Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства резорбируемых матриксов из полигидроксиалканоатов различного химического состава

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Свойства резорбируемых матриксов из полигидроксиалканоатов различного химического состава"

На правах рукописи

НИКОЛАЕВА Елена Дмитриевна

СВОЙСТВА РЕЗОРБИРУЕМЫХ МАТРИКСОВ ИЗ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ РАЗЛИЧНОГО ХИМИЧЕСКОГО

СОСТАВА

03.01.06 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск 2011

1 о НОЯ 2011

4858891

Работа выполнена в Институте биофизики Сибирского отделения РАН и на базовой кафедре биотехнологии Института фундаментальной биологии и биотехнологии, ФГАОУ ВПО «Сибирский Федеральный университет»

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук

доктор биологических наук Бондарь Владимир Станиславович

кандидат медицинских наук Деев Роман Вадимович

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится «¿3> года в 10-00 час. на заседании

диссертационного совета Д 003. 0074)1 при Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д.50, стр.50, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеках ФГАОУ ВПО СФУ и Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан «

яг

Ученый секретарь

диссертационного совета / '-Л

доктор биол. наук // Л. АФранк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Современная биотехнология позволяет получать широкий спектр целевых продуктов различной природы, включая новые экологически чистые биоматериалы с высокими потребительскими свойствами. Наиболее актуальной областью применения биоматериалов является биомедицина, остро нуждающаяся в биосовместимых материалах для изготовления медицинского инструментария, систем депонирования и доставки лекарственных средств, эндопротезов, сорбентов, биоконструкторов органов и тканей (Хенч, Джонс, 2007; Штильман, 2006; Nair, Laurencin, 2006). Открытие полигадроксиалканоатов (ПГА) - полимеров микробиологического происхождения, явилось значимым событием для биотехнологии новых материалов. ПГА - это линейные, термопластичные, биоразрушаемые и биосовместимые полимеры, сферы применения которых потенциально широки, включая восстановительную медицину, фармакологию, сельское и коммунальное хозяйство, радиоэлектронику и др. (Volova, 2004).

Новое и актуальное направление исследований ПГА ориентировано на решение задач для клеточной и тканевой инженерии. Многообещающей представляется перспектива использования этих полимеров для регенерации поврежденных кожных покровов и нервов, реконструкции дефектов мягких и костной тканей, кровеносных сосудов и клапанов сердца и др. (Williams et al., 1999; Williams, Martin, 2004; Chen, Wu, 2005; Волова с соавт., 2006). Используемый в тканевой инженерии междисциплинарный подход направлен на создание биоматериалов и биоконструкций для восстановления утраченных функций отдельных тканей или органов в целом.

Использование потенциала клеточных технологий в реконструктивных целях реализуется с использованием нескольких подходов. В одном из них суспензию клеток необходимого фенотипа, выросших in vitro, вводят в поврежденные ткани органов или в кровоток. В другом, технологически более сложном, клетки выращивают вне организма на матриксе (scaffold), и далее биоинженерную конструкцию или сформированную ткань имплантируют рецшшентному организму. Успех второго направления зависит во многом от свойств каркасов (матриксов), используемых в качестве носителей клеток (Wang et al., 2002; Хенч, Джонс, 2007).

Все необходимые свойства матрикса определяются свойствами исходного материала и технологией его переработки. Поэтому ключевой проблемой для успеха создания эффективных биоконструкций является наличие адекватного биодеградируемош и биосовместимого материала. Для конструирования матриксов используют биостабильные и биодеградируемые материалы неорганической и органической природы (металлы/сплавы, полимеры, керамику, гидроксиапатиты, композитные материалы, кораллы, коллаген, желатин, эластин, фибронектин, альгинат, хитозан и др.). Среди изучаемых материалов - полимеры монокарбоновых кислот: молочной, пшколиевой, алкановых (масляной, валериановой и др.). Большие надежды связаны сегодня с

полигодроксиалканоатами (Волова с соавт., 2003; 2006; Штильмап, 2006; Chen, 2009).

Однако относительно ПГА, как за рубежом, так и в России в основном исследования выполнены на двух типах, - гомогенном ПЗГБ и сополимерах 3-щдроксибутирата с 3-гидроксивалератом (ПЗГБ/ЗГВ). Высокая биосовместимость ПЗГБ базируется на том, что 3 -щдроксимасляпая кислота - естественный метаболит клеток и тканей высших животных и человека (Reusch et aL, 1992). Недостатком этого высококристалличного ПГА (степень кристалличности свыше 70 %) является то, что он не кристаллизуется упорядоченно, его весьма сложно перерабатывать в изделия, которые характеризуются низкой ударной прочностью, жесткостью и «старятся» во времени (Lakshmi et al., 2002). Особо ценным в ПГА является возможность синтеза полимеров различного состава, образованных мономерами с различной длиной С-цепи. Сополимерные ПГА более перспективны, т. к в зависимости от соотношения мономеров их базовые свойства могут изменяться в достаточно широких пределах (Sudesh et aL, 200; Volova, 2004; Волова с соавт., 2006). Однако наличие в ПГА, помимо 3-шдроксимасляной кислоты, других мономеров, делает необходимым проверку биосовместимости материала в полном объеме. Так, для доказательства биосовместимости более технологичных сополимеров 3 -гадроксибутирата с 3-гидроксивалератом, которые имеют пониженную степень кристалличности (50-60 %), понадобилось около 10 лет (Gogolewski et al, 1993; Shyshatskaya, Volova, 2004; Shyshatskaya et aL, 2003; 2004).

Относительно другах типов ПГА информация весьма отрывочна. В США компанией Tepha проводят исследования резиноподобного с низкой температурой плавления полимера 3-гидроксиоктановой кислоты (Martin, Williams, 2002). Одним из перспективных, но мало изученным ПГА, является сополимер З-гидроксибутирата/4-гадроксибутирата (ЗГБ/4ГБ), для которого характерны более высокие скорости биодеградации m vivo, и он является эластомером (Martin, Williams, 2003; Cheng et al., 2008). В Китае с недавних пор активно исследуют сополимеры 3-гидроксибутирата с 3-гидроксигексаноатом (ЗПГБ/ЗГГ) (Chen et al., 2006; 2008; 2010). Имеются единичные сообщения о трехкомпонентных ПГА, образованных мономерами масляной, валериановой и гексановой кислот (Ji et al., 2008; 2009; Wang et al., 2010).

Немногочисленные исследования биосовместимости ПГА различного химического состава выполнены в основном в культурах клеток. Опубликованные к настоящему моменты результаты не дают однозначного ответа о биосовместимости того или иного типа ПГА. Связано это с тем, что в экспериментах были использованы различные типы ПГА, различной степени очистки (об этом важном моменте информация в публикациях не представлена). Анализируемые изделия (пленки, мембраны и др.) были изготовлены различными методами, и далеко не во всех работах биосовместимость матриксов оценена комплексно, то есть с учетом физико-химических свойств полимеров, структуры и свойств поверхности. Поэтому для ответа на вопрос о том, какие типы ПГА безопасны и наиболее перспективны для применения, необходимы комплексные исследования.

Пели и задачи исследования. Цель исследования - конструирование матриксов из ПГА различного химического состава, исследование биологической совместимости в культурах клеток и экспериментах на лабораторных животных и закономерностей биоразрушения in vivo.

Для достижения цели сформулированы следующие задачи:

1. Сконструировать семейство клеточных матриксов различной геометрии и структуры из ПГА различного химического состава: гомогенного поли-3 -гидроксибутирата и сополимеров 3-гидроксибутирата с 4-гидроксибугиратом, 3-гидроксивалератом, 3-гидроксигексаноатом.

2. Исследовать свойства матриксов из ПГА в сопоставлении с контрольным матриксом из полимолочной кислоты (полилактида, ПМК).

3. Изучить возможность модификации поверхности матриксов обработкой Н2О2-ШШЗМОЙ.

4. Исследовать биологическую совместимость и функциональные свойства матриксов из ПГА различного химического состава в культурах клеток.

5. Исследовать биосовместимость и закономерности биоразрушения ПГА различного химического сос-ава в эксперименте на лабораторных животных.

Научная новизна. Впервые из ПГА различного химического состава (ПЗГБ и сополимеров ГОГБ/4ГБ, ПЗГБ/ЗГБ, ПЗГБ/ЗГГ) с применением различных технологий сконструированы и исследованы матриксы в виде плотных и пористых пленок, объемных форм, микрочастиц, нетканого полотна, сформированного ультратонкими волокнами. Установлено, что на свойства поверхности матриксов влияет химический состав ПГА и техника переработки полимера. Показана возможность модификации поверхности матриксов обработкой НгОг-плазмой, что положительно сказывается на адгезии и жизнеспособности функционирующих клеток. В культурах клеток и в экспериментах на лабораторных животных показана биологическая безопасность всех типов матриксов, изготовленных из ПЗГБ, ПЗГБ/4ГБ, ПЗГБ/ЗГВ, ПЗГБ/ЗГГ, на уровне клеток, тканей и организма Доказано отсутствие циготоксичности всех исследованных типов ПГА при прямом контакте с пролиферирукяцими клетками; по адгезивным свойствам и способности поддерживать пролиферацию клеток все матриксы сопоставимы с полистиролом и превосходят полимолочную кислоту. В хроническом 6-ти месячном эксперименте впервые исследованы последствия подкожной имплантации матриксов из ПГА различного химического состава и показано, что ответная реакция тканей однотипна и характеризуется не продолжительным посттравматическим воспалением без образования выраженных фиброзных капсул и иных неблагоприятных реакций. Установлено, что активность биоразрушения ПГА in vivo возрастает в ряду ПЗГБ < ПЗГБ/ЗГВ < ПЗГБ/4ГБ < ГОГБ/ЗГТ, и в этом процессе активное участие принимают макрофаги и гигантские клетки инородных тел. С применением ВЭЖХ показано, что наибольшее изменение молекулярной массы и полидисперности ПГА было у быстро разрушающихся сополимеров ПЗГБ/4ГБ и ПЗГБ/ЗГГ, для которых характерна более выраженная на ранних сроках гаганто-клеточная реакция тканей.

Практическая значимость. Разработано семейство матриксов различной геометрии и структуры из охарактеризованных и высокоочищенных образцов ПГА различного химического состава, отвечающих требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям биомедицинского назначения. Разработан способ модификации поверхности матриксов и стерилизации с гфименением НгОг-плазмы, позволяющий повысить гадрофильность поверхности и улучшить эксплуатационные свойства. Физико-химические и биологические свойства матриксов позволяют рекомендовать их для клеточных технологий и тканевой инженерии, а также в качестве барьерных средств для реконструктивной хирургии.

Положения, выносимые на защиту:

1 .Сконструированнное и охарактеризованное семейство матриксов из ПГА различного химического состава (ПЗГБ, ПЗГБ/4ГБ, ГОГБ/ЗГВ, ПЗГБ/ЗГГ).

2. Возможность модификации поверхности матриксов обработкой Н2О2 плазмой и повышением адгезионных свойств поверхности по отношению к культивируемым клеткам.

3. Доказанная высокая биологическая совместимость матриксов, изготовленных из ПГА различного химического состава в культурах клеток и 6-ти месячном эксперименте на лабораторных животных.

4. Закономерности биоразрушения матриксов из ПГА различного химического состава (ПЗГБ, ПЗГБ/4ГБ, ПЗГБ/ЗГВ, ПЗГБ/ЗГТ) in vivo.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (2006, 2011), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (2010), на Международном научном семинаре «Биотехнология новых материалов и окружающая среда» (2011).

Работа выполнена в рамках плановой тематики НИР Института биофизики СО РАН (№ государственной регистрации: 01201000937), Сибирского Федерального университета при поддержке Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (проект № 20.11), Программы Интеграционных программ Сибирского отделения РАН (проекты № 14 «Стволовые клетки - основа клеточных биотехнологий будущего»; № 96 «Фундаментальные основы биотехнологического получения целевых продуктов и препаратов»); Программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенциала высшей школы», проекты №№ 2.1.1.528; РНП-11); по мега-проекту (постановление Правительства РФ № 220 от 09.04.2010 «Для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих учёных в Российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования» (договор №11.G34.31.0013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ: в том числе 3 статьи в центральных изданиях РФ, входящих в список ВАК, 4 тезиса научных конференций.

Вклад автора; Планирование и проведение всех экспериментов по конструированию и исследованию матриксов, обработка и анализ полученных результатов, подготовка публикаций.

Структура работы: Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и содержит 13 таблиц и 41 рисунок; включает обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения (6 глав), заключение и выводы. Список цитируемой литературы включает 220 источников, в т. ч. 189 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Во введении обоснована актуальность работы и ее вклад в разработку полимерных клеточных носителей для биомедицины.

Аналитический обзор посвящен анализу литературы по биотехнологии материалов и полимерных конструкций для тканевой инженерии, включая описание требований, предъявляемых к биомедицинским изделиям и технологии получения разных форм матриксов. В заключительном разделе анализируется современное состояние исследований полигадроксиалканоатов и их биосоЕместимости in vitro и in vivo.

Объекты и методы исследования. Для создания матриксов использованы высокоочшценные образцы ПГА, полученные в Институте биофизики СО РАН: гомополимер ноли-3 -гндроксибутират (ПЗГБ) и сополимеры 3 -гадроксибутирата и 3-гидроксивалерата (ПЗГБ/ЗГВ) с включением ЗГВ 13 и 27,6 мол. %, 3-гадроксибутирата и 3-гадроксигексаноата (ПЗГБ/ЗГТ) с включением ЗГГ 7 мол. %, 3-гидроксибутирата и 4-шдроксибутирата (ПЗГБ/4ГБ) с включением 4ГБ 10,7 мол. %. Методами испарения растворителя, солевого выщелачивания, холодного прессования, электростатического формования из исследуемых образцов ПГА получены матриксы разной геометрии: пленки и мембраны, объемные матриксы, ультратонкое волокно.

Физико-химические свойства исходных образцов и полученных матриксов изучены с использованием газовой хроматографии («Hewelett Packard», США), рештеноструктурнош анализа (D8 ADVANCE «Bruker», Германия), гель-проникающей хроматографии (Breeze System фирмы Waters 2414, Великобритания), дериватографии (MOM, Венгрия), растровой электронной микроскопии (Phillips SEM 525 M) (ЦКП ЛИН СО РАН, Иркутск), атомно-силовой микроскопии (ACM) («SmartSPM™», ООО «АИСТ-НТ», Россия, Зеленоград). Свойства поверхности рассчитывали па базе измерения контактного краевого угла смачивания водой, используя уравнения Де Жена, находили свободную поверхностную энергию (уз), свободную энергию межфазовой поверхности (ysO и величину сил сцепления (Wsl) (эрг/см2).

Биологическую совместимость матриксов из ПГА разных типов оценивали в культурах клеток (окраска клеток (трипановым синим, азур-эозином, DAPI), морфология, адгезия и рост клеток, MIT-тест (реакция с 3-(4,5-диметшггиазол-2-ил) -2,5 -дифенилтстразол бромидом), отражающий активность

митохондриальных дегидрогеназ живых клеток). Биосовместимость in vivo матриксов из ПГА различного химического состава изучена на крысах линии Вистар при подкожной имплантации в течение 180 суток. Животные распределены на 7 групп (5 экспериментальных - матриксы из ПГА, 2 контрольные - полилактид и интактные животные), по 15 животных в каждой группе. Изучали периферическую кровь, реакцию тканей гистологической техникой. Биодеградацию in vivo изучали по изменению веса матриксов, динамике молекулярных масс ПГА (ВЭЖХ).

Эксперименты проведены в соответствии с Международными рекомендациями (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (Разрешение от Комиссии Института биофизики СО РАН по биоэтике).

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel. Для получения данных рассчитывали среднее арифметическое, среднеквадратичное отклонение, ошибку средней арифметической. Достоверность отличия средних значений проверяли по критерию Стьюдента и U-критерию Манна-Уитни (уровень значимости 0,05).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Конструирование матриксов из ПГА различного химического состава и исследование свойств поверхности

Для конструирования матриксов использована серия высокоочищенных образцов ПГА различного химического состава, полученных в Институте биофизики СО РАН: ПЗГБ, ПЗГБ/4ГБ, ПЗГБ/ЗГВ, ПЗГБ/ЗГГ, свойства которых представлены в табл. 1.

Табл. 1 - Состав и основные характеристики использованных полимеров

№ Состав, мол. % Мв, Да М„, Да пд Сх, % Т °с 1 ПЛ 5 Т °С 1 пегр.5 ^

1 ПЗГБ (100) 1 200 500 722 890 1,66 76 179,7 273

2 ПЗГБ/4ГБ (89,3/10,7) 1 100 000 477 138 2,32 43 171,9 268

3 ПЗГБ/ЗГВ (87/13) 1 115 000 332 836 3,35 50 162 266

4 ПЗГБ/ЗГВ (82,4/27,6) 1 077 000 347 419 3,1 45 157 263

5 ПЗГБ/ЗГГ (93/7) 507 000 253 500 2,0 32 158 240

6 Полилактид (100) 100 000 50 590 1,78 - 50 -

Степень кристалличности (Сх) самая высокая была у ПЗГБ (76 %). Величины Сх сополимеров - ниже: для ПГБ/4ГБ и ПЗГБ/ЗГВ имели близкие значения (43-50 %), для ПЗГБ/ГГ - 32 %. Температурные характеристики (Т™. и Гдегр.) исследованных ПГА составили для ПЗГБ, соответственно, 179,7 и 273; для сополимеров варьировали в пределах 158-172,5 и 240-286° С, соответственно, в зависимости от мономерного состава и количественного соотношения мономеров.

Из охарактеризованных образцов ПГА сконструированы матриксы разных типов: пленки и мембраны, объемные формы, нетканое полотно, образованное ультратонкими волокнами, микрочастицы.

Объемные матриксы получены прямым холодным прессованием из порошка ПГА и композитов ПГА с гидроксиапатитом (ГАП) с различным соотношением компонентов. Такие матриксы перспективны для реконструкции дефектов костной ткани. С увеличением доли ГАП поверхность композитов становилась более рельефной, в ней появлялись узуры и поры. Добавление к полимеру ГАП значительно влияло на гидрофильность матриксов, которая возрастала с ростом содержания в композите ГАП. Влагопоглощение у образца с 10 %-м содержанием ГАП составляло 2,3, у образца с 30 %-м содержанием ГАП -9.84 %. Таким образом, варьируя соотношение составляющих в композите ПЗГБ/ГАП, можно получать матриксы различной степени гидрофильности.

Методами нанотехнологий (электростатическое формование - ЭСФ полимерных растворов и эмульсий) получены ультратонкие волокна различного диаметра, из которых сформированы матриксы в виде нетканого полотна. Микрочастицы в силу развитой поверхности перспективны не только для разработки систем доставки лекарственных средств, но и в качестве матриксов в технологиях клеточной и тканевой инженерии (иетига Й а1., 2005). Получены микрочастицы диаметром от 200 нм до 2 мкм. Установлено отсутствие негативного влияния этих типов матриксов на адгезию и рост фибробластов мыши линии МН ЗТЗ и их пригодность для выращивания клеток.

ПЗГБ/4ГБ (10,7 мол. %) ПЗГБ/ЗГГ (7 мол. %) ПМК

Рис. 1. РЭМ-снимки поверхности пленок, изготовленных из ПГА различного химического состава. Увеличение х 1200. Маркер Юмкм

Из ПГА различного химического состава изготовлены матриксы в виде пленок (рис. 1). Поверхность матриксов, полученных из гомополимерного ПЗГБ, имела минимальную рельефность, была плотной и практически без пор.

На поверхности матриксов из сополимера ПЗГБ/4ГБ видны множественные поры размером около 1 мкм. Поверхность матриксов из сополимеров ПЗГБ/ЗГВ более гладкая и однородная. У матриксов, изготовленных из сополимера 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата поверхность наиболее рельефная с многочисленными порами различного диаметра, от 0,5 до 5,0 мкм. Поверхность контрольных матриксов из полилактида сформирована сферическими слоистыми структурами.

Важный показатель биосовместимости полимерных матриксов - физико-химическая реактивность поверхности, которая определяется шероховатостью, структурой, химическим и фазовым составом материала. Величина контактных краевых углов смачивания поверхности водой, косвенно отражающая гидрофильность, позволяет вычислить важные характеристики поверхности: величину сил сцепления, поверхностное натяжение и свободную энергию межфазовой поверхности (Де Жен, 1987). Самые высокие значения краевого угла имели контрольные матриксы из ПМК (71,8±4,8°) и матриксы из ПЗГБ (70,0±0,4°). Сополимерные матриксы из ПЗГБ/ЗГВ и ПЗГБ/ЗГГ по этому показателю практически не различались (60-62,5°). Это соответствует значению у широко используемых клеточных планшетов из полистирола. Самое низкое значение краевого угла смачивания зафиксировано для матрикса из ПЗГБ/4ГБ - 57,4±0,6°. Таким образом, наиболее низкие значения соотношения гидрофильность/гидрофобность поверхности имели сополимерные образцы. Вычисленные по уравнениям Де Жена энергетические характеристики поверхности показали, что наиболее низкие значения поверхностного натяжения и величины сил сцепления характерны для матриксов из ПМК и ПЗГБ, (порядка 31-32 и 95-97 эрг/см2), имеющих самую низкую гидрофильность. У сополимерных матриксов эти значения выше, соответственно, 38,9-43,1 и 106,4-112,0 эрг/см2 (табл. 2).

Табл. 2 - Свойства поверхности матриксов, изготовленных из полилактида и ПГА разной химической структуры

№ Состав, мол. % Контактный угол смачивания Поверхностное натяжение у, эрг/см2 Свободная энергия межфазовой поверхности узь, эрг/см2 Величина сил сцепления fVsi эрг/см2

1 ПЗГБ (100) 70,0±0,4 32,8 7,9 97,7

2 ПЗГБ/4ГБ (89,3/10,7) 57,4±0,6 43,1 3,9 112,0

3 ПЗГБ/ЗГВ (87/13) 60,3±2,8 40,7 4,6 108,9

4 ПЗГБ/ЗГВ (82,4/27,6) 62,5±2,0 38,9 5,3 106,4

5 ПЗГБ/ЗГГ (93/7) 60,9±1,6 42,4 4,1 111,1

6 Полилактид (100) 71,8±4,8 31,3 8,6 95,5

С использованием атомно-силовой микроскопии (АСМ) исследована другая важная характеристика поверхности - шероховатость (табл. 3). Получены следующие результаты: среднеквадратичная шероховатость (Rq) оказалась близкой как для гомополимера ПЗГБ, так и сополимеров ПЗГБ/4ГБ, ПЗГБ/ЗГВ, ПЗГБ/ЗГГ, в диапазоне 109-113 нм. Значение Rq поверхности матриксов из полилактида составило 241,629 нм, что в 2 раза выше этого показателя для ПГА всех типов.

Табл. 3 - Показатели шероховатости поверхности матриксов из ПГА разных типов, вычисленные по результатам атомно-силовой микроскопии (АСМ)

№ Состав, мол. % Rz - высота неровностей профиля по десяти точкам, нм Ra - среднее арифметическое отклонение профиля (шероховатость), нм Rq - среднеквадратичная шероховатость, нм

1 ПЗГБ (100) 1307.2 93.200 109.390

2 ПЗГБ/4ГБ (89,3/10,7) 644,6 98,682 107,931

3 ПЗГБ/ЗГВ (87/13) 577,8 99,120 113,466

4 ПЗГБ/ЗГГ (93/7) 1405,6 92,909 113,062

5 Полилактид (100) 2188,6 226,000 241,629

Таким образом, показано, что из образцов ПГА, различающихся химическим составом, возможно получение пленочных изделий, имеющих отличия топографии и характеристик поверхности. В целом, поверхность матриксов из ПГА гидрофобна и аналогична поверхностям изделий из синтетических полимеров (полиэтилентерефталата, полиметилметакрилата, поливинилхлорида, полиэтилена).

2. Изучение возможности модификации поверхности матриксов из ПГА обработкой Н202-плазмой

Изделия из ПГА гидрофобны, поэтому для повышения адгезионных свойств поверхности изделий из этих полимеров необходимы дополнительные усилия. Один из современных подходов, применяемых для модификации поверхности полимерных изделий, заключается в обработке газовой плазмой. Плазменная обработка представляет интерес не только как средство модификации свойств поверхности изделий, но также и как стерилизующий агент. Необходимо отметить, что отношение материалов и изделий из них к методам стерилизации является важным аспектом успешного применения.

Оценка возможности модификации поверхности Н202-плазмой выполнена на серии сконструированных матриксов разной геометрии: пленочных матриксах из ПГА и ПГА с добавлением полиэтиленгликоля (ПЭГ),

прессованных объемных формах и нетканом полотне, образованном ультратонкими волокнами (рис. 2). На поверхности исходных пленок из ПЗГБ видны микропоры размером до 1 мкм. Более эластичные пленки из менее кристалличного сополимерного ПГА - (ПЗГБ/ЗГВ) имели более выраженную ламинарную структуру. Добавление ПЭГ к полимеру увеличивало структурированность и пористость поверхности пленок. Для прессованных объемных матриксов характерна монолитная структура поверхности с наличием единичных трещин. Матриксы из нетканого волокна, образованного ультратонкими волокнами, имели наиболее развитую структуру.

1 2 3

Рис. 2. РЭМ-снимки необработанных матриксов, изготовленных из ПГА: 1 -пленка ПЗГБ; 2 - пленка ПЗГБ/ЗГВ; 3 - пленка ПЗГБ+ПЭГ; 4 - пленка ПЗГБ/ЗГВ+ПЭГ; 5 - прессованный образец ПЗГБ; 6 - нетканное полотно. Маркер - 10 мкм

Величины контактных краевых углов смачивания водой существенно зависят от техники изготовления и типа матрикса. Самый низкий показатель (62,66±0,80 °) зарегистрирован у матриксов, сформированных из ультратонких волокон; самый высокий - у объемных прессованных матриксов (70,88±1,7Г). Пленочные образцы, независимо от типа использованного полимера, имели близкие значение (от 65,71±0,55 до 68,02±0,36 Это значение очень близко к показателям контроля (полистирол - 67,12 Добавление к полимеру ПЭГ на величину угла достоверно не влияло.

Полученные матриксы были обработаны Н202-плазмой в стерилизаторе 81еггасЗ ЫХ («Джонсон&Джонсон», США) в течение 0,5 ч при 45 °С. Для сравнения аналогичные образцы были простерилизованы в автоклаве (1 атм, 120 °С в течение 2 ч). Независимо от типа матрикса, после стерилизации с применением Н202-плазмы краевой угол достоверно снижался; наиболее

значительно - у нетканого полотна (до 36.43°). В других вариантах снижение показателей было выражено в меньшей степени - на 4-8 %. Для всех матриксов, обработанных Н202-плазмой, зарегистрировано снижение свободной межфазовой поверхности и увеличение сил сцепления и поверхностного натяжения. Достоверного влияния автоклавирования на величину краевого угла не обнаружено.

Стерильные матриксы были засеяны фибробластами мыши линии N11-1 ЗТЗ. Через 3 ч после посева подсчет адгезированных клеток показал, что на матриксах, обработанных Н202-плазмой, количество клеток было сопоставимо с полистиролом и выше, чем на автоклавированных. Наиболее значительное влияние плазменной обработки получено для пленочных матриксов. Самое высокое количество клеток (до 28-29 в поле зрения) зафиксировано на пленках из ПЗГБ и ПЗГБ/ЗГВ с добавлением ПЭГ. Это выше, чем на матриксах, стерилизованных автоклавированием, соответственно, на 40 и 25 %. На обработанных Н202-плазмой матриксах из нетканого полотна количество клеток было выше на 18 % по сравнению с автоклавированными.

Обработка плазмой И.О. Автоклавирование Обработка плазмой нгО, Автоклавирование

Рис. 3. РЭМ-снимки фибробластов мыши линии ШН ЗТЗ на матриксах, стерилизованных разными методами через 7 суток после засева матриксов (нумерация матриксов - аналогично рис. 2)

На пленочных матриксах из ПГА, а также из ПГА с добавлением ПЭГ, простерилизованных Н202-плазмой, клетки были хорошо распластаны, формировали монослой, среди них преобладали клетки веретенообразной формы (рис. 3). На аналогичных матриксах, но простерилизованных автоклавированием, клеток было в 2-3 раза меньше, и они были неправильной формы. На нетканых матриксах, сформированных ультратонкими волокнами,

13

морфология клеток была наиболее сходной с морфологией клеток в контроле, преобладали клетки активной звездчатой формы. Клетки проникли во внутренние слои матрикса, их рост сопровождался образованием межклеточного вещества, и это было более выраженным на матриксах, обработанных плазмой. Среди немногочисленных клеток, адгезированных и растущих на объемных матриксах, также наблюдали клетки неправильной формы; при этом, это было более выражено для автоклавированных матриксов.

Результаты МТТ-теста на 7 сутки после засева матриксов клетками также показали, что количество метаболически активных клеток на матриксах, обработанных Н202-плаз\гой, было выше, чем на автоклавированных и в контроле. Наибольшее количество клеток зафиксировано на нетканом полотне, подвергнутом стерилизации плазмой, количество клеток возрастало до 249 х 106 кл./мл. На пленках, обработанных Н202-плазмой, количество клеток составило 215-234 х 10б кл./мл. Наименьшее количество клеток наблюдали на прессованных объемных матриксах (193,4 х 106 кл./мл).

Таким образом, клеточные матриксы разных типов, сконструированных из ПГА, характеризуются различной структурой поверхности, свойства которой по разному изменяются при стерилизации автоклавированием и обработкой Н202-плазмой. Обработка Н202-плазмой оказывает положительное влияние на свойства поверхности, в особенности, пленочных образцов, снижая контактные краевые углы смачивания водой. Это сопровождается повышением адгезионных свойств поверхности и способствует более активному росту фибробластов.

3. Исследование биосовместимости и функциональных свойств матриксов из ПГА различного химического состава в культуре клеток

Для оценки влияния химического состава ПГА на функциональные характеристики матриксов, перспективных в качестве клеточных носителей и хирургических барьерных средств, сконструирована серия пленочных матриксов из: ПЗГБ, ПЗГБ/ЗГВ (13 мол. % и 27,6 мол. %), ПЗГБ/ЗГГ (7 мол. %) и ПЗГБ/4ГБ (10,7 мол. %). В качестве полимера сравнения использован полилактид (ПМК).

Биосовместимость матриксов из ПГА различного химического состава исследована в культуре фибробластов мыши линии N14 ЗТЗ. Подсчет клеток, окрашенных азур-эозином, прикрепленных и растущих на исследуемых матриксах на всех сроках наблюдения выявил достоверно большее (Р=0,05) количество клеток на матриксах из ПГА всех типов по сравнению с контрольным матриксом из ПМК. Через 24 ч после засева количество клеток (в поле зрения) составляло на матриксах из ПЗГБ (п=24,3), ПЗГБ/4ГБ (п=16,7), ПЗГБ/ЗГВ (13 и 27,6 мол. %) (п=30.3 и п=38,3). Через 4 суток количество клеток на всех матриксах из ПГА стало более равномерным (п = 139-150); спустя 7 суток количество клеток выросло до 402,7-498,0. Это выше показателей на полилакгиде (п=265)и близко к полистиролу (п=380). Прикрепленные клетки на всех матриксах были хорошо распластаны, в основном имели звездчатую форму, то есть были в активном состояние.

Применение флуоресцентных красителей позволяет по сравнению с другими красителями более корректно произвести подсчет клеток. Результаты подсчета клеток с использованием ОАР1 - флуоресцентного зонда на ДНК. дали результаты, сходные с окрашиванием азур-эозином (рис. 4). Спустя 24 ч после засева матриксов фибробластами N114 ЗТЗ их количество в контроле (полистирол) и на полилактиде было достоверно ниже, чем на матриксах из всех типов ПГА. Это отставание сохранялось на сроке 4 суток. К концу наблюдения количество клеток на экспериментальных матриксах из ПГА было сопоставимо с полистиролом и составляло (клеток/поле) на ПЗГБ - 440±27,4; на ПЗГБ/4ГБ - 366±18,9; на ПЗГБ/ЗГВ (13 мол. %) - 423±32.6; на ПЗГБ/ЗГВ (27,6 мол. %) - 452±13,8 и на ПЗГБ/ГГ - 402±19,4, что от 22 до 50 % в отдельных случаях больше, чем на матриксе сравнения из ПМК.

Таким образом, установлено, что матриксы из ПГА различного химического состава не оказывали негативного влияния при прямом контакте с клетками на их адгезию и рост.

Б

В

1 2 3 4 5 6

Рис. 4. Окраска DAPI фибробластов NIH ЗТЗ, растущих на матриксах разных типов: А - через 24 ч, Б - через 4 суток, В - через 7 суток (1 - ПМК, 2 - ПЗГБ, 3 -ПЗГБ/4ГБ (10,7мол. %), 4 и 5- ПЗГБ/ЗГВ (13 и 27,6мол. %), 6~ПЗГГ(7мол. %)

О высокой биосовместимости матриксов, полученных из всех исследованных типов ПГА, свидетельствуют также результаты МТТ-теста (рис. 5). Через 24 ч после засева количество метаболически активных клеток было одинаковым в контроле (полистирол) и на матриксах из всех типов ПГА и несколько выше, чем на полилактиде. Через 4 суток количество клеток на матриксах из ПГА всех типов, а также в контроле было сопоставимым, а количество клеток на полилактиде - практически вдвое ниже. Через 7 суток количество клеток на матриксах из ПГА было близким (79-94 х 10б кл./мл), что аналогично контролю (полистирол). Количество клеток на контрольном

полилактиде было ниже в 2 раза по сравнению с данными, полученными для всех типов исследованных типов ПГА (42 х Юб кл./мл).

Клетки х 106/мл

Рис. 5. Динамика прироста

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

результатам МТТ-mecma: контроль -полистирол,

ЗТЗ на матриксах разных типов по

(нумерация 1-6-аналогично рис. 4)

фибробластов N1H

24 часа

4 суток

7 суток

■ контроль «1 ш2 ИЗ и А «5 »6

Этими экспериментами впервые показано, что пленочные матриксы из ПГА, образованных мономерами с длиной С-цепи от С4 до С6, обладают высокой биосовместимостью и пригодны для выращивания клеток в культурах.

4. Оценка биосовместимости матриксов, изготовленных из ПГА разной химической структуры, в эксперименте на животных

Для подтверждения биосовместимости новых материалов и изучения закономерностей взаимодействия с организмом in vivo на этапе доклинических исследований необходимы длительные и сложные эксперименты на лабораторных животных. Известно, что реакция тканей на имплантаты зависит не только от химической структуры материала и степени чистоты образца, но также формы и способа изготовления изделия и места введения в организм (Park, Lakes, 2007). Имеющиеся данные в отношении биосовместимости новых типов ПГА весьма ограничены и не свободны от противоречий.

Биосовместимость серии пленочных матриксов из ПГА различного химического состава (аналогичных разделу 3) исследована при подкожной имплантации на крысах линии Вистар (180 суток). В течение всего эксперимента все животные во всех экспериментальных группах, которым были имплантированы матриксы из ПГА различного химического состава, были здоровы и активны, равномерно прибавляли в весе. Достоверных изменений по сравнению с контрольными группами (интактные животные и положительный контроль - матриксы из полилактида) обнаружено не было. Относительные массы внутренних органов у животных всех экспериментальных групп также не отличались от таковых в контроле. Макроскопические исследования внутренних органов животных наблюдения каких-либо отклонений не выявили. Ни у одного

животного не обнаружено отторжения имплантатов, нагноения, расхождения швов и других отрицательных проявлений.

Анализ морфологического состава периферической крови в контрольных и опытных группах показал, что в основном эти показатели находились в пределах физиологических величин и не отличались существенно у животных экспериментальных групп относительно контролей. Незначительное повышение количества лейкоцитов (от 10 до 12,5-13.0*10%) и уровня СОЭ (до 3.0-3.5) отмечено на 10 сутки после оперативного вмешательства во всех группах у оперированных животных относительно интактного контроля, что было в пределах естественной реакции организма на хирургическое вмешательство. По данным показателям достоверных различий между животными всех 5-ти экспериментальных групп, которым были имплантированы матриксы из ПГА различного химического состава не выявлено.

Рис. 6. Состояние матриксов, изготовленных из полимеров различного химического состава, и морфология окружающих тканей через 10 суток после имплантации. Окраска гематоксилин-эозином. Стрелками обозначены границы «матрикс-ткань». Маркер 25 мкм

Гистологические исследования реакции тканей на подкожную имплантацию пленочных матриксов из ПГА различного химического состава существенных отличий и неблагоприятных проявлений не выявили. Начальная реакция тканей на ПГА по характеру воспаления была менее выраженной по сравнению с реакцией на имплантат сравнения (ПМК), количество нейтрофилов и лимфоцитов вокруг которого было выше в 2 раза (рис. 6).

Через 30 суток после имплантации вокруг матриксов всех типов сформировались тонкие фиброзные капсулы. Прорастание соединительной ткани в имплантаты не отмечено. По периферии в окружающей фиброзно-мышечной ткани некрозов, кровоизлияний, лимфогистиоцитарной инфильтрации и отека не

наблюдали. Капсулы характеризуются наличием небольшого количества макрофагов и фибробластов, располагающихся на внутренней поверхности капсулы на границе с пленкой. Определяются единичные гигантские клетки инородных тел (ГКИТ), лежащие в толще внутренней поверхности капсулы. Минимальная толщина капсулы в эти сроки (22,48±4,16 мкм) составляла вокруг имплантатов из ПЗГБ; максимальная (42,36±3,43) - вокруг сополимеров ПЗГБ/4ГБ. В капсуле вокруг контрольного матрикса из ПМК количество нейтрофилов и лимфоцитов было выше в 2,5-3 раза, а ГКИТ, являющихся, как известно, одним из основных агентов биорезорбции ПМК и ПГА - в 20 раз. Капсула вокруг контрольного полилактида была более плотная, толщиной 56,75±4,5 мкм. Разрушения матриксов из ПГА не отмечено.

Существенных отличий в состоянии тканей и структуре фиброзных капсул вокруг экспериментальных ПГА-матриксов спустя 60 суток после имплантации не отмечено, за исключением увеличения количества макрофагов и ГКИТ в 3-5 раз. Сформированные капсулы в основном были представлены фибробластами и коллагеновыми волокнами. В капсулах отмечено наличие сосудов микроциркуляторного русла, в их структуре преобладали коллагеновые волокна зрелого типа. В тканях вокруг контрольного матрикса из ПМК отмечено увеличение количества клеток всех типов, а также увеличение толщины фиброзной капсулы до 40-60 мкм.

Рис. 7. Состояние матриксов. изготовленных из полимеров различного химического состава, и морфология окружающих тканей через 90 суток после имплантации. Окраска гематоксилин-эозином. Стрелки указывают на границы полимерных матриксов. Маркер 40 мкм

Спустя 90 суток отмечено возрастание толщины фиброзных капсул вокруг всех типов матриксов, однако капсулы были не грубыми, а их толщина не превышала 100 мкм (рис. 7). Капсулы характеризуются наличием ярко

выраженной двухслойности. внутренний слой занимает 1/3 толщины, представлен фиброзной тканью с большим количеством макрофагов, фибробластов и примесью ГКИТ. Наружная поверхность представлена плотной фиброзной тканью в виде пучков коллагеновых волокон и прилегающих к ним фиброцитов. Капсулы характеризуются высокой зрелостью коллагена с наличием фиброцитов в внешнем слое, внутренний представлен тонким слоем фибробластов с примесью макрофагов. Матриксы из ПГА деструктурированы в разной степени, матриксы из ПМК - практически полностью разрушены.

Спустя 180 суток после имплантации вокруг ПГА-матриксов зафиксировано значительное истончение капсул до 30-40 мкм, что является показателем высокой биосовместимости ПГА (рис. 8). Средняя толщина капсул вокруг матриксов из всех типов ПГА сократилась в 1,5-2,3 раза по сравнению со сроком 90 суток. При этом количество активных макрофагов в тканях, примыкающих к имплантатам, по-прежнему оставались на высоком уровне, выросло количество ГКИТ с 10-12 ядрами. В периферических частях капсулы наблюдали образование зрелой соединительной ткани в виде пучков коллагеновых волокон и прилегающих к ним фиброцитов. За исключением ПЗГБ. практически все матриксы сильно разрушены и дефрагментированы.

ПЗГБ/4ГБ (10,7 мол %) ПЗГБ/ЗГВ (13 мол %)

ПЗГБ/ЗГВ (27,6 мол %) ПЗГБ/ЗГГ (7 мол %) ПМК

Рис. 8. Состояние матриксов, изготовленных из полимеров различного химического состава, и морфология окружающих тканей через 180 суток после имплантации. Окраска гематоксилин-эозином. Стрелки указывают на границы полимерных матриксов. Маркер 40 мкм

Таким образом, впервые в экспериментах на животных проведены исследования семейства матриксов из ПГА различного химического состава. Не выявлено отрицательного влияния подкожной имплантации ПГА-матриксов на физиологические и биохимические характеристики животных. Независимо от состава ПГА и длительности контакта с внутренней средой организма, не

отмечены отклонения в поведении животных, их росте и развитии, а также функции переферической крови. Реакция тканей на ПГА-матриксы характеризуется непродолжительным и умеренным воспалением с образованием негрубых фиброзных капсул не более 100 мкм, которые постепенно инволюционируют. Реакция тканей на ПМК была более выражена на ранних сроках.

5. Исследование динамики разрушения ПГА-матриксов in vivo

Знание закономерностей разрушения матриксов in vivo необходимо для разработки биомедицинских изделий из резорбируемых ПГА. Для оценки динамики разрушения матриксов in vivo, помимо морфологических исследований гистологических срезов, регистрировали остаточное содержание ПГА в тканях, а также показатели, характеризующие изменение полимеров в процессе разрушения: молекулярную массу Мв (средневесовую), М„ (среднечисловую) и полидисперсность ПД (рис. 9-10).

Наиболее активно разрушался контрольный матрикс из полилактида (ПМК): его остаточная масса через 30 суток не превышала 60, через 60 - была на уровне 36; спустя 90 суток - порядка 10-15 %, через 180 суток остаточная масса полимера матрикса из ПМК была следовой. Все матриксы из ПГА разрушались значительно медленнее (рис. 9).

Рис. 9. Изменение веса

полимерных матриксов в ходе 180-ти суточной подкожной имплантации

-+-ПЗГБ -»-ПЗГБ/4ГБ (10,7 мол %)

—*-ПЗГБ/ЗГВ (13 мол %) -#-ПЗГБ/ЗГВ (27,6 мол %)

-»-ГВГБ/ЗГГ(7 мол%) -»-ПМК

Остаточная масса матриксов из сополимеров ПЗГБ/ЗГГ и ПЗГБ/4ГБ составила соответственно через 30 суток 75-80. через 90 суток - 20 и 33, к концу эксперимента, 10 и 20 % от исходной. Разрушение матриксов из сополимеров ПЗГБ/ЗГВ происходило практически одинаково и было менее замедленным по сравнению с выше описанными сополимерами: через 90 суток их остаточная масса составляла около 40 %, а через 180 суток - 30-35 % от исходной. Наиболее устойчивы к разрушению in vivo матриксы из ПЗГБ.

% от исходной

О 30 60 90 120 150 180 суток

заметное разрушение которых (на уровне 25 %) зафиксировано только на сроке 90 суток, а через 180 суток остаточная масса этого типа матрикса составляла 45 % от исходной.

У всех матриксов в ходе эксперимента происходило снижение Мв и М„. У контрольного матрикса из ПМК. исходно характеризующегося существенно более низкими значениями Мв и Мн (табл. 1), зарегистрировано самое быстрое по срокам и значительное изменение молекулярной массы. Так. спустя месяц после имплантации Мв и М„ ПМК снизились практически на половину от исходных величин, а к концу эксперимента через 180 суток составляли, соответственно, 13 и 12 % от исходных. Значения Мв и Мн у матриксов из всех типов ПГА, разрушение которых протекало с различной интенсивностью, и, в целом, менее активно, чем ПМК, также закономерно падали. Наиболее значительно и на ранних сроках величина Мв уменьшалась у матриксов из сополимера ПЗГБ/4ГБ, и составляла через 30 суток 58, через 180 суток - 22 % от исходной величины. Падение Мв у матриксов из сополимеров ПЗГБ/ГВ и ПЗГБ/ЗГГ было сходным, через 30 суток - 60, через 180 суток снизилась до 2629 % от исходной (рис. 10).

МВ, %

Рис. 10. Динамика убывания молекулярной массы М6 образцов полимеров при подкожной имплантации в течение 180 суток, в % от исходной

Полидисперсность ПГА, характеризующая соотношение в полимере фрагментов с различной степенью полимеризуемости, падала у всех исследованных матриксов, что является показателем вымывания более короткоцепочечных фрагментов. Падение ПД было сопоставимо для матриксов из ПЗГБ/4ГБ и ПЗГБ/ЗГГ (в 1.3 раза от исходной величины) и более заметным у ПЗГБ (в 2,3 раза).

Таким образом, установлено, что по биоразрушаемости сконструированные матриксы из ПГА различного химического состава находятся в ряду: ПЗГБ/ЗГГ - ПЗГБ/4ГБ - ПЗГБ/ЗГВ - ПЗГБ. Наиболее активно разрушаемыми ПГА определены матриксы из сополимеров, содержащие 3-

«ПМК иПЗГБ * ПЗГБ/4ГБ (10,7 мол %)

■ ПЗГБ/ЗГВ (13 мол. %) « ПЗГБ/ЗГВ (27.6 мол. %) • ПЗГБ/ЗГГ (7 мол. %)

гидроксигексаноат и 4-гадроксибутират. Следующими и более медленно разрушаемыми были матриксы из сополимера ПЗГБ/ЗГВ, и самыми устойчивыми - матриксы из ПЗГБ. Более медленная разрушаемость матриксов из ПГА сопровождалась более поздним развитием гигантоклеточной реакции.

Выводы:

1. Впервые из высокоочшцепных образцов ПГА различного химического состава (ПЗГБ и сополимеров ГОГБ/4ГБ, ПЗГБ/ЗГВ, ГОШЗГГ) с применением технологии испарения растворителя, техники выщелачивания, холодного прессования, микродропинга, электростатического формования сконструированы и исследованы матриксы в виде плотных и пористых пленок, объемных форм, микрочастиц, нетканого полотна, сформированного ультратонкими волокнами.

2. С применением РЭМ, АСМ, вычислением характеристик поверхности на базе измерения краевого угла смачиваемости водой установлено, что на свойства поверхности матриксов влияет химический состав ПГА, введение порообразуюгцих компонентов и техника изготовления.

3. Показана возможность модификации поверхности матриксов из ПГА обработкой НгОг-плазмой, которая сопровождается повышением гидрофильности, что положительно сказывается на адгезии и жизнеспособности функционирующих клеток.

4. В культуре фибробластов мыши линии NM ЗТЗ по результатам окрашивания клеток флуоресцентным зондом на ДНК DAPI и в МТТ-тесте доказано отсутствие цитотоксичности всех исследованных типов ПГА (ПЗГБ, ПЗГБ/4ГЕ, ПЗГБ/ЗГВ, ПЗГБ/ЗГГ) при прямом контакте с клетками; по адгезивным свойствам и способности поддерживать пролиферацию клеток все матриксы сопоставимы с полистиролом и превосходят полимолочную кислоту.

5. Впервые в хроническом эксперименте на лабораторных животных изучены ответ организма и реакция тканей на подкожную имплантацию матриксов из ПГА различного химического состава и получены количественные данные, характеризующие этот процесс; доказана биологическая безопасность матриксов из всех исследованных типов ПГА и соответствие требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям медико-биологического назначения.

6. Установлено, что биодеградация ПГА in vivo зависит от химической структуры и усиливается в ряду ПЗГБ < ПЗГБ/ЗГВ < ПЗГБ/4ГБ < ПЗГБ/ЗГГ. С применением ВЭЖХ показано, что наибольшие изменение молекулярной массы и полидисперности ПГА имеют место у быстро разрушающихся сополимеров ПЗГБ/ЗГБ и ПЗГБ/ЗГГ, для которых характерна более выраженная на ранних сроках шгантоклеточная реакция тканей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Николаева Е.Д. Влияние обработки НгОг-плазмой на свойства клеточных носителей из резорбируемых полиэфиров «Биопластотан» /Е.Д. Николаева, Д.Б. Гончаров, Е.И. Шишацкая //Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2011. - Т. VI, № 2. - С. 65-70.

2. Николаева Е. Д. Сравнительное исследование клеточных носителей, полученных из резорбируемых полигадрокисалканоатов различного химического состава /Е. Д. Николаева, Е.И. Шишацкая, КЕ. Мочалов, Т.Г. В олова, Э. Дж. Сински // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2011. - Т. 6, № 4. - С. 63-67.

3. Zhila N. Microbial synthesis and characterization of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) copolymers / N. Zhila, T. Volova, D. Sirvacheva, I. Osipova, E. Nikolaeva // Journal of Siberian Federal University. Part "Biology". — 2011. -V. 4, №2. - P. 155-165.

Тезисы докладов и материалов конференций:

4. Николаева Е. Создание биосовместимых биоразрушаемых сосудистых стентов на основе полиоксиалканоатов / Е. Николаева, Е.И. Шишацкая // XLIV Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс», секция «Медицина». - Сб. тезисов. -Новосибирск. - 2006. - С. 21-22.

5. Николаева Е.Д. Резорбируемые матриксы для культивирования клеток / Е.Д. Николаева, Е.И. Шишацкая // Медицинский академический журнал. -Санкт-Петербург. - 2010. - Т.5, № 10. - С. 216.

6. Гончаров Д.Б. Влияние способов стерилизации на свойства поверхности полигадроксиалканоатов / Д.Б. Гончаров, Е.Д. Николаева // XLIX Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс». - Сб. тезисов. - Новосибирск. - 2011. - С. 228

7. Николаева Е.Д. Сравнительное исследование клеточных матриксов, полученных из резорбируемых ПГА различного химического состава / Е.Д. Николаева, Е.И Шишацкая //Международный научный семинар с молодежной школой «Биотехнология новых материалов и окружающая среда». - Сб.тезисов. - Красноярск. - 2011, С. 44-46.

Автор благодарит своего научного руководителя Шшпацкую Екатерину

Игоревну и руководителя Лаборатории хемоавтотрофного биосинтеза Волову

Татьяну Григорьевну за постоянное внимание и участие в работе, сотрудников

Института биофизики СО РАН О.Г. Беляеву, Н.О. Жила, А.Н. Бояндина, A.B.

Гореву за помощь в проведении экспериментов. Отдельная благодарность

сотрудникам Лимнологического института СО РАН Е.В. Лихошвай и В.И.

Егорову за помощь в проведении электронно-микроскопических исследований.

Подписано в печать 27.10. 2011г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная 80 г/м2 Способ печати - оперативный. Заказ № 361. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии «ДарМа-печать». Адрес: г. Красноярск, Академгородок, 50, стр. 28. оф. 156. Тел. 290-72-32

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Николаева, Елена Дмитриевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Требования, предъявляемые к материалам биомедицинского назначения.

1.2 Матриксы и другие изделия, способы получения и характеристики.

1.3 Полигидроксиалканоаты - перспективный класс природных биополимеров.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Синтез и выделение ПГА.

2.3. Определение свойств ПГА.

2.4 Конструирование полимерных матриксов для культивирования клеток.

2.4.1 Изготовление 2D матриксов.

2.4.2 Изготовление прессованных объемных матриксов.

2.4.3 Изготовление матриксов в виде ультратонкого волокна

2.4.4 Получение микрочастиц.

2.4.5 Покрытие сетчатых хирургических эндопротезов.

2.5. Стерилизация полученных матриксов.

2.6 Оценка свойств полученных матриксов.

2.7. Оценка токсичности полимерных матриксов in vitro.

2.8. Оценка токсичности матриксов из ПГА in vivo.

2.9. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ ИЗДЕЛИЙ ИЗ ПГА РАЗЛИЧНОГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ.

3.1. Характеристика ПГА, использованных для получения полимерных изделий различной геометрии.

3.2. Характеристики двумерных (2D) ПГА матриксов.

3.3. Конструирование полимерных изделий из ПГА методами нанотехнологии.

3.4 Характеристики объемных (3D) конструкций, сформированных из ПГА.

РЕЗЮМЕ.

ГЛАВА 4. МОДИФИКАЦИИ ПОВЕРХНОСТИ ПГА МАТРИКСОВ

ОБРАБОТКОЙ Н202-ПЛАЗМ0Й.

4.1. Оценка влияния обработки Н202-плазмой на характеристики матриксов из ПГА.

4.2 Оценка влияния обработки матриксов Н202-плазмой в культуре клеток.

РЕЗЮМЕ.

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОСОВМЕСТИМОСТИ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ ИЗДЕЛИЙ, СКОНСТРУИРОВАНННЫХ ИЗ ПГА РАЗЛИЧНОГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА, В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК.

5.1 Исследований биологической совместимости 2D полимерных матриксов из ПГА различного химического состава.

5.2 Оценка биосовместимости и потенциала полимерных микрочастиц из ПГА в качестве клеточных носителей.

5.3. Исследование биосовметимости и остеогенного потенциала 3D объемных форм, полученных на основе ПГА

РЕЗЮМЕ.

ГЛАВА 6. БИОСОВМЕСТИМОСТЬ 2D МАТРИКСОВ,

ИЗГОТОВЛЕННЫХ ИЗ ПГА РАЗНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ

СТРУКТУРЫ, В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VIVO.

6.1 Исследование реакции тканей на имплантаты, изготовленные из ПГА разного химического состава.

6.2. Динамика деструкции полимерных матриксов в ходе 6месячной подкожной имплантации.

РЕЗЮМЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свойства резорбируемых матриксов из полигидроксиалканоатов различного химического состава"

Современная биотехнология позволяет получать широкий спектр экологичных материалов с полезными свойствами для различных сфер человеческой деятельности. Наиболее актуальной областью применения биоматериалов является биомедицина, остро нуждающаяся в биосовместимых материалах для изготовления медицинского инструментария, систем депонирования и доставки лекарственных средств, эндопротезов, сорбентов, биоконструкторов органов и тканей (Платэ, 1977; Nair, Laurencin, 2006).

Используемый в тканевой инженерии междисциплинарный подход направлен на создание эквивалентов тканей и органов, представляющих собой сложные конструкции из функционирующих клеток, закрепленных на клеточных носителях (каркасах, матриксах, скаффолдах). Успех этого направления зависит во многом от свойств матриксов, используемых в качестве носителей клеток (Wang et al., 2002; Хенч, Джонс, 2007).

Все необходимые свойства матрикса определяются свойствами исходного материала и технологией его переработки. Поэтому ключевой проблемой для успеха создания эффективных биоконструкций является наличие адекватного биодеградирующего и биосовместимого материала. Для конструирования матриксов используют биостабильные и биодеградируемые материалы неорганической и органической природы (металлы/сплавы, полимеры, керамику, гидроксиапатиты, композитные материалы, кораллы, коллаген, желатин, эластин, фибронектин, альгинат, хитозан и др.). В связи с тем, что имплантируемый матрикс с функционирующими клетками действует как временный каркас, способствующий формированию зрелой ткани, использование биодеградируемых матриксов является предпочтительным. При использовании не разрушаемых матриксов могут иметь место осложнения, связанные с длительным присутствием чужеродного материала в организме. Среди изучаемых материалов - полимеры монокарбоновых кислот: молочной, гликолиевой, алкановых (масляной, валериановой и др.).

Среди множества исследуемых биоматериалов полигидроксиалканоаты (ПГА) заслуживают особого внимания. ПГА - линейные полиэфиры бактериального происхождения, обладают рядом ценных свойств, среди которых способность в биодеструкции без образования токсичных продуктов разрушения и высокая биосовместимость, что позволяет использовать ПГА во многих сферах: медицине, фармакологии, сельском хозяйстве и т.д. Новое и актуальное направление исследований ПГА ориентировано на решение задач для клеточной и тканевой инженерии. Многообещающей представляется перспектива использования этих полимеров для регенерации поврежденных кожных покровов и нервов, закрытия дефектов мягких и костной тканей, имплантатов кровеносных сосудов и клапанов сердца и др. (Williams et al., 1999; Williams, Martin, 2004; Chen, Wu, 2005; Волова с соавт., 2006).

Однако до недавнего времени исследования ПГА, как за рубежом, так и в России, проводились на двух представителях данного класса полимеров: гомополимере поли-3-гидроксимасляной кислоте (поли-3-гидроксибутират, ПЗГБ), и на сополимере 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом.

ПЗГБ характеризуется высокой биосовместимостью, это связано с тем, что гидроксимасляная кислота является естественным метаболитом клеток и тканей высших животных и человека (Reusch et al., 1992). Недостатком этого типа ПГА является высокая степень кристалличности (свыше 70 %), а также то, что он не кристаллизуются упорядоченно, его весьма сложно перерабатывать в изделия, которые характеризуются низкой ударной прочностью, жесткостью и «старятся» во времени (Lakshmi, Laurencin, 2007).

Особо ценным в ПГА является возможность синтеза полимеров различного состава, образованных мономерами с различной длиной С-цепи. Сополимерные ПГА более перспективы, так как в зависимости от соотношения мономеров их базовые свойства могут изменяться в достаточно широких пределах (Volova, 2004; Волова с соавт., 2006; Sudesh et al., 2000). Но наличие в ПГА, помимо гидроксимасляной кислоты, других мономеров делает необходимым проверку биосовместимости материала в полном объеме.

Следующим по изученности представителем ПГА стали сополимеры 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом, которые имеют пониженную степень кристалличности (50-60 %) и более удобные технологичные свойства. Однако понадобилось около 10 лет для доказательства биосовместимости этого типа ПГА (Gogolewski et al., 1993; Севастьянов и др., 2001; Шишацкая и др., 2000; Volova et al., 2003; 2004; Kôse et al., 2005).

Относительно других типов ПГА информация весьма отрывочна и противоречива. Например, в США компанией Tepha проводят исследования резиноподобного с низкой температурой плавления (40-60 °С) полимера 3-гидроксиоктановой кислоты (полигидроксиоктаноата, ПГО) (Williams, Martin, 2001; 2003). Группа ученых в Китае активно исследует сополимеры 3-гидроксибутирата с 3-гидроксигексаноатом (ПЗГБ/ЗГГ) (Chen, 2009). Имеются немногочисленные данные о трехкомпонентных ПГА, образованных мономерами масляной, валериановой и гексановой кислот (Ji et al., 2008; Ji et al., 2009; Wang et al., 2010). Одним из перспективных, но мало изученным ПГА, является сополимер З-гидроксибутирата/4-гидроксибутирата, для которого характерны высокие скорости биодеградации in vivo, он является эластомером, имеет более высокие показатели удлинения при разрыве и относительно высокий предел прочности на разрыв в отличие от большинства общеизвестных полимеров этого класса (Martin, Williams, 2003; Cheng et al., 2008).

Немногочисленные исследования биосовместимости ПГА различного химического состава выполнены в основном в культурах клеток, при этом эксперименты на животных еще менее представительны. Опубликованные к настоящему моменты результаты не дают однозначного ответа о биосовместимости того или иного типа ПГА. Связано это с тем, что в экспериментах были использованы различные типы ПГА, различной степени очистки (об этом важном моменте информация в публикациях не представлена). Анализируемые изделия (пленки, мембраны и др.) были изготовлены различными методами, и далеко не во всех работах биосовместимость матриксов оценена комплексно, то есть с учетом физикохимических свойств полимеров, структуры и свойств поверхности. Поэтому для ответа на вопрос о том, какие типы ПГА безопасны и наиболее перспективны для применения, необходимы комплексные исследования.

Исходя из этого, целью работы было конструирование матриксов из полигидроксиалканоатов различного химического состава (поли-3-гидроксибутирата и сополимеров 3-гидроксибутирата с 4-гидроксибутиратом, 3-гидроксивалератом, 3-гидроксигексаноатом) исследование биологической совместимости в культурах клеток и экспериментах на лабораторных животных и закономерностей биоразрушения in vivo.

Для достижения цели сформулированы следующие задачи:

1. Сконструировать семейство клеточных матриксов различной геометрии и структуры из ПГА различного химического состава: гомогенного поли-3-гидкросиубтирата и сополимеров 3-гидрокисбутирата с 4-гидрокисбутиратаом, 3-гидроксивалератом, 3-гидркосигексаноатом.

2. Исследовать свойства матриксов из ПГА в сопоставлении с контрольным матриксом из полимолочной кислоты (полилактида, ПМК).

3. Изучить возможность модификации поверхности матриксов обработкой Н202-плазмой.

4. Исследовать биологическую совместимость и функциональные свойства матриксов из ПГА различного химического состава в культурах клеток.

5. Исследовать биосовместимость и закономерности биоразрушения ПГА различного химического состава в эксперименте на лабораторных животных.

Научная новизна:

Впервые из ПГА различного химического состава (ПЗГБ и сополимеров ПЗГБ/4ГБ, ПЗГБ/ЗГВ, ПЗГБ/ЗГГ) с применением различных технологий сконструированы и исследованы матриксы в виде плотных и пористых пленок, объемных форм, микрочастиц, нетканого полотна, сформированного ультратонкими волокнами. Установлено, что на свойства поверхности матриксов влияет химический состав ПГА и техника переработки полимера. Показана возможность модификации поверхности матриксов обработкой Н2О2-плазмой, что положительно сказывается на адгезии и жизнеспособности функционирующих клеток. В культурах клеток и в экспериментах на лабораторных животных показана биологическая безопасность всех типов матриксов, изготовленных из ПЗГБ, ПЗГБ/4ГБ, ПЗГБ/ЗГВ, ПЗГБ/ЗГГ, на уровне клеток, тканей и организма Доказано отсутствие цитотоксичности всех исследованных типов ПГА при прямом контакте с пролиферирующими клетками; по адгезивным свойствам и способности поддерживать пролиферацию клеток все матриксы сопоставимы с полистиролом и превосходят полимолочную кислоту. В хроническим 6-ти месячном эксперименте впервые исследованы последствия подкожной имплантации матриксов из ПГА различного химического состава и показана, что ответная реакция тканей однотипна и характеризуется не продолжительным посттравматическим воспалением без образования выраженных фиброзных капсул и иных неблагоприятных реакций. Установлено, что активность биоразрушения ПГА in vivo возрастает в ряду ПЗГБ/ЗГГ > ПЗГБ/4ГБ > ПЗГБ/ЗГВ >ПЗГБ, и в этом процессе активное участие принимают макрофаги и гигантские клетки инородных тел. С применением ВЭЖХ показано, что наибольшие изменение молекулярной массы и полидисперности ПГА имеют место у быстро разрушающихся сополимеров ПЗГБ/4ГБ и ПЗГБ/ЗГГ, для которых характерна более выраженная на ранних сроках гиганто-клеточная реакция тканей.

Практическая значимость. Разработано семейство матриксов различной геометрии и структуры из охарактеризованных и высокоочищенных образцов ПГА различного химического состава, отвечающих требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям биомедицинского назначения. Разработан способ модификации поверхности матриксов и стерилизации с применением Н202-плазмы, позволяющий повысить гидрофильность поверхности и улучшить эксплуатационные свойства. Физико-химические и биологические свойства матриксов позволяют рекомендовать их для клеточных технологий и тканевой инженерии, а также в качестве барьерных средств для реконструктивной хирургии.

Положения, выносимые на защиту:

1 .Сконструированнное и охарактеризованное семейство матриксов из ПГА различного химического состава (ПЗГБ, ПЗГБ/4ГБ, ПЗГБ/ЗГВ, ПЗГБ/ЗГТ).

2. Возможность модификации поверхности матриксов обработкой Н202-плазмой и повышением адгезионных свойств поверхности по отношению к культивируемым клеткам.

3. Доказанная высокая биологическая совместимость матриксов, изготовленных из ПГА различного химического состава в культурах клеток и 6-ти месячном эксперименте на лабораторных животных.

4. Закономерности биоразрушения матригсов из ПГА различного химического состава (ПЗГБ, ПЗГБ/4ГБ, ПЗГБ/ЗГВ, ПЗГБ/ЗГГ) ш vivo.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (2006, 2011), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (2010), на Международном научном семинаре «Биотехнология новых материалов и окружающая среда» (2011).

Работа выполнена в рамках плановой тематики НИР Института биофизики СО РАН (№№ государственной регистрации: 01201000937), Сибирского Федерального университета при поддержке Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки-медицине» (проект № 20.11), Программы Интеграционных программ Сибирского отделения РАН (проекты 14 «Стволовые клетки - основа клеточных биотехнологий будущего»; № 96 «Фундаментальные основы биотехнологического получения целевых продуктов и препаратов»); Программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенциала высшей школы», проекты №№ 2.1.1.528; РНП-11); по мега-проекту (постановление Правительства РФ № 220 от 09.04.2010 «Для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих учёных в Российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования» (договор №11 .G34.31.0013).

Автор благодарит своего научного руководителя Шишацкую Екатерину Игоревну и руководителя Лаборатории хемоавтотрофного биосинтеза Волову Татьяну Григорьевну за постоянное внимание и участие в работе, сотрудников Института биофизики СО РАН О.Г. Беляеву, Н.О. Жила, А.Н. Бояндина, A.B. Гореву за помощь в проведении экспериментов. Отдельная благодарность сотрудникам Лимнологического института СО РАН Е.В. Лихошвай и В.И. Егорову за помощь в проведении электронно-микроскопических исследований.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Николаева, Елена Дмитриевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Работа посвящена исследованиям физико-химических и биологических свойств матриксов, сконструированных из полигидроксиалканоатов (ПГА) -биоразрушаемых полиэфиров природного происхождения.

На первом этапе работы сконструирован ряд матриксов из ПГА различного химического состава (поли-3-гидроксибутират и сополимеры 3-гидроксибутирата с 4-гидроксибутиратом, 3-гидроксивалератом, 3-гидроксигексаноатом). С использованием различных методов (испарение растворителя, солевое выщелачивание, холодное прессование, электростатическое формование) из данных образцов полимеров получены 2Б и ЗЭ матриксы: пленки, прессованные компактные и пористые формы, ультратонкие волокна и микрочастицы. Установлено, на структуру матриксов и физико-химические свойства поверхности влияют состав полимеров, техника изготовления, введение дополнительных компонентов (гидроксиапатит, полиэтиленгликоль). В зависимости от состава исследуемых ПГА показаны изменения таких параметров поверхности, как пористость, структура рисунка поверхности матриксов, при этом средние значения шероховатости матриксов из разных типов ПГА имели близкие значения. Наиболее гидрофобным представителем ПГА определен гомополимер ПЗГБ, у ПГА с включением 4-гидроксибутирата, 3-гидроксивалерата или 3-гидроксигексаноата отмечено снижение контактных краевых углов смачивания. Добавление ГАП и ПЭГ к полимеру приводило к изменению топографии поверхности, увеличению пористости матриксов и смачиваемости поверхности изделий.

Показано, что обработка Н202-плазмой матриксов, изготовленных из ПГА, повышает гидрофильность поверхности, способствует адгезии клеток и в дальнейшем положительно сказывается на их пролиферации и жизнеспособности, а также может быть использована в качестве способа стерилизации.

В исследованиях in vitro на примере фибробластов мыши линии NIH ЗТЗ показано, что матриксы, изготовленные из исследованных типов ПГА, не оказывают цитотоксического воздействия при прямом контакте и пригодны для изготовления клеточных носителей и других изделий медицинского назначения. Все исследованные типы ПГА хорошо поддерживали адгезию и пролиферацию клеток по сравнению с другим биоматериалом - полимером молочной кислоты.

Полученные положительные результаты в системах in vitro позволили перейти к исследованиям на лабораторных животных. В ходе медико-токсикологических исследований 2D матриксов при подкожной имплантации в течение 180 суток не было зафиксировано негативного влияния матриксов из ПГА на физиологические и биохимические характеристики животных, их поведение, рост и развитие, а также функции крови. В течение всего периода эксперимента не было отмечено неблагоприятных некротических проявлений, а также гнойного воспаления, кальцификации и малигнизации фиброзной капсулы вокруг полимерных имплантатов. Реакция тканей на ПГА-матриксы была сопоставима с реакцией на полилактид, но существенно менее выражена на ранних сроках после имплантации. Состав полимеров влиял на скорость деградации - наиболее устойчивыми были матриксы из ПЗГБ, наиболее быстро разрушались матриксы из ПЗГБ/4ГБ и ПЗГБ/ЗГГ. При этом деструкция всех полимерных пленок из ПГА была более медленная по сравнению с полилактидом, и сопровождалась более поздним развитием гигантоклеточной реакции. Результаты работы, полученные в экспериментах на клеточных культурах и лабораторных животных говорят о биосовместимости ПГА на клеточном, тканевом и организменном уровнях.

В целом, полученные данные свидетельствуют о пригодности полигидроксиалканоатов для использования в биомедицине.