Микроорганизмы природных биоценозов для биоремедиации почв и водных объектов Сибири, загрязненных нефтепродуктами

Емельянова, Елена Константиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микроорганизмы природных биоценозов для биоремедиации почв и водных объектов Сибири, загрязненных нефтепродуктами
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Микроорганизмы природных биоценозов для биоремедиации почв и водных объектов Сибири, загрязненных нефтепродуктами"

На правах рукописи

Емельянова Елена Константиновна

МИКРООРГАНИЗМЫ ПРИРОДНЫХ БИОЦЕНОЗОВ ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ ПОЧВ И ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ СИБИРИ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЕПРОДУКТАМИ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ии3462182

Кольцово - 2009

003462182

Работа выполнена в ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Репин Владимир Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Теплякова Тамара Владимировна доктор биологических наук, профессор Дейнеко Елена Викторовна

Ведущая организация:

Институт систематики и экологии животных СО РАН

диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора Минздравсоцразвития России по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559; тел. (383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан « 7 » 2009 года.

Защита состоится «5» марта 2009 года

часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета

Л. И. Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Загрязнение нефтью представляет большую опасность для окружающей среды. Биоремедиация в местах утечек нефти является одним из важнейших природоохранных мероприятий, направленных на восстановление биогеоценозов загрязненных земель и водоемов.

Проблема загрязнения окружающей среды нефтью особенно актуальна для Сибири, где располагается основной нефтегазоносный район России (территория Ханты-Мансийского автономного округа). Негативное влияние нефти распространяется на все составляющие экосистем Севера: ухудшается качество гумусового слоя, нарушаются аэрация, гидрологический режим и микрорельеф верхних горизонтов почвы, разрушаются устоявшиеся трофические цепи и, как следствие, увеличиваются техногенные площади, изменяется биологическое разнообразие природных ландшафтов.

Для уязвимых северных экосистем со специфическими природно-климатическими условиями (длительный период с отрицательными температурами воздуха, наличие многолетнемерзлых пород), где самоочищение происходит медленно, необходимость биоремедиации не вызывает сомнений. Легко разрушаемые при техногенном воздействии в результате интенсивного освоения природных ресурсов и медленно восстанавливающиеся природные экосистемы требуют разработки особого подхода к решению экологических проблем.

Нефть представляет собой сложную смесь трудноутилизируемых в природе компонентов. Бактерии, микроскопические низшие водоросли, актиномицеты, грибы, входящие в состав микробоценозов почв и водоемов, являются деструкторами нефтепродуктов. Микроорганизмы способны подвергать разрушению углеводороды избирательно в следующей убывающей последовательности: н-алканы -разветвленные алканы - изопреноидные алканы - ароматические углеводороды -циклические углеводороды (Cohen, 2002).

микроорганизмов сокращается. Внесение дополнительных количеств эффективных микроорганизмов-деструкторов (биодеструкторов) позволяет усилить и ускорить разрушение нефти. Для условий севера оптимальным является внесение психротолерантных микроорганизмов, способных функционировать при пониженных температурах. Одним из эффективных приемов биоремедиации в условиях Сибири является сочетание использования штаммов-деструкторов, природных сорбентов, высева травянистых растений. Эти технологии очистки от нефтепродуктов являются перспективными, поскольку позволяют без значительного ущерба для природы восстановить экосистемы.

Цель исследования. Целью исследования являлось выделение психротолерантных микроорганизмов-нефтедеструкторов и создание ассоциаций, способных эффективно деградировать нефть и нефтепродукты в климатических условиях Сибири с перспективой их использования для биоремедиации.

Основные задачи исследования:

1. выделение и идентификация штаммов микроорганизмов, утилизирующих нефть;

2. оценка степени биодеградации н-алканов и ароматических углеводородов микроорганизмами-деструкторами, выделенными из природных биоценозов;

3. создание ассоциаций штаммов микроорганизмов, включающих разные таксономические группы, способных к эффективной утилизации нефти;

4. оценка роста и развития растений в очищенной биодеструкторами почве.

Научная новизна работы. Выделены и идентифицированы новые штаммы микроорганизмов, обладающие высокоэффективной нефтеутилизирующей активностью, адаптированные к климатическим условиям Сибири, способные к росту в широком диапазоне рН и содержания №С1. Создана ассоциация штаммов микроорганизмов, включающая бактерии и дрожжи. Определена степень утилизации углеводородов нефти Западной Сибири и республики Коми штаммами выделенных микроорганизмов.

Практическая значимость. Полученные штаммы микроорганизмов, часть из которых защищена патентами (№ 2272071, № 2271390), предложены для использования с целью биоремедиации окружающей среды (почв, водоемов), очистки нефтезагрязненных промышленных объектов в условиях северного климата.

Положения, выносимые на защиту:

1. бактериальные штаммы Acinetobacter junii El 133, Acinetobacter calcoaceticus El 134, Acinetobacter calcoaceticus El 135, выделенные из антропогенно загрязненной реки, Enterobacter sp. В 1024, выделенный из эвтрофного озера, дрожжи Yarrowia lipolytica Y 1064, выделенные из реликтового торфа, являются эффективными биодеструкторами нефти, утилизирующими до 97% н-алканов и до 53,5% ароматических компонентов нефти.

2. обработка нефтезагрязненных сред ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024, штаммами Acinetobacter способствует ускорению деструкции нефти.

3. утилизация нефти происходит с большей эффективностью в ассоциации Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 по сравнению с применением монокультуры штамма Yarrowia lipolytica Y 1064.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на международных и межрегиональных конференциях, конгрессах и симпозиумах «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), «Фундаментальные проблемы изучения и использования воды и водных ресурсов» (Иркутск, 2005), «Экватэк-2004» (Москва, 2004), «Добыча, подготовка, транспорт нефти и газа» (Томск, 2004), «Наука и Бизнес. Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина» (Пущино, 2004), «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (Кара-Даг, Украина, 2003), «Innovate roles of biological resource Centers» (Tsukuba, Japan, 2004), «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004), «Современные проблемы геохимической экологии и сохранения биоразнообразия» (Бишкек, Киргизия, 2003), «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водоемов» (Иркутск, 2003), «Проблемы биоремедиации в XXI веке» (Красноярск, 2002).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, в том числе 3 статьи.

Личный вклад. Автору принадлежат постановка задач, выделение природных изолятов микроорганизмов из различных биоценозов, их идентификация, выявление биохимических и физиологических свойств, выделение ДНК, амплификация, оценка нефтеутилизирующей активности, создание ассоциаций штаммов микроорганизмов, постановка и осуществление опытов с растениями. Исследование степени деструкции компонентов нефти газохроматографическими методами проведены на базе ФГУН

ГНЦ ВБ «Вектор» зав. химико-аналитической лабораторией С. Е. Олькиным, в ЗАО Институте хроматографии «ЭкоНова» Л. А, Кожановой, в институте органической химии им. Н. Н. Ворожцова совместно с к.б.н. С. В. Морозовым, во ФГУП СНИИГГиМС совместно с В. Н. Меленевским, в институте химии нефти (Томск) совместно с к.б.н. Л. И. Сваровской. Выделение плазмид и электрофорез проведен к.б.н. Л. И. Пучковой. Атомно-силовая микроскопия осуществлена к.б.н. Б. Н. Зайцевым. Определение жирнокислотного профиля микроорганизмов и работа с системой «Вю1о§» проведена совместно с Т. Торок в Национальной лаборатории Лоуренса (Беркли, США).

Объем и струкгтура работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка литературы из 236 наименований, в т.ч. 85 на иностранном языке, приложения. Работа изложена на 143 листах машинописного текста и содержит 16 таблиц и 21 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В обзоре литературы рассмотрено влияние нефти на окружающую среду в условиях северного климата, описаны особенности трансформации нефти в почве, способы и определяющие факторы биоремедиации. Обобщены данные о влиянии нефти на почвенные ферменты. Рассмотрены изменения в составе гумуса почвы в результате загрязнения нефтепродуктами. Особое внимание уделяется значению микроорганизмов в утилизации нефти и ее компонентов. Отмечена роль плазмид бактерий в биодеградации компонентов нефти. Проведен анализ опубликованных материалов о коммерческих препаратах на основе микроорганизмов и сорбентов для очистки почвы и водных объектов от нефтепродуктов.

Глава 2. Объекты и методы исследования

Отбор образцов грунтов, воды, донных отложений осуществляли из загрязненных объектов в районе месторождений нефти в ХМАО, ЯНАО, реликтового торфа Васюганской низменности (ХМАО), почвы прибрежной зоны реки Катунь (Горный Алтай), почвы зоны вечной мерзлоты Якутии, ила эвтрофного озера Кротовая Ляга (Новосибирская область), ила и воды антропогенно загрязненных рек Новосибирской области: Ельцовки-1, Койнихи, Власихи, Чика, Издревой.

Выделение микроорганизмов-деструкторов нефти проводили после инкубирования образцов природных субстратов (воды, почвы, донных отложений, загрязненных грунтов) в жидкой питательной среде 8Е (г/л): (NH4)2HP04 - 1.5; КН2Р04 - 0.7; MgS04 х 7Н20 - 0.8; NaCl - 0.5; pH 7.2 с добавлением нефтепродукта до 2 % на качалке при различных температурах; затем полученные накопительные культуры переносили на агаризованную среду 8Е для получения чистых культур углеводородокисляющих микроорганизмов.

Изучение морфологических признаков живых и окрашенных клеток полученных изолятов-деструкторов проводили с помощью светового микроскопа Carl Zeiss Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия), а также с помощью атомно-силового микроскопа.

Биохимические и физиологические свойства штаммов микроорганизмов изучали с помощью системы «OmniLog» («Biolog», США), а также стандартными методами в соответствии с «Методами общей бактериологии» (Герхардт, 1983).

Идентификацию штаммов осуществляли методами анализа жирных кислот, системой "MicroLog", сравнением нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР, соответствующих фрагментам гена 16S рРНК.

Жирнокислотный профиль определяли с помощью газового хроматографа Agilent Technologies (Palo Alto, США) Model 6890. Хроматограммы анализировали системой Sherlock Microbial Identification System Version 4.5 (MIDI, США).

Выделение ДНК из клеток проводили с помощью реагентов «Qiagen», США согласно их рекомендациям (Qiagen Genomic..., 2001). Амплификацию ДНК проводили на приборе "Applied biosystems 16 capillary 3100 Genetic Analyzer systems". Цикл включал 25 реакций по следующей программе: 96° С в течение 10 с, 50° С в течение 5 с, 60° С в течение 4 мин.

Для проведения ПЦР-реакции использовали 1.5 ц1 ДНК, 2 ц1 27 F праймера (5' -AGAGTTTG ATCMTGGCTCAG-3'), 2 ц1 1492 R праймера (5' -TACGGYTACCTTGTTACGACT 3'), 44.5 ц1 смеси ферментов, буфера, нуклеотидов (общий объем 50jil). Полученную последовательность нуклеотидов сравнивали с базой данных NCBI, по результатам сравнения идентифицировали штаммы.

Предварительную оценку непатогенности штаммов-деструкторов проводили косвенным образом при исследовании гемолитических, плазмокоагулазных и фибринолитических свойств.

Чувствительность к антибиотикам у выделенных бактерий определяли методом бумажных дисков на среде РПА (Лебедева, 1973).

Выделение илазмидных ДНК проводили методом щелочного лизиса (Манниатис и др, 1984). Полученную ДНК анализировали в 0.8%-ом агарозном геле в трис-боратном буфере, рН 8.0.

Первичную оценку нефтеутилизирующей активности штаммов производили по следующим параметрам: характеру и скорости биоэмульгации нефти, увеличению оптической плотности культуральной жидкости, наличию газообразования.

Экстрагирование остаточной нефти проводили хлороформом трехкратно.

Для определения содержания углеводородов нефти использовали методы капиллярной газовой хроматографии, жидкостной хроматографии и хроматомасс-спектрометрии. Хроматографический анализ выполняли на приборах модели 3600 ("VARIAN Associates", Inc., США), оснащенном колонкой J&W Scientific DB-5, 30 м х 0.22 мм, инжектором с делением потока, пламенно-ионизационным детектором, системой регистрации и обработки хроматографических данных (ChromStar, "Bruker", Германия); микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» с УФ-спектро-фотометрическим детектором; хроматомасс-спектрометре с использованием кварцевой капиллярной колонки 30 м • 0.32 мм с неподвижной хроматографической фазой ДВ-5 .

Отнесение хроматографических пиков на хроматограммах экстрактов выполняли по времени удерживания с использованием калибровочного образца (Boiling Point Calibration Sample #1, "ULTRA Scientific, Inc.", США). Величину утилизации углеводородов (в процентах) определяли как разность площадей его пиков на хроматограммах экстрактов проб без добавления деструкторов (контроль) и после деструкции (Colombo, et al., 1996; Palittapongarnpim et al., 1998; Chaineau et al., 2003).

Статистическую обработку экспериментальных данных при измерениях параметров роста растений выполняли стандартными методами (Гранатовский, Сирая, 1990).

Глава 3. Результаты и обсуждение

Выделение и идентификация штаммов микроорганизмов

На основе выделенных из селективной среды с нефтью микробных изолятов создана коллекция из 424 штаммов, включающая бактерии (представители родов Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Rhodococcus, Mycobacterium, Nocardia, Acinetobacter, Enterobacter и др.), дрожжи (Yarrowia sp., Saccharomyces sp. и др.) и

несовершенные грибы (Penicillium, Aspergillus и др.). Эффективными деструкторами нефти оказались природные изоляты из грунтов Спорышевского месторождения Arthrobacter sp. Nb 16, Западно-Сальгмского месторождения - Pseudomonas ND 4, Saccharomyces sp. NR 3-2, из торфа Васюганской низменности - микромицет NF 2-2, из берегового грунта Горного Алтая - Acinetobacter sp. Alt 221, Acinetobacter sp. Alt 222, бактериальные изоляты из Якутии Ja 285, Arthrobacter sp. Ja 269 и др.

Идентификация некоторых штаммов современными методами (табл. 1) была произведена после газохроматографических исследований и подтверждения высокой нефтеутилизирующей активности.

Таблица 1. Идентификация штаммов-деструкторов разными методами

Штамм Метод анализа жирных кислот Индекс сходства MicroLog system Индекс сходства По результатам данных о нуклеотидной структуре участка гена 16S РНК Индекс сходства, %

El 133 Acinetobacter junii 0,625 Acinetobacter calcoaceticus 0,635 Acinetobacter junii 99%

El 134 Acinetobacter johnsoni 0,397 He проводилась - Acinetobacter calcoaceticus 99%

El 135 Acinetobacter radioresistens 0, 394 Acinetobacter calcoaceticus 0, 284 Acinetobacter calcoaceticus 99%

Y 1064 He проводилась - Yarrowia lipolytica 0, 969 Yarrowia lipolytica 99%

В ¡024 Enterobacter cancerogenus 0, 783 Kluyvera ascorbata 0, 374 Enterobacter sp. В 901-2 100%

Поскольку результаты идентификации штаммов отличались в разной степени в зависимости от метода, а индексы сходства микроорганизмов, полученные методами жирнокислотного анализа и биохимической системы «MicroLog», были недостаточно высокими, было принято решение руководствоваться результатами секвенирования, где индекс сходства составлял 99-100%. Таким образом, самые эффективные штаммы - утилизаторы нефти были идентифицированы как Acinetobacter junii, Acinetobacier calcoaceticus (2 штамма), Yarrowia lipolytica, Enterobacter sp.

Морфолого-культурадьныс и физиологические свойства штаммов-деструкторов

Выявлено, что штаммы Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024, наиболее перспективные для биотехнологических разработок по

нефтеутилизирующей способности, являются психротолерантными и солеустойчивыми (до 5 % N801). Это предполагает возможность их использования в засоленных природных субстратах при пониженных температурах (например, на территории нефтеразлива, где кроме нефти присутствуют минерализованные пластовые воды).

Косвенные признаки патогенности: гемолитические, плазмокоагулазные и фибринолитические свойства у штаммов-деструкторов Е1 133, Е1 134, Е1 135, У 1064, В 1024 не выявлены.

Скриниг плазмидных ДНК в клетках бактерий АсшеюЬааег /ипи Е1 133, Ас1пе1оЬас1ег сакоасенсия Е1 134 и АсшеюЬааег са!соасе1кш Е1 135 показал, что штамм],I содержат разное количество плазмид, которые отличаются по молекулярному весу (рис. 1).

тгз

>т-

шч -21812254"

12 3 4 5

-23130 -941« -«81 —4361

Размер плазмидных ДНК в штаммах Е1 133 и Е1 134 составляет более 23000 Ьр. Штамм Асте1оЬас1ег сакоасеНсиз Е1 135 содержит набор плазмид, как высоко-, так и низкомолекулярных, что позволяет в природных условиях повысить конкурентноспособность и адаптивность.

Рис. 1. Плазмидные ДНК в клетках штаммов-деструкторов Ас1пе1оЬас1ег Е1 133, Е1 134, Е1 135.

Обозначения: I - ВяН+Я, 2 - Е1 133; 3 - Е1 134; 4 - Е1 135; 5 - НшсИПМ. ДНК.

Биодеградация нефти бактериальными и дрожжевыми штаммами микроорганизмов

Способность микроорганизмов продуцировать внеклеточные эмульгирующие агенты является ключевой в биодеградации нефти. Выделенные бактериальные штаммы из урбанизированной реки Ельцовки-1 (АсшеюЬааег Е1 133, Е1 134 и Е1 135) и штамм дрожжей из реликтового торфа Васюганской низменности (Уаггомга Нро1уИса У 1064) обладали уникальной способностью к биоэмульгации нефти.

Сплошная пленка нефти под действием биоэмульгаторов этих микроорганизмов разбивалась на отдельные сферические конгломераты уже на вторые сутки культивирования. С помощью световой микроскопии было выявлено, что значительная часть бактериальных и дрожжевых клеток биодеструкторов сорбировалась на поверхности микрокапель нефти (рис. 2).

Для ряда штаммов (Bacillus sp. 282, Artrobacter sp. 283, Saccharomyces sp. NF 4-2 и Yarrowia lipolytica Y 1064) степень биодеградации нефти была выявлена весовым методом (табл. 2).

Таблица 2. Результаты анализа исходной и остаточной после биодеструкции нефти весовым методом

Образец Исходная навеска, мг Остаточная нефть, мг Степень деструкции,% Групповой состав, мг

Углеводороды Смолы + асфальтены

Контроль 400 400 0 370 30

Bacillus sp. 282 400 126 69 112 14

Arthrobacter sp. 283 400 107 73 91 16

Saccharomyces sp. NF 4-2 400 66 84 55 И

Yarrowia lipolytica Y 1064 400 125 69 105 20

Как видно из табл. 2, исследованные штаммы имели степень деструкции нефти в интервале от 69 до 84 % за 7 сут культивирования в жидкой среде с нефтью при 23-25°С, что является хорошим результатом.

Оценка деструкции н-алканов микроорганизмами

Для выбора оптимального штамма-деструктора и его дальнейшей разработки был проведен газохроматографический анализ остаточной нефти, который показал, что после деструкции в течение 5 суток при температуре 23-25°С штаммом Уаггст'/а

Рис. 2. Клетки дрожжевого штамма Уаггоы/а Иро1уИса Y 1064 на поверхности нефти(световая микроскопия, х 2500).

Нро1уНса У 1064 произошло уменьшение площади н-алканов с 7.17 до 3.89 по сравнению с контролем, т.е. в \,84 раза (табл. 3).

Таблица 3. Результаты анализа исходной и остаточной после биодеструкции нефти газохроматографическим методом

Параметры Штаммы

Контроль Yarrowia lipolytica Y 1064 Bacillus sp. 282 Artrobacter sp. 283

Суммарная площадь н-алканов 7.17 3.89 6.54 6.66

Соотношение Пристан (1-С 19) / Фитан (1-С 20) 0.93 0.82 0.94 1.17

Соотношение площадей: четные н-алканы / нечетные н-алканы 1.02 0.98 1.05 1. 02

Соотношение н-С 17/Пристан 2.72 1.7 2.84 2.21

Соотношение н-С18/Фитан 2.14 1.19 2.12 2.27

Содержание пристана, % 2. 78 4. 69 2. 84 3.41

Содержание фитана, % 3.00 5.67 3.03 2. 93

Показателями биохимического окисления нефтяных углеводородов являются увеличение содержания пристана и фитана, уменьшение отношения гептадекана к пристану, октадекана к фитану (Петров, 1984). Представленные в табл. 3 данные показывают, что в окисленных нефтяных остатках штаммом Yarrowia lipolytica Y 1064 указанные соотношения уменьшаются. Так, соотношение гептадекана к пристану уменьшается с 2,72 до 1,7; соотношение октадекана к фитану уменьшается с 2,14 до 1,19. В остаточной нефти после биодеструкции штаммом Yarrowia lipolytica Y 1064 показатель увеличения составляет для пристана в 1,68 раза, для фитана - в 1,89 раза.

В связи с тем, что в состав нефти входит большое количество различных химических соединений, и один штамм не способен обладать всем спектром ферментов, необходимых для биодеградации этих компонетов, представляется необходимым применение ассоциаций штаммов микроорганизмов. Внесение нескольких штаммов в загрязненный субстрат, отличающихся по спектру потребляемых веществ, позволяет утилизировать нефть более продуктивно (Кобзев и др., 2001). В наших исследованиях наиболее эффективно утилизировала компоненты нефти ассоциация, содержащая в своем составе микроорганизмы Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 (табл. 4).

Таблица 4. Степень утилизации н-алканов нефти разных месторождений ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 в различных условиях эксперимента, выявленная газохроматографическим методом

Условия опыта Утилизация н-апканов, %

Месторождение нефти pH среды Концентрация соли в среде (NaCl, %) Температура, "С

Спорышевское pH 5 0,5 23-25 87,07

pH 7 0,5 23-25 91,46

pH 8,5 0,5 23-25 68,7

pH 7 5,0 23-25 75,7

pH 7 7,0 23-25 70,0

pH 7 0,5 4-6 76,06

Усинское pH 7 0,5 4-6 62,4

pH 7 0,5 23-25 90,9

В табл. 4. продемонстрировано, что в разных условиях эксперимента (добавление в питательную среду соли, изменение pH, температуры, нефть из разных месторождений) утилизация н-алканов ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 оставалась высокой и составляла от 62 до 91 %.

Проведенные эксперименты показали, что утилизация компонентов нефти происходит с большей эффективностью в опытах с ассоциацией штаммов, чем с внесением монокультур. Так, степень деструкции н-алканов Спорышевской нефти ассоциацией, включающей в свой состав штаммы Y 1064 и В 1024, при pH 7.0 достигала 91 % за 6 суток, в отличие от использования монокультуры штамма Yarrowia lipolytica Y 1064, где степень деструкции была равной 69 %. Наибольший процент деструкции нефти ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 был достигнут при значении pH 7, концентрации NaCl 0,5% и температуре 23-25°С (табл. 4, рис. 3).

Рис. 3. Газовая хроматограмма хлороформного экстракта Спорышевской нефти без добавления деструкторов (А) и после биодеструкции ассоциацией штаммов Yarrowia Hpolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 (Б) в течение 6 суток инкубирования при температуре 23°С и pH среды 7.0.

Высев содержимого емкостей с нефтью и микроорганизмами во время культивирования и после биодеградации нефти на агаризованные среды 8Е и РПА показал, что количество выросших колоний соответствует соотношению 1:1, что говорит о стабильности полученной ассоциации штаммов.

В исходной нефти гомологический ряд н-алканов был представлен углеводородами от Сю до С3я(рис. 4).

Рис. 4. Молекулярно-массовое распределение насыщенных углеводородов нефти Jlac-Еганского месторождения после биодеградации ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 после 7 суток культивирования при температуре 23 - 25 "С. Обозначения: пр - пристан, фит - фитан.

Как видно из молекулярно-массового распределения насыщенных углеводородов на рис. 4, после биодеградации ассоциацией штаммов в течение 7 сут при температуре 23 - 25°С определялись легкие и средние углеводороды от С|0 до С38. Относительное содержание н-алканов н-Сю-н-Сщ уменьшилось в 3-7 раз; значительно возросла доля изоалканов Си, Си, С]6, Сщ. Количество остаточной нефти после биодеградации нормировано на остаточные углеводороды.

Среди нефтеутилизирующих штаммов из реки Ельцовки-1 наибольшую биоэмульгирующую и нефтеокисляющую активность проявили неспороносные бактерии, идентифицированные впоследствии как АстеюЬааег ]ши\ Е1 133, АапеюЬаМег сакоасегют Е1 134, АстеюЬас1ег сакоасейст Е1 135. Представители рода Асте!оЬас/ег являются типичными обитателями водных экосистем, обладают устойчивостью к неблагоприятным факторам среды, в т.ч. к таким загрязнителям, как тяжелые металлы, являются деструкторами нефтепродуктов, вследствие чего перспективны для использования в целях биоремедиации. Штаммы рода Ас1пеюЬас1ег были выделены также из воды и донных отложений рек Чика, Власихи, почвы береговой зоны реки Катунь.

Методом газовой хроматографии было установлено, что выделенные из Ельцовки-1 штаммы рода АстеюЬааег являются высокоэффективными утилизаторами н-алканов (табл. 5).

Таблица 5. Степень утилизации углеводородов нефти штаммами АстеюЬааег ]ипт Е1 133, ЛстеюЬас/ег са1соасейст Е1 134, Асте1оЬас!ег сакоасеИсиз Е1 135 после 7 суток культивирования при температуре 23 - 25 "С

Углеводород Кол-во атомов углерода Утилизация углеводородов нефти (%)

EI 133 Е1 134 EI 135

н-Додекан С12 71 89 88

н-Тридекан С13 93 97 92

н-Тетрадекан CI4 97 97 98

н-Пентадекан С15 94 93 98

н-Гексадекан С16 99 99 99

н-Гептадекан С17 89 97 99

н-Октадекан С18 98 97 97

н-Нанодекан С19 99 98 96

н-Эйкозан С20 96 97 99

н-Генэйкозан С21 96 98 98

н-Докозан С22 93 96 93

н-Трикозан С23 99 97 98

н-Тетракозан С24 97 97 97

н-Пентакозан С25 91 96 98

н-Гексакозан С26 88 92 96

н-Гептакозан С27 87 94 97

н-Октакозан С28 78 95 98

н-Нанокозан С29 90 98 98

н-Триконтан СЗО 94 97 95

н-Гентриконтан С31 75 90 91

н-Дотриконтан С32 91 87 98

н-Тритриконтан СЗЗ 93 93 99

Среднее значение по найденным углеводородам 91 95 97

Было показано, что степень деструкции различных н-алканов штаммами рода Acinetobacter El 133, El 134, El 135 составляла от 91 до 97 % за 7 суток культивирования.

Оценка деструкции ароматических углеводородов микроорганизмами

Ароматические углеводороды в исходной нефти были представлены гомологами бензола с молекулярными массами 92, 106, 120; алкилнафталинами с массами 128, 142, 156, 170, 184; триаренами с массами 178, 192, 206 и дибензтиофенами с массами 184 и 198. После биодеградации ассоциацией культур Yarrowia lipolyüca Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 значительно снизилась доля алкилбензолов и алкилнафталинов (табл. 6).

Таблица 6. Состав ароматических углеводородов и дибензтиофенов в исходной нефти и после ее биодеградации ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024

Масса иона, название соединения Содержание, % отн.

Исходная нефть Остаточная после биодеградации

92 толуол 3.32 7.85

106 диметилбензолы, этилбензол 11.06 1.02

120 триметилбензолы, метилэтилбензолы 14.16 0.41

128 нафталин 2.87 0.04

142 метилнафталины 12.23 0

156 диметилнафталины, этилнафталины 26.08 0.33

170 тримегилнафталины, метил этилнафталины 23.48 4.11

184 тетраметинафталины, диэтилнафталины 5.83 1.97

178 фенантрен 0.16 22.25

192 метилфенантрены 0.53 41,53

206 диметилфенантрены 0.30 20.50

184 дибензтиофен 1.76 0.49

198 метилдибензтиофен 2.91 1.78

Наиболее токсичными среди ароматических соединений нефти являются, как известно, моно- и диароматические углеводороды, причем в ряду бензолов, нафталинов и фенантренов токсичность увеличивается с увеличением степени алкилирования.

Как видно из табл. 6, содержание диметилбензолов и этилбензолов снизилось в 10,8 раз, триметилбензолов и метилэтилбензолов в 34,5 раза, метилнафталинов в 12,3 раза, диметилнафталинов и этилнафталинов в 79 раз, триметилнафталинов и метилэтилнафталинов в 5,71 раза. Увеличилось относительное содержание углеводородов ряда фенантрена, уменьшилось содержание дибензтиофена - в 3,6 раза, и метилдибензтиофена - в 1,63 раза. Увеличение содержания углеводородов ряда фенантрена - относительное (за счет утилизации ароматических углеводородов с меньшей молекулярной массой).

Проведены опыты, позволяющие оценить степень деструкции ароматических углеводородов ассоциацией штаммов микроорганизмов и монокультурой. Выяснено, что утилизация ароматических углеводородов происходит более интенсивно в образце с ассоциацией штаммов Yarrowia lipolylica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 (уменьшение площадей пиков в 2,14 раза по сравнению с контролем), чем с добавлением одного штамма Y 1064 (уменьшение площадей пиков в 1, 44 раза по сравнению с контролем) за 20 суток культивирования. Т.е. ассоциация штаммов Y 1064 и В 1024 утилизировала ароматические углеводороды в 1,5 раза эффективнее монокультуры штамма Y 1064.

Таким образом, исследованные микроорганизмы обладали способностью эффективно окислять широкий спектр компонентов нефтепродуктов. Проведенные эксперименты по утилизациии н-алканов и ароматических углеводородов штаммами микроорганизмов показали преимущество использования бактериально-дрожжевой ассоциации над монокультурой дрожжей.

Оценка роста и развития растений в очищенной биодеструкторами почве

В результате исследования в природных условиях выяснено, что выбранные биодеструкторы способствовали очищению почвы от нефти. Экспериментальные растения чувствительных к нефти видов (огурец, горох) и устойчивых (пырей ползучий), выросшие в почве, очищенной биодеструкторами, были сравнимы с контрольными растениями, выросшими в чистой почве без нефти, по рассмотренным показателям (высота растений, количество листьев, длина корня) (рис. 5).

2 2

И"-—' - 'Высота растения, см ^ 'Длина корня, см Количество листьев, шт.

Обозначения:

1 - в почве, загрязненной нефтью;

2 - в почве, загрязненной нефтью и очищенной ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024;

3 - в контрольной почве, не содержащей нефти.

Рис, 5. Параметры роста растений пырея, выращенных в различных вариантах опыта.

Так, например, для пырея средняя высота растений в контрольном варианте составила 30,7 см, в варианте с очищенной биодеструкторами почвой - 26,3 см, в варианте с загрязненной почвой без биодеструктора - 17 см (рис. 5).

Сочетание методов интродукции биодеструкторов и внесения сорбента

Для большей эффективности процесса биоремедиации является целесообразным сочетание методов интродукции микроорганизмов и использования природных сорбентов. На данный момент оптимальным в условиях северных регионов является применение сорбента «Сорбонафт», основой которого служит верховой торф месторождения Кировской области (производитель ЗАО «Пресс-Торф»), Преимуществами сорбента «Сорбонафт» являются возможность многократного применения, высокая нефтеемкость и плавучесть. Полевые испытания сорбента «Сорбонафт» были проведены летом 2005 года в Усинском районе республики Коми на нефтяном разливе двухнедельной давности на малых водотоках.

В опытных экспериментах было выяснено, что нефть, адсорбированная частицами гидрофобного торфа, доступна исследованным микроорганизмам только частично (с поверхности). Таким образом, сорбент, впитавший нефть, снижает ее доступность для внесенных микроорганизмов-деструкторов. Поэтому целесообразным является применение сорбента и внесение предложенных биодеструкторов последовательно. При этом внесенный сорбент снижает токсичность

нефти связывая ее. С водной поверхности удаляется пленка, что способствует аэрации, нормальному функционированию экосистемы, и позволяет аэробной микробиоте постепенно окислять компоненты нефтепродуктов.

Опытным путем было установлено, что, в случае очистки водной поверхности от нефтезагрязнсния, эффективным является внесение сорбента с последующим его сбором. В случае же очистки грунта предпочтительнее в качестве утилизаторов нефти использовать микроорганизмы-деструкторы.

Предложенные бактериальные и дрожжевые микроорганизмы, являющиеся эффективными деструкторами нефти, могут быть использованы для биоремедиации загрязненных нефтепродуктами и минерализованными пластовыми водами почв, водных и промышленных объектов в условиях пониженных температур.

ВЫВОДЫ

1. Из природных биоценозов Сибири выделены 424 штамма психротолерантных и галотолерантных микроорганизмов-деструкторов, способных к деструкции нефти и нефтепродуктов в климатических условиях северных регионов с перспективой их использования в целях биоремедиации.

2. Наибольшее количество выделенных микроорганизмов-нефтедеструкторов относилось к бактериям родов Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Rhodococcus, Mycobacterium, Nocardia, Enterobacter, к грибам родов Aspergillus, Pénicillium, Yarrowia и др. Эффективные штаммы-деструкторы нефтепродуктов были идентифицированы как Yarrowia lipolytica, Enterobacter sp., Acinetobacter junii, Acinetobacter calcoaceticus.

3. Оценена степень деструкции н-алканов и ароматических углеводородов штаммами-деструкторами. Содержание н-алканов после биодеградации штаммами Acinetobacter junii, Acinetobacter calcoaceticus снизилось до 97%, ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 - до 92%. Содержание производных бензола после биодеградации ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 снизилось до 34,5 раз; производных нафталина - до 79 раз.

4. Утилизация ароматических углеводородов нефти в ассоциации штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 происходит в 1,5 раза эффективнее по сравнению с использованием одного штамма Yarrowia lipolytica Y 1064.

5. Интродукция биодеструкторов Yarrowia lipolytica Y 1064, Enterobacter sp. В 1024, Acinetobacter junii El 133, Acinetobacter calcoaceticus El 134, Acinetobacter calcoaceticus El 135 в загрязненные субстраты способствовала их очищению от нефти.

6. Результаты испытаний наиболее эффективных деструкторов в вегетационных опытах по очищению почвы от загрязнения нефтью показали, что растения пырея по своим характеристикам роста и развития в 1,5 раза превышали аналогичные показатели для растений из загрязненной почвы и незначительно отличались от растений в почве без загрязнения.

Список опубликованных работ по теме диссертации

Статьи:

1. Emelvanova Е.. Andreeva I., Zagrebelny S. Repin V. Psychrotolerant oil-degrading microorganisms for bioremediation // Environ. Eng. Manag. J. - 2006. - V.5. - No.2. - P. 169-179.

2. Андреева И.С., Емельянова E.K.. Загребельный C.H., Олькин С.Е., Резникова И.К., Репин В.Е.. Психротолерантные штаммы-нефтедеструкторы для биоремедиации почв и водной среды // Биотехнология. - 2006. - №1. - С. 43-52.

3. Andreeva I.S., Emel'vanova Е.К.. Ol'kin S.E., Reznikova I.K., Zagrebel'nyi S.N., Repin V.E. Consumption of Hydrocarbons by Psychrotolerant Degrader Strains // Appl. Biochem. Microbiol. - 2007. - V. 43. - No. 2. P. 201-206.

Патенты на изобретение:

4. Андреева И.С., Емельянова Е.К.. Олькин С.Е., Резникова И.К., Загребельный С.Н., Репин В.Е. Штаммы микроорганизмов-деструкторов Saccharomyces sp. и Pseudomonas sp., используемые для биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды, и ассоциация на их основе // Патент на изобретение № 2272071. Заявка 2004107206/13 от 10.03.2004. Патентообладатель ГНЦ ВБ «Вектор».

5. Андреева И.С., Емельянова Е.К.. Репин В.Е. Штамм Alcaligenes sp. El 135 для биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды // Патент на изобретение № 2271390. Заявка № 2004124964/13 от 16.08.04. Патентообладатель ГНЦ ВБ «Вектор».

Тезисы:

6. Загребельный С.Н., Андреева И.С., Емельянова Е.К.. Пучкова Л.И. Экология природных микробных сообществ водных экосистем // Мат. межрегионального рабочего совещания «Проблемы биоремедиации в XXI веке». - Красноярск. - 2002. - С. 73-74.

7. Емельянова Е. К. Микроорганизмы-биодеструкторы для биоремедиации почв и водной среды, загрязненных нефтепродуктами // Мат. XLI Международной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс". НГУ. - 2003. - С. 66-67.

8. Емельянова Е.К., Андреева И.С., Загребельный С.Н. Исследование разнообразия микроорганизмов, адаптированных к сибирским природным условиям для биоремедиации "местных" нефтезагрязненных почв и водных объектов // Мат. Международного междисциплинарного Конгресса "Прогрессивные научные технологии для здоровья человека". Кара-Даг, Феодосия, Украина, 2003. - С. 69-70.

9. Андреева И.С., Емельянова Е.К.. Загребельный С.Н., Репин В.Е. Ассоциации микроорганизмов, адаптированные к условиям Западной Сибири для биодеградации нефтезагрязнений почвы и водной среды // Материалы Международной научно-практической конференции "Современные проблемы геохимической экологии и сохранения биоразнообразия", Бишкек, Киргизия, 2003,- С. 60-63.

10. Andreeva I.S., Emelyanova Е.К.. Repin V.E., Zagrebelny S.N. The Investigation of the ability of microbial communities from the lake ecosystems to degrade the oil components // IBSM-2003, Irkutsk-Russia, September 8-13, 2003. - P. 5-6.

11. Emel'vanova E„ Andreeva I., Zagrebelny S., Repin V. Bioremediation of oil-polluted soils of Western Siberia with psychrotolerant acid-resistant destructing microorganisms. // Innovate roles of biological resource centers. Proceedings of the tenth International Congress for Culture Collections Tsukuba, Japan, 10-15 October, 2004. - P. 652.

12. Емельянова E.K.. Андреева И.С., Репин В.Е. Загрязненные экосистемы малых рек в черте города Новосибирска - источник активных микроорганизмов-нефтедеструкторов // Материалы 6-ого Международного Конгресса «Экватэк-2004», Москва, 1-4 июня 2004 г. -С. 317.

13. Емельянова Е.К.. Андреева И.С., Репин В.Е. Микроорганизмы-нефтедеструкторы из загрязненных экосистем малых рек // Мат. 3-ей Всероссийской научно-практической конференции «Добыча, подготовка, транспорт нефти и газа», Томск, 20-24 сентября 2004 г. - С. 60-63.

14. Емельянова Е.К., Андреева И.С., Репин В.Е. Бактериальное загрязнение малых городских рек и их способность к самоочищению от нефтепродуктов // Мат. межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование», 27-28 октября 2004 г. Иркутск, 2004. - ИГУ, 2004. -С. 134-138.

15. Емельянова Е.К.. Андреева И.С., Торок Т., Репин В.Е. Проблема загрязнения малых рек. Микробиологический анализ урбанизированной реки Ельцовки-1 в Новосибирске. //

Мат. конф. «Фундаментальные проблемы изучения и использования воды и водных ресурсов», 20-24 сентября 2005г., Иркутск, 2005. - С. 240-242.

16. Емельянова Е.К.. Андреева И.С., Репин В.Е. Применение микроорганизмов, выделенных в загрязненных биотопах, в качестве биодеструкторов нефтепродуктов // Мат. Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», 14-16 сентября 2005 г, Саратов. - С. 70.

17. Andreeva I.S., Svarovskaya L.I., Emelvanova Е.К.. Zagrebelny S.N., Repin V.E. Oxygenase activity of pure cultures of yeasts, bacteria of Arthrobacter genus and their association in the process of biodégradation of the oil of the Las-Egan oilfield //Abstracts 2nd International Conference "SCIENCE-BUSINESS-EDUCATION", Pushchino. -2005. - P. 122-123.

18. Емельянова E.K.. Пучкова Л.И., Андреева И.С., Репин В.Е. Плазмидосодержащий штамм-нефтедеструктор, выделенный из реки Катунь // Мат. 2-го Байкальского Микробиологического Симпозиума «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ», 10-15 сентября 2007 г., Иркутск, 2007. - С. 75-76.

Благодарности

Автор признателен сотрудникам, способствовавшим выполнению данной работы: н.с. Н. И. Печуркиной, к.б.н. Л. И. Пучковой, зав. химико-аналитической лабораторией С. Е. Олькину, н.с. И. К. Резниковой, д.б.н., проф. Т. В. Тепляковой, к.б.н. А. Ю. Алексееву, к.б.н. Л. И. Сваровской, к.х.н. С. В. Морозову, зав. лабораторией «Коллекция вирусов бактерий, плазмид, генетических конструкций и некультивируемых микроорганизмов» В. Г. Пугачеву, Г. М. Тулянкину, к.б.н. Т. И Лобовой, н.с. С. А. Киселеву, д.б.н. Е. В. Дейнеко.

Особую благодарность автор приносит своим руководителям и учителям к.б.н. В. Е. Репину, зав. лабораторией бактериальных и архейных культур И. С. Андреевой, д.б.н., проф. С. Н. Загребельному.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 01-05-64615), МНТЦ (проекты 2490, 2216).

Емельянова Елена Константиновна

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать 30.01.2009. Заказ № 82. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Типография Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Емельянова, Елена Константиновна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Влияние нефти на окружающую среду

1.1.1. Воздействие нефтепродуктов на почву в условиях северного климата

1.1.2. Изменения в составе гумуса в результате загрязнения нефтыо

1.1.3. Влияние загрязнения нефтью на почвенные ферменты

1.1.4. Особенности трансформации нефтезагрязнений в почве северных регионов

1.1.5. Влияние нефти на растения

1.1.6. Воздействие нефтепродуктов на животных и человека

1.2. Способы восстановления почв

1.2.1. Способы и определяющие факторы ремедиации

1.2.2. Сорбенты для сбора нефтепродуктов

1.2.3. Деструкция углеводородов микроорганизмами

1.2.4. Роль плазмид бактерий в биодеградации компонентов нефти

1.2.5. Коммерческие препараты на основе микроорганизмов для очистки почвы и водных объектов от нефтепродуктов

1.2.6. Фиторемедиация

1.2.7. Проведение биоремедиационных работ

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1. Методы выделения, идентификации и хранения штаммов-деструкторов нефтепродуктов

2.2. Методы изучения физиологических и биохимических свойств штаммов микроорганизмов

2.3. Методы изучения биодеградации нефтепродуктов

Глава 3. Результаты исследования и обсуждение

3.1. Выделение и идентификация штаммов-деструкторов нефтепродуктов

3.2. Морфолого-культуральные и физиологические свойства штаммовдеструкторов Yarrowia lipolytica, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter junii, Enterobacter sp.

3.3. Биодеградация нефти бактериальными и дрожжевыми штаммами микроорганизмов

3.4. Оценка деструкции н-алканов микроорганизмами

3.5. Оценка деструкции ароматических углеводородов микроорганизмами

3.6. Исследование биодеструкции нефти в природных условиях

3.7. Рост растений в загрязненной нефтью почве и почве, очищенной биодеструкторами Yarrowia lipolytica и Enterobacter sp. 106 Заключение 111 Выводы 117 Список литературы 118 Приложениие

Список сокращений:

АСВ — абсолютно сухое вещество в. ч. - весовая часть

КАА - крахмало-аммиачный агар

ОДК - ориентировочно допустимые концентрации

РПА - рыбный питательный агар

ПАВ - поверхностно-активные вещества

ПАУ - полициклические ароматические углеводороды

ХМАО - Ханты-Мансийский автономный округ

ЯНАО - Ямало-Ненецкий автономный округ

- удобрения, содержащие азот, фосфор и калий

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микроорганизмы природных биоценозов для биоремедиации почв и водных объектов Сибири, загрязненных нефтепродуктами"

Актуальность темы исследования. Нефтедобывающая промышленность и трубопроводный транспорт по уровню негативного влияния на окружающую среду приближаются в перечне наиболее «грязных» отраслей в России к таким лидерам, как черная и цветная металлургия, нефтехимия и электроэнергетика. От всех объектов нефтегазовой отрасли в окружающую среду попадает большое количество загрязняющих веществ (Мшу^та е1 а!., 2000).

Основные вредные выбросы загрязнителей при добыче нефти и газа происходят при аварийном фонтанировании, опробовании и испытании скважин, испарениях из мерников и резервуаров, очистке технологических емкостей, на установках комплексной подготовки и очистных сооружениях (Мазур, 1996). Проведение рекультивационпых работ в местах утечек является одним из важнейших природоохранных мероприятий, направленных на восстановление биогеоценозов загрязненных земель и водоемов.

Проблема загрязнения окружающей среды иефтыо особенно актуальна для Сибири, где располагается основной нефтегазоносный район России (территория Ханты-Мансийского автономного округа). Негативное влияние нефти распространяется на все составляющие экосистем Севера: ухудшается качество маломощного гумусового слоя, нарушаются аэрация, гидрологический режим и микрорельеф верхних горизонтов почвы, увеличиваются техногенные площади и, как следствие, изменяется биологическое разнообразие природных ландшафтов, разрушаются устоявшиеся трофические цепи. Загрязнение нефтью представляет собой экологическую опасность для живых организмов в связи с такими свойствами, как токсичность, канцерогенность, биоаккумуляция (возможность накопления компонентов нефти в живых организмах).

В связи с тем, что биологическая деградация нефти в окружающей среде начинается микроорганизмами-деструкторами, важно, чтобы их численность была высокой (особенно на начальном этапе восстановления экосистемы). Это не всегда возможно, поскольку микробоценоз страдает от токсического шока, вызываемого поступлением больших количеств нефти в случае разлива, и численность микроорганизмов сокращается. Внесение дополнительных количеств эффективных микроорганизмов-деструкторов (биодеструкторов) позволяет усилить и ускорить разрушение нефти. Для условий севера оптимальным является внесение психротолерантных микроорганизмов, способных функционировать при пониженных температурах. Целесообразным является внесение подкормки для микроорганизмов в виде минеральных и органических веществ для создания оптимальных условий жизнедеятельности. Одним из эффективных приемов биоремедиации является сочетание использования штаммов-деструкторов, природных сорбентов, высева травянистых растений. Эти технологии очистки от нефтепродуктов являются перспективными, поскольку позволяют без значительного ущерба для природы восстановить экосистемы.

Основные задачи исследования:

1. выделение и идентификация штаммов микроорганизмов, утилизирующих нефть;

4. оценка роста и развития растений в очищенной биодеструкторами почве.

Научная новизна работы. Выделены и идентифицированы новые штаммы микроорганизмов, обладающие высокоэффективной нефтеутилизирующей активностью, адаптированные к климатическим условиям Сибири, способные к росту в широком диапазоне pH и содержания NaCl. Определена степень утилизации углеводородов нефти Западной Сибири и республики Коми штаммами выделенных микроорганизмов.

Практическая значимость. Полученные штаммы микроорганизмов, часть из которых защищена патентами (№ 2272071, № 2271390 в приложении), предложены для использования с целью биоремедиации окружающей среды (почв, водоемов), очистки нефтезагрязненных промышленных объектов в условиях северного климата.

Положения, выносимые на защиту:

1. бактериальные штаммы Acinetobacter junii El 133, Acinetobacter calcoaceticus El 134, Acinetobacter calcoaceticus El 135, выделенные из антропогенно загрязненной реки, Enterobacter sp. В 1024, выделенный из эвтрофного озера, дрожжи Yarrowia lipolytica Y 1064, выделенные из торфа, являются эффективными биодеструкторами нефти, утилизирующими до 97% н-алканов и до 53,5% ароматических компонентов нефти.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на международных конференциях «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), «Фундаментальные проблемы изучения и использования воды и водных ресурсов» (Иркутск, 2005), международном Конгрессе «Экватэк-2004» (Москва, 2004), международных конференциях «Добыча, подготовка, транспорт нефти и газа» (Томск, 2004), «Наука и Бизнес. Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина» (Пущино, 2004), «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (Кара-Даг, Украина, 2003), «Innovate roles of biological resource centers» (Tsukuba, Japan, 2004), межрегиональных научно-практических конференциях «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004), «Современные проблемы геохимической экологии и сохранения биоразнообразия» (Бишкек, Киргизия, 2003), Международном Байкальском Симпозиуме по микробиологии «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водоемов» (Иркутск, 2003), межрегиональном совещании «Проблемы биоремедиации в XXI веке» (Красноярск, 2002).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка литературы из 236 наименований, в т.ч. 85 на иностранном языке, приложения. Работа изложена на 143 листах машинописного текста и содержит 16 таблиц и 21 рисунок.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Емельянова, Елена Константиновна

Выводы

2. Наибольшее количество выделенных микроорганизмов-нефтедеструкторов относилось к бактериям родов Acinetobacter, Arthrobacler, Bacillus, Pseudomonas, Rhodococcus, Mycobacterium, Nocardia, Enterobacter, к грибам родов Aspergillus, Pénicillium, Yarrowia и др. Эффективные штаммы-деструкторы нефтепродуктов были идентифицированы как Yarrowia lipolytica, Enterobacter sp., Acinetobacter junii, Acinetobacter calcoaceticus.

3. Оценена степень деструкции п-алканов и ароматических углеводородов штаммами-деструкторами. Содержание н-алканов после биодеградации штаммами Acinetobacter junii, Acinetobacter calcoaceticus снизилось до 97%, ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 - до 92%. Содержание производных бензола после биодеградации ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 снизилось до 34,5 раз; производных нафталина - до 79 раз.

Заключение

Загрязнение нефтью представляет опасность для окружающей среды. В результате разливов нефти нарушается аэрация, гидрологический режим и микрорельеф верхних горизонтов почвы. Наличие нефтяного загрязнения ведет к угнетению растительного покрова на обширных территориях, увеличению техногенных площадей, изменению биологического разнообразия природных ландшафтов. В случае загрязнения нефтепродуктами водных объектов, уменьшается количество растворенного кислорода в воде и происходит обеднение видового разнообразия флоры и фауны.

Нефть представляет собой сложную смесь углеводородов, кислородных, сернистых и азотистых соединений. В ее составе обнаруживается свыше 1000 индивидуальных органических веществ. Легкие фракции обладают наибольшей токсичностью по отношению к живым организмам, но влияние их достаточно кратковременно вследствие быстрого испарения, биодеградации, рассеивания. Тяжелые фракции менее токсичны, но они значительно ухудшают свойства почв, затрудняя водо- и газообмен. Эти компоненты очень устойчивы и могут сохраняться в земле продолжительное время. Наиболее опасна группа ПАУ, являющихся продуктами неполного сгорания ископаемого топлива и органических веществ (Панченко и др., 2003).

Для очистки нефтезагрязненных объектов использование биотехнологических методов является наиболее перспективным направлением. В связи с высокой уязвимостью экосистем в районах нефтедобычи на территории Западной Сибири недостаточно применения обычных рекультивациопных методов, целесообразно внесение биодеструкторов для создания пула активно утилизирующей нефть микробиоты. Внесение дополнительных объемов биомассы обеспечивает пополнение экосистемы ферментами микроорганизмов, которые были иигибированы во время разлива нефти, а также в целом увеличивает биологическую активность почв. Применение эффективных микроорганизмов-деструкторов нефти для биоремедиации почв в условиях пониженных температур Западной Сибири является приоритетным решением. Для очистки водных поверхностей от нефтезагрязнений наиболее экологически приемлимым способом является использование природных сорбентов, например «Сорбонафта», который, помимо сорбции нефти, обеспечивают доступ кислорода в толщу воды, способствуя развитию аэробной углеводород-окисляющей микробиоты.

В связи с тем, что не существует одного универсального штамма-деструктора для всех географических зон, способного утилизировать сразу все компоненты нефти, для суровых условий Сибири актуально использование тех микроорганизмов, которые выделены непосредственно в Сибири. В связи с тем, что в состав нефти входит большое количество различных химических соединений, и один штамм не способен обладать всем спектром ферментов, необходимых для биодеградации этих компонетов, представляется необходимым применение ассоциаций штаммов. Внесение нескольких штаммов в загрязненный субстрат, отличающихся по спектру потребляемых веществ, позволяет утилизировать нефть более эффективно (Кобзев и др., 2001). В условиях природного микробоценоза наблюдается одновременная ассимиляция разных фракций нефти различными группами микроорганизмов (Шкидченко, Аринбасаров, 2001). Таким образом, создание ассоциации штаммов позволяет осуществлять деструкцию нефти наиболее полно. Это связано с разным приоритетным использованием составляющих компонентов нефти различными штаммами, разной скоростью роста микроорганизмов, продуцируемыми метаболитами, которые могут являться факторами роста для других штаммов-деструкторов.

В качастве субстратов для выделения штаммов-деструкторов отбирали пробы в местах нефтедобычи (ХМАО, ЯНАО). С целью выделения штаммов, способных не только к деструкции нефти, но и устойчивых к другим антропогенным загрязнителям (например, к солям тяжелых металлов), отбирали образцы воды и донных отложений малых рек, протекающих по территории г. Новосибирска и области.

Отбор микроорганизмов из загрязненных местообитаний позволил выявить 424 штамма-деструктора нефти родов Acinetobacter, Enterobacter, Yarrowia, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Rhodococcus, Mycobacterium, Nocardia, Acinetobacter, Enterobacter, несовершенных грибов и др.

Эффективными деструкторами нефти оказались природные изоляты из грунтов Спорышевского месторождения Arthrobacter sp. Nb 16, Западно-Салымского месторождения Pseudomonas ND 4, Saccharomyces sp. NR 3-2, из торфа

Васюганской низменности микромицет NF 2-2, из почвы Горного Алтая Acinetobacter sp. Alt 221, Acinetobacter sp. Alt 222, бактериальные изоляты из Якутии Ja 285, Arthrobacter sp. Ja 269.

По результатам весового метода степень деструкции нефти дрожжами Yarrowia lipolytica Y 1064 составляла 69% за 7 суток культивирования в жидкой среде с нефтью при температуре 23-25° С.

Деструкция нефти ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 оказалась более эффективной по сравнению с отдельно взятым штаммом Y 1064. Соотношение клеток 1:1 в ассоциации сохранялось в течение инкубирования. В разных условиях эксперимента (добавление в питательную среду соли, изменение pH, температуры, использование нефти из разных месторождений) утилизация н-алканов ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 оставалась стабильно высокой. При pH 7.0 деструкция н-алкаиов ассоциацией достигала 92 % за 6 суток, в отличие от использования только штамма Yarrowia lipolytica Y 1064, где степень деструкции была равной 69 %. В экспериментах других специалистов (Margesin et al., 2003; Аушева, 2007) показатель деструкции нефти аналогичным штаммом Yarrowia lipolytica был ниже показателя выделенного нами штамма Yarrowia lipolytica Y 1064. Так, утилизация нефти штаммом Yarrowia lipolytica по прошествии 30 сут в опытах Аушевой составляла 42%, а в опытах R. Margesin степень деструкции н-алканов (додекан, гексадекан) штаммом Yarrowia lipolytica RM7/11 при 15°С составляла 50 % и 73 % соответственно по прошествии 5 сут. Степень деструкции и додекана, и гексадекана ассоциацией штаммов Y 1064 и В 1024 составляла 99,5% по прошествии 5 сут. Этот показатель оказался одинаковым как для додекана и гексадекана из Западно-Сибирской нефти, так и для додекана и гексадекана нефти Усинского месторождения (республика Коми).

Поскольку в природе не существует идеальных условий со стабильным значением температур, pH, ассоциация штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 испыгывалась в разных вариантах опыта при pH 5, pH 7, pH 8,5; температурах 4-6° С и 23-25° С; содержании NaCl 0,5%; 5%; 7%; добавлении нефти Васюганской нефтяной провинции и Усинского месторождения.

Так, при pH 5 утилизация н-алканов ассоциацией штаммов Y 1064 и В 1024 составляла 87 %, а при pH 8,5 - 75 % за 6 суток. При 5% NaCl степень утилизации достигает 78 %, при 7% NaCl - 73 % за 6 суток. Кроме этого, ассоциация штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 также достаточно эффективно утилизировала образцы нефти, отличающиеся наличием большого количества тяжелых углеводородов с повышенной вязкостью (нефть Усинского месторождения). При температуре 23 - 25° С утилизация н-алканов Усинской нефти составляла 92 % за 6 суток, при температуре 4 - 6° С - 64 % за 6 суток, в то время как деструкция н-алканов более легкой Васюганской нефти достигала 92% при температуре 23 - 25° С, и 82 % при температуре 4-6 °С. Таким образом, ассоциация штаммов Y 1064 и В 1024 является эффективной в широком интервале температур (в том числе при пониженных), и может быть использована для создания препарата, очищающего нефтезагрязненные территории северных районов.

Выяснено, что утилизация ароматических углеводородов (нафталина и антрацена) происходит более интенсивно в образце с ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 (уменьшение площадей пиков в 2,14 раза), чем с добавлением монокультуры штамма Y 1064 (уменьшение площадей пиков в 1,44 раза) по сравнению с контролем за 20 суток культивирования. Таким образом, ассоциация штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 утилизировала ароматические углеводороды в полтора раза эффективнее одного внесенного штамма Y 1064. После биодеградации ассоциацией культур Y 1064 и В 1024 в остаточной нефти значительно снизилась доля алкилбензолов и алкилнафталинов.

Важно, что штаммы Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024, перспективные для биотехнологических разработок по нефтеутилизирующей способности, являются, согласно полученным данным, психротолерантными и солеустойчивыми (до 5 % NaCl). Это предполагает возможность их использования в засоленных природных субстратах при пониженных температурах (например, на территории нефтеразлива, где кроме нефти присутствуют минерализованные пластовые воды).

Из антропогенно преобразованной малой реки Ельцовки-1 в черте г. Новосибирска были выделены 3 штамма, идентифицированные как Acinetobacter junii и Acinetobacter calcoaceticus. Степень деструкции различных н-алканов, согласно хроматографическому анализу, клетками штаммов Acinetobacter junii El 133, Acinetobacter calcoaceticus El 134, Acinetobacter calcoaceticus El 135 составляла от 91 до 97 % за 7 суток культивирования, что также явялется хорошим показателем утилизации нефти.

Скриниг плазмидных ДНК в клетках штаммов El 133, El 134 и El 135 показал, что штаммы содержат разное количество плазмид, которые отличаются по молекулярному весу. Размер плазмидных ДНК в штаммах El 133 и El 134 составляет более 23000 Ьр. Штамм El 135 содержит набор плазмид, как высоко-, гак и пизкомолекулярпых. Возможно, высокая степень утилизации нефти, а также устойчивость к различным загрязнителям, поступающим с ливневым стоком в реку, является следствием наличия плазмид.

Отсутствие фитопатогенного эффекта у деструкторов было доказано опытом с обработкой суспензией штаммов Y 1064, El 133, El 134 и El 135, В 1024 семян огурца и гороха. Всхожесть семян оказалась 100%, развитие проростков не отличалось от контрольных. В эксперименте с выращиванием огурца и гороха было показано, что в очищенной ассоциацией Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 почве всхожесть семян была 98%. Семена в загрязненной почве имели низкую всхожесть, выросшие из них растения огурца и гороха были существенно ниже, стадия цветения не наступила. Внешне побеги экспериментальных растений в очищенной почве были немного ниже контрольных, выращенных в чистой почве, но стадия цветения наступила одноврехменно у экспериментальных и контрольных растений. Впоследствии разница в росте растений в контрольной и экспериментально очищенной штаммами почве исчезла.

В эксперименте с растениями пырея внесение суспензий штаммов-деструкторов (ассоциация Y 1064 и В 1024) в нефтезагрязненную почву значительно улучшало рост пырея по таким параметрам, как высота растений, длина корня, количество листьев. Например, высота экспериментальных растений в очищенной почве была меньше по сравнению с контролем в 1,17 раза, больше по сравнению с растениями из загрязненной почвы в 1,54 раза. Таким образом, предложенная ассоциация микроорганизмов очищала почву, что доказывает существенно улучшенный рост растений по сравнению с ростом растений в загрязненной почве.

Предложенные микроорганизмы могут быть использованы для биоремедиации загрязненных нефтью и минерализованными пластовыми водами почв, водных и промышленных объектов в условиях пониженных температур.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Емельянова, Елена Константиновна, Кольцово

1. Алгале Анвар Абдулрахман Салем. Сорбционные и биологические методы ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций при обращении с нефтепродуктами: Дис. . канд. техн. наук: СПб., 2004. 145 с.

2. Алексеева Т.П., Бурмистрова Т.И., Терещенко H.H., Стахина Л.Д., Панова H.H. Перспективы использования торфа для очистки нефтезагрязненпых почв // Биотехнология. 2000. - №1. - С. 58-64.

3. Алыков Н.М. Реснянская A.C. Очистка воды природным сорбентом. // Экол. и пром-сть России. 2003. - № 2. - С. 12-13.

4. Антоненко A.M., Занина О.В. Влияние нефти па ферментативную активность аллювиальных почв Западной Сибири // Почвоведение. 1992. - № 1. - С. 3843.

5. Арене В.Ж., Саушин А.З., Гридин О.М. Очистка окружающей среды от углеводородных загрязнений. М.: Интербук, 1999. - 371 с.

6. Артемьева Т.И, Жеребцов А.К., Борисович Т.М. Влияние загрязнения почвы нефтью и нефтепромысловыми сточными водами на комплекс почвенных животных // Восстановление загрязненных нефтью наземных экосистем. М., Наука, 1988.-С. 82-98.

7. Артемьева Т.И. Комплексы почвенных животных и вопросы рекультивации техногенных территорий. М., "Наука", 1989. - 109 с.

8. Аушева Х.А. Разработка новой формы биопрепарата для очистки водных объектов от тонких нефтяных пленок: Автореферат дис. . канд. техн. наук. -М., 2007.- 21 с.

9. Ахметов JI.И. Роль горизонтального переноса плазмид биодеградации в микробной деструкции полициклических ароматических углеводородов: Дис. . канд. биол. наук. Пущино, 2006. 163 с.

10. Балашова Н.В., Кошелева И.А., Филонов А.Е., Гаязов P.P., Воронин A.M. Штамм Pseudomonas putida BS3701 деструктор фенантрена и нафталина // Микробиология. - 1997. - Т. 66. - № 4. - С. 488^193.

11. Барышникова Л.М., Грищенков В.Г., Аринбасаров М.У., Шкидченко А.Н., Воронин A.M. Биодеградация нефтепродуктов штаммами-деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде // Прикл. биохим. и микробиол. 2001. - Т. 37. -№ 5. - С. 542-548.

12. Белоусова Н.И., Барышникова Л.М., Шкидченко А.Н. Отбор микроорганизмов, способных к деструкции нефти и нефтепродуктов при пониженных температурах. // Прикл. биохим. и микробиол. — 2002. — Т. 38. -№5.-С. 513-517.

13. Биологическая очистка шламонакопителя (на примере аэропорта «Сыктывкар»), Арчегова И.Б., Хабибуллина Ф.М., Шубаков A.A., Романов Г.Г., Маркарова М.Ю., Мульд О.О., Сыркова В.Л. Сыктывкар. - 2002. - 16 с.

14. Биологическая рекультивация ira Севере (вопросы теории и практики). Ред. Арчегова И.Б. Коми научный центр УрО РАН, Сыктывкар, 1992. 104 с.

15. Бурмистрова Т.И., Алексеева Т.П., Перфильева В.Д., Терещенко H.H., Стахина Л.Д. Биодеградация нефти и нефтепродуктов в почве с использованием мелиорантов на основе активированного торфа // Химия растительного сырья. 2003. - №3. - С. 69-72.

16. Вавер В.И. Рекультивация земель, загрязненных нефтью // Биол. Ресурсы и природопользование. 1997. - Вып. 1. - С. 114-135.

17. Васильев С.В. Воздействие нефтегазодобывающей промышленности на лесные и болотные экосистемы. Новосибирск: «Наука», 1998. 136 с.

18. Владимиров A.M., Ляхин Ю.И., Матвеев Л.Т., Орлов В.Г. Охрана окружающей среды. Л.: Гидрометеоиздат, 1991. - 423 с.

19. Воронина Л.П. Аспекты действия гуминоминеральных удобрений // мат. коиф. «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». Саратов, 2005. - С. 126-127.

20. Восстановление земель на Крайнем Севере. Ред. Арчегова И.Б. Коми научный центр УрО РАН, Сыктывкар, 2000. 152 с.

21. Восстановление нефтезагрязненпых почвенных экосистем. Ред. Глазовская М.А. М.: «Наука», 1988. - 239 с.

22. Врагова Е.В. Оценка потенциальной устойчивости природных комплексов в условиях воздействия нефтегазового комплекса // «Технологии ТЭК», изд-во «Нефть и капитал». 2003. - № 3 (10). - С. 68-72.

23. Габбасова И.М., Сулейманов P.P. Трансформация серых лесных почв при техногенном засолении и осолонцевании и в процессе их рекультивации в нефтеперерабатывающих районах Южного Приуралья // Почвоведение. -2007.-№ 9. С. 1120-1128.

24. Габбасова И.М., Хазиев Ф.Х., Сулейманов P.P. Оценка степени восстановленности нефтезагрязненных почв с давними сроками загрязнения после биологической рекультивации // Почвоведение. 2002. - № 10. - С. 1259-1273.

25. Гашева М.Н., Гашев С.Н., Соролютин A.B. Состояние растительности как критерий нарушепности лесных биоценозов при нефтяном загрязнении // Экология. 1990. - № 2. - С. 77-78.

26. Глазовская М.А. Способность окружающей среды к самоочищению // Природа.- 1979. -№3. -С. 71-79.

27. Градова Н.Б., Гориова И.Б., Эддауди Р., Салина Р.Н. Использование бактерий рода Azotobacter при биоремедиации нефтезагрязненных почв // Прикл. биохим. и микробиол. 2003. - Т. 39. -№3. - С. 318-321.

28. Гранатовский В.А., Сирая Т.Н. Методы обработки экспериментальных данных при измерениях. Л.: Энергоатомиздат, 1990. - 288 с.

29. Грищенко О.М. Ботанические аномалии как поисково-разведочный критерий нефтегазоносности // Экология. № 1. - 1982. - С. 18-22.

30. Гулько А.Е., Хазиев Ф.Х. Фенолоксидазы почв: продуцирование, иммобилизация, активность // Почвоведение. 1992. - № 11. - С. 55-67

31. Добровольский В. В. География почв с основами почвоведения. М.: «Владос», 2001 г. - 384 с.

32. Долгова Л.Г. Применение ферментативной активности как одного из диагностических показателей, характеризующих загрязнение промышленными выбросами почвы // Биологическая диагностика почв. М.: «Наука», 1976. С.76-77.

33. Евдокимова Г.А., Мозгова Н.П., Корнейкова М.В., Ахтулова Е.М., Михайлова И.В. Воздействие загрязнения почв дизельным топливом на растения и ризосферную микробиоту на Кольском Севере // Агрохимия. 2007. - № 12. -С. 49-55.

34. Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М.: Изд-во МГУ, 1995. - 224 с.

35. Етерсвская Л.В., Яранцева Л.Д. О влиянии на растения загрязнений почвы при бурении и разведке на нефть и газ // Растения и промышленная среда. Киев: Наукова думка, 1976. С. 73-75.

36. Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ, 2005. -445 с.

37. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М. Экология актиномицетов. М.: ГЕОС, 2001. 257 с.

38. Зеленкова 11.Ф, Аринбасаров М.У. Анализ продуктов микробиологической деградации толуола методом обращено-фазной жидкостной хроматографии // Прикл. биохим. и микробиол. 2003. - Т. 39. - № 2. - С. 199-201.

39. Зубайдуллип A.A. К вопросу рекультивации нефтезагрязненных земель на верховых болотах // Биологические ресурсы и природопользование. Сборник научных трудов. Нижневартовск: Изд-во Нижневарт. пед. ин-та, 1998. - Вып. 2.-С. 106-116.

40. Зубайдуллин A.A. Рекультивация нефтезагрязненных земель в Среднем Приобье: недостатки и основные причины низкой эффективности // Биологические ресурсы и природопользование. Сборник научных трудов. Выпуск 6. Сургут: «Дефис». - 2003. - С. 129-139.

41. Ибатуллин P.P., Шайдуллина И.А., Латыпова В.З., Мутин И.И. Оценка экологической эффективности мероприятий по рекультивации нефтезагрязненных земель // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. 2006. - № 8. - С. 14-18.

42. Иванов A.B. Гигиеническая характеристика окружающей среды и здоровья населения в районах добычи тяжелой нефти и природных битумов // Гигиена и санитария. 2001. -№ 3. - С. 5 - 33.

43. Измалкова Т.Ю. Разнообразие генетических систем катаболизма нафталина штаммов флуоресцирующих пссвдомонад: Дис. . канд. биол. наук. Пущино, 2004. 129 с.

44. Измалкова Т.Ю., Сазонова О.И., Соколов C.JL, Кошелева И.А., Воронин A.M. Плазмиды биодеградации нафталина и салицилата Р-7 группы несовместимости в штаммах флуоресцирующих псевдомонад // Микробиология. 2005. - Т. 74. - № 3. - С. 342 -348.

45. Исмаилов Н.М. Влияние нефтяного загрязнения на круговорот азота в почве // Микробиология. 1983. - Т. 52. - № 6. - С. 1003-1007.

46. Исмаилов Н.М. Микробиологическая и ферментативная активность нефтезагрязненных почв // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. М.: «Наука», 1988. С. 42-56.

47. Казанцева М.Н., Гашев С.Н., Казанцев А.П. Влияние нефтедобычи на состояние и продуктивность живого напочвенного покрова и Oxycoccus palustris Pers. верховых болот Среднего Приобья // Растит. Ресурсы. 2002. -Т. 38.-№ 1.- С. 44-48.

48. Капелькина JI.П. Экологические аспекты оптимизации техногенных ландшафтов. СПб, 1993.- 190 с.

49. Капелькина Л.П, Бакина Л.Г. Критерии установления региональных нормативов допустимого остаточного содержания нефти в почвах // Мат. конф. «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». Саратов, 2005. - С. 133-134.

50. Киприанов А.И., Юдкевич Ю.Д., Завьялов А.Н., Голылмидт Ю.М., Лебедев Е.А. Способ получения материала для удаления нефтепродуктов с поверхности воды // A.C. СССР № 998645, МКИ Е 02 В 15/04. Опубл. 23.02.83. БИ №7, 1983.

51. Киреева H.A. Микробиологические процессы в нефтезагрязненпых почвах. Уфа: Издательство БашГУ, 1995. 172 с.

52. Киреева H.A., Галимзянова A.M., Мифтахова A.M. Микромицеты почв, загрязненных нефтью, и их фитотоксичность // Микология и фитопатология. 2000.-Т. 34. -Вып.1. С. 36-41.

53. Киреева H.A., Водопьянов В.В., Новоселова Е.И., Онегова Т.С., Жданова Н.В. Микробиологическая рекультивация нефтезагрязненных почв. Москва, ОАО «ВНИИОЭНГ», 2001 а. 40 с.

54. Киреева H.A., Мифтахова A.M., Кузяхметов Г.Г. Рост и развитие" сорных растений в условиях техногенного загрязнения почвы // Вестник Башкирского университета. -2001 b. № 1. - С. 32-34.

55. Киреева H.A., Новоселова Е.И., Ямалетдинова Г.Ф. Активность оксидоредуктаз в нефтезагрязненных и рекультивируемых почвах // Агрохимия. 2001. - №4. - С. 53-60.

56. Киреева H.A., Новоселова Е.И., Онегова Т.С. Активность каталазы и дегидрогеназы в почвах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами // Агрохимия. 2002. - №8. - С. 64-72.

57. Киреева H.A., Бакаева М.Д., Галилезянова Н.Ф. Влияние нефтепродуктов на комплекс почвенных микромицетов // Микология и фитопатология. 2004 а. — вып.1.-Т. 38.-С. 27-31.

58. Киреева H.A., Тарасенко Е.М., Бакаева М.Д. Детоксикация нефтезагрязненных почв под посевами люцерны (Medicago sativa L.) // Агрохимия. 2004 b. - № 10. - С. 68-72.

59. Киреева H.A., Тарасенко Е.М., Шамаева А.А, Новоселова Е.И. Влияние загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами на активность липазы // Почвоведение. 2006. - № 8. - С. 1005-1011.

60. Киреева H.A., Бакаева М.Д., Галимзянова Н.Ф. Влияние различных способов биоремедиации нефтезагрязненных почв на характеристику комплекса микромицетов // Прикл биохим. и микробиол. 2008. - Т. 44. - № 1. - С. 63-68.

61. Кобзев E.H., Пстрикевич С.Б., Шкидченко А.Н. Исследование устойчивости ассоциации микроорганизмов-нефтедеструкторов в открытой системе // Прикл. биохим. и микробиол. 2001. - Т. 37. - № 4. - С. 413-418.

62. Консорциум дрожжей Candida maltosa для биодеградации нефтезагрязнений: пат. Рос. Федерация: 2114174 С1. Кузнецов П.А., Авчиева П.Б.; заявитель и патентообладатель Кузнецов П.А. 05.06.97. 4 с.

63. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей срсде // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. - Т. 32. - №6. - С. 579 - 585.

64. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Ильинский В.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон // Микробиология. 1994. - Т. 63. - Вып. 5.- С. 917-923.

65. Кочетков В.В., Балакшина В.В., Мордухова Е.А., Воронин A.M. Плазмиды, кодирующие биодеградацию нафталина в ризосферных бактериях рода Pseudomonas // Микробиология. 1997. - Т. - 66. - № 2. - С. 211-216.

66. Куюкина М.С., Ившина И.Б., Осипенко М.А., Няшин Ю.И., Коростина O.A. Модель нефтеотмывания загрязненного почвогрунта под действием ^/го^/ососс^-биосурфактанта // Российский журнал биомеханики. 2006. - Т. 10. -№ 1. - С. 59-67.

67. Лабинская A.C. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М., Медицина, 1978. - 394 с.

68. Лапина Г.П., Чернавская Н.М., Литвиновский М.Е., Сазанова C.B. Физико-химические характеристики загрязнения окружающей среды при техногенных катастрофах (разлив нефти) // Хим. и биол. безопасность. 2007. - № 1 (31). -С. 24-32.

69. Лапшина Е.Д., Блойтен В. Типы нарушений и естественное восстановление растительности олиготрофных болот на нефтяных месторождениях Томской области // Сибирский ботанический журнал (Krylovia). 1999. - Т. 1. - № 1. - С. 129-140.

70. Лебедева М.Н. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. М.: Медицина, 1973. - 312 с.

71. Логинов О.Н., Бойко Т.Ф., Костюченко В.П., Комаров С.И., Подцепихин А.К., Галимзянова Н.Ф. О биологической очистке технологических отвалов от нефтепродуктов // Почвоведение. 2002. - № 4. - С. 481-486.

72. Логинов О.Н., Нуртдинова Л.А., Бойко Т.Ф., Четвериков С.П., Силищев H.H. Оценка эффективности нового биопрепарата «Лепойл» для биоремедиации нефтезагрязненных почв // Биотехнология. 2004. - № 1. - С. 77-82.

73. Логинов О.Н., Силищев H.H., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф. Биотехнологическис методы очистки окружающей среды от техногенных загрязнений. Уфа, 2000. 99 с.

74. Магомедова М.А. Лишайники предтупдровых лесов Западной Сибири // Ботан. Журн. 1994.-Т. 79. - № 11.-С. 1-11.

75. Мазур И.И. Инженерная экология. Общий курс. М.: Высшая школа, 1996. -2 Т.-655 с.

76. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.

77. Маркарова М.Ю. Использование углеводородокисляющих бактерий для восстановления нефтезагрязненных земель в условиях Крайнего Севера: Дис. . канд. биол. наук. Пермь, 1999. 157 с.

78. Масленников П.В., Бородей A.B. Антоцианины как тест на нефтяное загрязнение // Мат. И Международного симпозиума по биоиндикаторам "Современные проблемы биоиндикации и биомониторинга". Сыктывкар, 2001.-С. 124-125.

79. Методы общей бактериологии. Ред. Ф Герхард и др. М.: Мир, 1983. -536 с.

80. Мирчинк Т.Г. Почвенная микология. М.: Изд.-во МГУ, 1988. 220 с.

81. Мишустин E.H., Емцев В.Т. Микробиология. М.: Колос, 1978. 351 с.

82. Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями. Ред. Игнатов B.B. М.: Наука, 2005. - 262 с.

83. Морозов Н.В., Петров Г.Н. Опыты по самоочищению воды от нефти в присутствии водной растительности. // Теория и практика биологического самоочищения загрязненных вод. М.: Наука, 1972. С. 53-59.

84. Муратова А.Ю., Турковская О.В., Хюбнер Т., Кушк П. Использование люцерны и тростника для фиторемедиации загрязненного углеводородами грунта // Прикл. биохим. и микробиол. 2003. - Т. 39. - №6. - С. 681 - 688.

85. Назаров A.B., Иларионов С.А. Изучение причин фитотоксичности нефтезагрязненных почв // Письма в Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология». 2005 а. - № 1. - С. 60-65.

86. Назаров A.B., Иларионов С.А. Фиторемедиация почв, загрязненных соединениями токсичных химических элементов // Защита окруж. среды в нефтегаз. комплексе. 2005 Ь. - № 12. - С. 21-26.

87. Некрасов Н. П. Лекции по биофизике. М.: Наука, 1984. 241 с.

88. Никитина Е.В. Токсиколого-микробиологические аспекты биоремедиации нефтешлама отхода нефтехимического производства: Автореферат дис. . канд. биол. наук. - Казань, 2003. - 23 с.

89. Новоселова Е.И. Структурно-функциональная трансформация биогеоценоза при нефтяном загрязнении и пути его восстановления. Уфа, РИО БашГУ, 2004. 126с.

90. Определитель бактерий Берджи: в 2 тт. Ред. Хоулт Дж., Криг Н., Снит П. и др.; пер. с англ. под ред. Заварзина Г.А. МИР, 2001 г. - 800 с.

91. Панов Г.Е. Охрана труда при разработке нефтяных и газовых месторождений. М.: Недра, 1982.- 248 с.

92. Панченко JT.B., Турковская О.В., Дубровская Е.В., Муратова А.Ю. Методические рекомендации по биорекультивации нефтезагрязненных земель. Изд-во Саратовского Ун-та. 2003. - 28 с.

93. Петерсон Е.В., Курыляк Е.К. Свободная и связанная пероксидаза почв // Почвоведение. 1982. - № 5. - С. 60-67.

94. Петров Ал. А. Углеводороды нефти. М.: Наука, 1984. 264 с.

95. Пиковский Ю.И. Природные и техногенные потоки углеводородов в окружающей среде. М.: Изд-во МГУ, 1993. 208 с.

96. Пиковский Ю.И. Трансформация техногенных потоков нефти в почвенных экосистемах // Восстановление иефтезагрязненых почвенных экосистем. М.: Наука, 1988. С. 7-22.

97. Пиковский Ю.И., Солнцева Н.П. Геохимическая трансформация дерново-подзолистых почв под влиянием потока нефти // Техногенный поток веществ в ландшафтах и состояние экосистем. М., 1981. 250 с.

98. Плешакова Е.В., Муратова А.Ю., Турковская О.В. Деградация минерального масла штаммом Acinetobacter calcoaceticus II Прикл. биохим. и микробиол. -2001. Т. 37.-№ 4. - С. 398-405.

99. Пономарев В.Г., Иоккимис Э.Г., Монгайт И.Л. Очистка сточных вод нефтеперерабатывающих заводов. М.: Химия, 1985. С. 114-124.

100. Посттехногенные экосистемы Севера. Ред. Арчегова И.Б. СПб.: Наука, 2002. 159 с.

101. Раськова Н.В. Активность и свойства пероксидазы и полифенолоксидазы в дерново-подзолистых почвах под лесными биоценозами // Почвоведение. -1995.-№ 11.-С. 1363-1368.

102. Сангаджиева О.С. Экологические особенности нефтезагрязненных почв Республики Калмыкия и разработка методов их биоремедиации: Дис. . канд. биол. наук: Астрахань, 2004. 167 с.

103. Сачкова О. А., Коннова С. А., Игнатов В. В. Изменение состава гликанов тростника обыкновенного в ответ на загрязнение воды // мат. конф. «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». -Саратов, 2005. С. 145-146.

104. Седых В. П., Игнатьев JI. А., Семенюк В. М. Реакция растений на отходы бурения нефтяных скважин. Всхожесть семян и развитие сеянцев. Сообщ.1. // Сиб. Экол. Журнал. 1998 а. -№1.-С. 105-110.

105. Седых В. Н., Игнатьев JI. А., Семенюк В. М. Реакция растений на отходы бурения нефтяных скважин. Ювенильная фаза развития. Сообщ. 2. // Сиб. Экол. Журнал, 1998 Ь. -№1. - С. 111-116.

106. Сергиенко С.Р., Таимова Б.А., Талалаев Е.И. Высокомолекулярные неуглеводородные соединения нефти. М.: «Наука», 1979. - 270 с.

107. Сивоконь И.С. Анализ современного состояния природной среды в районе Ватинского нефтяного месторождения // Биол. ресурсы и природопользование. 1997. - Вып. 1. - С. 99-113.

108. Симонян Б.Н., Галстян А.Ш. Диагностика эродированных почв по активности ферментов. // Проблемы и методы биологической диагностики и индикации почв. М.: «Наука», 1976. 400 с.

109. Справочник по гигиене труда. Ред. Карпов Б.Д., Ковшило В.Е. JL: «Медицина». - 1976. - 536 с.

110. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Рева О.Н., Иванов В. Н. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв. //Прикл. биохим. и микробиол. 1995. - Том 31. - №5. - С. 534 - 539.

111. Суржко JI. Ф., Финкелыитейн 3. И., Баску нов Б. П., Янкевич М. И., Яковлев В. И., Головлева Л. А. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками // Микробиология. 1995. - Т. 64. - № 3. - С.393-398.

112. Таскаев А.И., Боровинских А.П., Архипченко И.А. Опыт биологической рекультивации земель в условиях Крайнего Севера // Экол. и пром-сть России. -2004.-С. 27-31.

113. Фахрутдииов А.И. Микробиологическая и ферментативная активность почв и грунтов при рекультивации нефтезагрязненных территорий: Автореф. дис. канд. биол. наук СПб., 2005. - 20 с.

114. Хазиев Ф.Х. Ферментативная активность почв. М.: Наука, 1976. 179 с.

115. Хазиев Ф.Х., Багаутдинова Ф.Я. Углеводные компоненты органического вещества почвы. Уфа: БФАН СССР, 1978. 146 с.

116. Хенце М., Армоэс П., Ля-Кур-Янсен Й., Арван Э. Очистка сточных вод. -Мир, 2006 г.-480 с.

117. Химия окружающей среды. Пер. с англ. / Ред. А.П.Цыганкова. М.: Химия, 1982. - 672 с.

118. Хомякова Д. В., Ботвинко И. В., Нетрусов А. И. Выделение психроактивных углеводородокисляющих бактерий из нефтезагрязненных почв // Прикл. биохим и микробиол. 2003. - Т. 39. - № 6. - С. 661 - 664.

119. Хотеев В.В. Формирование растительности на нефтезагрязненных территориях различных почвенно-климатических зон Тюменской области: Дис. . канд. биол. наук. Тюмень, 2002. - 182 с.

120. Чижов Б.Е. Рекультивация нефтезагрязненных земель Ханты-Мансийского автономного округа (практические рекомендации). Тюмень: Изд-во ТюмГУ, 2000. 52 с.

121. Чижов Б.Е., Захаров А.И., Гаркунов Г.А. Деградационно-восстановительная динамика лесных фитоценозов после нефтяного загрязнения // Леса и лесное хозяйство Западной Сибири. Вып. 6. Тюмень: Изд-во ТюмГУ, 1998. - С. 160 -172.

122. Шайдуллина И.А. Нормирование и минимизация образования и опасности нефтезагрязненных почв для природной среды (на примере ОАО «Татнефть»): Дис. . канд. хим. наук. Казань, 2006. - 137 с.

123. Шкидченко А.Н., Аринбасаров М.У. Изучение нефтедеструктивной активности микрофлоры прибрежной зоны Каспийского моря // Прикл. биохим. и микробиол. 2001. - Т. 38. - № 5. - С. 509-512.

124. Щербакова Т.А. Ферментативная активность почв и трансформация органического вещества. Мн.: Наука и техника, 1983. 220 с.

125. Экология зарастающего озера и проблема его восстановления. Ред. Драбкова В. Г., Прыткова М. Я. Спб: Наука, 1999. - 222с.

126. Ягафаров И. Р. Совершенствование методов и средств для обезвреживания и ликвидации нефтешламовых накопителей: Автореферат дис. . канд. техн. наук: Уфа, 2006. 23 с.

127. Ягафарова Г.Г. Экологическая биотехнология в нефтегазодобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности. Учеб.пособие. - Уфа, 2001. - 213 с.

128. Ягафарова Г.Г., Сафаров А.Х., Ильина Е.Г., Ягафаров И.Р., Барахнина В.Б., Сухаревич М.Э. Влияние продуктов окисления керогена сланцев на биодеструкцию нефти и нефтепродуктов в почве и воде // Прикл. Биохим. и микробиол. 2002. Т 38. - № 5. С. 518-522.

129. Ягафарова Г.Г., Хлесткин Р.Н., Ягафаров И.Р. Испытания биопрепарата "Родотрин" для ликвидации нефтяных загрязнений на территории Татарстана // Нефтепереработка и нефтехимия. 1998. - №7. - С. 45-47.

130. Янкевич М. И. Формирование ремедиационных биоценозов для снижения антропогенной нагрузки на водные и почвенные экосистемы: Автореферат дис. . д-ра биол. наук. Щелково, 2002. - 50 с.

131. Ahrean D.G., Meyer S.P., Standard P.G. The role of yeasts in the decomposition of oils in marine environments. In: Murray, E.D. (Ed.). Developments in Industrial Microbiology. V. 12. American Inst. Biol. Sci. Washington, DC. - 1971. - P. 126134.

132. Aislabie J., Foght J., Saul D. Aromatic hydrocarbon-degrading bacteria from soil near Scott Base, Antarctica. // Polar. Biol. 2000. - Vol. 23. - P. 183-188.

133. Al-Hasan R.II., Al-Bader D.A., Sorkhoh N.A., Radwan S.S. Evidence for n-alkane consumption and oxidation by filamentous cyanobacteria from oil-contaminatedcoasts of the Arabian Gulf// Marine Biology. 1998. - V. 91. - No 3. - P. 533540.

134. Al-Hasan R.H., Khanafcr M., Eliyas M., Radwan S.S. Hydrocarbon accumulation by picocyanobactcria from the Arabian Gulf // J. Appl. Microbiol. 2001. - V. 91. -No 3. - P. 533-540.

135. Al-Hasan R.H., Sorkhoh N.A., Al-Bader D., Radwan S.S. Utilization of hydrocarbons by cyanobacteria from microbial mats on oily coasts of the Gulf // J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. - V. 41. - No 5. - P. 615-619.

136. Anderson T.A., Guthrie E.A., Walton B.T. Bioremediation in rhizosphere // Environ. Sci. Technol. 1993. - V. 27. - No 13. - P. 2630-2636.

137. Banks M.K., Kulakow P., Schwab A.P., Chen Z., Rathbone K. Degradation of crude oil in the rhizosphere of Sorghum bicolor // Int. J. Phytoremediation. 2003. -V. 5.-No3.-P. 225-234.

138. Baraniecki C.A., Aislabie J., Foght M. Characterization of Sphingomonas Ant-17, an aromatic hydrocarbon-degrading bactcrium isolated from Antarctic soil // Microbial ecol. 2002. - V. 43. - No 1. - P. 44-54.

139. Bento F.M., Gaylarde C.C. Biodeterioration of stored diesel oil: studies in Brazil // Int. Biodeterior. Biodegrad. 2001. - V. 47. - No 2. - P. 107-112.

140. Biological degradation and bioremediation of toxic chemicals. Ed. Rasul Chaudhry G. Oregon. - 2004. - 515 p.

141. Britton L.N. Microbial Degradation of Aliphatic Hydrocarbons. In: Microbial Degradation of Organic Compounds. Gibson D.T. (Ed.). Marccl Dekker, New York. 1984.-P. 89-129.

142. Cerniglia C.E., Baalen C.V., Gibson D.T. Metabolism of naphthalene by the cyanobacterium Oscillatoria sp., strain JCM // J. Gen. Microbiol. 1980. - V. 116. -No 1,-P. 485-494.

143. Cerniglia C.E., Gibson D.T., Van Baalen C. Algal oxidation of aromatic hydrocarbons: formation of 1-naphthol from naphthalene by Agmenellum quadruplicatum, strain PR-6 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. - V. 88. -No l.-P. 50-58.

144. Cerniglia C.E. Biodégradation of polycyclic aromatic hydrocarbons // Biodégradation. 2002. - V. 3.-No 2-3.-P. 351-368.

145. Chaillan F., Gugger M., Saliot A., Coûté A., Oudot J. Role of cyanobactcria in the biodégradation of crude oil by a tropical cyanobacterial mat // Chemosphere. -2006. -V. 62.-No 10.-P. 1574-1582.

146. Chaineau C.H., Yepremian C., Vidalie J.F., Ducreux J., Ballerini D. Bioremediation of a Crude Oil-Polluted Soil: Biodégradation, Leaching and Toxicity Assessments // Water Air and Soil Pollution. 2003. - V. 144. - No l.-P. 419-440.

147. Cirigliano M.C., Carman G.M. Purification and characterization of Liposan, a bioemulsifier from Candida lipolytica II J. Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 50.-No 4.-P. 846-850.

148. Cohen Y. Bioremediation of oil by marine microbial mats // Int. Microbiol. -2002.-V. 5.-No 4.-P. 189-193.

149. Colombo J.C., Cabello M., Arambarri A.M. Biodégradation of aliphatic and aromatic hydrocarbons by natural soil microflora and pure cultures of imperfect and lignolitic fungi // Environ, pollution. 1996. - V. 94. - No 3. - P. 355-362.

150. Cooper D.G., Paddock D.A. Production of a Biosurfactant from Torulopsis bombicola //J. Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 47. - No 1. - P. 173-176.

151. Cunningham S.D., Anderson T.A., Schwab A.P., Hsu F.S. Phytoremediation of soils contaminated with organic pollutants // Adv. Agron. (year-book). — 1996. V. 56.-P. 55-116.

152. Dean-Ross D., Moody J.D, Freeman J.P., Doerge D.R., Cerniglia C.E. Metabolism of anthracene by a Rhodococcus species // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - V. 204. -No l.-P. 205-211.

153. Diaz E., Ferrandez A., Prieto M.A., Garcia J.L. Biodégradation of Aromatic Compounds by Escherichia coli II Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. - V. 65. - No. 4. - P. 523-569.

154. Ferrari M.D., Neirotti E., Albornoz C. Occurrence of heterotrophic bacteria and fungi in an aviation fuel handling system and its relationship with fuel fouling // Rev. Argent. Microbiol. 1998. - V. 30. - No 3. - P. 105-114.

155. Gallego J.L., Loredo J., Llamas J.F., Vazquez F., Sanchez J. Bioremcdiation of diesel-contaminated soils: Evaluation of potential in situ techniques by study of bacterial degradation // Biodégradation.- 2001. V. 12. - No 5. - P. 325 - 335.

156. Gaylarde C.C., Bento F.M., Kelley J. Microbial contamination of stored hydrocarbon fuels and its control // Rev. Microbiol. 1999. - V. 30. - No 1. - P. 110.

157. I-Ianson K.G., Nigam A., Kapadia M., Desai A.J. News & Notes: Bioremediation of Crude Oil Contamination with Acinetobacter sp. A3 // Curr. Microbiol. Issue. -1997,- V. 35.-No3.-P. 191- 193.

158. Harmsen J. Possibilities and limitations of landfarming for cleaning contaminated soils. In: Ilinchee RE & Ollenbuttel RF (Eds). On site Bioreclamation. - 1991. -P. 255-272.

159. Henriques I., Moura A., Alves A., Saavedra M.J., Correia A. Analysing diversity among 3-lactamase genes in aquatic environments // Microbiol. Ecol. 2006. - V. 56. No 3,-P. 418-429.

160. Ionata E., De Blasio P., La Cara F. Microbiological degradation of pentane by immobilized cells of Arthrobacter sp. // Biodégradation. 2005. - V. 16. - No 1. -P. 1-9.

161. Jirasripongpun K. The characterization of oil-degrading microorganisms from lubricating oil contaminated (scale) soil // Letters in Appl. Microbiol. 2002. - V. 35. No 4.-P. 296-300.

162. Kim I., Oriel P.J. Characterization of the Bacillus stearothermophilus BR219 phenol hydroxylase gene // J. Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - No 4. -P. 1252-1256.

163. Liu T., Chapman P.J. Purification and properties of a plasmid encoded 2,4 dichlorophenol hydroxylase//FEBS Lett. 1984.-V. 173.- No 2. - V. 314-318.

164. Liu Y., Zhang J., Zhang Z. Isolation and Characterization of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons-Degrading Sphingomonas sp. Strain ZL5 // Biodegradation. 2004. -V. 15. - No 3. - P. 205 - 212.

165. Marchal R., Penet S., Solano-Serena F., Vandecasteele J.P. Gasoline and Diesel Oil Biodegradation // Oil & Gas Science and Technology. 2003. - V. 58. - No. 4. -P. 441-448.

166. Margesin R., Gander S., Zacke G., Gounot A.M., Schinner F. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of cold-adapted bacteria and yeasts // Extremophiles. 2003 a. - V. 7. No 6. - P. 451-458.

167. Margesin R., Labbé D., Schinner F., Greer C.W., Whyte L.G. Characterization of Hydrocarbon-Dcgrading Microbial Populations in Contaminated and Pristine Alpine Soils // J. Appl. Environ. Microbiol. 2003 b. - Vol. 69. - No. 6. - P. 3085-3092.

168. Margesin R., Schinner F. Bioremediation (Natural Attenuation and Biostimulation) of Dicsel-Oil-Contaminated Soil in an Alpine Glacier Skiing Area // Appl. Environ. Microbiol.-2001.-V. 67.-No 7.-P. 3127-3133.

169. Margesin R., Zimmerbauer A., Schinner F. Soil lipase activity a useful indicator of oil biodegradation // Biotechnol. Techniq. - 1999. - V. 13. - № 3. - P. 859-863.

170. Muratova A., Hubner Th., Tischer S., Turkovskaya O., Moder M., Kuschk P. Plant-rhizosphere-microflora assotiation during phytoremediation of PAH-contaminated soil // Int. J. Phytoremediation. 2003. - V. 5. - No 2. - P. 137-151.

171. Murygina V., Arinbasarov M., Kalyuzhnyi S. Bioremediation of oil polluted aquatories and soils with novel preparation "Rhoder". // Biodégradation. 2000. -Vol. 11. No 6.-P. 385-389.

172. Murygina V.P., Markarova M.Y., Kalyuzhyi S.V. Application of biopreparation "Rhoder" for remediation of oil polluted polar marshy wetlands in Komi Republic // Environ Int. 2005. - V. 31. - No 2. - P. 163 -166.

173. Narro M.L., Cerniglia C.E., Van Baalen C., Gibson D.T. Metabolism of phenanthrene by the marine cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum PR-6 // J. Appl. Environ. Microbiol. 1992.-V. 58.-No 4.-P. 1351-1359.

174. Neujahr H.Y., Gaal, A. Phenol hydroxylase from yeast // Eur. J. Biochem. 1973. -V. 35. - No 2.-P. 386-400.

175. Palittapongarnpim M., Pokethitiyook P., Upatham E.S., Tangbanluekal L. Biodégradation of crude oil by soil microorganisms in the tropic // Biodégradation. -1998.-V. 9.-No 2.-P. 83-90.

176. Pineda-Flores G., Boll-Arguello G., Lira-Galeana C., Mesta-Howard A.M. A microbial consortium isolated from a crude oil sample that uses asphaltenes as a carbon and energy source // Biodégradation. 2004. - Vol. 15. - No 3. - P. 145-551.

177. Piskonen R., Nyyssonen M., Rajamaki T., Itavaara M. Monitoring of accelerated naphthalene-biodegradation in a bioaugmented soil slurry // Biodégradation. 2005. -Vol. 16.-No. 2.-P. 127-134.

178. Qiagen Genomic DNA Handbook. Qiagen. - 08/2001.

179. Raghukumar C., Vipparty V., David J.J., Chandramohan D. Degradation of crude oil by cyanobacteria // Appl. Microbiol. Bioteehnol. 2001. - V. 57. - No 3. - P. 433-436.

180. Rahman K.S, Thahira-Rahman J., Lakshmanaperumalsamy P., Banat I.M. Towards efficient crude oil degradation by a mixed bacterial consortium. // Bioresour. Technol. 2002 a. - Vol. 85. - No 3. - P. 257-261.

181. Rahman K.S., Rahman T., Lakshmanaperumalsamy P., Banat I. M. Occurrence of crude oil degrading bacteria in gasoline and diesel station soils // J. Basic Microbiol. 2002 b. - Vol. 42. - No 4. - P. 284-291.

182. Ron E., Rosenberg E. Natural roles of biosurfactants // Environ. Microbiol. -2001. V. 3. -No 4. - P. 229-236.

183. Rosenberg E., Ron E. Z. Surface active polymers from the genus Acinetobacter. In Biopolymers from renewable resources. Ed. Kaplan D.L. 1998. - Springer-Verlag KG, Berlin, Germany. - P. 281-289.

184. Rosenberg E., Ron E.Z. High- and low-molecular-mass microbial surfactants // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. -V. 52. - No 2. - P. 154-162.

185. Salt D.E., Smith R.D., Raskin I. Phytoremediation // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant mol. Biol. 1998. - Vol 49. - No 1. - P. 643-668.

186. Sanchez O., Diestra E., Esteve I., Mas J. Molecular Characterization of an Oil-Degrading Cyanobacterial Consortium // Microbial Ecol. 2005. - V. 50. - No 4. -P. 580-588.

187. Sanchez O., Ferrera I., Vigues N., de Oteyza T.G., Grimait J, Mas J. Role of cyanobacteria in oil biodégradation by microbial mats // Int. Biodeterioration & Biodégradation. 2006. - V. 58.-No 3-4. - P. 186-195.

188. Sasser M. Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fatty acids. MIDI Technical Note 101.-2001.

189. Schwartz E., Scow K.M. Repeated inoculation as a strategy for the remediation of low concentrations of phenanthrene in soil // Biodégradation. 2001. - V. 12. - No 3.-P. 201-207.

190. Sharma S.L., Pant A. Biodégradation and conversion of alkanes and crude oil by a marine Rhodococcus II Biodégradation Issue. 2000. - V. 11.- No. 5. - P. 289 -294.

191. Smits T.H.M., Balada S.B., Witholt B., van Beilen J.B. Functional analysis of alkane hydroxylases from gram-negative and gram-positive bacteria // J. Bacterid. -2002.-V. 184.-No. 6.-P. 1733-1742.

192. Tang Y.W., Ellis N.M., Hopkins M.K., Dodge D.E., Persing D.H. Comparison of Phenotypic and Genotypic Techniques of Identification of Unusual Aerobic Pathogenic Gram Negative Bacilli // J. Clinical Microbiol. 1998. - V. 36. - No 12. -P. 3674-3679.

193. Todd S.J., Cain R.B., Schmidt S. Biotransformation of naphthalene and diaryl ethers by green microalgae II Biodégradation.- 2002. V. 13. - No 4. - P. 229-238.

194. Toledo F.L., Calvo C., Rodelas B., Gonzalez-Lopez J. Selection and identication of bacteria isolated from waste crude oil with polycyclic aromatic hydrocarbons removal capacities II Syst. and Appl. Microbiol. 2006 - Vol. 29. - No 3. - P. 244252.

195. Trapp S. Karlson U. Aspects of phytoremediation of organic pollutants // J. Soils Sediment. 2001,-V. l.-No 1.-P. 37-43.

196. Van Beilen J.B., Li Z., Duetz W.A., Smits T.H.M., Witholt B. Diversity of Alkane Hydroxylase Systems in the Environment // Oil & Gas Science and Technology. -Rev. IFP. 2003. - Vol. 58. - No. 4. - P. 427-440.

197. Vance D. B. Phytoremediation: Enhancing natiral attenuation processes // Nat. Environ. J. 1996. - V. 6. - No 1. - P. 30-31.

198. Walker J.D., Colwell R.R., Petrakis L. Degradation of petroleum by an alga, Prototheca zopfii // Appl. Microbiol. 1975. -V. 30. No 1. - P. 79-81.

199. Whyte L. G., Hawari J., Zhou E., Bourbonniere L., Inniss W., Greer C.W. Biodégradation of variable-chain-length alkanes at low temperatures by apsychrotrophic Rhodococcus sp. II Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - No. 7.-P. 2578-2584.

200. Yadav J.S., Loper J.C. Multiple P450alk (cytochrome P450 alkane hydroxylase) genes from the halotolerant yeast Debaryomyces hansenii II GENE. 1999. - V. -226.-No 2.-P. 139-146.

201. Yemashova N.A., Murygina V.P., Zhukov D.V., Zakharyantz A. A., Gladchenko M.A., Appanna V., Kalyuzhnyi S.V. Biodeterioration of crude oil and oil derived products: a review Rev Environmental Science and Biotechnology. 2007. - 6. -No 4.-P. 315-337.

202. Zinjarde S.S., Pant A., Emulsifier from a tropical marine yeast, Yarrowia lipolytica NCIM 3589 // J. Basic Microbiol. 2002 a. - V. 42. - No 1. - P. 67-73.

203. Zinjarde S.S., Pant A.A. Hydrocarbon degraders from tropical marine environments // Marine Pollution Bulletin. 2002 b. - V. 44. - No 2. - P. 118-121.

204. Zinjarde S.S., Sativel C., Lachke A.H., Pant A. Isolation of an emulsifier from Yarrowia lipolytica NCIM 3589 using a modofoed mini isoekectric focusing unit // Lett. Appl. Microbiol. 1997.-V. 24. - No 2. - P. 117-121.

205. Арене В., Гридин О., Гридин А. Рекламные иллюзии и реальные перспективы применения нефтяных сорбентов Электронный ресурс. // журн. «Нефтегазовая вертикаль». Доступ : http://w\vw.ngv.ru/article.aspx?articleID=23726

206. ЗАО «Маркетинг-бюро» Электронный ресурс. Доступ: http://sorbent.m-Ь.ги/

207. Лапина Г.П., Чернавская Н.М., Литвиновский М.Е., Сазанова С.В. Влияние нефти на пигментный состав сосны обыкновенной Pinus sylvestris

208. Электронный ресурс. // науч. журн. «Исследовано в России». С. 569-580. — Доступ: http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2007/053.pdf

209. Молотков И.В., Касьяненко В.А. Фиторемедиация Электронный ресурс. // НефтьГазПромышленность. 2005. - № 1 (13). - Доступ: http://www.ccr.ru/?id=4722.

210. НГЖ «Окпур» Электронный ресурс. Доступ: http://www. okpur.ru/razlivzhidk.php235. «Эко-Лайф» Электронный ресурс. — Доступ: http://www.ecolifc-sorbent.com/

211. Watanabe К., Kodama Yu., Kaku N. Diversity and abundance of bacteria in an anderground oil-storage cavity Электронный ресурс. II BMC Microbiol. — 2002. — V. 2. No 23. - Доступ: http://www.biomedcentral.eom/1471-2180/2/23

Информация о работе

Емельянова, Елена Константиновна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Микроорганизмы природных биоценозов для биоремедиации почв и водных объектов Сибири, загрязненных нефтепродуктами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы