоидов (прямой анд-рогенез) не наблюдали. Каллусогенез, таким образом, является важной первоначальной стадией в процессе индукции андрогенеза in vitro у колонновидных слаборослых генотипов яблони. В связи с этим были изучены факторы, которые оказывают наибольшее влияние на процесс каллусообразования - это генотип исходных растений-доноров, гормональный состав инициальных питательных сред, стадия развития пыльцы, холодовая предобработка пыльников, условия формирования пыльников in vitro растений.

Генотип растений-доноров

Изучена способность пыльников колонновидных слаборослых генотипов яблони к образованию в условиях in vitro андрогенных каллусных тканей. Среди испытанных генотипов выявлены значительные различия в активности данного процесса. Частота каллусообразования колебалась от 27,6 до 17,5% (табл. 1). Наибольший выход андрогенных каллусов отмечен у форм I и V, наименьший у II и VI.

Таблица 1. Влияние генотипа яблони на каллусогенную активность пыльников

Генотип Посеяно пыльников, шт. Получено каллусов Группа по активности каллусообразования

шт. %

I 693 191 27,6±1,70 Высокая

V 547 147 26,9±1,90

IV 699 173 24,7± 1,63

VII 546 134 24,5± 1,84

III 563 136 24,2±1,81

VIII 529 104 19,7±1,73 Средняя

II 650 116 17,8±1,50

VI 594 104 17,5±1,56

Все изученные формы яблони по данному показателю условно распределили в две группы: с высокой (более 20%) и средней (менее 20%) каллусоген-

7

ной активностью пыльников. Первая группа оказалась более многочисленной, в нее вошли пять форм (I, III, IV, V, VIII) во вторую - остальные три.

Гормональный состав питательных сред

Важным фактором успешной индукции в пыльниках андрогенных новообразований, наряду с генотипом, является гормональный состав инициальных питательных сред, т.е. их качественное и количественное содержание.

Для культивирования колонновидных слаборослых генотипов было испытано 7 вариантов питательных сред с различным соотношением ауксинов и цитокининов для индукции первичных андрогенных новообразований (табл. 2).

Таблица 2. Гормональный состав инициальных питательных сред для колонновидных форм яблони

Название среды Гормональный состав (мг/л) Соотношение ауксин : цитокинин

с, ИУК, ИМК, 2,4-Д, НУК по 1,0; кинетин и 6-БАП по 2,0 1:1

с2 ИУК, ИМК, 2,4-Д, НУК по 1,0; кинетин и 6-БАП по 4,0 1:2

С3 ИУК, ИМК, 2,4-Д, НУК, кинетин и 6-БАП по 1,0 2:1

с4 ИУК 3,0, 2,4-Д 1,0 кинетин 2,0 и 6-БАП - 1,0 1,3:1

с5 ИУК, 2,4-Д, НУК, 6-БАП по 1,0 3:1

с6 ИМК, 2,4-Д, НУК по 0,5 и 6-БАП - 1,0 1,5:1

с7 ИУК, ИМК, 2,4-Д, НУК и 6-БАП - 1,0 4:1

Такой подбор сред обусловлен тем, что, как известно, преобладание ауксинов в питательных средах способствует образованию каллусных тканей, а повышенное содержание цитокининов может привести к образованию эмбрио-идов. На всех средах у изученных генотипов были получены андрогенные каллусы, случаев образования эмбриоидов отмечено не было.

Однако активность этого процесса была различной и колебалась от 9,0% (IV) до 56,8% (VIII). Выделены две наиболее продуктивные питательные среды: С6 (ИМК, 2,4-Д, НУ К по 0,5 мг/л + 6-БАП - 1,0 мг/л) и С5 (ИУК, 2,4-Д, НУК, 6-БАП по 1,0 мг/л). Среда С6 показала высокие результаты у генотипов VII и VIII, a C¡ у форм IV и VI (рис. 1).

Варианты питательных сред

Рис. 1. Эффективность каллусогенеза пыльников различных генотипов яблони в зависимости от состава питательных сред.

Стадия развития пыльцы

В исследованиях, проведенных в основном на однолетних с.-х. культурах, было установлено, что эффективность андрогенеза in vitro в значительной степени зависит от стадии развития пыльцы в момент введения пыльников в культуру. Для большинства растений наиболее благоприятной является стадия сильно вакуолизированных микроспор, на которой отмечается эмбрио- и кал-лусогенез, а иногда и формирование растений (Круглова, Горбунова, Батыгина, 1993; Куксо, 2003; Тюкавин, Наумова, 2006; Шмыкова, 2006; Бобков, 2010).

Такие исследования на колонновидных слаборослых генотипах яблони были проведены впервые. В результате было установлено, что бутоны размером 6-8 мм, которые имели слабовыраженный бело-розовый конус, окраску пыльников от зеленовато-желтой до светло-желтой, содержат пыльцу на стадии микроспор (одноядерную). Зеленые бутоны размером менее 6 мм с зеленоватыми пыльниками имели пыльцу на стадии тетрад. У бутонов с хорошо выраженным бело-розовым конусом и размером более 8 мм присутствовали желтые пыльники в основном с двуядерной пыльцой.

Культивирование in vitro пыльников с разными стадиями развития пыльцы проводили на среде С6: ИМК, 2,4-Д, НУ К по 0,5 мг/л, и 6-БАП - 1,0 мг/л. На всех изученных стадиях у колонновидных слаборослых генотипов были получены каллусы с частотой от 7,2 до 34,5% (табл. 3).

Наибольшее их количество у всех генотипов отмечено на стадии микроспор и составило от 16,8% (форма VI) до 34,5% (IV). Наименьший выход каллусов получен при культивировании пыльников на стадии тетрад от 7,2% (форма VIII) до 17,2 (IV). Двуядерная стадия развития по этому показателю заняла у всех форм промежуточное положение. Частота каллусообразования на этой стадии колебалась от 14,2 (VI) до 31,3% (IV). Таким образом, установлено, что культивирование пыльников колонновидных форм яблони следует проводить на стадии микроспор с размером бутонов от 6 до 8 мм.

Таблица 3. Интенсивность каллусообразования пыльников яблони в зависимости от стадии развития пыльцы в условиях in vitro (2011-2012 гг.)

Форма Стадии развития пыльцы

тетрады микроспора двуядерная

посеяно пыльников, шт. получено каллусов, % посеяно пыльников, шт. получено каллусов, % посеяно пыльников, шт. получено каллусов, %

IV 235 17,2±2,07 313 34,5±2,69 284 31,3±2,75

VI 136 10,7±2,65 279 16,8±2,24 238 14,2±2,26

VII 176 12,5±2,04 191 31,4±3,36 148 24,6±5,54

VIII 116 7,2±2,40 202 24,3±3,02 163 15,7±2,85

Холодовая предобработка пыльников растений-доноров

Для повышения выхода первичных андрогенных структур (каллусов, эм-бриоидов) в культуре изолированных пыльников используют такой прием, как холодовая предобработка - воздействие низкими положительными температурами (+3°...+5°С) на бутоны до инокуляции из них пыльников. Ее продолжительность видоспецифична и может варьировать в широких пределах - от 1 до 15-ти и более суток (Атанасов, 1993; Xynias et al., 2001; Галиева и др., 2005).

Изучено влияние низкими положительными температурами (+3° ... +5°С) на андрогенную активность колонновидных слаборослых генотипов. Были испытаны следующие экспозиции холодовой предобработки: 0 (контроль), 1, 3, б и 9 суток. Предобработку пыльников проводили накануне их введения в культуру in vitro. Во всех вариантах опыта отмечено каллусообразование, однако активность его была различной (рис. 2).

Экспоэицияхолодовой предобработки, сут.

—•—[V (32-26x5-24) —я ■ VI (18-9*5-24) ■■■»■■ VII (7-22*32-26) --•—VIII (32-26*5-24)

Рис. 2. Влияние холодовой предобработки пыльников на каллусогенез яблони в условиях in vitro. 10

У двух форм VI и VII холодовое воздействие приводило к снижению кал-лусогенной активности во всех опытах. Наибольшим оно было при экспозиции 6 суток. У формы VIII только одна экспозиция (1 сутки) вызывало снижение выхода каллусов (22,9 %), остальные экспозиции увеличивали их выход. Самым высоким (в 1,4 раза) он был при экспозиции 6 и 9 суток. Стимуляция активности данного процесса наблюдалась также у генотипа IV при экспозиции 1 сутки (23,8 %).

Отмечена индивидуальная реакция пыльников колонновидных слаборослых генотипов яблони на холодовое воздействие. Стимуляция каллусогенной активности пыльников возможна при экспозиции ] сутки у формы IV, а также 6 и 9 суток у формы VIII.

Условия формирования пыльников in vivo донорных растений яблони

Проведенные исследования и литературные данные свидетельствуют о том, что в общем варьировании такого признака, как способность к индукции новообразований в культуре in vitro пыльников, определенная роль принадлежит факторам внешней среды в период формирования пыльников, у однолетних растений - периодом выращивания донорных растений.

Проводимые исследования пришлись на 2009 г., который предшествовал аномальному 2010 г., и двум последующим за ним годам. 2010 год, включая май - месяц последних этапов формирования пыльников и сбора бутонов, характеризовался экстремально высокими (до 40°С) температурными режимами, низкой относительной влажностью воздуха (не более 50%) и минимальным количеством осадков (41 мм). В остальные годы исследований эти показатели были на уровне среднегодовых.

Полученные данные об активности каллусообразовательного процесса у пыльников изученных генотипов яблони за 2009-2012 гг. показали, неодинаковую их реакцию в разные годы (табл. 4).

Таблица 4. Активность каллусообразования у пыльников яблони в 2009-2012 гг.

Генотип Образовалось каллуса, %

2009 2010 2011 2012

I 42,8±2,97 16,0±4,23 20,2±2,97 14,6±2,82

II 18,9±2,59 30,9±3,96 5,4±1,86 16,7±3,19

III 46,9±4,14 13,8±3,30 15,4±2,73 19,4±3,42

IV 43,0±3,23 19,8±3,62 9,1±2,05 20,5±3,34

V 29,0±3,52 9,6±2,89 38,8±4,05 25,0±3,77

VI 15,4±2,50 24,2±3,85 10,2±2,79 18,1±3,21

VII 34,2±3,93 7,6±2,20 17,9±3,31 17,4±3,45

VIII 20,8±3,27 8,4±2,15 39,7±4,54 13,0±3,51

У половины генотипов (I, III, IV, V, VII) самая высокая каллусогененная активность пыльников (34,2-46,9%) отмечена в 2009 г. Эти генотипы, а также формы V и VIII показали наиболее низкую активность этого процесса (7,6-16,0%) в 2010 году. У формы IV дальнейшее снижение наблюдалось и в 2011 г. Только у двух генотипов - II и VI в 2010 г. активность каллусогенеза была самой высокой. Однако в 2011 г. они показали наименьшую частоту кал-лусообразования - 5,4 и 10,2% соответственно. В 2012 г. этот показатель у ко-лонновидных форм имел более выровненные, чем в предыдущие два года значения, максимально низких показателей не отмечено. Лучшую способность не только восстанавливать, но и повышать андрогенную активность пыльников, после воздействия на донорные растения экстремальными факторами внешней среды показали формы V и VIII, которые в 2011 году вышли на свою самую высокую активность каллусообразования.

Морфологические особенности андрогенных каллусов колонновидных слаборослых генотипов яблони

В ходе исследований была проведена морфологическая оценка андрогенных каллусов восьми колонновидных форм яблони. Основными ее критериями служили: окраска, плотность, активность нарастания каллусной массы. Большинство полученных каллусов имело плотную морфогенную структуру, они быстро зеленели на свету и долго сохранялись в культуре. Среди них отмечено небольшое количество (1,0-1,4%), которые с течением времени превращались в рыхлые (рис. 3). Они наблюдались у форм VIII, VII, VI.

Рис. 3. Перерождение плотного каллуса в рыхлый (У) и его потемнение (2).

В целом наибольшая активность нарастания каллусной массы (более 4 баллов) отмечена у генотипов VII, VIII, VI на среде С6 у формы IV - С5. (рис. 4).

Проводимые исследования показали, что активность нарастания каллусной массы не всегда является показателем их морфогенной способности.

01 (1:1) С2 (1:2) С3(2:1) С4 (1,3:1) С5 (3:1) С6 (1,5:1) С7 (4:1) Варианты питательных сред

Рис. 4. Морфологические особенности андрогенных каллусов колонно-видных форм яблони в зависимости от гормонального состава инициальных питательных сред.

Таким образом, наибольший выход светлых быстро зеленеющих на свету каллусов способных к дальнейшему морфогенетическому развитию дают среды С4 ,С5 и С6. Эти каллусы в перспективе могут быть источником получения реге-нерантов.

КУЛЬТУРА IN VITRO ЛИСТОВЫХ ЭКСПЛАНТОВ

Культура in vitro листовых эксплантов используется как метод для размножения определенных видов растений. Большое значение культура изолированных листьев имеет для выделения изолированных протопластов из мезофилла и последующей их гибридизации с целью получения новых генотипов. Культура сегментов листьев, в том числе яблони, используется для разработки эффективных систем трансформации. Известны работы по культуре in vitro листовых эксплантов плодовых и ягодных культур (Высоцкий, 2008; Соловых, 2009). Однако у гибридов, полученных от скрещивания колонновидных слаборослых генотипов, такие исследования не проводились.

Стерилизация листовых эксплантов и введение их в культуру

Стерилизация исходного растительного материала (листовых эксплантов), взятого из природных условий, является важным этапом, так как его поверхностные ткани заражены грибами и их спорами, а также бактериями.

В работе с листовыми эксплантами исследователи чаще всего применяют целые листовые пластинки первых трех настоящих листочков размером 1-1,5 см с небольшим черешком до 0,5 мм. Их сбор проводили преимущественно в первой половине мая.

В качестве стерилизующего агента использовали «Белизну» в разведении водой 1:1,5 и 1:1, а также 6% р-р гипохлорита кальция длительность обработки 5 мин., так как более продолжительная обработка, вызывала сильную некроти-

зацию материала и делала его непригодным для дальнейшего использования в экспериментах. Экспозиции меньше 5 мин. приводили к сильному инфицированию исходного материала (более 90%).

Изучение влияния на выход стерильных эксплантов раствора «Белизна» 1:1,5 показало большой разброс показателей в зависимости от исходного генотипа (табл. 5).

Таблица 5. Влияние раствора «Белизна» 1:1,5 на выход стерильных эксплантов яблони

Название формы Количество эксплантов, шт. Заражено, шт. % заражения

1 90 4 4,4±2,16

11 90 50 55±5,30

III 90 0 0

IV 90 64 71,1±4,78

V 90 5 5,5±2,40

VI 90 54 60,0±5,16

VII 90 0 0

VIII 90 25 27,8±4,72

Всего 720 202 27,5±1,68

Средний показатель заражения составил 28,1%. Процент заражения колебался от 0 (формы III и VII) до 71,1% (форма IV). Это указывает на то, что уровень инфицированное™ зависит не только от стерилизующих агентов, но и от генотипических особенностей исходных форм. «Белизна» в разведении 1:1 давала показатели инфицированности от 35,6% (форма VI) до 78,8% (форма II) (табл. 6).

Таблица 6. Влияние стерилизующих агентов на выход стерильных эксплантов яблони («Белизна» 1:1)

Номер формы Количество эксплантов, шт. Заражено, шт. % заражения

II 90 71 78,8±4,31

IV 90 66 73,3±4,66

VI 90 32 35,6±5,05

VIII 90 34 37,8±5,11

Всего 360 203 56,4±5,23

При использовании в качестве стерилизующего агента гипохлорита кальция была отмечена наибольшая инфицированность объектов. Процент заражения колебался от 43,3% (форма III) до 75,5% (IX) (табл. 7).

Таблица 7. Влияние стерилизующих агентов на выход стерильных эксплантов яблони (6% гипохлорит кальция)

Номер формы Количество эксплантов, шт. Заражено, шт. % заражения

I 90 62 68,8±4,88

III 90 39 43,3±5,22

V 90 62 68,8±4,88

VII 90 45 50±5,27

IX 90 68 75,5±4,53

Всего 450 276 61,3±5,13

В среднем выход стерильных эксплантов при обработке водным раствором «Белизны» 1:1,5 составил 72,5 %, при соотношении 1:1 -43,6%, у гипохлорита кальция - 38,7% (рис. 5).

а. а> н о

80 i 70 -60 -50 40 30 20 10 0

72,5

43,6 .....Т.

38,7

..„Т.

Белизна 1:1,5 Белизна 1:1 6% гипохлорит Тип и концентрация стерилизатора

Рис. 5. Эффективность различных стерилизующих агентов на листовых эксплантах яблони.

Уровень инфицированное™ зависит также от генотипических особенностей исходных форм. Наименее инфицируются в условиях in vitro листовые экспланты форм III и VII. Таким образом, установлено, что лучшим стерилизующим агентом колонновидных слаборослых генотипов яблони является раствор «Белизны» в разведении 1:1,5 при экспозиции 5 мин.

Индукция процессов каллусо- и морфогенеза

Изучали способность листовых эксплантов колонновидных форм яблони к каллусо- и морфогенезу. В качестве культуральных сред для каллусогенеза было испытано 3 варианта сред с добавлением ауксинов и цитокининов в различных соотношениях и следующих концентрациях: ИУК 0,5-1,0 мг/л, 2,4-Д 1,0-2,0 мг/л, кинетин 0,5-1,5 мг/л, 6-БАП 1,0-3,0 мг/л, ИМК 0,5-1,0 мг/л. Среди них были выделены наиболее продуктивные.

Лучшей для индукции и пролиферации каллусной ткани оказалась среда, содержащая ИУК 1,0 мг/л, 2,4-Д 1,0 мг/л, кинетин 0,5 мг/л. С целью индукции прямого органогенеза также было испытано 7 сред, в которых содержание цитокининов превышало количество ауксинов в 1,5-3,0 раза (в качестве цитокининов использовали 6-БАП 0,5-3,0 мг/л, ИУК 0,5-1,5 мг/л, ИМК 0,5-1,0 мг/л). Из них была выделена питательная среда, которая дает наибольший выход почек способных к дальнейшей регенерации, она содержала - ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,5 мг/л, 6-БАП 3,0 мг/л. У форм VII и VIII образовались настоящие почки (35 и 15% соответственно) и развились регенеранты у формы VII (табл. 8).

Таблица 8. Активность нарастания каллусной массы и регенерация из листовых эксплантов колонновидных форм яблони на среде органогенеза

Форма, происхождение Число эксплантов, шт. Средний балл нарастания каллусной массы Регенерация, %

I 20 2,2 0,0

II 20 4,0 0,0

III 20 4,5 0,0

IV 20 3,0 0,0

V 20 4,3 0,0

VI 20 3,5 0,0

VII 20 4,5 35,0

VIII 20 3,5 15,0

IX 20 3,5 0,0

Всего 180 3,7 5,6

Таким образом, для листовых эксплантов нами подобраны среды: для каллусогенеза - ИУК 1,0 мг/л, 2,4-Д 1,0 мг/л, кинетин 0,5 мг/л и прямого органогенеза для получения растений-регенерантов - ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,5 мг/л, 6-БАП 3,0 мг/л.

МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ КОЛОННОВИДНЫХ СЛАБОРОСЛЫХ ГЕНОТИПОВ ЯБЛОНИ

Микроклональное размножение - одно из направлений в биотехнологии, которое используется для получения безвирусного посадочного материала, размножения растений, трудно размножаемых традиционными способами. Этот метод позволяет добиваться высоких коэффициентов размножения растений, проводить работы в течение всего года и экономить площади, необходимые для выращивания посадочного материала.

Отработана методика клонального микроразмножения колонновидных слаборослых генотипов яблони. Установлено, что для этих целей следует использовать апикальные почки размером 0,3-0,4 см, их стерилизацию лучше проводить 0,1% раствором сулемы в течение 1 мин. Выход стерильных неповрежденных эксплантов составляет при этом в зависимости от генотипа от 39 (I форма) до 75% (VII). Использование в качестве стерилизующего агента раствора «Белизны» в разведении 1; 1,5 и экспозиции 5 мин, показавшие хорошие результаты на листовых эксплантах, для почек оказалось неблагоприятным, т.к. при дальнейшем культивировании они не раскрылись.

Проведенные исследования показали, что для снятия апикального доминирования и стимуляции заложения дополнительных почек результаты дает включение в инициальную питательную среду 0,5 мг/л 6-БАП. Наиболее активно развивались на этой среде почки VII и VIII форм, наименее I и V.

На этапе собственно микроразмножение 1-й пассаж были испытаны 3 варианта питательных сред с различными концентрациями 6-БАП (табл. 9).

Таблица 9. Коэффициент размножения микропобегов яблони на средах с различными концентрациями 6-БАП

Форма Концентрация 6-БАП в питательной среде, мг/л

0,5 1,0 2,0

I 0,5 0 0

III 1,3 0 0,3

IV 0 1,2 15,5

V 0 0 0

VI 0,5 0,8 0

VII 8,2 0 0

VIII 19,0 4,0 0

Проведенные исследования показали, что колонновидные слаборослые генотипы яблони обладают различной способностью к микроклональному размножению. Наименее отзывчивой была форма V, у которой ни в одном варианте опыта не было получено дополнительных побегов. Незначительное их количество получено у формы I только в варианте с концентрацией 6-БАП 0,5 мг/л.

Лучшие показатели по выходу дополнительных побегов получены у форм VIII на среде 0,5 мг/л 6-БАП и IV (2,0 мг/л 6-БАП). Среда с 0,5 мг/л 6-БАП оказалась также благоприятной для формы VII. Таким образом, успех клонального микроразмножения у колонновидных слаборослых генотипов яблони зависит от конкретного генотипа, то есть от его генетических особенностей.

Для укоренения образовавшихся микропобегов были испытаны концентрации ИМК 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 мг/л. Проведенные исследования показали, что у всех изученных генотипов наиболее активное корнеобразование — от 31,0 (VIII форма) до 54,1% (IV) дает присутствие в питательной среде ИМК в концентрации 1,0 мг/л. Близкие показатели по укоренению (32,8 - 43,8%) получены также при концентрации 0,5 мг/л. Более высокие концентрации ИМК (2,0 и 3,0 мг/л) приводили к образованию на базальном участке микропобегов каллуса, это вызывало снижение укореняемости и, как следствие этого, снижало жизнеспособность регенерантов, что приводило в целом к снижению укореняемости микропобегов. Минимальной (20,1-28,7%) она была у всех генотипов при 3,0 мг/л ИМК.

Таким образом, для укоренения in vitro миропобегов колонновидных слаборослых генотипов яблони следует использовать концентрации ИМК 1,0 и 0,5 мг/л.

Адаптация микрорастений к условиям открытого грунта

Заключительным этапом при получении растений методом in vitro из экс-плантов различного происхождения является перенос пробирочных растений в нестерильные условия, то есть их адаптация к условиям открытого грунта. Для достижения минимальной гибели растений при их высадке необходимо учитывать целый ряд факторов, основными из которых являются: общее состояние высаживаемых растений (их рост, развитие корневой системы), состав почвенного субстрата, влажность воздуха, сроки высадки, температурный и световой режимы.

В исследованиях по адаптации к нестерильным условиям отбирали растения высотой от 3 см и более, которые имели 4-5 настоящих листочка и корни длиной 1,5 и более см. Также использовали неукорененные побеги высотой 3 см и выше. Не укорененные in vitro побеги для лучшей адаптации обрабатывали водным раствором ИМК концентрацией 50 мг/л с экспозицией обработки 30 минут. Все растения высаживали в торфоперегнойные горшочки с почвенным субстратом, состоящим из перегноя, песка и дерновой земли в соотношениях 1:1:1.

В результате проведенных исследований количество адаптированных к почвенным условиям растений составило от 10,8 до 51,4% (табл. 10).

Наибольший выход адаптированных растений получен в опытах, где использовались укорененные in vitro растения, он составил от 46,7 до 51,4 %. Побеги без корней у всех генотипов адаптировались намного хуже, показатели их адаптации составили от 10,8 до 20,6 %. Подготовленные таким образом растения высаживали в открытый грунт на постоянное место.

Таблица 10. Результаты адаптации растений-регенерантов яблони к почвенным условиям

Форма Вариант Высажено растений, шт. % адаптации

IV с корнями 35 34,3±8,02

без корней (обработка ИМК) 37 10,8±5,10

VII с корнями 30 46,7±9,11

без корней (обработка ИМК) 35 14,3±5,92

VIII с корнями 35 51,4±8,45

без корней (обработка ИМК) 34 20,6±6,94

Экономическая эффективность выращивания посадочного материала андрогенных растений яблони с применением метода клонального микроразмножения

В настоящее время колонновидные формы яблони пользуются большой популярностью, что обуславливает повышенный спрос на их посадочный материал. Это связано с высокой экономической эффективностью при их использовании как в производственных насаждениях, так и в любительском садоводстве. В связи с этим разработка методов их массового и быстрого получения весьма актуальна. Перспективным в этом направлении является получение посадочного материала через культуру in vitro. Этот метод особенно важен для колонновидных форм яблони, так как они в силу своих особенностей дают сравнительно небольшой годовой прирост побегов, что является существенным ограничителем при их размножении в питомнике методом окулировки или прививки. Культура in vitro позволяет от одного исходного экспланта (меристемы, почки) получить до 5 и более дополнительных побегов, а в последующем и растений. Таким образом, с 1 м2 культуральной комнаты можно получить от 400 исходных эксплантов до 719 адаптированных к условиям in vivo растений, полные затраты при этом равны 24172,7 руб. на 1 м2. В то время как в питомнике с такой же площади при схеме посадки 20x10 выход материала составляет около 35 растений. Потери при адаптации in vivo растительного материала отмечены на уровне 51,4 %.

Результаты расчета и сравнения экономической эффективности производства посадочного материала колонновидной яблони через культуру in vitro в условиях in vivo показали, что технология микроразмножения требует меньше капиталовложений на единицу площади с одновременно большим выходом растительного материала на этапе размножения и адаптации, что существенно

снижает себестоимость саженца со стандартной методикой, в результате чего уровень рентабельности повысился на 97,5%. Также выгода при размножении через культуру in vitro состоит в том, что готовый посадочный материал можно получить уже на 2-3 год выращивания, по сравнению со стандартным методом размножения через посадку сеянцев и дальнейшей их окулировки (3-4 года) (табл.11).

Таблица 11. Экономическая эффективность выращивания посадочного материала

Показатели Технология размножения растений-регенерантов

с применением метода in vitro в условиях in vivo

Исходное количество материала на 1 м2, шт. 400 50

Выход материала с 1 м2 теплицы или культуральной комнаты за 1 пассаж, шт. 1400 35

Выход адаптированных стерильных растений после доращивания in vivo, шт. 719 —

Полные затраты, руб. 24172,7 1573,2

Себестоимость, руб. 33-62 44-95

Средняя цена реализации, руб./шт. 130 130

Стоимость валовой продукции, руб. 93470 4550

Прибыль, руб. 69297,3 2976,7

Уровень рентабельности, % 286,7 189,2

выводы

1. В результате проведенных исследований усовершенствованы биотехнологические приемы, способствующие получению андрогенных новообразований, регенерантов из листовых эксплантов и почек колонновидных слаборослых генотипов яблони.

2. Выявлены генотипы (IV, VII, VIII формы) с высоким выходом андрогенных каллусов до 46,9% при культивировании in vitro пыльников, а также способностью к регенерации из листовых эксплантов до 35%, и микроклональ-ному размножению с коэффициентом выхода побегов-регенерантов от 8,2 (VII) до 19,0 (VIII).

3. Показано, что для повышения каплусообразующей способности пыльников и улучшения качественных показателей каллуса следует использовать две инициальные питательные среды следующего состава (в мг/л):

1) ИУК, 2,4-Д, НУК, 6-БАП по 1,0;

2) ИМК, 2,4-Д, НУК по 0,5 + 6-БАП - 1,0.

4. Наибольший выход андрогенных новообразований (до 34,5%) дает культивирование пыльников на стадии микроспор (одноядерная), имеющих размер бутона от 6 до 8 мм.

5. Установлено, что предобработка пыльников колоновидных слаборослых генотипов яблони низкими положительными температурами +3...+5 °С продолжительностью 6 и 9 суток может увеличивать выход андрогенных каллусов в 1,4 раза.

6. Выделены формы V и VIII, которые способны увеличивать андроген-ную активность пыльников после воздействия на донорные растения экстремальных факторов внешней среды.

7. Эффективной для культивирования листовых эксплантов является среда, содержащая ИУК 0,7 мг/л, ИМК 0,5 мг/л, 6-БАП 3,0 мг/л., на которой у всех испытанных генотипов были индуцированы каллусы, а у двух форм VII и VIII отмечено образование почек (до 35%) и получены регенеранты.

8. На этапе собственно микроразмножения высокий выход микропобегов дает использование почек размером 3-4 мм, при их культивировании на питательных средах с концентрациями 6-БАП 0,5 и 2,0 мг/л коэффициент размножения составляет 8,2 -19,0.

9. При укоренении побегов-регенерантов лучшие результаты (до 50%) дает присутствие в питательной среде 1 мг/л ИМК.

10. Установлено, что укорененные in vitro микропобеги лучше адаптируются к условиям открытого грунта, чем неукорененные, их приживаемость составляет более 40%.

11. Получение посадочного материала колонновидных слаборослых генотипов яблони методом клонального микроразмножения обеспечивает увеличение рентабельности на 97,5%.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА И СЕЛЕКЦИИ

1. Для практического использования в селекционно-генетической и биотехнологической работе рекомендуем колонновидные слаборослые генотипы яблони - IV, VII, VIII, обладающие способностью к андрогенезу in vitro, регенерации в культуре листовых эксплантов и микроклональному размножению.

2. В исследованиях по андрогенезу in vitro у колонновидных форм яблони следует использовать пыльники на стадии микроспор (размер бутона 6-8 мм), проводить их холодовую предобработку низкими положительными температурами +3...+5 °С продолжительностью 6 и 9 суток и культивировать на питательных средах, включающих (мг/л):

1) ИМК, 2,4-Д, НУК по 0,5 + 6-БАП - 1,0;

2) ИУК, 2,4-Д, НУК, 6-БАП по 1,0.

3. Для культивирования листовых эксплантов in vitro рекомендуется использовать питательную среду, содержащую ИУК 0,7 мг/л, ИМК 0,5 мг/л, 6-БАП 3,0 мг/л.

4. При микроклональном размножении колонновидных слаборослых генотипов яблони рекомендуется использовать апикальные почки размером 34 мм, проводить их культивирование на питательных средах с 0,5 и 2 мг/л 6-БАП. При укоренении микропобегов использовать ИМК 1 мг/л.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Савельев, Н.И. Каллусо- и морфогенез в культуре пыльников in vitro плодовых растений [Текст] / Н.И. Савельев, О.Я. Олейникова, Н.Ю. Ван-Ункан // Плодоводство и ягодоводство России. - М., 2011. - Том XXVI. -С. 262-268 (ВАК) (РИНЦ).

2. Ван-Ункан, Н.Ю. Культура in vitro листовых эксплантов колонновидных форм яблони [Текст] / Н.Ю. Ван-Ункан, О.Я. Олейникова // Плодоводство и ягодоводство России : сб. науч. работ / ГНУ ВСТИСП. - М., 2012. -Том XXXI, ч. 1. - С. 62-68 (ВАК, РИНЦ).

3. Ван-Ункан, Н.Ю. Влияние холодовой предобработки пыльников на андрогенез in vitro яблони и груши / Н.Ю. Ван-Ункан, Н.И. Савельев, О.Я. Олейникова // Вестник МичГАУ. - 2013,- №2,- С. 29-32.

Подписано в печать 30.07.2014 г. Формат 60x84 '/ ]6,

Бумага офсетная № 1. Усл. печ. л. 1,3 Тираж 100 экз. Заказ № 27

ГНУ Всероссийский НИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина Россельхозакадемии

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Ван-Ункан, Надежда Юрьевна, Мичуринск-наукоград РФ

ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПЛОДОВЫХ РАСТЕНИЙ им. И. В. МИЧУРИНА

На правах рукописи

0^201460936

Ван-Ункан Надежда Юрьевна

РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ КОЛОННОВИДНЫХ СЛАБОРОСЛЫХ ГЕНОТИПОВ ЯБЛОНИ ИЗ ЭКСПЛАНТОВ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик РАН Н.И. Савельев

Мичуринск-наукоград РФ 2014

СОДЕРЖАНИЕ стр.

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................7

1.1. Использование методов культуры in vitro органов и тканей для селекционно-генетических целей.............................7

1.2. Андрогенез in vitro сельскохозяйственных культур...............13

1.3. Влияние ряда факторов на андрогенез in vitro.......................14

1.3.1 .Влияние генотипа.......................................................15

1.3.2. Стадии развития пыльцы и влияние состава питательных

сред..............................................................................................17

1.4. Культура in vitro листовых эксплантов.................................25

1.5. Клональное микроразмножение растений...........................27

1.6. Методы адаптации пробирочных растений к нестерильным

почвенным условиям...................................................34

1.6. Биологические особенности колонновидных форм яблони......37

ГЛАВА 2. ЦЕЛЬ, ЗАДАЧИ, ОБЪЕКТЫ, МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ...............................................41

2.1. Цель и задачи исследования...........................................41

2.2. Материалы и методы исследования...................................42

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА ПРОЦЕСС КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO ПЫЛЬНИКОВ ЯБЛОНИ............... 48

3.1. Генотип растений-доноров............................................48

3.2. Влияние условий формирования пыльников in vivo донорных растений яблони на индукцию андрогенеза in vitro................................................................................50

3.3. Стадии развития пыльцы..............................................54

3.4. Инфицированность пыльников яблони в условиях in vitro...........................................................................57

3.5. Холодовая предобработка пыльников.............................59

3.6. Подбор питательных сред для индукции каллусогенеза..........62

3.7. Морфологические особенности андрогенных каллусов........68

ГЛАВА 4. ИНДУКЦИЯ ПРОЦЕССОВ МОРФОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ ЛИСТОВЫХ ЭКСПЛАНТОВ ЯБЛОНИ........................................72

4.1. Разработка приемов стерилизации листовых эксплантов и введение их в культуру...................................................72

4.2. Индукция каллусо- и морфогенеза у различных генотипов

яблони........................................................................76

ГЛАВА 5. МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ КОЛОННОВИДНЫХ СЛАБОРОСЛЫХ ГЕНОТИПОВ ЯБЛОНИ..........81

5.1. Возраст и состояние маточных растений, сроки изоляции,

размер инициальных эксплантов.................................82

5.2. Введение в культуру in vitro апикальных меристем.............85

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА ПРИЕМОВ РАЗМНОЖЕНИЯ ПОБЕГОВ-РЕГЕНЕРАНТОВ КОЛОННОВИДНЫХ ФОРМ ЯБЛОНИ В УСЛОВИЯХ IN VITRO..............................................................................89

6.1. Собственно микроразмножение......................................89

ГЛАВА 7. УКОРЕНЕНИЕ МИКРОПОБЕГОВ IN VITRO

КОЛОННОВИДНЫХ ФОРМ ЯБЛОНИ.......................................93

7.1. Адаптация микрорастений к условиям открытого грунта......97

ГЛАВА 8. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВЫРАЩИ-ВАНИЯ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА КОЛОННОВИДНЫХ СЛАБОРОСЛЫХ ГЕНОТИПОВ ЯБЛОНИ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ........................................................102

ВЫВОДЫ..............................................................................104

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................107

ВВЕДЕНИЕ

В селекционно-генетических исследованиях, проводимых в настоящее время с плодовыми и ягодными растениями, все шире применятся современные биотехнологические методы и приемы, в том числе и такие, как культура in vitro изолированных пыльников, листовых эксплантов, меристем. Их использование позволяет успешнее решать многие как фундаментальные, так и прикладные задачи. Культура изолированных пыльников (метод андрогенеза in vitro) является самым быстрым и эффективным методом получения гаплоидных, а на их основе гомозиготных растений. Использование таких растений в селекционно-генетической практике ускоряет процесс получения новых сортов, повышает эффективность генетических исследований, расширяет существующий генофонд. Это показано на ряде овощных и зерновых культур, у которых с использованием метода культуры пыльников уже получены новые высокоэффективные сорта. Однако у плодовых культур, в частности яблони, метод андрогенеза in vitro разработан недостаточно. Лишь у отдельных генотипов получены андрогенные каллусы, эмбриоиды и растения-регенеранты с небольшой частотой.

Метод культуры пыльников (андрогенез) позволяет быстро получать гаплоидные, а на их основе и гомозиготные растения и линии. Разработка таких методов важна для плодовых культур, особенно для яблони, в связи с тем, что она имеет сложную гетерозиготную природу, многолетний цикл развития и не может репродуцироваться из семян. Однако исследования по культуре изолированных органов и тканей в частности пыльников яблони не многочисленны (Hofer М., 1994,1999., Савельев, Олейникова и др., 2009). Остаются недостаточно изученными вопросы, связанные с индукцией морфогенеза, как прямого, так и непрямого.

Интерес к явлению гаплоидии все более возрастает, особенно в последнее время, когда с особой остротой встал вопрос сокращения сроков выведения новых сортов и гибридов, наиболее полно отвечающих современным требованиям производства. Управление явлением гаплоидии открывает перспективы не только в совершенствовании существующих, но и в разработке новых путей и методов генетики, в коренной реконструкции культурных растений.

В связи с этим исследование андрогенеза in vitro у плодовых растений, в частности у колоновидных форм яблони, является актуальным.

В настоящее время в биотехнологической работе используется также культура in vitro листовых эксплантов. Этот метод применяется в области генной инженерии, для выделения изолированных протопластов из мезофилла и гибридизации соматических клеток, для изучения действия физиологически активных веществ, механизма перехода клеток к дедифференциации, в системах микроразмножения и оздоровления ценных генотипов. Для этого необходимо наличие надежных методов регенерации растений из листовых эксплантов. Однако у колонновидных форм яблони такие методы недостаточно разработаны.

Метод клонального микроразмножения служит для оздоровления и быстрого размножения ценных генотипов растений (Рыбалко, 1991; Коршун, Муратова, Иванов, Тугарев, 1996; Дорошенко, 1998; Орлова, Юшев, 2000; Ломовская, 2003). Основными преимуществами данного метода является возможность получения необходимого числа растений из небольшого количества исходного материала и сокращение сроков его получения до одного года, в то время, как при использовании традиционных вегетативных способов размножения у плодовых растений требуется обычно более 3 лет. Имеется ряд исследований по клональному микроразмножению яблони (Верзилин, Иванов и др 1998 г,. Самусь., Семенас 2006 г, Матушкина, Пронина автореферат 2008 г) Однако условия культивирования,

разработанные для одних генотипов, часто оказываются неэффективными для других и требуют дополнительных исследований. Воспроизводимость результатов часто бывает весьма низкой.

Особое место в современном плодоводстве занимают колонновидные формы яблони, которые имеют несомненные биологические преимущества по сравнению с обычными сортами. Они отличаются небольшой, не более 2,5 метров высотой, особым типом кроны - без бокового ветвления, ранним, уже с первого-второго года посадки, вступлением в плодоношение, необычно высокой продуктивностью в 5-6 раз превышающей обычные сорта. (Кичина, 2006) Все это делает данные формы яблони ценными для селекционно-генетических и биотехнологических исследований. Однако многие вопросы, связанные с культурой in vitro пыльников, листовых эксплантов, меристем изучены у них недостаточно, в первую очередь - возможности индукции процессов морфогенеза с учетом их биологических особенностей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Приемы индукции каллусо- и морфогенеза в культуре in vitro изолированных пыльников колонновидных слаборослых генотипов яблони.

2. Условия получения регенерантов в культуре листовых эксплантов колонновидных форм яблони.

3. Микроклональное размножение, укоренение и адаптация к условиям in vivo.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование методов культуры in vitro органов и тканей для селекционно-генетических целей

Использование современных биотехнологических методов, таких как культура in vitro пыльников, листовых эксплантов, верхушечных меристем позволяет решать важные селекционно-генетические задачи такие, как ускорение селекционного процесса, создание нового ценного для генетики и селекции исходного материала.

В настоящее время для совершенствования традиционного селекционного процесса, важное значение приобретает использование биотехнологических методов и приемов, в частности, таких, как культивирование в системе in vitro клеток, тканей и органов растений, направленных на сокращение сроков создания ценных генотипов. Клеточные технологии в селекционной работе можно разделить на две группы: 1) облегчающие и ускоряющие традиционные процессы; 2) создающие генетическое разнообразие и скрининг генотипов с ценными признаками (Бутенко, 1986; Расторгуев, 2009). Одним из таких методов является культивирование in vitro изолированных пыльников и пыльцы (андрогенез in vitro). Основы этого метода заложены Гуха и Магешвари в 1964 г., когда впервые была достигнута индукция гаплоидных эмбриоидов, а затем и целых растений из пыльцы у Datara innoxia (Maheshwari S. С., Rashid A., Gyagi A., 1982). Было установлено, что в условиях in vitro микроспора может отклониться от нормального, гаметофитного пути развития и перейти к спорофитному. Андрогенез in vitro - процесс образования гаплоидного растения (спорофита) из микроспоры или клеток пыльцевого зерна (гаметофита высших растений) - можно охарактеризовать как одно из самых значительных открытий в биологии растений второй половины XX века (Круглова, Горбунова, 1997).

Основной интерес к культуре пыльников связан с тем, что это эффективный способ получения гаплоидов. Гаплоидия - процесс, приводящий к получению растений, у которых в хромосомном наборе представлена только одна из гомологичных хромосом, в результате чего общее количество хромосом уменьшено вдвое (п) по сравнению с исходной родительской формой (2п). В пыльнике содержатся тысячи микроспор, каждая из которых потенциально может дать целое гаплоидное растение (Атанасов, 1993).

Метод культуры пыльников (андрогенез in vitro) позволяет быстро получать гаплоидные, а на их основе гомозиготные растения и линии. Интерес к явлению гаплоидии все более возрастает, особенно в последнее время, когда с особой остротой встал вопрос сокращения сроков выведения новых сортов и гибридов, наиболее полно отвечающих современным требованиям производства. Управление явлением гаплоидии открывает перспективы не только в совершенствовании существующих, но и в разработке новых путей и методов генетики, в коренной реконструкции культурных растений.

Применение гаплоидных растений в селекции позволяет решать многие проблемы. 1 Прежде всего, получать константные, нерасщепляющиеся гомозиготные формы, для получения которых традиционными методами гибридизации и отбора требуется длительный инбридинг; с помощью же культуры пыльников от гибридных растений первого поколения, родители которых различались по ряду признаков, можно получать гомозиготные растения в первой генерации и, таким образом, сократить селекционный процесс на 3-4 генерации, необходимые для обычной схемы селекции (Касаева, 1988).

Использование гаплоидных растений упрощает и делает более эффективными исследования в области экспериментального мутагенеза. Это связано с тем, что у гаплоидов гены находятся в гемизиготном состоянии,

отсутствует доминирование и все гены имеют фенотипическое проявление, поэтому отбор мутантов возможен уже в первом поколении. Гемизиготное состояние гаплоидов способствует проявлению также летальных генов, которые у диплоидных форм обычно находятся в рецессиве. Такие гаплоиды, как правило, погибают на ранних этапах развития, а те, которые выживают и растут, имеют хороший внутренний генный баланс и поэтому являются ценным материалом для селекции (Lespinasse, Yves, 1987).

От гаплоидов можно получать моносомные линии и использовать их в хромосомной инженерии и цитогенетике. Гаплоидные ткани и клетки используются в клеточной селекции для получения протопластов, их слияния и образования гибридных клеток и растений (Гапоненко, 1987).

Многие виды при культивировании пыльников образуют каллусную ткань, в которой затем индуцируется органогенез, и формируются растения. Каллусная ткань может содержать, наряду с гаплоидными клетки других уровней плоидности (анеуплоидные, диплоидные, полиплоидные), что служит дополнительным источником генетической изменчивости в селекции (Савельев, Олейникова, 2009).

Разработка метода андрогенеза in vitro важна для плодовых культур, которые имеют сложную гетерозиготную природу, многолетний цикл развития и не могут репродуцироваться из семян, и поэтому являются очень трудными объектами для селекционно-генетической работы. Однако исследования по культуре in vitro пыльников плодовых не многочисленны (Савельев, Олейникова и др., 1999; Hôfer M., 1999, 2004). Остаются недостаточно изученными вопросы, связанные с индукцией первичных андрогенных образований (каллусов, эмбриоидов), а также морфогенеза, как прямого, так и непрямого.

Создание такого метода явилось бы поистине огромным достижением, позволившим значительно ускорить селекционную работу с этими культурами и повысить результативность генетических исследований.

Работы по культуре пыльников плодовых растений проводятся в Германии, Франции, Китае и других странах, но достигнутые результаты весьма ограничены: только у отдельных генотипов получены с небольшой частотой андрогенные новообразования - каллусы, эмбриоиды различного уровня плоидности и побеги-регенеранты, среди которых обнаружены удвоенные гаплоиды (Hôfer M., 1994, 1999). Определенные положительные результаты получены при культивировании in vitro пыльников земляники (Хамукова, 1994; Высоцкий, 1998, 2005). Более значительные успехи по получению гаплоидов методом культуры пыльников достигнуты у зерновых и овощных культур. У них с помощью данного метода уже получены новые высокоэффективные сорта (Graig, 1974; Выскот, Новак, 1975; Шамина, 1981; Кучко, Маруненко, 1983; Кучеренко и др., 1986; Dayuan Wang, 1988; Соколов, Шумный, 1989; Hanre, Viola, 1990; Орлов, 1998; Анапиляев, 2000; Бобков С. В., 2002; Шмыкова Н. А., 2006; Муравлев, 2007).

Изучение вопросов гаплоидии и гомозиготности имеет особенно важное значение для такой плодовой культуры как яблоня, так как эти растения - сложные гетерозиготы, они не могут репродуцироваться из семян, имеют многолетний цикл развития и, в связи с этим, представляют трудный материал в генетических исследованиях и селекции.

Однако у плодовых растений, в том числе и у колонновидных форм яблони, еще не разработаны на основе андрогенеза in vitro массовые и надежные способы получения гаплоидов, которые обеспечили бы их применение в практической селекции и генетики. Это обусловлено тем, что у данной группы растений морфогенетические процессы индуцируются с большим трудом, характеризуются нестабильностью и плохой воспроизводимостью. У многих генотипов трудно бывает получить даже первичные андрогенные образования - каллусы, эмбриоиды. Условия получения регенерантов, разработанные для одного вида или сорта, как

правило, бывают неэффективными для другого и требуют значительных модификаций.

Метод клонального микроразмножения служит для быстрого размножения селекционно и генетически ценного материала важных сельскохозяйственных культур, в том числе плодовых и ягодных. Установлено, что на процесс клонального микроразмножения оказывают влияние генетические, физиологические, гормональные и физические факторы (Калашникова, 2003). Их необходимо учитывать при разработке оптимальных приемов более полной реализации морфогенетического потенциала эксплантов при микроразмножении растений. Однако для ряда плодовых культур, в том числе колонновидных форм яблони, метод клонального микроразмножения разработан недостаточно. Данная группа растений представляет особый интерес в связи с тем, что ее сорта наиболее полно отвечают современным требованиям интенсивного садоводства, их использование позволяет увеличить продуктивность производственных насаждений до 4000 ц/г (Watkins, Alston, 1973; Tobutt, 1985, 1994).

Культура in vitro листовых эксплантов используется ка�