Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биорекультивация загрязненных углеводородами грунтов с использованием психротолерантных микроорганизмов, обладающих микостатической активностью

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биорекультивация загрязненных углеводородами грунтов с использованием психротолерантных микроорганизмов, обладающих микостатической активностью"

На правах рукописи

СМОЛОВА ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

БИОРЕКУЛЬТИВАЦИЯ ЗАГРЯЗНЕННЫХ УГЛЕВОДОРОДАМИ ГРУНТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПСИХРОТОЛЕРАНТНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ОБЛАДАЮЩИХ МИКОСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 ФЕВ 2015

Щелково - 2015

005559480

005559480

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Уфимский Институт биологии РАН

Научный руководитель:

Бакаева Маргарита Дмитриевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН Уфимский институт биологии РАН

Официальные оппоненты:

Сопрунова Ольга Борисовна, доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой «Прикладная биология и микробиология» ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет»

Филонов Андрей Евгеньевич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории биологии плазмид ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Уфимский государственный нефтеной технологический университет»

Защита состоится 17 апреля 2015 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП; тел./факс: 8(496)567-32-61, (347)235-62-47, e-mail: vnitibp@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии

Автореферат разослан февраля 2015 г. и размещен на сайте ВНИТИБП

Россельхозакадемии www.vnitibp.com и на официальном сайте ВАК http://www.vak.ed.gov.ru

Ученый секретарь Фролов Юрий

диссертационного совета, кандидат биологических наук

Дмитриевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В России в связи с постепенным истощением месторождений Поволжья и Северо-Кавказского региона добыча нефти и сопровождающее ее загрязнение территорий постепенно перемещается на север. По чрезвычайным техногенным ситуациям, связанным с выбросами нефти и нефтепродуктов, Ханты-Мансийский автономный округ лидирует не только в России, но и в мире. Несмотря на многократное увеличение объемов рекультивационных работ, проблема нефтяного загрязнения в округе остается чрезвычайно острой (Чижов, 2008). Поэтому разработка и совершенствование технологий рекультивации загрязненных нефтяными углеводородами северных земель является актуальным направлением научных исследований.

Степень разработанности проблемы

Ряд российских и иностранных научных работ посвящен исследованию реакции тундровых и арктических экосистем на нефтяное загрязнение (Mair et al., 2013), изучению свойств деструкторов углеводородов, развивающихся при низких положительных температурах (Whyte et al., 1999, Пырченкова и др., 2006, Margesin et al., 2013). Акцент в таких работах, как правило, делается на поиске психрофильных бактерий, однако в качестве основы для технологий биорекультивации более предпочтительны психротолерантные микроорганизмы, способные расти при большом перепаде температур весна-лето-осень, характерных для резко-континентального климата.

Современной тенденцией в области экологической биотехнологии является поиск микроорганизмов, одновременно обладающими несколькими полезными качествами, такими как способность работать в широком диапазоне температур, стимулировать рост растений, подавлять патогенные микроорганизмы. Принципиальная возможность совмещения углеводородокисляющей и микостатической активности у одного штамма бактерий показана для представителей рода Pseudomonas (Минаева и др., 2008). Однако исследований возможности использования таких микроорганизмов для биорекультивации загрязненных почв нами обнаружено не было.

Цель работы. Разработать новый биопрепарат на основе психротолерантных микроорганизмов и оценить эффективность его применения для биорекультивации грунтов, загрязненных углеводородами.

Задачи исследования

1. Выделить из загрязненных нефтью грунтов микроорганизмы, способные к окислению углеводородов при пониженных температурах и изучить их свойства, важные для биорекультивации загрязненных почв.

2. Провести сравнительную оценку эффективности консорциума бактерий ИБ НД 1 относительно коммерческого биопрепарата Ленойл в процессе очистки подзолистой почвы, чернозема и техногенного отхода, содержащего углеводороды.

3. Изучить воздействие окисляющего углеводороды консорциума ИБ НД 1 на микроскопические грибы загрязненных нефтью почв.

4. Разработать технологию получения биологического препарата для рекультивации загрязненных углеводородами грунтов на основе консорциума бактерий ИБ ИД 1.

5. Разработать способы применения биопрепарата на основе консорциума бактерий ИБ НД 1 для биологической рекультивации загрязненных нефтью грунтов в условиях пониженных температур.

Научная новизна.

Впервые на основании направленного скрининга выделен и изучен консорциум из психротолерантных штаммов с углеводородокисляющей и микостатической активностью в качестве основы для биорекультивации загрязненных нефтяными углеводородами грунтов.

Экспериментально доказано, что использование консорциума ИБ НД 1 более эффективно снижает фитотоксичность почв, чем применение биологического препарата Леиойл при сопоставимой эффективности окисления углеводородов. Внесение в подзолистую почву и чернозем консорциума ИБ НД 1 способствует нормализации численности и состава микроскопических грибов, в том числе уменьшает количество фитопатогенных микромицетов.

Впервые показана возможность утилизации углеводородсодержащего отхода нефтехимической промышленности с применением консорциума ИБ НД 1 при пониженных температурах.

Практическая значимость

Доказана высокая эффективность биотехнологических приемов, основанных на применении психротолерантного консорциума ИБ НД 1 для рекультивации загрязненных объектов, в том числе подзолистой почвы, чернозема и отработанной отбеливающей земли, содержащей нефтепродукты.

Разработанная технология биорекультивации загрязненных нефтяными углеводородами грунтов с положительным результатом испытана в промышленных

4

условиях при проведении рекультивационных работ на полигоне ОАО «Орскнефтеоргсинтез» и на нефтяном разливе на Мамонтовском месторождении Ханты-Мансийского автономного округа.

Степень достоверности результатов

Статистическую обработку полученных данных проводили в компьютерной программе Microsoft Excel 2003 с использованием дополнительной функции «анализ данных». Оценка достоверности различий полученных совокупностей данных была выполнена с применением t-критерия Стьюдента с уровнем достоверности 95%.

Апробация работы

Основные результаты исследований были представлены на 15-й Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2011 г.), IV Международной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы науки и техники» (Уфа, 17-18 мая 2012 г.), 17-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 21-26 апреля 2013 г), Всероссийской молодежной научно-практической конференции «Актуальные вопросы науки и образования» (25-27 апреля 2013 г., Уфа), школе-конференции молодых ученых на базе Института фундаментальных проблем биологии РАН «Биосистема: от теории к практике» (Пущино, 24-25 октября 2013 г.), IV Международной научно-практической конференции с элементами научной школы для молодежи «Экологические проблемы нефтедобычи - 2014» (Уфа, 21-23 октября 2014 г.), Международной научно-практической конференции «Наука и образование в XXI веке» (Тамбов, 31 октября 2014 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК, рекомендованных для соискателей ученой степени кандидата биологических наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, экспериментальной части, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 122 страницах, содержит 35 таблиц и 10 рисунков. Список литературы включает 110 наименований, из них 37 на английском языке.

Личный вклад автора заключается в разработке основных положений

диссертации, выносимых на защиту, постановке целей и задач исследований,

решении поставленных задач, планировании экспериментов и выполнении

исследований, обобщении результатов и использовании их в практике. Результаты

диссертационной работы являются совокупностью многолетних научных

5

исследований, проведенных в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Уфимский Институт биологии РАН лично автором и при его непосредственном участии в качестве ответственного исполнителя.

Благодарности. Свою глубокую благодарность за постоянное внимание и консультации автор выражает д.б.н., профессору О.Н. Логинову. Автор искренне благодарит всех сотрудников лаборатории биологически активных веществ Уфимского Института биологии РАН за постоянную поддержку при выполнении работы. Особую признательность автор выражает безвременно ушедшему из жизни первому научному руководителю д.б.н. H.H. Силищеву за идейное вдохновение, ценные советы и научно-методическое руководство.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы, способные использовать нефть в качестве единственного источника углерода, выделяли методом накопительных культур из образцов почвы, загрязненной нефтью в результате промышленных аварий. Окислительную активность культур определяли по количеству выделенного конечного продукта окисления нефтепродуктов - углекислого газа.

С целью идентификации исследовали морфологические, физиологические и биохимические признаки чистых культур, используя общепринятые руководства (Методы общей бактериологии, 1984, Добровольская и др., 1990, The Prokaryotes, 1992, Определитель бактерий Берджи, 1997). Для более точной идентификации бактерий проведены секвенирование и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК с известными структурами из GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank).

В условиях модельного эксперимента исследования проводили на образцах чернозема выщелоченного, отобранного на территории сельскохозяйственных угодий в Республике Башкортостан (азот 0,41%, гумус 8,2%, рНка 5,7), а так же на образцах подзолистого среднесуглинистого почвогрунта (азот 0,09%, гумус 1,2%, рНкс1 4,3) и торфянистого почвогрунта (азот 3,5%, орг.вещ. 51%) отобранного на территории Ханты-Мансийского автономного округа. В качестве загрязнителя использована товарная нефть Угутского месторождения (температура начала кипения 85°С, содержание серы 1,1 мас.%). Подзолистый грунт инкубировали в емкостях по 2 кг в холодильной камере при температуре 8°С и 15°С, чернозем - при комнатной температуре воздуха 18-25°С. Содержание остаточных углеводородов в грунте определяли весовым методом после экстракции углеводородов из навески образца почвы или грунта хлороформом на аппарате Сокслета (ПНД Ф 16.1.416

04).Фитотоксичность грунта определяли по степени прорастания семян кресс-салата и томата, учитывали так же длину проростков.

Учет численности физиологических групп микроорганизмов осуществляли методом разведений на питательных средах: микроорганизмов, использующих минеральные формы азота - на крахмал-аммиачной среде, целлюлозоразушающих микроорганизмов - на среде Хетчинсона и Клейтона, микроскопических грибов - на среде Чапека - Докса, углеводородокисляющих бактерий - на средах Диановой-Ворошиловой и Цукамуры (Звягинцев, 1991, Практикум по микробиологии, 2005). Для поддержания и культивирования фитопатогенных грибов использовали среду Чапека и агар картофельно-глкжозный. Антагонистическое действие бактериальных культур по отношению к штаммам фитопатогенных грибов Altenuiria alternate, Bipolaris sorokiniana, Fusarium nivale BKM 3106, Fusarium o.xysporitm BKM 137, Fusarium solani BKM 142 определяли по образованию зон ингибирования роста грибного газона в чашках Петри. Длину гиф грибного мицелия определяли методом мембранных фильтров. Идентификацию видов микроскопических грибов проводили по определителям (Литвинов, 1967, Милько, 1974, Пидопличко, 1972, Билай, 1977, Билай, 1988, Watanabe, 200, Алимова, 2005). Видовые названия микроскопических грибов уточняли по пополняемым спискам опубликованных видов в базе данных «Species fungorum» (wwvv.spcciesfungorum.org).

В процессе исследований были использованы коммерческие биопрепараты. Деструктор углеводородов Лепойл на основе штаммов Acinetobacter sp. ИБ ДТ -5.1/1, Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2. Ленойл - норд, отличающийся от базовой формы биопрепарата Ленойл наличием в нем психротолерантного штамма Pseudomonas sp. ИБ-1.1. Биопрепарат Елена на основе штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ-51 является стимулятором роста растений, обладающим фунгицидным эффектом. Биопрепарат Азолен на основе штамма Pseudomonas sp.

- полифункциональным средством для улучшения плодородия почв.

Опытные серии биопрепарата для полевых испытаний выращивали в модифицированных лабораторных ферментерах АК-210 (СКБ БП, Пущино). Сухую препаративную форму получали путем сепарации культуральной жидкости на бактофуге при 9000 об./мин и лиофильной сушки биомассы при -45°С.

Полевые испытания предложенной технологии биологической рекультивации проводили в 2013-2014 гг. на отвалах отработанной отбеливающей земли (содержание углеводородов 43-220 г/кг) на полигоне промышленных отходов ОАО «Орскнефтеоргсинтез», а также на участке подзолистой почвы, загрязненной в

результате утечки товарной нефти (содержание углеводородов 580-800 г/кг ночвы).

7

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение, описание л идентификация микроорганизмов - деструкторов

В Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Уфимский Институт биологии РАН из 14 образцов загрязненной почвы различного происхождения было выделено 32 культуры психротолерантных микроорганизмов. На основе таких показателей как динамика численности и разложение углеводородов при росте в жидкой питательной среде с нефтью был выбран активный консорциум микроорганизмов и помещен в Коллекцию микроорганизмов Уфимского Института биологии РАН под номером ИБ НД 1, а составляющие его штаммы обозначены как ИБ НД 1.1 и ИБ НД 1.2.

На основании морфологических, культурально-биохимических признаков и анализа генов 16S рРНК было установлено сходство штамма ИБ НД 1.2 со штаммом Pseudomonas nitroreducens DSM 14399 (Т) АМ0088474 (99,93% общих нуклеотидов). Штамм ИБ НД 1.1 однозначно идентифицировать до вида не удалось, он был определен как Rhodococcus sp. ИБ НД 1.1. Максимальная степень сходства 99,49% обнаружена между штаммом Rhodococcus sp. ИБ НД 1.1 и штаммами Rhodococcus gingshengii djl 6 (Т) DQ090961 и Rhodococcus jialingiae djl-6-2(T) DQ185597. Положение изучаемых штаммов бактерий по отношению к филогенетически близким им видам представлено на рисунках 1 и 2.

-Rhodococcus_baikonurensis_GTC_1041 (Т)

63J Rhodococcus Jialingiae_djl-6-2(T) Rhodococcus_qingshengii_djl-6(T) -Rhodococcus sp ND IB 1.2

• Rhodococcus_erythropolis_DSM_43066(T)

- Rhodococcus_globerulus_DSM_4954(T) -Rhodococcus_triatomaeJMMIB_RIV-085(T)

— Rhodococcus_marinonascens_DSM_43752fO

- Rhodococcus_koreensis_DNP505fO -Rhodococcus JostiiJFOJ 6295(7)

- Rhodococcus_wratislaviensis_NBRC_100605(T)

— Rhodococcus_percolatus_MBS1(T)

0.002

Рис. 1. Филогенетическое положение штамма Rhodococcus ер. ИБ НД 1.2 согласно анализу нуклеотидных последовательностей гена 165 рРНК

100

— Pseudomonas_citronellolis_DSM_50332(T) -Pseudomonas_delhiensis_RLD-1(T)

- Pseudomonas_panipatensis_Esp-1(T)

- Pseudomonas_knackmussH_B13(T)

100

| Pseudomonas sp. ND IB 1.1

Pseudomonas_nitroreducens_DSM_14399(T)

-PseudomonasJinjuensis_Pss_26(T)

-Pseudomonas_otitidis_MCC10330(T)

■ Pseudomonas_alcaligenes_NBRC_14159(T)

0.005

Рис. 2. Филогенетическое положение штамма Pseudomonas nitrorcdiicens ИБ НД 1.1 согласно анализу нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК

Определение окислительной активности культуры ИБ НД 1 и составляющих ее штаммов по отношению к нефти и дизельному топливу

Определение окислительной активности было использовано для проверки способности консорциума ИБ НД 1 к окислению нефтяных углеводородов при пониженных температурах и сравнения ее с возможностями коммерческого биологического препарата Ленойл. Было показано, что при температуре 5°С и 15°С консорциум ИБ НД 1 окисляет нефть более активно, чем биопрепарат Ленойл (табл. 1). При этом окислительная активность индивидуальных штаммов Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 и Pseudomonas nitroreducens ИБ НД 1.1 по отношению к нефти и дизельному топливу была ниже, чем у консорциума их включающего. Штамм Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 обладал более выраженной психротолерантностью.

Таблица 1- Окислительная активность консорциума ИБ НД 1 и отдельных штаммов по отношению к нефти при различной температуре (мг СО;/г) за 3 суток

Микроорганизмы Температура, °С

25+1 20±1 15+1 5+1

Ленойл 117,8±7,3 112.6+8.0 78.3+8,7 35,6±4.1

Консорциум ИБ НД 1 136.2+11.9 131.4+5,7 128.6+6.2 83,9+6.9

Pseudomonas nitroreducens ИБ НД 1.1 120, 2±10,5 110,3±11,6 73,2±4,7 21,4+4,4

Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 125,7+5,3 119,6+4,5 124,6+7,5 77,5+4,2

Бнорекультивация подзолистой торфянистой почвы при пониженной температуре в лабораторных условиях

Биорекультивация подзолистой торфянистой почвы, загрязненной нефтью Угутского месторождения, консорциумом ИБ НД 1 была смоделирована в лабораторных условиях при температуре 14°С. Численность аборигенных окисляющих углеводороды микроорганизмов была высокой - порядка 106-107 КОЕ/г. Однако интродукция консорциума ИБ НД 1 и биопрепарата Ленойл обеспечивала большую скорость разложения углеводородов в грунте по сравнению с активностью аборигенных микроорганизмов (рис. 3). Максимальная скорость удаления углеводородов из грунта, загрязненного нефтью в концентрации 4% и 8%, была зарегистрирована до 30 суток, а при 16% загрязнении - с 30 по 60 сутки. Значимых отличий в остаточном содержании нефти между вариантами опыта с Ленойлом и культурой ИБ НД 1 при 8% и 16% загрязнении обнаружено не было.

^^ контроль -»—Ленойл -ж-ИБ НД 1 ■ Контроль а Ленойл □ ИБ НД 1

а) б)

Рис. 3. Содержание остаточных углеводородов (а) и всхожесть семян кресс-салата (в конце эксперимента) (б) в подзолистом грунте с 8% загрязнением нефтью

Фитотоксичность подзолистой почвы по отношению к семенам кресс-салата зависела от концентрации нефти и внесенных в нее микроорганизмов -деструкторов. С ростом концентрации нефти всхожесть семян кресс-салата значительно снижалась. На грунте, обработанном консорциумом ИБ НД 1, всходило больше семян, чем после обработки Ленойлом при сопоставимом содержании остаточных углеводородов.

После интродукции микроорганизмов - деструкторов, особенно консорциума ИБ НД 1, в грунте уменьшалось количество микроскопических грибов, а их видовой

состав имел больше сходства с составом микромицетов в незагрязненном контроле, чем у необработанных препаратами образцов.

Исследование антагонистической активности штаммов Pseudomonas

nitroreducens ИБ НД 1.1 и Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 по отношению к микроскопическим грибам

В результате сопоставления данных о численности и составе микроскопических грибов, концентрации остаточных углеводородов и фитотоксичности почвы было предположено, что консорциум способен продуцировать биологически активные вещества. В связи с этим входящие в состав консорциума штаммы были протестированы на способность угнетать рост фитопатогенных грибов.

Было выявлено, что штамм Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 не обладает антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам видов Alternaría alternate, Bipolaris sorokiniana, Fusarium nivale, Fusarium oxysporum, Fusarium solani. Тогда как нанесение штамма Pseudomonas nitroreducens ИБ НД 1.1 на газон этих грибов в чашках Петри вызывало появление зон ингибирования их роста. Радиус зон подавления грибного роста по сравнению с зонами, образуемыми известными биопрепаратами с антигрибной активностью Елена и Азолен представлены в таблице 2. Биологические препараты Елена и Азолен были выбраны в качестве объектов для сравнения в связи с наличием экспериментальных данных о том, что входящие в их состав микроорганизмы способны выживать в загрязненных нефтью почвах и оказывать влияние на процесс их рекультивации.

Таблица 2 - Радиус зон угнетения роста микромицетов бактериями-антагонистами, мм_

Виды микромицетов Бактерии

Pseudomonas nitroreducens ИБ НД 1.2 биопепарат Елена биопепарат Азолен

Alternaría altérnala (Fr.) Keissl. 8,0+1,5 18,2+3,8 14,6+1.5

Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker 10,6+0,9 28,6+4,3 23,5±2,7

Fusarium nivale Ces. ex Berl. and Voglino 8,1+1,2 13,5+2,1 10,8+2,9

Fusarium oxysporum Schltdl 6,2+1,3 15.0+3,3 14,4+2,0

Fusarium solani (Mart.) Sacc. 5.4+1,7 16.2+2.7 12,1+3.0

Биорекультивация почв в лабораторных условиях с применением микроорганизмов, выделяющих биологически активные вещества

Рекультивацию подзолистой почвы при более низкой температуре изучали в холодильной камере при 8°С. Чтобы определить влияет ли консорциум ИБ ИД 1 на свойства рекультивируемой почвы так же как биопрепараты - антагонисты

фитопатогенных грибов Елена и Азолен их вводили в качестве дополнительных вариантов опыта.

Выявлено положительное влияние интродукции окисляющих углеводороды бактерий на деструкцию нефти при температуре 8°С (рис. 4). Внесение консорциума ИБ НД 1 в подзолистый грунт, загрязненный нефтью в концентрации 10% и 15%, приводило к удалению большего количества углеводородов по сравнению с биопрепаратом Ленойл. При концентрации 5% разница была статистически недостоверной.

Применение биопрепарата Ленойл и консорциума ИБ НД 1 увеличило численность окисляющих углеводороды микроорганизмов до 2,4-106 - 8,5-107 КОЕ/г по сравнению с загрязненными почвами без биопрепартов, где она составляла 5,3-103 - 5,6-104 КОЕ/г. Существенных отличий в численности микроорганизмов

между вариантами опытов с использованием разных

микроорганизмов - деструкторов выявлено не было.

Воздействие консорциума ИБ НД 1 на разложение углеводородов и детоксикацию грунта исследовали также на окультуренном черноземе.

При 10% загрязнении введение любых бактерий, выделяющих биологически активные вещества, в рекультивируемый грунт увеличивало темпы его очистки. При 15% степени загрязнения лучшие результаты фиксировались для сочетания биопрепаратов Ленойл и Елена и консорциума бактерий ИБ НД 1. Обнаружено, что фитотоксичность загрязненной нефтью подзолистой почвы и чернозема (рис. 5) по отношению к семенам кресс-салата и томата после обработки консорциумом ИБ НД ] была ниже, чем после обработки биопрепаратом Ленойл.

30 60 90

Сроки отбора проб, сутки

О—Ленойл й— Ленойл+Азолен Ж Без биопрепаратов

- ИБ НД 1 -Ленойл+Елена

Рис. 4. Динамика содержания углеводородов подзолистого грунта с 15% загрязнением нефтью в процессе рекультивации при температуре 8°С

Меньшая фитотоксичность по сравнению с вариантом опыта с биопрепаратом Ленойл наблюдалась и в вариантах опыта. где рекультивация чернозема и подзолистого грунта дополнялась внесением в грунт биопрепаратов Елена или Азолен. Многие семена и проростки на загрязненном черноземе без введения консорциума ИБ НД 1 и биопрепаратов Елена или Азолен поражались грибным

мицелием.

При изучении комплекса почвенных микроскопических

грибов были использованы такие показатели как длина мицелия в 1 г почвы и его видовой состав.

Обнаружено относительно невысокое содержание грибного мицелия в незагрязненном черноземе (27,5±4.4 м/г) и подзолистом грунте (105±11 м/г). Нефтяное загрязнение в концентрации 5%, 10% и 15% вызывало увеличение этого показателя (табл. 3). Гораздо меньше мицелия обнаруживалось после рекультивации, возможно за счет вытеснения его бактериальной составляющей биоценоза. Более выраженное антигрибное влияние оказывала интродукция культуры ИБ НД 1, а так же биопрепарата Елена, что. возможно, свидетельствует о влиянии их метаболитов на микроскопические грибы в почвенных образцах.

В частности, в загрязненных почвах возрастала доля грибов, принадлежащих к родам Fusarium и Aspergillus. Из использованных для интродукции утилизирующих углеводороды микробных культур ИБ НД 1 в большей степени, чем Ленойл влияла на видовой состав почвенных микромицетов. значительно снижая долю представителей рода Fusarium.

Дополнительное введение биопрепаратов с антигрибной активностью Елена и Азолен также уменьшало количество фузариев относительно представителей других родов. Данное обстоятельство в совокупности с уменьшением количества грибного мицелия можно считать благоприятным фактором для последующей фитомелиорации.

П Без биопрепарата □ Ленойл

еа ИБ НД 1 И Ленойл+Елена

Н Ленойл+Азолен

Рис.5. Всхожесть семян кресс-салата на загрязненном нефтью черноземе

Таблица 3 - Длина грибных гиф через 60 суток в загрязненной нефтью почве, м/г _

Микроорганизмы Концентрация нефти, %

5 10 15

Чернозем

Без биопрепарата 121,5+7,4 119,1+21,0 59,3+9,5

Ленойл 64,0+6,8 71,3+4,0 43,0+3,9

ИБ НД 1 22,0±4,2 28,8+5,0 16,4+2,7

Ленойл+Елена 25,5±3,3 20,4+1,8 9,8+0,5

Ленойл+Азолен 70,2+8,3 55,8+7,1 54,0+4,6

Подзолистый грунт

Без биопрепарата 117,0±5.6 145,1+5,5 130,8+3,1

Ленойл 54,0+7,2 89,6+4,0 23,1+1,8

ИБ НД 1 20,6+3,9 45,1+6,8 13,6+3,7

Ленойл+Елена 15,0+2,1 21,7+1,6 16,3+0,5

Ленойл+Азолен 54,3+4,5 83,0+1,8 10,8+0,3

Ленойл+Азолен ► Ленойл+Елена ИБ НД 1 Ленойл без интродукции незагрязненная почва

□ Fusarium S Penicillium и Aspergillus в Trichoderma □ Mucor а другие

Представители рода Aspergillus не были в такой степени подвержены

воздействию биопрепаратов. Как в загрязненной, так и в рекультивируемой почве они составляли значительную часть выделенных грибных изолятов, а после внесения нефти в количестве 15% доминировали в грибном комплексе.

Таким образом,

уменьшение температуры инкубации почвы до 8°С выявило некоторое преимущество ИБ НД 1 как психротолерангного консорциума микроорганизмов. Консорциум ИБ НД 1 и препараты- антагонисты грибов воздействовали на почвы сходным образом. Использование представителей рода Pseudomonas с антигрибной активностью, способствовало уменьшению

Рис. 6. Доля представителей различных родов в составе комплекса микроскопических грибов незагряз-ненного, загрязненного нефтью в количестве 15% и рекультивированного чернозема

фитотоксичности обрабатываемых почв и снижению обилия в них микромицетов. Использование консорциума ИБ НД 1 позволяет избежать сложных схем рекультивации с внесением нескольких типов биопрепаратов и снимает проблему выживания микроорганизмов - синтетиков биологически активных веществ в загрязненной почве.

Полевые испытания биотехнологии рекультивации загрязненных нефтью грунтов на основе консорциума микроорганизмов ИБ НД 1

Консорциум ИБ НД 1 был использован в 2013 году для рекультивации нефтяного разлива на Мамонтовском месторождении (куст 290) Ханты-Мансийского автономного округа. Подвергшаяся загрязнению почва сформировалась на месте заросшего лесом болота, торфянистый горизонт расположен близко к поверхности почвы, растительные остатки в лесной подстилке представлены в основном неперегнившим мхом. Непосредственно после порыва нефтепровода в 2012 г. избыток нефти был собран механическим способом. Степень загрязнения нефтью высокая - 66-80%. Среднемесячная температура в период рекультивации: сентябрь 2013 г. +7,8°С; октябрь 2013 г. -1°С; апрель 2014 г. -0,5°С; май 2014 г. +7,7°С.

Перед началом эксперимента участки очищали от мусора, мертвой растительности и рыхлили. 1 сентября 2013 г. в почву вносили суспензию микроорганизмов в титром 108 КОЕ/мл в количестве 1 л/м2. В качестве вариантов для сравнения помимо консорциума ИБ НД 1 использованы другие психротолерантные микроорганизмы, предоставленные сотрудниками Института биологии УНЦ РАН.

Полученные результаты свидетельствуют об активном разложении нефти в осенние месяцы непосредственно после внесения в почву микроорганизмов-деструкторов (рис. 7), за исключением варианта опыта со штаммом ЯЛо^ососс/« ер. ИБ 3.3. По-видимому, этот штамм не смог конкурировать в условиях, сложившихся в данной почве. Количество углеводородов, удаленных из почвы с момента схода снега до 1.06.2014 было меньше, хотя на рекультивированном участке этот показатель был по-прежнему выше, чем в контроле. За осенне-весенний период за счет деятельности консорциума ИБ НД 1 из почвы удалось удалить 45 % содержавшихся в ней углеводородов.

1 2 3 4 5

варианты опыта

Рис.7. Убыль углеводородов в почве рекультивированного нефтяного разлива 1 - контроль, 2 - ИБ НД 1,3- Ленойл-норд, 4 - 11Ьос1ососси8 ер. 3.3, 5 -ЯЬюёососсив ер. 4.4

Рекультивация с применением консорциума ИБ НД 1 значительно увеличивала численность углеводород окисляющих микроорганизмов (табл. 4). Причем более высокая численность регистрировалась так же и в весенних пробах.

Таблица 4 - Численность окисляющих углеводороды микроорганизмов в почве рекультивированного нефтяного разлива, КОЕ/г

Внесенные в почву микроорганизмы Даты отбора проб

5.09.20013 26.09.2013 1.06.2014

контроль(без внесения микрорганизмов) менее 103 (1,7+0,3)-103 (2.2+0,4)-104

консорциум ИБ НД 1 (1,2+0,2)-106 (7,8±0,4)-104 (4.0±0,3)-106

Ленойл-норд (7,5+0,4)-104 (7,5+0,5)-104 (6,0+0.4)-106

1?.Ьо(1ососси5 ер. 3.3 (2,2±0,2)-105 (1,2+0,5)-104 (1,2+0.3)-105

1Уюс1ососси8 Бр. 4.4 (6.0+0.5)-105 (9,5+0,3)-104 (8,5+0,5)-105

Таким образом, было показано, что психротолерантный консорциум ИБ НД 1, способен активно разлагать нефтяные углеводороды и поддерживать численность окисляющих углеводороды микроорганизмов в полевых условиях при положительных низких температурах. Применение психротолерантных бактерий

позволило увеличить период, благоприятный для проведения рекультивационных работ, за счет сентября и мая месяца.

Полевые испытания предлагаемой биотехнологии в 2013 году были проведены так же территории отвалов ОАО «Орскнефтеоргсинтез» на площадке складирования отработанной отбеливающей земли. Рекультивируемый субстрат (отбеливающая земля) до недавнего времени использовался на предприятии для контактной доочистки масел, насыщен устойчивыми к химическому и биологическому разложению полициклическими ароматическими углеводородами и смолистыми соединениями. На поверхности полигона были намечены два участка относительно однородных по степени загрязнения. Содержание углеводородов на первом участке колебалось в пределах 4 - 6% от веса грунта, на втором участке - в пределах 18 - 22% (вес.).

На основе предварительных экспериментов для микробиологического этапа рекультивации была предложена следующая схема. Двукратное с интервалом полтора месяца орошение суспензией консорциума в количестве 1 л/м2 с титром 108 КОЕ/мл, которое сопровождалось двукратным внесением в почву полного минерального удобрения (NPK) 40 г/м2. Рыхление грунта после внесения в него микроорганизмов и удобрения для обеспечения доступа кислорода к загрязнителю. Поддержание 60% влажности субстрата.

На контрольных участках без рекультивации разложение нефтепродуктов почти не наблюдалось (рис. 8).

С 10.07.13 по 13.11.13 на делянках менее загрязненного участка, обработанных культурой ИБ НД 1, в среднем потеря углеводородов составила 23,7 г/кг. На делянках, обработанных биопрепаратом Ленойл, - 19,7 г/кг. Меньше углеводородов разложилось после интродукции в грунт отдельно штамма Pseudomonas nitroreducens ИБ НД 1.1 и штамма Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2. Убыль нефтепродуктов на более загрязненном участке для консорциума ИБ НД 1 составила 90 г/кг, штамма Pseudomonas nitroreducens ИБ НД 1.1 - 56 г/кг, штамма Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2-55 г/кг, биопрепарата Ленойл - 94 г/кг.

С помощью предложенной биотехнологии на протяжении всего периода рекультивации (в том числе осенью) в грунте удалось поддерживать стабильную численность окисляющих углеводороды микроорганизмов на уровне 105 -106 КОЕ/г.

Таким образом, консорциум ИБ НД 1 способен к разложению сложных углеводородных загрязнителей в полевых условиях. Показано его успешное применение в качестве основы для биотехнологии рекультивации отработанной

отбеливающей земли ОАО «Орскнефтеоргсинтез».

17

08.08.2013 г. 02.10.2013 г. 13.11.2013 г. даты отбора проб

□ Контроль

а Культура И Б ИД 1

□ Pseudomonas nitroreducens ИБ ЦЦ 1.1

□ Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 Н Ленойл

о 40 ч

30

10

ж

I

08.08.2013 г. 02.10.2013 г. 13.11.2013 г. даты отбора проб

а) б)

Рис. 8. Разложение углеводородов в отработанной отбеливающей земле на опытном участке с 18 - 22% загрязнением (а) и 4 - 6% загрязнением (б) в процессе рекультивации

Технология производства биологического препарата «Леноил»®-микостат

На основе окисляющего углеводороды консорциума ИБ НД 1 был создан биологический препарата «Ленойл»®-микостат, разработана технология его получения в промышленных условиях, получены опытные партии биопрепарата. Биопрепарат нефтедеструктор «Ленойл»®-микостат, выпускается в виде культуральной жидкости (Ж) и сухого порошка (СХП).

Основные стадии получения биопрепарата «Ленойл»®-микостат представлены на рисунке 9. Для ферментации используется солевая основа среды Раймонда с дизельным топливом в качестве источника углерода и энергии. Процесс культивирования длится 48 часов при (=26°С. Динамику роста микроорганизмов отслеживают по оптической плотности культуральной жидкости. Титр целевых и посторонних микроорганизмов в контрольных точках технологического процесса

определяют путем посева на плотные питательные среды. Для стандартизации сухой препаративной формы до заданного титра используют стерильный каолин.

Рис. 9. Принципиальная технологическая схема производства биопрепарата «Ленойл»®-микостат

Жидкая форма биопрепарата «Ленойл»®-микостат представляет собой суспензию кремового цвета со специфическим запахом и титром живых клеток углеводородокисляющих микроорганизмов не менее 1-Ю8 КОЕ/мл. Сухая препаративная форма представляет собой порошок кремового цвета, с влажностью не более 10% и титром живых клеток углеводородокисляющих микроорганизмов не менее МО8 КОЕ/г.

С учетом затрат на производство и реализацию в январе 2015 г. рыночная стоимость биопрепарата «Ленойл»®-микостат (Ж) составила 80000 руб./м2, «Ленойл»®-микостат (СХП) - 1500 руб./кг. Использование биопрепарата «Ленойл»®-микостат (Ж) для рекультивации загрязненного нефтью грунта на 8-17% дешевле совместного применения для тех же целей деструктора углеводородов «Ленойл»® (Ж) и биоудобрения «Азолен»® (Ж). Аналогичные расчеты для сухих препаративных форм показали, что выбор «Ленойл»®-микостат (СХП) вместо двух биопрепаратов позволяет сократить затраты на покупку препаратов на 33-45%.

ВЫВОДЫ

1. В результате скрининга выделен, типирован и помещен в Коллекцию микроорганизмов Уфимского Института биологии РАН под номером ИБ НД 1 психротолерантный консорциум микроорганизмов, состоящий из штаммов Pseudomonas nitroreducens ИБ НД 1.1 и Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2.

2. Консорциум микроорганизмов ИБ НД 1 обладает высокой окислительной активностью по отношению к нефтяным углеводородам, способен адаптироваться к высоким дозам нефти в грунте и утилизировать субстрат независимо от типа почв и особенностей загрязнителя при пониженной температуре. Эффективность удаления углеводородов из загрязненной подзолистой почвы, чернозема и содержащего углеводороды техногенного отхода консорциумом микроорганизмов ИБ НД 1 превосходит или сопоставима с с коммерческим биопрепаратом Ленойл.

3. Интродукция в загрязненные почвы консорциума ИБ НД 1 уменьшает вызванные загрязнением неблагоприятные изменения в видовом составе почвенных микроскопических грибов: снижает обилие фитопатогенных микромицетов и способствует формированию грибных комплексов по составу близких к естественным фоновым аналогам.

4. Разработана технология получения биологического препарата «Ленойл»®-микостат на основе консорциума микроорганизмов ИБ НД 1 и способы его

применения для рекультивации почв и грунтов, загрязненных нефтяными углеводородами.

5. Применение для биорекультивации консорциума ИБ НД 1 позволило удалить 306 г углеводородов из 1 кг торфянистой почвы за 2 месяца при пониженных температурах на нефтяном разливе на Мамонтовском месторождении и 90 г углеводородов из 1 кг отработанной отбеливающей земли за 4,5 месяца на полигоне ОАО «Орскнефтеоргсинтез».

Практические предложения

На основании проведенных исследований разработаны для практики:

- ТУ 9291-009-33822935-2015 «Биопрепарат - нефтедеструктор «Ленойл»®-микостат», утвержденные зам. директора по науке ЗАО НПП «Биомедхим»

- Руководящий документ (временный технологический регламент) «Технология биологической рекультивации почв, загрязненных нефтью, с использованием бактериальной культуры ИБ НД 1», ЗАО НПП «Биомедхим» (лицензия № ОП-41-002200 на осуществление деятельности по сбору, использованию, обезвреживанию, транспортировке и размещению отходов I-IV классов опасности)

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Бакаева М.Д. Влияние рекультивации биопрепаратами на микроскопические грибы подзолистого грунта / М.Д. Бакаева, H.H. Силищев, О.С. Смолова // Известия Самарского научного центра РАН.-2011.-Т. 13, № 5 (З).-С. 125-127.

2. Бакаева М.Д. Влияние микроорганизмов - деструкторов углеводородов на токсичность загрязненного нефтью чернозема / М.Д. Бакаева, О.Н. Логинов, О.С. Смолова // Известия Самарского научного центра РАН. - 2013. - Т. 15, № 3 (5). - С. 1563-1566.

3. Бакаева М.Д. Использование для биорекультивации микроорганизмов -деструкторов углеводородов рода Pseudomonas с микостатической активностью / М.Д. Бакаева, О.С. Смолова, О.Н. Логинов // Биотехнология. -2014. - №6.-С. 62-72.

Материалы и тезисы международных и всероссийских конгрессов и

конференций

4. Смолова О.С. Биологическая рекультивация загрязненной нефтью почвы при низкой температуре / О.С. Смолова, М.Д. Бакаева, Ю.С. Ануфриева // БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 18-22 апреля 2011 года). Сборник тезисов. - С. 282.

5. Бакаева М.Д. Влияние рекультивации биологическими препаратами на численность микроорганизмов в загрязненной товарной нефтью подзолистой почве / М.Д. Бакаева, О.С. Смолова, А.Ф. Халитова // Сборник научных трудов IV Международной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы науки и техники» (17-18 мая 2012 г., Уфа).-Уфа: Нефтегазовое дело, 2012. - С. 110-112.

6. Заретдинова P.A. Комплексы микроскопических грибов загрязненного нефтью подзолистого грунта после его рекультивации / P.A. Заретдинова, М.Д. Бакаева, О.С. Смолова // БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 17-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых (Пущино, 21-26 апреля 2013 г.). Сборник тезисов. - С. 333.

7. Смолова О.С., Заретдинова P.A. Улучшение свойств загрязненной нефтью подзолистой почвы в результате интродукции окисляющих углеводороды микроорганизмов// Актуальные вопросы науки и образования: тезисы Всероссийской молодежной научно-практической конференции (25-27 апреля 2013 г., г. Уфа) / отв. ред. В.Ю. Гуськов. - Уфа: РИЦ БашГУ, 2013. -С. 228.

8. Бакаева М.Д. Влияние пониженной температуры на активность консорциума бактерий, окисляющих нефтяные углеводороды / М.Д. Бакаева, О.Н. Логинов, О.С. Смолова // Сборник тезисов школы-конференции молодых ученых на базе Института фундаментальных проблем биологии РАН «Биосистема: от теории к практике» (24-25 октября 2013, г. Пущино). Пущино, 2013. - С. 71.

9. Бакаева М.Д. Долговременный эффект от применения биопрепаратов для рекультивации загрязненной нефтью подзолистой почвы / М.Д. Бакаева, О.С. Смолова, О.Н. Логинов // Сборник докладов IV Международной научно-практической конференции с элементами научной школы для молодежи «Экологические проблемы нефтедобычи - 2014» (Уфа, 21-23 октября 2014 г.). Уфа: Изд-во «Нефтегазовое дело», 2014. - С. 9-10.

Ю.Бакаева М.Д. Изменение фитотоксичности сильно загрязненной нефтью торфянистой почвы в процессе ее рекультивации / М.Д. Бакаева, О.С. Смолова, О.Н. Логинов // Наука и образование в XXI веке: сборник научных трудов по материалам Международной научно-практической конференции (31 октября 2014 г.):в 17 частях. Часть 6. Тамбов: ООО «Консалтинговая компания Юком», 2014. - С.20-21.

11. Смолова О.С. Опыт рекультивации загрязненного углеводородами техногенного отхода консорциумом микроорганизмов - деструкторов / О.С. Смолова, М.Д. Бакаева, О.Н. Логинов // Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии: материалы VIII Всероссийской научной интернет-конференции / редкол.: P.A. Исмаков и др. - Уфа: РИД УГНТУ, 2014. - С.122.

Список сокращений

ИБ - Институт биологии (в названии штамма подразумевает принадлежность к Коллекции микроорганизмов Уфимского института биологии РАН) НД - в названии штамма подразумевает принадлежность к разделу «Деструкторы нефтепродуктов» Коллекции микроорганизмов Уфимского института биологии РАН КОЕ - колонию образующая единица

Подписано в печать 06.02.2015г.

Усл.п.л. - 1.5 Заказ № 25565 Тираж: 110 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru