Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Бактерии Azotobacter vinelandii - основа биопрепарата, обладающего фунгицидной активностью
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Бактерии Azotobacter vinelandii - основа биопрепарата, обладающего фунгицидной активностью"
На правах рукописи
ПУГАЧЕВА ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА
БАКТЕРИИ: АгОТОВАСТЕИ УШЕЕАЫБП - ОСНОВА БИОПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
03.00.07 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа-2004
Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра РАН в рамках темы «Ферменты и метаболиты почвенных и ризосферных микроорганизмов» (номер государственной регистрации: ГР № 01200210612)
Научный руководитель:
доктор биологических наук Логинов Олег Николаевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Кнреева Наиля Ахняфовца
кандидат биологических наук Положенцев Сергей Игоревич
Ведущая организация:
Башкирский Государственный Аграрный университет
Защита состоится 20 января 2005 г. в 14 часов на заседании Регионального Диссертационного Совета КМ 002.124.01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан по адресу: 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ в г. Уфе «Иммунопрепарат» по адресу: 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105.
Автореферат разослан « декабря 2004 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета,
доктор медицинских наук:
К.А. Лукманова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Способностью образовывать токсины обладают многие почвенные микромицеты, в том числе различные виды фузариев. По данным ФАО (Food and Agriculture Organization of the United Nations) 25% урожая зерновых культур загрязнено микотоксинами, которые наносят значительный вред здоровью людей (Ф. Муно и др., 2002). Приемы защиты культурных растений от грибных фитопатогенов основываются на использовании химических протравителей семян, что также приводит к загрязнению производимой продукции и окружающей среды. Создание комплексного микробиологического препарата, сочетающего возможность защиты растений от патогенов, стимуляцию их роста за счет синтеза фитогормонов и обогащения почвы азотом, является альтернативой химическим фунгицидам с точки зрения экологически чистого земледелия.
Бактерии рода Azotobacter являются эффективными стимуляторами разных видов растений (И.А. Дегтярева и др., 2001; S. Sindhu et al., 1994; А.Ф. Антипчук и др., 1985), что объясняется: их способностью фиксировать молекулярный азот; синтезировать витамины и гормоны роста (JI.H. Олюнина и др., 1999; J. GonzalezLopez et al., 1986; М. Lee et al., 1970); проявлять биоконтролирукяцую активность фитопатогенов за счет продуцирования антибиотиков (Придачина и др., 1982; Ки-mari Lakshmi et al., 1972), способностью некоторых штаммов азотобактера моби-лизовывать труднорастворимые соединения фосфора, улучшая фосфорное питание растений (V. Kumar et al., 2000; N. Narula et al., 2000; Д.П. Баженов и СЛ. Чернышев, 1999), а также ослаблять действие на прорастающие семена неблагоприятных факторов (Т.В. Лихолат и Т.К. Шишова, 2000). Использование биоудобрений на основе азотобактера способствует увеличению количества и улучшению качества урожая (J. Wyszkowska, 1999; J. Kucharski et al., 1997). Бактерии p. Azotobacter способны колонизировать ризосферу различных растений (Н.Н. Мальцева и др., 1992), а также стимулировать деятельность аборигенной микрофлоры (Пат. 2177466, РФ). Биологические препараты на основе азотобактера позволяют значительно снизить расход азотных удобрений (М. Govedarica et al., 1997). Поэтому поиск новых штаммов азотфиксирующих бактерий, проявляющих антагонистическую активность по отношению к грибным фитопатогенам, обладающих комплексом свойств благоприятно воздействующих на растения, и перспективных с точки зрения создания биопрепаратов является актуальной задачей прикладной микробиологии.
| и>
НАЦИОНАЛЬНАЯ I
Цель исследований. Выделение новых штаммов бактерий р. АгсНоЬасЛег, обладающих широким спектром антагонистической активности по отношению к фитопатогенкым микромицетам и перспективных для создания на их основе биопрепарата, для защиты сельскохозяйственных растений от болезней и увеличения урожайности. В соответствии с целью были поставлены основные задачи:
1. Выделить из почвы новые штаммы бактерий-антагонистов р. АгошЬасСег и охарактеризовать выделенные штаммы по видовой принадлежности, спектру антагонистической активности, влиянию на фитопатогенные микромицеты, уровню ншрогеназной активности.
2. Изучить природу выделяемых штаммами азотобактера метаболитов, обладающих фунгицид ной активностью.
3. Изучить в лабораторных и полевых условиях приживаемость и динамику развития популяций штаммов-антагонистов, интродуцированных в ризосферу различных растений.
4. Оценить эффективность применения выделенных штаммов азотобактера для улучшения развития культурных растений и защиты их от болезней.
Научная новизна. Выделены три новых штамма (АгоЮЬайег уте1апс!п ИБ 1, АгоЮЬас1ег уте1апс1п ИБ 3, АгоЮЬайег \чпе1апсШ ИБ 4), обладающие широким спектром антагонистической активности к фитопатогенным микромицетам.
Проведена генетическая паспортизация выделенных штаммов А.уте1апсШ.
Показано, что выделенные штаммы азотобактера продуцируют фитогормо-
ны.
Доказано, что антагонистическое воздействие штаммов А. уте1апсШ связано с продуцированием веществ антибиотической природы. Определено, что выделенные метаболиты представляют собой политиофосфаты тетрааминосахарозы и относятся к группе ранее неописанных в литературе метаболитов с антибиотической активностью. Штаммовые различия метаболита определяются величиной поли-тиофосфатного остатка.
Установлено, что интродуцированные бактерии-антагонисты способны приживаться в прикорневой зоне обработанных растений, сохраняя на высоком уровне антагонистическую и нитрогеназиую активности, не угнетая аборигенную микробиоту.
Практическая значимость. На основе штамма бактерий А.уте1апсШ ИБ 4 разработан новый биопрепарат «Азолен». Препарат предназначен для защиты сельскохозяйственных культур от грибных фитопатогенов и стимуляции роста. Проведен комплекс испытаний в условиях открытого и закрытого грунтов, опре-
деливших эффективность нового биопрепарата. В настоящее время биопрепарат «Азолен» находится на стадии регистрации в Госхимкомиссии Российской Федерации.
Апробация работы. Результаты работы доложены на XV Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2002), I и II Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003), II Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2003), II научной Internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 2003), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РФ и РБ, д.с.-х.н., профессора Ю.А.Усманова «Роль средств химизации в повышении продуктивности агроэкосистем» (Уфа, 2003), XVII Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2004), Международной научно-практической конференции «Биотехнологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, получено 2 патента Российской Федерации.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, экспериментальной части, заключения, выводов, списка используемых источников литературы и приложения. Работа изложена на 156 страницах, содержит 27 таблиц и 11 рисунков. Список использованной литературы представлен 185 наименованиями, из них 64 на иностранных языках.
Благодарности. Автор выражает признательность за помощь при выполнении работы старшему научному сотруднику лаборатории прикладной микробиологии Института биологии УНЦ РАН к.б.н. Галимзяновой Н.Ф., заведующему контрольно-аналитической лабораторией Четверикову С.П., сотруднику лаборатории биохимии и физиологии растений Института биологии УНЦ РАН к.б.н. Весе-лову Д.С., старшему научному сотруднику лаборатории молекулярной биологии и генетики Института биохимии и генетики УНЦ РАН к.б.н. Баймиеву А.Х., доценту БГАУ к.б.н. Исаеву Р.Ф.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектами исследований служили штаммы-антагонисты бактерий Azotobac-ter vinelandii, выделенные из различных почвенных образцов в лаборатории биологически активных веществ Института биологии УНЦ РАН. В качестве тест-объектов для исследования антагонистических свойств штаммов азотобактера использовали фитопатогенные грибы из Коллекции Института биологии УНЦ РАН, а также полученные из Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ).
Фенотипическую характеристику выделенных штаммов проводили с использованием стандартных методик (Берджи, 1997; E.H. Мишустин, 1968; Л.И. Рубенчик, 1960).
Генетическую паспортизацию штаммов проводили методом концевого ме-чения рестриктазных фрагментов (КМРФ) (А.Х. Баймиев и др., 1999), с использованием штаммов p. Azotobacter полученных из ВКМ.
Культуральный бульон штаммов-антагонистов, используемый в экспериментах, нарабатывали на среде 40 следующего состава, г/л: сахароза -20, дрожжевой экстракт - 0,5, К2НР04- 0,8, КН2Р04 - 0,2, MgS04 -71-ЬО - 0,2, CaS04 -2Н20 -0,1, FeCl3 - 0,001, Na2Mo04 - 0,001, вода дистиллированная - 1л.
Определение нитрогеназной активности штаммов в условиях in vitro и в условиях ризосферы растений проводили методом, основанным на восстановлении ацетилена (М.М. Умаров, 1986), наличие этилена после инкубации в атмосфере ацетилена устанавливали методом газовой хроматографии на газовом хроматографе «Кристалл Люкс 4000» с пламенно-ионизационным детектором. Определение в культуральных жидкостях штаммов азотобактера фитогормонов проводили с помощью иммуноферментного анализа (Г.Р. Кудоярова и др., 1990, 1986). Способность к расщеплению соединений фосфора определяли по наличию зон просветления вокруг бактериальных колоний на средах Пиковской и Муромцева.
Спектр антагонистической активности по отношению к фитопатогенным микромицетам определяли по наличию зон подавления роста патогенов вокруг бактериальных колоний штаммов-антагонистов при совместном культивировании на плотной картофельно-глюкозной среде (КГА). Морфологические изменения, происходящие с микромицетами иод воздействием метаболитов штаммов-антагонистов p. Azotobacter, изучали под микроскопом марки JENAMED-2 при увеличении х 4800 раз) в зоне действия бактериальной колонии после инкубации на среде КГ А в течение 48 -72ч.
Выделение метаболитов с фунгицидной активностью из культуральных жидкостей штаммов-антагонистов проводили при помощи ультрафильтрации на модулях волоконного типа "'Amicon ЗР-10" (США) с дальнейшим концентрированием ультрафильтрата путем упаривания под вакуумом. После чего изучаемые метаболиты осаждали из концентрата метанолом. Активность метаболитов определяли по способности подавлять развитие гриба Bipolaris sorokiniana. Чистоту выделенных метаболитов проверяли при помощи ВЭЖХ в системе, состоящей из насоса высокого давления модели 572Р ("Gasukuro Kogyo", Япония), детектора -рефрактометра ("Du Pont", США). Для разделения использовали колонку из нержавеющей стали с сорбентом (размер зерна 5 мкм) HP - NH2 (250x4,6 мм). В качестве элюента использовали смесь ацетонитрил : вода = 75 : 25 с расходом 1 мл/мин. Элементный состав метаболитов определяли на С, H, N - анализаторе HP Model 185 В (США). ИК - спектры записывали на спектрофотометре Specord М80 (Carl Zeise, Германия) в области 400-4000 см"1 (в вазелиновом масле). Спектры ЯМР 13С регистрировали на спектрометре Bruker AMX-III-300 (Германия) при рабочей частоте 300,13 МГц с внутренним стандартом - тетраметилсиланом (ТМС) и растворителем D20.
Для изучения динамики колонизации и выживания штаммов интродуцентов в ризосфере корней инокулированных растений был получен штамм Azotobacter vinelandii ИБ 4amp, резистентный к концентрации ампициллина в среде 1500 мкг/мл, который не утратил свойств исходного штамма. Количественную оценку интродуцентов на корнях растений проводили путем водного смыва с корней с последующим высевом на среду 40 с ампициллином.
Уровень биологической защиты от болезней и ростстимулируюшую активность изучали на злаковых и овощных культурах в вегетационных, полевых и производственных испытаниях. Обработку посевного материала проводили культу-ральными бульонами штаммов-антагонистов, полученными при культивировании на среде 40 в течение 72 ч, из расчета 1 л/т семян, что, в среднем, соответствовало 104-105 КО'Е/семя. Изучение эффективности биологической защиты пшеницы и овощных культур при применении штаммов-антагонистов оценивали по общепринятой методике.
Статистическую обработку результатов проводили, используя критерий Стьюдента на 5 % уровне значимости. Полученные экспериментальные данные были обработаны на персональном компьютере с помощью программы Excel-2000.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. НОВЫЕ ШТАММЫ-АНТАГОНИСТЫ Р. AZOTOBACTER И НАЛИЧИЕ У НИХ СВОЙСТВ, ПОЛОЖИТЕЛЬНО ВЛИЯЮЩИХ НА РАСТЕНИЯ
1.1. Выделение и фенотипическая характеристика новых штаммов бактерий р. Azotobacter - антагонистов фитопатогенных грибов
В результате скрининга из почвенных образцов было изолировано 700 штаммов микроорганизмов р. Azotobacter, из которых антагонистическую активность по отношению к Bipolaris sorokiniana проявили 8 изолятов, и только 3 штамма проявили антагонизм по отношению к патогенам, принадлежащим к роду Fusarium. По совокупности культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков новые штаммы 1, 3, 4 были идентифицированы как Azotobacter vinelandii и депонированы в Коллекцию микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН под № ИБ 1, № ИБ 3, № ИБ 4.
Изучение геномного полиморфизма ДНК штаммов методом КМРФ показало, что ДНК штамма ИБ 4 содержала 41 участок рестриктазных фрагментов ДНК совпадающих с ДНК А. vinelandii В-1617, штамм ИБ 3 - 22 участка. У штамма ИБ 1 обнаружены 11 участков, совпадающих с фрагментами А. vinelandii В-1617 (ВКМ) и 7 участков рестриктазных фрагментов, аналогичных участкам штамма Azotobacter beijerinckii В-1615 (ВКМ) (табл. 1).
Таблица 1
Фрагменты генетических паспортов штаммов полученных методом КМРФ
Штаммы Рестриктазные фрагменты ДНК
А. vinelandii В-1617 181, 183-186, 189-195, 197, 200-202, 204, 206, 209-212, 214, 215, 218, 219, 221, 224226, 229, 230-232, 234-239, 241, 242, 244-250, 252- 254, 256, 257, 260, 261, 263, 265, 266, 270, 272, 274, 275, 277-285, 287,289, 291, 292, 294- 296, 297-299, 302- 304, 306, 307, 309, 311, 314, 3.15, 317, 319, 320, 322, 323, 325, 326, 328-331, 333- 339, 341, 343345,347-350
A. chroo- coccum B-I616 236,238, 239, 241, 242, 343, 244, 247, 248, 252, 254, 256, 260, 263, 265, 269, 281, 282, 284,287,290, 293, 294, 296, 297, 302, 304, 310, 312, 318, 322, 323, 325, 327, 329, 330, 333, 335, 337, 341, 344, 345, 347, 349, 350, 352, 355-361, 363, 365, 368, 371, 374-378, 386, 387, 389, 390, 398, 399, 401- 403, 405, 408
A. beijerinckii В-1615 189, 193-195, 206, 207, 221, 222, 228, 229, 241, 249, 252, 258, 267, 269, 270, 285, 288, 289, 295, 304, 307, 311, 315, 331, 335, 338, 3.40, 342, 347-351
ИБ 1 227,229, 256, 266, 267, 272, 279, 280, 285, 306, 311, 348, 350, 351
ИБ 3 189, 194, 195, 208, 209, 228, 257, 260, 269, 276, 278, 279, 282, 285, 287, 293, 304, 305, 307, 308, 314, 321, 324, 328, 329,330, 334,335, 340, 341, 344, 346, 348, 349, 354, 357,361, 362
ИБ 4 181, 182,183, 184,185,186, 188, 188,190,192, 193, 194,195,197, 198, 199, 204,207, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 221, 222, 224, 227, 228, 230, 233, 238, 240, 242, 254, 259, 269, 274, 276, 288, 289,290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 304, 308, 309, 313, 318, 321, 323, 325, 328,329, 331, 332, 334, 341, 345,347,348, 349, 350
В таблице выделены номера фрагментов, совпадающие с фрагментами штамма Azotobacter vinelandii В-1617 (ВКМ).
Таким образом, было установлено, что ДНК выделенных штаммов по набору генетических фрагментов являются близкородственными к ДНК штамма А. vinelandii В-1617, что подтверждает результаты идентификации, проведенной традиционными диагностическими методами.
1.2. Влияние штаммов Azotobacter vinelandii на фитопатогенные микромицеты
При оценке спектра антагонистической активности новых штаммов бактерий р. Azotobacter было обнаружено, что они обладают способностью задерживать развитие микромицетов родов Bipolaris, Fusarium, Alternaria (табл. 2).
Таблица 2
Спектр антагонистической активности новых штаммов бактерий Azotobacter vinelandii (72 ч инкубации при 28°С)
Виды фитопатогенных грибов Диаметр зоны ингибирования роста гриба, мм
ИБ 1 ИБ 3 ИБ 4
Fusarium culmorum 21,0±2,1 22,0±3,0 32,0±2,5
Fusarium gibbosum 20,5±1,9 7,0±2,2 18,0±2,2
Fusarium grarninearum 11,3±1,5 8,5±2,4 14,4±1,4
Fusarium moniliforme 18,0±2,2 15,0±1,5 13,0±1,2
Fusarium nivale 9,0±1,7 5,5±2,3 9,5±0,5
Fusarium oxysporum 12,7±2,2 - 10,4±2,1
Fusarium semitectum 15,0±2,0 19,5±1,б 14,2±1,1
Fusarium solani 12,5±2,1 12,0±1,3 9,0±0,5
Fusarium avenaceum 18,0±1,3 12,0±1,7 19,0±2,3
Bipolaris sorokiniana 28,0±2,0 19,7±2,5 21,0±2,1
Alternaria alternata 30,0±4,3 - 14,0±2,0
- отсутствие зоны подавления роста тест-гриба.
При совместном культивировании штаммов-антагонистов и фитопатоген-ных грибов на чашках Петри были отмечены нарушения формирования растущего мицелия. Как видно из рис. 1, мицелий Bipolaris sorokiniana, развивающийся под воздействием метаболитов всех трех штаммов, характеризовался заметными морфологическими особенностями - увеличением объема гиф, образованием сферо-пластов на концах гиф, учащением образования септ. При воздействии антагонистов на мицелий микромицетов р. Fusarium, кроме того, наблюдалось отделение содержимого от клеточных стенок и зернистость мицелия (рис. 2). Отдельные представители р. Fusarium (F. moniliforme, F. semitectum, F. avenaceum) под действием метаболитов образовали только субстратный мицелий. У некоторых фитопа-тогенов в зоне действия антагонистов отсутствовало спорообразование.
Я*' Ч
IV ?
Рис. 1 - Влияние штаммов-антагонистов на развитие микромицета В1ро1аг1з зого1ишапа при совместном культивировании, 72 часа инкубации. Световая микроскопия. Увеличение х 4800:
а -В1ро1аш БогоЫшапа (контроль) б -АгоЮЬааег уте1агк1п ИБ 1; в -АгоюЬааег уте1апсШ ИБ 3; г -АгоЮЬа^ег уте1апсШ ИБ 4.
Ч -формирование гиф в виде нитки бус.
Рис. 2 - Влияние штаммов-антагонистов на развитие микромидетов р. Fusarium при совместном культивировании, 72 часа инкубации. Световая микроскопия. Увеличение х 4800: а - Fusarium culmorum (контроль); б - Fusaruim moniliforme (контроль) в -А. vinelandii ИБ 1 + F. culmorum; г - А. vinelandii ИБ 1 + F. moniliforme; д - А. vinelandii ИБ 4 + F. moniliforme;
Ч -формирование гиф в виде нитки бус;
В - нарушение в строении апексов (сфероила-
сты);
3 - зернистость мицелия.
Г. Г Ш&Ш Ъ
В ходе исследований было определено, что антагонистическая активность выделенных штаммов не лимитируется присутствием железа в среде. По-видимому, антифунгальные свойства культур определяются не синтезом сидеро-форов, а веществами антибиотической природы.
1.3. Характеристика новых штаммов А. уше1апсШ по наличию свойств, положительно влияющих на растения
Характеристика штаммов азотобактера по способности к синтезу фитогор-монов, уровню нитрогеназной активности при росте в жидкой культуре, возможности растворения фосфатов приведена в табл. 3.
Таблица 3
Характеристика штаммов по комплексу свойств, положительно влияющих
Штаммы Цитокини-ноподобные вещества, нг/мл ЮК ИУК, нг/мл ЮК Нитрогеназная активность, мкгМ2/мл/час Растворение минеральных фосфатов
А.угае1апсШ ИБ 1 290 490 0,655 -
А.утекпсШ ИБ 3 76,5 - 0,634 -
А.уте1апсШ ИБ 4 119 - 0,647 +
- не обнаружено. •
Обнаружено, что все штаммы обладают способностью к синтезу цитокини-нов. Индолил-3-уксусная кислота (ИУК) присутствовала в культуральной жидкости только у штамма А. уте1апсШ ИБ 1. Нитрогеназная активность всех штаммов оказалась на высоком уровне, а способность к растворению минеральных фосфатов обнаружена только у штамма А. уте1апс!и ИБ 4.
1.4. Ассоциативная азотфиксация в ризосфере растений при интродукции изучаемых штаммов АгоЮЬас1ег уте!апсШ
Изучение ассоциативной азотфиксации в прикорневой зоне растений, ино-кулированных изучаемыми штаммами, показало, что они способны активно фиксировать молекулярный азот в ризосфере на протяжении всего периода вегетации (табл. 4). Величина нитрогеназной активности в ризосфере инокулированных растений увеличивалась с возрастом растений и была значительно выше, чем в варианте без бактеризации. Вместе с тем, численность олигонитрофильных микроорганизмов и в контрольном варианте была на высоком уровне (табл. 5). Данный факт, по всей вероятности, связан с низким уровнем азотфиксации у аборигенных диазотрофов. В эксперименте было установлено, что бактеризация семян штамма-
ми-антагонистами не угнетала представителей аборигенкой микрофлоры в ризосфере растущих растений (табл. 5).
Таблица 4
Фиксация азота в ризосфере растений при обработке штаммами А. уте1апсШ
Вариант обработки Нитрогоназная активность по фазам роста, мкг Ыу'сосуд/ час
25 дней 40 дней 60 дней
Контроль (без инокуляции) 1,431 ±0,610 3,149^1,258 9,367±3,698
А. vinelandii ИБ 1 19,904cfc4,5Öl* 21,900^586* ' 315,945^12,497* .
А. vinelandii ИБ 3 27,612Ji6,581* 38.240.1=5,2(3* 30,087*4,786'
А. vinelandii ИБ 4 5,167-ьЗ,156* . '51,670«,147,* , 149,344-115,126'*
* - различия по сравнению с Контролем существенны лри р=(),95.
Таблица 5
Влияние бактеризации семян огурца на динамику численности аборигенных микроорганизмов в ризосферной зоне, КОЕ/ г корней
Вариант инокуля- Сроки отбора образцов, сут
ции 10 25 40 60 80
Численность олигонитрофильных микроорганизмов
10s 10 Ю10 109 lö7"
Контроль 1,4±0,8 4,0±1,3 15,8=1,1 26,0±4,1 6S,2±11,1
А. vinelandii ИБ 1 14» 1* 3,1±2.9 4,710 <•)* ' {. -- v "1 52,0±!2,3
А. vinelandii ИБ 3 12,2±1,8 17,2±5,9 L39,3±9,6
А.vinelandii ИБ 4 1 ' 9,4±5,0 1,2-0.3" 4I,6±8,9
Общая численность микроорганизмов
108 10 Ш17 ^ 10ш 107
Контроль 7,2±2,2 32,0±2,5 11,2±1,0 17,5±4,1 63,5±5,0
А.vinelandii ИБ 1 0-1 И" 32,6±2,5
A.vinelandii ИБ 3 9,3±3.7 т^иД*-"1 54,6±4,8
A.vmelandii ИБ 4 да ; 30.3:6,2 !0,4±0,4 40,0±8,1
* - различия по сравнению с контролем существенны при р=0,95
Таким образом, выявлено, что бактеризация семян огурца способствовала повышению в ризосфере ассоциативной азотфиксации и не оказала отрицательного воздействия на представителей аборигенной микробиоты.
2. ПРИРОДА МЕТАБОЛИТОВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ ШТАММАМИ-АНТАГОНИСТАМИ AZOTOBACTER VINELANDII
Из литературы известен лишь один антифунгальный антибиотик, продуцируемый штаммом Azotobacter chroococcum 92, по химической структуре представляющий собой метиловый эфир алифатической тетраеновой кислоты (H.H. Придачи на, 1982).
В наших исследованиях, было установлено, что на среде 40, штаммы А. vinelandii синтезировали по одному метаболиту с фунгицидной активностью, а в качестве примесей присутствовала только остаточная сахароза. Данный факт уп-
ростил схему выделения и хроматографическую оценку чистоты метаболитов (рис. 3).
Метаболиты, продуцируемые изучаемыми штаммами, были проанализированы при помощи метода спектроскопии. Наличие в спектре ЯМР 13С химических сдвигов 62.2, 63.0, 66.8, 71.7, 71.8, 78.9, 106.1 м.д. показывает, что основу метаболитов составляет молекула сахарозы, аминированная в четырех положениях (на наличие аминогрупп указывают характерные полосы поглощения в ИК-спектре на 2800-3200 см"1).
Рис. 3 - Характерный хроматографический профиль фракции после стадии упаривания (а) и выделенных метаболитов штаммов Аго1:оЬас1ег (б), обладающих фунгицидной активностью, (ВЭЖХ, рефрактометр, колонка НР - (250x4,6 мм,), элюент - ацетонитрил : вода = 75 : 25, расход 1 мл/мин), где 1 - вода, 2 - метаболит, 3 - остаточная сахароза.
Так как фосфат- и сульфатионов в исследуемых веществах обнаружено не было, то учитывая результаты элементного анализа (табл. 6) и полос в ИК-спектре, характерных для Р- и Б- связей (1296 см"1), можно говорить о наличии в структуре метаболитов политиофосфатного остатка различного состава для каждого штамма. Предполагаемая структура метаболитов представлена на рис. 4.
Таблица 6
Элементный состав метаболитов штаммов А/о1;оЬа^ег уте1апсШ, обладающих фунгицидной активностью
Культура Содержание элемента (%)
Углерод Водород Азот Сера Фосфор
А. У1пе1апс1ц ИБ 1 5,2 1,6 ОД 12,2 34,1
А. шпе1ап<Ш ИБ 3 14,3 3,0 0,1 6,8 22,5
А. ущ.е1ап<Ш ИБ 4 3,5 1,7 1,5 5,1 34,2
OH он
н-(- о- p -)- (- о- P -)-о V ц /п „ ^
о S
n=35 т=6
Рис. 4 - Вероятная структура метаболитов, продуцируемых штаммами A. vinelandii
Таким образом, было установлено, что выделенные метаболиты представляют собой политиофосфаты тетрааминосахарозы и относятся к группе ранее неописанных в литературе антибиотиков. Штаммовые различия метаболита определяются величиной политиофосфатного остатка. Минимальная ингибирующая концентрация действующего вещества метаболитов составляла 0,5-0,6 мг/мл для Bipo-laris sorokiniana. Присутствие в структуре веществ политиофосфатного остатка косвенным образом согласуется с данными о том, что бактерии рода Azotobacter при росте на молекулярном азоте в латентной фазе образуют значительное количество высокомолекулярных кислотонерастворимых полифосфатов, служащих резервом фосфора и энергии (Г.Н. Зайцева, 1965).
3. ПРИЖИВАЕМОСТЬ ШТАММА AZOTOBACTER VINELANDII ИБ 4^ В РИЗОСФЕРЕ РАСТЕНИЙ
Наличие у бактерий, относящихся к группе PGPR (Plant Growth-Promotion Rhizobacteria), способности к активной колонизации корней и длительному сроку выживания в ризосфере растения-хозяина дает им преимущество среди микроорганизмов, обладающих антагонистическими свойствами, но не конкурентных в новых условиях обитания (JLB. Кравченко, 1993; V. Caponlgro & R. Contillo, 1986).
Целью исследования было изучение колонизирующей способности штам-мма-антагониста A.vinelandii ИБ 4атр устойчивого к концентрации ампициллина в среде 1500 мкг/мл, но при этом не утратившего антагонистической активности исходного штамма. Изучение выживания интродуцированного штамма проводили в ризосфере пшеницы сорта Жница в полевом эксперименте 2003 г. (табл.7) и в модельном эксперименте на огурцах сорта Зозуля (табл. 8).
Было выявлено, что интродуцированный штамм способен приживаться и размножаться в ризосфере растений-хозяев, притом в фазах активного роста растений его численность достигала 107-109 КОЕ/г корней. Численность штамма в ризосфере огурцов была более высокой, чем на корнях пшеницы, что может быть связано, как с условиями эксперимента, так и со спецификой корневых экссудатов растений. Кроме того, установлено, что у выделенного из ризосферы штамма А.
уте1апсШ ИБ 4атр, сохранялась антагонистическая активность на протяжении всего срока эксперимента на огурцах и до фазы восковой спелости в полевом опыте на пшенице.
Таблица 7
Динамика численности штамма Аго1оЬас1ег уте1апсШ ИБ 4атр в ризосфере пшеницы
Фаза развития Численность клеток в ризосфере пшеницы, КОЕ/г корней Диаметр зоны подавления роста Вфо1апз зогокЫапа, мм
Третий лист (4,2±0,1) -10" 16,5±1,7
Кущение (3,2±0,8) ТО' 17,5±1,2
Восковая спелость (1,4±0,2) -10й -
- активность отсутствовала.
Таблица 8
Динамика численности штамма АгошЬайег уте!апсШ ИБ 4ашр в ризосфере огурца
Время, сут. Численность клеток в ризосферной зоне огурца, КОЕ/г корней Диаметр зоны подавления роста Bipolaris sorokiniana, мм
10 (3,0±1,2)-10* 15,7±0,2
25 (9,0±0,3)-10у 17,3±1,4
40 (2,4±0,2)-108 18,1±1,3
60 (8,0±2,2)-10й 19,0±2,4
90 (7,2±0,6)-10ь 18,2±3,0
Таким образом, установлено, что штамм АгогоЬайег уще1апсШ ИБ 4, способен приживаться в ризосфере инокулированных культур и сохранять антагонистическую активность к фитопатогеннам в прикорневой зоне растений.
4. ВЛИЯНИЕ НОВЫХ ШТАММОВ А. УШЕЬАШП НА РАЗВИТИЕ БОЛЕЗНЕЙ И РОСТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР
4.1. Влияния бактеризации штаммами АгойзЬа^ег уте1апсШ на развитие растений
Для изучения влияния бактеризации семян штаммами А. уше1апсШ на рост растений был поставлен модельный эксперимент на огурцах, семена которых были инокулированны изучаемыми штаммами, из расчета Ю5КОЕ/семя. На протяжении вегетации растений учитывали следующие биометрические показатели: всхожесть, начало цветения, число соцветий, количество образовавшихся завязей, высота растений (табл. 9). Было отмечено увеличение всхожести семян на 27% при обработке штаммом ИБ 1. Наиболее экономически значимой характеристикой овощных культур является способность образовывать большое количество соцветий и завязей. Появление первых соцветий было зафиксировано на 25 день с момента посадки в вариантах с обработкой штаммами А. уте1ап<1п ИБ 1 и А. уте1апсШ ИБ 4.
Влияние инокуляции, ш
Вариант обработки
Контроль (вода)
A. vinelaiidii ИБ I
A. vinelandii ИБ 3
А.
vinelandii ИБ 4
гаммами A. vinelandii на развитие растений огурц
Габлица 9
С я -CQ Cue
25
40
60
JL5 25
м
ж
2S
40
60
85 25
40
60 85
Средняя высота
растений, см
12,5±2,1
26,9±3,0
33,6±4,5
39,2±2,4
14,6±0,9
29.8:1-2.7 37.1 ±3.6
13.4±1.2
■ з ь 2 ^ 39.54^2.6
44.8±8.9
J5.J±1.4
■
38.4±4.3
51 2±5 1'
Средт
ЛИЧеС ПЮ
сониешй на 1 растении.
шг.
3 4 0 1 О I 0 4
_но
¿Von
1, 0: DM _7.2±0.3_ но
6.5±0.5
6.9±0.7 но_
-liM'il'1-
5.7±0.8
8 3±0 4*
Среднее количество записей на I растении, шг
2.0.КК5 1.7±1,1
К.оличесто |)астепнй обраноиаиших чаиячи,%
0 9
2&П .5 4 УЫ 2 +
.У±0.9
2.6±0.9
3.9±1.2
3 6±0 9"
3 О Ь2 1k
6 2-tl У
44,6_ jS9,2_ 75,3
ЖГ
75,0 100
84,3
100
100
100
loo
100
-" характеристика на данный период роста растении
* различия по сравнению с контролем существенны
отсутствовала: при р=0,95.
но - не определяли;
Образование завязей наиболее эффективно стимулировал штамм ИБ 4. На 40 день со дня посадки все растения в данном варианте смогли образовать завязи, в то время, на контрольном варианте завязи образовали только 44,6% растений. По окончании эксперимента было установлено, что в контрольном варианте завязи смогли образовать 75,4% растений, тогда как в вариантах с бактеризацией штаммами азотобактера образование завязей оказалось 100%.
Таким образом, установлено благоприятное влияние бактеризации штаммами А. У1пе1апс111 на рост и развитие растений, что очевидно связано со способностью штаммов синтезировать цитокинины и улучшать азотное питание.
4.2. Эффективность применения штаммов Azotobacter vinelandii против корневых гнилей пшеницы
В опытах in vitro было установлено, что изучаемые штаммы азотобактера проявляют антагонистическую активность в отношении возбудителей корневых гнилей пшеницы, что было подтверждено также в вегетационном эксперименте в условиях повышенного инфекционного фона. Определено, что штаммы A. vinelandii подавляли развитие гельминтоспориозной корневой гнили в среднем на 5262,6%, снижали распространение альтернариозной и фузариозной корневых гнилей с эффективностью 48,1-57,6% и 48,1-57,6%, соответственно.
1К
В полевых экспериментах (2002-2004 гг.) оценивали эффективность использования предпосевной бактеризации семян пшеницы штаммами азотобактера для защиты от корневых гнилей и стимуляции развития. Учет поражения растений пшеницы корневыми гнилями проводили в фазу полной спелости.
В 2002 г. было выявлено, что при обработке штаммом ИБ 4 распространение корневых гнилей снизилось на 9%, а защита от развития данной инфекции составила 12,3% (рис. 5). Штамм ИБ 4 также способствовал увеличению урожая на 11,2 ц/га и повышению содержания белка в зерне на 6,1%. Для штаммов ИБ I и ИБ 3 было отмечено снижение уровня распространения корневых гнилей на 3% и 1,8%, а эффективность защиты от развития болезни составила 12,7% и 16,6%, соответственно. В полевых сезонах 2003-2004 гг. было продолжено изучение А. Уше1апс1п ИБ 4, как наиболее перспективного штамма. В полевом сезоне 2003 г. биологическая эффективность защиты от корневых гнилей штаммом ИБ 4 составила 28,8%, что в 2,3 раза больше, чем в предыдущем сезоне. В 2004 г. бактеризация штаммом ИБ 4 способствовала как снижению степени развития, так и уменьшению уровня распространения инфекции. Биологическая эффективность подавления корневых гнилей составила 55,7%, что в 2 раза выше, чем в сезоне 2003 г. и в 4,5 раза по сравнению с сезоном 2002 г. Распространение инфекции было на 33,1% меньше, чем в контроле. Различия в эффективности защиты от корневых гнилей, по видимому, обусловлены погодными условиями определенного полевого сезона.
Распространение кирнспмх гнилей,
% Развитие корневых гнилей, %
В Кин-гроль
ШФнтоепорнн ЕПКощршп,
2002г 2003г 2004Г 2002г 2003г 2004г
Рис. 5- Влияние бактеризации семян пшеницы на распространение и развитие корневых гнилей
Развитие инфекции при обработке штаммом А. \те1апсШ ИБ 4 на протяжении трех полевых сезонов не превышало уровня 18%, в то время как данная величина контрольного варианта изменялась в пределах 20-38,9% . Изучаемый штамм не уступал по эффективности известному препарату «Фитоспорин».
Также, в двух полевых сезонах оценивали влияние интродукции штаммов-антагонистов на аборигенную микробиоту ризосферы пшеницы. Было установлено, что штаммы-антагонисты не оказали негативного воздействия на основные группы данной экологической ниши. Отмечено только снижение численности почвенных микромицетов в фазе активного роста растений, что объясняется антифунгальны-ми свойствами интродуцированных штаммов азотобактера. Было выявлено достоверное увеличение популяции бацилл, которое можно объяснить наличием механизма положительного взаимодействия по типу комменсализма, т.е. взаимно благоприятного влияния сопутствующих бактерий. В частности, для бактерий Azoto-bacter vinelandii был отмечен такой специфический механизм отношений с Bacillus circulans, при котором наблюдалось увеличение численности бацилл и увеличение азотфиксации в 2-3 раза (A.A. Белимов, 1992).
Таблица 10
Влияние бактеризации семян пшеницы на динамику численности аборигенных микроорганизмов в ризосферной зоне, КОЕ/ г корней (сезон 2002 г)
Вариант Общая численность. *10к Олигонитро-филы, *108 Спорообразу-ющие бактерии, *10& Микромицеты, >4 О'1
Контроль I 1,47±0,4 3,31±1,7 4,29±0,4 24.4±6,2
И 4,72±0.7 16,0±3.2 2,03±0,9 3,65±1,8
Ш 4,81±1,0 3,38±0,9 0,31±0,1 2,39+2,1
ИБ 1 1 I.OJ 1 _ '■16,44А3.4*>, , 3.82±0,5 1.2Ш-0.И
11 1.1,76*4,2» 15,31 ±2,3 ' ' ' * 5,15±1,8
III 4,05±2,0 2,96±1,9 , ■ '^.osxiis*: 1 б,53±2,2
ИБ 3 I 1,75±0,9 '12.7Ы.&' ' 2.39±1,9 ,7,49+4,2 *
II 3,44± 1,2 17,08±3,9 2,53±0,7 3,72±1,7
III 3,14±1,5 2,67±0,6 с J 5,11±3,3
ИБ 4 I • , 4^5=0,6' , ', 22 62i5.1" 12,63±2,9Г
11 4,74г.ь0,6 9,93±2,8 TM'ZA' 6.28±3,5
III 4,26±1,7 4,17±0,7 22.1*3.7 f 1 ■ 1
* различия по сравнению с контролем существенны при. р=0,95; I - фаза третьего листа; II -фаза кущения; III - фаза восковой спелости.
4.3. Влияние бактеризации штаммами азотобактера на снижение уровня заболеваний овощных культур
В модельных вегетационных экспериментах была оценена эффективность биологической защиты штаммами азотобактера от бактериоза капусты и огурцов, корневых гнилей фасоли, ризоктониоза картофеля. Наиболее высокая степень биологической защиты отмечена в вариантах с обработкой штаммами ИБ 1 и ИБ 4 (рис. 6). Эти штаммы снизили развитие бактериоза капусты на 33,5% и 31,8% и ризоктониоза картофеля на 41,2% и 31,8%, соответственно. Штамм ИБ 4 снизил уровень развития корневой гнили фасоли на 43,8 %.
а
б
ИЬ .)
Контроль 37
И1> 1 III
В
ИБ4
Г
ИЬ 51,-
Контроль
ИБ 3 33,5,
ИВ 1
20,4
порин
41,8
Ко мт-роль 61,6
45.2
Рис. 6 Влияние бактеризации штаммами Л. \'те!апсШ па степень развития болезней овощных культур, %: а - бактериоза капусты; б - бактериоза огурцов; в - корневых гнилей фасоли; г - ризоктониоза картофеля.
Таким образом, выделенные штаммы АхоюЬа^ег Уте1апс1п являются эффективными агентами биологической защиты культурных растений от болезней, вызываемых бактериями и грибами.
5. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ИСПЫТАНИЙ БИОПРЕПАРАТА «АЗОЛЕН»
На основе штамма А. утектсШ ИБ 4 создан микробиологический препарат «Азолен», на который для предприятия-производителя ГУЛ «Опытный завод» были разработаны лабораторный регламент и техническое задание на производство.
В 2002-2003 годах проведены производственные испытания биопрепарата «Азолен» на посевных площадях озимой пшеницы Мелеузовского района Республики Башкортостан, на томатах защищенного грунта в тепличных хозяйствах ГУСП «Рощинский» и ГУП «Алексеевский». Были получены положительные результаты по увеличению урожая томатов и защите озимой пшеницы от корневых гнилей.
ВЫВОДЫ
1. Выделены и охарактеризованы новые штаммы Azotobacter vinelandii ИБ 1, ИБ 3 и ИБ 4, перспективные для разработки препаратов против фитола- го-генных грибов и повышения урожая. На все изучаемые штаммы получены генетические паспорта.
2. Обнаружена новая труппа антигрибных веществ, продуцируемых бактериями вида Azotobacter vinelandii ИБ 1, ИБ 3, ИБ 4, которые, согласно данным физико-химических методов анализа представляют собой политиофосфаты тетраам иносахарозы.
3. Установлено, что штамм Azotobacter vinelandii ИБ 4шпр способен приживаться в ризосфере злаковых и овощных культур, сохраняя высокий уровень антагонистической активности.
4. Показано, что инокуляция посевного материала штаммами A. vinelandii способствует увеличению нитрогеназной активности в ризосфере растений.
5. Выявлено стимулирующее воздействие исследуемых штаммов азотобактера на рост и развитие овощных культур. Бактеризация семян пшеницы штаммом A.vinelandii ИБ 4 способствовала увеличению содержания белка в зерне на 6,1%.
6. В вегетационных и полевых опытах доказана эффективность использования новых штаммов азотобактера для защиты посевов пшеницы от корневых гнилей, альтернариоза, а также овощных культур: огурца и капусты от бактериозов, фасоли от корневых гнилей, картофеля от ризоктониоза.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Пугачева Е.Г., Исаев Р.Ф., Силищев H.H. Бактеризация картофеля против ризоктониоза // Материалы XV Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии», 7-10.10.2002 г.-Уфа: Гос. изд-во научн-техн. лит-ры «Реактив», 2002.-Т. 1.-С. 106.
2. Пугачева Е.Г., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Фунгистатическое и ростстиму-лирующее действие почвенных свободноживущих азотфиксирующих бактерий рода Azotobacter. // Материалы I Международного конгресса «Биотехнология -состояние и перспективы развития», 14-18.10.2002 г.- М., 2002.-С. 143.
3. Логинов О.Н., Пугачева Е.Г., Силищев H.H. Использование бактерий рода Azotobacter с целью защиты пшеницы от корневых гнилей и для повышения урожая // Материалы II Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов», 02-03.06.2003 г.- М., 2003.-С. 96.
4. Пугачева Е.Г., Логинов О.Н., Силищев H.H. Новое микробиологическое удобрение Азолен // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РФ и РБ, д.с.-х.н., профессора Ю.А.Усманова «Роль средств химизации в повышении продуктивности агроэкосистем», 04-06.06.2003 г.-Уфа: Изд-во БГАУ, 2003.-С. 295-297.
5. Пугачева Е.Г., Логинов О.Н., Силищев H.H. Возможность использования куль-туральной жидкости штамма Azotobcater vinelandii ИБ 1, содержащей экзопо-лисахарид, для повышения процесса нефтеотдачи // Материалы II Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 10-14.10.2003 г.- М., 2003.-4.1-С. 328.
6. Логинов О.Н., Пугачева Е.Г., Исаев Р.Ф., Силищев H.H., Бойко Т.Ф., Галимзя-нова Н.Ф. Биологические средства защиты картофеля от болезней // Аграрная наука.-2003 - №7 -С.24.
7. Логинов О.Н., Четвериков СЛ., Свешникова Е.В., Пугачева Е.Г., Васильева Н.С., Силищев H.H. Новые биопрепараты для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды //Тез. докл. семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2003», - 24-25.11.2003.- Пущино: ИБФМ, 2003. - С.74-75.
8. Свешникова Е.В., Пугачева Е.Г., Силшцев H.H., Логинов О.Н. Использование бактериальных препаратов для томатов защищенного грунта // II Всероссийская Internet-конференция «Интеграция науки и высшего образования в области органической и биоорганической химии и механики многофазных систем», 1530.12.2003 г., Уфа: Гос. Изд-во научн-техн. лит-ры «Реактив», 2003.- С.8.
9. Пугачева Е.Г., Четвериков С.П, Логинов О.Н., Силищев H.H. Исследование нитрогеназной активности бактерий рода Azotobacter vinelandii // Там же С.73.
10. Логинов О.Н., Пугачева Е.Г., Силищев H.H., Мелентьев А.И., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф. Штамм бактерий Azotobacter vinalandii для борьбы с болезнями пшеницы, вызываемыми грибными фитопатогенами, и повышения урожая // Патент РФ № 2224791, Б.И. № 6,2004.
11. Пугачева Е.Г., Логинов О.Н., Четвериков С.П, Силищев H.H. Изучение влия-
ния условий культивирования на нитрогеназную активность штаммов бактерий рода Azotobacter // Башкирский химический журнал. -2004. -Т. 11, - №2,-С. 51-54.
12. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., ПугачеваЕ.Г., Шарафутдинов A.M., Силищев
H.H. Биопрепараты для томатов в защищенном грунте // Аграрная наука.-2004. - №5. -С. 7-8.
13. Логинов О.Н., Пугачева Е.Г., Силищев H.H., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф. Штамм бактерий Azotobacter vinelandii для получения биопрепарата для борь-
бы с корневыми гнилями пшеницы и повышения количества и качества урожая // Решение Роспатента от 3.09.2004 о выдаче патента по заявке № 2003120768/13. 14. Васильева Н.С., Пугачева Е.Г., Силищев H.H., Логинов О.Н. Разработка твердой препаративной формы биоудобрения «Азолен» // Материалы XVII Международной научно-технической конференции «Химические реагенты, реактивы и процессы малотоннажной химии» (12-14.10.2004 г., Уфа). Уфа: Гос. изд-во научн-техн. лит-ры «Реактив», 2004.-С. 63-64.
15. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Пугачева Е.Г., Васильева Н.С., Силищев H.H.
Биопрепараты комплексного действия «Елена» и «Азолен» на основе микроорганизмов - антагонистов фитопатогенных грибов // Материалы Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем». 29.09.-1.10.2004 г., Краснодар.- Краснодар, 2004,-Вып 3.-С. 163-165.
16. Логинов О.Н., Пугачева Е.Г., Силищев H.H., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф. Оценка влияния штаммов бактерий-антагонистов рода Azotobacter на поражение корневыми гнилями и урожайность посевов яровой мягкой пшеницы // Сельскохозяйственная биология.-2004.-№ 5.- С. 104-108.
РНБ Русский фонд
2006-4 1772
ПУГАЧЕВА ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА
БАКТЕРИИ А20Т0В АСПЗК. УПЧЕЬАШП - ОСНОВА БИОПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
03.00.07- микробиология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Лицензия № 0177 от 10.06.96 г. Подписано к печати 10.12.2004 Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Формат 60x84 1/,б. Усл.-печ. л. 1,5. Уч.-изд, 1,7. Тираж 110 экз. Заказ № 327.
450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, Башкирский государственный медицинский университет
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пугачева, Елена Геннадьевна
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Влияние интродукции бактерий р. АгсЯоЬааег в прикорневую систему растений на их развитие и продуктивность 10 12. Бактерии рода АгоШЬа^ег продуценты биологически активных веществ и антибиотиков 22 1.3. Перспективы создания эффективных биопрепаратов на основе свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов 27 ^ 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1.Скрининг штаммов-антагонистов фитопатогенных грибов среди бактерий рода АгошЬа^ег /
2.2. Изучение фенотипических характеристик выделенных штаммов
2.3. Генетическая паспортизация штаммов методом концевого мечения рестриктазных фрагментов (КМРФ)
2.4. Определение нитрогеназной активности штаммов азотобактера при росте в жидкой культуре
2.5. Бактеризация семян КБ изучаемых штаммов
2.6. Определение ассоциативной азотфиксации в ризосфере корней инокулированных растений
2.7. Определение у штаммов азотобактера способности к синтезу индо л и л-3-уксусной кислоты и цитокининоподобных веществ и способности к разложению соединений фосфора
2.8. Изучение антагонистических свойств выделенных штаммов А. уте1апсШ
2.9. Определение структуры метаболитов штаммов А. уте1апсШ, обладающих фунгицидной активностью л 2.10. Изучение влияния бактеризации штаммами АгоЫэа^ег уте1апсШ на прорастание семян сельскохозяйственных культур
2.11. Оценка влияния бактеризации семян штаммами АгоШЬа^ег уте1апсШ на развитие овощных культур в модельных экспериментах
2.12. Оценка биологической эффективности изучаемых штаммов А. уте1апсШ против возбудителей корневых гнилей пшеницы в условиях лабораторных и полевых экспериментов
2.13. Оценка уровня биологической защиты от заболеваний овощных культур в лабораторно-вегетационных опытах при применении штаммов АгоШЬа^ег уте1апсШ
2.14. Получение ампициллинрезистентной модификации штамма Аго1оЬас1ег уте1апсШ ИБ
2.15. Изучение способности к колонизации корней растений у ампициллинрезистентного штамма Аго1:оЬас1ег уте1апсШ ИБ 4атр
2.16. Изучение способов хранения в лабораторных условиях штаммов-антагонистов рода Аго1оЬас1ег
2.17. Статистическая обработка результатов ■' 56 3. НОВЫЕ ШТАММЫ АгОТОВАСТЕЯ УШЕЬАИОИ - АНТАГОНИСТЫ ФИТОПАТОГЕНОВ И ИХ СВОЙСТВА КАК РОРЯ-БАКТЕРИЙ
3.1. Выделение и фенотипическая характеристика новых штаммов бактерий р. Аго1оЬас1ег - антагонистов фитопатогенных грибов
3.2. Генетическая паспортизация выделенных штаммов
3.3. Влияние штаммов А. уте1апсШ на развитие фитопатогенных грибов
3.4. Характеристика выделенных культур по наличию свойств, положительно влияющих на растение '
3.4.1. Нитрогеназная активность штаммов азотобактера
3.4.2. Ассоциативная азотфиксация в ризосфере растений при интродукции штаммов А. уте1ап<Ш
3.4.3. Фитогормоны, продуцируемые штаммами А. уте1ап<Ш
3.4.4. Способность штаммов азотобактера к разложению фосфатов
4. СТРУКТУРА АНТИФУНГАЛЬНЫХ МЕТАБОЛИТОВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ ШТАММАМИ AZOTOBACTER VINELANDII
5. ПРИЖИВАЕМОСТЬ ИНТРОДУЦЕНТОВ В РИЗОСФЕРЕ РАСТЕНИЙ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА АБОРИГЕННУЮ МИКРОБИОТУ
5.1. Способность штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4amp приживаться в ризосфере растений
5.2. Влияние интродукции штаммов-антагонистов рода
Azotobacter на микробиоту ризосферы пшеницы
5.3. Влияния интродукции штаммов-антагонистов A. vinelandii на микробиоту ризосферы огурца
6. ВЛИЯНИЕ НОВЫХ ШТАММОВ A. VINELANDII НА ЗАЩИТУ ОТ БОЛЕЗНЕЙ И РОСТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР
6.1. Воздействие инокуляции штаммами A. vinelandii на прорастание семян овощных культур
6.2. Влияние штаммов A. vinelandii на развитие растений в модельных экспериментах
6.3. Защита пшеницы от корневых гнилей штаммами A. vinelandii, в модельных и полевых экспериментах
6.4. Эффективность использования штаммов A. vinelandii против заболеваний овощных культур
7. ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБОВ ХРАНЕНИЯ ШТАММОВ-АНТАГОНИСТОВ
7.1. Способность штаммов Azotobacter vinelandii к синтезу экзополисахаридов
8. ПРОИЗВОДСТВЕННЫЕ ИСПЫТАНИЯ БИОПРЕПАРАТА «АЗОЛЕН»
Введение Диссертация по биологии, на тему "Бактерии Azotobacter vinelandii - основа биопрепарата, обладающего фунгицидной активностью"
Актуальность проблемы. Одним из ведущих факторов, ухудшающих агроэкологические свойства почв, является их загрязнение различными ксенобиотиками. Очевидно, что при ухудшении качества хотя бы одного из компонентов агроландшафта (вода, воздух, почва), производить безопасный, высококачественный урожай сельскохозяйственных растений весьма проблематично (Хабиров, 1993; Круговорот и баланс азота., 1979). Концепция и цели создания устойчивого, сбалансированного сельскохозяйственного производства, предложенные ФАО (Food and agriculture organization of the United Nations) в 1992 г предполагают, что первым и самым главным осуще-Йг ствлением программы является «безопасность питания», обеспечивающая выживание человечества (Соколов, 1995).
Но в то же время, фитосанитарная обстановка на полях Башкортостана продолжает ухудшаться и, в первую очередь, это происходит из-за увеличивающейся из года в год засоренности посевов, наличия вредных объектов на посевах, а также из-за дороговизны химических препаратов (Ямалеев и др., 1998; Шроль, 1990). В связи с этим разработка экологически безопасных и экономически выгодных методов защиты растений и приемов повышения почвенного плодородия является актуальной задачей.
Известно, что ряд представителей бактериального сообщества выступают в качестве антагонистов широкого спектра фитопатогенных грибов, являющихся причиной заболевания зерновых и овощных культур. Изучение свойств бактерии рода Azotobacter, как PGPR микроорганизмов, для создания биологических препаратов на их основе показало, что они являются одними из эффективных стимуляторов для разных видов растений (Дегтярева и др., 2001; Sindhu et al., 1994; Антипчук и др., 1985), что объясняется: их способностью фиксировать молекулярный азот, синтезировать витамины и гормоны роста (Олюнина и др., 1999; Gonzalez-Lopez et al., 1986; Lee et al., Ф 1970); проявлять биоконтролирующую активность фитопатогенов, за счет продуцирования антибиотиков (Придачина и др., 1982; Kumari Lakshmi et al., 1972), a также ослаблять действие на семена неблагоприятных факторов (Ли-холат и др., 2000). Кроме того, при использовании биоудобрений на основе азотобактера, было отмечено увеличение количества и улучшение качества урожая (Дегтярева и Врачев, 2001 ;Мухортов и Рябчикова, 1995) а также накопление азота в почве (Шерстобаева и др., 1997; Любимов, 1969). В связи с этим, разработка и внедрение в сельскохозяйственную практику биологичеI ских препаратов и биологических удобрений на основе штаммов PGPR бактерий рода Azotobacter, приобретает особое значение.
Цель исследования. Выделение новых штаммов бактерий p. Azotobacter, обладающих широким спектром антагонистической активности по отношению к фитопатогенным микромицетам и перспективных для создания на их основе биопрепарата для защиты сельскохозяйственных растений от болезней и увеличения урожайности.
Задачи исследования.
1. Выделить из почвы новые штаммы бактерий-антагонистов p. AzotobacI ter и охарактеризовать выделенные штаммы по видовой принадлежности, спектру антагонистической активности, влиянию на фитопатогенные микро-мицеты, уровню нитрогеназной активности.
2. Изучить природу выделяемых штаммами азотобактера метаболитов, обладающих фунгицидной активностью.
3. Изучить в лабораторных и полевых условиях приживаемость и динамику развития популяций штаммов-антагонистов, интродуцированных в ризосферу различных растений.
4. Оценить эффективность применения выделенных штаммов азотобактера для улучшения развития культурных растений и защиты их от болезней.
Научная новизна. Выделены три новых штамма (Azotobacter vinelandii ИБ 1, Azotobacter vinelandii ИБ 3, Azotobacter vinelandii ИБ 4), обладающие широким спектром антагонистической активности к фитопатогенным мик-ромицетам.
Проведена генетическая паспортизация выделенных штаммов.
Показано, что выделенные штаммы азотобактера продуцируют фитогормоны.
Антагонистическое воздействие штаммов АгоШЬа^ег уте1апсШ на фи-топатогенные микромицеты связано с продуцированием веществ антибиотической природы.
Определено, что выделенные метаболиты представляют собой поли-тиофосфаты тетрааминосахарозы и относятся к группе' ранее неописанных в литературе антибиотиков. Штаммовые различия метаболита определяются величиной политиофосфатного остатка.
Установлено, что интродуцированные бактерии-антагонисты способны приживаться в прикорневой зоне обработанных растений, сохраняя на высоком уровне антагонистическую и нитрогеназную активности, и, не угнетая аборигенную микробиоту.
Практическая значимость. На основе штамма бактерий А.уте1апсШ ИБ 4 разработан новый биопрепарат «Азолен», предназначенный для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатЬгенов и стимуляции роста. Проведен комплекс испытаний в условиях открытого и закрытого грунтов, определивших эффективность нового биопрепарата. В настоящее время биопрепарат Азолен находится на стадии регистрации в Госхимкомис-сии Российской Федерации.
Апробация работы Результаты работы доложены на XV Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2002), I и II Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003), II Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2003), II научной Мегпе!:-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 2003), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РФ и РБ, д.с.-х.н., профессора Ю.А.Усманова «Роль средств химизации в повышении продуктивности агро-экосистем» (Уфа, 2003), XVII Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2004), Международной научно-практической конференции «Биотехнологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 научных I работ, получено 2 патента Российской Федерации.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Пугачева, Елена Геннадьевна
ВЫВОДЫ
1. Выделены и охарактеризованы новые штаммы АгоШЬас^ег уте!апсШ ИБ 1, ИБ 3 и ИБ 4, перспективные для разработки препаратов против фитопатогенных грибов и повышения урожая. На все изучаемые штаммы получены генетические паспорта.
2. Обнаружена новая группа антигрибных веществ,' продуцируемых бактериями вида АгоШЬа^ег уше1апсШ ИБ 1, ИБ 3, ИБ 4, которые, согласно данным физико-химических методов анализа представляют собой политиофосфаты тетрааминосахарозы.
3. Установлено, что штамм АгоШЬа^ег уте!апсШ ИБ 4атр способен приживаться в ризосфере злаковых и овощных культур, сохраняя высокий уровень антагонистической активности.
4. Показано, что инокуляция посевного материала штаммами А. уте!апсШ способствует увеличению нитрогеназной активности в ризосфере растений.
5. Выявлено стимулирующее воздействие исследуемых штаммов азотобактера на рост и развитие овощных культур. Бактеризация семян пшеницы штаммом А.утеЛапсШ ИБ 4 способствовала увеличению содержания белка в зерне на 6,1%.
6. В вегетационных и полевых опытах доказана эффективность использования новых штаммов азотобактера для защиты посевов пшеницы от корневых гнилей, альтернариоза, а также овощных культур: огурца и капусты от бактериозов, фасоли от корневых гнилей, картофеля от ризоктониоза. '
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Современные технологии возделывания сельскохозяйственных культур основаны, главным образом, на применении химических средств защиты растений, что неизбежно приводит к загрязнению производимой продукции и окружающей среды. По последним данным, по России более 12 % образцов исследованых пищевых сельскохозяйственных продуктов и более 20 % кормов не соответствуют нормам безопасности, поскольку содержание в них ксенобиотиков, в частности пестицидов превышает предельно допустимые концентрации.
В связи с этим разработка и применение экологически безопасных методов защиты растений в интегрированной борьбе с вредителями и болезнями сельскохозяйственных растений является актуальной задачей современного земледелия.
Болезни культурных растений, вызываемые фитопатогенными грибами, уничтожают до 30 % потенциального урожая. Кроме того, заражая культурные растения, грибы загрязняют их продуктами своей жизнедеятельности - микотоксинами, которые ухудшают потребительские качества сельскохозяйственного пищевого сырья, что снижает его биологическую полноценность и безопасность. Тенденция к широкому использованию биопрепаратов в сельском хозяйстве наблюдается во всех развитых странах, где объемы применения химических препаратов в растениеводстве неуклонно снижаются.
Разработка новых типов биопрепаратов для сельского хозяйства, обладающих комплексным действием, сочетающим антагонистическую активность по отношению к фитопатогенам с продукцией биологически активных веществ стимулирующих развитие растений является важной задачей микробиологии. Новые штаммы бактерий р. АгоШЬаЛег, выделенные нами из почвенных образцов, проявляют антагонистическую активность к широкому спектру фитопатогенных грибов, вызывающих болезни зерновых и овощных культур, а также сохраняют высокую нитрогеназную активностью при интродукции в ризосферу растений.
Антагонистическая активность изучаемых штаммов А. уте1апсШ связана с продукцией веществ антибиотической природы. Вещества, обладающие фунгицидной активностью, продуцируемые штаммами А. уше1апсШ ИБ 1, ИБ 3, ИБ 4 представляют собой политиофосфаты тетрааминосахарозы и различаются только по величине полифосфатного хвоста. Антибиотические вещества с подобной структурой ранее в литературе описаны не были.
Новые штаммы бактерий-антагонистов способны синтезировать фито-гормоны типа цитокининов и ауксинов, стимулирующие развитие растений, кроме того, изученные бактерии положительно влияют на азотное и фосфорное питание растений. Совокупность положительных свойств изученных штаммов позволяют считать их перспективной основой для создания биопрепаратов нового поколения. Также, использование биопрепаратов на основе таких типичных представителей почвенной микробиоты, какими являются бактерии рода Аго1оЬас1ег, не нарушает экологического равновесия в аборигенном сообществе почвенных микроорганизмов.
Испытание разработанного биопрепарата «Азолен» в лабораторных и полевых условиях показало его эффективность для защиты пшеницы от корневых гнилей, альтернариоза. Разработанный биопрепарат также может быть использован для. подавления развития бактериоза огурцов, корневых гнилей фасоли, ризоктониоза картофеля. На штамм А. уте1апсШ ИБ 4 получено токсикологическое заключение, свидетельствующее, о его безопасности. Таким образом, применение в сельском хозяйстве биопрепарата «Азолен», обладающего комплексом свойств положительно влияющих на растение, на наш взгляд, будет способствовать улучшению фитосанитарного состояния почв при снижении химической нагрузки на агроценозы.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пугачева, Елена Геннадьевна, Уфа
1. Андреюк Е.И., Антипчук А.Ф., Рангелова В.Н., Танцюренко Е.В. Биоторфяное удобрение новый комплексный бактериальный препарат // Мпсробюл. журн. - 1999. - Т. 61, № 2. - С. 45-52.
2. Андреюк Е.И., Путинская Г.А., Антипчук А.Ф. и др. Исследование микробных сообществ почвы на разных уровнях их организации // Мжробюл. журн. 1998. - Т. 60, № 5. - С. 19-26.
3. Антипчук А.Ф., Канцелярук P.M., Скочинская H.H., и др. Влияние азотобактера на прорастание семян огурцов // Микробиол. журн. 1985. — Т. 47, №2.-С. 19-23.4»
4. Антипчук А.Ф., Рангелова В.М.и др. Вплив азотобактера на врожай та яюсть цукрових буряюв // Мпсробюл. журн. 1997. - Т.59, №4. - С. 90-94.
5. Антипчук А.Ф., Андреюк Е.И., Рангелова В.Н. и др. Ростовая активность и технологические свойства азотфиксирующих микроорганизмов при их гетерофазном культивировании // Мжробюл. журн. — 1997. — Т.59, № 4. -С. 117-123.
6. A.c. 1359272 А/ СССР, С 05 F 11/08/. Штамм Azotobacter chroococcumiдля получени бактериального удобрения под томаты / Троцкий H.A., Новицкая Н. А., Троицкая Т.М., Васильев В.М.; Заявлено 26.07.85; Опубл. 15.12.87.1. Бюл. 46.
7. A.c. 1316189 А/СССР, С 05 F 11/08, С 12 N 1/20//С 12 R 1: 065:С 12 N 1/20. Штамм бактерий Azotobacter chroococcum несимбиотический азотфик-сатор для ячменя/ Троицкий H.A., Новицкая М.А., Троицкая Т.М.; заявлено 07.06.85; Опубл. 15.03.88. Бюл. 10.
8. Айзенман Б.Е. Антибиотические свойства бактерий. — Киев: Наукова думка, 1973.- 183с.
9. Бажанов Д. П., Чернышев С.П. Растворение фосфата кальция азотфик-сирующими ризосферными бактериями // Генетика и селекция на рубеже Щ XXI в: Сб. ст. Минск, 1999. - С. 166-168.
10. Белимов A.A., Кожемяков А.П. Смешанные культуры азотфиксирующих бактерий и перспективы их использования в земледелии // Сельскохозяйственная биология. 1992. - №2. - С. 77-86.
11. Бельтюкова К.И. Влияние азотобактерина на поражаемость сельскохозяйственных растений бактериальными болезнями // Вопросы применения бактериальных удобрений: СБ. ст. Киев: АН УССР, - 1953. - С. 56.
12. Берестецкий O.A., Шерстобоев Н.К. и др. Модифицированный метод накопительных культур для выделения симбиотических азотфиксирующих микроорганизмов // Микробиол. журн. 1994. - Т.56, №3. - С. 24-27.
13. Биологический азот и его роль в земледелии / Под ред. E.H. Мишустина. М.: Наука, -1967. -368с.
14. Ваксман З.А. Антагонизм микробов и антибиотические вещества. -М.: Гос. изд. ин. лит-ры, 1947. 891с.
15. Винтика Я. Некоторые вопросы использования азотобактерина в ЧССР // Бактериальные удобрения: Сб. ст. Л.: Колос, 1964. - С. 136-150.
16. ГОСТ Р 50459-92. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения заражености болезнями. Издание официальное. Изд-во стандартов. - 1993. - С.13-18.
17. Гринберг Т.А., Смоляр С.И., Малашенко Ю.Р. и др. Микробные полисахариды и пищевая промышленность // Микробиол. ;журн. 1991. - Т.53, №5. - С. 82-96.
18. Дегтярева И.А.,Чернов И.А. Роль ассоциативной азотфиксации в повышении продуктивности небобовых культур, биологической активности почв и их плодородия // там же. С. 183-186. /
19. Доросинский Л.М. Бактериальные удобрения дополнительное средство повышения урожая. — М.: Россельхозиздат, 1965. - 174с.
20. Досон Д., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991,429 с.
21. Дьяков Ю.Т. Ограничение численности фитопатогенных грибов с учетом их жизненных стратегий // Культ, растения для устойчивого сельского хозяйства в XXI в. (иммунитет, селекция, интродукция). М., 2002. - С.46-63.
22. Егоров С.Ю., Захарова Н.Г., Акимова Ф.К. и др. А^отфиксирующие бактерии защищенного грунта // Вестник российской академиии с.-х. наук. — 1994.- №6.-С. 18-20.
23. Емцев В.Т. Ассоциативный симбиоз почвенных диазотрофных бактерий и овощных культур // Почвоведение. 1994. - №4. - С.74-84.г
24. Ефимов В.В., Воробейков Г.А. и др. Азотное питание и продуктивность гороха и кормовых бобов при обработке семян комплексом бактериальных препаратов // Агрохимия. — 1996.- № 1. С.10-15.
25. Зайцева Т.С. Биохимия азотобактера. М.: Наука, 1968. - 304 с.
26. Звягинцев Д.Г., Добровольская Т.Г., Лысак Н.В. Растения как центры формирования бактериальных сообществ // Ж. общая биология. — 1993. — Т.54, №3. С. 183-200.I
27. Звягинцев Д.Г. Почва и микрорганизмы. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1987. -256с.
28. Калько Г.В., Воробьева Н.И., Лагутина Т.М. и др. Ингибирование микробами-антагонистами фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum в торфо-грунте // Микология и фитопатология. -2001. -Т.35, вып.З. — С.66-73.
29. Каталог культур микроорганизмов. Пущино-Москва. 1992. - 363 с.
30. Карагуйшиева Д.К. Свободноживущие азотфиксаторы почв Казахстана. -Алма-Ата: Наука, 1972.-200 с.
31. Карпунина Л.В., Никитина В.Е., Сторник Г.И. Нитрогеназная активность иммобилизованных клеток Bacillus polimixa // Биотехнология. 1986. - № 2. -С. 97-101.
32. Квасников Е.И., Петрушенко О.П., Жвачкина A.A. Бактерии-азотфиксаторы в почвах Узбекистана // Микробиология на службе сельского хозяйства: Сб. ст. -М.: Сельхозгиз, 1959. С.115-120.
33. Ковальская Н.Ю., Лобакова Е.С., Умаров М.М. Формирование искусственного азотфиксирующего симбиоза у растений рапса (Brassica napus var.Napus) в нестерильной почве // Микробиология. 2001. - Т. 70, №5. -С.701-708.
34. Колешко О.И. Гидролитическая активность азотобактера // Микроорганизмы продуценты биологически активных веществ: Сб.ст. Минск: Наука и техника, 1973. - 146с.
35. Корсак И.В. Применение биологических препаратов против корневыхjгнилей огурца // Культ, растения для устойчивого сел. хоз-ва в XXI в. (иммунитет, селекция, интродукция). М., 2002. - С. 372-379.
36. Кравченко JI.B., Макарова Н.М. Кинетика колонизации корневой поверхности злаков при интродукции ассоциативных бактерий // Микробиология. 1993. - Т. 62, вып. 3. - С. 82-86.j
37. Красильников H.A. Микроорганизмы почвы и высшие растения. М.: Изд. АН СССР, 1958.-463с.
38. Кретович B.JI. Усвоение и метаболизм азота у растений. М.: Наука. -1987.-485с.
39. Кретович B.JL, Евстигнеева З.Г., Карякина Т.И., Львов Н.П. и др. Молекулярные механизмы усвоения азота растениями. М.: Наука. - 1983. -264с.
40. Круговорот и баланс азота в системе почва-удобрение-растение-вода. / Сб. науч. тр. под ред. E.H. Мишустина. М.: Наука, 1979. — 335с.
41. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каровайко Н.И. и др. ИммуноферментнаяIсистема для определения цитокининов // Физиология растений. 1990. — Т.37, вып. 1.-С. 193-199.
42. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Еркеев М.И. и др. Иммуноферментное определение содержания индолилуксусной кислоты в семенах кукурузы с использованием меченых антител // Физиология растений. — 1986. Т.ЗЗ, вып.б.-С. 1221-1227.
43. Кузнецова Т.В., Емцев В.Т., Соловьев A.A. Изучение взаимосвязи ассоциативных азотфиксаторов тритикале // Новые методы селекции и создание адаптивных сортов с.-х. культур: результаты и перспективы. Киров, 1998. -С. 199-201.
44. Курдиш И.К., Титова JI.B. Гранулированные препараты азотобактера на основе глинистых минералов // Прикл. биохимия и микробиология. 2000.1. Т.36, № 4. С. 484-487.
45. Курдиш И.К., Титова Л.В., Цимберг Е.А. и др. Влияние аэросилов на рост Azotobacter chroococcum // Микробиол. журн. — 1993. Т. 55, № 1. - С. 38-42.
46. Курдиш И.К., Рой А.А, Мельникова H.H. и др. Формирование проростков сельскохозяйственных растений при бактеризации семян отдельными видами микроорганизмов и их композициями // Физиология и биохимия культурных растений. 2001. - Т. 33, №4. - С. 341-346.
47. Линчевская М.П., Калиберда P.M. Влияние бактериальных удобрений наурожай картофеля // Получение и применение бактериальных удобрений: Сб.ст. Киев: АН УССР, 1958. - С. 203-209.
48. Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Силищев H.H. и др. Роль бактерий-антагонистов фитопатогенов в защите сельскохозяйственных растений от болезней. Уфа.: Гил ем. 2001. — 66с.
49. Ш Логинов О.Н., Четвериков С.П., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Выскоэффективная жидкостная хроматография низкомолекулярных бактериальных метаболитов белковой природы // Журнал аналитической химии. -2004. Т. 59, № 3. - С. 310-314.
50. Лукин С.М., Симаков Г.В., Морозов А.М. Эффективность использования препаратов азотфиксирующих микроорганизмов под картофель // Химия в сельском хозяйстве. 1995. - № 2-3. - С.36-38.
51. Любимов В.И. Биохимия фиксации молекулярного азота. М: Наука, 1969. - 160с.Ф
52. Макарова J1.А. Погода и болезни культурных растений. J1.: Гидроме-теоиздат, 1977. - 144 с.
53. Мальцева H.H., Надкерничная Е.В., Волкогон В.В и др. Активность азотфиксации и азотфиксирующие микроорганизмы ризосферы озимой ржи // Микробиол. журн. 1992. - Т. 54, № 6. - С. 10-16.
54. Мелентьев А.И., Галимзянова Н.Ф. Влияние метаболитов бацилл-антагонистов на прорастание спор и развитие грибов-возбудителей обыкновенной корневой гнили // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. -Т.35,№3. -С. 353-357.
55. Методы общей бактериологии. В 3 т. / Под ред. Ф. Герхардта. М.: Мир, 1984.-Т. 1-3.
56. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. -М.: Изд-во Моск. ун-та, 1991. 304 с.
57. Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур / Под ред. К.В. Новожилова. -М., 1985. 130 с.
58. Микробные сообщества и их функционирование в почве: Сб. науч. тр. под ред. Е.И. Андреюка. Киев: Наукова думка, 1981. - 279 с.
59. Минеральный и биологический азот в земледелии СССР: Сб. науч. тр. под ред. E.H. Мишустина. М.: Наука, 1985. - 270 с.
60. Мишустин E.H. Ассоциации почвенных микроорганизмов. М.: Наука, 1975.- 108 с.
61. Мишустин E.H. Микрооорганизмы и плодородие почвы. М.: Изд. АН СССР, 1956.-248 с.
62. Мишустин Е.Н, Наумова А.Н., Хохлова Ю.М. Антифунгальный антибиотик из культуры Azotobacter chroococcum // Микробиология. 1969. -Т.38,№1.-С. 87-90.
63. Мишустин E.H., Шильникова В.К. Биологическая фиксация атмосферного азота. М.: Наука, 1968. - 531с.
64. Могилевич Н.Ф., Гвоздяк П.И., Романова Е.А. и др. Активность свободных и иммобилизованных клеток Azotobacter vinelandii — деструктора эти-ленгликоля // Микробиология. -1992. Т.61, вып. 3. - С. 431-437.
65. Муно Ф., Сланг С., Ванг Хов Ф. Фумонизины: микотоксины, продуцирующие Fusarium spesies из комплекса Gibberellafujicuroi (секция Liseda) // Проблемы медицинской микологии. 2002. — Т4, №3. - С. 35-38.
66. Мухортов С.Я., Рябчикова В.В. Разработка адаптационной модели агро-экосистемы с овощными культурами // Совершенствование технологии в пром. садоводстве и овощеводстве. — Воронеж, 1996. С. 57-62.
67. Мухортов С.Я. Получение экологически безопасной продукции овощных культур на орошаемых черноземах // там же. С. 62-65.
68. Мухортов С.Я., Рябчикова В.В. Использование азотобактерина для регулирования качества получаемой продукции // Агроэкол. пробл. применения средств химизации в земледелии ЦЧЗ. Воронеж, 1995. - С. 175-179.
69. Мюллер Э., Леффлер В. Микология. М.: Наука, 1995, 343 с.
70. Наумова А.Н. Приживаемость азотобактера в подзолистых почвах // Получение и применение бактериальных удобрений. Киев: АН УССР, 1958. -С. 189-203.j
71. Нурмухаметов Н.М., Нагимова Л.М. Влияние продуктов обмена микроорганизмов на урожай яровой пшеницы // Повышение эффективности производства в сел. хоз-ве Респ. Башкортостан. Уфа, 1998. - С. 184-188.
72. Ожиганова Г.У. Эффективность использования бактерии рода Azotobacter для инокуляции семян Amaranthus cruentus: (Казан, гос. ун-т): Автореф. дис. канд. биол. Наук. Казань, 1993, - 20 с.
73. Олюнина JI.H., Ладыгина Г.Н., Лезова H.A. Продуцирование индолил-3-уксусной кислоты в процессе роста Azotobacter chroococcum // IV съезд о-ва физиологов растений России: Тез. докл. М., 1999. - Т. 2. - С. 655-656.
74. Определитель бактерий Берджи: В 2 т. / Под ред. Дж. Хоулта и др. М.: Мир, 1997.-Т.1.
75. Пат. 2073712 Российская Федерация, 6 С 12 N 1/20// (С 12 R 1:065). Штамм бактерий Azotobacter vinelandii (Lipman) продуцент экзополисаха-рида / Краснопевцева Н.В., Чернягин A.B., Яроцкий C.B.; Заявлено 05.01.93; Опубл. 20.02.97. Бюл. 5.
76. Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. 4-е изд., пе-рераб. и дополн. - М.: ВО «Агропромиздат», 1989. — 480 с.
77. Плетнева Т.Н., Ладыгина Г.Н., Дыдыкин A.M. и др. Влияние азотобактера на урожайность, качество и некоторые болезни томатов сорта "Горьков-ский 44" // Докл. «80 лет селекционеру-генетику, акад. И. П. Елисееву». 1998 г. Н. Новгород, 1998. - С. 187-190.
78. Полянская Л.М., Ведина О.Т., Лысак Л.В. и др. Стимуляция роста растений культурами Beijerinckia и Clostridium // Микробиология. 2002. — Т.71, №1.- С.123-129.
79. Почвенные организмы как компоненты биогеоценоза / Сб. науч. тр. под ред. Мишустина E.H. М.: Наука, 1984. - 248с.
80. Прибылых Е.И., Степанов А.И. Влияние удобрений на микробиологические процессы в почве // Становление и зрелость с.-х. науки Якутии и пути ее развития в условиях рынка. Новосибирск, 2000. - С. 147-149.
81. Придачина H.H., Новогрудская Е.Д., Кругляк Е.Б. и др. Azotobacter chroococcum — продуцент нового противогрибкового антибиотика // Антибиотики. 1982. - Т.21, №1 . - С. 3-5.
82. Рой A.A., Бега З.Т., Булавенко J1.B., Курдиш И.К. Мобилизация фосфора из органо- и неоргано-фосфатов бактериями родов Bacillus и Azotobacter // Междунар. конф., 1-2 июл. 2000г. Минск, 2000. - С. 80-81.
83. Рубенчик Л.И. Азотобактер и его применение в сельском хозяйстве. -Киев: АН УССР, 1960. 328 с.
84. Садыков Б.Ф., Зуева Л.Д., Шлыков В.И. Круговорот азота в целинных и пахотных почвах // Микробиология. 1985. - Т. 10, №4. - С. 656-660.
85. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно-патогенных грибов. М.: Мир. -2001. - 468с.
86. Сеги И. Методы почвенной микроскопии. М.: Колос, 1983. - 296 с.
87. Сергеева Р. Азотобактерин в повышении урожая томатов // Картофель и овощи. 1960. - №4. - С. 42.
88. Скочинская H.H., Танцюренко Е.В., Антипчук А.Ф. Приживаемость азотобактера на различных субстратах и в прикорневой зоне томатов в условиях закрытого грунта // Тез. докл. респ. конф., 1987г. Киев., 1987. - С. 113.
89. Соколов М.С. Возможности получения экологически безопасной продукции растениводства в условиях хагрязнения агросферы (экотоксикологи-ческий аспект) // Агрохимия. 1995. -№ 6. - С. 107-125.
90. Суховицкая Л.А., Сафронова Г.В., Клышко Г.М. и др. Выживаемость Rizobium в монокультуре и бинарных популяциях с ризосферными бактериями // Прикладная биохимия и микробиология . -2002. Т. 38, №1. - С. 7378.
91. Титова JI.B., Антипчук А.Ф., Курдиш И.К. и др. Влияние высокодисперсных материалов на физиологическую активность бактерий рода Azoto-bacter // Микробиол. журн. 1994. - Т.56, №3. - С. 60-64.
92. Толкачев Н.З. Повышение эффективности симбиотическокой азотфикса-ции и продуктивности сои путем применения стимуляторов и биопрепаратов // Физиология и биохимия культ, растений. 1997. - Т.29, №4. - С. 304-309.
93. Трейкале О., Дзене А., Николаева В. и др. Биодеструкция полимерных матриц, содержащих полигидроксибутират, и биологическая эффективность иммобилизированных фунгицидов // Защита растений на рубеже XXI в. — Минск, 2001. С. 455-457.
94. Троицкая Т.М., Троицкий H.A. Азотфиксация Azotobacter chroococcum в ассоциации с ячменем // Микробиология. 1988.- Т.57, № 2. - С. 288-291.
95. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1986.-136с.
96. Фатыхова Ю.Н., Минаева О.М., Бондаренко A.A. Разработка биофунгицида на основе бактерий рода Azotobacter и Pseudomonas / Регион, пробл. экологии и природопользования. Томск, 2000. — С. 90-91.
97. Хабиров И.К. Экология и биохимия азота в почвах Приуралья. Уфа.: * УНЦ РАН, 1993.-224 с.
98. Цыбульский В.Ф., Шишков И.Д.,Кириллова Э.В. Влияние различных доз минеральных удобрений и бактериальных препаратов на урожай зеленой массы кукурузы и микрофлору ее ризосферы // Аграр. вюн. Причорномор'я. 1998. -Вип.2. - С. 19-26.
99. Чемерисов Б.М. Усиление азотфиксации новое направление в селекции пшеницы и других небобовых полевых культур // Сельхоз. биология. - 1988. -№ 6. - С. 43-49.
100. Шабаев В.П., Смолин В.Ю., Стрекозова В.И. Влияние азотфиксирую-щих родов Azospirillum и Azotobacter на баланс азота в почве при выращивании растений // Агрохимия. 1990. — №5. - С. 86-90.
101. Шерстобоева Е.В., Дудинова И.А. и др. Биопрепараты азотфиксирую-щих бактерий: проблемы и перспективы применения // Микробиол. журн. -1997. Т.59, №4. - С. 109-116.
102. Широков А.В., Мелентьев А.И., Логинов О.Н., Актуганов Г.Э. Белковые и пептидные факторы Bacillus sp. 739 ингибиторы роста фитопатогенных грибов //Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. -Т. 38, № 2. - С. 161-165.
103. Шроль Т.С. Роль бактерий в токсичности почвы под озимой пшеницей // Аллелопатия и продуктивность растений: Сб. ст. — Киев. — 1990. С. 19-22.
104. Ямалеев A.M., Семенова Г.Н., Леонтьева Т.Л. и др. Экологически безопасные приемы защиты зерновых культур от вредных организмов // Баш. экол. вестник. -1998. -№3.- С. 8-10.
105. Aguilar J.E., Sanchez М. Efecto de una rizobacteria nitrofijadora у niveles de fertilizante en el comportamiento agronomico del tomate Lycopersicon esculentum var. // Acta agron. 1998. -Vol.48, № 1/2. - P. 60-70.
106. Altimirska L. Response of wheat to inoculation with Azospirillum and Azotobacter // Trans. 14th Int. Congr. Soil Sci., Kyoto. aug. 1990. - Vol. 3, commis 3. -Kyoto, 1990.-P. 111-139.
107. Annison G., Couperwhite I. Influence — of calcium on.alginate production and compocition in continuous cultures of Azotoacter vinelandii // Appl. Microbiol, and Biothechnol. 1986. - 25, № 1. - P.55-61.
108. Bagyaraj D.J., Tilak K.V. Progress in the development of biofertilizers and their application // 3rd Agr. science congr. 1997. - New Delhi, 1997. - Vol.1. -P. 211-222.
109. Bowen G.D., Rovira A.D. Microbial colonization of roots // Ann. Rev. Phyto-path. 1976. - V.14. -P.121-144.
110. Brown M.E. Seed and root bacterization // Ann. Rev. Phytopath. 1974. -V.12. -P.181-197.
111. Brivonese A.C., Sutherland I.W. Polimer production by a mucoid strain of Azotobacter vinalandii in batch culture // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1989. -30, № 1.-P. 97-102.
112. Carlile M.J., Watkinson S.C., Gooday G.W. The fungy. San Diego, San Francisco, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo: Academic press. 2001 588c.m
113. Clementi F., Mancini M., Moresi M. Rheology of alginate from Azotobacter vinelandii in aquaeous dispersions // J. Food Engg. 1998. — Vol.36, № 1. - P. 5162.
114. Clementi F., Crudele M.A., Párente E., Mancini M., Moresi M. Production and characterisation of alginate from Azotobacter vinelandii // J. Sc. Food Agr. -1999. Vol.79, № 4, - P. 602-610.
115. Click B.R. The enhancement of plant grown by free-living bacteria // Can. J. Microbiol. 1996. - V.42. - P. 207-220.
116. Dibut Alvarez В., Martinez Viera R., Casanova Castillo I. et al. Acción esP- timuladora de Azotobacter chroococcum sobre cultivo del tomate en suelo Fer-ralitico Rojo. Efecto sobre la plantación // Agrotecn. Cuba, 1997. Vol.27, № 2/3. -P. 20-25.
117. Dukic D., Mandic L. Nitragin and azotobacterin in the function of increasing biological productivity of soil and ecological sustainability // Науч.Труд. / Висш Селскостоп. Инст. Пловдив. - 1997. - Т.42, кн.2, - С. 9-15.
118. Forlani G., Pastorelli R., Branzoni M. et al. Root colonization efficiency, plant-growth-promoting activity and potentially related properties in plant-associated bacteria // J. Genet. Breedg. 1995. - Vol. 49, № 4. - P. 343-351.
119. Govedrica M., Milosevic N., Jarak M., Duric S., h op. Uticai diazotrofa na prinos i kvalitet secerne repe // Zb. Rad. / Nauc. Inst. Ratarstvo Povrtarstvo. Novi Sad. -1999. Sv. 32. - S. 285-292.
120. Govedrica M., Milosevic N., Jarak M. Bioloska azotofiksacija u poljo-privredi: moducnosti primena i perspective Zb. Rad. / Nauc. Inst. Ratarstvo Povrtarstvo. Novi Sad. -1997. Sv. 29. - S. 35-43.
121. Gururaj R., Mallikarjunaiah R.R. Interaction effect of Azotobacter and phosphate-solubialising fungi on seed germination and seedling growth of sunflower//Helia. Novi Sad. 1994.-Vol.17, № 21.-P. 33-40.
122. Johns L.W., Greaves J.K. Azotobacter chroococcum and its relationship to accessory groth factors // Soil. Sci. 1943. - Vol. 55. - P. 393.
123. Konde B.R., Desai J.N. Influence of inoculum of Azotobacter on growth and yield of wheat // Food Farmg. Agric. 1976. Vol. 8, №3. - P.13-14.
124. Kloepper J.W., Litshitz R., Zablotowicz R.M. Free-living bacteria // Can. J. Microbiol. -1995. V.41, - P. 109-117.
125. Kucharski J., Wyszkowska J., Nowak G. Wplyw prekursorow etylenu i Azotobacter sp. na plonowanie bobiku i aktywnosc drobnoustrojow glebowych. Rosliny straczkowe w hodowli i uprawie. -Warszawa, 1997. S. 213-220.
126. Kucharski J., Wyszkowska J., Nowak G. Wplyw L-tryptofanu oraz kwasu 3-indolilooctowego na drobnoustroje glebowe i plonowanie marchwi // Agricultura. -1996.-№63.-P. 47-57.
127. Kumar V., Aggarwal N.K., Singh B.P. Performance and persistence of phosphate solubilizing Azotobacter chroococcum in wheat rhi^osphere // Folia micro* biol. 2000. - Vol.45, № 4. - P. 343-347.
128. Kumari Lakshmi M., Vijayalashmi V., Subba Rao N.S. Interaction between Azotobacter spesies and fungi // Phytopathol. 1972. - Bd.75. - S. 27-30.
129. Kumar V., Narula N. Solubilization of inorganic phosphates and growth emergence of wheat as affected by Azotobacter chroococcum mutants // Biol. Fertil. Soils. 1999. - Vol.28, № 3. - P. 301-305.
130. Moharram T.M. Effect of soil amendmentwith composted filter mud inoculation with zotobacter spp.on the yield of wheat plants in newly reclaimed soils // Ann. agr. Sc. 1999. - Vol.44, № 1, P. 15-26.
131. Milic V. Uticaj inokulacije i genotipa soje na broj mikroorganizama u zemljistu // Zb. Rad. /Nauc. Inst. Ratarstvo Povrtarstvo. Novi Sad. 1999. - Sv.32. -S. 305-314.
132. Mrkovacki N., Cacic N., Kovacev L. et al. Response of sugar beet to inoculation with Azotobacter in field trials // Agrochimica. 2002. - Vol.46, № 1/2. - P. 18-26.
133. Mrkovacki N., Kovacev L., Cacic N. et al. Primena mikrobioloskog preparataiu proizvodnji secerne repe // Zb. Rad. / Nauc. Inst. Ratairstvo Povrtarstvo. Novi Sad. 2001. - Sv.35. - S. 67-73.
134. Narula N., Behl R.K., Dudi H.R., Suneja S., Lakshminarayana K. Response of wheat genotypes to Azotobacter inoculation under rainfed conditions // Rachis. 1998,-Vol.17, № 1/2.-P. 66-67.i
135. Nair S.K., Chandra N. Phytohormone production by diazotrophs associated with plantation and orchard crops // J. trop. Agr. 1997. - Vol.35, № 1/2. - P. 47-48.
136. Navale A.M., Shinde D.B., Vaidya B.R. et al. Effect of Azotobacter and Azospirillum inoculation under graded levels of nitrogen on growth and yield of sugarcane (Saccharum officinarum) II Indian J. Agron. 1995. - Vol.40, № 4. - P. 665-669.
137. Padney A., Kumar S. Inhibitory effects of Azotobacter chroococcum and Azospirillum brasilianse on a range of rhizospire fungi // Indian. J. Exp. Biol. -1990. Vol. 28, № 1. — P.52-54.
138. Prasad M., Prasad R. Response of upland cotton (Gossypium hirsutum) to bio-fertilizer and nitrogen fertilization // Indian J. Agron. 1994. - Vol.39, № 2. - P. 334-336.
139. Rabie K.A.E., Nasr S.A., Mervat A.A. The effect of a symbiotic nitrogen fixers on the growth and endogenous growth substances of wheat plants // Ann. Agr. Sc. 1995. - Vol.40, №1. - P. 11-32.
140. Rosario Azcon, J.M. Barea. Synthesis of auxins, gibberellins and cytocinins by Azotobacter vinelandii and Azotobacter biejierincii related to effects producedfton tomato plants // Plant and soil. 1975. - Vol. 43. - P.609-619.
141. Rovira A.D. Manipulation of the rhizospera microflora the increase plant production // Reviews of rural science // Biotech, and recombinant DNA technology in the animal production / Eds.Leng R.A. et al. — University New England Press, 1985.-P. 185-197.j
142. Shanky B.T. Effect of Azotobacter and Azospirillum on germination of seeds of some agricultural crops // Zbl. Microbiol. 1990. - V.145, №3. - P. 209-217.
143. Shanshoury A.R. Interactions of Azotobacter chroococcum, Azospirillumjbrasilense and Streptomyces mutabilis ,in relation to their effect on wheat development // J.Agron.Crop Sc. -1995. -Vol.175, № 2. P. 119-127.
144. Sharma S., Jain N., Shan A.K. Occurence of Azotobacter chroococcum in Photos scandens//Curr. Sei. 1985.-Vol.54.-P. 142-143.
145. Sindhu S.S., Lakshminarayana K.,Singh D. Expression of hydrogenase activity in Azotobacter chroococcum and its possible role in crop productivity // Indian J. Exper. Biol. 1994. - Vol.32, № 4. - P. 423-426.
146. Sood M.C., Sharma R.C. Value of growth promoting bacteria, vermicompostand Azotobacter on potato production in Shimla hills // J. Indian Potato Assn. i2001. Vol.28, № 1.-P. 52-53.
147. Strzelec A. Wplyw autochtonicznej mikroflory glebowej i wolno zyjacych asymilatorow N2 z rodzajow Azospirillum i Azotobacter // Postepy Nauk roln. -1995. -R.42, № 2. S. 25-35.
148. Sudhakar P., Chattopadhyay G.N., Gangwar S.K., Ghosh J.K. Effect of foliar application of Azotobacter, Azospirillum and Beijerinckia on leaf yield and quality of mulberry // J. Agr. Sc. -2000. Vol. 134, pt 2. -P. 227-234.
149. Suneja S., Lakshminarayana K. Production of hydroxamate and catechol siderophores by Azotobacter chroococcum // Indian J. Exper. Biol. 1993. -Vol.31, № 11.-P. 878-881.
150. Suneja S., Narula N., Anand R.C. at al. Relationship of Azotobacter chroococcum siderophores with nitrogen fixation // Folia microbiol. 1996. — Vol.41, № 2. -P.154-158.
151. Sutherland I.W. Biosynthesis of microbial exopolysacharides // Adv. Microbiol. Phisiol. 1982. -23.-P. 80-142.
152. Tomar U.S., Tomar I.S., Badaya A.K. Response of chemical and bio-fertilizers on some matric traits in wheat // Crop Res. 1998. -Vol.16, № 3. - P. 408-410.
153. Wachowska U., Banaszkiewicz T. Effect of the herbicide roundup on microorganisms in the rhizosphere of grasses // Natural sciences. Olsztyn. -1999. -№ 2.-P. 191-200.
154. Wyszkowska J. Modyfikacja skladu chemicznego bobiku pod wplywem pre-kursorow fitohormonow i drobnoustrojow glebowych // 3iol. nauk. / Akad. rol.-techn. -Olsztyn. 1999. - № 5. - S. 75-82.
155. Yates M.G., De Souza E.M., Kahindi J.H. Oxygen, hydrogen and nitrogen fixation in azotobacter // Soil Biol. Biochem. 1997. - Vol.29, № 5/6. - P. 863869.
156. Zahir Z.A., Arshad M., Azam M., Hussain A. Effect of an auxin precursor tryptophan and Azotobacter inoculation on yield and chemical composition of potato under fertilized conditions // J. Plant Nutrit. -1997. -Vol.20 № 6. P. 745752.
157. Zaki M.M., Demerdash M.E., Amara M.A. Interactions between Azospiril-lum spp. and rhizosphere microflora of wheat // Ann. Agr. Sc. 1992. -Vol.37, № 2,-P. 351-358.I
-
Пугачева, Елена Геннадьевна
-
кандидата биологических наук
-
Уфа, 2004
-
ВАК 03.00.07
- Новые микробиологические препараты для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды
- Разработка сухих препаративных форм микробиологических препаратов Ленойл, Елена, Азолен
- Биологически активные вещества из клеточных липидов азотфиксирующей бактерии Azotobacter Chroococcum
- Физиолого-биохимическая активность и биоразнообразие штаммов Azotobacter Chroococcum, выделенных из почв Нижегородской области
- Микробиологические технологии в процессах ремедиации природных и техногенных объектов
