Оценка опасности и способы ремедиации нефтешламов, содержащих природные радионуклиды

Гумерова, Раушания Ханифовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оценка опасности и способы ремедиации нефтешламов, содержащих природные радионуклиды
ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Оценка опасности и способы ремедиации нефтешламов, содержащих природные радионуклиды"

На правах рукописи

ГУМЕРОВА РАУШАНИЯ ХАНИФОВНА

ОЦЕНКА ОПАСНОСТИ И СПОСОБЫ РЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕШЛАМОВ, СОДЕРЖАЩИХ ПРИРОДНЫЕ РАДИОНУ1СЛИДЫ

03.02.08 - экология (биологические науки)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 5 СЕН 2013

005532783

КАЗАНЬ-2013

005532783

Рабата выполнена на кафедре прикладной экологии Института экологии и географии Казанского (Приволжского) федерального университета.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор кафедры прикладной экологии ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Селввановская Светлана Юрьевна

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, зав.лаборатории «Бионанотехнология» Казанского национального исследовательского технологического университета Зарипова Сапин Кашафовна

доктор биологических на}*,

профессор, зав. лаборатории агроэкологии и

микробиологии ГНУ Татарский НИИАХП

Россельхозакадемии

Дегтярева Ирина Александровна

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет», г. Уфа

Защита диссертации состоится «19» сенгября 2013 г. в 1700 часов на заседании Диссертационного Совета ДМ 212.081. при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, ауд 211.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им Н.И. Лобачевского ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет». Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте Казанского (Приволжского) федерального университета http://wTAy.kpfu.ru или на сайте ВАК Министерства образования и науки РФ http://www.vak.ed.pov.ru.

Автореферат разослан «16» августа 2013 г. Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат биологических наук, доцент / ' Р.М.Зелеев

Актуальность работы. Процесс добычи и переработки нефти сопровождается образованием отходов, количество которых может достигать 0,2-0,5% от полученной товарной нефти (Lazar et al., 1999; Morelli et al., 2005; Ouyang et al., 2005; Roldan-Carrillo et al., 2011; Tahhan et al., 2011; Wang et al., 2012). Эти отходы содержав помимо большого количества тяжёлой нефти и природные радиоактивные элементы естественных радиоактивных семейств U238 и Th23!, а также К40, которые ко-осзэдаются из водо-нзфтяной эмульсии в виде баритов (El Afifi, Awwad, 2005; Bakr et al., 2010). Нефтяные компоненты представлены смесью гидрофобных компонентов, многие из которых способны вызывать токсичные и мутагенные эффекты (Солнцева, 1988; Пиховский, 1988; Кураков с соавт., 2006; Reddy et al., 2011; Wang et al., 2012).

В настоящее время остаётся наиболее распространенной практика депонирования нефтееодержащих отходов в специальных накопителях или размещение на почве. Однако такое размещение приводит к миграции компонентов отходов с дождевыми осадками в почву и поступлению загрязняющих ¡веществ в воду. Ситуация осложняется тем, что отходы, содержащие нефтепродукты и радиоактивные элементы, являются токсичными для окружающей среды. В литературе представлены данные о токсичности индивидуальных углеводородов, их смесей, почв и воды, загрязнённой нефтью (Saterbalc et al., 2000; Van Gestel et al., 2003; Sabate et al., 2004; Molina-Barahcma et al., 2005; Plaza et al., 2.005; Xu et al., 2010; Frutos et al., 2012; Liado et al., 2012). Информация о токсичности отходов, содержащих и нефтепродукты, и радиоактивные элементы ограничена. В то же время она является крайне важной, поскольку многие соединения в отходах в процессе хранения трансформируются в метаболиты, токсичность и устойчивость которых неизвестна (Киреева с соавт., 2003; Кураков с соавт., 2006; А1-Mutairi et al., 2008). Отсутствует также информация о миграции по почвенному профилю углеводородов и радиоактивных элементов и их влиянию на почвенные сообщества.

Сложность обращения с подобными отходами определяется многообразием их видов и состава, высокой опасностью. Физико-химические методы обработки нефтееодержащих отходов являются дорогостоящими, энергоемкими и сопряжены с образованием вторичных отходов, захоронение которых представляет дополнительную проблему (Ouyang et al., 2005; Das, Mukherjee, 2007; Biswal et al., 2009; Wang et al., 2012). В связи с этим активно развиваются направления, использующие биологические методы.

В литературе широко представлены данные о биоремедиации нефтезагрязненных почв (Balba et al., 1998; Bento et al., 2005; Кураков с соавт, 2006; Wang et al., 2012; Liado et al., 2013). Одиако данные о деструкции углеводородов в отходах немногочисленны, при этом в основном обсуждается возможность их деструкции в жидких средах (Mana Capelli et al., 2001; Biswal et al., 2011; Reddy et al., 2011). Публикации, посвященные деструкции микроорганизмами нефтяных компонентов в отаодах, содержащих природные радионуклиды, практически отсутствуют.

Цель настоящей работы - оценка воздействия компонентов отходов нефтедобывающего комплекса на почвенные системы и разработка способа их биоремедиации. Задачи исследования.

1. Охарактеризовать радиоактивные отходы нефтедобывающего комплекса по уровню радиоактивности, содержанию нефтяных компонентов и их фракционному составу.

2. Оценить токсичность компонентов отходов с использованием элюатных (тесты на бактериях Bacillus pumilus, на инфузориях Paramecium caudatum, на водорослях Scenedesmus quadricauda, на низших ракообразных Daphnia magna, на пресноводных рачках Thamnocephalus platyurus, на коловратках Brachionus calyciflorus, на высших растениях Raphanus sativus) и контактных (тесты на растениях Raphanus sativus, на бактериях Bacillus pumilus) тестов.

3. Осуществить лабораторное моделирование процесса миграции компонентов нефтесодержащих отходов по почвенному профилю. Определить миграционную способность нефтяных компонентов и радиоактивных элементов. Оценить изменение состояния микробного сообщества почвенных колонок на основе анализа общей микробной биомассы, ферментативной активности, численности гетеротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов в условиях воздействия.

4. Методами дисперсионного и кластерного анализов установить доминирующий фактор при воздействии на микробные сообщества отходов, содержащих нефтепродукты и радиоактивные элементы.

5. Осуществить лабораторное моделирование процесса ремедиации отходов нефтедобывающего комплекса с использованием приёмов биостимуляции и биоаугментации. Оценить изменение содержания радиоактивных элементов, нефтепродуктов, фракционного состава в процессе ремедиации. Выявить закономерности изменения функционирования микробных сообществ на основании анализа микробной биомассы, респираторной и ферментативных активностей, численности гетеротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов. Определить изменение фитотоксичности в промессе ремедиации.

6. Методами молекулярной биологии выявить изменения в структуре микробных сообществ при ремедиации отхода.

Положения, выносимые на защиту.

Отхода, отобранные в товарном парке, содержат нефтепродукты, в составе которых доминируют насыщенные и ароматические углеводороды; среди радиоактивных элементов основным является радий.

тест с D. magna (30.1) > тест с В. calyciflorus (13.0) > тест с P. caudatum (12.3) > тест с S. quadricauda (7.6) > тест с R. sativus (7.5) > тест с Т. platyurus (6.2) > тест с В. pumilus (4.2) > тест «Эколюм» (1.0).

Размещение радиоактивных нефтесодержащих отходов на поверхности почвы приводит к миграции нефтяных компонентов и радионуклидов: достоверный негагивный эффект на микробное сообщество оказывают нефтепродукты в верхнем 20см слое почвы.

Оптимальным способом ремедиации отхода является его обработка с компостом.

Научная новизна. Впервые с использованием батареи тестов проанализирована токсичность радиоактивных отходов, образующихся в процессе добычи нефти, и установлено, что основной вклад в её формирование вносят нефтяные углеводороды, которые оказывают наибольший эффект в отношении простейших и водорослей и не влияют на активность бактерий. Показано, что контактные тесты на основе R. sativus и В. pumilus более чувствительны к компонентам отходов по сравнению с элюатными тестами на основе этих организмов. Выявлено, что отход, подвергнутый термической обработке, более токсичен по сравнению с исходным.

Впервые показано, что миграция радиоактивных элементов из отходов по почвенному профилю зависит от уровня содержания нефтепродуктов в отходе. Не выявлено негативного влияния радиоактивных элементов на функционирование микробного сообщества почв. Установлено, что вымывающиеся в почву нефтепродукты вызывают снижение уровня микробной биомассы почвы, наиболее выраженное в верхнем (0-20см) почвенном горизонте, увеличение респираторной активности и численности углеводородокисляющих микроорганизмов.

Проведено сравнение эффективности биодеградации нефтяного комлонета отходов при применении различных методов биоремедиации - лаццфарминг, биостимуляция, биоаугментации и их сочетаний. Установлено, что методы биоаугментации эффективны при высоком содержании нефтепродуктов. Способом, обеспечивающим наиболее эффективное снижение нефтепродуктов, является обработка отхода компостом и специально селекционированными микроорганизмами.

Впервые методами молекулярной биологии показано, что при обработке почвы отходом происходит изменение структуры сообщества в сторону- доминирования устойчивых к воздействию нефтяных компонентов видов микроорганизмов, идентифицированных как Dyella sp„ Sinobacter flavus и Parvibaculum lavamentivorans.

Практическая значимость работы. Полученные в диссертационной работе результаты являются основой способа биоремедиации отходов нефтедобывающего комплекса. Полученные результаты могут быть использованы при разработке мер по минимизации негативного влияния нефтяных отходов на окружающую среду и совершенствованию отдельных аспектов экологического нормирования хозяйственной деятельности человека.

Результаты исследований используются при проведении практических работ по курсам «Управление в обращении с отходами», «Нормирование и снижение

загрязнения окружающей среды» на кафедре прикладной экологии Казанского (Приволжского) федерального университета.

Апробация работы.

Материалы работы доложены на I городской студенческой конференции «Междисциплинарные исследования в области естественных наук» (Казань, 2008), 13 Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2008), Всероссийской научной конференции с международным участием «Окружающая среда и устойчивое развитие регионов: новые методы и технологии исследований» (Казань, 2009), II Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы науки и техники» (Уфа, 2010), II международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Прогрессивные технологии и перспективы развития» (Тамбов, 2010), Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодёжи «Экологические проблемы нефтедобычи» (Уфа, 2010), Proceedings of the International Symposíum "Euro-ECO - Hanover 2011": Environmental, Engineering (Hanover, Germany, 2011), Г! Международной научно-практической конференции «Современные проблемы безопасности жизнедеятельности: теория и практика» (Казань, 2012), 4Л International Conferenee on Environmental Management, Engeneering, Planninig and Economice (CEMERE) and SECOTOX Conferenee (Mykonos island, Greece, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 статьи в журналах из Перечня ВАК.

Личный вклад автора в работу состоит в выполнении экспериментальной части диссертации, обсуждении результатов и формулировании выводов на их основе. Соавторами публикаций являются научный руководитель д.б.н., проф. Селивановская С.Ю., к-б.н., доцент, Галицкая П.Ю., к.ф-м.н., доцент Бадрутдинов О.Р., участвовавшие в обсуждении результатов. В создании программы для математической обработки результатов принимал участие к.ф-м.н, д.б.н., проф. Савельев А.А.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах; состоит кз обзора, литературы, описания материалов и методов исследований, раздела собственных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 39 рисунков, 6 таблиц. Список литературы содержит 75 отечественных и 293 зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1 Обзор литературы

В обзоре литературы приведены характеристики отходов, образующихся при добыче и: производстве нефти: содержание и фракционный состав нефтепродуктов, активная концентрация природных радиоактивных элементов (РЭ) 226Ra, 232Th и 40К. Представлены данные о токсичности отдельных компонентов нефти, почв, загрязненных нефтью, нефтесодержащих отходов и природных РЭ.

Основная часть обзора литературы посвящена влиянию .загрязнения почв уг леводородами на характеристики почвенного микробного сообщества: численность гетеротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ), микробную биомассу (Смш,), респираторную и ферментативную активность почв, структуру микробного сообщества. Произведён анализ публикаций, посвященных биодеградации нефтяных углеводородов (УВ) и современным способам рекультивации нефтезагрязнённых почв и нефтесодержащих отходов. Особое втмание уделено биологическим способам ремедиации: биостимуляции и биоаугментации.

Глава 2 Материалы и методы исследования

Объекты исследования, схема эксперимента. Объемами исследования являлись 16 отходов, отобранных в различных резервуарах Тихоновского товарное парка (Альметьевск, Республика Татарстан): М, С, Н, Р, Р1, Р2, И1, И2, ИЗ, Н1, Н2, НЗ, Н4, НТ1, НТ2 и НТЗ. Отход Р1 был получен путем удаления нефтяных компонентов из отхода Р2.

Для моделирования процессов миграции компонентов отходов по почвенному профилю были отобраны 6 ненарушенных почвенных монолитов высотой 60 см. На поверхность колонок были помещены отход Р2 (колонки Н) и отход Р1 (колонки Р). Количество отходов было уравнено по содержанию РЭ. В качестве контрольных использовали колонки без внесения отходов (колонки К). Колонки орошали в течение месяца водой, имитируя дождевые осадки. Через месяц отходы удаляли с поверхности колонки, разбирали почву по горизонтам 0-20, 20-40 и 40-60 см. В образцах определяли содержание нефтепродуктов, РЭ, рН, электропроводность, показатели микробного сообщества (С«,«, респираторную, дегидрогеназную и целлюлазнуго активности, численность гетеротрофных бактерий и УОМ).

Для определения способа ремедиации использовали отход НТ1. Для этого отход вносили в почву в соотношении 1:4 (образец ОП); отход вносили в почву и добавляли компост в количестве 5% по массе (образец ОГК), в отход вносили компост в количестве 5% по массе (образец ОК); в отход вносили почву в соотношении 1:4, добавляли компост в количестве 5% по массе и вносили смесь двух штаммов микроорганизмов-деструеторов в количестве 250 мл на 1 кг отхода (образец ОПКМ); в отход вносили компост в количестве 5% и смесь двух штаммов микроорганизмов-деструкторов в количестве 250 мл на 1 кг отхода (образец ОКМ). В каждой из смесей доводили соотношение С:Ы мочевиной до 10:1. В качестве контроля использовали отход без внесения добавок (образец О) и почва без внесения добавок (образец П). Отбор проб производили на 0, 7, 14, 21, 35, 49, 80 и 123 сутки инкубирования и измеряли содержание УВ, активность РЭ, Сии1, респираторную активность, численность гетеротрофных бактерий, выращенных на питательной среде МПА, УОМ. Фитотоксичность смесей определяли на 0, 14, 35, 80 и 123 сутки инкубирования.

Аналетщсские методы. Определение содержания нефтепродуктов в отходах, почве и водных экстрактах проводили методом ИК-спекгрометряи с предварительной

экстракцией четыреххлористым углеродом (ПНД Ф 16.1:2.2.22-98, 1998; 1ТНД Ф 14.1:2:4.5-95, 2004). Определение фракционного состава нефти проводили гравиметрическим методом после экстракции нефтяных компонентов из проб малополярными растворителями в аппарате Сокслета и последующем разделении фракций методом колоночной хроматографии согласно Mishra et al., 2001. Определение общего азота в образцах отходов и почвы проводили по методу Къельдаля (ISO 11261:1995, 1995). Определение органического вещества проводили по методу Тюрина в модификации ЦИНАО (ГОСТ 26213-91, 1992). Значение рН определяли потенциометрическим методом в водном экстракте (ГОСТ 26423-85, 1985). Электрическую проводимость почвы определяли потенциометрическим методом в водном экстракте с помощью кондуктометра (ГОСТ 26423-85, 1985). Влажность определяли гравиметрическим методом (ГОСТ 5180-84, 2008). Измерение активности РЭ осуществляли с использованием сцинтилляционного гамма-спектрометра с программным обеспечением «Прогресс» (Методика измерения..., 2003).

Биотестирование отходов. Биотестирование водных экстрактов отходов проводили с использованием низших ракообразных D. magna (ПНД Ф 14.1:2:4.12-06, 2006), инфузорий P. caudatum (ФР. 1.39.2003.00923, 2003), водорослей S. quadricauda (ПНДФ 14.1:2:3:4.10-04, 2004), пресноводных рачков Т. platyurus (Tamnotoxkit F, 2011), коловраток В. calyciflorus (Rotoxkit F, 2011), коммерческого теста «Эколюм» (ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.11-04, 2004), высших растений R. sativus L (редис сорт «Красный круглый с белым кончиком») (ISO 11269-1, 1993), бактерий В. pumilus (Ronnpagel et al., 1997).

Контактное биотестирование осуществляли с использованием растений R. sativus L (редис сорг «Красный круглый с белым кончиком») (ISO 11269-2, 1995) и бактерий В. pumilus (Ronnpagel et al., 1997). Класс опасности определяли в соответствии с («Критерии отнесения...», 2001).

Методы оценки состояния почвенного микробного сообщества. Респираторную активность почвенного микробного сообщества оценивали путем титриметричеекого определения количества выделившегося С02 после поглощения щелочью (Microbiological..., 2006). Сиик вычисляли на основе субстрат-индуцированной респираторной активности (Microbiological..., 2006). Уреазную активность оценивали фотометрически по количеству ионов аммония, образующихся в результате восстановления мочевины (Хазиев, 2005). Дегидрогеназную активность оценивали колориметрически по количеству восстановленного ресазурина (Ronnpagel et al., 1997). Численность гетеротрофных микроорганизмов определяли путем высева на МПА, УОМ определяли методом предельных разведений на жидких средах с нефтью в качестве единственного источника углерода (Руководство ..., 1983).

Видовую идентификацию выделенных микроорганизмов-деструкторов осуществляли методами молекулярной биологии на основе анализа последовательности 16S рДНК. Обработку полученных хроматограмм проводили в программе Mega 8.02. Для идентификации нуклеотидных последовательностей использовали базы данных

ww.ncbi.nlm.nih.gov/blast. Для анализа структуры микробного сообщества использовали метод анализа конформационного полиморфизма одноиитевой ДНК.

Статистические методы анализа. Измерение всех параметров проводили не менее чем в трёхкратной повторности. В работе представлены значения средних и стандартных ошибок. Для объединения массивов данных в группы применяли кластерный анализ (Айвазян с соавт., 1989). Кластеризацию данных осуществляли методом Варда (Дюран с соавт., 1977). Для определения статистической значимости факторов миграции компонентов отходов применяли дисперсионный анализ (Шеффе 1980).

Глава 3. Результаты и обсуждение

1. Характеристика отходов.

На первом этане 16 отходов нефтедобывающего производства были охарактеризованы по содержанию нефтяных компонентов, природных РЭ, определён их фракционный состав, а также уровень влажности, кислотности и электропроводности. Установлено, что содержание нефтяных компонентов в отходах варьировало в широких пределах от 30,5 до 880 г/кг (табл. 1).

Таблица 1.

Oixo д Содержание УВ, г/кг Содержание, Бк/кг

Ra Th -"к

м 35,0 ±7,0 11930 ±2624 9399,0 ± 1879,0

с 59,0 ± 11.8 620,0 ± 136,0 347,0 ± 69,4 _

н 153,1 ± 30,6 468,4 ± 103,1 247,2 ±49,4 57,2 ± 8,6

Р 90,4 ± 18,1 1699,8 ^ 373,9 296,2±59,2 255,0±38,3

ш 880±176 70,7±15,5 20,2±4,1 28,3±4,3

ш 95,4±19,1 1809,8±398,1 276,2±55,2 255,0±38,3

из 720±144 2739,0±602,6 916,0±183,2 271,1±40,6

PI 4,6± 0,9 7861,7±1729,6 5085,9±1017,2 2277,9±341,7

Р2 560 ± 112 4402,5±968,5 2848,1±569,6 1275,6±191,3

Н1 123,3 ± 24,6 34,0±7,5 30,0±6,0 59,0±8,8

Н2 57,4 ± 11,5 282,0±62,0 146,0±29,2 51,0±7,6

НЗ 59±11,8 246,0±54,1 107,0±21,4 60,0±9,0

Н4 30,5±6,1 430,0±94,6 197,0±39,4 139,0±20,8

НТ1 640±128 859,0±199,0 385,1±77,0 272,0±40,8

НТ2 46,5±9,3 1479,0±325,4 123,6±24,7 59,5±8,9

IIT3 126,0±25,2 317,6±69,8 143,1±28,6 82,4±12,4

^«шдиоыныи состав отходов отличался для отходов с высоким и низким содержанием нефтяных компонентов. Для отходов с высоким содержанием нефти: большая доля нефтяных компонентов приходилась па фракции ароматических УВ и асфальтенов (32,3-38,5% и 26,2-28,3% соответственно), в меньшем количестве присугствовали алифатические УВ и смолы. В отходах с низким содержанием нефти насыщенные УВ составляли 35,4-36,3%, тогда как содержание остальных фракций было примерно одинаково и варьировало на уровне 19,3-23,8%. РЭ (226Яа, 232ТЬ и 40К) включаются в отходы с водой, проходящей через породы при добыче нефти и со-

осаждаются в основном в виде комплексов радиобарита. Установлено, что доминирующим элементом в отходах являлся 226Ка, активная концентрация которого составляла в отходах 34-11930 Бк/'кг (табл. 1). В меньших количествах присутствовали 232ТЬ (20,2 - 9399,0 Бк/хг) и 10К (28,3 - 1275,6 Бк/кг). Выявлено, что влажность отходов варьировала в интервале 7,3-45,3%, рН-6,81-11,9, электропроводность - 2,89 - 5,75 мСм/см.

2. Токсичность отходов нефтедобывающего комплекса, установленная методами элюатного и контактного биотестирования Тестированию подвергали 6 отходов (Р], Р2, Н1, Н2, НЗ и Н4). Четыре отхода бьшо отобрано при очистке нефтепромыслового оборудовашм. Отход Н4 отбирали в промышленной установке, на которой термическим способом обрабатывали отход Н1. Отход Р1 был получен в лабораторных условиях путём многократного промывания отхода Р2 бензином и четыреххлорисгым углеродом.

Из отходов были получены водные экстракты и в них определено содержание нефтепродуктов, РЭ и рН (табл. 2). Анализ РЭ показал, что содержание всех изучаемых радионуклидов оюеалось ниже уровня обнаружения.

Таблица 2.

Содержание нефтепродуктов и радиоактивных элементов в водном экстракте отходов

Образец Нефтепродукты, мг/л "bRa ЖТЬ 4UK рН

Р1 4,4+0,9 <7 <5 <30 7,15

Р2 35,6+7,9 <7 <5 <30 7,24

Ш 9,0+2.3 <7 <5 <30 6,85

Н2 12,8+4,2 <7 <5 <30 6,88

НЗ 11,1+3,1 <7 <5 <30 6,84

Н4 9,1+2,4 <7 <5 <30 11,94

Для оценки экологической опасности отходов элюатным методом использовали набор из 7 биотестов. Максимальный уровень токсичности выявлен в тестах с низшими ракообразными D. magna (рис. 1).

Исходный водный экстракт всех образцов за исключением образца НЗ вызывал 100% гибель тест-обьектов. Для достижения 10% токсичности необходимо было разбавление экстрактов образцов в 20,5-44 раза. Одинаковую чувствительность по отношению к водорастворимым компонентам отходов продемонстрировали инфузории P. caudatum и коловратки В. calyciftorus. В обоих случаях самым опасным оказался отход Н4 (Крю 16,0±3,2 и 18,0±3,6 соответственно). Ни один из исходных экстрактов отходов Ее вызвал 100% изменения тестовой функции водорослей S. quadricauda, пресноводных рачков Т. platyurus и растений R. sativus.

На основании средних значений Крю, рассчитанных для всех отходов использованные тесты могут быть расположены в следующий ряд: тест с D. magna (Крю=30.1) > тест с В. calyciflorus (Крю=13.0) > тест с P. caudatum (Кр10=12.3) > тест с S. quadricauda {Крю-7.6) > тест с R. sativus (Крю=7.5) > тест с Т. platyurus (Крю--6.2) > тест с В. pumilus (Kp]0=4.2) > тест Эколюм (Кр№=1.0).

D. nragna

Рисунок 1 Токсичность отходов в элюатном тесте с использованием D. magna

Для каждого отхода были рассчитаны средние значения Кр10 по результатам тестирования всеми тестами (рис. 2). Установлено, что токсичность отхода Р1 составила 87% от токсичности отхода Р2. Эти результаты прогнозируемы, поскольку отход Р1 получен путем удаления нефтяного компонента из отхода Р2 и в водном экстракте отхода Р1 содержание нефтепродуктов ниже. При анализе токсичности отходов Н1 и Н4 получены обратные результаты: токсичность отхода Н4, в котором УВ были удалены термическим методом оказалась в 1,5 раз выше по сравнению с необработанным отходом Н1.

Скорее всего такой эффект связав с тем, что при термической обработке существенно изменяется кислотность отхода. Так, рН водного экстракта отхода Н4 составляет 11,9, Тс'гда как в случае остальных отходов значения рН варьируются в интервате 6,8-7,2. Таким образом, скорее всего, такой способ обработки отхода, несмотря на то, что он снижает содержание У В, приводит к увеличению негативного воздействия отхода на организмы окружающей среды. В целом не обнаружено прямой корреляции между содержанием нефтепродуктов в экстракте отходов и уровнем их токсичности. Скорее всего, это связано с тем, что в водный экстракт могут переходить и метаболиты, образующиеся в процессе хранения отходов, которые также влияют на уровень токсичности. Поскольку в водный экстракт переходит незначительное количество РЭ (ниже предела обнаружения), вероятно, эти элементы не оказывают влияния на уровень токси чности отходов.

Процедура контактного биотестирования позволяет проанализировать исходные образцы без получения водного экстракта В качестве тест-объектов были использованы бактериальный тест на основе В. ритИш и растительный тест на основе А хаН\>и$ £ (рис. 3). В тесте с растениями наивысшую токсичность продемонстрировал образец Р1 (Кр10=36), а образцы Н1, Н2 и Ю не оказывали негативного эффекта на растения. В случае бактериального теста максимальна! токсичность установлена для образца Н4 (Кр10=21).

Н-4

| шт.

Н-1 Н-2 образец

Рисунок 2 Средине значения токсичности отходов, рассчитанные с учетом всех результатов тестирования

При сравнении чувствительности элюатного и контактного биотестирования выявлено,

что чувствительность контактного бактериального теста оказалась выше по сравнению с таковой элюатного. Так, для пяти образцов Кр10, установленная для контактного теста, была существенно выше. Похожая зависимость выявлена для теста с R. sativus L.

В целом, все

проанализированные отходы

представляют опасность для окружающей среды и на основании их тестирования с D. magna, P. caudatum и S. quadricauda могут быть отнесены к 3 классу опасности.

3. Миграция компонентов отходов по почвенному профилю и их Рисунок 3 Токсичность отходов в контактном воздействие на качество почвы и

тесте с использованием Я sativus (А) и В. pumilus состояние почвенного биоценоза

(Б). Характеристика___почвенных

профилей. В эксперименте использовали отходы Р1 и Р2. Выявлено, что размещение на поверхности колонок отхода Р2 привело к увеличению содержания б почве нефтепродуктов (рис 4а). При этом, в среднем, миграция нефтяных компонентов из отхода Р2 в верхний слой почвы составила 4%. В образцах Н(0-20) их содержание оказалось достоверно выше такового содержания в образцах К(0-20) в 3,5 раза. Определение фракционного состава нефтепродуктов верхнего горизонта почвы колонок Н выявило примерно одинаковое соотношение фракций: 33,33% ароматических УВ, по 25% смол и асфальте нов, 16,67% предельных УВ. В колонке Р1 не обнаружено увеличение содержания нефтепродуктов. Размещение отхода Р1 привело к увеличению в почве РЭ (рис 46). Содержание 226Ra ори внесении отхода Р1 в верхнем слое почвы Р(0-20) оказалось выше в 3,5 раза по сравнению с образцами К(0-20). Схожие результаты получены и по 2,2Th: превышение над контрольным вариантом составило 1,6 раз. Не обнаружено достоверных различий с контролем в содержании 226Ra, 2,:'Th в образцах Р(20-40) и Р(40-60). Ни в одном из слоев не выявлено увеличения содержания 40К. Несмотря на то, что при размещении отходов на почве было уравнено количество РЭ, во всех почвенных образцах, отобранных в колонках Н, не было обнаружено достоверных различий в содержании РЭ с контрольным вариантом. Поскольку РЭ в основном концентрируются в твердой матрице отходов (Gazinsu et ai., 2005), скорее всего, наличие органического вещества в отходе Р2 обусловливает их меньшую миграцию в почву.

i 2.5 z

S 1 i 2 2

« Vi ч „о

0 1

1 *

i" 0.5 с

S о

,-Si

к к к

(о- {20- (4020) 40) 60)

(0- (20- (4020) 40) 60)

образцы

H H H (0- (20- (4020) 40) 60)

по сравнению с контрольным вариантом, не оказывают негативного влияния на микробную биомассу.

Это подтверждается тем, что рассчитанная на основании Terrestrial model R&D i 28 (Coppelstorie et al., 2001, Jones et al. 2003) доза для доминирующего элемента 226Ra составила 0,7 Гр, тогда как согласно данным: литературы, эффект на

микроорганизмы обнаруживается при дозе 40-50 Гр (Yardin et ai. 2000; Jones; et al. 2004; Buchan et al„ 2012). Уровень респираторной активности в колонках К не зависел от глубины отбора проб и варьировал в интервале 1-1,2 мгСОг-С/кг час (рис.6). Обнаружено увеличение респираторной активности в образце H (0-2.0) по сравнению с респираторной активностью

образцов К(0-20) в 2,4 раза. В случае остальных проб достоверных различий не установлено. Уровень респирации в образцах колонок Р достоверно не отличался от образцов колонок К и не зависел от глубины отбора. Увеличение респираторной активности микробного сообщества почвы, загрязнённой нефтью связывают с использованием микроорганизмами углеводородов в качестве источника углеродного питания (Marin et al.. 2005, Labud et al., 2007, Lee et al., 2008). Однако, более вероятным является предположение о преодолении стресса микробным сообществом, что приводит к увеличению метаболической активности микроорганизмов (Chander et al., 1991; Franco et al., 2004).

Результат анализа целлюлазной bjktmbhocth во всех образцах, отобранных по почвенному профилю, показал, что её уровень был максимальным в верхнем слое (020см) и достоверно снижался по почвенному профилю. Не выявлено каких-либо закономерностей при анализе дегидрогепазной активности почв: абсолютные значения активности достоверно не различались как в разных колонках, так и. в образцах, отобранных в разных почвенных профилях. Миграции компонентов отходов в почву в основном не оказала достоверного влияния на общую численность бактерий.

Рисунок 5 Респираторная активность в образцах почвенных колонок

¡.30

Ï25

§20

|15

оЮ о;

1 5 ? о

и к к (с- (20- (4020) 40) 80)

Р Р Р (о- (20 (4020) 40) 60) образи^

H H H

(cl- (20- (4020) 40) 60)

Рисунок 6 Микробная биомасса в образцах почвенных колонок

В результате дисперсионного анализа с учётом вышеуказанных посылок установлено, что основной вклад (70%) в дисперсию показателя нефтепродуктов вносит фактор «наличие и тип отхода». Доминирование этого фактора (80%) выявлено тажже при анализе дисперсии такого показателя как численность УОМ. Фактор «глубина отбора» вносит наиболее существенный вклад в дисперсию таких показателей как электропроводность (45,6%), содержание 40К (53,65%) и микробная биомасса (54,6%). В случае рада показателей установлено, что ни гот ни другой фактор не оказывали существенного вклада в ,дисперсию их значений. Об этом свидетельствует тот факт, что максимальное значение доли дисперсии получено для остаточной дисперсии. К числу таких показателей относятся содержание 22611а (59,3%), содержание 232ТЪ (73,95%), рН (62,4%), респираторная активность (84,5%).

Рассмотрение биологических параметров по отдельности не может дать ответ на вопрос, влияет ли размещение отходов на биологические параметры почв и, в случае положительного ответа, на какую глубину распространяется этот эффект. Для того, чтобы решить эту задачу, нами был применён кластерный анализ. Для этого каждая почвенная проба, отобранная в колонках на разных глубинах, была представлена нормализованными значениями показателей, определяемых, в эксперименте. Каждая

почвенная проба считалась отдельным объектом, который использовали для кластерного анализа.

Дерево иерархической

кластеризации представлено на рис. 8. На дереве отчетливо видно три основных кластера. В первый кластер объединены три образца, два из которых отобраны в верхнем слое (0-20 см) колонок Н (ОГ<.п и ОКц), а также один образец слоя 20-40 см (ОК2]). Первая цифра индекса обозначает номер колонки, вторая - горизонт отбора. В состав второго кластера входят также три образца, два - отобранные в контрольных колонках (К) в верхнем почвенном горизонте и один в слое 20-40 см. Все остальные образцы были объединены в третий кластер. Более подробное рассмотрение объединения почвенных образцов в третьем кластере позволяет выделить группу, включающую образцы, отобранные с нижних слоев колонок Н. Необходимо отметить, что все образцы колонок Р были объединены з группу вместе с контрольными образцами, отобранными в нижних слоях. Это свидетельствует о том, что достоверный эффект на биологические показателя почв оказывает размещение необработанного отхода (Р2), притчам этот эффект наиболее выражен в верхнем слое почвы. Начиная с глубины 20 см, влияние этого отхода снижается и становится недостоверным. Отход, из которого

1 Л Г1! Г П

й Я

о о

п X г

р.<йв* |1с)и&( с, 'ЧмапГ>

Рисунок 8. Дерево иерархической класгеризацаи

удалён нефтяной компонент (PI), практически не оказывает влияния на биологическую активность почв.

4. Биоремедиация нефтесодержащих отходов Для биоремедиации отходов использоЕ:ано 2 ранее выделенных штамма деструкторов нефти - RG1 и R.G2. Определена видовая принадлежность выделенных штаммов. Идентификацию проводили на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК. Результаты сравнения установленной нуклеотидной последовательности 16S рРНК изучаемых штаммов с таковыми последовательностями, содержащимися в базе данных www.ncbi.nkn.nih.gov, позволяют идентифицировать изучаемый штамм RG1 с 96% вероятностью как Bacillus thuringiensis, штамм RG2 с 93% вероятностью как Bacillus pumilus.

Изменение содержания нефти, фр^упионного____состава___и РЭ__процессе

биоремедиации. Для анализа биодеградации углеводородов отхода были смоделированы условия ландфарминга (вариант ОП), биостимуляцки (вариант OK), и сочетания этих приемов с биоаугментацией (варианты: ОГЖ, ОПКМ и ОКМ). К 123 сугкам культивирования выявлено снижение содержания нефтепродуктов на '79, 79 и 72% соответственно в вариантах 01Ж, ОПКМ и ОП (рис. 9). Меньшее снижение нефтепродуктов наблюдается в вариантах OK и ОКМ, составившее 53 и 65%

соответственно. Ii варианте О снижение содержания нефтепродуктов составляв:!' 12%.

Внесение микроорганизмов оказывает стимулирующее действие при ремедиации образцов с начальным содержанием нефтепродуктов 461-481 г/кг (варианты OK и ОКМ), тогда как при более низком содержании нефтепродуктов (103-121 мг/кг) такой эффект не был обнаружен. Возможно, это связано с тем, что разбавление почвой отхода приводит к активизации аборигенной микрофлоры, на фоне которой активность интродуцированных микроорганизмов не вносит существенно вклада в деградацию углеводородов. В литературе представлены данные как об увеличении эффективности биодеградации углеводородов, содержащихся в нефтяных отходах, интродуцврованными микроорганизмами, так я об отсутствии эффекта (Liu et al., 2009; Kauppi et al., 2011; Tahhan et Eil., 2011). Для всех вариантов смесей с отходом НТ1 был определён фракционный состав в начале и ковце инкубирования. Как видно из данных рис. 10, тенденция изменения компонентов отдельных фракций была аналогична дня вариантов ОП, ОГК и ОПКМ. Наиболее быстро деструкции подвергаются предельные и ароматические углеводороды, что согласуется с данными литературы (Atlas, 1981, Tahhan et al., 2011). За 123 сутки инкубирования происходит снижение ароматически?:

-О— ОПКМ

ч>— от

Рисунок 9. Изменение содержания нефтепродуктов при ремедиации отхода НТ1

ероматичос*»т У8 предельные Ув

углеводородов на 90-92%, предельных - на 80-89%. В меньшей степени происходит снижение компонентов фракций смол и асфальтенов. В случае группы образцов ОК и ОКМ обнаружено максимальное снижение компонентов фракции насыщенных углеводородов (86-88%), второй по скорости снижения оказалась фракция смол (6473%) (рис 11). Незначительно от скорости последней отличалось снижение ароматических углеводородов, которое составило 47-53%. Как и в предыдущей группе наименее активное снижение продемонстрировали компоненты фракции асфаиьтенов. Скорее всего, это связано с тем, что к моменту финального отбора проб в образцах этой группы остаточное содержание нефтепродуктов оказалось существенно выше по сравнению с образцами первой группы.

Это свидетельствует о том, что процесс ремедиации в этих вариантах не завершён. Вероятно, при продлении срока ремедиации содержание

ароматически:'; углеводородов также снизится. Различная скорость деградации

компонентов нефтяных фракций приводит к изменению фракционного состава в сторону увеличения содержания фракций асфальтенов и смол в случае эффективной ремедиации и в сторон)' асфальтенов и ароматических углеводородов при незавершённой ремедиации.

Установлено несущественное увеличение содержания РЭ в процессе ремедиации в среднем в 1,1 раза по сравнению с исходным содержанием, что связано с их концентрированием за счёт минерализации органического вещества. Аналогичное явление установлено для металлов, концентрация которых

увеличивается в компостных кучах при минерализации органического вещества (Pare et al., 1999). В литературе представлены данные о том,

варианты

Рисунок 10, Фракционный состав смесей на 1 и 120 сутки опыта: 1,3,5-ОП, ОПК, ОПКМ на сутки, 2,4,6 -ОП, ОПК, ОПКМ на 120 сутки.

12 3 4

варианты

Рисунок 11. Фракционный состав смесей на 1 и 120 сутки опыта: 1,3 - ОК, ОКМ на 1 сутки, 2,4 - ОК, ОКМ на 120 сутки. Цифры на рисунке - содержание фракции и г/кг смеси.

что негативный эффект на микроорганизмы оказывает доза от 40 Гр (Jones et al. 2004) до 50 кГр (Yardin et al. 2000; Buch an et al. 2012), рассчитанная на основании концентрации 2i6Ra. В нашем исследовании полученная почвенными микроорганизмами доза, определённая с использованием модели R&D128 (Teirestrial model) (Coppelstone et al. 2001; Jones et al. 2003) составляет 0,5 Гр, что существенно ниже значения, вызывающего негативный эффект. Это позволяет считать, что основным фактором, определяющим эффекты отхода на микробные сообщества, является содержание нефтепродуктов.

Изменение биологической активности в процессе биоремелияпии В процессе инкубирования смесей с отходом НТ1 были определены изменения уровня Смюс, респираторной и уреазной активности, численности гетеротрофов и УОМ. Как видно из данных, представленных на рис. 12, в варианте ОГ1 уровень Смик существенно не отличался от такового в варианте Г1. В то же время внесение в смесь компоста и инокуляция смеси микроорганизмами (варианты ОПК и ОПКМ) привело к увеличению C„„R в 1,3 -2 раза, соответственно по сравнению с почвой. В процессе ремедиации, как в почве, так и в смесях с отходом отмечены флуктуирующие изменения Смик, причем к концу эксперимента различия между ними становятся менее существенными. Увеличение СМШ1 при рекультивации почвы, загрязненной нефтью в дозах 5-10% было

отмечено и другими авторами (Joergensen et al., 1995; Marin et al., 2005). Обработка отхода компостом и микроорганизмами (варианты OK и ОКМ) приводит к увеличению СМШ1. Скорее всего, это связано с тем, что компост оказывал структурирующее воздействие,

обеспечивая благоприятные условия для развития аэробных микроорганизмов. В то же время, высокое начальное содержание нефтепродуктов в этих вариантах обусловило более низкий уровень Смик по сравнению с остальными вариантами.

При анализе респираторной активности выявлено, что на 14 сутки инкубирования наблюдается увеличение респираторной активности в образцах ОП, ОПК, ОГ1КМ в 1,7, 2,8 и 3,5 раза соответственно по сравнению с образцом П (рис.13). В дальнейшем происходит снижение активности с повторным ее повышением на 35 сутки. Далее уровень респирации стабилизируется. Сравнение

—а—ОП

время, сугк»

Рисунок 12. Изменение микробной биомассы при ремедиации отхода НТ1

врамя, сутки

Рисунок 13. Изменение респираторной активности при ремедиации отхода НТ1

уровня респираторной активности в вариантах ОК, ОКМ показывает, что внесение в отход НИ компоста и микроорганизмов приводит к увеличению респираторной активности в 2-30 раз по сравнению с вариантом О в течение всего эксперимента. Следует отметить, что в вариантах смесей с добавлением микроорганизмов (ОПКМ, ОКМ) респираторная активность выше по сравнению с вариантами без внесения бактерий (ОШС, ОК).

Численность микроорганизмов является индикатором их жизнеспособности и отражает биодеградационный потенциал загрязнённой системы (МцЪга Ы а1., 2001, КоШп-СахпИо е! а1., 2011). Поскольку основную роль в биодеградации нефти играют У ОМ, в процессе биоремедиации была определена их численность, а также численность гетеротрофных микроорганизмов.

■» в р-

ё 4 |

I 3

э— ОП

^—опк

-■ ОПКМ - ОКМ

> 60 80 100 120 140

ЕрЕМЯ, СУКИ

Рисунок 14. Изменение численности Рисунок 15. Изменение численности

гетеротрофных организмов при ремедиации утлеводородокисляющих микроорганизмов отхода НТ1 при ремедиации отхода НТ1

Кале видно из результатов, представленных на рис. 14 и 15 численность гетеротрофных микроорганизмов увеличивается при смешивании почвы с отходом и в среднем выше на протяжении эксперимента в 1,7, 3,2 и 3,2 раза для вариантов ОП, ОПК и ОПКМ соответственно. Более существенные различия выявлены при сравнении численности У ОМ. Так, их численность в смесях, подвергаемых ремедиации,

оказывается в среднем в 24, 45 и 15 раз выше для вариантов ОП, ОПК и ОПКМ соответственно по сравнению с их численностью в почве. Ремедиации отхода путем смешивания с компостом, а также обработка смеси микроорганизмами-деструкторами приводит к увеличению численности гетеротрофов в среднем за эксперимент в 1,8 и 2,8 раза. Увеличение численности У ОМ составляет 1,1 и 2,6 раз. Установленное явление вполне

закономерно: во-первых, смешивание

шю

у 5500 5000

; 3500 Г ШЗО 2500

| их»

15Ю 1000

100 120

'10 60 60 армия, су' гу.

Рисунок 16. Изменение уреазной активности при ремедиации отхода НТ1.

отхода с почвой или компостом приводит к увеличению пористости отхода и, как следствие, к лучшей аэрации, во-вторых, углеводороды нефти являются субстратом для бактерий этой группы, и увеличение их численности отражает превращение углерода в новую клеточную массу.

Активность ферментов азотного обмена является важным диагностическим показателем интенсивности процессов мобилизации почвенного азота. В связи с этим были определены изменения в процессе ремедиации отхода уреазной активности. Согласно подученным данным (рис. 16) уровень уреазной активности образцов ОК и ОКМ увеличивается в 2,5-7,3 раза но сравнению с отходом. Следует отметить, что образцы с внесением микроорганизмов (ОПКМ и ОКМ) демонстрируют наибольшую уреазную активность по сравнению с аналогичными образцами без внесения бактерий (образцы ОПК и ОК). Полученные данные согласуются с данными литературы. Известно, что уреазная активность в загрязненных нефтью почвах со временем возрастает (Carayaca et al,, 2003; Tejada el: al., 2007; Новоселова, 2008).

Изменение фитотоксичности в процессе биоремедиации. Как видно из представленных данных (рис 17), на протяжения всего периода исследования почва

(вариант IT) не оказывает негативного

влияния на подсолнечника ингибирс'ьание

всхожесть семян Н. annuus'. всхожести семян

ОК ОПКМ ОКМ варианты

Рисунок! 7. Изменение фитотоксичности в процессе ремедагошм отхода НТ1

варьирует от 10 до 17%. В то же время при тестирований отхода, который подвергается только перемешиванию (вариант О) обнаружен 100%-ный ингибирующий эффект. При ремедиации отхода происходит снижение уровня фитотоксичности. Так, в вариантах ОП, ОШ а ОПКМ фитотоксичиость енижапась со 100% в начале эксперимента до 32, 2:8 и 29% соответственно к 135 суткам эксперимента. В вариантах ОК и ОКМ, которые характеризовались, более высоким начальным содержанием нефтепродуктов (459 и 405 г/кг) выявлено существенно меньшее снижение фитотоксичности. Во-первых., в течение первого месяца отсутствует всхожесть семян, во-вторых, к концу эксперимента фитотоксичиость составляет 67 и 54%. Полученные результаты свидетельствуют о том, что за четыре месяца в вариантах ОК и ОКМ ремедиации не завершилась. По уровню фитотоксичности, установленной к концу эксперимента смеси могут быть расположены в следующий ряд 0>0К>0КМ>0П>0ПК=0ГОСМ. Во всех вариантах, опыта обнаружено немонотонное снижение уровня фитотоксичнос-ги.

Изменение структуры микробного сообщества в процессе биоремедмации. Поскольку одним из наиболее успешных способов ремедиации отходов явилась обработка отхода почвой (вариант ОП), на следующем этапе было изучено микробное

сообщество в конце эксперимента методами молекулярной биологии. Для сравнения использовали чистую почву (вариант П). Использовали метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (Single-strand conformation polymorphism, SSCP). Для этого, на первом этапе была получена и очищена тотальная ДНК. На следующем этапе была проведена амплификация выделенных фрагментов с праймерами Coml/Com2 и осуществлено разделение ампликонов 16S рРНК бактерий с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 18).

При анализе результатов разделения ампликонов выявлено, что образец П характеризуется большим количеством полос одинаковой интенсивности, что

свидетельствует о том, что в почве содержится большее количество видов бактерий. Кроме этого установлено, что количество полос в образце П значительно больше по сравнению с образцом ОН. Особо необходимо отметить, что в образце ОП обнаружено несколько доминирующих полос, которые не выявлены в образце чистой почвы. Это позволяет предположить, что в сообществе под воздействием компонентов отхода произошла селекция штаммов, устойчивых к данному виду воздействия. Действительно, по мнению ряда авторов, длительное внесение нефти приводит к резкому изменению структуры сообщества: оно благоприятствует относительному развитию одних и уменьшению других видов, приводит к появлению новых видов в спектре бактериального сообщества (Tang et al., 2010; Reddy et al., 2011; Llado et al., 2012;. Mori et al., 2013).

На следующем этапе из геля были вырезаны фрагменты (участки доминирующих полос), содержащие ДНК, клонированы с помощью бакгерий Е. coll, а затем клоны идентифицированы. Для каждого вырезанного фрагмента анализировали по 3-4 клона.

Все клоны полосы 1 (a, f, j, к) продемонстрировали высокую схожесть (98,8 -99%) с родом Dyella. Необходимо отметить, что штамм Dyella sp. 528F-2 (BU872214) ранее был обнаружен в почвах, загрязнённых нефтью, а штамм Dyella ginsengisoli strain LA-4 (EF191354) был изолирован как деструктор бифенила (Li et al, 2009). Бифенил является одним из компонентов сырой нефти.

Три клона полосы 2 (с, f, и j) были близко схожи со Sinobacter flavus (EF154515) (99,3 -100%) и один клон с Pseudoxanthomonas spadix (АМ418384) (99,5%)(Young et al, 2007). Среди бакгерий, относящихся к роду Pseudoxanthomonas, обнаружено несколько деструкторов нефти (Kumari et al, 2011; Patel el al, 2012). Секвенция нашего клона, отнесенного к Sinobacter flavus, показала высокое сходство с секвенцией

К ОПОП П П

Рисунок 18. Разделение ампнифицированных. фрагментов 16S рРНК бактерий в образцах П и ОП при электрофорезе

некультивируемой бактерии Proteobacteria МК11 (EF1733I5), которая была выявлена в почве, загрязнённой углеводородами (Low et al., 2007).

Parvibaculum lavameniivorans (АУ387398), секвенция которой совпадала на 95,695,8% с секвенциями двух клонов полосы 3 (g, j), способна к омега-оксигенировашпо коммерческого сурфактанта линейного алкилбензенсульфоната (Scheleheck et al., 2007). Более близкородственная секвенция (99,5 - 99,8%) относилась к секвенции бактерии донных отложений 22-39 (EU167984), которая была изолирована как деструктор полициклических ароматических углеводородов из отложений реки Элизабет (Hilyard et al., 2008).

Таким образов нами установлено, что при обработке почвы отходом происходит изменение структуры сообщества в сторону доминирования устойчивых к воздействию нефтяных компонентов видов микроорганизмов.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено, что содержание нефтяных компонентов в отходах нефтедобывающего комплекса варьирует в широких пределах от 30,5 до 880 г/кг. Установлено, что доминирующим элементом в отходах является 226Ra, активная концентрация которого составляет 34-11930 Бк/'кг. В меньших количествах присутствуют 232Th (20,2 - 9399,0 Бк/кг) и 40К (28,3-2277,9 Бк/кг). Обнаружено, что фракционный состав отходов отличается для отходов с высоким и низким содержанием углеводородов.

2. При анализе токсичности водных экстрактов отходов с использованием тестов на основе бактерий Bacillus pumilus, коммерческого теста «Эколюм», инфузорий Paramecium caudatum, водорослей Scenedesmus quadricauda, низших ракообразных Daphnia. magna, пресноводных рачков Thamnocephalus platyurus, коловраток Brachicnus calyciflorus, высших растений Raphanus sativus L. обнаружено отсутствие прямой корреляции между содержанием нефтепродуктов и уровнем их токсичности, что может быть связано как с различиями во фракционном составе отходов, так и с наличием токсичных метаболитов. Выявлено, что отход, подвергнутый термической обработке, более токсичен по сравнению с исходным. Показано, что все проанализированные отходы представляют опасность для окружающей среды и на основании их тестирования с D. magna, P. caudatum и S. quadricauda могут быть отнесены к 3 классу опасности.

3. Показано, что размещение на поверхности почвенных колонок отходов с высоким содержанием нефтепродуктов приводит к миграции по почвенному профилю нефтяных компонентов в количестве 4%, и не сопровождается миграцией радиоактивных элементов, что возможно связано с их связыванием органической матрицей отходов. При размещении отхода с низким содержанием нефтепродуктов содержание 22sRa и232 ^ в верхнем слое почвы оказывается выше в 3,5 и 1,6 раза по сравнению с необработанной почв,ой соответственно. При анализе состояния микробного сообщества почв колонок было установлено, что миграция углеводородов приводит к

снижению уровня микробной биомассы, увеличению респираторной активности почв, увеличению содержания гетеротрофных микроорганизмов и УОМ, наиболее выраженным в почве верхнего горизонта (0-20см). Не выявлено достоверных различий в состоянии микробного сообщества в присутствии радиоактивных элементов, поступивших в почву из отхода.

4. С применением дисперсионного анализа результатов анализа микробных сообществ почвенных колонок выявлено, что основной вклад (80%) в дисперсию показателя численность углеводородокисляющюс бактерий вносит фактор «наличие и тип отхода». Фактор «глубина отбора» вносит наиболее существенный вклад в дисперсию показателей микробная биомасса (54,6%) и целлголазная активность. Ни тот ни другой фактор не вносили существенного вклада в дисперсию значений респираторной и дегидрогеназной активностей. Проведённый кластерный анализ результатов показал, что достоверный эффект па биологические показатели почв оказывает размещение отхода с высоким содержанием нефтяного компонента, причём этот эффект наиболее выражен в слое почвы 0-20 см.

5. Установлено, что способы биоремедиации ландфарминг и биостимуляция обеспечивают снижение нефтепродуктов и фитотоксичности отхода. Инокуляция смесей выделенными микроорганизмами-деструкторами нефти (В. и В. ритНия) эффективна при высоком содержании нефтепродуктов (461, 481 г/кг) и не оказывает влияния при их начальном содержании 120 г/кг. Различная скорость биодеградации предельных, ароматических углеводородов, асфальтенов и смол приводит к изменению фракционного состава отхода к концу процесса ремедиации в сторону увеличения содержания двух последних фракций.

6. Выявлено, что в процессе биоремедиации отхода методом яандфарминга происходит изменение структуры сообщества исходной почвы: уменьшается разнообразие видов, появляются доминирующие виды, идентифицированные как ОуеЦа ар., БтоЬаЫег Асп>м и Раг\'1Ъаал1ит ШуатепШогапя.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛШСОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах из списка ВАК

1. Гумерова Р.Х. Изменение фитотоксичности отхода нефтедобывающего комплекса, содержащего радиоактивные элементы, при их ремедиации / Р.Х. Гумерова, С.Ю. Селивановскгии, П.Ю. Галицкая // Ученые записки Казанского университета. Серия: Естественные науки. - 2011.- №3.-С.127-136.

2. Селиваиовская С.Ю. Влияние радиоактивных отходов нефтедобывающего комплекса на микробное сообщество серой лесной почвы / С.Ю. Селивановская, Р.Х. Гумерова, О.Р. Бадругдинов, П.Ю. Галицкая // Вестник РУДН. Серия: Экология и безопасность жизнедеятельности. - 2011.- №4.-. С.85-97

3. Гумерова Р.Х. Моделирование ремедиации отходов нефтедобывающего комплекса, содержащего радиоактивные элементы, методом ландфаршшга / Р.Х.

Гумерова, А.З. Низамутдинова, С.Ю. Селивановская // Вестник Уральской медицинской академической науки- 2011.-№4/1 (38). - С.169-170.

4. Селивановская С.Ю. Экологическая токсичность отходов нефтедобывающего комплекса / Селивановская С.Ю., Гумерова Р.Х., Степанова Н.Ю., Галицкая П.Ю. //Токсикологический вестннк.-2012.-N6.-C.76-81.

Статьи в других журналах, научных сборниках, тезисы докладов на конференциях

5. Гумерова Р.Х. Опасно ли размещение на почве отходов нефтедобывающего производств / Р.Х. Гумерова // Материалы итоговой научно-образовательной конференции студентов Казанского Государственного университета. - Казань, 2008

6. Гумерова Р.Х. Влияние отходов нефтедобывающего производства на микробные сообщества и фитотоксичность почв / Р.Х. Гумерова //1 городская студенческая конференция «Междисциплинарные исследования в области естественных наук», Казань, 2008

7. Гумерова Р.Х. Изменение функциониртвания микробных сообществ и фитотоксичности при размещении на почве отходов нефтедобывающего производства. / Р.Х. Гумерова // Материалы 13 Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий», Новосибирск, 2008.

8. Гумерова Р.Х. Влияние отходов, содержащих нефть и радионуклиды, на биологическую активность черноземной почвы / Р.Х. Гумерова // Сборник научных трудов II Международной научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы науки и техники-2010». - Уфа: Нефтегазовое дело, 2010. -С. 223-224.

9. Гумерова Р.Х. Метод обезвреживания радиоактивных отходов нефтедобывающего комплекса / Р.Х. Гумерова, С.Ю. Селивановская // Материалы II Международной паучно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Прогрессивные технологии и перспективы развития». - Тамбов: Изд-во ООО «ТР-принт», 2010. -С.91-92.

10. Гумерова Р.Х. Оценка влияния радиоактивных отходов нефтедобычи на микроорганизмы и растения. / Р.Х. Гумерова // Сборник трудов Всероссийской научной конференции с элементами научной школы для молодежи «Экологические проблемы нефтедобычи». - Уфа: Нефтегазовое дело, 2010. - С. 400- 402.

ll.Selivanovskaya S.Yu. Microbial activity of grey forest soil contaminated by oily waste /S.Yu. Selivanovskaya, P.Yu. Galitskaya, H.H. Gumerova, B.U. Shafigullin // Proceedings of the International Symposium "Euro-ECO - Hanover 2011": Environmental, Engineering - Economic and Legal Aspects for Sustainable Living, Hannover (Germany), 2011. - P. 100-101.

12. Гумерова P.X. Способы ремедицаии радиоактивных отходов нефтедобывающего комплекса / Гумерова Р.Х., Селивановская С.Ю., Галицкая П.Ю., Низамутдинова А.З. // Материалы II Международной научно-празегической

конференции "Современные проблемы безопасности жизнедеятельности: теория и практика. Часть П. - Казань: ГУ "Научный центр безопасности жизнедеятельности детей", 2012. - С.111-115.

13. Selivanovskaya S. Effects of leakage of compounds from radioactive oily waste on soil microbial community. / S. Selivanovskaya, R. Gumerova, P.Galitskaya // Book of abstracts of the 4th International Conference on Environmental Management, Engeneering, Planninig and Economics (CEMERE) and SECOTOX Conference. -Mykonos island, Greece: Grafima publications, 2013- P.160-161.

Отпечатано в полном соответствии с предоставленным оригинал-макетом

Подписано в печать 02.08.2013 г. Форм. 60 х 84 1/16. Гарнитура «Тайме». Печать ризографическая. Печ. л. 1,6. Тираж 120. Заказ 97/08.

Лаборатория оперативной полиграфии Издательства КФУ 420045, Казань, Кр. Позиция, 2а Тел. 233-72-12

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гумерова, Раушания Ханифовна, Казань

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГАОУВПО «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

оУ

На правах рукописи

04201361688

Гумерова Раушания Ханифовна

Оценка опасности и способы ремедиации нефтешламов, содержащих

природные радионуклиды

03.02.08 - Экология (биологические науки)

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

д.б.н., профессор, Селивановская С.Ю.

Казань-2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................................................5

1.1. Характеристика отходов, образующихся при добыче и производстве нефти....................10

1.1.1. Содержание и фракционный состав нефтепродуктов в отходах..................................10

1.1.2. Содержание в отходах радиоактивных элементов.........................................................13

1.2. Токсичность нефтесодержащих отходов................................................................................15

1.2.1. Биологические тесты для определения токсичности.....................................................15

1.2.2. Токсичность нефтесодержащих отходов и почв, загрязненных нефтью.....................16

1.3. Влияние нефтяного загрязнения на почвенные микробные сообщества............................20

1.4. Воздействие ионизирующего излучения на биологические объекты..................................27

1.5. Структура микробного сообщества нефтезагрязненных почв.............................................30

1.6. Биодеградация нефтяных углеводородов и методы рекультивации нефтезагрязненных почв .....................................................................................................................................................31

1.6.1. Биодеградация нефтяных углеводородов........................................................................31

1.6.2. Биоремедиация нефтезагрязненных почв и отходов......................................................33

1.6.3. Биоремедиация нефтесодержащих отходов....................................................................38

ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ....................................................................................................40

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...........................................................40

2.1 Объекты исследования.............................................................................................................40

2.2. Схемы экспериментов...................................................................................................................40

2.3. Аналитические методы.................................................................................................................42

2.3.1. Определение фракционного состава отходов.................................................................43

2.4. Методы оценки состояния почвенного микробного сообщества.........................................43

2.4.1. Определение респираторной активности почвенного микробного сообщества.........43

2.4.2. Определение суммарной микробной биомассы..............................................................44

2.4.3. Целлюлазная активность почвенного микробного сообщества....................................45

2.4.5. Уреазная активность почвенного микробного сообщест ва...........................................46

2.4.6. Определение численности гетеротрофных микроорганизмов......................................46

2.4.7. Определение численности углеводородокисляющих микроорганизмов.....................46

2.5. Определение фитотоксичности почв (контактный тест).......................................................46

2.6. Методы элюатного биотестирования......................................................................................47

2.6.1. Биотестирование с использованием дафний Daphnia magna....................................47

2.6.2. Биотестирование с использованием ракообразных Tamnocephalus platyurus........48

2.6.3. Биотестирование с использованием коловраток Brachionus calyciflorus.................48

2.6.4. Биотестирование с использованием инфузорий Paramecium caudatum..................49

2.6.5. Биотестирование с использованием водорослей Scenedesmus quadricauda.............49

2.6.6. Биотестирование с использованием люминисцентных бактерии..............................50

2.6.7. Биотестирование объектов с использованием семян редиса Raphanus sativus L.. 50

2.6.8. Определение токсичности отходов с использованием дегидрогеназной активности интродуцированной культуры Bacillus pumilus............................................................................51

2.7. Методы молекулярной биологии.............................................................................................51

2.7.1. Идентификация штаммов деструкторов..........................................................................51

2.7.1.1. Экстрагирование ДНК................................................................................................52

2.7.1.2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР).................................................52

2.7.1.3. Секвенирование продукта ПЦР................................................................................53

2.8. Экспериментальный метод отнесения отходов к классам опасности..................................54

2.9. Статистическая обработка результатов..................................................................................54

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ....................................................................................55

3.1. Компонентный состав и некоторые характеристики отходов нефтедобывающего комплекса..............................................................................................................................................55

3.2. Токсичность отходов нефтедобывающего комплекса, установленная методами элюатного и контактного биотестирования.........................................................................................................59

3.2.1. Определение токсичности отходов элюатными методами биотестирования..............60

3.2.2. Определение токсичности отходов контактными методами биотестирования...........65

3.3. Миграция компонентов отходов по почвенному профилю и их воздействие на качество почвы и состояние почвенного биоценоза.........................................................................................66

3.3.1. Характеристика почвенных профилей..............................................1..............................67

3.3.2. Характеристика микробного сообщества образцов почвенных колонок.....................69

3.3.3. Статистический анализ данных........................................................................................74

3.3.3.1. Дисперсионный анализ..............................................................................................74

3.3.3.2. Кластерный анализ.....................................................................................................76

3.4. Биоремедиация нефтесодержащих отходов...........................................................................78

3.4.1. Анализ биоремедиации отхода с низким содержанием нефти.....................................78

3.4.1.1. Получение микроорганизмов для биоремедиации отходов...................................78

3.4.1.2. Изменение содержания нефтепродуктов при биоремедиации..............................81

3.4.1.3. Изменение биологической активности в процессе биоремедиации......................82

3.4.1.4. Изменение фитотоксичности в процессе биоремедиации......................................84

3.4.2. Анализ биоремедиации отхода с высоким содержанием нефти...................................85

3.4.2.1. Изменение содержания нефти и фракционного состава в процессе биоремедиации.............................................................................................................................85

3.4.2.2. Изменение содержания радиоактивных элементов в процессе ремедиации........89

3.4.2.3. Изменение биологической активности в процессе биоремедиации......................90

3.4.2.4. Изменение фитотоксичности в процессе биоремедиации......................................94

3.4.2.5. Изменение структуры микробного сообщества в процессе биоремедиации.......95

ВЫВОДЫ..............................................................................................................................................99

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................101

ЛИТЕРАТУРА....................................................................................................................................102

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Процесс добычи и переработки нефти сопровождается образованием отходов, количество которых может достигать 0,2-0,5% от полученной товарной нефти (Lazar et al., 1999; Morelli et al., 2005; Ouyang et al., 2005; Roldan-Carrillo et al., 2011; Tahhan et al., 2011; Wang et al., 2012). Эти отходы содержат помимо большого количества тяжелой нефти и природные радиоактивные элементы естественных радиоактивных семейств U238 и Th232, а также К40, которые ко-осаждаются из водо-нефтяной эмульсии в виде баритов (El Afifi, Awwad, 2005; Bakr et al., 2010). Нефтяные компоненты представлены смесыо гидрофобных компонентов, многие из которых способны вызывать токсичные, и мутагенные эффекты (Солнцева, 1988; Пиковский, 1988; Кураков с соавт., 2006; Reddy et al., 2011; Wang et al., 2012).

В настоящее время остается наиболее распространенной практика депонирования нефтесодержащих отходов в специальных накопителях или размещение на почве. Однако такое размещение приводит к миграции компонентов отходов с дождевыми осадками в почву и поступлению загрязняющих веществ в воду. Ситуация осложняется тем, что отходы, содержащие нефтепродукты и радиоактивные элементы, являются токсичными для окружающей среды. В литературе представлены данные о токсичности индивидуальных углеводородов, их смесей, почв и воды, загрязненной нефтью (Saterbak et al., 2000; Van Gestel et al., 2003; Sabate et al., 2004; Molina-Barahona et al., 2005; Plaza et al., 2005; Xu et al., 2010; Frutos et al., 2012; Liado et al., 2012). Информация о токсичности отходов, содержащих и нефтепродукты, и радиоактивные элементы ограничена. В то же время она является крайне важной, поскольку многие соединения в отходах в процессе хранения трансформируются в метаболиты, токсичность и устойчивость которых неизвестна (Киреева с соавт., 2003; Кураков с соавт., 2006; Al-Mutairi et al., 2008). Отсутствует также информация о миграции по почвенному профилю углеводородов и радиоактивных элементов и их влиянию на почвенные сообщества.

Сложность обращения с подобными отходами определяется многообразием их видов и состава, высокой опасностью. Физико-химические методы обработки нефтесодержащих отходов являются дорогостоящими, энергоемкими и сопряжены с образованием вторичных отходов, захоронение которых представляет дополнительную проблему (Ouyang et al., 2005; Das, Mukherjee, 2007; Biswal et al., 2009; Wang et al., 2012). В связи с этим активно развиваются направления, использующие биологические методы.

обсуждается возможность их деструкции в жидких средах (Mana Capelli et al., 2001; Biswal et al., 2011; Reddy et al., 2011). Публикации, посвященные деструкции микроорганизмами нефтяных компонентов в отходах, содержащих природные радионуклиды, практически отсутствуют.

Цель настоящей работы - оценка воздействия компонентов отходов нефтедобывающего комплекса на почвенные системы и разработка способа их биоремедиации.

Задачи исследования.

2. Оценить токсичность компонентов отходов с использованием элюатных (тесты на бактериях Bacillus pumilus, на инфузориях Paramecium caudatum, на водорослях Scenedesmus quadricauda, на низших ракообразных Daphnia magna, на пресноводных рачках Thamnocephalus platyurus, на коловратках Brachionus calyciflorus, на высших растениях Raphanus sativus) и контактных (тесты на растениях Raphanus sativus, иа бактериях Bacillus pumilus) тестов.

5. Осуществить лабораторное моделирование процесса ремедиации отходов нефтедобывающего комплекса с использованием приемов биостимуляции и биоаугметации. Оценить изменение содержания радиоактивных элементов, нефтепродуктов, фракционного состава в процессе ремедиации. Выявить закономерности изменения функционирования микробных сообществ на основании анализа микробной биомассы, респираторной и ферментативных активностей, численности гетеротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов. Определить изменение фитотоксичности в процессе ремедиации.

6. Методами молекулярной биологии выявить измеиения в структуре микробных сообществ при ремедиации отхода.

Положения, выносимые на защиту.

Отходы, отобранные в товарном парке, содержат нефтепродукты, в составе которых доминируют насыщенные и ароматические углеводороды; среди радиоактивных элементов основным является радий.

Токсичность отходов по отношению к водным организмам, бактериям и растениям обусловлена содержанием в отходе нефтяных компонентов и их кислотностью. По уровню чувствительности к компонентам отходов биологические тесты составляют ряд тест с D. magna (30.1) > тест с В. calyciflorus (13.0) > тест с P. caudatum (12.3) > тест с S. quadricauda (7.6) > тест с R. sativus (7.5) > тест с Т. platyurus (6.2) > тест с В. pumihis (4.2) > тест Эколюм (1.0).

Размещение радиоактивных нефтесодержащих отходов на поверхности почвы приводит к миграции нефтяных компонентов и радионуклидов: достоверный негативный эффект на микробное сообщество оказывают нефтепродукты в верхнем 20-см слое почвы.

Оптимальным способом ремедиации отхода является его обработка с компостом.

Научная новизна. Впервые с использованием батареи тестов проанализирована токсичность радиоактивных отходов, образующихся в процессе добычи нефти, и установлено, что основной вклад в ее формирование вносят нефтяные углеводороды, которые оказывают наибольший эффект в отношении простейших и водорослей и не влияют на активность бактерий. Показано, что контактные тесты на основе R. sativus и В. pwnilus более чувствительны к компонентам отходов по сравнению с элюатными тестами на основе этих организмов. Выявлено, что отход, подвергнутый термической обработке, более токсичен по сравнению с исходным.

Проведено сравнение эффективности биодеградации нефтяного компонента отходов при применении различных методов биоремедиации - ландфарминг, биостимуляция, биоаугментации и их сочетаний. Установлено, что методы биоаугмептации эффективны при высоком содержании нефтепродуктов. Способом, обеспечивающим наиболее эффективное снижение нефтепродуктов, является обработка отхода компостом и специально селекционированными микроорганизмами.

Впервые методами молекулярной биологии показано, что при обработке почвы отходом происходит изменение структуры сообщества в сторону доминирования устойчивых к воздействию нефтяных компонентов видов микроорганизмов, идентифицированных как Dyella sp., Sinobacter flavus и Parvibaculiim lavamentivorans.

Результаты исследований используются при проведении практических работ по курсам «Управление в обращении с отходами», «Нормирование и снижение загрязнения окружающей среды» на кафедре прикладной экологии Казанского (Приволжского) федерального университета.

Апробация работы.

Материалы работы изложены на I городской студенческой конференции «Междисциплинарные исследования в области естественных наук» (Казань, 2008), 13 Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2008), Всероссийской научной конференции с международным участием «Окружающая среда и устойчивое развитие регионов: новые методы и технологии исследований» (Казань, 2009), II Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы науки и техники» (Уфа, 2010), II международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Прогрессивные технологии и перспективы развития» (Тамбов, 2010), Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экологические проблемы нефтедобычи» (Уфа, 2010), Proceedings of the International Symposium "Euro-ECO - Hanover 2011": Environmental, Engineering (Hanover, Germany, 2011), II Международной научно-практической конференции «Современные проблемы безопасности жизнедеятельности: теория и практика» (Казань, 2012), 4th International Conference on Environmental Management, Engeneering, Planninig and Economics (CEMERE) and SECOTOX Conference (Mykonos island, Greece, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 статьи в журналах из Перечня ВАК.

Информация о работе

Гумерова, Раушания Ханифовна
кандидата биологических наук
Казань, 2013
ВАК 03.02.08

Диссертация

Оценка опасности и способы ремедиации нефтешламов, содержащих природные радионуклиды - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы