Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка сухих препаративных форм микробиологических препаратов Ленойл, Елена, Азолен

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка сухих препаративных форм микробиологических препаратов Ленойл, Елена, Азолен"

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВА НАТАЛЬЯ СЕРГЕЕВНА

РАЗРАБОТКА СУХИХ ПРЕПАРАТИВНЫХ ФОРМ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ЛЕНОЙЛ, ЕЛЕНА, АЗОЛЕН

03.00.23 -биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Щелково-2005

Ъе^ч

мы

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВА НАТАЛЬЯ СЕРГЕЕВНА

РАЗРАБОТКА СУХИХ ПРЕПАРАТИВНЫХ ФОРМ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ЛЕНОЙЛ, ЕЛЕНА, АЗОЛЕН

03.00.23 -биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

| вММЦАЯиЯШИ н» { МЗНмкги»*.) 1

.1- \

ИЬлково^ОСЙ, ?

imiib

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра РАН в рамках темы « Ферменты и метаболиты почвенных и ризосферных микроорганизмов».

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Денисов Аркадий Алексеевич кандидат биологических наук, доцент Прищепов Федор Александрович

Ведущая организация: Центр Биоинженерии РАН, г. Москва

Защита состоится 23 сентября 2005 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности Россельхозакадемии по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево ВНИТИБП РАСХН

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности

Автореферат разослан 22 августа 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Ю.Д. Фролов

доктор биологических наук

Логинов Олег Николаевич

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ I

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современное развитие биотехнологии способствовало появлению нового поколения высокоэффективных многофункциональных биопрепаратов, применяющихся в различных отраслях сельскохозяйственного и промышленного производства Использование для создания таких препаратов природных штаммов микроорганизмов обеспечивает им высокую экологическую безопасность Прогресс в производстве и применении биопрепаратов, во многом, связан с разработкой высокотехнологичных, сохраняющих долгое время их исходные свойства, препаративных форм. Одним из наиболее удачных решений этой проблемы является производство биопрепаратов в порошкообразном виде, удобном для хранения, транспортировки и применения

Разработка технологий производства сухих препаративных форм биопрепаратов, способных длительно сохранять жизнеспособность и функциональную активность клеток микроорганизмов различных системных групп является актуальной задачей современной биотехнологии

Цель исследования. Разработка сухих препаративных форм микробиологических препаратов Елена (на основе Pseudomonas aureofaciens ИБ 51), Азолен (Azotobacter vinelandii ИБ 4), Ленойл (консорциум бактерий Bacillus brevis и Arthrobacter spesies ИБ ДТ-5) Задачи исследования.

1. Разработать способ концентрирования биомассы микроорганизмов из культуральной жидкости, позволяющий сохранять на исходном уровне активность бактерий-антагонистов по отношению к грибным фитопатогенам.

2. Разработать технологию концентрирования биомассы микроорганизмов, составляющих основу биопрепаратов Елена, Азолен, Ленойл.

3 Исследовать в лабораторных условиях жизнеспособность и активность клеток бактерий, составляющих основу биопрепаратов, иммобилизованных на твердых носителях.

4. Разработать технологию получения сухих препаративных форм биопрепаратов Елена, Азолен, Ленойл.

5. Оценить эффективность применения сухих препаративных форм биопрепаратов Плена, Азолеп в полевых условиях для защиты пшеницы от болезней и повышения ее урожайности.

Научная новизна. Впервые предложен новый способ выделения биомассы бактерий рода Pseudomonas, предусматривающий использование в качестве флокуляпта реагента Гивпан, обеспечивающий сохранение антагонистической активности бактерий по отношению к грибным фитопатогенам (Пат. РФ Х°2245916).

Изучены процессы концентрирования биомассы бактерий рр Pseudomonas и Azotobacter при использовании реагента Гивпап, консорциума микроор! анизмов Bacillus brevis и Artbrobacter spesies ИБ ДТ-5 с применением флокулянта Каустамин-15.

Изучено влияние процесса иммобилизации клеток на жизнеспособность и ' функциональную активность бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, Azotobacter vinelandii ИБ 4, Bacillus brevis и Arthrobacter spesies ИБ Дт-5.

Практическая значимость. Разработана технология производства сухих препаративных форм биопрепаратов Плена, Азолен, Ленойл, в течение длительного времени сохраняющих жизнеспособность и функциональную активность микроорганизмов, составляющих их основу.

Совместно с предприятием-производителем ГУП "Опытный завод АН РБ" разработаны, согласованы с контролирующими организациями и утверждены технические условия на сухую препаративиую форму биопрепарата Ленойл (ТУ 9291 -020-22357427-2004).

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на II Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов " (Москва, 2003), семинаре-презентации инновационных научпо-тсхпических проектов "Биотехнология-2003" (Пущино, 2003), II Всероссийской научной Internet-конференции "Интеграция пауки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем" (Уфа, 2003), XVII Международной научно-технической

конференции "Химические реагенты, реактивы и процессы малотоннажной химии" (Уфа, 2004), Международной научно-практической конференции "Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем" (Краснодар, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 2 патента Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания объектов и методов исследования, экспериментальной части (2 главы), выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 107 страницах, содержит 25 таблиц и 7 рисунков. Список использованной литературы включает 175 наименований, из них 136 на русском языке.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность за неоценимую помощь _и поддержку при выполнении работы сотрудникам лаборатории биологически активных веществ Института биологии УНЦ РАН с.н.с., к.т.н. Силищеву Н.Н, к.б.н. Четверикову С П., сотрудникам лаборатории прикладной микробиологии с.н.с., к.б.н. Галимзяновой Н.Ф., с.н.с., к.б.н. Бойко Т.Ф.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования служили микроорганизмы родов Pseudomonas, Azotobacter, Bacillus, Arthrobacter. выделенные из различных источников в лаборатории биологически активных веществ ИБ УНЦ РАН и депонированных в Коллекцию микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН. В качестве тест-объектов при оценке антагонистических свойств микроорганизмов, иммобилизованных на твердых носителях, служили различные фитопатогенные грибы из Коллекции Института биологии УНЦ РАН и Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Штаммы-антагонисты рода Pseudomonas выращивали на среде Кинг В (Смирнов, 1990) следующего состава, г/л: пептон - 2, глицерин - 1, К2НР04 - 0.15, MgSOv 7Н20 - 0.15, вода дистиллированная - до 1л.

Штаммы-антагонисты рода Azotobacter выращивали на среде 40 (Каталог культур микроорганизмов, 1992) следующего состава, г/л: сахароза - 20,

дрожжевой экстракт - 0 5, К2НР04 - 0 8, КН2Р04 - 0 2, MgSO„- 7Н20 - О 2, CaS04 7Н20 -Ol, FeCI3 - 0.001, Na2Mo04 - 0 001, вода дистиллированная - до 1л.

Биомассу консорциума бактерий Bacillus brevis и Arthrobacter spesies получали культивированием на жидкой среде Раймонда (Егоров, 1976) следующего состава, г/л Na2СО, - 0.1, СаС12 - 0.01, MnSOr 7Н20 - 0.02, FeSC>4- 7Н20 - 0 02, Na Н2РО„ - 1.5, К2НР04 - 1.0, MgS04- 7Н20 - 0.2, NH4N03 - 2, дрожжевой автолизат -1 0, источником углерода служило дизельное топливо - 1%, вода дистиллированная - до 1л.

В качестве флокулянтов на стадии выделения биомассы микроорганизмов использовали промышленные флокулянты - катионогенный водорастворимый полиэлектролит Каустамин-15 по ТУ 2227-222-00203312-2002 и водорастворимый полимер Гивпан по ТУ 2216-00-04698227-99 Оптическую плотность культуральной жидкости и супернатанта измеряли на фотоэлектроколориметре марки КФК-2. В кювету сравнения вносили супернатант, полученный при центрифугировании культуральной жидкости на лабораторной установке марки ОПн-8 УХЛ 4 2 В качестве адсорбента микроорганизмов применяли каолин технический по ГОСТ 19608-84.

Антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным микромицетам определяли по наличию зон подавления роста патогенов вокруг бактериальных колоний штаммов-антагонистов при совместном культивировании на плотной картофельно-глюкозной среде (КГА) (Азолен) и на агаризованной глюкозо-пептонной среде (ГПА) (Елена).

Углеводородокисляющую способность бактерий, входящих в консорциум Ленойл, определяли титрованием выделившегося и поглощенного щелочью углекислого газа. Количество углеводородов, подвергнувшихся биоконверсии, определяли гравиметрическим способом.

Процесс сушки с получением сухих препаративных форм биопрепаратов Ленойл, Елена, Азолен осуществляли на лабораторной вакуумной сушилке при температуре 40°С, давлении 0,08 МПа, температуре носителя 40-45°С, времени процесса 12-14 ч до конечной влажности целевого продукта, составляющей не более 10%.

Изучение влияния бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter, входящих в состав сухих препаративных форм биопрепаратов Елена и Азолен, на растения проводили на пшенице сорта "Жница". В качестве эталонов средств защиты от болезней служили жидкие препаративные формы препаратов Елена и Азолен, а также известный биофунгицид Фитоспорин М.

Статистическую обработку результатов проводили, используя t-критерий Стьюдента на 5% уровне значимости. Данные, полученные в опытах, были обработаны на персональном компьютере с помощью программы Excel-2002.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛОКУЛЯНТОВ 1.1 Изучение процесса концентрирования биомассы микроорганизмов биопрепарата Ленойл

В работе использовали промышленный образец биопрепарата Ленойл, полученный при культивировании консорциума микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter spesies ИБ ДТ 5-3, общий титр клеток в котором составил 71010 КОЕ/мл.

В качестве флокулянтов на стадии выделения биомассы микроорганизмов использовали катионогенные водорастворимые полиэлектролиты: ВПК-402 (поли-N,N- диметил- N,N- диаллиламмоний хлорид) по ТУ 6-05-2009-86, Каустамин-15 (поли- N, N - диметил-Г4-(2-гидрокси)-пропиламмонийхлорид) и водорастворимый полимер Гивпан (продукт гидролиза полиакрилонитрильного сополимера акрилонитрила с метакрилатом), в качестве коагулянта использовали сернокислый алюминий марки "х ч.". В экспериментах концентрация реагентов варьировала в пределах 0 01-0.8 об.% по отношению к культуральной жидкости.

Результаты экспериментов показали, что использование коагулянта -сернокислого алюминия в процессе концентрирования биомассы микроорганизмов консорциума осложняется образованием стойкой эмульсии на поверхности раздела фаз. Также данные исследований говорят о неэффективности применения реагентов ВПК-402 и Гивпан.

в

В связи с этим дальнейшие эксперименты по исследованию процесса концентрирования биомассы консорциума биопрепарата Ленойл проведены с использованием флокулянта Каустамин-15 (рис.1).

Как видно из рис.1, оптимальной концентрацией флокулянта Каустамин-15, обеспечивающей 99%-ную степень осветления КЖ микроорганизмов, являлась 0,1 об.% по отношению к культуральной жидкости. Время осаждения биомассы в лабораторном эксперименте составило при этом 95 мин.

В данном эксперименте, титр микроорганизмов в осадке составил - 3 10" КОЕ/мл, в то время как в надосадочной жидкости эта характеристика не превышала 3109 КОЕ/мл.

О 20 40 60 80 100 120 140 160 мин

Рис 1 Характеристика процесса выделения биомассы микроорганизмов биопрепарата Ленойл из культуральной жидкости под действием флокулянта Каустамин-15 при его содержании'

1-0,01%; 2-0,06%; 3-0,1%; 4-0,5%; 5-0,8%.

Как показали морфологические исследования консорциума микроорганизмов, в исходном образце биопрепарата и в осажденной биомассе видовой состав консорциума не претерпел изменений в процессе осаждения, а соотношение численности микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter spesies оставалось стабильным и равным 1:1.

Таким образом, при осаждении консорциума микроорганизмов биопрепарата Ленойл использование флокулянта Каустамин-15 (0.1 об.%), позволяет за время, равное 95 мин, практически полностью (на 99%) выделить биомассу, сохраняя при этом стабильность видового состава микроорганизмов-нефтедеструкторов.

1.2. Исследование процесса концентрирования биомассы бактерий-антагонистов рода Pseudomonas и Azotobacter

В работе использовали выделенные, идентифицированные в лаборатории биологически активных веществ ИБ УНЦ РАН и депонированные в Коллекцию микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН штаммы микроорганизмов-антагонистов грибных фитопатогевов:

- Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 (Пат. РФ № 2203945);

- Pseudomonas putida ИБ 17 (Пат. РФ Jfe 2213774);

- Azotobacter vinelandii ИБ 1 (Пат. РФ № 2224791);

- Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 (Решение Роспатента о выдаче Патента РФ от 21.03.2005 по заявке № 2003101144/13) - высокоэффективный продуцент цитокннинов.

Промышленные флокулянты ВПК-402, Каустамин-15 и Гивпан использованы и для концентрирования биомассы бактерий-антагонистов. При этом было установлено, что при применении катионогенных полиэлектролитов ВПК-402 и Каустомин-15 в концентрации 0.1-0.8 об.% к культуральной жидкости хотя и происходит концентрирование биомассы микроорганизмов, однако, в то же время, в значительной степени снижается антагонистическая активность осажденных клеток бактерий по отношению к фитопатогенным грибам Fusarium culmorum, Alternaria altérnala, Bipolaris sorokiniana. В табл. 1 приведены данные по антагонистической активности бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, выделенных из культуральной жидкости при помощи различных флокулянтов.

Аналогичные результаты получены и для бактерий-антагонистов Pseudomonas putida ИБ 17 и Azotobacter vinelandii ИБ 1

Анализируя полученные результаты, можно отметить, что введение в культуральную жидкость бактерий-антагонистов таких флокулянтов, как ВПК-402 и Каустамин-15 влечет за собой некоторое нарушение жизнедеятельности микроорганизмов, выражающееся в снижении значения такого важного показателя, как антагонистическая активность Возможная причина этого явления заключается в том, что катионогенные полиэлектролиты ВПК-402 и Каустамин-15 обладают в некоторой степени бактерицидными свойствами по отношению к микроорганизмам, в частности к сульфатвосстанавливающим бактериям. Известно, например, применение этих реагентов в нефтедобыче в качестве нефтевытеснякнцих агентов, стойких к биоразрушению под действием пластовой микрофлоры (A.c. СССР № 1445297; A.c. СССР № 1438304)

Таблица 1

Антагонистическое действие бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, концентрированных из культуралыюй жидкости при использовании различных

флокулянтов

Флокулянт и его концентрация, об.% по сухому веществу Средний диаметр зоны подавления роста гриба, мм

Вид фитопатогенных грибов

Fusarium culmorum Altemaria alternata Bipolans sorokintana

Гивпан 0,1 0,5 0,8 9,0±2,1 18,8±1,8 54,0±0,7

8,7±1,9 19,5±2,2 55,0±1,5

8,4±2,4 19,1±2,6 55,0±1,1

ВПК-402 0,1 0,5 0,8 5,1±2,2 8,2±0,7 16,8±1,4

2,6±0,8 7,4±1,2 1б,4±2,1

2,2±0,4 4,8±0,8 16,2±1,8

Каустамин-!5 0,1 0,5 0,8 5,4±2,2 6,2±2,1 20,2±0,8

3,3±2,0 5,6±1,9 15,4±1,5

2,8±0,8 3,8±1,5 6,6±1,2

Р. aureofaciens ИБ 51 (КЖ, необработанная флокулянтом) 9,1±1,0 19,3±3,0 55,2±3,0

Таким образом, оценка антагонистической активности микроорганизмов, осажденных Гивпаном из соответствующих культуральных жидкостей, на тест-

грибах Bipolans sorokiniana, Fusarium culmorum и Alternaria alternate показала, что это свойство микроорганизмов-антагонистов не претерпевает при использовании в качестве флокулянта Гивпан каких-то изменений и не отличается от исходной Новый способ выделения биомассы микроорганизмов из культуралъной жидкости, основанный на использовании флокулянта Гивпан запатентован в Российской Федерации (Пат. РФ № 2245916).

Дальнейшие эксперименты по исследованию процесса концентрирования биомассы бактерий-антагонистов проведены с использованием в качестве флокулянта реагента Гивпан.

Графическая интерпретация результатов экспериментов приведена на рис 2

Процесс седиментации под действием Гивпана для различных бактериальных суспензий имеет свои особенности Так, бактериальные суспензии, содержащие биомассу псевдомонад, сравнительно быстро и довольно четко (процент осветления на уровне 90%) разделимы на супернатант и осажденную биомассу Время, необходимое для концентрирования биомассы микроорганизмов из той или иной культурапьной жидкости с указанным уровнем процента осветления, зависит от особенностей ее физико-химического состава и составляет в условиях эксперимента от 100 мин для Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 до 150 мин для Pseudomonas putida ИБ 17 и 220 мин для Pseudomonas aureofaciens ИБ 6. При этом концентрация флокулянта для достижения необходимого результата должна составлять 0.5-0.8 об % от культурапьной жидкости В эксперименте по концентрированию биомассы микроорганизмов, полученной при культивировании штамма Azotobacter vinelandii ИБ 1, степень осветления культурапьной жидкости в процессе флокуляции не превысила 70% (рис. 2, г), что, очевидно, связано с наличием в культурапьной жидкости экзополисахаридов, секретируемых этим штаммом в процессе ферментации и значительно повышающих вязкость культурапьной жидкости.

Рис 2. Характеристика процесса выделения биомассы из культуральной жидкости Р putida ИБ 17(ал Р aureofasiens ИБ 51(6), Р aureofasiens ИБ 6(в) и Azotobacter vinelandii ИБ 1(г) под действием флокулянта Гивпан при его содержании: 1 -нативная культуральная жидкость; 2 - 0,1 %; 3 - 0,3% ; 4 - 0,5 %; 5 - 0,8%.

Таким образом, проведенные в лабораторных условиях эксперименты позволили определить технологические показатели (концентрация флокулянта и время) процесса выделения биомассы микроорганизмов бактерий рода Pseudomonas - антагонистов фитопатогенов и продуцентов веществ, стимулирующих рост и развитие растений.

2 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ИММОБИЛИЗАЦИИ БАКТЕРИЙ, ЯВЛЯЮЩИХСЯ ОСНОВОЙ БИОПРЕПАРАТОВ ЛЕНОЙЛ, ЕЛЕНА И АЗОЛЕН, НА ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ 2.1. Изучение способов хранения и разработка рецептуры сухой препаративной формы биопрепарата Ленойл

Были изучены образцы сухих препаративных форм биопрепарата Ленойл, полученных в лабораторных условиях путем концентрирования биомассы консорциума бактерий Bacillus brevis и Arthrobacter spesies ИБ ДТ-5 и ее адсорбцией на твердом носителе - каолине. В первом случае, концентрирование биомассы микроорганизмов из культуральной жидкости (титр 4-10" КОЕ/мл) проводилось с использованием флокулянта - Каустамин-15. Концентрация реагента составляла 0.1 об.% по отношению к культуральной жидкости. Во втором случае, концентрирование биомассы бактерий консорциума проводилось путем центрифугирования культуральной жидкости (титр 310" КОЕ/мл) и последующим отделением осадка. В обоих случаях отделенная биомасса смешивалась с каолином (массовые соотношения 10:3, 10:5, 10:7, 10:10), последующая сушка осуществлялась на лабораторной вакуумной сушилке при температуре 40°С, давлении 0.08 МПа, температуре носителя 40-45°С, времени процесса 12-14 ч до конечной влажности целевого продукта, составляющей не более 10%. Сухие препаративные формы биопрепарата Ленойл хранились при температуре 4-5°С в течении 7 месяцев (табл. 2,4).

Таблица 2

Изменение титра микроорганизмов биопрепарата Ленойл при его хранении на каолине (концентрирование биомассы с использованием флокулянта Каустамин-15) (КОЕ/ г твердого носителя)

Массовое соотношение каолин: биомасса Период хранения, мес

0 14 17

СХП Ленойл, полученный в лаборатории БАВ ИБ УНЦ РАН

10:3 (5±0,8)10и (4±2,3)10" (2±1,2)Ю10

10:5 (2±0,3)10" (1,5±0^)10ш (4±2,1)-10|и

10:7 (3±1,2)10" (1±0,8)10" (2,5±1,8)10ш

10:10 (2,7±1,4)10" (1±0,7)10ш (7±2,3)10*

СХП Ленойл .полученный на ГУП "Опытный завод АН РБ"

10:3 (2,6± 1,5)10" (1±0,3>10* (8±3,4)Ю*

По результатам морфологических исследований видно, что видовой состав консорциума в препарате не претерпел каких-либо качественных и количественных изменений по истечении срока хранения равного 4 и 7 месяцам (табл. 3)

При сравнении таблиц 2 и 4 можно заметить, что общая численность консорциума микроорганизмов (период хранения - 7 мес ) сухого биопрепарата Ленойл, полученного при концентрировании биомассы с использованием флокулянта Каустамин-15, сохраняется на уровне !0'-Ю10 КОЕ/ г носителя, а титр микроорганизмов биопрепарата Ленойл, полученного при концентрировании биомассы путем центрифугирования, на уровне 107-10' КОЕ/ г носителя По-видимому, высокомолекулярный водорастворимый реагент Каустамин-15 в данном случае играет двойную положительную роль: во-первых, высокоэффективного флокулянта; во-вторых, своего рода протектора, защищающего иммобилизованные клетки микроорганизмов в процессе хранения, что позволило поддерживать жизнеспособность клеток бактерий биопрепарата с практически неизменным титром в течении 7 месяцев. По результатам экспериментов было выбрано оптимальное массовое соотношение каолин • биомасса, которое составляет 10 3. При увеличении концентрации биомассы в сухой препаративной форме итоговые результаты не имеют существенных отличий по численности микроорганизмов, но возрастают экономические затраты на получение сухих биопрепаратов.

Таблица 3

Соотношение титра Bacillus brevis : Arthrobacter spesies биопрепарата Ленойл при его хранении на каолине (концентрирование биомассы с использованием

флокулянта Каустамин-15) (КОЕ/ г твердого носителя)

Массовое соотношение Период хранения, мес

0 4 7

СХП Ленойл, полученный в лаборатории БАВ ИБ УНЦ РАН

10" 10 10'

10:3 2,5±1,0: 2,5±0,9 200±11,1 :200±45,6 10±5,3 : Ю±4,5

10:5 1±1,2: 1±0,4 7,5±2,8 : 7,5±4,6 20±14Д: 20±8,9

- 10:7 1,5±0,3 : 1,5±1,0 50±12,8 : 50±4,9 12±4,5 : 12±3,6

10:10 1,3±0,9: 1,3±0,5 5±2,1 : 5±0,9 3,5±2,5 : 3,5±1,9

СХП Ленойл, полученный на ГУП "Опытный завод АН РБ"

109 10" 10"

10:3 1,3±0,8: 1,3 ±0,2 5±2,6: 5±1,8 4±0,7: 4±3,2

Таблица 4

Изменение титра микроорганизмов биопрепарата Ленойл при хранении на каолине (КОЕ/ г твердого носителя) (концентрирование биомассы микроорганизмов путем центрифугирования)

Массовое соотношение каолин: биомасса Период хранения, мес

0 4 7

10:3 (4±1,3)-10" (2±1,0)-Ю10 (2±1,2)10;

10:5 (2±0,8)10и (2±0,5)109 (1±0,3)'10*

10:7 (7±3,2) 10" (7±2,8)10^ (1±0,9) 10"

10:10 (1±0,2)1012 (1±0,6)10ш (1±0,3)-109

Определены величины окислительной активности микроорганизмов сухого биопрепарата Ленойл по отношению к нефти и продуктам ее переработки (рис, 3).

163 162

ш

ШИШя

ЕЭ жидкая форма Ш сухая форма

смазочное масло

Рис 3. Сравнительная окислительная активность сухой и жидкой форм биопрепарата Ленойл по отношению к нефти и продуктам ее переработки.

Из рисунка 3 видно, что окислительная активность сухого биопрепарата Ленойл по отношению к нефти и дизельному топливу достигает практически того же уровня, что и жидкая форма препарата, а по отношению к смазочному маслу превышает на 19 мг С02 /г, что говорит о сохранении величины окислительной активности при получении сухой формы биопрепарата Ленойл.

Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее эффективным способом получения сухой формы биопрепарата Ленойл является

концентрирование культуральной жидкости, содержащей консорциум Bacillus brevis и Arthrobacter spesies ИБ Дт-5, с использованием флокулянта Каустамин-15, адсорбция биомассы на каолине (оптимальное массовое соотношение каолин : биомасса - 10 3), с последующей вакуумной сушкой. Разработанная технология позволяет долгое время сохранять высокие значения титра микроорганизмов, их неизменную окислительную активность по отношению к нефти и продуктам ее переработки и стабильность видового состава консорциума.

На основе результатов лабораторных экспериментов были разработаны и утверждены технические условия на получение сухой препаративной формы биопрепарата Ленойл - ТУ 9291-020-22357427-2004. Согласно ТУ, в сухой препаративной форме Ленойла число живых клеток углеводородокисляющих микроорганизмов должно составлять не менее 1 -108 КОЕ/мл, окислительная активность нефти и продуктов ее переработки должна соответствовать заданным значениям

В соответствии с разработанными техническими условиями на предприятии-производителе ГУП "Опытный завод АН РБ" в 2005 году была наработана и отправлена заказчику опытно-промышленная партия сухого биопрепарата Ленойл, в количестве 10 т.

2 2. Изучение способов хранения и разработка рецептуры сухой препаративной

формы биопрепарата Елена

В ходе лабораторных экспериментов были получены образцы сухой

препаративной формы биопрепарата Елена на основе концентрированной

биомассы живых клеток Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 и адсорбцией ее на твердом носителе - каолине. Стадия выделения биомассы проводилась при

использовании флокулянта - Гивпан, концентрация которого составляла 0.5 об.%

по отношению к культуральной жидкости (титр 1,25 Ю10 КОЕ/мл). Отделенная биомасса смешивалась с каолином (массовые соотношения 10:3, 10:5, 10-7),

процесс сушки не отличался по своим параметрам от ранее описанного для биопрепарата Ленойл. В качестве образца для сравнения был приготовлен сухой

препарат Елена, в состав которого входила культурапьная жидкость, не подвергавшаяся обработке флокулянтом Гивпан, нанесенная на каолин и

высушенная при аналогичных условиях. Сухие препаративные формы биопрепарата Елена хранились при температуре 4-5°С в течении 11 месяцев (табл.5).

Таблица 5

Изменение титра микроорганизмов биопрепарата Елена при его хранении на каолине ( концентрирование биомассы с использованием флокулянта Гивпан и без его применения) (КОЕ/ г твердого носителя)

Каолин' биомасса (масс соот-ие) Биопрепарат Елена (биомасса, осажденная гивпаном) Каолин КЖ (масс, соот-ие) Биопрепарат Елена (без использования флокулянта)

0 6 мес 11 мес 0 6 мес 11 мес

10' 108 10" 10е 107 Ю7

ю-з 150±80 90±36 5,5±1,6 10:3 250±30 50±24 7±3,2

10.5 90±36 340±23 42±28 10:5 5±3,1 8,6±5 1,4±0,2

107 1,2±0,5 6±4,2 2,4±0,7 10-7 10±1 15±7 2±0,6

По стабильности сохранения самого высокого титра в сухом биопрепарате Елена было выбрано оптимальное массовое соотношение каолин : биомасса, равное 10:5.

Антагонистическую активность бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 сухого биопрепарата Елена определили по наличию зоны подавления роста грибных фитопатогенов вокруг колонии бактерии-антагониста. В качестве тест-объектов были выбраны микроскопические грибы-фитопатогены Fusarium oxysporum, Bipolaris sorokmiana, Alternaria alternata (табл.6).

Таким образом, показано, что титр биомассы микроорганизмов биопрепарата Елена (массовое соотношение каолин : биомасса - 10 : 5 ), выделенной при использовании высокомолекулярного водорастворимого полимера Гивпан, как и антагонистическая активность бактерий-антагонистов по отношению к грибам-фитопатогенам, остаются неизменными в период хранения биопрепарата, равный 11 месяцам Сравнивая общую численность микроорганизмов в биопрепарате Елена (биомасса, осажденная гивпаном) и в биопрепарате Елена (без использования флокулянта) можно предположить, что флокулянт Гивпан, вероятно предохраняет клетки микроорганизмов от высыхания.

Таблица 6

Размеры зон ингибирования роста грибных фитопатогенов для бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 (через 11 месяцев хранения биопрепаратов)

Виды фитопатогенных грибов Диаметр зоны ингибирования роста гриба, мм

Биопрепарат Елена (биомасса, осажденная гивпаном) К Ж Р. aureofaciens ИБ51

Fusarium oxysporum 22,0±1,8 29,2±2,1

Bipolaris sorokiniana 52,0±1,9 55,0±1,5

Alternaria altemata 16,0±1,5 19,5±2,2

Таким образом, разработана технология получения сухого биопрепарата Елена, с применением в качестве флокулянта - водорастворимого полимера Гивпан, иммобилизации клеток псевдомонад на каолин и вакуумной сушке полученного продукта.

2.3. Изучение способов хранения и разработка рецептуры сухой препаративной формы биопрепарата Азолен

В ходе проведенных лабораторных экспериментов были получены образцы сухих препаративных форм биопрепарата Азолен путем адсорбции культуральной жидкости микроорганизмов АгоЫэа^ег vineland1i ИБ 4 (титр 3,4 10й КОЕ/мл ) на твердом носителе - каолине (массовые соотношения каолин : культуральная жидкость - 10:3, 10:5, 10:7, 10:10) Процесс сушки по своим технологическим параметрам аналогичен сушке биопрепаратов Ленойл и Елена. Сухие препаративные формы биопрепарата Азолен хранились при температуре 4-5°С в течении 13 месяцев (табл.7).

За оптимальное массовое соотношение каолин : культуральная жидкость принято соотношение 10 : 3, т.к. различия численности микроорганизмов при других соотношениях каолин : культуральная жидкость на один и тот же период хранения биопрепарата были незначительными.

Таблица 7

Изменение титра микроорганизмов биопрепарата Азолен при его хранении на каолине (КОЕ/ г твердого носителя)

Массовое соотношение каолин. КЖ Период хранения, мес

0 2 4 13

Ю10 10,и 10" 10'

10:3 1,5±1,1 1±0,5 8±4,3 1,5±0,6

10:5 4±2,3 1±0,2 7±2,6 2±0,6

10:7 7,2±5,2 1±0,4 7,5±3,1 2,4±1,3

10:10 4±0,9 2±0,9 8±4,2 3,б±2,6

Антагонистическую активность бактерий А. vinelandii ИБ 4 сухого биопрепарата Азолен определяли по наличию зоны подавления роста грибных фитопатогенов вокруг колонии бактерии-антагониста В качестве тест-объектов были взяты те же микроскопические грибы, что и при определении антифунгальной активности бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 биопрепарата Елена (табл. 8).

Таблица 8

Размеры зон ингибирования роста грибных фитопатогенов для бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4

Виды фитопатогенных грибов Диаметр зоны ингибирования роста гриба, мм

КЖ Azotobacter vinelandii ИБ 4 СХП Азолен (через 13 месяцев хранения)

Fusarium oxysporum 10,4±2,1 8,5±1,5

Bipolans sorokiniana 21,0±2,1 19±2,3

Altemana alternata 14,0±2,0 13Д±1,6

Как видно из таблицы 8, анатагонистическая активность бактерий А. vmelandil ИБ 4 сухого биопрепарата Азолен, хранящегося более года, оставалась на том же уровне, что и активность микроорганизмов А. У1пе1аЫп ИБ 4 свежей культурапьной жидкости.

Наблюдения за изменением титра микроорганизмов А. уше1апс1п ИБ 4 в сухом препарате Азолен (массовое соотношение каолин : культуральная жидкость - 10 3) в течении 13 месяцев показали сохранение стабильно высокого уровня численности микроорганизмов, что, по-видимому, связано с способностью азотобактеров при неблагоприятных условиях образовывать цисты, а также способностью бактерий Аг^оЬайег уте1ап<1п во время культивирования секретировать экзополисахариды, выступающие своего рода протектором, способствующим как сохранению жизнеспособности клеток, так и их антагонистической активности.

3. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ЕЛЕНА И АЗОЛЕН ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОРНЕВЫХ ГНИЛЕЙ ПШЕНИЦЫ В УСЛОВИЯХ ПОЛЕВОГО ЭКСПЕРИМЕНТА

Эффективность предпосевной обработки семян биопрепаратами Елена и Азолен для защиты пшеницы от корневых гнилей была оценена в полевом мелкоделяночном опыте.

Результаты опыта показали, что использование сухих форм препаратов Елена и Азолен, наравне с жидкими формами, приводит к стимуляции развития растений и защите их от корневых гнилей (табл. 9). Биологическая эффективность сухого биопрепарата Елена по защите пшеницы от корневых гнилей составила на период уборки урожая 46,3 % по сравнению с контролем. Биологическая эффективность защиты от развития корневых гнилей пшеницы сухого биопрепарата Азолен составила в аналогичных условиях 38,8%. Применение известного препарата Фитоспорин М также имело достоверно положительный эффект, при этом его биологическая эффективность по защите пшеницы от корневых гнилей не превысила 18,2%. Необходимо отметить, что предпосевная обработка семяи пшеницы биопрепаратами Елена и Азолен не только способствовала снижению заболевания растений корневыми гнилями, но и положительно влияла на элементы структуры урожая Так, применение сухих форм биопрепаратов Елена и Азолен способствовало увеличению длины растений на 11% и 7,6%, соответственно; масса 1000 зерен увеличилась на 18,3% и 22,2%, соответственно. При использовании биопрепарата Фитоспорин М не удалось получить статистически достоверных данных по увеличению массы 1000 зерен.

Анализ данных по полевому опыту показал, что сухие формы биопрепаратов не теряют своей эффективности по сравнению с их жидкими формами.

Таблица 9

Результаты полевых испытаний по использованию биопрепаратов на основе штаммов-антагонистов р^кеиёотопак и Аго^Ьа^ег для подавления корневых гнилей пшеницы сорта Жница

Варианты опыта Высота растения, см Длина главного колоса, см Число колосков в главном колосе Число зерен в главном колосе Масса 1000 зерен, г Распространение корневых гнилей,% Биологическая эффективность Развитие корневых гнилей, % Биологическая эффективность

Контроль 76,6±3,9 8,6±0,3 14,6±0,6 27,8±2,5 36,1±3,2 73,5±7,3 38,9±3,1

Фитоспорин 9,1 ±0,4 14,&г0,5 едйьцу 1 39,2±2,8 грШЕ 31,8±3,2; Ш , <'-.

Жидкая форма биопрепарата Азолен 79,8±2,9 14,7±0,6 33,1±2;!* ; ■>, ... | ЩЙ! ¿§Щ

Сухая форма биопрепарата Азолен 15,2±0,5 34,52^2,27* 44,1±1:,8* v ! ч ' ч•"» 23,8±1,7* ^Г"'*" ^

Жидкая форма биопрепарата Елена 5»,2±0,2': 14,1±0,45 32,8±1,83* 41,5±4,2 59,5±6,8 19,0 28,ЗЛ4,5" 27,2'

Сухая форма биопрепарата ¿гена 9,40±0,37* 14,8±0,63 42,7±1,5' 52,9±5,4* 28,0" 20,9±2,3* 46,3*

* различия по сравнению с Контролем существенны при р=0,95.

22

ВЫВОДЫ

1 Изучены способы концентрирования биомассы микроорганизмов рода Pseudomonas и консорциума микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter spesies ИБ ДТ-5 с использованием флокулянтов Гивпан и Каустамин-15. Определены основные технологические параметры процесса (время и оптимальная концентрация флокулянта по отношению к культуральной жидкости) 2. Разработан новый способ выделения биомассы микроорганизмов-антагонистов рода Pseudomonas из культуральной жидкости с применением флокулянта Гивпан, позволяющий сохранить антагонистическую активность выделяемых микроорганизмов по отношению к трибным фитопатогенам. 3 Исследована жизнеспособность и активность клеток бактерий, составляющих основу биопрепаратов, иммобилизованных на твердом носителе -каолине. Выбрана оптимальная рецептура и разработаны технологии получения сухих препаративных форм биопрепаратов Ленойл и Елена, позволяющие в течении долгого времени сохранять основные функции препаратов

4. Разработана технология получения сухой препаративной формы биопрепарата Азолен, заключающаяся в иммобилизации бактерий Azotobacter vinelandn ИБ 4 из культуральной жидкости на каолин и вакуумной сушке полученного продукта.

5. В полевом мелкоделяночном опыте доказана эффективность использования сухих препаративных форм биопрепаратов Елена и Азолен для защиты посевов пшеницы от корневых гнилей и стимулирования развития растений Показано, что по биологической эффективности сухие препаративные формы биопрепаратов не уступают их жидким формам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Васильева Н.С., Силищев H.H. Биопрепараты в аспекте повышения качества урожая //Материалы II Российской научн-практ. конф «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (2-3 июня 2003 г., Москва) М, РАЕН-МААНОИ.-2003.-С. 89-90.

2 Логинов О Н., Свешникова Е.В , Четвериков С.П., Пугачева Е.Г , Васильева Н.С., Силищев Н Н. Новые биопрепараты для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды //Тез. докл семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2003» (24-25 ноября 2003 г., г Пущино, ИБФМ). Пущино.-2003.-С. 74-75.

3. Логинов О.Н., Васильева Н.С, Силищев H.H., Бойко ТФ Технологические аспекты опытно-промышленного производства биопрепарата-нефтедеструктора «Ленойл» //Башкирский химический журнал.-2003.-Т. 10, № 4.-С 76-77. 4 Логинов О.Н., Васильева Н С, Гусаков В.Н., Силищев Н.Н Флокулянты в процессе концентрирования биомассы микроорганизмов //Материалы II Всероссийской научной Internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (15-30 декабря 2003 г., г Уфа). Уфа.-Гос. изд-во научн-техн. лит-ры «Реактив».-2003.-С. 9.

5. Логинов О Н., Васильева Н.С, Силищев H.H., Гусаков В.Н. Исследование процесса выделения биомассы микроорганизмов с использованием флокулянта //Биотехнология -2004.-№ 2.-С. 55-57

6. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Пугачева Е.Г., Васильева Н.С., Силищев H.H. Биопрепараты комплексного действия «Елена» и «Азолен» на основе микроорганизмов - антагонистов фитопатогенных грибов //Материалы Межд. научн-практ. конф. «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (29 сетября-1 октября 2004 г., г.Краснодар) Краснодар.-2004 -Вып З.-С. 163-165.

7 Васильева Н С , Пугачева Е Г., Силищев Н Н , Логинов О.Н. Разработка твердой препаративной формы биоудобрения «Азолен» //Материалы XVII Межд научн-техн. конф. «Химические реагенты, реактивы и процессы малотоннажной химии» (12-14 октября 2004 г., г.Уфа). Уфа.-Гос изд-во научн-техн. лит-ры «Реактив» -2004.-С. 64-65.

8. Логинов О.Н., Васильева Н.С., Силищев H.H., Гусаков В.Н Способ выделения биомассы микроорганизмов //Патент РФ № 2245916, Б.И. № 4,2005.

9. Логинов О Н , Мелентьев А.И., Свешникова Е.В., Кузьмина Л Ю., Четвериков С.П., Васильева Н.С., Силищев H.H. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 - продуцент цитокининов //Заявка № 2003101144/13 (001017). Заявл. 15 01.2003; Опубл. 10.08.2004. Решение о выдаче Патента РФ от 21.03 2005

10. Васильева 11.(1, Силищев H.H., Четвериков С.И., Бойко Т.Ф., Пигильцева С.А., Логином ОН. Разработка сухой препаративной формы биопрепарата-псф 1 сдссчруктора «Лснойл» //Башкирский химический журнал.-2005.-Т. 12, № 2-С. 33-35.

11. Логинов О.И., Васильева Н.С., Силшцев H.H. Получение сухой препаративной формы биопрепарат а сельскохозяйствешюго назначения «Елена» У/Башкирский химический журнал.-2005.-Т. 12, № 2.-С. 45-47.

t

i i

|М 3 5 О О

РНБ Русский фонд

2006-4 9852

Отпечатано в ООО «Мещера» Московская обл., г. Щелково, ул. Свирская, 8а. тир. 100 экз. зак. №430

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Васильева, Наталья Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ *

1.1 Микробиологические препараты для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов и повышения урожайности

1.2 Микробиологические препараты для биологической рекультивации нефтезагрязненных почв

1.3 Сухие препаративные формы микробиологических препаратов

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Объекты исследований

2.2 Характеристика биопрепаратов Елена, Азолен, Ленойл

2.3 Исследование антагонистической активности микроорганизмов биопрепаратов Елена и Азолен

2.4 Определение стабильности видового состава консорциума микроорганизмов - нефтедеструкторов

2.5 Исследование окислительной активности микроорганизмов -деструкторов нефти и нефтепродуктов

2.6 Исследование процесса концентрирования биомассы микроорганизмов в лабораторных условиях

2.7 Изучение способов хранения в лабораторных условиях микроорганизмов, составляющих основу биопрепаратов Елена, Азолен, Ленойл

2.8 Исследование влияния процесса сушки биопрепаратов на их функциональные характеристики

2.9 Оценка эффективности применения сухих препаративных форм биопрепаратов Елена и Азолен против возбудителей корневых гнилей пшеницы в условиях полевого эксперимента

2.10 Статистическая обработка результатов

3. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛОКУЛЯНТОВ

3.1 Изучение процесса концентрирования биомассы микроорганизмов биопрепарата Ленойл

3.2 Исследование процесса концентрирования биомассы бактерий -антагонистов рода Pseudomonas и Azotobacter

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ИММОБИЛИЗАЦИИ БАКТЕРИЙ, ЯВЛЯЮЩИХСЯ ОСНОВОЙ БИОПРЕПАРАТОВ ЛЕНОЙЛ, ЕЛЕНА

И АЗОЛЕН, НА ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ

4.1 Изучение способов хранения и разработка рецептуры сухой препаративной формы биопрепарата Ленойл

4.2 Изучение способов хранения и разработка рецептуры сухой препаративной формы биопрепарата Елена

4.3 Изучение способов хранения и разработка рецептуры сухой препаративной формы биопрепарата Азолен

4.4 Оценка эффективности применения сухих препаративных форм биопрепаратов Елена и Азолен против возбудителей корневых гнилей пшеницы в условиях полевого эксперимента

4.5 Опытно-промышленное производство сухих биопрепаратов Ленойл и Елена

5. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка сухих препаративных форм микробиологических препаратов Ленойл, Елена, Азолен"

Актуальность проблемы. Современное развитие биотехнологии способствовало появлению нового поколения высокоэффективных многофункциональных биопрепаратов, применяющихся в различных отраслях сельскохозяйственного и промышленного производства. Использование для создания таких препаратов природных штаммов микроорганизмов обеспечивает им высокую экологическую безопасность. Прогресс в производстве и применении биопрепаратов, во многом, связан с разработкой высокотехнологичных, сохраняющих долгое время их исходные свойства препаративных форм. Одним из наиболее удачных решений этой проблемы является производство биопрепаратов в порошкообразном виде, удобном для хранения, транспортировки и применения.

Разработка технологий производства сухих препаративных форм биопрепаратов, способных длительно сохранять жизнеспособность и функциональную активность клеток микроорганизмов различных системных групп является актуальной задачей современной биотехнологии.

Цель исследования. Разработка сухих препаративных форм микробиологических препаратов Ленойл (консорциум бактерий Bacillus brevis и Arthrobacter spesies ИБ ДТ-5), Елена (на основе Pseudomonas aureofaciens ИБ 51), Азолен (Azotobacter vinelandii ИБ 4). Задачи исследования.

1. Разработать способ концентрирования биомассы микроорганизмов из культуральной жидкости, позволяющий сохранять на исходном уровне активность бактерий-антагонистов по отношению к грибным фитопатогенам.

2. Разработать технологию концентрирования биомассы микроорганизмов, составляющих основу биопрепаратов Ленойл, Елена, Азолен.

3. Исследовать в лабораторных условиях жизнеспособность и активность клеток бактерий, составляющих основу биопрепаратов, иммобилизованных на твердых носителях.

4. Разработать технологию получения сухих препаративных форм биопрепаратов Ленойл, Елена, Азолен.

5. Оценить эффективность применения сухих препаративных форм биопрепаратов Елена, Азолен в полевых условиях для защиты пшеницы от болезней и повышения ее урожайности.

Научная новизна. Впервые предложен новый способ выделения биомассы бактерий рода Pseudomonas, предусматривающий использование в качестве флокулянта реагента Гивпан, обеспечивающий сохранение антагонистической активности бактерий по отношению к грибным фитопатогенам (Пат. РФ №2245916).

Изучены процессы концентрирования биомассы бактерий pp. Pseudomonas и Azotobacter при использовании реагента Гивпан, консорциума микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter spesies ИБ ДТ-5 с применением флокулянта Каустамин-15.

Изучено влияние процесса иммобилизации клеток на жизнеспособность и функциональную активность бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, Azotobacter vinelandii ИБ 4, Bacillus brevis и Arthrobacter spesies ИБ ДТ-5.

Практическая значимость. Разработана технология производства сухих препаративных форм биопрепаратов Ленойл, Елена, Азолен, в течение длительного времени сохраняющих жизнеспособность и функциональную активность микроорганизмов, составляющих их основу.

Совместно с предприятием-производителем ГУП "Опытный завод АН РБ" разработаны, согласованы с контролирующими организациями и утверждены технические условия на сухую препаративную форму биопрепарата Ленойл (ТУ 9291-020-22357427-2004).

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на II Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов " (Москва, 2003), семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов "Биотехнология-2003" (Пущино, 2003), II Всероссийской научной Internet-конференции "Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем" (Уфа, 2003), XVII Международной научно-технической конференции "Химические реагенты, реактивы и процессы малотоннажной химии" (Уфа, 2004), Международной научно-практической конференции "Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем" (Краснодар, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 2 патента Российской Федерации. iV

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Техногенная нагрузка на почву в последнее время интенсивно возрастает, снижая ее плодородие. Основными причинами этой ситуации являются широкое использование химических средств защиты растений и загрязнение почвы различными ксенобиотиками, в том числе нефтью и продуктами ее переработки.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Васильева, Наталья Сергеевна

5.ВЫВОДЫ

1. Изучены способы концентрирования биомассы микроорганизмов рода Pseudomonas и консорциума микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter spesies ИБ ДТ 5 с использованием флокулянтов Гивпан и Каустамин-15. Определены основные технологические параметры процесса (время и оптимальная концентрация флокулянта по отношению к культуральной жидкости).

2. Разработан новый способ выделения биомассы микроорганизмов-антагонистов рода Pseudomonas из культуральной жидкости с применением флокулянта Гивпан, позволяющий сохранить антагонистическую активность выделяемых микроорганизмов по отношению к грибным фитопатогенам.

3. Исследована жизнеспособность и активность клеток бактерий, составляющих основу биопрепаратов, иммобилизованных на твердом носителе - каолине. Выбрана оптимальная рецептура и разработаны технологии получения сухих препаративных форм биопрепаратов Ленойл и Елена, позволяющие в течении долгого времени сохранять основные функции препаратов.

4. Разработана технология получения сухой препаративной формы биопрепарата Азолен, заключающаяся в иммобилизации бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 из культуральной жидкости на каолин и вакуумной сушке полученного продукта.

5. В полевом мелкоделяночном опыте доказана эффективность использования сухих препаративных форм биопрепаратов Елена и Азолен для защиты посевов пшеницы от корневых гнилей и стимулирования развития растений. Показано, что по биологической эффективности сухие препаративные формы биопрепаратов не уступают их жидким формам.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Васильева, Наталья Сергеевна, Щёлково

1. Андресон Р.К., Телин А.Г., Галимзянова Н.Ф., Агафарова Я.М., Багаутдинов Ф.Я., Бойко Т.Ф., Гарипов Т.Т. Биологическая рекультивация почвы, загрязненной нефтью, в промысловых условиях //Защита от коррозии и охрана окружающей среды.-1997.-№ 4-5.-С. 21-23.

2. Антипчук А.Ф., Канцелярук P.M., Скочинская Н.Н. и др. Влияние Азотобактера на прорастание семян огурцов //Микробиол. журн.-1985.-Т. 47, № 2.-С. 19.

3. Антипчук А.Ф., Рангелова В.М.и др. Вплив азотобактера на врожай та якють цукрових буряюв // Мшробюл. журн. 1997. - Т.59, №4. - С. 90-94.

4. Антипчук А.Ф., Андреюк Е.И., Рангелова В.Н. и др. Ростовая активность и технологические свойства азотфиксирующих микроорганизмов при их гетерофазном культивировании // Мнсробюл. журн. 1997. - Т.59, №4.- С. 117-123.

5. А.с. 1105501 СССР. С 12 N 1/02. Способ выделения дрожжей /В.П.Барабанов, Ш.Г.Еникеев, А.И.Курмаева и др. Заявлено 29.03.1983; Опубл. 30.07.1984. Бюл. 28.

6. А.с. 1133290 СССР. С 12 N 1/02. Способ выделения дрожжей /В.П.Барабанов, Ш.Г.Еникеев, А.И.Курмаева и др. Заявлено 30.03.1983; Опубл. 07.01.1985. Бюл. 1.

7. А.с. 1316189 СССР. С 05 F 11/08, С 12 N 1/20 //С 12 R 1:065:С 12 N 1/20. Штамм бактерий Azotobacter chroococcum несимбиотический азотфиксатор для ячменя /Н.А.Троицкий, М.А.Новицкая, Т.М.Троицкая. Заявлено 07.06.85; Опубл. 15.03.88. Бюл. 10.

8. А.с. 1359272 СССР. С 05 F 11/08. Штамм Azotobacter chroococcum для получения бактериального удобрения под томаты /Н.А.Троицкий, М.А.Новицкая, Т.М.Троицкий, В.М.Васильев. Заявлено 26.07.85; Опубл. 15.12.87. Бюл. 46.

9. А.с. 1438304 СССР. Е 21 В 43/22. Состав для вытеснения нефти /Фазлутдинов К.С., Хазипов Р.Х., Силищев Н.Н., Шурупов Е.В, Телин А.Г., Карташова Р.Г. Заявлено 09.02.87; Опубл. 1989.

10. А.с. 1445297 СССР. Е 21 В 43/22. Состав для вытеснения нефти /Фазлутдинов К.С., Канюков Р.З, Хазипов Р.Х., Силищев Н.Н., Телин А.Г., Трутнов Г.А., Абдрашитов Я.М., Шурупов Е.В. Заявлено 1989.

11. А.с. 1458382 СССР. С 12 N 1/02. Способ очистки культуральной жидкости микроорганизмов-продуцентов протеолитических ферментов /С.С.Фокина, Э.А.Шишкова, Л.И.Орещенко, Н.В.Барсукова. Заявлено 01.10.1985; Опубл. 15.02.1989. Бюл. 6.

12. А.с. 1603881 СССР . Е 21 В 43/22. Состав для вытеснения нефти / Хазипов Р.Х., Сафонов Е.Н., Камалетдинов P.M., Телин А.Г., Силищев Н.Н., Алмаев Р.Х. Исмагилов Т.А. Заявлено 18.08.1988; Опубл. 1.07.1990

13. Бляхман Д.А., Шахов С.В., Пойманов В.В., Рязанов А.Н. Повышение эффективности процесса вакуум-сублимационной сушкимикробиологических препаратов // Техника машиностроения. 2003 .-№3. -С. 56-59.

14. Борзенков И.А., Ибатуллин P.P., Милехина Е.И., Сидоров Д.Г., Храмов И.Т., Беляев С.С. Использование микроорганизмов при ликвидации нефтяных загрязнений почв //Конф. «Интродукция м-ов в окруж. среду», 1719 мая, 1994 г.: Тез. докл.-М., 1994.-С. 14-15.

15. Боровая В.П. НПА «Биота»: опыт производства и применения микробиологических препаратов //Защита и карантин растений.-2001.-№ 8.-С. 15-16.

16. Бельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы //Биотехнология.-1995.-№ 3-4.-С. 20-27.

17. Войкова И.В., Конев Ю.Е. Микробиологическая очистка воды и почвы от нефти и нефтепродуктов //Конф. «Интродукция м-ов в окруж. среду», 1719 мая, 1994 г.: Тез. докл.-М., 1994.-С. 12-13.

18. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем /Отв. ред. М.А.Глазовская.-М.: Наука, 1988.-264 с.

19. Вудворд Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты. М.: Мир, 1980. -215 с.

20. Выживаемость и антагонистическая активность Pseudomonas aureofaciens УКМ В-111 при хранении в высоко дисперсных материалах/ И.К.Курдиш, А.А. Рой, А.Д.Гарагуля и др. //Микробиология.-1999.-Т.68, № 3.-С.387-391.

21. Головлев E.JI. Проблемы интродукции микроорганизмов-деструкторов //VI Конф. РФ «Новые направления биотехнологии». 24-26 мая, 1994 г.: Тез. докл.-Пущино, 1994.-С. 4.

22. Голодяев Г.П., Никитина З.И. Состояние интродуцированных популяций нефтеокисляющих микроорганизмов в экосистемах береговой зоны Дальнего Востока //Конф. «Интродукция м-ов в окруж. среду», 17-19 мая, 1994 г.: Тез. докл.-М., 1994.-С.29.

23. Голодяев Г.П., Никитина З.И. Санация нефтезагрязненных почв юга Дальнего Востока //Тез. докл. II Съезда Об-ва почвоведов, Санкт-Петербург, 27-30 июля, 1996 г. Кн. l.-M., 1996.-С. 246-247.

24. ГОСТ 19608-84. Каолин обогащенный для резинотехнических и пластмассовых изделий, искусственных кож и тканей. Технические условия. Изд-во стандартов, 1984.

25. Гущина Ю.А., Евдокимов Е.В. Формальдегидрезистентные бактерии рода Pseudomonas как агенты биоконтроля и биостимуляции льна //Экология сегодня.-2001 .-№ 1.-С. 65-67.

26. Долгова Е.М., Манько О.П., Зубко И.Я. и др. Препараты псевдобактерин-2 и псевдобактерин-3 против болезней пшеницы //Химия в сельском хозяйстве.-1997.-№ 1.-С. 13-14.

27. Доросинский JI.M. Бактериальные удобрения дополнительное средство повышения урожая. М.: Россельхозиздат, 1965, 174 с.

28. Доросинский JI.M. Клубеньковые бактерии и нитрагин. Д., 1970

29. Дядечко В.Н., Толстокорова JI.E., Гашев С.Н. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья //Почвоведение.-1990.-№ 9.-С.148-151.

30. Дядечко В.Н., Толстокорова J1.E., Платонова С.В., Крысанова В.И., Жданова Е.Б. Применение бактериального препарата "Путидойл" для ликвидации нефтяных загрязнений воды и почвы. Инф. об ЦБ НТИ Минводстроя СССР, М., 1990, в.4, С.43-51.

31. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. М.: Изд-во Московского университета, 1976.-3 60с.

32. Егоров Н.С., Олескин А.В., Самуилов В.Д. Биотехнология. Проблемы и перспективы. М., 1987.-459 с.

33. Егоров С.Ю., Захарова Н.Г., Акимова Ф.Л. и др. Азотфиксирующие бактерии защищенного грунта //Вестник Российской Академии с.-х. наук,-1994.-№ 6.-С. 18-20.

34. Ермакова Н.И., Штершнис М.В. Новый биопрепарат РИЦ против болезней растений//Защита растений.-1994.-№ 12.-С. 18.

35. Заявка № 2004106004/13. Продуцент экзополисахарида / Логинов О.Н., Пугачева Е.Г., Силищев Н.Н., Калимуллина Г.З., Хлебникова М.Э., Симаев Ю.М.- Заявлено 12.02.2004; Решение Роспатента о выдаче патента РФ от 7.06.2005.

36. Звягинцев Д.И. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. М., 1973.-212 с.

37. Казначеев И.В., Гумагалиева К.З., Моисеев Ю.В. Докл. АН СССР.-1986.-№5. - С.1241-1244.

38. Карпунина Л.В., Никитина В.Е., Сторник Г.И. Нитрогеназная активность иммобилизованных клеток Bacillus polimixa // Биотехнология. 1986. - № 2. -С. 97-101.

39. Каталог культур микроорганизмов. Пущино-Москва. 1992. - 363 с.

40. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Семененко М.Н. Определение активности углеводородокисляющих бактерий с использованием н-алканов, меченых тритием //Прикладная биохимия и микробиология.-1988.-24, № 2.-С. 203-207.

41. Коронелли Т.В. Экофизиологические основы и практический опыт интродукции углеводородокисляющих бактерий в природные экосистемы //Конф. «Интродукция м-ов в окружающую среду». 17-19 мая 1994 г.: Тез. докл.-М., 1994.-С. 53.

42. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Ильинский В.В., Кузьмин Ю.И., Кирсанов Н.Б., Яненко А.С. Интродукция бактерий рода Rhodococcus втундровую почву, загрязненную нефтью //Прикладная биохимия и микробиология.-1997.-33, № 2.-С. 198-201.

43. Кочетков В.В., Чигалейчик А.Г., Петрикевич С.Б. Биопрепарат псевдобактерин-2 для защиты растений от широкого спектра фитопатогенов //Химия в сельском хозяйстве.-1997.-№ 1.-С. 15-16.

44. Кочетков В.В., Чигалейчик А.Г., Петрикевич С.Б. Защита растений биопрепаратами в защищенном грунте //Химия в сельском хозяйстве,-1997.-№1.-С. 16-17.

45. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Еркеев М.И. и др. Иммуноферментное определение содержания индолилуксусной кислоты в семенах кукурузы с использованием меченых антител //Физиология растений.- 1986.-Т. 33, вып. 6.-С. 1221-1227.

46. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко Н.И. Иммуноферментная система для определения цитокининов //Физиология растений.-1990.-Т. 37, вып. 1.-С. 193-199.

47. Кузнецова М.А., Филиппов А.В. Ризоплан и фитофтороз картофеля //Защита растений.-1995.-№ 8.-С. 19-20.

48. Кузьмина Л.Ю., Логинов О.Н., Бойко Т.Ф., Исаев Р.Ф., Свешникова Е.В., Мелентьев А.И. Эффективность бактериальных препаратов при защите растений яровой пшеницы от твердой головни // Сельскохозяйственная биология. -2003. -№5. С. 69-73.

49. Курдиш И.К., Титова Л.В. Гранулированные препараты азотобактера на основе глинистых минералов // Прикл. биохимия и микробиология. 2000. -Т.36, № 4. - С. 484-487.

50. Курдиш И.К., Титова Л.В., Цимберг Е.А. и др. Влияние аэросилов на рост Azotobacter chroococcum // Микробиол. журн. 1993. - Т. 55, № 1. - С. 38-42.

51. Кхариф М., Ткачева В., Зольникова Н. Бамил как новый биоорганический носитель для микроорганизмов-нефтедеструкторов

52. Всерос. науч. конф. «Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств», Санкт-Петербург, 21-23 ноября 1996 г.: Тез.докл.-С.-Петербург, 1996.-С. 20.

53. Логинов О.Н. Новые микробиологические препараты для сельского хозяйста и восстановления окружающей среды: Дисс. д-ра биолог, наук. — Щелково, 2004.-296 с.

54. Логинов О.Н., Костюченко В.П., Комаров С.И., Бойко Т.Ф., Подцепихин А.К. Технология биологической очистки отвалов отработанной отбеливающей земли // Нефтепереработка и нефтехимия.-2000, №11.-С. 1820.

55. Логинов О.Н., Нуртдинова Л.А., Бойко Т.Ф., Четвериков С.П., Силищев Н.Н. Оценка эффективности нового биопрепарата «Ленойл» для биоремедиации нефтезагрязненных почв // Биотехнология.-2004, №1.-С.77-82

56. Логинов О.Н., Пугачева Е.Г., Исаев Р.Ф., Силищев Н.Н., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф. Биологические средства защиты картофеля от болезней // Аграрная наука.-2003, №7.-С.24

57. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Исаев Р.Ф., Силищев Н.Н., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф. Биопрепараты против твердой головни пшеницы // Защита и карантин растений.-2002. №9.- С.39

58. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Пугачева Е.Г., Шарафутдинов A.M., Силищев Н.Н. Биопрепараты для томатов в защищенном грунте // Аграрная наука.-2004. №5.-С.7-8

59. Логинов О.Н., Силищев Н.Н., Погосова С.В. Технологические аспекты опытно-промышленного производства биопрепарата на основе бактерий рода Pseudomonas // Башкирский химический журнал.-2003-Т. 10, №4.-С. 73-75

60. Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур /Под ред. К.В.Новожилова.-М., 1985.-130 с.

61. Методы общей бактериологии. В 3 т. /Под ред. Ф.Герхардта и др.-М.:Мир, 1984.-Т. 1-3.

62. Миронова Р.И., Носкова В.П., Расулова Г.Е., Холоденко В.П. Биодеградация и биосорбция плавающей нефти природными микромицетами //Биотехнология.-1996.-№ 7.-С. 44-48.

63. Мишке И.В. Микробные фитогормоны в растениеводстве.-Рига: Зинатне, 1988.-151 с.

64. Назарова Л.Н., Наговицин В.А., Черемисина В.Г. Против комплекса болезней озимой ржи//Защита растений.-1995.-№ 8.-С. 18-19.

65. Назарова Л.Н. Агат-25 на зерновых культурах //Защита и карантин растений.-2002.-№ 1.-С.21-22.

66. Новиков Ю.В., Комзолова Н.В. Исследование бактериального препарата Путидойл, предназначенного для очистки водоемов от нефти. Водное хозяйство. 1992. - №2.-С.121-123.

67. Нурмухаметов Н.М., Нагимова Л.М. Влияние продуктов обмена микроорганизмов на урожай яровой пшеницы //Повышение эффективности производства в сельском хозяйстве Респ. Башкортостан.-Уфа, 1998.-С. 184188.

68. Олюнина Л.Н., Ладыгина Г.Н., Лезова Н.А. Продуцирование индолил-3-уксусной кислоты в процессе роста Azotobacter chroococcum // IV съезд о-ва физиологов растений России: Тез. докл. М., 1999. - Т. 2. - С. 655-656.

69. Пат. 2031860 Российская Федерация, 6 С 02 F 3/34, Е 02 В 15/04. Способ очистки воды от нефтяного загрязнения / Г.А. Кожанова. Заявлено 20.06.91; Опубл. 27.03.95. Бюл. 9.

70. Пат.2051586 Российская Федерация, 6 А01 N 63/00, С 12 N 1/20//С 12 N 1/20, С 12 R 1:40. Штамм бактерий Pseudomonas putida биостимулятор роста растений/ Н.П.Максимова, В.В.Лысак, О.К.Игнатович и др. Заявлено 12.07.91; Опубл. 10.01.96. Бюл. 1.

71. Пат. 2074158 Российская Федерация 6 С 05 F 11/08. Штамм бактерий Azotobacter chroococcum, используемый для получения бактериального удобрения под амарант /Г.У.Ожиганова, И.А.Чернов, И.А.Дегтярева. Заявлено 02.09.94; Опубл. 27.02.97. Бюл. 13.

72. Пат. 2074159 Российская Федерация, 6 С 05 F 11/08 //(С 05 F 11/08, С 12 R 1:065). Штамм бактерий Azotobacter chroococcum, используемый для получения бактериального удобрения /Г.У.Ожиганова, Г.П.Ланских, И.А.Чернов. Заявлено 02.09.92; Опубл. 27.02.97.

73. Пат. 2099947 Российская Федерация, А 01 N 63/00, С 12 N 1/20 //(С 12 N 1/20, С 12 R 1:125). Биопрепарат Фитоспорин для защиты растений от болезней /В.В.Смирнов, И.Б.Сорокулова, Т.Г.Бережницкая и др. Заявлено 15.11.96; Опубл. 27.12.97. Бюл. 36.

74. Пат. 2128914 Российская Федерация, 6 А 01 N 63/00, С 12 N 1/20 //(С 12 N 1/20, С 12 R 1:125). Способ получения препарата Фитоспорин /Ф.А.Байгузина, Г.А.Штро-ман, Т.Н.Кузнецова и др. Заявлено 30.03.98; Опубл. 20.04.99. Бюл.11.

75. Пат.2147181 Российская Федерация, А 01 N 63/00, С 05 F 11/08. Препарат для повышения урожая растений и защиты их от болезней / А.К.Злотников, И.К.Злотникова, Н.И.Санцевич и др. Заявлено 07.09.99; Опубл. 10.04.2000.

76. Пат. 2178970 Российская Федерация, А 01 N 63/00. штамм Bacillus subtilis ИБ-22 продуцент цитокининов / Мелентьев А.И., Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Архипова Т.Н., Гильванова Е.А., Усанов Н.Г., Кузьмина Л.Ю., Симонян М.В. Опубл. 10.02.2002. Бюл. №4.

77. А.И., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф.; Заявлено 17.08.2001; Опубл. 10.05.2003. Бюл. 13.

78. Плетнева Т.Н., Ладыгина Г.Н., Дыдыкин A.M. Влияние азотобактера на урожайность, качество и некоторые болезни томатов сорта «Горьковский 44» //Тез. докл. конф. «80 лет селекционеру-генетику, акад. И.П.Елисееву». Н.Новгород.-1998.-С. 187-190.

79. Препараты псевдобактерин-2 и псевдобактерин-3 против болезней пшеницы / Е.М. Долгова, О.П.Манько, И.Я.Зубко и др. // Химия в сельском хозяйстве,-1997.-№ 1 -С. 13 -14.

80. Придачина Н.Н., Новогрудская Е.Д., Кругляк Е.Б. и др. Azotobacter chroococcum продуцент нового противогрибкового антибиотика // Антибиотики. - 1982. - Т.27, №1 . - С. 3-5.

81. Пугачева Е.Г. Бактерии Azotobacter vinelandii основа биопрепарата, обладающего фунгицидной акивностью: Дисс. канд. биолог, наук. - Уфа, 2004.- 156 с.

82. Рубенчик Л.И. Азотобактер и его применение в сельском хозяйстве. -Киев: АН УССР, 1960. 328с.

83. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Под ред. Егорова Н.С. 2-е изд. - М: Изд-во Моск. Ун-та, 1983. С.198

84. Свешникова Е.В. Новые бактерии рода Pseudomonas антагонисты фитопатогенов и перспективы их использования в сельскохозяйственной практике: Дисс. канд. биолог, наук. - Уфа, 2003. - 154 с.

85. Свешникова Е.В., Логинов О.Н. Использование биопрепаратов для борьбы с твердой головней пшеницы // Материалы I Международного конгресса "Биотехнология состояние и перспективы развития". 1418.10.2002 г., - М., 2002. -С. 141

86. Сергеева Р. Азотобактерин в повышении урожая томатов // Картофель и овощи. 1960. - №4. - С. 42.

87. Сидоренко О.Д., Стороженко В.А., Кухаренкова О.Р. Применение бактериальных препаратов при выращивании картофеля //Междунар. с-х. ж.-1996.-№ 6.-С. 36-38.

88. Сидоренко О.Д., Стороженко В.А., Голенева Л.М. и др. Влияние микроорганизмов и минерального азота на формирование урожая картофеля

89. Моск. с.-х. акад. им. К.А.Тимирязева. М., 1996.-6 с. Депонированная рукопись.

90. Сидоров Д.Г., Борзенков И.А., Милехина Е.И., Беляев С.С., Иванов М.В. Микробиологическая деструкция мазута в почве при использовании биопрепарата Деворойл //Прикладная биохимия и микробиология.-1998.-34, № З.-С. 281-286.

91. Синицин А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов.-Изд -во Мос.Ун-та, 1994.-288 с.

92. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas.-Киев: Наук, думка, 1990.-264 с.

93. Соловов В.Л., Новохатко Т.Н., Шумская Г.И. //Тез. докл. конф. «Проблемы, способы и средства защиты окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами». М., 1995.-С. 73-74.

94. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. 2001 год. Приложение к журналу «Защита и карантин растений».-№3, 2001 г.

95. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Дульгеров А.Н., Иванов В.Н. Применение биопрепарата «Лестан» для очистки почвы от углеводородов нефти //Прикладная биохимия и микробиология.-1996.-32, № 2.-С. 219-223.

96. Сторожук С.В., Сидоров И.А., Соколов М.С. Высокое качество биопрепарата залог успеха //Защита растений.-1995.-№ 8.-С. 17.

97. Суржко Л.Ф., Финкельштейн З.И., Баскунов Б.П., Янкевич М.И., Яковлев В.И., Головлева Л.А. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками //Микробиология.-1995.-64, № З.-С. 393-398.

98. Титаренко Л.Н., Вяткина Г.Г., Алещенко М.Н. Применение ризоплана на Северном Кавказе //Защита растений.-1995.-№ 8.-С. 17.

99. Титова Л.В., Антипчук А.Ф., Курдиш И.К. и др. Влияние высокодисперсных материалов на физиологическую активность бактерий рода Azotobacter // Микробиол. журн. 1994. - Т.56, №3. - С. 60-64.

100. Трейкале О., Дзене А., Николаева В. и др. Биодеструкция полимерных матриц, содержащих полигидроксибутират, и биологическая эффективность иммобилизированных фунгицидов // Защита растений на рубеже XXI в. -Минск, 2001.-С. 455-457.

101. Хотянович А.В., Позднякова А.И. Производство торфяных препаратов клубеньковых бактерий // Труды ВНИИ сельскохоз. микробиолог. М., 1980. Т.50

102. Шерстобаева Е.В., Дудинова И. А. и др. Биопрепараты азотфиксирующих бактерий: проблемы и перспективы применения // Микробиол. журн. 1997. - Т.59, №4. - С. 109-116.

103. Щеблыкин И.Н., Биттеева М.Б., Бирюков В.В. //Трубопроводный транспорт нефти.-1995.-№ З.-С. 19-28.

104. Шлегель Г. Общая микробиология.- М.-1987 566 с.

105. Ягафарова Г.Г., Гатауллина Э.М. Испытания биопрепарата «Родотрин» для ликвидации нефтяных загрязнений //Баш. хим. ж.-1995.-2, № 3-4.-С. 6970.

106. Ягафарова Г.Г., Скворцова И.Н. Новый нефтеокисляющий штамм бактерий Rhodococcus erythropolis //Прикладная биохимия и микробиология.-1996.-32, № 2-С. 224-227.

107. Aguilar J.E., Sanchez М. Efecto de una rizobacteria nitrofijadora у nivelesfade fertilizan-te en el comortamiento agronomico del tomate Lycopersiconesculentum var. //Acta ag-ron.-1998.-Vol. 48, № 1/2.-P. 60-70.

108. Arshad M., Frankenberger W. Microbial production of plant hormones // Plant and Soil.-1991.-Vol.133.-P. 1-8.

109. Azcon R., Barea J.M. Synthesis of auxins, gibberellins and cytokinins by Azotobacter vinelandii and Azotobacter bijerinkii related to effects produced on tomato plants // Planta Soil.-1975.- Vol.43 .-P.609.

110. Bakker P.A., Bakker A.W., Geets F.P. et al. Increase of potato tuber yields in short rotations of potato by seed tuber treatment with fluorescent Pseudomonas sp. ///Developm. in Plant Soil Sc. Dordrecht etc.-1989.-№ 40.-P. 163-170.

111. Barea J.M., Brown M.E. Effects of plant growth produced by Azotobacter paspali related to synthesis of plant growth regulating substances // J.Appl. Bacteriol.-1974.-Vol.40.-P.583-599.

112. Blondeau R. Nature d'une cytokinine presente dans les cultures de certains Arthrobacter // C.R. Acad. Sci.-1974/-Vol. D.297.-P.1571-1574.

113. Blondeau R. Contribution a l'etude au niveau de la rhisosphere // These doct. sci. nat. bill.- Univ. Soet. Techn.-1985.-P.212-215

114. Brodelius P., Vandamme. In: Biotechnology.-1987. P. 405-464.

115. Caponlgro V. Coloizzazione radicale di tabacco con Pseudomonas fluorescenti //Ann. 1st. Sper. Tabacco. Scafoti (Salerno).-1986.-Vol. 12.-P. 49-64.

116. Copolla S., Giannattasio H. Activita citockinica in un actimicete rizosherico //Boll. Sci. Ital. Biol. Sper.-1968.- Vol. 44.-P. 1913-1915

117. Dibut Alvarez В., Martinez Viera R., Casanova Castillo I. Accion estimuladora de Azo-tobacter chroococcum sobre cultivo del tomate en suelo Ferralitico Rojo //Agrotecn. Cuba.-1997.-Vol. 27, № 2/3.-P. 20-25.

118. Gerson D.F., Zajic J.E. In: Immobilized Microbial Cells.-1974.- Vol. 106.-P. 29-58.

119. Govedrica M., Milosevic N., Jarak M. et al. Uticai diazatrofa na prinos i kvalitet secerne repe //Zb. Rad./Nauc. Inst. Ratarstvo Povrtarstvo.-Novi Sad, 1997; Sv. 32, S. 285-292.

120. Hattori R., Hattori T. J.Gen. Appl. Microbiol. -1985.-Vol.50.-№2. P.147163.

121. Konde B.R., Desai J.N. Influence of inoculum of Azotobacter on growth and yield of wheat //Food Faqrmg. Agric.-1996.-Vol. 8, № 3.-P. 13-14.

122. Kumar V., Narula N. Solubilization of inorganic phosphates and growth emergence of wheat as affected by Azotobacter chroococcum mutants // Biol. Fertil. Soils. -1999. Vol.28, № 3. - P. 301-305.

123. Mew T.W., Rosales A.M. Bacterization of rice plants for control of sheath blight caused by Rhizoctonia solani //Phytopathology.-1986.-Vol. 76, № 11.-P. 1260-1264.

124. Mori A. Proc. Biochem.-1985.-Vol.20, №3.-P. 67-74

125. Mozes N., Marchal F., Hermesse M.P. et al. Biotechnol. Bioeng.- 1987.-Vol.30.- P.43 9-450

126. Mrkovacki N., Kovacev L., Cacic N. et al. Primena mikrobioloskog ^ preparata u proi-zvodnji secerne repe //Zb. Rad./Nauc. Inst. Ratarstvo Povrtarstvo.

127. Novi Sad, 2001; Sv. 35.-S. 67-73.

128. Mrkovacki N., Cacic N., Kovacev L. et al. Response of sugar beet to inoculation with Azotobacter in field trials //Agrochimica.-2002.-Vol. 46, № 1/2.-P. 18-26.

129. Narula N., Kumar V., Behl R.K., et al. Effect of P-solubilizing Azotobacter chroococcum on N, P, К uptake in P-responsive wheat genotypes grown under greenhouse conditions // J.Plant Nutrit.Soil Sc. -2000. -Vol.163. № 4. P. 393398.

130. Osburn R.M., .Schroth M.N, .Hancook J.G et al. Dynamics of sugar beet colonization by Pythium ultimum and Pseudomonas species: effects on seed rot and damping-off// Phytopathology.- 1989.-Vol. 79, № 6.-P. 709-716.

131. Pietr S.J. Cucumber rhizosphere pseudomonads as antagonists of Fusarium //Interrelationships Between Microorganisms and Plants Soil: Proc. Int. Symp., June 22-27, 1987,-Praha, 1989.-P. 411-417.

132. Rabie K.A.E., Nasr S.A., Mervat A.A. The effect of a symbiotic nitrogen fixers on the growth and endogenous growth substances of wheat plants //Ann. agr. Sc.-1995.-Vol. 40, № l.-P. 11-32.

133. Renato de Freitas J. Pseudomonas cepacia and Pseudomonas putida as ujr winter wheat inoculants for biocontrol of Rhizoctonia solani //Can. J. Microbiol.1991.-Vol. 37, № 10.-P. 780-784.

134. Rosario Azcon, Barea J.M. Synthesis of auxins, gibberellins and cytocinins by Azotobacter vinelandii and Azotobacter biejierincii related to effects produced on tomato plants // Plant and soil. -1975.-№ 43. P.609-619.

135. Shanshoury A.R. Interactions of Azotobacter chroococcum, Azospirillum brasilense and Streptomyces mutabilis in relation to their effect on wheat development //J. Agron. Crop. Sc.-1995.-Vol. 175, № 2.-P. 119-127.

136. Sindhu S.S., Lakshminarayana К., Singh D. Expression of hydrogenase activity in Azotobacter chroococcum and its possible role in crop productivity //Indian. J. exper. Biol.-1994.-Vol. 32, № 4.-P. 423-426.

137. The newsletter of Phillips McDouglall-AgriService. May 2003, № 43, P. 1-4.

138. Tomar U.S., Tomar I.S., Badaya A.K. Response of chemical and biofertilizers on some matric traits in wheat //Crop Res.-1998.-Vol. 16, № 3.-P. 408-410.

139. Vasantha D.T., Malar V.R., Sakthivel N. et al. Biological control of sheath-blight of rice in India with antagonistic bacteria //Plant and Soil.-1989.-Vol. 119, № 2.-P. 325-330.

140. Zaspel J. Isolierung und Selektion fluoreszierender Pseudomonas-Arten als Antagonisten gegen Gaeumannomyces graminis (Sacc.) //Arch. Phytopathol. Pflzschutz.-1989.-Bd. 25, H. 2.-S. 123-130.