Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биотехнология полигидроксиалканоатов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Биотехнология полигидроксиалканоатов"
На правах рукописи
2 О АВ Г 2009
ШИШАЦКАЯ Екатерина Игоревна
БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ: НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ
03.00.23 -Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Красноярск 2009
003475366
Работа выполнена в Институте биофизики Сибирского отделения РАН
Научный консультант: академик РАН, доктор
медицинских наук Гительзон Иосиф Исаевич
Официальные оппоненты:
академик РАН, доктор медицинских наук Пирузян Лев Арамович
доктор биологических наук Бондарь Владимир Станиславович
доктор медицинских наук, профессор Якимов Сергей Владимирович
Ведущая организация:
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
Защита состоится «6» октября 2009 года в 10-00 час. на заседании диссертационного совета Д 003.007.01 при Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д.50,стр.50, конференц-зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.
Автореферат разослан
Г &<Р
«3 »
2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета канд. биол. наук
Л.А.Франк
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Создание и изучение новых биосовместимых материалов, необходимых для современных реконструктивных медико-биологических технологий, является актуальной проблемой биотехнологии. Повышение эффективности лечения и качества жизни невозможно без внедрения в практику реконструктивной медицины высоких технологий с применением новых материалов высокой функциональности и специфичности, включая конструирование систем, способных воспроизводить биологические функции живого организма (Bioartificial organs, 1999; Биосовместимость, 1999; 1 Sudesh et al., 2000; 2004; Biopolymers, 2002; Biotechnology of Biopolymers: From Synthesis to Patents, 2004; Biopolymers, 2002; Biopolymers for Medicinal and Pharmaceutical Applications, 2005; Штильман, 2006; Хенч, Джонс, 2007). Активно развиваемый в настоящее время новейший подход - это создание биоискусственных органов и тканей, развитие которого делает необходимым освоение новых функциональных материалов (Шумаков, 1995; Шумаков с соавт., 2003; Штильман, 2006).
Получение фундаментальной основы для разработки и реализации новых материалов и устройств требует комплексных исследований. Для понимания механизма взаимодействия материалов и изделий из них с тканями организма необходимы глубокие исследования закономерностей ответа организма на инородное тело, характера регенераторного процесса, с одной стороны, и изучение «судьбы» (включая кинетику биоразрушения и динамику прочностных свойств) имплантируемого материала, с другой. Имплантированные материалы/изделия и живой организм при контакте подвержены взаимовлиянию, как правило, негативного характера, при этом характер и степень выраженности этого воздействия определяются как комплексом физико-химических свойств собственно материала, массой и геометрией имплантата, так и природой и силой ответных физиолого-биохимических реакций организма-хозяина. Поэтому для освоения новых материалов основополагающей задачей является необходимость глубокого изучения механизма совместимости материала с кровью, тканями и организмом; при этом необходимо ответить на следующие ключевые вопросы: 1) как собственно материал и изделия из него влияют на организм, 2) каков характер ответа организма на имплантацию материала/изделия, 3) под действием каких факторов ш vivo материал/изделие и каким образом изменяются. Эти исследования реализуются на стыке биотехнологии, химии высокомолекулярных соединений, биофизики, молекулярной и клеточной биологии, медицины и включают разработку новых материалов и переработку их в специализированные изделия; изучение механизма взаимодействия' материалов с тканями; оценку биотехнологических, физико-химических и медико-биологических свойств.
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в биотехнологии .материалов в последние годы, пока не удалось создать материалы, полностью
совместимые с живым организмом. Основными факторами, сдерживающими широкое применение остро востребованных биоразрушаемых полимерных материалов, являются небогатый ассортимент данных материалов, а также пока не решенная проблема регулируемости процессов их функционирования и деструкции в живом организме (Zhu et al., 2003; Liu et al., 2005, Yun et al., 2004; Balthasar et al., 2005; «Biotechnology of Biopolymers: From Synthesis to Patents», 2004; «Biopolymers for Medicinal and Pharmaceutical Applications», 2005; Штильман, 2007; Хенч, Джонс, 2007).
Открытие и изучение полигидроксиалканоатов (ПГА) - полиэфиров микробиологического происхождения, явилось значимым событием для биотехнологии новых материалов. ПГА - это термопластичные, биоразрушаемые и биосовместимые полимеры, сферы применения которых потенциально широки и могут включать восстановительную хирургию, клеточную и тканевую инженерию, трансплантологию. Исследование этих полимеров активно проводится всеми развитыми странами, однако многие ключевые вопросы биотехнологии и материаловедения ПГА остаются открытыми. Это вопросы, связанные с получением высокоочищенных образцов и способами получения из ПГА специализированных изделий медико-биологического назначения различных типов. Остаются не изученными в полной мере кинетика и закономерности биоразрушения этих полимеров in viro. Отсутствие четких представлений о механизме взаимодействия изделий из ПГА с клетками и тканями различной структуры, а также медико-технических характеристиках и эффективности их функционирования in vivo делают эти вопросы первоочередными для исследований.
Это определило направление исследований настоящей работы, ориентированной на комплексное исследование ПГА применительно к конкретным биомедицинским задачам: конструирование экспериментальных изделий из ПГА медико-биологического назначения и проведение всесторонних исследований закономерностей их взаимодействия с тканями и организмом для получения доказательства биосовместимости и функциональности как необходимой основы для внедрения в практику.
Цели и задачи исследования. Цель работы - комплексное исследование и экспериментальное обоснование применения биоразрушаемых полигидроксиалканоатов в качестве хирургических элементов, самостоятельных эндопротезов и систем доставки лекарственных средств.
Для достижения цели сформулированы следующие задачи:
1. На основе ПГА разработать семейство функциональных изделий медико-биологического назначения, исследовать физико-механические свойства, устойчивость к воздействию биологических сред и физико-химических факторов.
2. Исследовать биосовместимость ПГА в культурах клеток и в экспериментах на животных на уровне клеточного ответа, реакции тканей и всего организма
3. Изучить кинетику биоразрушения ПГА в биологических средах in vivo в зависимости от технологии переработки полимера, формы и места имплантации изделия.
4. Оценить эффективность ПГА в качестве биосовместимых эндопротезов, шовного материала, остеопластических имплантатов, для депонирования и доставки лекарственных средств.
Научная новизна. Сконструировано семейство экспериментальных образцов хирургических изделий и имплантатов биомедицинского назначения, разработанных из биоразрушаемых полимеров ПГА; впервые проведены комплексные исследования этих изделий. В культурах клеток и в экспериментах на лабораторных животных показана биологическая безопасность созданных полимерных изделий на уровне клеток, тканей и организма. Показано, что биодеградация ПГА in vivo реализуется гуморальным и клеточным путями с участием макрофагов и гигантских клеток инородных тел с высокой активностью клеточной и сывороточной кислой фосфатазы; течение процесса биоразрушения ПГА зависит от химической структуры полимера, формы и места имплантации изделия. Впервые исследована реакция различных тканей и закономерности регенераторного процесса в ответ на имплантацию изделий из ПГА и получены количественные данные, характеризующие реакцию тканей на имплантацию ПГА. Показано, что ответная реакция тканей характеризуется не продолжительным посттравматическим воспалением без образования выраженных фиброзных капсул и неблагоприятных реакций. Впервые изучена возможность применения полностью биоразрушаемых эндопротезов из ПГА для реконструкции желчевыводящих путей. Исследованы свойства серии объемных имплантатов из ПГА и доказано, что ПГА и композиты ПГА с гидроксилапатитом биоинертны и не вызывают цитотоксических реакций in vitro и воспалительных, некротических и иных негативных реакций in vivo; обладают остеопластическими свойствами, медленно деградируют и способствуют новообразованию костной ткани, обеспечивая нормальное протекание репаративного остеогенеза. ПГА исследованы в качестве матрикса для депонирования и доставки лекарственных средств; доказана безопасность разработанных форм в виде пленок, таблеток и микрочастиц при различных способах введения, изучено распределение и биодеградация полимерных микрочастиц во внутренних органах животных.
Практическая значимость. Разработано семейство изделий из высокоочищенных образцов ПГА, отвечающих требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям биомедицинского назначения. На основе изученных свойств растворов, расплавов, эмульсий и порошков определены параметры для переработки ПГА в специализированные изделия в виде шовных волокон, пленочных и объемных матриксов, микрочастиц, полимерных эндопротезов. Отработаны способы модификации структуры матриксов из ПГА с применением химических и физических методов, обеспечивающие получение функциональных матриксов (scaffolds) в виде гибких пленок и мембран, пригодных для клеточных технологий. Биологические и физико-химические
свойства полимерных изделий позволяют рекомендовать их для использования в различных областях реконструктивной медицины. Моножильный шовный материал из ПГА обладает необходимыми физико-механическими свойствами и пригоден для хирургии. Показана возможность использования ПГА для изготовления полностью биоразрушаемых эндопротезов, эффективных для реконструкции желчевыводящих путей. Разработанные объемные имплантаты из ПГА и в композиции с гидроксилапатитом пригодны для реконструкции дефектов костной ткани. Полимерные микрочастицы являются перспективной лекарственной формой для длительного функционирования in vivo при различных способах введения и позволяют осуществить местную доставку ангипролиферативных препаратов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Разработанная серия экспериментальных изделий из ПГА в виде плоских и объемных матриксов, шовного материала, биосовместимых эндопротезов, систем депонирования и доставки лекарственных средств; результаты их комплексных исследований, свидетельствующие об их биосовместимости и соответствии требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям медико-биологического назначения.
2. Характер взаимодействия разработанных полимерных изделий с биологическими тканями различной структуры (мышечной, костной, тканями внутренних органов); течение регенераторного процесса; ответная реакция тканей на имплантацию ПГА, характеризующаяся непродолжительным посттравматическим асептическим воспалением без образования выраженных фиброзных капсул и других неблагоприятных реакций.
3. Закономерности биодеградации полигидроксиалканоатов in vivo в зависимости от способа и места введения, реализуемой гуморальным и клеточными путями с участием макрофагальных клеток; возможность длительного функционирования полимерных изделий in vivo, от нескольких месяцев до года.
4. Экспериментальное обоснование возможности применения изделий из ПГА в качестве биосовместимых и функциональных эндопротезов, шовного материала, остеозамещающих имплантатов и матриксов для депонирования и доставки лекарственных препаратов.
Работа выполнена в рамках плановой тематики НИР Института биофизики СО РАН (№№ государственной регистрации: 0120.0 404601; 01.200703092) и при поддержке Министерства образования РФ и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) (гранты REC 002, RUXO-002-KR-06, Yl-B-02-07, Р1М0002, BG5202, BG8102), Международного научно-технического центра (МНТЦ-ISTC, проект № 2218), РФФИ (гранты №№ 05-04-08024офи-а, 07-03-00112-а, РФФИ-КФН 02-0497701), Красноярского краевого фонда науки (ККФН) (гранты №№ 9F154C, 13G028, 15G104, 16G104), Программы Президента РФ для молодых кандидатов наук (гранты №№ МК-4149.2006.4 и МК-577.2008.4), Фонда содействия отечественной науке-2008 года по программе «Молодые кандидаты наук»,
Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки-медицине» (проекты №№ 11.1, 12.5, 12.11, 20.11), Программы Интеграционных программ Сибирского отделения РАН (проекты № 14 «Стволовые клетки - основа клеточных биотехнологий будущего»; № 54 «Научные основы разработки новых лекарственных препаратов»; № 96 «Фундаментальные основы биотехнологического получения целевых продуктов и препаратов»); Программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенциала высшей школы», проекты №№ 2.1.1.528; РНП-11).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XXXVIII и XXXIX Международных конференциях «Студент и научно-технический прогресс», (Новосибирск, НГУ, 2000 и 2001); Южно-Сибирской международной научной конференции студентов и молодых ученых (Абакан, 2000); Второй республиканской конференции «Молодежь и пути России к устойчивому развитию» (Красноярск, 2001); Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001); II Объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН «Новые технологии в медицине» (Новосибирск, 2002); Сессиях научной молодежи Красноярского научного центра СО РАН (Красноярск, 2002, 2006); International Symposium on Biopolymers 2002 ISBP02 (Germany, Munster), II International Symposium on Biopolymers (UK, Kordif, 2003); Advanced Research Workshop (NATO Science Programme), "Macromolecular Approaches to Advanced Biomaterials Engineering Systems"(Sofia, Bulgaria, 2003); Конференции по Программе Президиума РАН "Фундаментальные науки-медицине» (Москва, 2003, Новосибирск, 2006, 2007); Ш-ей конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004); XI и XV научно-технической конференции с участием зарубежных специалистов «Вакуумная наука и техника» (Украина, Судак, 2004; Дагомыс, 2008); European Symposium on Biopolymers ESBP04 (S-Gallen, Switzerland, 2004); European Symposium on Biopolymers ESBP05 (Madrid, Spain, 2005); 3-й Международном биотехнологическом конгрессе "Bio - 2007" (Москва, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии создания и применения биокерамики в восстановительной медицине» (Томск, 2007); British-Russian Workshop in Association with the European Comission Stem Cell: Policy, Research, and Innovations Perspectives, (Москва, 2007); 4th European Congress on Biopolymers (Madrid, Spain, 2007); 4th Europen Symposium on Biopolymers ESBP07 (Turkey, Kusadasi, 2007); IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов с международным участием «Биохим-2008» (Новосибирск, 2008); XVI International Conference on Bioencapsulation (Dublin, Ireland, 2008), IV Всероссийском съезде трансплантологов памяти академика В.И. Шумакова (Москва, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 89 работ: монография, 42 статьи в центральных РФ и зарубежных журналах, включая 36 статей в журналах, входящих в список ВАК.
Вклад автора: Планирование и проведение всех экспериментов, обработка и анализ полученных результатов, подготовка публикаций.
Структура работы. Диссертация изложена на 260 страницах машинописного текста и содержит 22 таблицы и 94 рисунка; включает обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения (5 глав), заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 485 источника, в т.ч. 380 зарубежных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Введение. Во введении обоснована актуальность работы и ее вклад в решение проблемы освоения новых материалов медико-биологического назначения.
Аналитический обзор посвящен анализу литературы по биотехнологии материалов медицинского назначения и включает характеристику потребностей в новых биоматериалах, требования, предъявляемые к материалам медико-биологического назначения; проведен анализ результатов в области разработки и применения биоматериалов и изделий из них в медицине. В заключительном разделе анализируется современное состояние исследований полигидроксиалканоатов (ПГА) и перспективы их применения в реконструктивных технологиях.
Объекты и методы исследования. Исследованы образцы ПГА, полученные в Институте биофизики Сибирского отделения Российской Академии наук: полимер 3-гидроксимасляной кислоты (ПГБ) и сополимеры 3-гидроксибутирата и 3-гидроксивалерата (ПГБ/ПГВ) с включением гидроксивалерата от единиц до 30 мол %. Исследованы исходные образцы ПГА (полимер, выделенный из биомассы микроорганизмов), водные вытяжки, разработанные экспериментальные образцы изделий медико-биологического назначения в виде микрочастиц, моножильных волокон, пленочных и объемных плотных и пористых матриксов, полностью биоразрушаемых полимерных эндопротезов. Физико-химические свойства полимеров и разработанных изделий изучены с использованием хроматографии (Hewlett Packard, США), дифференциального термического анализа (синхронный термоанализатор STA 449 Jupiter (фирмы NETZCSH, Германия), сочетающего одновременное измерение изменений массы (термогравиметрия) и тепловых потоков, рентгеноструктурного анализа (рентгеноспектрометр D8 ADVANCE фирмы Bruker (Германия), электронной микроскопии (JEM-100C, Япония); физико-механические характеристики образцов регистрировали на универсальной электромеханической испытательной машине Инстрон 5565 (Великобритания).
Медико-биологические исследования ПГА и изделий из них включали клеточные системы in vitro и эксперименты на лабораторных животных. Цитотоксичность ПГА изучена в культурах клеток с регистрацией морфологии клеток, синтеза белка, пролиферативной активности (в тесте ММТ по реакции восстановления соли тетразолия митохондриальными дегидрогеназами живых и метаболически активных клеток с образованием окрашенных кристаллов формазана). Разрешение на проведение экспериментов с использованием
позвоночных животных получено от Комиссии Института биофизики СО РАН по биоэтике. Токсикологические и медико-биологические свойства полимерных изделий из ПГА различной формы исследованы в острых опытах на белых мышах линии Balb/c длительностью 7 суток; в каждой серии было задействовано по 8 животных в каждой группе (интактные животные, положительный контроль, экспериментальные группы) и в хроническом опыте на белых крысах Вистар. Биосовместимость и функциональные свойства шовных волокон из ПГА исследованы на крысах Вистар (180 суток, 90 животных); трубчатые эндопротезы - на беспородных собаках (100 суток, 20 животных); остеопластические свойства объемных имплантатов - на крысах Вистар: в тесте эктопического костеообразивания (45 суток, 15 животных) и на модели сегментарной остеотомии (90 суток, 72 животных); лекарственную эффективность и биосовместимость полимерных микрочастиц при различных способах введения - на крысах Вистар (133 животных) и белых лабораторных мышах (200 животных). Оценивали общее состояние животных, массу тела, вес, картину крови, микро- и макроскопию внутренних органов. Анализ периферической крови и биохимических показателей выполнены общепринятыми методами; анализировали общее содержание и фракции белка, остаточный азот, мочевину, креатинин; активность ферментов: кислой и щелочной фосфомоноэстераз (КФ, ЩФ), аланин- и аспартаттрансфераз (АЛТ и ACT). Исследование лимфоидной ткани проводили патоморфологическим анализом отпечатков региональных лимфатических узлов (ЛУ). Анализировали макро- и микроскопические характеристики внутренних органов (печени, почек, сердца, селезенки и легких). Реакцию тканей на имплантацию изделий из ПГА исследовали общепринятыми гистологическими методами. С использованием Image Analysis System «Carl Zeiss Jena» (Германия) проводили анализ изображений и морфометрические исследования срезов. Микроскопические исследования срезов тканей выполнены на электронном микроскопе ("JEM-100C" Япония). Биодеградацию изделий из ПГА изучали in vivo; показателями биоразрушения служили изменения массы, микроструктуры и физико-механических свойств изделия. Статистическая обработка результатов проведена с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel. Находили средние арифметические вариант и ошибки среднего. Достоверность отличия средних значений в контрольных и экспериментальных группах проверяли в зависимости от величины выборки по U-критерию Манна-Уитни и t- критерию Стьюдента (уровни значимости: 0,05 и 0,01).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Конструирование и исследование свойств полимерных изделий из ПГА медико-биологического назначения
Физико-механические свойства полимерных изделий зависят от способа получения и структуры и физико-химических свойств исходного полимера, а
свойства ПГА, в свою очередь, определяются химическим строением и могут значительно варьировать в зависимости от типа и соотношения мономеров в полимерной цепи, поэтому для сравнительного исследования взята серия высокоочищенных образцов гомополимера 3-гидроксимасляной кислоты (ПГБ) и сополимеров 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот (ПГБ/ПГВ) с различным соотношением мономеров. Показано, что молекулярная масса ПГА - вариабельный параметр; разброс величины у серии образцов составил от 180 до 720 кДа; степень полимеризуемости ПГА зависит в основном от технологии синтеза, выделения и очистки полимера. Температура размягчения ПГБ (Тр) лежит в диапазоне 110-115 °С, плавления Т„л - 170-185°С, разложения Тразл - 270-3 05°С. Для сополимеров ПГБ/ПГВ характерны более низкие значения параметров, снижающиеся с увеличением доли гидроксивалерата в полимере. У сополимерных образцов с соотношением гидроксибутирата и гидроксивалерата как 1:1 значения Тпл и Тразл составили, соответственно, 140 и 220°С. Включение гидроксивалерата существенно влияет на степень кристалличности полимера. Линейная зависимости СХ/ГВ наблюдается в диапазоне включения гидроксивалерата от единиц до 25-30 мол.%; образцы с более высоким содержанием гидроксивалерата (свыше 30-40 мол.%), также имеют значения кристалличности порядка 50%. Это связано с закономерностями кристаллизации мономеров и формированием кристаллической решетки. Охарактеризованный набор образцов ПГА с различным соотношением мономеров гидроксибутирата и гидроксивалерата, позволяет использовать материал с различными базовыми свойствами. Важно отметить, что, несмотря на снижение температурных характеристик у сополимерных образцов, разрыв между температурой плавления и температурой деградации сохраняется, следовательно, полимер сохраняет свойство термопластичности при значительной вариабельности степени кристалличности. Для получения специализированных полимерных изделий использовали образцы ПГА в виде растворов, эмульсий, расплавов и порошков,
1.1. Растворимость ПГА и получение изделий из растворов
Для отработки условий изготовления пленок изучено поведение растворов ПГБ и ПГБ/ПГВ различной концентрации в серии растворителей. Максимальная температура растворения образцов ПГА составила, соответственно, 60 °С для хлороформа, 80 °С для дихлорметана, 100 °С для диоксана и 140 °С для тетрахлорэтана. Вязкость растворов ПГА колебалась в широких пределах (1-1000 Паскаль/сек) в зависимости от концентрации раствора и температуры среды. Из растворов ПГА в хлороформе и дихлорметане методом полива на поверхность полированного металла или тефлона получена серия гибких прозрачных пленок толщиной от 0,016±0,002 до 0,1±0,01 мм, прочностью 4,0±0,28 кг/мм2, модуль упругости 130±28 кг/ мм2, удлинение при разрыве около 4%. Вычисленные на базе измеренных контактных краевых углов смачивания водой (0), характеристики поверхности матриксов из ПГБ и ПГБ/ПГВ имели близкие значения: поверхностного
натяжения (у) 34,66-36,18; свободной энергии межфазовой поверхности 6,357,00, величины сил сцепления (\УЯ1,) 100,81-102,63 эрг/см2. Показано, что пленочные матриксы из ПГБ и сополимеров ПГБ/ПГВ с различным включением гидроксивалерата обладают высокой биосовместимостью по отношению к культивируемым клеткам. Фибробласты мыши линии МН ЗТЗ хорошо адгезировали на поверхности всех типов матриксов и их количество было сопоставимо с контролем (стекло, полистерин). Морфология клеток, I культивируемых при прямом контакте с поверхностью матриксов, не отличалась от клеток в контроле; жизнеспособность клеток в тесте прижизненного окрашивания трипановым синим составила 99,8±0,2% Культивирование фибробластов в течение 3-х суток на поверхности данных 1 матриксов не влияло на время генерации клеток и синтез белка.
Для модификации и повышения гидрофильности матриксов проведена обработка их поверхности С02-лазером, мощность которого варьировала в ; диапазоне от 3,0 до 30,0 Вт. Получена серия пленок с измененной поверхностью, от выраженных шероховатостей до сквозных перфораций (рис. 1). Исследована микроструктура и свойства поверхности в зависимости от характера облучения и найдены условия, позволяющие снизить контактные краевые углы смачивания поверхности водой пленок до 50° (относительно 7680° у исходных изделий), то есть значительно повысить гидрофильность матрикса без разрушения структуры материала. Прикрепляемость фибробластов на таких матриксах была на 18% выше по сравнению с | исходными.
а б в
Рис. 1. Топография поверхности пленочных матриксов из полигидроксибутирата, обработанных лазером с различной мощностью (Р) излучения: 6,15 Вт (а); 8 Вт (б);9,0 Вт (в). Маркер 50 мкм
Для получения пористых матриксов использована техника введения в растворы полимера кристаллических наполнителей (хлорида натрия, сахарозы) с последующим выщелачиваем их водой и метод взаимодействия растворов ПГА и осадителей - тетрагидрофурана (ТГФ), диметилформамида (ДМФ), диоксана и воды. Изучены четыре системы «полимер-растворитель-осадитель» в весовом соотношении 10:80:10 (ПГБ/ПГВ-хлороформ-ТГФ, ПГБ/ПГВ-хлороформ-ДМФ, ПГБ/ПГВ-тетрахлорэтан-ТГФ и ПГБ/ПГВ-диоксан-вода); лучшие результаты получены для системы ПГБ/ПГВ-диоксан-вода. На основе
исследованных свойств полимерных растворов и их взаимодействия с осадителями отработаны условия получения высокопористых полимерных матриксов с различными размерами пор, от 5-10 до 50-100 мкм (рис.2 б).
Рис. 2. Ультраструктура пленочных матриксов из полигидроксибутирата гибкая пленка !а). маркер 10 мкм; мембрана, полученная с применением техники выщелачивания (о). маркер 10 мкм; мембрана, полученная осаждением трехкомпонентной системы «ПГБ-хлороформ-тетрагидрофуран» (в), маркер 20 мкм
Исследованы условия для получения из ПГА матриксов в виде ультратонких волокон и микрочастиц методами наногехнологии (техникой микроинкапсулирования и электростатического формования (ЭСФ). Первый пример использование метода ЭСФ для получения ультратонких волокон из ПГА реализован на примере сополимера ПГБ/ПГВ (рис. За). Изучено влияние плотности полимерных растворов и параметров формования на диаметр и качество получаемых волокон, в результате выявлены оптимальные условия, позволяющие получать однородные волокна диметром от 1 до 5 мкм.
Рис. 3. Ультраструктура матриксов. полученных из полигидроксибутирата; ультратопких волокон (а), маркер 10 мкм; микрочастиц (б, в), маркер 10 и 5 мкм
Методы микроинкапсулирования позволяют получать микро- и наноразмерные частицы, которые в силу высокой развитости поверхности имеют большие перспективы не только для разработки систем доставки лекарственных средств, но и в качестве матриксов для выращивания клеток. Исследование применимости ПГА для этих целей показало возможность получение микрочастиц хорошего качества и различного диаметра. Выявлено влияние техники изготовления (типа эмульсии и способа диспергирования, температуры среды) на выход микросфер, их структуру и размер. С
применением технологии испарения растворителя из двух- и трехкомпонентной эмульсий на основе ПГА отработана процедура стабильного получения микросфер высокого качества (рис. 3 б-в).
1.2.Переработка ПГА из расплава
Наличие у ПГА выраженного диапазона между температурой начала плавления (150-160 °С) и температурой начала разложения (260-280 °С) позволяет получать из них изделия общепринятыми термическими методами переработки материалов. С использованием лабораторного мини-экструдера (ВгаЬепс1ег, Германия) из расплавов ПГБ и ПГБ/ПГВ получены различные изделия: плотные гибкие пленки толщиной от 0,2 до 1,0 мм и пластины толщиной от 2,3 до 8,0 мм. Физико-механические характеристики пленочных полимерных матриксов и полимерных пластин, полученных из расплавов ПГА, выше на 25-38%, чем у аналогичных изделий, полученных растворными технологиями. Волокна (диаметром 0,10-0,35 мм), полученные из расплавов ПГБ и сополимера ПГБ/ПГВ, характеризуются высокими физико-механическими свойствами (абсолютная прочность до 306 МПа, модуль упругости -3 ГПа, удлинение при разрыве 24 %).
1.3. Объемные имплантаты из ПГА и композитов ПГА с гидроксилапатитом
Для целей репаративного остеогенеза сконструирована серия объемных имплантатов из полигидроксибутирата и композитного материала полигидроксибутират/гидроксилапатит (ПГБ/ГАП) различных размеров и формы. Наполнение полимера гидроксилапатитом значительно влияло на гидрофильность полимерных конструкций. Влагопоглощение у образца с самым низким (10 %) содержанием ГАП оставило 2,3 % и возрастало практически линейно с ростом содержания ГАП, достигнув 18,9 % у образца, в котором соотношение ПГБ:ГАП было равным 50:50; таким образом, варьируя соотношение составляющих возможно получение биоматериала различной степени гидрофильности. Все матриксы из композита имели более низкий начальный краевой угол смачивания; при наполнении полимера ГАП на 10 и 50% показатель составил, соответственно, 68° и 46°; при этом степень кристалличности (Сх) композитов в целом выше (81-89 %), чем у ПГБ (67-73 %). Самые высокие значения Сх характерны для образцов с высоким содержанием ГАП - 40 и 50 %. Наполнение ГАП не влияло на температуру плавления, но изменяло температуру деградации композитного материала: с ростом содержания ГАП от 10 до 50 % температура деградации композита снижалась от 260 до 225°С. Из композитов ПГБ/ГАП и образцов полимера (ПГБ и ПГБ/ПГВ) методом прямой холодной компрессии сформованы плотные объемные конструкции (рис. 4), которые имели абсолютную прочность до 3040 МПа, модуль Юнга 4-6 ГПа. Композитные изделия имели в целом более высокие значения обоих показателей. У сополимерных образцов ПГБ/ПГВ с
наполнением на 20% гидроксилапатитом, максимальные значения абсолютной прочности - 40 и 65 МП соответственно, модуль Юнга 8-11 ГПа. Важно отметить, что конструкции поддаются механической обработке, что позволяет придавать образцам различную форму.
|
Рис. 4. Объемные имплантаты для
репаративного остео-генеза (маркер 1 см) \
Разработанные матриксы характеризуются высокой адгезионной ¡ способностью и пригодны для культивирования клеток in vitro. Лучшие результаты получены для матриксов с содержанием ГАП до 20%.
Установлено, что для стерилизации разработанных полимерных изделий пригодны общепринятые методы: автоклавирование в течение 45 мин при 120 °С (1,1 атм) и 130 °С (2,0 атм), сухожарочная обработка при 105-130 °С, у-облучение (доза 2,5 Мрад), обработка стерилизующими жидкостями. Все методы, стерилизации не влияют на прочностные свойства изделий, а также структуру и свойства поверхности изделий из ПГА.
I
Экспериментальные исследования биосовместимости и эффективности применения полимерных конструкций и эндопротезов из ПГА
Для выявления механизма взаимодействия имплантатов из новых биоматериалов с тканями организма необходимо комплексное исследование закономерностей местного регенераторного процесса тканей, реакции целого организма, а также наблюдения за состоянием имплантированного материала. В отношении ПГА в настоящее время отсутствуют четкие представления о механизме взаимодействия полимеров различной химической структуры и ! устойчивости in vivo при кратковременном или длительном функционировании. Разработанные полимерные конструкции различной формы и массы позволили ввести их в мышцу, кость, кровоток, внутренние органы и впервые исследовать реакцию различных тканей на имплантацию ПГА.
2. Результаты исследования полимерных волокон
Исследования биосовместимости и функциональных свойств ¡ разработанных полимерных изделий были начаты с определения реакции на ПГА скелетной мышечной ткани на модели ушивания мышечно-фасциального разреза экспериментальными моножильными шовными волокнами, полученными из ПГА двух типов - ПГБ и ПГБ/ПГВ. Целью работы было оценить не только биологическую совместимость волокон, но и определить,
II*
обладают ли они необходимой прочностью, адекватной требованиям, предъявляемым к хирургическому шовному материалу. Динамика деградации и прочностных свойств волокон из ПГА ш vivo изучена при непосредственном контакте с тканями животных, а также дополнительно в диффузионных камерах, помещенных подкожно в шейную складку крыс, что исключает контакт материала с окружающими тканями и препятствует формированию фиброзной капсулы вокруг него; это позволяет исследовать биостабильность и биоразрушение материала с точки зрения истинной клеточной деструкции (Розанова, 1999).
2.1. Биодеградация ПГА in vivo
Биодеградация полимерных волокон in vivo весьма замедлена по сравнению с современными разрушаемыми шовными волокнами на основе полимолочной и полигликолевой кислот. Волокна, имплантированные в мышцу, где они, помимо воздействия ферментов тканей и клеточных элементов, дополнительно подвержены динамическим нагрузкам, сохранили целостность в течение 1 года. Для изучения процесса биодеградации ПГА образцы волокон, расположенные внутри силиконовых диффузионных камер, вводили в шейную складку крыс. Камеры периодически извлекали и оценивали состав жидкости, внешний вид, массу и физико-механические свойства волокон. В начальный период наблюдения (до 60 суток) изменение массы волокон были менее значительными по сравнению с последующим периодом (90-180 суток). Спустя 180 суток остаточная масса волокон из ПГБ и ПГБ/ПГВ составила 74 и 62% соответственно, при этом убыль массы сополимерных волокон была выше. Физико-механические свойства волокон изменялись незначительно; за 180 суток экспозиции камер in vivo абсолютная прочность волокон, изготовленных из ПГБ и ПГБ/ПГВ снизилась, соответственно, до 5,2 и 6,0 Н, то есть всего на 33-35% от исходных значений. Анализ клеточного содержимого диффузионных камер показал увеличение в них количества клеток макрофагального ряда за счет одноядерных макрофагов, а также гигантских клеток инородных тел (ГКИТ). Состояние волокон через 90 суток после имплантации не изменилось. Существенных дефектов на их поверхности не было отмечено, несмотря на достоверное уменьшение массы. В более поздние сроки (120 и 180 суток) на поверхности волокон отмечено наличие адгезированных клеток, после удаления которых в ряде случаев наблюдали мелкие локальные дефекты, возможно, явившиеся результатом лизосомальной деятельности полиядерных макрофагов, доля которых в клеточном содержимом камер в эти сроки составляла 20-30% от общего числа клеток. Таким образом, биоразрушение ПГА in vivo происходит при постепенном разрушении материала с поверхности волокон без образования грубых дефектов и резкой потери прочности. Активное участие в этом процессе принимают макрофаги и гигантские клетки инородных тел. В окружающих волокна тканях видно присутствие большого количества макрофагов, ГКИТ и нарастание активности кислой фосфатазы, определенной по Гомори, которая
служит надежным показателем интенсивности биодеструкции полимерных материалов (Пхакадзе с соавт., 1982; Gogolevskii е1 а!.,1993).
Рис. 5. Гистохимическая реакция тканей на кислую фосфатазу (КФ) по Гомори: 1(а), 2(6) и 4(в) недели после имплантации ПГБ волокон. Обозначения: п-полимерная нить, м-макрофаги, ГКИТ- гигантские клетки инородных тел. Маркер
- 0.01 мм
Одновременно с результатами гистохимических исследований отмечено у величение активности КФ в сыворотке крови экспериментальных животных, от 5-7Ед/л в начале наблюдения, до 20-25 Ед/л вконце.
2.2. Оценка биосовместимости шовного материала из ПГА
Исследования биосовместимых и функциональных свойств моножильных шовных волокон, изготовленных из ПГБ и ПГБ/ПГВ, проведены на крысах Вистар, которым под ингаляционным наркозом в асептических условиях на правом бедре делали продольный разрез кожи и мышцы длиной 2 см, на мышцу накладывали три одиночных узловых шва из испытуемого материала (общая длина 3,0-3,5 см), кожу ушивали шелком. Животные были распределены на пять групп: I группа - отрицательный (интактный) контроль; II группа -положительный контроль (хирургический шелк); III группа -биодеградируемая нить сравнения (кетгут); IV группа - экспериментальная нить из сополимера ПГБ/ПГВ, включение гидроксивалерата 15 мол%; V группа
- экспериментальная нить из ПГБ. Учитывая возможные проявления токсичности ПГА и принимая во внимание литературные данные о функциональных реакциях организма, имеющих место при испытаниях новых биоматериалов, исследовали физиологические и биохимические показатели, комплексно отражающие состояние животных.
Наблюдения за поведением животных показало, что в течение всего I эксперимента все животные в экспериментальных группах были здоровы и активны, равномерно прибавляли в весе. Достоверных изменений по -сравнению с контрольными группами обнаружено не было. Относительные массы внутренних органов у животных всех экспериментальных групп также не отличались от таковых в контроле. Анализ морфологического состава периферической крови показал, что в основном эти показатели находилось в
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
¡3 ) ■
й)® •
О) ■
(4) ■
■¡¡¡о) • ■
(2?;. ■
■
г5; -® ■
&-
гф -
14; -
гй). ® -
,41) -
Оо;.
.'V .
(271 .
С.5:. '21^ .
пределах физиологических величин и не отличались существенно у животных экспериментальных групп относительно контролей. Функциональное состояние почек животных оценивали по количеству мочевины, креатинина и остаточного азота в сыворотке крови. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии негативного влияния ПГА на показатели азотного обмена и функцию почек животных. Содержание белка и его фракций в основном массиве данных оставались в норме. Для оценки дезинтоксикационной функции печени исследована в динамике активность печеночных ферментов, аланин- и аспартаттрасфераз, значения которых в ходе всего эксперимента оставались у всех животных экспериментальных групп в пределах физиологической нормы.
Отсутствие достоверных различий между всеми животными по всему комплексу физиолого-
биохимических показателей,
включающему 26 параметров (весовые показатели массы животных и внутренних органов, морфологии и биохимии крови) в течение всего эксперимента подтверждено кластерным
анализом, включая начальный постоперационный период (1, 2 и 4 недели, когда были отмечены достоверные отличия по наибольшему числу показателей между группами), не выявили достоверных отличий между группами сравнения и
контрольными (рис. 6).
Рис.6. Результаты кластерного анализа: 1,2,3 и ... до 45 - животные по группам (1-9 интактный контроль; 10-18 - нить шелк, 19-27 - нить кетгут, 28-36 - нить ПГБ/ПГВ, 37-45-нить ПГБ)
В связи с тем, что реакция организма на воспаление может сопровождаться изменениями в состоянии иммунной системы, проявления иммунных реакций опережают показатели крови и
надежно фиксируются в периферических органах иммуногенеза, исследовано
состояние лимфоузлов (ЛУ) животных. Во всех группах животных макроскопически ЛУ не изменены, их размеры были в пределах нормы. Достоверных изменений в соотношении клеточных популяций ЛУ у экспериментальных групп относительно контролен не выявлено. В течение всего наблюдаемого периода доминирующей популяцией были малые лимфоциты; соотношение зрелых и делящихся клеток также не изменилось. Это свидетельствует об отсутствии влияния имплантированных в мышцу животным полимерных волокон из ПГА на периферические органы иммунитета и продукцию ЛУ иммунокомпетентных клеток. Макроскопические исследования внутренних органов животных не выявили в них патологических изменений.
2.3. Реакция мышечной ткани на имплантацию волокон из ПГА
Изучение процесса взаимодействия в системе «имплантаты ПГА-ткани» включало анализ реакции и морфогенеза тканей на имплантированные нити с учетом силы и длительности воспаления, динамики образования и инволюции фиброзной капсулы и ее клеточного состава, времени развития и созревания коллагеновых волокон, а также состояния шовных волокон в сроки 1, 2, 4, 8, 16 и 24 недели после операции.
Функциональные свойства шовного материала из ПГА оценены положительно. Макроскопические исследования постоперационных швов показали, что моножильные волокна из ПГБ и ПГБ/ПГВ, аналогично
швы мышечно-фасциального разреза в течение
наблюдаемого периода у всех | животных. Реакция тканей на оперативное вмешательство и последующую имплантацию шовного материала из ПГА обоих типов протекала по обычной схеме, характерной -для раневого процесса и реакции на инородное тело (рис.7).
Рис. 7. Морфология тканей вокруг волокон, изготовленных из ПГА (а) и кетгута (б), имплантированных в мышцу крыс в разные сроки наблюдения. Обозначения: фк-фиброзная капсула; .«<?-мышечные волокна.
Гематоксилин-эозин. Маркер 0,01 мм
материалам сравнения, надежно удерживал
I
19
Ответная реакция тканей по силе была аналогичной реакции мышц на шелк, и существенно менее выраженной в сравнении с реакцией на кетгут. Микроскопическая картина в месте имплантации ПГА нитей обоих типов на 7-е сутки после операции характеризовалась незначительным отеком тканей вокруг имплантированных нитей, лейкоцитарной инфильтрацией и единичными ' тонкими зонами некроза. Через 2 недели признаки воспаления уменьшились, незначительная отечность тканей вокруг всех имплантатов сохранялась; в зоне ; воспаления по-прежнему встречались лейкоцитарные клетки; отмечено начало : формирования вокруг имплантатов фиброзных капсул.
¿16 л с
1 2 4 8 16 24
Время, недели
■ ПГБ 0ПГБ/ПГВ §3 шелк Окетгут
Рис.8. Морфометрические показатели реакции мышечной ткани на имплантацию шовных волокон из ПГА и традиционного шовного материала в разные сроки наблюдения
Через 4 недели толщина фиброзных капсул вокруг нитей из ПГА составила 172.23±13,64 мкм. Это было сопоставимо с реакцией на шелк и значительно меньше показателей в месте имплантации кетгута. Вокруг нитей из ПГА продолжало увеличиваться количество активных, с большим количеством выростов и клеточных лизосомальных структур макрофагов, до 11-12 в поле зрения. Капсулы в основном были представлены фибробластами и коллагеновьши волокнами, которые начинали формироваться в пучки. Через 8 недель гистологическая картина тканей в зоне имплантации
экспериментальных и контрольных нитей оставалась практически без изменений, как и толщина капсул и их клеточный состав. Спустя 16 недель вокруг нитей из ПГА зафиксировано значительное истончение капсул, их средняя толщина сократилась до 54,09±3,28 при рядности фибробластов на уровне 4,64±0,37; количество активных макрофагов в тканях, примыкающих к имплантату, по-прежнему оставались на высоком уровне. Через 24 недели отмечена дальнейшая инволюция фиброзных капсул вокруг шовного материала из ПГБ и ПГБ/ПГВ, при этом ТК уменьшились, соответственно, до 48,02±5,25 и 33,73±2,05 мкм (рис.7,8).
Спустя 9 месяцев толщина капсул вокруг экспериментальных нитей составляла 20-40 мкм, они были окружены здоровыми тканями из вновь сформированных волокон, которые ориентированы вокруг полимерного имплантата. Через 12 месяцев фиброзной капсулы вокруг имплантатов практически не наблюдали. В непосредственной близости с полимерной нитью, по ее окружности, а также в примыкающих тканях по-прежнему фиксировали значительное количество моно- и полиядерных макрофагальных клеток (рис.9). В эти сроки, несмотря на присутствие ПГА в мышечной ткани животных, отрицательной реакции тканей на инородное тело не зафиксировано.
а б
Рис.9. Макрофагальная инфильтрация в зоне имплантации ПГА: а-макрофаги на поверхности полимерного имплантата. маркер 1 мкм: б- ГКИТ в структуре фиброзной капсулы вокруг волокон. изготовленных из ПГА: маркер 0.01 мм. Обозначения: ГКИТ- гигантские клетки инородных шел: м-макрофаги
г
I 21
В целом, показано, что реакция тканей на ПГА сопоставима с реакцией I на хирургический шелк и по силе и длительности асептического воспаления ! выражена в меньшей степени по сравнению с реакцией на разрушаемый кетгут. Ответ тканей на имплантацию ПГА характеризуется типичной реакцией на инородное тело в виде непродолжительного асептического воспаления и пролиферации с выраженной макрофагальной стадией, приводящих к образованию фиброзной капсулы вокруг имплантата, которая спустя 4-6 месяцев подвергается инволюции, достигая толщины 40-60 мкм. ! Соединительно-тканные капсулы вокруг материалов сравнения подвержены | инволюции в значительно меньшей степени. В целом, установлено, что экспериментальные образцы шовного материла из ПГА обладают необходимой прочностью в течение всего периода заживления мышечно-фасциальных ран и 1 не уступают по функциональным характеристикам традиционным шовным материалам.
3. Исследование эффективности применения ПГА для конструирования биосовместимых эндопротезов
Материалы для изготовления эндопротезов, используемых для реконструктивных операций на сосудах и внутренних органах, остро востребованы. Для повышения биосовместимости эндопротезов исследуются различные подходы, включая нанесение специальных покрытий на металлические изделия и создание полностью биоразрушаемых полимерных стентов. Возможность использования ПГА для конструирования эндопротезов исследована в настоящей работе.
3.1. Разработка экспериментальных моделей эндопротезов из ПГА
Использованы высокоочищенные образцы ПГА на основе разработанной методики (Шишацкая, 2003; Севастьянов с соавт., 2003), обладающие | тромборезистентностью и не инициирующие ферментные системы крови. ! Разработаны три модели стентов: ячеистой структуры, спиральный и
-( трубчатой. Прототип ячеистого внутрисосудистого стента был изготовлен I методом плетения из полимерных волокон диаметром 0,2 мм, полученных ! экструзией из расплава ПГБ с последующим ориентированием. Для закрепления волокон в месте переплетения последних применяли термическую обработку или полимерный раствор высокой плотности. Созданные I экспериментальные образцы прототипа полностью разрушаемого полимерного ' стента диаметром от 4 до 6 мм и длиной 40-60 мм. Стенты спиральной структуры изготовлены из фрагментов предварительно изготовленной плотной полимерной пленки из ПГБ шириной 2 мм и длиной 120 мм.. Полимерным полоскам придавали форму спирали с использованием нагретых до температуры деформации полимера металлических стержней. Стенты обеих конструкций имели удовлетворительные значения прочностных показателей: модуля Юнга 1,5-2,3 и абсолютной прочности от 15 до 20 МПа.
Для конструирования трубчатого стента были использованы растворы ПГБ. которые наносили на поверхность стеклянной матрицы. После испарения растворителя сформированную полимерную трубочку снимали с матрицы. Получена серия трубчатых стентов различного диаметра, толщины и прочности, гладкие и со складчатой поверхностью. Абсолютная прочность трубчатых стентов составила до 25 МПа; стенты сохраняли эти показатели при экспонировании в фосфатном буфере в течение 100 суток.
3.2. Исследование экспериментальных моделей полностью разрушаемых стентов из ПГА
Впервые исследованы модели полностью биоразрушаемых стентов, изготовленных из ПГА для эндобилиарного протезирования.
Экспериментальные образцы стентов трубчатой структуры, изготовленных из сополимера ПГБ/ПГВ, были имплантированы в общий желчный проток животным (беспородные собаки весом 10-12 кт) с фиксацией к стенке протока моножильным шовным материалом из ПГБ/ПГВ; однорядный холецистодуоденоанастомоз также был наложен шовным материалом из ПГБ/ПГВ (рис.10).
Рис. 10. Внешний вид экспериментальных трубчатых эндопротезов и шовных волокон из сополимера ПГБ/ПГВ (а). После выполнения верхнесрединной лапаротомии верифш1ирован желчный проток и произведена холедохотомия. Стент имплантирован в супрадуоденальную часть желчного протока (б) и фиксирована к стенке протока моножильным волокном, изготовленным из ПГБ/ПГВ (61
Группе сравнения были установлены стенты из силикона и наложен холецистодуоденоанастомоз с помощью шовного материала «Викрил»; негативным контролем служили интактные животные. В раннем послеоперационном периоде всем животным проводили антибиотикопрофилактику цефтриаксоном, вводили анальгетики и спазмолитики.
Все животные удовлетворительно перенесли оперативное вмешательство; выживаемость составила 100%. Наблюдения осуществляли в течение 100 суток. Анализ состава периферической крови в контрольной и исследуемой группах показал, что в основном эти показатели находились в границах физиологической нормы. В лейкоцитарной формуле крови во все сроки
наблюдения выявили незначительный постоперационный лейкоцитоз, от 10 до 12*109/л, и повышение СОЭ до 10-15 мм/ч у всех оперированных животных относительно интактного контроля. У животных в группе положительного контроля повышение СОЭ сохранялось до конца наблюдения. Анализ результатов определения мочевины, общего белка в сыворотке крови свидетельствует об отсутствии негативного влияния имплантированных полимерных изделий из ПГА на показатели азотистого обмена и функцию почек. Достоверных различий между группой сравнения и исследуемой группой среди показателей, характеризующих функцию поджелудочной железы (амилаза крови), также выявлено не было. У животных группы сравнения с 30-х суток было зарегистрировано умеренное повышение уровня общего билирубина, которое было обусловлено нарушением оттока желчи. В экспериментальной группе содержание общего билирубина, основного маркера холестаза, было в границах нормы.
Во время аутопсии оценивали наличие выпота, спаечного процесса в свободной брюшной полости и подпеченочном пространстве, внешний вид желчного протока в области нахождения протеза, внешний вид холецистоэнтероанастомоза, печени и двенадцатиперстной кишки. У животных, которым был установлен стент из силикона, на аутопсии имело место незначительное количество серозного выпота, в подпеченочном пространстве - умеренный спаечный процесс; в области установки стента определялась инфильтрация, расширение протока, рубцовые изменения. Слизистая протока в месте контакта со стентом имела бледно-розовый цвет, отмечались участки атрофии. Стенты были хрупкими, в конце опыта на них имелись отложения солей и пигментов желчи; отмечен умеренный воспалительный процесс со стороны слизистой; швы, наложенные Викрилом, были состоятельными с незначительной инфильтрацией. При морфологическом исследовании препаратов протока, желчного пузыря, двенадцатиперстной кишки, печени у животных отмечены признаки воспалительной клеточной реакции и фиброза. В печени определялись признаки холестаза, разрушение гепатоцитов и балок. В зоне анастомозов также присутствовали признаки воспалительной клеточной реакции, множество лейкоцитов, макрофагов, грубая рубцовая ткань.
У животных экспериментальной группы на аутопсии патологии в свободной брюшной полости и подпеченочном пространстве не выявлено. Стенты, изготовленные из ПГБ/ПГВ, сохраняли первичные физические характеристики, не были подвержены процессам кальцификации, не было отмечено сужения просвета стентов, их внутренний диаметр составил 3,5±0,1мм. При макроскопическом исследовании
холецистодуоденоанастомозов со стороны слизистой данных за наличие воспалительных, инфильтративных и Рубцовых изменений не отмечено (рис.11); все анастомозы функционировали. Просвет анастомоза в среднем составил 12,3±4,3 мм.
Рис. 11. Гистологическое строение зоны анастомоза двенадцатиперстной кишки собаки с использованием шовного материала из сополимера ПГБ/ПГВ: А-сооственный слой мукозной мембаны; Б -мышечный слой- гладкомышечные клетки; В - субмукозный слой. Окраска гематоксилин-эозин; увеличение х 200
Морфологическое исследование участков желчного протока и желчного пузыря у экспериментальных животных патологических изменений не выявили (рис.12).
Рис. 12. Слизистый (а) и мышечный (б) слой желчного протока в месте имплантации трубчатого стента из ПГБ/ПГВ. Окраска гематоксилин-эозин, увеличение х 200
Желчный проток в месте установки стента имел обычный вид; миграции стентов не отмечено. Просвет протока у всех животных был сохранен, имел обычные размеры (0.4-0,5 мм). Общий желчный проток выстлан слизистой оболочкой со складчатым высоким цилиндрическим эпителием с .микроворсинками. Эпителий располагается на собственной пластинке слизистой, которая представлена рыхлой соединительной тканью, а вся слизистая лежит на слое гладкомышечной ткани, между которыми располагается соединительная ткань и эластические волокна. Серозная оболочка желчного протока представлена тонким слоем мезотелия. Морфологическая картина подтверждает отсутствие воспалительной клеточной реакции. В результате процесса биоразрушения ПГА к концу эксперимента отмечено уменьшение массы стентов на 30-35% от исходной: толщина стенки стентов несколько уменьшилась, в среднем 0.05-0.08 мм, с сохранением изначального диаметра изделий - 3.5±0,1мм.
Таким образом, физиологические, биохимические и морфологические исследования животных экспериментальной группы, которым были имплантированы экспериментальные стенты из ПГА, не выявили данных, свидетельствующих о том, что полимерные изделия (стенты и моножильные волокна) вызывают патологические реакции тканей желчевыводящих путей. Это позволяет заключить о перспективности применения ПГА для конструирования эндопротезов для эндобилиарной хирургии.
4. Биосовместимые и остеопластические свойства объемных имплантатов из ПГА
Конструирование полимерных композитных материалов для регенерации костных тканей является актуальной и сложной задачей. Успех создания и применения костнозамещающих имплантатов зависит от многих составляющих. Остеозамещающие имплантаты должны обладать биосовместимостью, многофункциональностью, достаточной механической прочностью и возможностью стерилизации без изменения свойств. ПГА представляют интерес для реконструкции дефектов костной ткани, так как обладают высокой механической прочностью, а скорости их разрушения in vivo в несколько раз ниже, чем у других известных биоразрушаемых материалов, что позволяет рассматривать ПГА для длительно текущей регенерации дефектов костной ткани.
4.1. Исследование бносовместнмости полимерных (Г1ГБ, ПГБ/ПГВ) и композитных (ПГБ/ГАП) имплантатов
Исследования биологической совместимости разработанных объемных полимерных имплантатов из ПГА и композита ПГА с гидроксилапатитом выполнены в культуре клеток при прямом контакте с экстрактами, полученными из этих изделий. Тестирование потенциальной цитотоксичности экстрактов проведено в первичной культуре остеобластов. Тест с трипановым синим показал, что 7-дневные экстракты не вызывают грубых морфологических изменений клеток и их гибели. Различий между биологическим действием экстрактов ПГБ и сополимерных образцов ПГБ/ПГВ не выявлено, что согласуется с ранее полученными результатами при тестировании полимерных пленок и волокон из ПГБ и сополимеров ПГБ/ПГВ с различным включением гидроксивалерата. Экстракты, полученные из композита ПГА/ГАП, наполненного гидроксилапатитом на 10, 20 и 30 % не влияли на состояние клеток, число которых варьировало в пределах 90-100 % и статистически не отличалось от показателей в контроле (экстракт культурального полистерина). Только продукты экстракции биологического ГАГ1 и образцов композита ПГБ/ГАП с соотношением компонентов 50:50 по массе вызывали на 20-22% снижение прикреиляемости клеток по сравнению с контролем, что может быть связано с присутствием в исходном биологическом ГАП аморфных (нестехио.метрических, растворимых) фракций фосфатов
кальция, влияющих на активную реакцию среды, а также прикрепляемость и пролиферацию клеток (ОгеГй й а1, 1998). Результаты тестирования остальных образцов не выявили отклонений от контроля.
Пролиферативный потенциал матриксов исследован в культуре остеобластов. Клеточную пролиферацию определяли после 10-ти суток культивирования, используя ММТ-тест с одновременным определением активности щелочной фосфатазы (рис. 13). Количество пролиферирующих остеобластов было несколько выше на композитных (ПГБ/ГАП) матриксах по сравнению с матриксом из ПГБ, не содержащем гидроксилапатита. Наибольший прирост клеток зафиксирован на матриксах из композита с содержанием гидроксилапатита 10 и 20%, соответственно, 240 и 260 х 106, гидрофильная поверхность гибридных матриксов способствовала более активной прикрепляемости клеток, в результате этого исходная концентрация прикрепленных клеток на ПГБ/ГАП была выше, чем на гидрофобном матриксе из ПГБ. При более высоком содержании ГАП в композите (50% по массе) плотность клеток была ниже, однако достовернее выше, чем на ПГБ-матриксе. Активность щелочной фосфатазы, которая является маркером дифференцировки остеобластов, была достоверно выше на всех типах матриксов, содержащих ГАП, по сравнение с клетками, растущими на матриксе из ПГБ. При этом наибольшей активностью обладали клетки, растущие на матриксах с невысоким содержанием ГАП (10 и 20%), соответственно, 4,2 и 4,6 мМ/мин- клетка.
300 250 -200 150 100 -50
концентраци» клеток (1 Лмл)
rh
rh
А
л
rh
3 •
ЩФ (мМ/мин клет*а х 10е)
Hi
rh
rh
rh
Рис. 13. Пролиферация остеобластов крысы в тесте ММТ (А) и активность щелочной фосфатазы (ЩФ) (Б) in vitro на 10-й день культивирования на композитных матриксах ПГБ/ГАП с содержанием гидроксилапатита 10, 20, 30, 40 и 50 вес. % (2,3,4 и 5, соответственно) по сравнению с матриксом из ПГБ (1)
Исследование возможного общетоксического действия имплантатов из ПГБ и композита ПГБ/ГАП выполнено в остром опыте на белых мышах линии ВАЬВ/с, которым подкожно были имплантированы матриксы разных типов, изготовленные из полимера (ПГБ и ПГБ/ПГВ) и композита ПГБ/ГАП с
различным соотношением компонентов.
Внешних проявлений интоксикации у животных после операции и введения всех типов имплантатов в течение всего наблюдаемого периода не выявлено. Отклонений в массе тела, массе внутренних органов у экспериментальных животных относительно интактных животных не отмечено. Макроскопические исследования внутренних органов животных не выявили каких-либо патологических изменений. Макроскопический анализ тимуса и селезенки (центральных органов иммунной системы) и динамика их массы в эксперименте по сравнению с контрольными животными показали отсутствие у животных выраженных иммунных реакций на имплантированные матриксы. Колебания концентрации количества эритроцитов и лейкоцитов в крови находились в пределах физиологических величин; сдвигов в лейкоцитарной формуле крови всех экспериментальных животных также не выявлено. Исследование реакции тканей на подкожную имплантацию изучаемых объемных матриксов в конце эксперимента показало отсутствие у животных признаков выраженной воспалительной реакции. Не выявлено значительной инкапсуляции имплантатов, что свидетельствует о слабом раздражении клеток соединительной ткани. Ответная реакция соединительной ткани, связанная с развитием фиброза на имплантацию матрикса, изготовленного ПГБ, зафиксирована на уровне 1 балл, из композита ПГБ/ГАП с 10 и 20-% наполнением ГАП - также 1 балл. При анализе тканей в месте введения имплантата из композита ПГБ/ГАП с соотношением компонентов 1:1 по массе зафиксировано увеличение адгезии образца с тканями (2 балла), что может свидетельствовать о наличии некоторого раздражающего воздействия на ткани со стороны ГАП (аналогично реакции, зафиксированной выше в культуре клеток in vitro). В целом, показано, что имплантаты из ПГБ, а также в композиции с кальций-фосфатными материалами (ПГБ/ГАП) биосовместимы и не вызывают реактивных изменений со стороны системы крови, а также выраженных воспалительных реакций тканей in vivo.
4.2. Оценка остеогенного потенциала ПГА в тесте эктопического костеобразования
Остеопластические свойства ПГА исследованы в тесте эктопического костеобразования методом гетеротопной трансплантации имплантатов, который позволяет оценить адгезионные свойства материала по отношению к клеткам костного мозга, способность продвигать (кондукция) клетки по его поверхности; индуцировать рост тканевой пластинки из столбика костного мозга. Для проведения эксперимента были изготовлены объемные имплантаты из ПГБ и композита ПГБ/ГАП (наполнение полимера ГАП на 20% по массе), на поверхность которых в стерильных условиях в полной культуральной среде (90 % среды DMEM, 10 % Э'ГС, гентамицнн 80 мг/л, L-глутамин 280 мг/л) наносили столбик костного мозга, извлеченного из бедренной кости половозрелых крыс Вистар (15-20 х 10(' клеток) и помещали в COi-инкубатор на 60 мин для адгезии костномозговых клеток к поверхности. Биоактивные
матриксы имплантировали подкожно половозрелым крысам Вистар. Спустя 45 cvtok животных выводили из эксперимента; имплантаты извлекали, проводили цифровую съемку объектов для последующей компьютерной морфометрии размеров выросшей тканевой пластинки и стандартные гистологические исследования. .
Имплантаты из ПГБ, ПГБ/ПГВ и композита ПГБ/ГАП практически в равной степени показали высокую биосовместимость in vivo. При анализе 1 ответной реакции тканей на имплантаты, изготовленные из ПГА и композита ПГА/ГАП, не выявлено неблагоприятных проявлений, выраженного развития Г фиброзных капсул вокруг всех имплантатов. Клетки костного мозга, нанесенные на поверхность имплантатов, пролиферировали на поверхности и в объеме материала. Пролиферация и дифференцировка клеток способствовала заполнению пор имплантата соединительной тканью. Новообразованная ткань была представлена клетками с вытянутыми ядрами (фибробластами и фиброцитами), мононуклеарами (макрофагами и лимфоцитами), многоядерными клетками, пронизана капиллярами, располагающимися между ( коллагеновыми волокнами. В многочисленных участках, прилежащих к имплантату, отмечено формирование костной ткани (рис. 14).
Рис. 14. Образование \
костной ткани в порах имплантата «ПГБ/ГАП» через 45 суток после подкожной имплантации. I
Окраска гематоксилином-
эозином. Увеличение хЮО
I
Основное вещество остеоидной ткани окрашивалось гомогенно, главным образом базофильно (что говорит о незрелости ткани), с примесью оксифилии. Наблюдали "слоистость" основного вещества ткани, определяемую ходом | коллагеновых волокон и расположенных вдоль них клеток. Костные клетки ) располагались более или менее регулярно, имели вытянутую или округлую форму с овальными либо уплощенными ядрами. Эти результаты показали, что сконструированные имплантаты из ПГБ и композита полимера с гидроксилапатитом (ПГБ/ГАП), обладают остеокондуктивными свойствами и 1 способствуют образованию костной ткани на поверхности и внутри имплантатов.
4.3. Результаты исследования остеоиндуктивных свойств имплантатов из ПГА на модели сегментарной остеотомии
Для определения остеоиндуктивных свойств ПГА и выявления оптимальных условий протекания репаративного остеогенеза проведен эксперимент на крысах линии Вистар с заполнением модельных дефектов костей (тест сегментарной остеотомии), которые были разделены на 6 групп: три экспериментальные группы (имплантаты, разработанные на основе ПГБ), две группы сравнения (имплантаты из коммерческих материалов), контрольная группа (без имплантата, заживление дефекта - под свертком крови). Область для формирования дефекта выбрана с учетом известных данных о том, что оптимальной моделью у крыс, позволяющей корректно оценить эффективность влияния на репаративный остеогенез имплантатов из различных материалов, является дефект метаэпифизарной зоны большеберцовой кости диаметром от 1,5 до 3,0 мм и глубиной от 1,0 до 3,5 мм (Берченко с соавт., 2006; Арсентьев, 2007). Для формирования дефекта костной ткани у животных под ингаляционным наркозом в области эпифиза большеберцовой кости после обнажения мыщелков и верхней трети правой голени с помощью остеотома диаметром 2,5 мм при постоянном охлаждении физиологическим раствором создавали дефекты диаметром 3,0 мм и глубиной до 2,0 мм, которые заполняли сконструированными имплантатами.
Исследованы экспериментальные имплантаты трех типов, изготовленные из полигидроксибутирата (ПГБ), композитного материала полигидроксибутират/гидроксилапатит (ПГБ/ГАП) с содержанием ГАП 20 % (фирмы ЗАО НПО Полистом®, Москва) и полигидроксибутирата, наполненного рекомбинантным морфогенетическим белком человека ПГА/гЬВМР-2 (ProSpec-Tany TechnoGene Ltd, Израиль) (рис 15). В качестве материалов сравнения использовали композитный материал гидроксилапатит/коллаген (препарат «Коллапол©», ЗАО НПО Полистом, Москва) и препарат аллокости «Bio-OSS®» (фирмы "Geistlich", Швейцария). Анализировали общее состояние животных, опороспособность оперированной конечности, состояние тканей в месте дефекта (по результатам замеров плотности костной ткани с использованием компьютерной рентгенографии (установка «Kodak Trophy IRIX-70» и стандартной гистологической техникой. С использованием Image Analysis System «Carl Zeis» (Германия) проводили анализ изображений и морфометрические исследования структуры костной ткани в месте дефекта, оценки состояния и динамики биоразрушения материала имплантатов.
У всех животных раны зажили первичным натяжением; через 7-8 дней животные нагружали оперированную конечность в полном объеме. По данным рентгенологических исследований зон разрежения костной ткани, образования фиброзных капсул вокруг имплантатов всех типов не выявлено. Заживление костных дефектов у животных протекало по общим закономерностям, включая фазы посттравматических изменений тканевых элементов, регенерации и адаптивной ремоделяции.
Заполнение модельных дефектов имплантатами, изготовленными из различных материалов, способствовало регенерации костного дефекта в различной степени (рис.15).
Сут.
14
28
84
Рис. 15. Поперечные спилы костей в области дефекта: 1 -ПГБ, II - композит ПГБ/ГАП (наполнение полимера ГАП 20% по массе), III - ПГБ+ костный морфогенетический белок-2 (ВМР-2), IV - Bio-OSS®, V -Коллапол®. Окраска гематоксилин-эозин, увеличение х 25
При использовании для заполнения костного дефекта имплантата, изготовленного из ПГБ, через 14 суток вокруг фрагментов полимера зафиксирована пролиферация остеогенных клеток, дифференцировка их в остеобласты и образование новой костной ткани в виде костных трабекул с формированием в межтрабекулярных пространствах сосудов капиллярного типа. В костных полостях зафиксированы большие фрагменты полимера, на границе которого происходило образование хрящевой и незрелой костной тканей. На препаратах видны новообразованная компактная кость и гаверсовы системы, остеоциты и остеоны, линии цементации (рис. 16а). Через 1 месяц в зоне дефекта на фоне активной перестройки в компактную кость, что подтверждалось наличием остеонов с четкими линиями цементации, зафиксировано значительное сокращение количества полимерного имплантата; фрагменты полимера на гистологических срезах составили около 60% от исходной площади. В отдельных участках препаратов наблюдали разрастание остеогенной ткани вокруг ПГБ с пролиферацией остеобластов и образованием остеоида. К окончанию эксперимента (3 месяца) в зоне имплантации ПГБ отмечено активное формирование новообразованной кости, имеющей дефинитивное строение, о чем свидетельствовали пластинчатая организация и формирование остеонов. В препаратах видны отдельные мелкие фрагменты разрушающегося полимера. Площадь, занимаемая фрагментами полимера, составила не более 25% от исходной. Присутствие полимерного материала в эти сроки свидетельствует о медленном процессе его биодеградации.
шш ш гЧ Якг- ж ИИийяи П и ЕЗ
ЕЭ О ш
IV
V
Проявлений воспалительной реакции в месте контакта имплантата с нативной костью и формирования капсулы не отмечено.
а б
Рис. 16. Тканевой регенерат в области имплантации ПГБ, 14 суток; а -формирование остеогенной ткани вокруг фрагмента ПГБ (1); б-пролиферирующие остеобласты; б- новосформированные гаверсовы системы. Окраска гематоксилин-эозин, увеличение х 100 (а) и 200 (б)
При замещении модельных дефектов костной ткани имплантатами из композита ПГБ/ГАП картина репаративного остеогенеза несколько отличалась. На 14 сутки в области дефекта наблюдали формирование незрелой костной ткани (рис. 17 а). В костных полостях частицы композитного матрикса располагались вместе с кроветворными клетками в виде крупных агрегатов. Отмечено формирование тонких костных пластинок с большим количеством пролиферирующих остеобластов. Отчетливо фиксировались зоны значительных массивов не разрушенного матрикса (рис.17 б).
Рис.17. Тканевой регенерат в области имплантации ПГБ/ГАП, 14 суток; а-новообразованные костные балки, построенные из незрелой костной ткани; б -фрагменты имтантированного материала, окруженного соединительной тканью и костными балками. Окраска гематоксилин-эозин, увеличение х 100
Через 1 месяц объем остеогенной ткани заметно увеличился, но расположение костных пластин было хаотичным; система остеонов выражена в меньшей степени, чем при использовании ПГБ. На срезах отчетливо видны фрагменты имплантатов, не интегрированные в новообразованную костную ткань; отмечено усиление продукции гемопоэтических клеток. Формирующаяся компактная кость с сохранением крупных полостей достаточно рыхлая, что позволяет предполагать отличия биомеханических свойств. Через 3 месяца зафиксирована практически полностью сформированная компактная костная ткань, содержащая систему остеонов, однако костные пластинки в отдельных участках гистологических препаратов имели не продольную, а хаотическую направленность. По-прежнему в препаратах видны достаточно крупные фрагменты имплантатов, суммарная площадь которых составляла до 30-40% от исходной, что в 2 раза выше этого показателя при использовании имплантата из ПГБ. Таким образом, резорбция композитного матрикса протекала значительно медленнее по сравнению с матриксами из ПГБ.
При регенерации костной ткани в месте имплантации матрикса из ПГБ, нагруженного стимулятором остеогенеза - костным морфогенетическим белком-2, на 14 сутки отмечены признаки индукции преимущественно хрящевой ткани с образованием массы хондробластов и хондроцитов (рис. 18).
Рис.18. Тканевой регенерат в области имплантации ПГБ/гИВМР-2б, 14 суток: а- поле хрящевой ткани, являющейся тацдармом для развертывания энхондрального остегенеза; б-фрагменты имплантата, окруженные соединительной тканью. Окраска гематоксилин-эозин, увеличение х 100
Новообразованная костная ткань имела рыхлую структуру и разнонаправленность пластинок. Количество имплантата в агрегатах в препаратах было таким же, как у животных, которым имплантировали ПГБ. Часть этих агрегатов была окружена клетками соединительнотканной природы. Через 1 месяц эксперимента в препаратах отмечено массивное разрастание созревающей соединительной ткани; имелись признаки прямого остеогенеза
(интрамембранозная оссификация) с формированием тонких «кружевных» костных балок, между которыми расположены соединительная ткань и единичные гемопоэтические клетки. Костные балки покрыты остеогенными клетками, отмечалось образование костно-хряхцевых структур, имеющих хаотичное направление. В препаратах обнаружено много крупных фрагментов имплантата. Через три месяца новообразованная костная ткань представлена в основном компактной костью с большим количеством остеонов с наличием на границах соседних систем линий цементации. Межтрабекулярные костные полости широкие, практически пустые, выстланы остеогенными клетками. Не смотря на то, что система остеонов сформирована, направление костных пластинок не всегда строго параллельно, а костная ткань имеет достаточно «рыхлую» структуру. Количество полимера существенно уменьшилось, но по-прежнему присутствовало в препаратах; его площадь составила 20-25% от исходной.
При использовании имплантатов из остеозамещающих фирменных материалов «Коллапол®» и «Bio-OSS*» регенерация костного дефекта протекала на фоне более активной резорбции матриксов в сравнении с матриксами на основе ПГБ. При использовании «Коллапол®» спустя 14 суток в зоне имплантации отмечены немногочисленные костные трабекулы. Пролиферативная активность остеогенных клеток, выстилающих костные полости, выражена очагово. Отмечено значительное утолщение периоста за счет разрастания фиброзного слоя, при этом остеогенный слой периоста тонкий, представлен неактивными остеогенными клетками. В препаратах рядом с «нежными» костными пластинками видны фрагменты имплантата; площадь фрагментов составила 20-25%. Через месяц костные трабекулы более выражены, чем на сроке 14 суток; межтрабекулярные костные полости более узкие, содержат много зрелой неоформленной волокнистой соединительной ткани, а также кроветворные клетки. Активность остеогенных клеток и остеобластов умеренная, то есть остеогенез продолжается с началом перестройки и формирования компактной кости. Признаков имплантированного материала не обнаружено. К концу эксперимента встречаются области, не до конца заполненные новообразованными костными структурами. При использовании препарата «Bio-OSS*» на сроке 14 суток материал в препаратах практически не определяется; признаки остеогенеза выражены слабо. Определяются немногочисленные костные трабекулы с оптически плотным органическим матриксом. Пролиферативная активность остеогенных клеток, выстилающих костные полости, выражена очагово. Через месяц в препаратах в основном представлена компактная кость с четкими гаверсовыми системами. Периост утолщен за счет фиброзного слоя. Костномозговой канал широкий, заполнен костным мозгом. Спустя три месяца, картина остеогенеза аналогична сроку 1 месяц. В препаратах зафиксирована кость с широким костно-мозговым каналом, заполненным костным мозгом. Эндост выстлан остеогенными клетками. Периост фиброзирован. В целом, в этом варианте эксперимента морфологические признаки репаративной регенерации выражены слабее, объем новообразованной костной ткани
меньше, чем при использовании всех типов имплантатов, полученных на основе ПГБ.
Восстановление костного дефекта в контроле, без имплантата («под свертком крови»), протекало по обычной схеме реконструкции. Через 14 суток в препарате отмечены признаки непрямого (энхондрального) остеогенеза. Отмечены области рыхлой волокнистой соединительной ткани в зоне формирования хрящевой ткани. Через месяц зафиксирована менее зрелая по сравнению с экспериментальными группами животных компактная кость с гаверсовыми системами и линиями цементации. Активность остеогенных клеток и остеобластов при этом невелика; остеокластический феномен отсутствует. На сроке три месяца препарат представлен компактной костью, костно-мозговой канал широкий, заполнен кроветворными клетками. Эндост представлен одним слоем остеогенных клеток.
Для сравнительной оценки эффективности остеогенеза в местах дефекта костной ткани проведена компьютерная рентгенография препаратов. Регенерация костного дефекта с образованием более плотной костной ткани через три месяца была достоверно выше в случае применения имплантатов из ПГА по сравнению с процессом репаративного остеогенеза, протекающего в местах имплантации коммерческих материалов. Результаты проведенных исследований показали, что имплантаты из ПГБ препятствуют прорастанию в зону дефекта костной ткани рыхлой соединительной ткани, способствуют образованию новой кости; полимер обладает выраженными остеопластическими свойствами, даже без использования стимулятора остеогенеза; медленно, адекватно росту новой костной ткани деградирует in vivo, постепенно замещается ею, обеспечивает оптимальное течение репаративного остеогенеза.
6. Исследование ПГА в качестве биосовместимого матрикса для депонирования и доставки лекарственных средств
Разработка долговременных систем доставки лекарственных средств является наиболее перспективным и быстро развивающимся направлением в современной фармакологии. Главное достоинство этих систем заключается в возможности длительного и стационарного поддержания требуемого уровня лекарственного препарата в крови и/или тканях пациента (Kim et al., 2002; Yeh and Huang, 2003). Успех конструирования таких систем во многом определяется наличием адекватного материала, используемого в качестве матрикса для депонирования препарата.
С использованием ПГА в различных фазовых состояниях (растворы, эмульсии, порошки) отработаны способы конструирования полимерных матриксов в виде пленок, прессованных таблеток и микрочастиц; исследована биосовместимость и кинетика ликвации препаратов in vitro и in vivo. Медленная кинетика выхода препаратов из полимерного матрикса в среду и отсутствие резких выбросов в начальные периоды наблюдения свидетельствуют о
перспективности ПГА в качестве матрикса для депонирования и долговременной доставки лекарственных средств.
Микросферы - наиболее перспективная форма лекарственного матрикса, однако при введении микросфер в организм в силу большой поверхности при малом объеме материала суммарная зона контакта с тканями велика, что может вызвать выраженную ответную реакцию.
6.1. Реакция мышечной ткани на имплантацию полимерных микрочастиц
Для изучения ответной реакции мышечной ткани на имплантацию микрочастиц из ПГА 20 мг стерильных микросфер в 0,3 мл физиологического раствора были введены внутримышечно в мышцу бедра самкам крыс линии Вистар. Через сутки после введения микросфер и далее еженедельно животных выводили из эксперимента; оценивали общее самочувствие, динамику веса, макроскопию внутренних органов и реакцию тканей на имплантацию микросфер. Все экспериментальные животные хорошо перенесли инъекцию полимерных микросфер. Ответ тканей характеризовался незначительной по силе и непродолжительной воспалительной реакцией, образованием нежной, хорошо васкуляризированной соединительно-тканной капсулы, истончающейся со временем, на границе зоны введения микрочастиц и мышечной ткани, а также выраженной и постепенно нарастающей макрофагальной инфильтрацией с присутствием гигантских клеток инородных тел (рис.19). Спустя неделю после имплантации на границе зоны введения микросфер и неповрежденных интактных мышечных волокон отмечена инфильтрация фибробластическими клеточными элементами и начало формирования тонкой фиброзной капсулы как ответной реакции на инородное тело. Через 2 недели кластер имплантированных микросфер был окружен тонкой фиброзной капсулой, в эти сроки количество крупных (свыше 10-15 мкм) частиц значительно сократилось и не превышало 14% в поле зрения. В структуре капсул идентифицированы активные фибробласгы; средняя толщина фиброзной капсулы не превышала 5060 мкм; рядность фибробластов в ней составила 4-6, что практически в 3 раза ниже по сравнению с зафиксированной ранее реакцией мышечных тканей на имплантацию шовных волокон из ПГА. Площадь отека в зоне имплантации значительно уменьшилась, некротических участков не отмечено. С увеличением длительности наблюдения отмечено нарастание макрофагальной инфильтрации в зоне введения микросфер, как моноядерных макрофагов, так и ГКИТ. Через 5 недель отмечено увеличение количества моно- и полиядерных макрофагальных клеток; фракция крупных частиц сократилась и не превышала 4-5 % от общего числа в поле зрения, что свидетельствует о процессе разрушения полимерного матрикса. Вокруг крупных микросфер (диаметром более 10 мкм) отмечено скопление ГКИТ с 6-8 ядрами. На границе мышечной ткани и зоны микросфер отмечено сохранение истонченной фиброзной капсулы, образованной 2-3-мя рядами зрелых фибробластических клеток. Тенденция к усилению макрофагальной реакции сохранялась также через 7-9
недель после введения микрочастиц с увеличением численности среди микрочастиц ГКИТ и ростом количества ядер в них. Образования грубых фиброзных капсул на границе зоны введения микрочастиц и тканей, а также вокруг отдельных микрочастиц не обнаружено. Это весьма важное обстоятельство, так как в случае формирования фиброзных капсул вокруг полимерных частиц вероятно существенное замедление оттока лекарственных веществ из полимерного матрикса.
Рис. 19. Микроскопическая картина тканей в месте имплантации микросфер из полигидроксибутирата внутримышечно (полутонкие срезы). Обозначения: мч -микрочастицы, мф - макрофаги. ГКИТ - гигантские клетки инородных тел, мв -мышечные волокна, фк - фиброзная капсула. Маркер - 20 мкм
В конце эксперимента (11-12 недели наблюдения) по-прежнему характерной реакцией тканей было наличие выраженной макрофагальной
инфильтрации с большим количеством ГКИТ, окружающих полимерные частицы или сгруппированными вокруг кластера мелких микрочастиц; отмечено наличие ГКИТ с 10-12 и более ядрами (рис.20). Отмечено значительное уменьшение в поле зрения количества крупных микросфер диаметром свыше 10-15 мкм (около 2-3%) и появление фрагментов разрушенных микрочастиц.
м
с; >
>s
о г
п
о а ю s -8-я
X
S
5Г q
о ь
60 т
50 --
40
30 --
20 --
10 --
4
т 18
-- 16
-- 14
-- 12
-- 10
-- 8
0
ш
о
га
-9-о а
s с;
о
Рис. 20.
Морфометричес-кие показатели реакции мышечной ткани на имплантацию микрочастиц из ПГА в разные сроки наблюдения
И Толщина фиброзной капсулы
5 12
Недели, время
• Количество макрофагов
Однако, в течение всего эксперимента в тканях присутствовало большое количество неразрушенных микросфер, что свидетельствует о длительности процесса биоразрушения микрочастиц из ПГА in vivo.
5.2. Распределение и биоразрушенне полимерных микрочастиц в тканях внутренних органов лабораторных животных
Биосовместимость материала по отношению к крови является самым высоким уровнем биологической совместимости, и разработка материалов, пригодных для контакта с кровью, является актуальной задачей высокой сложности. Для оценки возможности введения изделий из ПГА в кровоток и доставки в ткани внутренних органов микрочастицы, полученные из радиоактивного по ЫС полигидроксибутирата. диаметром до 4 мкм, были введены крысам в хвостовую вену (2 мг в 0,5 мл физиологического раствора на животное, радиоактивностью 6050 имп/мин/мг частиц). Это позволило изучить распределение микрочастиц во внутренних органах и впервые оценить реакцию тканей сердца, легких, печени, селезенки, почек на введение ПГА. Спустя 3 и
24 часа после введения микрочастиц, и далее еженедельно в течении 90 суток по три животных выводили из эксперимента, выделяли внутренние органы, проводили морфологический анализ, подвергали счету радиоактивности с использованием диоксанового сцинтилляционного раствора на автоматическом жидкостном сцинтилляционном счетчике TriCarb 2100TR (Perkin Elmer/Packard, США).
Все животные после внутривенного введения микрочастиц и далее в течение всего эксперимента были здоровы. Различий в росте и развитии животных и массе внутренних органов контрольной и экспериментальной групп не отмечено. Макроскопические исследования внутренних органов животных отклонений не выявили; гистологическая картина внутренних органов всех экспериментальных животных во все сроки наблюдения была идентичной интактному контролю. Распределение и аккумуляция частиц в тканях органов были различными с ,наибольшей аккумуляцией в печени и селезенке. Начиная с 28 суток эксперимента и далее зафиксировано достоверное снижение суммарной радиоактивности тканей органов, что позволяет говорить о том, что полимер разрушается, а 14С продукты разрушения полимера выводятся из организма.
Для сравнительной оценки активности биодеградации полимера в органах и определения «времени жизни» микрочастиц ткани органов животных были подвергнуты хроматографическому анализу. Анализировали содержание мономеров 3-гидроксимасляной кислоты, а также высокомолекулярного (не разрушенного) полимера. Для этого последний экстрагировали из тканей хлороформом и анализировали с использованием хроматографии. Анализ содержания радиоактивного углерода в тканях внутренних органов в сопоставлении с наличием в них высокомолекулярного полимера и продуктов деструкции полимера в виде мономеров 3-гидроксимасляной кислоты показал, что к концу эксперимента значительная доля радиоактивного полимера присутствует in vivo в виде мономеров. При этом, однако, зафиксировано наличие в органах животных в различные сроки наблюдения части целых полимерных микрочастиц. Обнаруженное относительно невысокое содержание высокомолекулярного полимера в органах, в особенности, в печени и селезенке, на фоне зарегистрированной высокой радиоактивности тканей этих органов, свидетельствует о высокой активности процесса разрушения полимерного матрикса в них. Этими экспериментами впервые доказана возможность использования полимерных микрочастиц из ПГБ для внутривенного ведения и доставки во внутренние органы. Зарегистрированное наличие высокомолекулярного полимера в органах свидетельствует о состоятельности полимера для долговременной (до 12 недель) доставки лекарственных препаратов в ткани внутренних органов путем внутривенного введения.
3.3. Лекарственная эффективность полимерных микрочастиц
Лекарственная эффективность полимерных микрочастиц исследована на
мышах с привитой асцитной карциномой Эрлиха (АКЭ) в 100-%-но летальной дозе (3 млн. клеток/животное) на примере депонированного в полимерный матрикс рубомицина гидрохлорида. Экспериментальной группе животных одновременно с суспензией клеток АКЭ были введены нагруженные рубомицином микрочастицы. Противоопухолевый эффект разработанной формы рубомицина оценивали по динамике смертности животных, уменьшению объема опухоли и концентрации клеток в асцитной жидкости. Одновременно определяли количество некротически погибших клеток по окрашиванию трипановым синим.
Через 7 суток после прививания АКЭ в контрольной группе объем опухоли у животных составил в среднем 0,62±0,08 мл; у экспериментальных животных - менее на порядок (0,02±0,004 мл). При сопоставимом уровне общего количества клеток в 1 мл асцита в контрольной (3,49±0,41)*108 и экспериментальной (1,25±0,31)х108 группах, количество опухолевых клеток, погибших по типу некроза, у животных, получивших препарат, был достоверно выше, и их доля от общего количества клеток составила 3,04 % (в контроле -1,88 %). Через 14 суток после прививания опухоли проявление противоопухолевого действия рубомицина было более наглядным. В контрольной группе объем опухоли у животных составил 5,26±0,49 мл, а у экспериментальных животных признаки асцита отсутствовали. Общее число клеток АКЭ в контрольной группе животных возросло до (6,41±0,89) *108, это в 4 раза выше, чем у экспериментальных животных. Количество клеток, погибших по типу некроза у животных контрольной группы, сократилось относительно первого срока и составило только 0,49 %, в это же время у животных, получивших пролонгированную форму рубомицина, доля погибших клеток выросла до 3,59 %. В контрольной группе с 14 суток началась массовая гибель животных, и к 21 суткам смертность составила 100%. Средняя продолжительность жизни мышей опухоленосителей в контрольной группе составила 8 суток. Кривая смертности мышей, получивших рубомицин, депонированный в полимерные микрочастицы, существенно отличалась от контроля. Начиная с 13 суток, отмечены единичные случаи гибели животных; к 21 суткам среди животных, получивших пролонгированный рубомицин, средняя продолжительность жизни составила 16 суток, что 2 раза выше, чем в контроле. В течение последующего наблюдения (еще 30 суток) интенсивность гибели животных в экспериментальной группе снизилась. Спустя 55 суток от начала эксперимента у 40% выживших животных признаки АКЭ отсутствовали.
Этими экспериментами показана высокая биосовместимость микрочастиц, полученных из ПГА, и возможность их введения внутримышечно и внутривенно. Разработанная форма высокотоксичного препарата, депонированная в полимерный матрикс в виде микрочастиц, при однократном внутрибрюшинном введении ингибирует пролиферативную активность АКЭ и позволяет вводить препарат местно, без негативных реакций, характерных для свободного рубомицина.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
С использованием высокоочищенных и охарактеризованных образцов ПГА разработано и исследовано семейство специализированных изделий для медицины в виде шовных волокон, 2-х и 3-х-мерных плотных и пористых матриксов, микрочастиц, моножильных волокон; исследованы структура, физико-химические и физико-механические характеристики. Разработанные полимерные конструкции различной формы и массы позволили ввести их в мышцу, кость, кровоток и внутренние органы и впервые исследовать реакцию тканей различной структуры на имплантацию ПГА. Показана высокая биосовместимость ПГА с различными тканями и возможность имплантирования на длительные сроки без развития негативных реакция со стороны системы крови, клеток, тканей и целого организма. Решение комплекса сформулированных задач обеспечило получение фундаментальных знаний о новом перспективном биоматериале и позволило ответить на заданные вопросы: 1) доказано, что собственно ПГА и конструкции из него различной массы и формы безопасны для организма и обладают высокой биосовместимостью; 2) ответ различных тканей на имплантацию ПГА характеризуется непродолжительной фазой асептического воспаления с активной регенерацией тканей без каких-либо негативных реакций; 3) ПГА под воздействием клеток макрофагального ряда, высокоактивных по кислой фосфатазе, медленно разрушаются in vivo без резкой потери прочности, обеспечивая длительное функционирование изделий, от нескольких месяцев до года. Показано, что ПГА эффективны в качестве самостоятельных эндопротезов, шовного материала, остеозамещающих имплантатов и матрикса для депонирования и доставки лекарственных препаратов.
Проведена сертификация технологии синтеза и очистки образцов ПГА; получен гигиенический сертификат соответствия Опытного производства полимеров медицинского назначения Главной санитарно-эпидемиологической службы РФ; разработаны и зарегистрированы Технические условия на ПГА различной химической структуры в качестве матриксов функционирующих клеток и лекарственных средств, хирургических имплантатов; в Роспатенте РФ зарегистрирована торговая марка «БИОПЛАСТОТАН™» на ПГА и изделия медико-биологического назначения. Серия экспериментальных образцов полимеров медицинской степени чистоты и экспериментальных образцов изделий из ПГА передана в исследовательские и медицинские учреждения, что позволило начать локальные исследования применения конструкций из ПГА для реконструкции дефектов тканей и органов в условиях клиники (в реконструктивных технологиях ортопедии и травматологии, челюстно-лицевой и абдоминальной хирургии). Полученные результаты имеют значение для биотехнологии новых материалов и современных реконструктивных медико-биологических технологий. С учетом существующих потребностей практики результаты направлены на снижение существующего дефицита в биосовместимых имплантатах для реконструктивных технологий.
ВЫВОДЫ:
1. С использованием высокоочищенных и охарактеризованных образцов полигидроксиалканоатов, на основе изученных свойств полимерных систем в различных фазовых состояниях сконструировано и исследовано семейство экспериментальных образцов изделий в виде микрочастиц, волокон, плоских и объемных матриксов, полностью биоразрушаемых полимерных эндопротезов; доказаны высокие медико-биологические свойства изделий, устойчивость к воздействию биологических и физико-химических факторов.
2. Разработанные способы получения и модификации поверхности матриксов из ПГА с применением химических и физических методов позволяют получать функциональные платформы в виде гибких пленок и мембран, которые характеризуются высокой адгезией по отношению к клеткам разных типов, способствуют нормальной пролиферации клеток in vitro и пригодны для клеточных технологий.
3. В культурах клеток in vitro, в острых и хронических экспериментах на лабораторных животных изучена реакция организма на имплантацию ПГА на уровне клеточного ответа, морфологии и биохимии крови, реакции тканей разных типов на имплантацию полимерных конструкций из ПГА подкожно, внутримышечно, внутривенно; доказана биологическая безопасность всех типов изделий из ПГА и соответствие требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям медико-биологического назначения.
4. Биодеградация ПГА в биологических средах зависит от химической структуры полимера, формы изделия и места имплантации, происходит медленно гуморальным и клеточным путями, главным образом с поверхности изделий, без образования локальных дефектов и резкого снижения прочности. В биодеградации ПГА принимают участие макрофаги и гигантские клетки инородных тел с высокой активностью кислой фосфатазы, коррелирующей с активностью фермента в сыворотке крови животных. ПГА устойчивы к воздействию биологических сред и пригодны для функционирования in vivo от нескольких месяцев до года.
5. Моножильные волокна из ПГА обладают высокой биосовместимостью и прочностью (абсолютная прочность до 306 МПа, модуль упругости 3 ГПа, удлинение при разрыве 24%) и пригодны для хирургии. Ответная реакция тканей на ПГА характеризуется коротким (1-2 недели) посттравматическим воспалением, и не сопровождается осложнениями.
6. ПГА пригодны для депонирования и доставки лекарственных средств при различных способах введения для длительного функционирования. Доказано отсутствие негативных реакций со стороны крови, мышечной ткани и тканей внутренних органов на введение микрочастиц. На примере лабораторных животных с привитой карциномой Эрлиха показано, что цитостатический препарат рубомицин, депонированный в полимерные микрочастицы, ингибирует пролиферативную активность АКЭ и позволяет обеспечить локальную доставку препарата.
7. Сконструирована серия имплантатов для репаративного остеогенеза на базе ПГА. В первичной культуре остеобластов и на лабораторных животных
доказано, что имплантаты биоинертны, не вызывают цитотоксических реакций in vitro и воспалительных, некротических и иных негативных реакций in vivo. Имплантаты обладают остеопластическими свойствами, медленно деградируют in vivo и обеспечивают нормальное протекание репаративного остеогенеза.
8. Впервые разработаны и исследованы полностью биоразрушаемые эндопротезы из ПГА. Результаты физиологических, биохимических и морфологических исследований тканей животных, которым были имплантированы трубчатые стенты из ПГБ, свидетельствуют о перспективности разработанных эндопротезов для выполнения реконструктивных операций на желчевыводящих путях.
9. Результаты исследования дали новые фундаментальные знания о медико-биологических свойствах нового перспективного биоматериала и закономерностях его взаимодействия с биологическими тканями. Полученные результаты имеют значение для биотехнологии полигидроксиалканоатов и являются научной основой для их медико-биологического применения.
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Шишацкая Е.И. Исследование цитотоксичности полиоксиалканоатов в культуре животных клеток / Е.И. Шишацкая, A.B. Еремеев, И.И. Гительзон, H.A. Сетков, Т.Г. Волова // Доклады РАН. - 2ООО. - Т. 374, N.4. - С. 561-564.
2. Волова Т.Г. Исследование структуры и свойств полиоксибутирата -термопластичного биоразрушаемого полимера / Т.Г. Волова, Е.И. Шишацкая, С.А. Гордеев, Э.П. Зеер //Перспективные материалы.-2001. -N. 2. - С. 40-48.
3. Шишацкая Е.И. Исследование свойств биодеградируемых полимеров (полиоксиалканоатов) в культуре животных клеток / Е.И. Шишацкая, И.И. Гительзон, A.B. Еремеев // Перспективные материалы. -2001. -N. 3. - С. 40-47.
4. Севастьянов В.И. Медико-биологические свойства полиоксиалканоатов - биодеградируемых бактериальных полимеров // В.И. Севастьянов, Н.В. Перова, И.А. Довжик, И.А. Титушкин, Е.А. Немец, З.М. Беломестная, Е.И. Шишацкая, Т.Г. Волова // Перспективные материалы. - 2001. - N. 5. - С. 4655.
5. Шишацкая Е.И. Исследование цитотоксичности полиоксиалканоатов в культуре животных клеток / Е.И. Шишацкая, И.И. Гительзон, A.B. Еремеев // Цитология. - 2001. - Т. 43, №.9-С. 904-905.
6. Шишацкая Е.И. Гигиеническая оценка полиоксиалканоатов - природных полиэфиров нового поколения / Е.И. Шишацкая, E.H. Есимбекова, Т.Г.Волова, Г.С. Калачева, В.А. Кратасюк // Гигиена и санитария. - 2002. - N. 4. -С. 59-63.
7. Шишацкая Е.И. Биодеградация шовных нитей на основе полиоксиалканоатов в биологических средах / Е.И. Шишацкая, Т.Г. Волова, С.А. Гордеев, А.П. Пузырь // Перспективные материалы. - 2002. - N. 2. - С. 5662.
8. Шишацкая Е.И. Реакция тканей на имплантацию биодеструктивных шовных нитей на основе полиоксиалканоатов / Е.И. Шишацкая, Т.Г. Волова, С.Н. Ефремов, А.П. Пузырь, О.А. Могильная // Медицинская техника. - 2002. -№4.-С.23-26.
9. Шишацкая Е.И. Морфогенез тканей при имплантации биоразрушаемого полигидроксибутирата / Е.И. Шишацкая, Т.Г. Волова, А.П. Пузырь, О.А. Могильная, С.Н. Ефремов, И.И. Гительзон// Доклады РАН. - 2002. - Т. 383, №.6.-С. 838-841.
10. Шишацкая Е.И. Об участии макрофагов и реакции фосфомоноэстераз в ответе тканей на имплантацию полиоксиалканоатов / Е.И. Шишацкая, Т.Г.Волова, И.И.Гительзон // Доклады РАН. - 2002. - Т.383, №5. - С. 702-705.
11. Шишацкая Е.И. Исследование токсикологических свойств полиоксиалканоатов в эксперименте in vivo / Е.И. Шишацкая, Т.Г.Волова, И.И.Гительзон // Доклады РАН. - 2002. - Т.383, № 4. - С. 565-567.
12. Шишацкая Е.И. Исследование биологических свойств полиоксиалканоатов в хроническом эксперименте in vivo / Е.И. Шишацкая, Т.Г.Волова, Т.Г. Попова // Медицинская техника. - 2002. - № 4. - С. 29-32.
13. Shyshatskaya E.I. Results of biomedical investigations of PHB and PHB/PHV / E.I. Shyshatskaya, T.G. Volova, V.I. Sevastianov, N.Perova // Abstr. Int. Symp. Biopolymers ISBP 2002. - Germany, Munster, 22-26 Sept. 2002. - P. 157.
14. Shyshatskaya E.I. Tissue response to the implantation of PHB and PHB/PHV sutures / E.I. Shyshatskaya, T. Volova, S. Efremov // Abstr. Int. Symp. Biopolymers ISBP 2002. - Germany, Munster, 22-26 Sept. 2002. - P. 156.
15. Волова Т.Г. Характеристика изделий на основе полиоксиалканоатов -разрушаемых природных полиэфиров / Т.Г. Волова, Ю.П. Некрасов, Е.И. Шишацкая, А.П. Пузырь, С.А. Гордеев// Пластические массы - 2003. - № 3. -С. 6-8.
16. Volova T.G. E.I. Results of biomedical investigations of PHB and PHB/PHV fibers / T.G. Volova, E.I. Shishatskaya, V.I. Sevastianov, S.N. Efremov, O.A. Mogilnaya // Biochemical Engin. J. - 2003. - V.16, N.2. - P. 125-133.
17. Sevastianov V.I. Production of purified polyhydroxyalkanoates (PHAs) for applications in contact with blood / V.I. Sevastianov, N.V. Perova, E.I. Shishatskaya, G.S. Kalacheva, T.G. Volova // J. of Biomater. Sci. Polymer. Edn. -2003.-V. 14.-P. 1029-1042.
18. Волова Т.Г. Полиоксиалканоаты - биоразрушаемые полимеры для медицины / Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов, Е.И. Шишацкая (под ред. ак. В.И.Шумакова) // Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения РАН. - 2003. -330с.
19. Волова Т.Г. Биотехнология новых полимерных материалов: синтез, свойства, применение / Т.Г. Волова, Е.И. Шишацкая // Очерки экологической биофизики. - Новосибирск: Наука. - 2003. - С. 106-119.
20. Shyshatskaya E.I. Tissue response to the implantation of biodegradable polyhydroxyalkanoate sutures / E.I. Shyshatskaya, T.G. Volova, S.N. Efremov, A.P.
Puzyr, O.A. Mogilnaya // J. of Material Science: Material in medicine. - 2004. -V.15,№. 6.-P. 719-728.
21. Shyshatskaya E.I. A comparative investigation of biodegradable polyhydroxyalkanoate films as matrices for in vitro cell cultures / E.I. Shyshatskaya, T.G. Volova // J. of Material Science: Material in medicine. - 2004. - V.15, № 8. - P. 915-923.
22. Shyshatskaya E.I. Results of investigations of of histo- hemo- and in vivo comparability of two PHA types (PHB and PHBV) as materials for tissue and organ prosthesis / E.I. Shyshatskaya, I.I. Gitelson, V.I. Sevastianov, T.G. Volova // Abstr. II Int. Symp. Biopolym. - UK, Kordif, 3-8 April 2003.
22. Shyshatskaya E.I. Matrix on the basis of polyhydroxybutyrate
copolymers for bioartificial tissues / E.I. SHYSHATSKAYA// advanced
Research Workshop (NATO Science Programme) "Macromolecular Approaches to Advanced Biomaterials Engineering Systems". - Sofia, Bulgaria, 8-11 November 2003. - P. 15.
23. Шишацкая Е.И. Исследование свойств полигидроксиалканоатов, перспективных для получения пористых матриксов / Е.И. Шишацкая, С.А Гордеев, Т.Г.Волова // Перспективные материалы. - 2004. - № 6. - С. 40-44.
24. Волова Т.Г. Физико-химические свойства одно-, двух- и трехкомпонентных полигидроксиалканоатов / Т.Г. Волова, В.Ф. Плотников, Е.И. Шишацкая, П.В. Миронов, А.Д. Васильев // Перспективные материалы. -2004. -№3.~ С. 42-48.
25. Шишацкая Е.И. Исследование биоразрушающихся полигидроксиалканоатов в качестве носителя противоопухолевых препаратов / Е.И. Шишацкая, А.В. Жемчугова, Т.Г. Волова// Антибиотики и химиотерапия. -2005.-№2-3.-С. 3-14.
26. Волова Т.Г. Физико-химические свойства двухкомпонентных -[поли (ЗГБ/ЗГВ)] полигидроксиалканоатов / Т.Г. Волова, В.Ф. Плотников, Е.И. Шишацкая, П.В. Миронов, А.Д. Васильев // Биофизика. - 2004. - Т. 49, №.6. -С. 1038-1046.
27. Shyshatskaya E.I. Degradation of Р(ЗНВ) and P(3HB-co-3HV) in biological media/E.I. Shyshatskaya, T.G. Volova, S.A. Gordeev, A.P. Puzyr//J. ofBiomater. Sci. Polymer. Edn. - 2005. - V. 15, N.5. - P. 643-657.
28. Shyshatskaya E.I. Investigations of purified polyhydroxyalkanoates (PHAs) for applications in contact with blood / E.I. Shyshatskaya, V.I. Sevastianov, T.G. Volova // Abstr. Europ. Symp. On Bopolymer ESBP-04. - Gallen, Switzerland, May 12-15 2004.-P.38.
29. Шишацкая Е.И. Структура и физико-химические свойства гибридного композита полигидроксибутират/гидроксиапатит / Е.И. Шишацкая, Б.А. Беляев, А.Д. Васильев, П.В. Миронов, Т.Г. Волова// Перспективные материалы. -2005. -№1. - С.40-46.
30. Гордеев С.А. Получения ультратонких волокон из полигидроксиалканоатов методом электростатического формования / С.А. Гордеев, Е.И.Шишацкая, Т.Г. Волова // Пластические массы. - 2006. - № 4. -С.49-52.
31. Гордеев С.А. Получение и исследование ориентированных волокон из сополимеров поли(гидроксибутирата/гидроксивалерата) /С.А. Гордеев, Е.И.Шишацкая, Т.Г. Волова // Перспективные материалы. - 2005. - № 3. - С. 50-55.
32. Волова Т.Г. Опытное производство разрушаемых биополимеров / Т.Г. Волова, H.A. Воинов, B.C. Муратов, Н.В. Бубнов, К.В. Гурулев, Г.С. Калачева, О.В. Горбунова, В.Ф. Плотников, Н.О. Жила, Е.И. Шишацкая, О.Г. Беляева. // Биотехнология. - 2006. - № 5-6. - С.28-34.
33. Shyshatskaya E.I. A hybrid PHB-hydroxyapatite composite for biomedical application: production, in vitro and in vivo investigation / E.I. Shyshatskaya, I.A. Khlusov, T.G. Volova // J. Biomater. Sei. Polymer Edn. - 2006. - V. 17, №-5. - P. 481-498.
34. Волова Т.Г. Характеристика ультратонких волокон, полученных электростатическим формованием термопластичного полиэфира [поли(гидроксибутирата/гидросивалерата)] / Т.Г. Волова, Е.И. Шишацкая, С.А. Гордеев // Перспективные материалы. - 2006. - № 3. - С. 25-29.
35. Шишацкая Е.И. Микрочастицы из биоразрушаемого полиоксибутирага в качестве матрикса для депонирования рубомицина / Е.И. Шишацкая, A.B. Горева // Перспективные материалы. - 2006. -№.4. - С.65-70.
36. Волова Т.Г. Полиоксиалканоаты - биоразрушаемые полимеры для медицины / Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов, Е.И. Шишацкая ( под ред. ак. В.И. Шумакова) // Красноярск: Платина, 2006. - 287 с.
37. Шишацкая Е.И. Биосовместимые и функциональные свойства гибридного композита полигидроксибутират/гидроксиапатит / Е.И. Шишацкая // Вестник трансплантологии и искусственных органов - 2006.- № 3,-С. 34-38.
38. Шишацкая Е.И. Клеточные матриксы из резорбиреумых полигидроксиалканоатов / Е.И. Шишацкая // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2007. - Т. II, № 2. - С.68-76.
39. Волова Т.Г. Разрушающийся пластик БИОПЛАСТОТАН: высокая технология - материал XXI века / Т.Г. Волова, Е.И. Шишацкая, О.Н. Шишацкий // Интеграл. - 2007. - № 4. - С. 8-9.
40. Shishatskaya E.I. Resorbable polyhydroxyalkanoates as a carrier of antitumor drugs / E.I. Shishatskaya, A.V. Goreva, O.N. Voinova, T.G. Volova. // .[.Biotechnology.- 2007. -Vol.131, №.2/-P.50.
41. Шишацкая Е.И. Реакция тканей на имплантацию микрочастиц из резорбируемых полимеров при внутримышечном введении / Е.И. Шишацкая, A.B. Горева, О.Н. Войнова, Т.Г. Волова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - №12. - С. 635-639.
42. Шишацкая Е.И. Биоактивные имплантаты на основе резорбируемых полиэфиров и гидроксиапатита для реконструктивного остеогенеза / Е.И. Шишацкая // 3-й Международный биотехнологический конгресс "Bio-2007". -Москва, 12-16 марта 2006. - С. 136.
43. Shishatskaya E.I. Resorbable polyester/hydroxyapatite matrices for growing mesenchymal stem cells of bone marrow and reparative osteogenesis / E.I. Shishatskaya // British-Russian Workshop in Association with the European Comission Stem Cell: Policy, Research, and Innovations Perspectives. - Moskow, 15-16 March 2007.-P.40-41.
44. Shishatskaya E.I. Biodegradable PHAs: Production, Biomedical investigations, Applications / E.I. Shishatskaya // 4th Europen Congress on Biopolymers. ESBP. - Turkey, Kusadasi, 2-4 October 2007. - P. 32.
45. Markelova N.M. Experimental justification of using endobiliary stents made of bioresorbable polyhydroxyalkanoates / N.M. Markelova, Yu.S. Vinnik, D.V. Cherdantsev, I.I. Beletskiy, E.I. Shishatskaya // 4th Europen Symposium on Biopolymers ESBP. - Turkey, Kusadasi, 2-4 October 2007. - P. 56.
46. Shishatskaya E.I. Biocompatibility of polyhydroxybutyrate microspheres: in vitro and in vivo evaluation / E.I. Shishatskaya, O.N. Voinova, A.V. Goreva, O.A. Mogilnaya, T.G. Volova// J. Material Science: Materials in Medicine. - 2008. - V. 19, №.6. -P. 2493-2502.
47. Шишацкая Е.И. Противоопухолевая эффективность рубомицина, инкапсулированного в резорбируемый полимерный матрикс / Е.И. Шишацкая, А.В. Горева, Е.В. Инжеваткин, О.Н. Воинова, Р.Г. Хлебопрос, Т.Г. Волова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - №3. - С.333-336.
48. Shishatskaya E.I. Biocompatability of polyhydroxybutyrate Microspheres: in vitro and in vivo evaluation / E.I. Shishatskaya, O.N. Voinova, A.V. Goreva, O.A. Mogilnaya, T.G. Volova // Journal of Siberian Federal University. Biology. - 2008. -№1. -P. 66-77.
49. Shishatskaya E.I. Biocompatability of polyhydroxybutyrate Microspheres: in vitro and in vivo evaluation / E.I. Shishatskaya, O.N. Voinova, A.V. Goreva, O.A. Mogilnaya, T.G. Volova // J. Mater Sci: Mater Med. - 2008. - V.19, № 6. - P.2493-2502.
50. Shishatskaya E.I. Production biomedical investigation, application of PHA / E.I. Shishatskaya //Macromol Symposia. -2008. - V. 269. - P. 65-81.
51. Shishatskaya E.I. In vivo justification of using endobiliary stents made of bioresorbable polyhydroxyalkanoates / N.M. Markelova, E.I. Shishatskaya, Y.S. Vinnic, D.V. Cherdansev, I.I. Beletskiy, M.N. Kuznecov, L.D. Zykova. //Macromol. Symposia. - 2008. - V. 269. - P.82-91.
52. Камендов И.В. Морфологический особенности остеогенеза с применением биополимера из полигидроксибутирата и его композиций / И.В. Камендов, С.И. Старосветский, Е.И. Шишацкая. Т.Г. Волова // Институт стоматологии. - 2008. - №2. - Стр.92-93.
53. Shishatskaya E.I. Biocompatability and drug eficency of microspheres from resorbable Poly(3)hydroxybutyrate / E.I. Shishatskaya // XVI International Conference on Bioencapsulation. - Dublin, Ireland, September 4-6, 2008.
54. Шишацкая Е.И. Экспериментальное обоснование к применению резорбируемых полигидроксиалканоатов в медицине / Е.И. Шишацкая, В.И. Шумаков, Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов и др.// Материалы IV Съезда
Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 2008. - С.364.
55. Shishatskaya E.I. Preparation and properties of polyhydroxybutyrate microspheres as drug carriers / E.I. Shishatskaya, A.V. Goreva, T.G. Volova // XVI International Conference on Bioencapsulation. Bioencapsulation. - Dublin, Ireland, September 4-6,2008.-4p.
56. Шишацкая Е.И. Экспериментальное обоснование применения резорбируемых полигидроксиалканоатов в реконструктивной медицине / Е.И. Шишацкая, Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов и др. // Материалы V Всероссийского съезда трансплантологов памяти академика В.И. Шумакова. -Москва, 2008. - С.323-324.
57. Volova T.G. Production of oriented fibers out of poly (hydroxybutyrate/hydroxyvalerate) copolymers and testing of mechanical stabilityv under static and cyclic loads / T.G. Volova, S.A. Gordeev, E.I. Shishatskaya // Journal of Siberian Federal University. Biology. - 2008. - V.2. - P. 126-135.
58. Шишацкая Е.И. Исследование остеопластических свойств матриксов из резорбируемого полиэфира гидроксимасляной кислоты / Е.И. Шишацкая, И.В. Камендов, С.И. Старосветский, Т.Г. Волова // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2008. - T.III, №4. - С. 41-47.
59. Волова Т.Г. Свойства композитов резорбируемого полиэфира «Биопластотан» с волластонитом и гидроксиапатитом / Т.Г. Волова, Е.И. Шишацкая, П.В. Миронов //Пластические массы. -2008. -№ 12. - С.41-43.
60. Волова Т.Г. Структура и физико-химические свойства гибридного композита полигидроксибутират/волластонит / Т.Г. Волова, Е.И. Шишацкая, П.В. Миронов, А.В. Горева // Перспективные материалы. - 2009. - №1. - С. 4350.
УОП ИЛ СО РАН Подписано в печать 29.06.2009 Формат 60x84/16 Усл. пл. 1,86 Тираж 100 экз.
Заказ № 105
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Шишацкая, Екатерина Игоревна
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Требования, предъявляемые к материалам медико- 14 биологического назначения и методы исследования
1.2. Потребности в новых биоматериалах
1.3. Медико-биологический потенциал 37 биоразрушаемых полигидроксиалканоатов
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.2. Конструирование и исследование свойств 62 полимерных изделий медико-биологического назначения
2.3. Методы исследования
2.3.1. Физико-химические исследования
2.3.2. Исследование биосовместимости ПГА in vitro
Медико-биологические исследования
2.3.3. разработанных полимерных изделий из ПГА в экспериментах на животных
2.4. Исследование биодеградации ПГА
2.5. Статистически методы обработки результатов
ГЛАВА 3. ОТРАБОТКА УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗ ПГА
ИЗДЕЛИЙ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО
НАЗНАЧЕНИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ СВОЙСТВ
3.1. Характеристика ПГА
3.2. Растворимость ПГА и получение изделий из растворов
3.3. Переработка ПГА из расплава
3.4. Переработка ПГА методами нанотехнологии
3.5. Конструирование объемных имплантатов из ПГА и композитов ПГА с гидроксилапатитом
3.6. Влияние физико-химических факторов на свойства ПГА
ГЛАВА 4.
4.2.1.
4.2.2.
ГЛАВА 5.
ГЛАВА 6.
6.2. 6.2.1 6.2.2.
Резюме
БИОСОВМЕСТИМЫЕ СВОЙСТВА ВОЛОКОН 109 ИЗ ПГА И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ В ХИРУРГИИ
Биодеградация волокон из ПГА
Биосовместимость полимерных волокон из ПГА и 115 оценка пригодности для хирургических швов Общая реакция организма животных на имплантацию волокон из ПГА
Функциональные свойства шовных волокон из
ПГА и реакция тканей на имплантацию Резюме
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ
ПРИМЕНЕНИЯ ПГА ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ЭНДОПРОТЕЗОВ
Конструирование экспериментальных моделей 136 эндопротезов из ПГА
5.2. Исследование экспериментальных моделей 138 биоразрушаемых стентов
Резюме
ИССЛЕДОВАНИЕ ОСТЕОПЛАСТИЧЕСКИХ 146 СВОЙСТВ ИМПЛАНТАТОВ ИЗ ПГА И ОЦЕНКА ПРИГОДНОСТИ ДЛЯ
РЕКОНСТРУКТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА
Исследование биосовместимости объемных 146 имплантатов на основе ПГА, предназначенных для реконструкции дефектов костной ткани
Исследование остеогенного потенциала полимерных (ПГБ) и гибридных (ПГБ/ГАП) имплантатов
Исследование остеокондуктивных свойств 155 объемных полимерных имплантатов в тесте эктопического костеобразования
Исследование остеопластических свойств объемных полимерных имплантатов из ПГА на модели сегментарной остеотомии
Резюме
ГЛАВА 7.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПГА В КАЧЕСТВЕ
МАТРИКСА ДЛЯ ДЕПОНИРОВАНИЯ И
ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
7.1. Депонирование препаратов в полимерный матрикс 174 из ПГА
7.2. Лекарственные препараты, депонированные в 180 полимерный матрикс из ПГА в виде микрочастиц
7.3. Биосовместимость полимерных микрочастиц из 183 ПГА in vivo при различных способах введения
7.3.1. Реакция тканей на введение полимерных 184 микрочастиц внутримышечно
7.3.2. Распределение и биоразрушение полимерных 191 микрочастиц в тканях внутренних органов лабораторных животных при внутривенном введении
5.4. Лекарственная эффективность рубомицина, 201 депонированного в полимерные микрочастицы из ПГА
Резюме
Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнология полигидроксиалканоатов"
Развитие науки и техники приводит к все более широкому внедрению в практику различных целевых продуктов, синтезируемых живыми системами. В последние годы все более актуальными становятся работы по биополимерам (полимерам биологического происхождения). Главной целью данного направления является поиск и изучение новых биополимеров и получение фундаментальной основы для конструирования биологических систем, синтезирующих полимеры с заданными свойствами.
Создание и изучение новых биосовместимых полимерных материалов, необходимых для современных реконструктивных медико-биологических технологий, является актуальной проблемой биотехнологии. Значимость этого направления исследований связана с тем, что повышение эффективности лечения и качества жизни невозможно без внедрения в практику реконструктивной медицины революционных технологий с применением новых материалов высокой функциональности и специфичности, включая конструирование систем, способных воспроизводить функции биологических тканей (Bioartificial organs, 1999; Биосовместимость, 1999; Sudesh et al., 2000;2004; Biopolymers, 2002; Biotechnology of Biopolymers: From Synthesis to Patents, 2004; Biopolymers, 2002; Biopolymers for Medicinal and Pharmaceutical Applications, 2005; Штильман, 2006; Хенч, Джонс, 2007).
Значительные успехи, достигнутые в биотехнологии новых материалов, стимулировали разработку и применение разнообразных систем и устройств биомедицинского назначения. Среди применяемых и активно разрабатываемых в настоящее время биоматериалов — полилактиды, полилактид/гликолиды, полиэтиленгликоль (Lemmouchi et al., 1998; Zhu et al., 2003; Liu et al.,2004; 2005), полиангидриды (Goepferich, Tessmar, 2002), полиортоэфиры (Heller et al., 2002; 2003), полисахариды (Kato et al., 2003; Balthasar et al., 2005; Hazer, Steinbuchel, 2007). К настоящему времени удалось достичь существенных успехов в области конструирования из новых биоматериалов эндопротезов и устройств. Это позволяет улучшить и спасти жизнь миллионов людей (Шумаков с соавт., 2003; Трапслвантология, 2006; Штильман, 2006). Однако при многих тяжелых заболеваниях для спасения жизни пациента продолжает оставаться один путь - трансплантация донорских органов, которая не может обеспечить помощь всем нуждающимся в ней из-за дефицита трансплантатов. Более распространенное применение искусственных протезов ограничено временным поддержанием функций жизненно важных органов. Поэтому решение проблемы повышения эффективности лечения невозможно без внедрения новых технологий.
Активно развиваемый в настоящее время новейший подход - это создание биоискусственных органов и тканей, развитие которого невозможно без освоения новых функциональных материалов
Создание фундаментальных основ для разработки и реализации новых материалов, устройств, и технологий требует комплексных исследований. Связано это с тем, что для понимания механизма взаимодействия материалов и изделий из них с тканями организма необходимы глубокие исследования закономерностей ответа организма на инородное тело, характера регенераторного процесса, с одной стороны, и изучение «судьбы» (включая кинетику биодеструкции и динамику прочностных свойств) имплантируемого материала, с другой. Имплантированный материал/изделие и живой организм при контакте подвержены взаимовлиянию, как правило негативного характера. При этом характер и степень выраженности этого воздействия определяется как комплексом физико-химических свойств собственно материала, массой и геометрией имплантата, так и природой и силой ответных физиолого-биохимических реакций организма-хозяина. Поэтому для внедрения каждого нового материала основополагающей задачей является необходимость изучения механизма совместимости этого материала с биологическими структурами. При этом необходимо ответить на следующие вопросы: 1) как собственно материал и конструкции из него влияют на организм, 2) каков характер ответа организма на имплантацию материала/изделия, 3) под действием каких факторов организма in vivo материал и конструкции из него и каким образом изменяется.
Эти исследования реализуются на стыке биотехнологии, химии высокомолекулярных соединений, биофизики, молекулярной и клеточной биологии, медицины (Шумаков с соавт., 2003; «Biotechnology of Biopolymers: From Synthesis to Patents», 2004; «Biopolymers for Medicinal and Pharmaceutical Applications», 2005; Штильман, 2007; Хенч, Джонс, 2007) и включают разработку новых материалов и переработку их в специализированные изделия; изучение механизма взаимодействия материалов с кровью и тканями; оценку биотехнологических, физико-химических и медико-биологических свойств; экспериментально-клиническое исследование.
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в биотехнологии новых материалов в последние годы, пока не удалось создать материалы, полностью совместимые с живым организмом. Основными факторами, сдерживающими широкое применение остро востребованных биодеградируемых в живом организме материалов являются, в принципе, небогатый ассортимент данных материалов, а также пока не решенная проблема регулируемости процессов их функционирования и деструкции в живом организме (Zhu et al., 2003; Liu et al., 2005, Yun et al., 2004; Balthasar et al., 2005; «Biotechnology of Biopolymers: From Synthesis to Patents», 2004; «Biopolymers for Medicinal and Pharmaceutical Applications», 2005; Штильман, 2007; Хенч, Джонс, 2007).
Открытие и изучение полигидроксиалканоатов (ПГА) - полиэфиров микробиологического происхождения, явилось значимым событием для биотехнологии новых материалов. ПГА (в англоязычной литературе — polyhydroxyalkanoates, РНА) — линейные, термопластичные и биоразрушаемые полимеры микробиологического происхождения. Интерес к
ПГА растет с конца 80-х - начала 90-х годов. Сферы применения ПГА потенциально широки и могут включать сельское и коммунальное хозяйство, радиоэлектронику, фармакологию. Особо перспективны эти полимеры для разработки изделий и устройств медико-биологического назначения. Из ПГА возможно получение нетканых и одноразовых изделий, шовных и перевязочных материалов, систем доставки лекарственных средств, матриксов и для клеточной и тканевой инженерии, элементов для восстановительной хирургии и трансплантологии (Noisshiki and Komatsuzaki, 1995; 1996; Amass et al., 1998; Pouton, Akhtar, 1996; Kassab et al., 1997; Atkins, 1997; Kim et al., 2000; Sodian et al., 1999; 2000a,b;2002; Hoerstrup et al., 1999; 2000; Stock et al., 2000; Ttiresin et al., 2001; Korkusuz et al., 2001; Asrar and Graus, 2002; Williams, Martin, 2002; Sudech, 2004; Kenar et al., 2006;2007; Zorlutana et al., 2007;2008; Jing et al., 2008).
Медико-биологические исследования ПГА до недавнего времени выполнялись исключительно за рубежом с применением препаратов Biopol®, DegraPol/btc®, производимых известными фирмами (Metabolix Inc., Tepha, Proctor & Gambel). В России целенаправленные исследования ПГА отечественного происхождения были начаты и активно проводятся в Институте биофизики СО РАН.
В настоящее время исследование ПГА активно проводится всеми развитыми странами, однако многие ключевые вопросы биотехнологии и материаловедения ПГА остаются открытыми. Это вопросы, связанные с получением высокоочищенных образцов и способами получения из ПГА специализированных изделий медико-биологического назначения различных типов. Остаются не изученными в полной мере кинетика и закономерности биоразрушения этих полимеров in vivo. Отсутствие четких представлений о механизме взаимодействия изделий из ПГА с клетками и тканями различной структуры, а также медико-технических характеристиках и эффективности их функционирования in vivo делают эти вопросы первоочередными для исследований.
Это определило направление исследований настоящей работы, ориентированной на комплексное исследование ПГА применительно к конкретным биомедицинским задачам: конструирование экспериментальных изделий из ПГА медико-биологического назначения и проведение всесторонних исследований закономерностей их взаимодействия при имплантации in vivo для получения доказательства биосовместимости и функциональности как необходимой основы для внедрения в практику.
Цели и задачи исследования. Цель работы - комплексное исследование и экспериментальное обоснование применения биоразрушаемых полигидроксиалканоатов в качестве хирургических имплантатов, самостоятельных эндопротезов и систем доставки лекарственных средств.
Для достижения цели сформулированы следующие задачи:
1. На основе ПГА разработать семейство функциональных изделий медико-биологического назначения, исследовать физико-механические свойства, устойчивость к воздействию биологических сред и физико-химических факторов.
2. Исследовать биосовместимость ПГА в культурах клеток и в экспериментах на животных на уровне клеточного ответа, реакции тканей и всего организма
3. Изучить кинетику биоразрушения ПГА в биологических средах in vivo в зависимости от технологии переработки полимера, формы и места имплантации изделия.
4. Оценить эффективность ПГА в качестве биосовместимых эндопротезов, шовного материала, остеопластических имплантатов, для депонирования и доставки лекарственных средств.
Научная новизна. Впервые проведены комплексные исследования экспериментальных образцов семейства хирургических изделий и имплантатов биомедицинского назначения, разработанных из биоразрушаемых полимеров (ПГА). В культурах клеток и в экспериментах на лабораторных животных показана биологическая безопасность созданных полимерных изделий на уровне клеток, тканей и организма. Показано, что биодеградация ПГА in vivo реализуется гуморальным и клеточным путями с участием макрофагов и гигантских клеток инородных тел с высокой активностью клеточной и сывороточной кислой фосфатазы; течение процесса биоразрушения ПГА зависит от химической структуры полимера, формы и места имплантации изделия. Впервые исследована реакция различных тканей и закономерности регенераторного процесса в ответ на имплантацию изделий из ПГА и получены количественные данные, характеризующие реакцию тканей на имплантацию ПГА. Показано, что ответная реакция тканей характеризуется не продолжительным посттравматическим воспалением без образования выраженных фиброзных капсул и неблагоприятных реакций. Впервые изучена возможность применения полностью биоразрушаемых эндопротезов из ПГА для реконструкции желчевыводящих путей. Исследованы свойства серии объемных имплантатов из ПГА и доказано, что ПГА и композиты ПГА с гидроксилапатитом биоинертны и не вызывают цитотоксических реакций in vitro и воспалительных, некротических и иных негативных реакций in vivo; обладают остеопластическими свойствами, медленно деградируют и способствуют новообразованию костной ткани, обеспечивая нормальное протекание репаративного остеогенеза. ПГА исследованы в качестве матрикса для депонирования и контролируемой доставки лекарственных средств; доказана безопасность при различных способах введения и изучено распределение и биодеградация полимерных микрочастиц во внутренних органах животных.
Практическая значимость. Разработано семейство изделий из высокоочищенных образцов ПГА, отвечающих требованиям, предъявляемым и к материалам и изделиям биомедицинского назначения. На основе изученных свойств растворов, расплавов, эмульсий и порошков определены условия, необходимые для переработки ПГА в специализированные изделия в виде шовных волокон, плоских и объемных матриксов, микрочастиц, полимерных эндопротезов. Отработаны способы модификации структуры матриксов из ПГА с применением химических и физических методов, обеспечивающие получение функциональных матриксов (scaffolds) в виде гибких пленок и мембран, пригодных для клеточных технологий. Биологические и физико-химические свойства полимерных изделий позволяют рекомендовать их для использования в различных областях реконструктивной медицины. Моножильный шовный материал из ПГА обладает необходимой механической прочностью и пригоден для хирургии. Показана возможность использования ПГА для изготовления полностью биоразрушаемых эндопротезов, эффективных для реконструкции желчевыводящих путей. Разработанные объемные имплантаты из ПГА и в композиции с гидроксилапатитом пригодны для реконструкции дефектов костной ткани. Полимерные микрочастицы являются перспективной формой для длительного функционирования in vivo при различных способах введения и позволяют осуществить местную доставку высокотоксичных антипролиферативных препаратов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Разработанная серия экспериментальных изделий из ПГА в виде плоских и объемных матриксов, шовного материала, биосовместимых эндопротезов, систем депонирования и доставки лекарственных средств; результаты их комплексных исследований, свидетельствующие о биосовместимости и соответствии требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям медико-биологического назначения.
2. Характер взаимодействия разработанных полимерных изделий с биологическими тканями различной структуры (мышечной, костной, тканей внутренних органов); ответная реакция тканей на имплантацию, характеризующаяся не продолжительным посттравматическим воспалением без образования выраженных фиброзных капсул и неблагоприятных реакций, и течение регенераторного процесса.
3. Закономерности биодеградации полигидроксиалканоатов in vivo в зависимости от способа и места введения, реализуемой гуморальным и клеточным путями с участием макрофагальных клеток; возможность длительного функционирования полимерных изделий in vivo, от нескольких месяцев до года.
4. Экспериментальное обоснование возможности применения изделий из ПГА в качестве биосовместимых и функциональных эндопротезов, шовного материала, остеозамещающих имплантатов и матриксов для депонирования и доставки лекарственных препаратов.
Комплекс задач сформулирован впервые; их решение обеспечило получение новых фундаментальных знаний по различным аспектам биотехнологии полигидроксиалканоатов и являются научной основой для практического применения отечественного материала и изделий нового поколения.
Работа выполнена в раках плановой тематики НИР Института биофизики СО РАН (№№ госрегистрации: 0120.0 404601;01.200703092) и при поддержке Министерства образования РФ и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF); Международного научно-технического центра (МНТЦ-ISTC), Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ), Красноярского краевого фонда науки (ККФН), Программы Президента РФ для молодых кандидатов наук, Фонда содействия отечественной науке, Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки-медицине», Программы Интеграционных программ Сибирского отделения РАН, Программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенциала высшей школы».
Вклад автора состоит в планирование и проведение всех экспериментов, обработке и анализе полученных результатов, подготовке публикаций.
Выражаю признательность за постоянное внимание и помощь в работе научному консультанту работы академику И.И. Гительзону, научным сотрудникам Института биофизики СО РАН - д.б.н. Т.Г. Воловой Т.Г., к.б.н. Г.С. Калачевой, к.б.н. О.А.Могильной и А.П. Пузырю, аспирантке А.В. Горевой, инженерам О.Г. Беляевой и В.Ф. Плотникову,
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Шишацкая, Екатерина Игоревна
9. Результаты исследования дали новые фундаментальные знания о медико-биологических свойствах нового перспективного биоматериала и закономерностях его взаимодействия с биологическими тканями. Полученные результаты имеют значение для биотехнологии полигидроксиалканоатов и являются научной основой для их медико-биологического применения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Настоящая работа посвящена комплексным исследованиям биосовместимости и функциональных свойств семейства изделий медико-биологического назначения, разработанных из резорбируемых линейных полимеров микробиологического происхождения полигидроксиалканоатов, ПГА), и технологии их применения как необходимой научной основы для внедрения в практику перспективного биоматериала нового поколения.
Недостаток знаний и проработанности ряда вопрос по различным аспектам биотехнологии этих полимеров ограничивает широкое их использование в практике. Это, прежде всего, отсутствие данных о условиях, обеспечивающих получения из ПГА специализированных изделий медико-биологического назначения различных типов, медико-технических и функциональных характеристиках, а также кинетики и механизме биодеградации их в биологических средах в зависимости от геометрии, массы изделия, места и длительности имплантации. Без четких представлений о механизме взаимодействия изделий из ПГА с клетками и тканями организма и возможных сроках сохранения ими функциональных свойств in vivo невозможно прогнозировать эффективность их применения в тех или иных реконструктивных биомедицинских технологиях.
Это определило цель работы, направленной на комплексное исследование и экспериментальное обоснование применения ПГА в качестве хирургических имплантатов, самостоятельных эндопротезов и для депонирования и доставки лекарственных средств.
Для достижения цели необходимо было разработать семейство функциональных изделий медико-биологического назначения, исследовать физико-механические и медико-биологические свойства, включая устойчивость к воздействию биологических сред, биосовместимость на уровне клеточного ответа, реакции тканей и целого организма; изучить кинетику биорезорбции в биологических средах и оценить эффективность ПГА в качестве шовного материала, биосовместимых эндопротезов, остеопластических имплантатов и матрикса для депонирования и доставки лекарственных средств.
Получены следующие основные результаты:
С использованием высокоочищенных и охарактеризованных образцов ПГА разработано и исследовано семейство специализированных изделий для медицины в виде шовных волокон, 2-х и 3-х-мерных плотных и пористых матриксов и микрочастиц. Из расплавов ПГА получены моножильные волокна высокой механической прочности (прочность 306 МПа, модуль упругости 3 ГПа, удлинение при разрыве 24%), пригодные для хирургии. Для целей репаративного остеогенеза механо-физическим методом получен композитный материал из ПГА и биологического гидроксилапатита (ГАП) и исследованы структура и физико-химические свойства композита. Установлена возможность применения для стерилизации изделий из ПГА общепринятых физических и химических методов.
Разработанные полимерные конструкции различной формы и массы позволили имплантировать их в мышцу, кость, кровоток, внутренние органы и впервые исследовать реакцию тканей различной структуры на имплантацию ПГА. Показана высокая биосовместимость ПГА с различными тканями и возможность имплантирования на длительные сроки без развития негативных реакция со стороны системы крови, различных тканей и целого организма.
Установлено, что биодеградация ПГА in vivo реализуется гуморальным и клеточным путями с участием макрофагов и гигантских клеток инородных тел с высокой активностью кислой фосфатазы, коррелирующей с активностью фермента в сыворотке крови животных. Процесс биоразрушения ПГА in vivo зависит от химической структуры полимера, формы и места имплантации изделия. Уменьшение массы полимерных волокон, имплантированных в мышечную ткань, сопровождается незначительными изменениями микроструктуры без существенной потери прочности в течение длительного (до 6 месяцев и более) времени. Установлено, что разрушению подвергается поверхность нитей без образования грубых дефектов и значительной потери прочности. Независимо от состава имплантированных полимерных ПГА-волокон и длительности контакта с внутренней средой организма, отклонений в росте и развитии животных, а также функции крови и показателях обмена не выявлено. Впервые получены количественные данные, характеризующие реакцию мышечной ткани на имплантацию ПГА и показано, что она характеризуется кратковременным посттравматическим воспалением без образования грубых фиброзных капсул, признаков некрозов тканей, кальцификации и иных неблагоприятных реакций. Моножильные шовные волокна из ПГА обладают необходимой прочностью в течение постоперационного периода и не уступают по функциональным характеристикам традиционным шовным материалам (шелку, кетгуту, викрилу).
ПГА положительно оценены в качестве матрикса для депонирования и контролируемой доставки лекарственных препаратов в виде пленок, трехмерных форм и микрочастиц. Показана высокая биосовместимость полимерных микрочастиц и возможность их введения внутрибрюшинно, внутримышечно и внутривенно. Впервые с использованием 14С полимерных микрочастиц исследована динамика распределения полимерных микрочастиц во внутренних органах и закономерности биоразрушения in vivo при внутривенном введение; показано отсутствие негативных реакций организма на внутривенное ведение частиц со стороны крови и внутренних органов и возможность сохранения целостности частиц in vivo при внутримышечном и внутривенном введение до 12 недель и более. На примере антибиотика антрациклинового ряда показана возможность варьирования величиной включения препарата в полимерный матрикс и регулирования скоростью оттока препарата в среду. Отсутствие резких выбросов в начальные периоды наблюдения и низкие скорости выхода препарата в среду свидетельствуют о перспективе использования микросфер из ПГБ в качестве пролонгированной лекарственной формы высокотоксичного рубомицина. Доказана состоятельность ПГБ в качестве матрикса для долговременной (до 12 недель) доставки лекарственных препаратов в ткани и внутренние органы. На животных-опухоленосителях с привитой асцитной карциномой Эрлиха (АКЭ) показано, что разработанная форма рубомицина, депонированного в микросферы из ПГБ ингибирует пролиферативную активность АКЭ и позволяет вводить препарат местно без негативных реакций, возникающих при применении свободного рубомицина.
Исследованы остеопластические свойства сконструированной серии полимерных имплантатов из ПГА и доказано, что они биоинертны, не вызывают цитостатических реакций in vitro в культуре остеобластических клеток и воспалительных, некротических и иных негативных реакций in vivo. В тесте эктопического костеобразования и на модели сегментарной остеотомии показано, что имплантаты из ПГА обладает остеокондуктивными и остеоиндуктвиными свойствами, медленно деградирует in vivo и обеспечивают нормальное протекание репаративного остеогенеза.
Впервые разработаны и исследованы полностью резорбируемые эндопротезы из ПГА. Результатами экспериментально обоснована пригодность трубчатых эндопротезов из ПГА для выполнения реконструктивных операций на желчевыводящих путях.
Решение комплекса сформулированных задач обеспечило получение фундаментальных знаний о новом перспективном биоматериале. Полученные результаты исследования реакции организма и тканей разного строения на введение ПГА в виде изделий различной массы и геометрии позволило получить ответы на заданные вопросы:
- доказано, что собственно ПГА и конструкции из него различной массы и формы безопасны для организма и обладают высокой биосовместимостью;
- ответ тканей различного строения на имплантацию ПГА характеризуются непродолжительной фазой асептического воспаления с активной регенерацией тканей без каких-либо негативных реакций;
- ПГА под воздействием клеток макрофагального ряда, высокоактивных по кислой фосфатазе, медленно деградируют in vivo без резкой потери прочности, обеспечивая длительное функционирование полимерных изделий, от нескольких месяцев до года и более.
В практическом аспекте проведена сертификация технологии синтеза и очистки образцов ПГА; получен гигиенический сертификат соответствия Опытного производства полимеров медицинского назначения Главной санитарно-эпидемиологической службы РФ; разработаны и зарегистрированы Технические условия на три типа ПГА в качестве матриксов функционирующих клеток и лекарственных средств, хирургических имплантатов; в Роспатенте РФ зарегистрирована торговая марка «БИОПЛАСТОТАН™» на ПГА в качестве материала и изделий медико-биологического назначения.
Серия экспериментальных образцов полимеров медицинской степени чистоты и экспериментальных образцов изделий из ПГА в виде пленочных матриксов, стентов с полимерным покрытием, полностью резорбируемых полимерных стентов, пленочных матриксов передана в исследовательские и медицинские учреждения: Научный гематологический центр РАМН, ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава, Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, Красноярский стоматологический научный центр по проблеме сахарного диабета, Клинический Центр новых медицинских технологий СО РАН для проведения исследований в клинических условиях и оценки эффективности применения ПГА для реконструкции дефектов тканей и органов в ортопедии и травматологии, челюстно-лицевой и абдоминальной хирургии.
Полученные результаты имеют значение для биотехнологии новых материалов, материаловедения и реконструктивных медико-биологических технологий. С учетом существующих потребностей практики в новых функциональных биоматериалах полученные результаты направлены на снижение существующего дефицита в биосовместимых имплантатах и эндопротезах ряда областей реконструктивной медицины и создание в России рынка функциональных полимерных конструкций для удовлетворения существующих потребностей практики.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Шишацкая, Екатерина Игоревна, Красноярск
1. Адамян А.А. Основные направления и перспективы в создании и клиническом применении полимерных имплантатов // Биосовместимость. — 1994.-№2.- С. 97-107.
2. Атауллаханов Ф.И., Баташева Т.В., Витвицкий В.М. Влияние температуры, концентрации даунорубомицина и гематокрита суспензии на связывание даунорубомицина эритроцитами человека// Антибиотики и химиотерапия. 1993.- Т.39, № 9-10.- С.26-29.
3. Баркан Р.С., Никольский Н.Н. Минимально трансформированные клеточные линии ЗТЗ как объект исследования механизма пролиферации. //Цитология. 1985.- Т.27, N. 1.- С.5-27.
4. Брицке М.Э. Атомно-абсорбционный спектрофотометрический анализ.//М.:Химия. 1982.- 222 с.
5. Батыралиев Т.А., Першуков И.В., Ниязова-Карбен З.А. и др.????? //Грудная и сердечно-сосудистая хирургия. 2002. № 2.С.21-24.
6. Биосовместимость/ Под ред В.И. Севастьянова // М.: ИЦ ВНИИгеоси-стем, 1999. 368 с.
7. Биотехнология: принципы и применения / Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, И. Дж. Джонса. М.: Мир, 1988.
8. Буттери JI, Бишон Э. Введение в инжиниринг тканей // Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей (под.ред. JI. Хенч, Д. Джонс).- М.: Техносфера, 2007. С.214-222.
9. Буянов В.М., Егиев В.Н., Удотов О.А. Хирургический шов. М., 1993.
10. Буянов В.М., Егоров В.И., Счастливцев И.В. и др. О значении подсли-зистого слоя при сшивании органов желудочно-кишечного трак-та.//Анналы хирургии.- 1999.-Ж4.-С.28-33.
11. Волова Т.Г., Калачева Г.С. Способ получения полимера /?-оксимаслянной кислоты. Патент РФ // № 2051967. - БИ. - 1996. - № 3.
12. Волова Т.Г., Калачева Г.С. Синтез сополимеров полигидроксибутирата и полигидроксивалерата поли(ЗГБ/ЗГВ) бактериями Ralstonia eutropha II Микробиология. -2005. Т.78. - № 1. - С. 71-76.
13. Волова Т.Г., Войнов Н.А., Муратов B.C. и др. Опытное производство разрушаемых биополимеров // Биотехнология. 2006а Биотехнология. -2006.-№.-6.-.С. 28-34.
14. Волова Т.Г., Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И. Полиоксиалканоаты -биоразрушаемые полимеры для медицины / Под ред. академика В.И.Шумакова. Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения РАН, 2003. -350 с.
15. Воспаление: Руководство для врачей / Под. ред. В.В. Серова, B.C. Пау-кова. М.: Медицина, 1995. - 629 с.
16. Воробьев А.А., Бебуришвили А.Г. Хирергическая анатомия оперированного живота и лапораскопическа хирургия спаек//Волгоград.-2001.
17. Воробьев Г.И. 50 лекций по хирургии (под ред. B.C. Савельева).- М.-2003.
18. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение//М.: «Мир».-2002.
19. Григорьянц JI.A., Рабухина Н.А., Бадалян В.А.Применение остеопла-стических материалов при хирургическом лечении больных с радику-лярными кистами, прорастающими в верхнечелюстной синус и полость носа //Клиническая стоматология. 1998. - № 3. - С. 36-38.
20. Грудянов А.И., Григорян А.С., Воложин А.Н. Вопросы эффективности мембранной технологии при лечении заболеваний болезней пародон-та//Стоматология.-2001 -т.80, № 1 .-С.74-77.
21. ГОСТ Р 10993.10.2000 Оценка биологического действия медицинских изделий.
22. Джоунс, Р. Искусственные органы // Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей (под ред. JL Хенч, Д. Джонс). М.: Техносфера, 2007. - С.158-170.
23. Деев Р.В., Исаев А.А., Кочиш А.Ю., Тихилов P.M. Клеточные технологии в травматологии и ортопедии: пути развития// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2007.-Т. И.-С.18-30.
24. Десятиченко К.С., Курдюмов С.Г. Тенденции в конструировании тка-неинженерных систем для остеопластики// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.- 2008.-Т. III, №6.-С.62-69.
25. Дубова Е.А., Щеголев А.И., Чекмарева И.А., и др. Тканевая реакция на имплантацию облегченных полипропиленовых сеток //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2006.- Т. 142, № 12.-С.687-692.
26. Дубова Е.А., Щеголев А.И., Чекмарева И.А., и др.Морфологическая характеристика тканевой реакции в зоне имплантации нетканого полипропиленового эндопротеза "COUSIN'V/Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2007.- Т. 143, № 5.-С.595-600.
27. Егиев В.Н. Шовный материал (лекция)// Хирургия.-1998.-№ 3.- С.33-38.
28. Де Жен П.-Ж. Смачивание: статика и динамика // Успехи физических наук. 1987.- Т. 151. - Вып.1. - С. 619-681.
29. Дудина Барковская А .Я., Миттельман Л.А. Получение первичной культуры гепатоцитов мыши. //Цитология. -1981.- Т.23, N.8.- С.944-946.
30. Искусственные органы/ Под ред. В.И. Шумакова. М.: Медицина, -1990.
31. Коков Л.С., Балан А.Н., Покровский А.В. и др. Первый опыт клинического применения отечественного нитинолового стента для лечения сте-нозирующих поражений артерий // Ангиология и сосудистая хирургия. -1999.-№ 4.-С. 20-24.
32. Куликова Е.В., Витвицкий В.М., Кохно А.В. Введение эритроцитов, нагруженных доксорубомицином, больным с лимфопролиферативными заболеваниями //Гематология и трансфузиология//1998.-Т.43, № 4,- С.26-29
33. Леонтьев В.К., Воложин А.И., Курдюмов С.Г. «Гидроксиапол» и «Колапол» в стоматологии. //Новости стоматологии- 1995. №5. - С.32-35.
34. Лосев Ф.Ф. Использование принципа направленной тканевой регенерации костной ткани в имплантологии // Стоматология для всех. 1998. - № 4. - С. 42-46.
35. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. // М.:Мир.- 1969.- 645с.
36. Липатова Т.Э., Пхакадзе Г.А. Применение полимеров в хирургии. Киев.: Наук. Думка, 1977. - 132 с.
37. Материалы конференций «Фундаментальные науки медицине.- Новосибирск.- 2008.
38. Материалы IV Всероссийского съезда трансплантологов памяти академика В.И. Шумакова// Москва.- 2008.
39. Методические указания (МУ 25.1-001.86). Устойчивость изделий медицинской техники к воздействию агрессивных биологических жидкостей. Методы испытаний.// М:Министерство прибростроения, средств автоматизации и систем управления. М.-1986.-17с.
40. Морфологические и биохимические аспекты биодеструкции полимеров / Под ред. Г.А. Пхакадзе. Киев.: Наук, думка, 1986. - 152 с.
41. Музыкант Л.И., Дудникова Г.Н. Современные данные о функциональной морфологии клеток грануляционной ткани в кожной ране // Архив патологии. 1975. - № 5. - С. 80-87.
42. Наноматериалы. Нанотехнологии.Наносисттемная техника( под ред П.П. Мальтцева)//М. изд-во Техносфера.Серия «Мир материалов и технологий». -2006.- 149 с.
43. Ольхов А.А. Иорданский А.Л., Шаталова О.В. Смеси на основе поливинилового спирта и полигидроксибутирата // Пластические массы. -2002. № 12. - С. 20-22.
44. Ольхов А.А., Иорданский А.Л., Власов С.В., и др. Композиционные материалы на основе сегментированного полиуретана и полигидроксибутирата // Пластические массы. 2003. - № 4. - С. 8-12.
45. Платэ Н.А. Полимеры для медицины // Наука в СССР. 1986. - № 1. -С. 2-9.
46. Платэ Н.А., Васильев В.Е. Физиологически активные полимеры. М.: Химия, 1986.-294 с.
47. Полимеры медицинского назначения// Под ред. С. Манабу. М.: Медицина, 1981.-248 с.
48. Протопопов А.В., Коков Л.С., Покровский А.В. и др. Клиническое применение отечественного нитинолового стента при атеросклеротиче-ском поражении артерий // Патология кровообращения и кардиохирургия. -2001 а.-№2.-С. 74-76.
49. Протопопов А.В., Покровский А.В., Коков Л.С. и др. Экспериментальная разработка и клиническое применение отечественного саморасширяющегося нитинолового стента // Первая краевая. 2001 б. - № 9. - С. 813.
50. Пхакадзе Г.А., Яценко В.П., Коломийцев А.К. и др. Биодеструктивные полимеры. Киев.: Наук, думка, 1990. - 143 с.
51. Репин С.В., Ржанинова А.А., Шаменков Д.А. Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная биология и медицина. М.: Реметэкс, 2002.
52. Розанова И.Б. Биодеструкция имплантатов // Биосовместимость / Под. ред В.И. Севастьянова. 1999. - С. 212-242. (М.: ИЦ ВНИИ).
53. Розанова И.Б., Васин С.Л. Кальцификация имплантатов // Биосовместимость/Под. ред В.И. Севастьянова. 1999. - С. 246-294. (М.: ИЦ ВНИИ).
54. Сайт ВОЗ // http://www.who.int/ru/index.html.
55. Сакураи Я., Акаикэ Т. Взаимодействие полимеров медицинского назначения с живым организмом. Введение в биоматериаловедение // Полимеры медицинского назначения/ Под ред. С. Манабу. М.: Медицина. -1981.-С. 194-243.
56. Сборник методических рекомендаций по оценке биосовместимых свойств искусственных материалов, контактирующих с кровью. Под ред. Добровой Н.Б., Носковой Т.П., Новиковой С.П, Севастьянова В.И.// М.: «ВНИТИПРИБОР».- 1991.- 70 с.
57. Севастьянов В.И. Биоматериалы для искусственных органов // Искусственные органы/ Под ред. В.И.Шумакова. М.: Медицина, 1990. - С. 214220.
58. Севастьянов В.И. Биосовместимые материалы медицинского назначения // Перспективные материалы. 1995. - № 5. - С. 41-55.
59. Севастьянов В.И. Новое поколение материалов медицинского назначения // Перспективные материалы. 1997. -№ 4. - С. 41-55.
60. Севастьянов В.И., Васин С.Л., Перова Н.В. Методы исследования биоматериалов и медицинских изделий // Биосовместимость / Под ред В.И. Севастьянова. М.: ИЦВНИИгеосистем, 1999. - С. 47-87.
61. Севастьянов В.И., Лаксина О.В., Новикова С.П. и др. Современные ге-мосовместимые материалы для сердечно-сосудистой хирургии / Под ред. В.И. Шумакова (медицина и здравоохранение, серия хирургия). М.: ВНИИМИ, 1987. - Вып. 2.
62. Севастьянов В.И., Немец Е.А. Пути повышения гемосовместимости биомедицинских изделий // Бирсовместимость / Под ред В.И. Севастьянова. М.: ИЦВНИИгеосистем, 1999. - С. 295-352.
63. Севастьянов В.И., Перова Н.В., Довжик И.А. и др. Медико-биологические свойства полиокси-алканоатов-биодеградируемых бактериальных полимеров // Перспективные материалы. — 2001. № 5. - С. 4755.
64. Севастьянов В.И., Розанова И.Б., Цейтлина Е.А. и др. Методология отбора гемосовместимых материалов в условиях in vitro для искусственных органов // Медицинская техника. 1990. - № 4. - С. 26-29.
65. Воспаление: Руководство для врачей/ Под. ред В.В.Серова, В.С.Паукова. М: Медицина, 1995. - 640 с.
66. Сетков Н.А., Полуновский В.А., Епифанова О.И. Зависимость вступления клеток линии NIH ЗТЗ в период синтеза ДНК от длительности их предварительного пребывания в покое. // Цитология. -1984.- Т.25, N. 8.- С. 936-942.
67. Сосудистое и внутриорганное стентирование. Руководство, (под ред. Кокова Л.С., Капранова С.А., Долгушина Б.И. и др.).- Москва: издательский Дом «Грааль».-2003.-366 с.
68. Суковатых Б.С., Бежин А.И., Нетфга А.А., и др. Экспериментальное обоснование и клиническое применение отечественного эндопротеза «ЭСФИЛ» для пластики брюшной стенки// Вестник хирургии.-2004Т.63,№ 6.-С.48-50.
69. Сухих Г.Т., Малайцев В. Д., Богданова И. М. Дубровина И. В. Мезен-химальные стволовые клетки // Бюллетень экспериментальной биологии. -2002.-Т. 133.-№2.-С. 124-131.
70. Тандзава X. Полимеры, совместимые с живым организмом // Полимеры медицинского назначения. -1981. С. 87. (Тбилисси)
71. Толь X. Сохранение альвеолярного гребня и наращивание десны // Клиническая стоматология. 2001. - № 4. - С. 40-43.
72. Транпслантология. Руководство для врачей/под ред В.И.Шумакова.-М.:000 «МИА», 2006- 400с.
73. Трансплантология. Под ред. В.И. Шумакова // М.:Медицина. 1995.
74. Федоров В.Д., Адамян А.А., Гогия Б.Ш. Эволюция лечения паховых грыж//Хирургия.-2000а.-№ 1,- С.1 51.-14.
75. Федоров В.Д., Адамян А.А., Гогия Б.Ш. Эволюция лечения паховых грыж //Хирургия.-2000 б.-№ 3,- С. 51.-53.
76. Фомин В.А., Гузеев В.В. Биоразлагаемые полимеры, состояние и перспективы использования // Пластические массы. 2001. - № 2. - С. 42-46.
77. Фрешни 3. Культура животных клеток. М.: Мир, 1989. - 322 с.
78. Хенч Д., Джонс Д. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей (под ред. А.А. Лушниковой) //М. изд-во Техносфера. Серия «Мир биологии и медицины».-2007.-304 с.
79. Хилькин A.M., Шехтер А.Б., Истранов Л.П. и др. Коллаген и его применение в медицине. — М.: «Медицина», 1976. — 210 с.
80. Чайкина М.В. Механохимия природных и синтетических апатитов. Новосибирск: Изд-во СО РАН,2002.-223 с.
81. Чапут К., Яхиа X., Ландри Д. и др. Полигидроксибутират бактериального происхождения как поверхность для культивирования фибробластов связок позвоночника пациента // Биосовместимость. — 1995л. Т. 3. - С. 21-30.
82. Чапут К., Ассад М., Яхиа X. и др. Оценка цитотоксичности и гемолитической активности бактериальных сополимеров на основе полигидро-ксибутирата в условиях in vitro II Биосовместимость. — 19956. Т. 3. - С. 31-42.
83. Шабанов В.Ф., Кузнецов Б.Н., Щипко М.Л., Волова Т.Г., Павлов «Фундаментальные основы комплексной переработки углей КАТЭК для получения энергии, синтез-газа и новых материалов с заданными свойствами»// Новосибирск. Изд-во Наука.-2005. с. 231.
84. Шевцов В.И., Попова JI.A. Совершенствование способов чрескостного ос-теосинтеза — новая методология реабилитации больных в травматологии и ортопедии//Курортные ведомости. 2006.-Т. 38.-С.136-140.
85. Шефтель В.О. Полимерные материалы. Токсические свойства: Справочник. -JL: Химия, 1982. 239 с.
86. Шехтер А.Б., Розанова И.Б. Тканевая реакция на имплантат // Биосовместимость / Под. ред В.И. Севастьянова. 1999. - С.174-211.(М.: ИЦ ВНИИгеосистем).
87. Шишацкая Е.И. Медико-биологические свойства биодеградируемых бактериальных полимеров полиоксиалканоатов для искусственных органов и клеточной трансплантологии: Автореф. дис. канд. мед.наук. НИИ-ТиИО МЗ РФ. М., 2003. - 23 с.
88. Штильман М.И. Полимеры медико-биологического назначения //М:ИКЦ «Академкнига»-2006-399 с.
89. Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Скалецкий Н.Н. и др. Трансплантация островковый клеток поджелудочной железы. М.: Канон, 1995.
90. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенников М.Е. и др. Дифференци-ровка стромальных клеток костного мозга в кардиомиоцитоподобные клетки различных видов млекопитающих // Бюлл. Эксп. Биол. И Мед. -2003а. Т. 135. - №4. - С. 393-396.
91. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Расулов М.Ф. и др. Использование предифференцированных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для лечения глубоких ожоговых ран // Вестник хирургии им. И.И.Грекова. 20036. - Т. 162. -№4.-С. 38-41.
92. Шумаков В.И., Севастьянов В.И. Биополимерные матриксы для искусственных органов и тканей // Здравоохранение и медицинская техника. -2003в. № 4. - С. 30-33.
93. Эммануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов // М:Наука.-1977.- 419 с.
94. Ярема И.В., Магомедов М.А. профилактика образования послеоперационных спаек //Российские медицинские вести.-2003.-№ 2.-С.34-38.
95. Яценко В.П., Кабак К.С., Терещенко Т.Л., Коломийцев А.К // Морфологические и биохимические аспекты биодеструкции полимеров. Киев.: Наук, думка, 1986. - С. 73-89.
96. Abe Н. Thermal degradation of environmentally degradable poly(hydroxyalkanoic acid)// Macromol Biosci. -2006.-V. 14; N.6.-P. 469-86.
97. Abe H., Doi Y. Enzymatic and environmental degradation of racemic poly(3-hydroxybutyric acid)s with different stereoregularities // Macromol.-1996. V. 29. - P. 8683-8688.
98. Abe H., Marsubara I., Doi Y. Physical properties and enzymatic degradabil-ity of polymer blends of bacterial poly(i?)-3-hydroxybutyrate. stereoisomers // Macromol. 1995. - V.28. - P. 844-853.
99. Abe H., Doi Y., Hori Y. et al. Physical properties and enzymatic degradabil-ity of copolymers of poly(i?)-3-hydroxybutyric acid. and (S,S)~ lactet // Polymer. 1997. - V.39. - P. 59-67.
100. Abe H., Doi Y., Satkowski M.M. et al. Miscibility and morphology of blends of isotactic poly(3-hydroxybutyrate) // Macromol. 1994. - V. 27. - P. 50-54.
101. Abe H., Matsubara I., Doi Y. Physical properties and enzymatic degradabil-ity of polymer blends of bacterial poly (R)-3-hydroxybutyrate. and poly[(R,S)-3-hydroxybutyrate] stereoisomers // Macromolecules. 1995. - V. 28. - P. 844853.
102. Abe H., Doi Y., Aoki H. et al. Solid-state structures and enzymatic degrad-ability for melt-crystallized films of copolymers of (R)-3-hydroxybutyric acid with different hydroxyalkanoic acids // Macromol. 1998. - V.31. - P. 17911797.
103. Abe H., Kikkawa Y., Iwata T. et.al. Microscopic visualization on crystalline morphologies of films for poly(R)-3-hydroxybutyric acid. and its copolymer // Polymer. 2000.1. V.41.-P. 867-874.
104. Alberts KA, Loohagen G, Einarsdottir H. Open tibial fractures: faster union after unreamed nailing than external fixation// Injury.-1999.-V.8.-P.519-523.
105. Anderson J.M. Inflammatory response to implantants //ASAIO. 1988. - V. 11.-P. 101-106.
106. Anderson J.M. Mechanisms of inflammation and infection with implanted devices // Cardiovasc. Pathol. 1993. - V. 2 (Suppl.). - P. 33-41.
107. Anderson J.M. Biomaterials and medical implant science: Present and future perspectives: A summary report // J. Biomed. Mater. Res. 1996. - V. 32. - P. 143-147.
108. Anderson A.J., Dawes E.A. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates // Microbiol. Rev. 1990. - V. 54. - P. 450-472.
109. Anderson J.M., Shive M.S. Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microsheres// Adv Drug Deliv Rev.- 1997.-V.28.-P.25-24.
110. Angelova N., Hukeler D. Rationalizing the design of polymeric biomaterials // Tibtech. 1999. - V.17. - P. 409-421.
111. Asrar J., Gruys K.J. Biodegradable Polymer (Biopol®) // In: Series of Bio-polymers in 10 vol. (A. Steinbuchel.Ed.) Wiley VCY Verlag GmbH. - 2002. -Vol. 4. - P. 55-86.
112. Atkins T.W. Fabrication of microcapsules using poly(ethelene adipate) and ablend of poly(ethylene adipate) with poly(hydroxybutyrate-hydroxyvalerate): incorporation and release of bovine serum albumin // Biomaterials. 1997. - V. 18.-P. 173-180.
113. Atkins T.W., Peacock S.J. The incorporation and release of bowine serum albumin from poly-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate microcapsules // J.Microincapsulation. 1996a. -V. 13.-P. 709-717.
114. Avella M., Martuscelli E. Poly-D-(-)-(3-hydroxybutyrate)/polyIethylenen oxide) blends: phase diagram, thermal and crystallization behavior // Polymer. -1998.-V. 29.-P. 1731-1737.
115. Avella M., Martuscelli E., Greco P. Crystallization behavior of poly(ethylenen oxide) from poly-D-(-)-(3-hydroxybutyrate)/poly(ethylenen oxide): phase structuring, morphology and thermal behavior // Polymer. -1991.-V. 32.-P. 1647-1653.
116. Balthasar S., Michaelis K., Dinauer N., et al. Preparation and characterization of antibody modified gelatin nanoparticles as drug carrier system for uptake in // Biomaterials. 2005. - V. 26. - P. 2723-2732.
117. Baptist J.N. Processing for preparing poly-/?-hydroxybutyric acid // US Patent № 3,036,959. 1962a.
118. Baptist J.N. Processing for preparing poly-/?-hydroxybutyric acid // US Patent № 3,044,942. 1962 b.
119. Baptist J.N. Molded product containing poly-/?-hydroxybutyric acid and method of making // US Patent № 3,107,172. 1963.
120. Baptist J.N. Plasticized poly-/?-hydroxybutyric acid and process // US Patent №3,182,036.- 1965.
121. Baptist J.N., Ziegler J.B. Method of making absorbable surgical sutures from poly beta hydroxy acid // US Patent № 3 229 766. 1965.
122. Bassas M, Diaz J, Rodriguez E, Espuny MJ, Prieto MJ, Manresa A. Microscopic examination in vivo and in vitro of natural and cross-linked polyunsaturated mclPHA// Appl Microbiol Biotechnol. -2008.-V.78, N.4.-P.587-96.
123. Behrend D., Kramer S., Schmitz K.P. Biodegradation and biocompatibility of resorbable poluester // Zetl. Interoke. Biomater. 2000. - P.28-32.
124. Bertrand O.F., Sipehia R., Mongrain R. et al. Biocompatibility aspects of new stent technology// J.Amer. Coll. Cardiology //1998.V.32, No 3. P.562-571.
125. Beumer G.J., van Blitterswijk C.A., Ponec M. Biocompatibility of a biodegradable matrix used as a skin substitute: an in vivo evaluation // Br. J. Addict Alcohol Other Drugs. 1978. - V. 73. - № 4. - P. 423-424.
126. Billingham N.C., Henman T.J., Holmes P.A. Degradation and stabilization of polyesters of biological and synthetic origin // In: Development in Polymer Degradation (N.Grassie. Ed.). Amsterdaam: Elsevier. 1978. - V. 7. - P. 81121.
127. Bioartificial organs. I. (A. Procop, D: Hunkelen, and A.D. Cheirington.Eds.) // Annals of the New York. Academy of Sciences. 1997. - V. 831. - 476 p.
128. Bioartificial organs. II. (D.Hunkelen, A.Procop, and A.D. Cherrington. Eds.) // Annals of the New York. Academy of Sciences. 1999. - V. 875. - 4151. P
129. Bioartificial Organs III. Tissue Sourcing, Immunoisolation, and Clinical Trials. D. Hunkeler, A. Cherrington, A. Prokop, R. Rajotte (eds.) // Annals of the New York Academy of Sciences N.Y. 2001. - V. 944.
130. Biocompatibility Polymers, Metals, and Composites. (N. Szycher Ed.), Technom. Publ. Co Inc., Lancaster. 1983.
131. Biomedical Polymers. (S.W. Shalaby Ed.), Hanser/Gardner Publ., Inc., Cincinnati. 1994.
132. Biopolymers for Medicinal and Pharmaceutical Applications (Steinbuchel A. and Marchessault R. H. eds.).- Hardcover. Handbook Wiley-VCH, Wein-heim.- 2005.-1133p.
133. Biotechnology of Biopolymers: From Synthesis to Patents (Steinbuchel A. and Doi Y., (eds.)// Hardcover Handbook. Wiley-VCH, Weinheim.-2004.-l 190p. BioWorld // http://www.cbio.ru.
134. Biomedical Polymers. Designed-to-Degrade Systems (Shaloby W.Shaloby.
135. Ed.).- Hanser Publishers, Minich Vienna. New York. 1994a. - 263 p.
136. Biomedical Polymers. S.W. Shalaby (ed.). Hanser //Gardner Publ. Inc. Cincinnati. -1994b.
137. Blumm E., Owen A.J. Miscibillity, crystallization and melting of poly(3-hydroxobutyrate)/poly(L-lactide) blends // Polymer. 1995. - V. 36. - P. 40774081.
138. Bonthrone K.M., Clauss J., Horowitz D.M. et al. The biological and physical chemistry of poly-hydroxyalkanoates as seen by NMR spectroscopy // FEMS Microbiol. 1992. -V. 103. - P. 269-277.
139. Borden M., Attawia M., Laurencin C.T. The sintered microsphere matrix for bone tissue engineering // J Biomed Mater Res. 2002. - V. 61. - № 3. - P. 421429.
140. Borkenhagen M., Stoll R.C., Suter U.W. et al. In vivo performance of a new biodegradable polyester system used as a nerve guidance channel // Biomate-rials. 1998. - V. 19. -№ 23. - P. 2155-2165.
141. Borsa J., Fontaine A., Hoffer E. et al. Retrospective comparison of the patency of Wallstents and Palmaz long-medium stents used for TIPS // Cardio-vasc.Int.Radiol. 2000. -V.23. - P. 332-335.
142. Bourne, R.B. Fractures of the patella after total knee replacement// Orthop Clin North Am. -1999.-V. 2.-P.287-291.
143. Brandl H., Gross R., Lenz R. et al. Plastics from bacteria and for bacteria: poly(-y0-hydroxyalkanoates) as natural, biocompatible, and biodegradable polyesters // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1990. - V. 41. - P. 77-93.
144. Brannon-Peppas L. Polymers in controlled drug delivery // Medical Plastics and Biomaterials. 1997. - V. 6. - P. 34-46.
145. Braunegg G., Lefebvre G., Genzer K.F. Polyhydroxyalkanoates, biopoly-esters from renewable resources: Physiological and engineering aspects (Rewiew article) // J. of Biotechnol. 1998. - V. 65. - P. 127-161.
146. Breitenbach A., Mohr D., Kissel T. Biodegradable semi-crystalline comb polyesters influence the microsphere production by means of a supercriticalfluid extraction technique (ASES) // J. Control. Rel. 2000. - V. 63,1.1-2. - P. 53-68.
147. Biinger C.M, Grabow N, Sternberg K, et al. A biodegradable stent based on poly(L-lactide) and poly(4-hydroxybutyrate) for peripheral vascular application: preliminary experience in the pig// J Endovasc Ther. -2007.-V. 14.-P.725-733.
148. Burpee V.F., Hackenberg R.W., Hillegas D.V. Acid phosphatase activity as enzymatic assent of the polymer-tissue compatibility// J. Biomed.Mater.Res. -1978.-V. 12.-№5.-P. 767-771.
149. Byron D. Polymer synthesis by microorganisms: technology and economics // Trends Biotechnol. 1987. - V. 5. - P. 246-250.
150. Byron D.(ed.) Biomaterials: novel materials from biological sources. -Stockton, New York, 1989.
151. Byron D. Production of poly-P-hydroxybutyrate: polyhydroxyvalerate copolymers // FEMS Microbiol. Rev. 1992. - V. 103. - P. 247-250.
152. Byron D. Polyhydroxyalkanoates // In: D.P. Mobley.Ed. Plastics from microbes: microbial synthesis of polymers and polymer precursors. Hanser Munich. 1994. -P.5-33.
153. Cammas S., Bear M.M., Moine L. et al. Polymers of malic and 3-alkylmalic acid as synthetic PHA in the design of biocompatible hydrolysable devices // Int. J. of Biol. Macromol. 1999. - V. 25. - № 1-3. - P. 273-282.
154. Cao A., Arai Y., Yoshie N. et al. Solid structure and biodegradation of the compositionally fractionated poly(3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxypropionic acids)// Polymer. 1999. - V. 40. - P. 6821-6830.
155. Canetti M., Urso M., Sadocco P. Influence of the morphology and of the supermolecular structure on the enzymatic degradation of bacterial poly(3-hydroxybutyrate) // Polymer. -1999. V. 40. - P. 2587-2594.
156. Carroccio A., Ellozy S., Spielvogel D. et al., Endovascular Syent Garfting of Thoracic Aortic Aneurysms // Dev.Endovasc.Endoscop. Surgery. 2003. - V.17.-P. 473-478.
157. Chaput С., Des Rosiers E.A., Assad M. et al. Processing biodegradable natural polyesters for porous soft materials // NATO ASI Ser. 1995a. - V. 294. - P. 229-245.
158. Chaput C., Yahia L., Selmani A. et al. Natural Poly(hydroxybutyrate-hydroxyvalerate) polymers as degradable biomaterial // Res.Soc.Symp.Proc. -1995b.-V. 394.-P. 111-116.
159. Chen G., Wu Q. The application of polyhydroxyalkanoates as tissue engineering materials // Biomaterials. 2005. - V. 26. - P.6565-6578.
160. Cheung A.K., Lemke H. Criteria and standardization for biocompatibility // Nephrol. Dial. Transplant. 1994. -V16. - №1. - P.72-76.
161. Chun Y.S., Kim W.N. Thermal properties of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) and poly( г-caprolactone) blends.-Polymer. 2000. - V. 41. -P. 2305-2308.
162. Consensus conference of biocompatibility // In: (H.Klinkmann, A.M.Davison Eds). Nephrol. Dial. Transplant. Oxford, Oxford University. -1994. V. 9 (Suppl.). - P. 32-40.
163. Conti C.R. Restenosis after angioplasty: Have we found the Holy Grail? // Clin.Cardiol//-2002.V.25, No.2. P.47-48
164. Conway B.R., Eyles J.E., Alpar H.O. Immune response to antigen in microspheres of different polymers // Proc. Int. Symp. Controlled release Bioact. Mater. 1996. - V. 23. -P. 335-336.
165. Conway B.R., Eyles J.E., Alpar H.O. A comparative study on the immune responses to antigens in PLA and PHB microspheres // J.Controlled release. -1997.-V.49.-P.1-9.
166. Coskun S, Korkusuz F, Hasirci V. Hydroxyapatite reinforced poly(3-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) based degradable composite bone plate // J Biomater Sci Polym Ed. -2005.-V. 16.-P.1485-1502.
167. Costagna M.T., Mintz G.S., Weissman NJ. et al. The contribution of "mechanical" problems to in-stent restenosis. An intravascular ultrasound analysis of 1090 consecutive in-stent restenosis lesions// Amer. Heart J.2001.V.142. P.970-974.
168. Cox M.K. Properties and applications of polyhydroxyalkanoates // In: Biodegradable Plastics and Polymers.(Y.Doi and K. Fukuda. Eds.). Amsterdam: Elsevier. - 1994. - P. 120-135.
169. Daculsi G. New technology for calcium phosphate bioactive ceramics in bone repair // Medical Biological Engineering & Computing. 1999. - V. 37. -Suppl. 2. -Part II. - P. 1598-1599.
170. Damien C.J., Parsons J.R. Bone graft and bone graft substitutes:a review of current technology and applications// J. Appl. Biomater. -1991.-V.2.-P.187 -208.
171. Dang M.-H., Birchler F., Ruffieux K., Wintermantel E. Toxocity screening of biodegradable polymers I.Section and evaluation of cell culture test methods //J. Environ.Poly.Degrad. 1996. - V. 4. - P. 197-203.
172. Davies M.C., Short R.D., Khan M.A. et al. A XPS and SSIMS analysis of biodegradable biomedical polyesters // Surface & Inter. Analysis. 1989. - V. 14. - P. 115-120.
173. Dawes E.A (Ed.) Novel biodegradable microbial polymers // Kluwer Academic, Dordrecht, the Netherlands. 1990. - 287 p.
174. D'Haene P., Remse E.E., Asras J. Preparation and characterization of a branched bacterial polyester // Macromol. 1999. - V. 32. - P. 5229-5235.
175. Degradable Materials. (Barenberg S., Brash J., Narayan R., Redpath A. Eds.), CRC Press, Boca Raton. 1990.
176. Dijkhuizen-Radersma R., Hesseling S.C., Kaim P.E. et al. Biocompatibility and degradation of poly(ether-ester) microspheres: in vitro and in vivo evaluation // Biomaterials. 2002. - V. 23. - P. 4719-4729.
177. Doi Y. Microbial polyesters // VCH Publishers : New-York. 1990.
178. Doi Y. Microbial synthesis, physical properties, and biodegradability of polyhydroxyalkanoates. 1995.
179. Doi Y., Abe H. Structural effects on biodegradation of aliphatic polyesters// Macromol. Symp. 1997. -V. 118. - P. 725-731.
180. Doi Y., Kanesawa Y., Tanahashi N. et al. Biodegradation of microbial poly(hydroxyalkanoates) // Makromol. Chem. Rapid. Commun. 1989. - V.10. -P. 227-230.
181. Doi Y., Segawa A., Kawaguchi Y. et al. Cyclic nature of poly(3-hydroxyalkanoate) metabolism in Alcaligenes eutrophus II FEMS Microbiol. Lett. 1990. - V. 67. - P. 165-170.
182. Doi Y., Kanesawa Y., Kawaguchi Y. et al. Hydrolytic degradation of microbial polyesters in the marine environment // Polym. Degrad. Stub. 1992a. -V.36.-P.173-177.
183. Doi Y., Kawaguchi Y., Nakamura S. et al. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates //FEMS Microbiol.Rev. 1992b. - V. 1-3. - P. 103-108.
184. Doi Y., Mukai K., Kasuya K. et al. Biodegradation of biosynthetic and chemosyntchetic polyhydroxyalkanoates.// In: Y.Doi and K. Fukuda K. (Eds). Biodegradable plastics and polymers. Elsevier, Amsterdam. 1994. - P. 39-51.
185. Dong J., Kajima H., Uemura T. et al. In vivo evaluation of a novel porous hydroxyapatite to sustain osteogenesis of transplanted bone marrow-derived osteoblastic cells // J. Biomed. Mater Res. 2001. - V. 57. - № 2. - P. 208-216.
186. Doyle C., Tanner E.T., Bonfield W. In vitro and in vivo evaluation of Poly-hydroxybutyrate and polyhydroxyvalerate reinforced with hydroxyapatite // Biomaterials. 1990. - V. 11. - № 3. - P. 206-215.
187. Doyle C., Tanner E.T., Bonfield W. In vitro and in vivo evaluation of poly-hydroxybutyrate and polyhydroxyvalarate reinforced with hydroxyapatite // Biomaterials. 1991. - V. 12. - № 2. - P. 841-847.
188. Drury J.K., Ashton T.R., Cunningham J.D. et al. Experimental and clinical experience with a gelatin impregnated Dacron prosthesis // Ann. Vase. Surg. -1987. -V.l.-P. 542-547.
189. Duarte M.G., Brunnel D., Gil M.H. et al. Microcapsules prepared from starch Derivatives I I J. Mater. Sci: Mater. In Medicine. 1997. - V. 8. - P. 321323.
190. Duprat G., Wright K., Charnsangavej C. et al. Seft expanding metallic stents for small vessels:an experimental evalution // Radiology. 1987. -V. 162. - P. 469-472.
191. Duvernoy O, Malm T, Ramstrom J, Bowald S. A biodegradable patch used as a pericardial' substitute after cardiac surgery: 6- and 24-month evaluation with CT //Thorac Cardiovasc Surg. 1995-.V.43.-P.271-274.
192. Engelberg I., Kohn J. Physico-chemical properties of degradable polymers used in medical application: a comparative study // Biomaterials. 1991. - V. 12. - P. 292-304.
193. Entholzner E., Mielke I., Piclilmeier R. et al. EEG changes during sedation with gamma-hydroxybutyric acid // Anesthetist. 1995. - V. 44. - P. 345-350.
194. Embelton I.K., Tighe В J. Polymers for biodegradable medical devices. X: Microincapsulation studies: control of polyhydroxybutyrate-hydroxyvalerate microcapsule porosity via polycaprolactone blending // Biomaterials. 1993. -V. 10. -№3.-P. 341-352.
195. Ferro C, Ambrogi C, Perona F., Barile A., Cianni R. Malignantprosthesis: Wallstent vs Strecker's stent. // Radiol. Med. (Torino). 1993. Vol. 85. N. 5. -P. 644-647.
196. Fontaine A.B., Borsa J J., Hoffer E. et al. Evaluation of silicone as an en-dovasculare stent membrane: in (vivo) canine studies // Cardiovasc Intervent Radiol.-2001.-V.24.-№ 5,- P. 324-328.
197. Forri D., Bee G., Kreuzer M., Wenk C. Novel biodegradable plastics in sheep nutrition. 2. Effect of NaOH pretreatment of poly(3-hydroxybutyrate) onin vivo digestibility and on in vitro desappearance // J.Ann.Physiol. Nutr. -1999a. -V.81.-P.41-50.
198. Forri D., Bee G. Wenk C. Digestive utilization of novel biodegradable plastic in growing pigs // Ann. Zoolog. 1999b. - V.48. - P. 163-171.
199. Foster L.J. Biosynthesis, properties and potential of natural-synthetic hybrids of polyhydroxyalkanoates and polyethylene glycols// Appl Microbiol Biotechnol. -2007,- V.75, N.6.-P.1241-1247.
200. Freiberg S., Zhu X. Polymer microspheres for controlled drug release // Int. J. Pharm. 2004. - V. 282. - P. 1-18.
201. Freischlag J., Moore W. Clinical .experience with a collagen-impregnated knitted Dacron vascular graft // Ann. Vase. Surg. 1990. - V. 3. - P. 895-903.
202. Furgenson D.Y., Dreher M.R., Chilkoti A. Structural optimization of a "smart" doxorubicin-polypeptide conjugate for thermally targeted delivery to solid tumors// J Control Release. 2006. -V.l 10, No 2.- P.362-369
203. Furuhashi Y., Imamura Y., Jikihara Y. Highe order structyres and mechanical properties of bacterial homo poly(3-hydroxybutyrate) fibers prepared by col-drawing annealing processes // Polymer. 2004. - V. 45. - P. 5703-5712.
204. Galaev I.Y., Mattiasson B. "Smart" polymers and what they could do in biotechnology and medicine // TibTech. 1999. - V. 17. - P. 335-340.
205. Galego N., Miguens F.C., Sanchez R. Physical and functional characterization of PHAscl membranes // Polymer. 2002. - V. 43. - P. 3109-3114.
206. Galgut P., Pitrola R., Waite I. et al. Histological evaluation of biodegradable and non-degradable membranes placed in rat // J.Clin.Periodental. 1991. - V. 18.-P. 581-586.
207. Galletti P, Jauregui H.O. Liver support systems. In: Bronzino J( ed.) The biomedical engineering handbook. Boca Raton. FL: CRC Press. 1995. - P. 952-966.
208. Gangrade N., Price J.C. Poly(hyrdoxybutyrate-co-hydroxyvalerate) microspheres containing progesterone: preparation, morphology and release properties //J. Microencapsulation. 1991. - V. 8. - P. 185-202.
209. Gassner F., Owen A.J. Physical properties of Poly(/?-hydroxybutyrate)-Poly(/?-caprolactone) blends // Polymer. 1994. - V. 35. - P. 2233-2236.
210. Grabow N, Biinger CM, Schultze C, et al., A biodegradable slotted tube stent based on poly(L-lactide) and poly(4-hydroxybutyrate) for rapid balloon-expansion// Ann Biomed Eng. -2007.-V. 35.-P.2031-2038.
211. Giewirtz D.A. A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the amtracycline antibiotics andromycin and daun-ombomicin // Biochem. Pharmocol. 1999. V.57, No7. P.727-741.
212. Gerlach J.C. Development of a hybrid liver support system // A Review. Int. J. Artif. Organs. 1996. - V.19. - P.645-654.
213. Gillams A., Dick R., Dooley J.S., et al.Self-expandable stainless steel braided endoprosthesis for biliary strictures. // Radiology. 1990. N. 174. -P. 137-140.
214. Goepferich A., Mathiowitz E. Biodegradable polymers: polyanhydride // Encyclopedia of controlled drug delivery. New York: Wiley. - 1999. - P. 6171.
215. Goepferich A., Tessmar J. Polyanhydride degradation and erosion // Adv. Drug Deliv. Rev. 2002. - V. 54. - P. 911-931.
216. Gogolewski S., Javanovic M., Perren S.M. The effect of melt-processing on the degradation of selected polyhydroxyacids: polylactides, polyhydroxybu-tyrate and polyhydroxybutyrate-co-valerates // Degradation and Stability. — 1993a.-V. 40.-P. 313-322.
217. Goh S.H., Ni X. A completely miscible ternary blend system poly(3-hydroxybutyrate) poly(ethylene oxide) and polyepichlorohydrin // Polymer. -1999. -V. 40. P. 5733-5735.
218. Gonzalez O., Smith R.L., Goodman S.B. Effect of size, concentration, su-face area and volume of polymethylmethacrylate particle on human macrophages in vitro II J. Biomed. Mater. Res. 1996. - V. 30. - P. 463-475.
219. Gordeev S.A., Nekrasov Y.P. Processing and mechanical properties of oriented poly(/?-hydroxybutyrate) fibers // J. Mater. Sci. Lett. 1999. - V. 18. - P. 1691-1692.
220. Gordeev S.A., Nekrasov Y.P., Shilton S.J. Processing of Gel-Spun Poly(/?-hydroxybutyrate) fibers // J. Appl.Polym. Sci. 2001. - V. 81. - P. 2260-2264.
221. Gotfredsen K., Nimb L., Hjorting-Hansen E. Immediate implant placement using a biodegradable barrier polyhydroxybutyrate-hydroxyvalerate reinforced with polyglactin. An experimental study in dogs // Clin. Oral. Res. 1994. - V. 5. - P. 83-91.
222. Gould P.L., Holland S.J., Tighe B.J. Polymers for biodegradable medical devices. IV. Hydroxybutyrate-velerate copolymers as nondisintegrating matrices for controlled-release oral dosage forms // Int. J. Pharm. 1987. - V. 38. - P. 231-237.
223. Grabow N, Bunger CM, Schultze C, et al., A biodegradable slotted tube stent based on poly(L-lactide) and poly(4-hydroxybutyrate) for rapid balloon-expansion// Ann Biomed Eng. -2007.-V. 35.-P.2031-2038.
224. Griffith L.G. WTEC Panel on Tissue engineering research. Final report (Mclntire L.V., Greisler H., Griffith L., et al. // Biomaterials. Chapter 2. -2002.-P. 7-11.
225. Gross R.A. Bacterial polyesters: structural variability in microbial synthesis. In: Biomedical Polymers. Shalaby Sh.W. (ed.). Hanser, N.Y. 1994. - P. 173188.
226. Grove J.E., Bruscia E., Krause D.S. Plasticity of bone marrow-derived stem cells// Stem Cells. 2004. - V. 22. - № 4. - P. 487-500.
227. Gursel Ih., Hasirci V. Properties and drug release behaviour of poly(3-hydroxybutyric acid ) and various poly(3-hydroxybutyrate —hydroxyvalerate) copolymer microcapsules // J.Microincapsulation. 1995. - V. 12. - P. 185-193.
228. Gursel Ih., Korkusaz F., Ttiresin F. et al. In vivo application of biodegradable controlled antibiotic release systems for the treatment of implant-related osteomyelitis // Biomaterials. 2000. - V. 22. - № 1. - P. 73-80.
229. Hao J:, Deng X. Semi-interpenetrating networks of bacterial poly(3-hydroxybutyrate) with net-poly(ethylene glycol) // Polymer. 2001. - V. 42. - P. 4091-4091.
230. Hant J.A., Flanagan B.F., McLaughlin P.J. et al. Effect of biomaterial surface charge on the inflammatory response:Evalution of cellular infiltration and TNFaproduction//J. Biomed. Mater.Res. 1996. - V. 31.-P. 139-145.
231. Harewood G.C., Baron Т.Н., LeRoy A.J., Petersen B.T. Cost-effectiveness analysis of alternative strategies for palliation of distal biliary obstruction after a failed cannulation attempt // Am. J. Gastroenterol. 2002. Vol. 97. - N. 7. - P. - 1701-1707.
232. Hartman H.M., Vehof J.W.M., Spauwen P.H.M., Jansen Y.A. Ectopic bone formation in rats: the importance of the carrier// Biomaterials.- 2005.-V. 26.-P.1829-1835.
233. Hasircii V. Biodegradable biomedical polymers // In: Biomaterials and Bio-engineering Handbook (Wase D.L. Ed). New-York: Marcel Dekker. 2000. - P. 141-155.
234. Hasircii V., Giirsel I., Turesin F. et al. Microbial polyhydroxyalkanoates as biodegradable drug release materials // In:Biomedical Sience and Technology (A.A.Hincal and H.S.Kas.Eds.) New-York: Plenum Press. 1998. - P. 183-187.
235. Hazer В, Steinbiichel A. Increased diversification of polyhydroxyalkanoates by modification reactions for industrial and medical applications//Appl Microbiol Biotechnol.- 2007 .- V.74.-P.1-12.
236. Heller J., Barr J., Ng S.Y., et al. Poly(ortho esters) their development and some recent applications // Eur. J. Pharm. Biopharm. - 2000. - V. 50. - P. 121128.
237. Heller J., Barr J., Ng S.Y. et al. Poly(ortho esters) synthesis, characterization, properties and uses // Adv. Drug Deliv. Rev. 2002. - V. 54. - P. 10151039.
238. Hench L.L. Biomaterials: a forecast for the future // Biomaterials. 1998. -V. 19.-P. 1419-1423.
239. Heuer A., Fink D., Laraia V. et al. Innovative materials processing strategies: a biomimetic approach // Science. 1992. - V. 255. - P. 1098-1105.
240. Hocking PJ. and Marchessault, R.H. Biopolyeasters //in:Chemistry and technology of Biodegradable Polymers (Griffin G.J. Ed.). Glasgow:Blackie. -1994. P. 48-96.
241. Hocking P.J., Timmins M.R., Sherer T.M. et al. Enzymatic degradability of poly(/?-hydroxybutyrate) as a function of tacticity // J. Macromol. Sci Pue Appl Chem A. 1996. -V. 32. - P. 889-894.
242. Hoerstrup S.P., Zund G., Ye Q. et al. Tissue engineering of a bioprosthetic heart valve: stimulation of extracellular martix assessed by hydroxyproline assay // ASAIO J. 1999. -V. 45. - P. 397-402.
243. Hoerstrup S.P., Sodian R., Dzebris S. et al. Functional trileflet heart valves grown in vitro // Circulation. 2000. - V. 102. - P. 44-49.
244. Hoffman A.S. Molecular bioengineering of biomaterials in the 1990s and beyond: a growing liason of polymers with molecular biology // Artif. Organs. -1992. -V.16.-№1. -P. 43-49.
245. Hoffman A.S. "Intelligent" polymers in medicine and biotechnology // Artif Organs. -1995. V.19. - № 5. - P. 458-467.
246. Holland S.J., Tighe B.J., Gould P.L. Polymers fur biodegradahte medical devices. The potential of polyesters as controlled macromolecular release systems // J.Controlled Release. -1986. V. 4. - P. 155-180.
247. Holland S.J., Jolli A.M., Yasin M. et al. Polymers for biodegradable medical devices. II. Hydroxybutyrate-hydroxyvalerate copolymers: hydrolytic degradation studies // Biomaterials. 1987. - V. 8. - № 3. - P. 289-295.
248. Holland S.T., Yasin M., Tighe B.J In vitro and in vivo evaluation of polyhy-droxybutyrate and polyhydroxyvalerate reinforced with hidroxyapatite // J.Biomed. Engeen. 1990b. - V. 12. - № 2. - P.102-104.
249. Holmes P.A. Applications of PHB — A microbially produced biodegradable thermoplastic // Phys. Technol. 1985. - V.16. - P. 32-36.
250. Holmes P.A. Biologically produced /3-3-hydroxyalkanoate polymers and copolymers // In: Developments in Crystaline Polymers (Bassett D.C. Ed.) London: Elsevier. 1988. - V. 2. - P. 1-65.
251. Horowitz E.M., Prockop D.J., Fitzpatrick L.A. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta // Nat.Med. 1999. - V. 5. - № 3. - P. 309-313.
252. Hu Y., Grainger D.W., Winn S.R. et al. Fabrication of poly(/?-hyrdoxy acid) foam scaffolds using multiple solvent systems // J. Biomed Mater Res. 2002. -V. 59.-№3.-P. 563-572.
253. Hu Y., Winn S.R., Krajbich I. et al. Porous polymer scaffolds surface modified with arginine-glycine-aspartic acid enhance bone cell attachment and differentiation in vitro И J. Biomed Mater Res. 2003. - V. 64A. - № 3. - P. 583590.
254. Huang Z.-M., Zhang Y.-Z., Kotaki M. et al. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites // Composites Sci.Technol. 2003. - V. 63. - P. 223-2253.
255. Huang Z.-M., Zhang Y.-Z., Ramakrishna S. et al. Electrospinning ans mechanical characterization of gelatin nanofibers // Polymer. 2004. - V. 45. - P. 5361-5368.
256. Hutmacher D.W. Scaffold design and fabrication technologies for engineering tissues state of the art and future perspectives // J. Biomater. Sci. Polymer Edn. -2001. - V. 12. -№ l.-P. 107-124.
257. James S. J., Pogribna M., Miller B.J. et al. Characterization of cellular response to silicone implants in rats: implications for foreign-body carcinogenesis //Biomaterials. 1997. - V.18. - P. 667-675.
258. Jendrossek D. Microbial Degradation of Polyesters //Adv. Biochem. Engin. Biotechnol.-2001. V. 71. - P. 293-325.
259. Jendrossek D., Handrick R. Microbial degradation of Polyhydroxyalkanoates // Annu. Rev. Microbiol. 2002. - V. 56. - P. 403-432.
260. John K.R., Zardiackas L.D., Terry R.C. Histological and electron microscopic analysis of tissue-response to synthetic composite bone graft in the ca-nine//J. Appl. Biomater.-1995.-V.-P.89 -97.
261. Johnson H.J., Northup S.J., Seagraves P.A. e.a. Biocompatibility test procedures for materials evaluation in vitro. II. Objective methods of toxicity assessment // J. Biomed. Mater. Res.-1985.-Vol.l9.-P.489-508.
262. Kang I.-К., Choi S.-H., Shin D.-S. et al. Surface modification of polyhy-droxyalkanoate films and their interaction with human fibrablasts // Int. J. of Biol. Macromol. 2001. - V. 28. - № 3. - P. 205-212.
263. Kanewasa Y., Tanahashi N., Doi Y. et al. Enzymatic degradation of microbial poly(3-hydroxyalkanoates) // Polymer Degrad. and Stability. 1994. - V. 45.-P. 179-185.
264. Kassab A. Ch., Xu K., Denkbas E.B. et al. Riphampicin earring polyhy-droxybutyrate microspheres as potential chemoembolization agent // J. Bioma-ter. Sci. Polymer Edn. 1997. - V. 8. - P. 947-961.
265. Kassab A.Ch., Piskin E., Bilgis S. et al. Embolization with polyhydroxybu-tyrate (PHB) microspheres: in vivo studies // J. Bioact.Compat.Polym. 1999. -V. 14.-P. 291-303.
266. Kasuya K., Inoue Y., Yamada K. et al. Kinetics of surface hydrolysis of poly(R)-3-hydroxybutyrate. film by PHB depolymerase from Alcaligenes fae-calis T1 // Polym. Degrad. Stab. 1995. - V. 48. - P. 167-174.
267. Kato M., Bao H.J., Kang C.K. et al. Production of a novel copolyesters of 3-hydroxybutyric acid and medium-chain-length 3-hydroxyalkanoic acids by Pseudomonas sp. 61-3 from sugars // Appl.Microbiol. Biotechnol. 1996. - V. 45.-P. 363-370.
268. Katsufumi H., Takao Y., Yoshihiko K. e.a. The influence of calcium phosphate ceramics and glass-ceramics on cultured cells and their surrounding media//J. Biomed. Mater. Res.-1989.-Vol.23.-P.1049-1066.
269. Kenar H, Kose GT, Hasirci V. Tissue engineering of bone on micropatterned biodegradable polyester films// Biomaterials. -2006.-V.27.-P.885-895.
270. Kenar H, Kocabas A, Aydinli A, Hasirci V. Chemical and topographical modification of PHBV surface to promote osteoblast alignment and confinement //J Biomed Mater Res.- 2007.-V.28 (Epub ahead of print)
271. Kenawy El-R., Layman J.M., Watkins J.R. et al. Electrospinning of poly(ethylene-co-vinyl alcohol) fibers // Biomaterials. 2003. - V. 24. - P. 907913.
272. Keskin D.S, Tezcaner A, Korkusuz P, Korkusuz F, Hasirci V. Collagen-chondroitin sulfate-based PLLA-SAIB-coated rhBMP-2 delivery system for bone repair // Biomaterials. -2005.- V.26.-P.4023-4034.
273. Kessing R., Fenn J., Tepper G. The use of AC potentials inelectrospraying and elecrospining processes // Polymer. 2004. - V. 45. - P. 2981-2984.
274. Khil M S., Kim H.K., Kim M.S. et al. Nonofibrous mats of poly(trimethylene terephtalate) via elecrospining // Polymer. 2004. - V. 45. -P. 295-301.
275. Kim G.J., Bang K.H., Kim Y.B. et al. Preparation and characterization of native poly(3-hydroxybutyrate) microspheres from Ralstonia eutropha II Biotechnology letters. 2000. - V.22. - № 18. - P. 1487-1492.
276. Klinge U., Klosterhalfen В., Ottinger A.P., et al. PVDF as a new polymer for the construction of surgical meshes// Biomaterials.-2002.-V.23.-P.3487-3493.
277. Knowles J.C., Hastings G.W. In vitro and in vivo investigation of a range of phosphate glass-reinforced polyhydroxybutyrate based on degradable composites // J. Material. Sci. -1993a. V. 4. - P.102-106.
278. Knowles J.C., Hastings G.W. Physical properties of a degradable composite for orthopaedic use which attaches bone // Proceeding First Int. Conference on Intelligent Materials (Takagi T. Ed). Lancaster:Technomic. 1993b. - P. 495504.
279. Korkusuz F., Korkusaz P., Eksioglu F., et al. In vivo response to controlled antibiotic release systems // J.Biomed. Mater. Res. 2001. - V. 55. - № 2. - P. 217-228.
280. Korsatko-Wabnegg В., Korsatko W. Polyhydroxyalkanoates as drug carriers for the formulation of tablets with "quik-release" effect // Pharmazie. 1990. -V. 45. - № 9. - P. 691-692.
281. Kose G., Kenar H., Hasirci N. et al. Macroporous poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) matrices for bone tissue engineering // Biomaterials. — 2003a.-V. 24. -P.1949-1958.
282. Kose G.T, Ber S, Korkusuz F, Hasirci V. Poly(3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxyvaleric acid) based tissue engineering matrices // J Mater Sci Mater Med. -2003b.-V.14.-P.121-126.
283. Kose G.T, Korkusuz F, Korkusuz P, Hasirci V. In vivo tissue engineering of bone using poly(3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxyvaleric acid) and collagen scaffolds// Tissue Eng. -2004.-V.10.-P.1234-1250.
284. Kose G., Korkusur F., Ozkul A. Tissue engineerig cartilage on collagen and PHBV matrices // Biomaterials. 2005. - V. 26. - P. 5187-5197.
285. Kostopoulos I., Karring T. Guided bone regeneration in mandibular defects in rats using a bioresorbable polymer // Clin. Oral Impl. Res. 1994a. - V. 5. -P. 66-74.
286. Madden L.A., Anderson A.J., Asrar J. et al. Production and characterization of poly(3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyvalerate-co-4-hydroxybutyrate) synthesized by Ralstonia eutropha in fed-batch cultures // Polymer. 2000. - V. 41. -P. 3499-3505.
287. Madison L.L., Huisman G.W. Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates): From DNA to plastic // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -1999. -V. 63. P. 21-53.
288. Maekawa M., Pearce R., Marchessault R.H. et al. Miscibility and tensile of poly(/?-hydroxybutyrate)-cellulose propionate blends // Polymer. 1999. - V. 40.-P. 1501 -1505.
289. Malm Т., Bowald S., Bylock A. et al. Prevention of postoperative pericardial by closure of the pericardium with absorbable polymer parches. An experimental study // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1992b. - V. 104. - № 3. p. 600-607.
290. Malm Т., Bowald S., Karacagil S. et al. A new biodegradable patch for closure of af atrial septal defect // Scand. J. Thor.Cardiovasc. Surg. 1992c. - V. 26.-P. 9-14.
291. Malm Т., Bowald S., Bylock A. et al. Enlargement of the right ventricular outflow tract and the pulmonary artery with a new biodegradazzble patch in transannular position // Eur. Surg. Res. 1994. - V. 26. -№ 5. - P. 298-308.
292. Marchessault.R.H., Bluhm.T.L., Deslandes.Y. et al. Ро1у(Д hydroxyalcanoates): Biorefinery polymers in search of applications // Macromol. Chem., Macromol.Symp. 1998. -V. 19. - P. 235-254.
293. Marois Y., Zhang Z., Vert M. et al. Effect os sterilization on the physical and structural characteristics of polyhydroxyoctanoate (PHO) // J. Bioma-ter.Sci.polymer. Edn. 1999a. -V. 10.-P. 469-482.
294. Marois Y., Zhang Z., Vert M. et al. In vivo biocompatibility and degradation studies of polyhydroxyoctanoate in the rat: A new sealant for the polyeatere arterial prothesis // Tissue Eng. 1999b. - V. 5. - P. 369-386.
295. Martin D., Williams S. Medical application of polyhydroxybutyrate: a strong flexible absorbable biomaterial//Biochem.Engiin.J.-2003.-V. 16.-P.97-105.
296. Martini F., Perazzo L., Vietto P. Manufacture of Polymeric products // US Patent №4880 592. 1989.
297. Martin D.P., Skraly F.A., Williams S.F. Polyhydroxyalkanoate compositions having controlled degradation rates // PCT Patent application. № WO 99/32536. - 1999.
298. Martin D.P., Peoples O.P., Williams S.F. Nutritional and therapeutic uses of 3-hydroxyalkanoate oligomers // PCT Patent Application № WO 00/04895. -2000.
299. Miller N.D., Williams D.F. On the biodegradation of poly-/?-hydroxybutyrate (PHB) homopolymer and poly-/?-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate copolymers // Biomater. 1987. - V. 8. - P.129-137.
300. Mistry A.S, Mikos A.G. Tissue engineering. Strategiest for Bone Regenerations//Adv. Biochem.Engin/Biotechnol.- 2005-V.94.-P. 1-22.
301. Mistry A.S, Mikos A.G., Jansen J.A. Degradation and biocompatibility of a poly(propylene fumarate)-based/alumoxane nanocomposite for bone tissue engineering// J Biomed Mater Res.- 2007.-V.83.-P.940-953
302. Mo X.M., Xu C.Y., Kotaki M. et al. Electrospun P(LLA-CL) nanofebar: a biomimetic extracellular matrix for smooth muscle cell and endothelial cell proliferation // Biomaterials. -2004. V. 25. - P. 1883-1890.
303. Mohan N. Babapulle, Mark J. Eisenberg Coated Stents for the Prevention of Restenosis // Circulation. 2002. - V. 106. - P. 2859-2864.
304. Molecular and Cellular Methods in Developmental Toxicology (G.P. Daston Ed.) // CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida. 1996.
305. More G.S., Sauders S.M. Advances in Biodegradable Polymer // UK, Kapra. Shiropshire. 1998. - 1000 p.
306. Moroni A., Moroni A., Aspenberg P., Toksvig-Larsen S. Enhanced fixation witn hydroxyapatite coated pins// Clinical Orthopaedics and Related Research.-1998.-V.346.-P. 171 -177.
307. Nagata M, Machida T, Sakai W. et al. Synthesis, Characterization, and Enzymatic Degradation Studies on Novel Network Aliphatic Polyester // Macro-mol. 1998. - V. 32. - P. 6450-6454.
308. Nelson Т., Kaufman E., Kline J. et al. The extraneural distribution of y-hydroxybutyrate // J. Neurochem. 1981. - V. 37. - P. 1345-1348.
309. Nelson S., deSouza N., Allison D. Endovascular stents and stent-grafts: is heparin coating descrable // Cardiovasc Inter. Radiol. 2000. - V. 23. - P. 252255.
310. Nkere U.U., Whawell S.A., Saraff C.E. et al. Pericardial substitution after cardiopulmonary bypass surgery: A trial of an absorbable patch // Thorac. Cardiovasc. Surg. 1998. -V. 46. - P. 77-83.
311. Noda I., Green Ph., Satkowski M. et al. Preparation and Properties of Novel Class of Polyhydroxyalkanoate Copolymers // Biomacromol. 2005. - V. 6. - P. 580-586.
312. Noisshiki Y., Komatsuzaki S. Medical materials for soft tissue use // Japanese Patent Application. № JP 7275344 A2. 1995.
313. Noishiki Y., Tomizawa Y., Yamane Y. et al. Autocrine angiogenic vascular prosthesis with bone marrow transplantation // Nature Med. 1996. - V. 2. - P. 90-93.
314. Oreffo R.O.C. Driessens F.C.M., Planell J.A., triffitt J.T. Growth and differentiation of human bone marrow osteoprogenitors on novel calcium phosphate cements // Biomaterials.-1998.-Vol. 19.-P. 1845-1854.
315. Palmaz JC. Intravascular stents in the last and the next 10 years // J. En-dovasc Ther. -2004. V. 11. - Suppl. 2. - Part II. - P. 200-206.
316. Pi§kin E. Biomaterials in different forms for tissue engineering// In: Porous materials for tissue engineering (Dean-Mo Liu, Vivek Dixit Eds.): Materials Science Forum. 1997. - V. 250. - P. 1-14.
317. Poirier Y., Dennis D.E., Klomparents K. et al. Polyhydroxybutyrate, a biodegradable thermoplastic, produced in trasnsgenic plants // Science. 1992. - V. 256. - P. 520-523.
318. Poirier Y., Nawrath C., Somerville C. Production of polyhydroxyalkanoates, a family of biodegrabable plastics and elastomers, in bacteria and plants // Bio/Technol. 1995. - V. 13. -P. 142-150.
319. Pouton C.W. Polymeric materials for advanced drug delivery// Adv Drug Deliv Rev.2001.-V. 53, N.1.-P.1-3
320. Pouton C.W., Akhtar S. Biosynthetic polyhydroxyalkanoates and their potential in drug delivery // Adv. Drug. Delivery Rev. 1996. - V. 18. - P. 133162.
321. Raitz C.R.H., Ulevitch R.J., Wringht S.D. et al. Gram-negative endotoxin: an extraordinary lipid with profound effects on eucaryotic signal transduction // FASEB J. -1991. V. 5. - P. 2652-2959.
322. Ratner B.D., Chikoti A., and Castner D.G. Contemporary methods for characterizing complex biomaterials //Clin.Materials.- 1993.- V.l 1,- P.25-36.
323. Reusch R.N., Sparrow A.W., Gardiner J. Transport of poly-beta-hydroxybutyrate in human plasma //Biochim.Biophys Acta. 1992. - V. 1123. -P. 33-40.
324. Riboldi S., Sampaolesi M., Neuenschwander P. et.al. Elecrospun degradable polyesterurethane membranes: potential scaffolds for skeletal muscle tissue // Biomaterials. 2005. -V. 26. - P. 4606-4615.
325. Richards G., Nsung S.C., Betty M.T. Multi-pulse drug delivery from a resorbable polymeric microchip device // Nature Mater. 2003. - V. 2. - P. 767772.
326. Rivard C.H., Chaput C., DesRosiers E.A. et al. Fibroblast seeding and culture in biodegradable porous substrates // J. Appl Biomater. 1995. - V. 6. - № l.-P. 65-68.
327. Rivard C.H., Chaput C., Rhalmi S. et al. Bioresorbable synthetic polyesters and tissue regeneration. A study of three-dimensional proliferation of ovine chondrocytes and osteoblasts // Ann. Chir. 1996. - V. 50. - № 8. - P. 651-658.
328. Rouxhet L., Legras R., Schneider Y.-J. Interactions between biodegradable polymer poly(hydroxybutyrate-hydroxyvalerate), proteins and macrophages // Macromol Symp. 1998. - V. 130. - P. 347-366.
329. Rumisek J.D., Wade C.E., Brooks D.E. et al. Heat-denatured albumin-coated Dacron vascular grafts: Physical characteristics and in vivo performance // J. Vase. Surg. 1986. - V. 4. -P. 136-143.
330. Saad В., Ciardelli G., Matter S.,et al. Characterization of the cell response of cultured macrophages and fibroblasts to particles of short-chain poly(R)-3-hydroxybutyric acid // J. Biomed.Mater.Res. 1996. - V. 30. - № 4. - P. 429439.
331. Saad В., Keiser O.M., Welti M. et al. Multiblock copolymers as biomaterials in vitro biocompatibility testing // J. Materials. Sci.: Materials in Medicine. -1997a. -V. 8. № 4. - P. 497-505.
332. Saad В., Hirt T.D., Welti M. et al. Development of degradable polyesterur-erethans for medical applications: in vitro and in vivo evaluations // J. Biomed. Mater. Res. 1997b. - V. 36. - № 1. - P. 65-74.
333. Saad В., Ciardelli G., Matter S. et al. Degradable and highly porous polyes-terurethane foam as biomaterial: effects and phagocytosis of degradation products in osteoblasts // J.Biomed.Mater.Res. 1998. - V. 39. - № 4. - P. 594-602.
334. Saad В., Neuenschwander P., Uhlschmid G.K. et al. New versatile, elas-tomeric, degradable polymeric materials for medicine // Int. J.Biol.Macromol. -1999. V. 25. - № 1-3. - P. 293-301.
335. Saad В., Casotti M., Huber Т.Н. et al. In vitro evaluation of the biofunction-ality of osteoblasts culture on Degra-Pol-foam // J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 2000. - V.l 1. - № 8. - P. 787-800.
336. Saad B, Kuboki Y, Welti M, Uhlschmid GK, Neuenschwander P, Suter UW. DegraPol-foam: a degradable and highly porous polyesterurethane foam as a new substrate for bone formation // Artif Organs. -2000.-V.24.-P.939-945.
337. Sackett K, Hendricks C, Pope R. Collaboration: an innovative education/business partnership// Case Manager. -2000.-V.6.-P.40-44.
338. Saito Т., Tovita K., Juni K., Ooba K. In vitro and in vivo degradation of poly(3-hydroxybutyrate) // Biomaterials. 1991. - V. 12. - № 3. - P. 309-312.
339. Salthouse T.N. Cellular enzyme activity at the polymer-tissue interface// J. Biomed. Mater.Res. 1976. - V. 10. - № 2. - P. 197-229.
340. Salthouse T.N., Matlaga B.F. Significance of cellular enzyme activity at nonabsorbable suture implant sites: silk, polyester, polypropylene // J. Syrg.Res. 1975. - V. 19. - P. 127-132.
341. Sevastianov V.I., Perova N.V., Shishatskaya E.I. et al. Production of purified polyhydroxyalkanoates (PHAs) for applications in contact with blood // J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 2003. - V. 14. - № 10. - P. 1029-1042.
342. Sevastianov V.I., Tseytlina E.A. The activation of the complement system by polymer materials and their blood compatibility // J. Biomed. Mater. Res. -1984.-V. 18.-P. 969- 978.
343. Sevastianov V.I., Shishatskaya E.I., Perova N.V. et al. Production of purified polyhydroxyalkanoates (PHAs) for applications in contact with blood // J. Biomaterial Science.-2003.- V.14, № 10. -P. 1029-1042.
344. Shin H., Jo S., Mikos A.G. Biomimetic materials for tissue engineering// Biomaterials.-2003.-V. 24.-P.4353-4364
345. Shiotani Т., Kobayshi G // US Patent № 5, 292, 860. 1994.
346. Shum-Tim D., Stock U., Hrkach J. et al. Tissue engineering of autologous aorta using a new biodegradable polymer // The Annal. Thorac. Surg. 1999. -V. 68. - № 6. - P.2298-2304.
347. Sodian R., Sperling J.S., Martin D.P. et al. Tissue engineering of a trileaflet heart valve. Early in vivo experiences with a combined polymer // Tissue Eng. -1999. V.5. -P.489-493.
348. Sodian R., Hoerstrup S.P., Sperling J.S. et al. Tissue engineering of heart valves: in vitro experiences // The Annal. Thorac. Surg. 2000a. - V. 70. - № 1. -P. 140-144.
349. Sodian R., Hoeratrup S.P., Sperling J.S. et al. Evaluation of biodegradable, threedemensional matrices for tissue engineering of heart valves // ASAIO J. -2000b.-V. 46.-P. 107-110.
350. Sodian R, Loebe M, Hein A, Martin DP, Hoerstrup SP, Potapov EV, Hausmann H, Lueth T, Hetzer R.Application of stereolithography for scaffold fabrication for tissue engineered heart valves// ASAIO J.- 2002.-V.48, N.I.-P.12-16
351. Soldani G., Steiner M., Galletti P. et al. Development of small-diameter vascular prostheses which release bioactive agents // Clinical Materials. — 1991. -V. 8-P. 81-88.
352. Steinbiichel A. Polyhydroxyalkanoic acids // In: D. Byron (ed.) Biomate-rials: novel materials from biological sources. Stockton, New York. 1990. - P. 124-213.
353. Steinbiichel A. Biodegradable plastics // Curr. Opin. Biotechnol. 1992. -V. 3.-P. 291-297.
354. Steinbiichel A. Presentation at the International Symposium on Bacterial Polyhydroxyalkanoates-94 //Montreal, Canada. 1994.
355. Steinbiichel A. Perspectives for the Biotechnological Production and Utilization of Biopolymers: Metabolic Engineering of Polyhydroxyalkanoate Biosynthesis Pathways as Successful Example // Macromol. Biosci. 2001. - № 1. -P. 1-24.
356. Steinbiichel A., Valentin H.E. Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids // FEMS Microbiol Lett. 1995. - V. 128. - P. 219-228.
357. Steel M.L., Norton-Berry P. Non-wowen fibrous materials // US Patent № 4 603 070. 1986.
358. Stock U., Nagashima M., Khalil P.N. et al. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2000. - V. 119. -№4. - P. 732-740.
359. Suchanelc W, Yashima M, Kakihana M, Yoshimura M. Hydroxyapatite ceramics with selected sintering additives//Biomaterials. -1997.-V.8.-P.923-933.
360. Sudesh K., Abe H., Doi Y. Synthesis, structure and properties of polyhy-droxyalkanoates: biological polyesters // Prog. Polym. Sci. 2000. - V.25. - P. 1503-1555.
361. Sudesh K. Microbial polyhydroxyalkanoates (PHAs): an emerging biomate-rial for tissue engineering and therapeutic applications// Med J Malaysia. -2004.-V.59.-P.55-66.
362. Sudesh K, Loo CY, Goh LK, Iwata T, Maeda M.The oil-absorbing property of polyhydroxyalkanoate films and its practical application: a refreshing new outlook for an old degrading material //Macromol Biosci.- 2007.-V.7, N.ll.-P.l 199-1205.
363. Tamai H., Igaki К., Kyo E. et al. Inital and 6-month result of biodegrable poly-L-lactic acid coronary stents in humans // Cicculation. 2000. - V. 102. -P. 399-404.
364. Taylor M.S., Daniels A.U., Andriano K.P. et al. Six bioabsorbable polymers:^ vitro acute toxicity of accumulated degradation products // J.Appl.Biomater. 1994. - V. 5. - № 2. - P. 151-157.
365. Terada S., Sato M., Sevy A., Vacanti J.P. Tissue engineering in the twenty-first century// Yonsei Med J. -2000.-V.41.-P.685-691.
366. Tomizava Y. Vascular prostheses for aortocoronary bypass grafting: a review // Artif. Organs. 1995. - V. 19. - P. 39-45.
367. Tsuji Т., Tamai H.K. et al. Biodegradable polymeric stents // Curr Interv Cardiol Rep.-2001.-V. 3.-№ 1.-P.10-17.
368. Tsuji Т., Tamai H., Igaki K. et al. Biodegradable stents as a platform to drag loading // Int J Cardiovasc Intervent. 2003. - V.5. - № 1. - P.13-16.
369. Ttiresin F., Gursel I., Hasirci V. Biodegradable polyhydroxyalkanoate implants for osteomyelitis therapy: in vitro antibiotic release // J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 2001. -V.12. - № 2. - P.195-207.
370. Ueda H., Tabata Y. Polyhydroxyalkanoate derivatives in current clinical applications and trials //Adv. Drug Deliv.Rev. 2003. -V. 5 5. - P. 501-518.
371. Uemura Т., Dong Y., Wang Y., Kojima H. Et al. Transplantation of cultured bone calls using combinations of scaffolds and culture techniques// Biomaterials. -2003.-V.24.-P.2277-2286.
372. Unverdorben M., Spielberger A., Schywalsky M. et al. Polyhydroxybutyrate Biodegradable Stent: Preliminary Experience in the Rabbit // Cardiovasc. Inter-vent. Radio. 2002. -V. 25. - P.127-132.
373. Urist M.R. Bone: Formation by autoinductio// Science.-1965.-V.50.-P.893-899.
374. Urist M.R., Leitze A., Davidson E. B-tricalcium phosphate delivery system for bone morphogenetic protein// Clin Ortop.-1984a.-V.187.-P.277-279.
375. Urist M.R., Budy A., Mc Lean F. Purification of bone morpogenetic protein by hydroxyapatite chromatography// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1984b.-V.81.-P.371-375.
376. Urmeneta J., Jordi M., Guerrero R. Biodegradation of Poly-p-Hydroxyalkanoates in Lake Sediment Sample Increases Bacterial Sulfate Reduction // Appl. and Environ. Microbiol. -1995. V.28.- P.2046-2048.
377. Vacanti C.A, Vacanti J.P. The science of tissue engineering // Orthop Clin North Am. 2000. - V. 31. - № 3. - P. 51-56.
378. Valappil S.P, Misra S.K, Boccaccini A.R, Roy I. Biomedical applications of polyhydroxyalkanoates: an overview of animal testing and in vivo responses// Expert Rev Med Devices. -2006.-V.3.-P.853-868.
379. Vert M., Feijen J., Albertsson A. et al. Biodegradable polymers and plastics // Cambridge: Royal society of chemistry. 1992. - 320 p.
380. Virmani R., Kolodgie F. D., Farb A. Drug eluting stents: are human and animal studies comparable // Heart. 2003. - V. 89. - P. 133-138.
381. Volova T.G. Microbial polyhydroxyalkanoates plastic materials of the 21st century (biosynthesis, properties, applications). Nova Science Pub. Inc. NY, USA. - 2004. - 283 p.
382. Wang M. Developing bioactive composite materials for tissue replacement// Biomaterials.- 2003 .-V.24.-P.2133-2151
383. Wang L., Khor Eu., Wee A. et al. Chitosan-alginate PEC membrane as a wound dressing: assessment of incisional wound healing // J. Biomed Mater Res. 2002. - V. 63. - № 5. - P. 610-618.
384. Webb A. Tampon applicators and compositions for making same //Europen Patent №0291024. 1998.
385. Webb A. // US patent № 4900299. 1990.
386. West J.L. Pulsed polymers. Drug delivery // Nature Materials. 2003. - V. 2.-P. 709-710.
387. Williams D.F., Miller N.D. The Degradation of Polyhydroxybutyrate (PHB) // Biomater. Clin. Appl. 1987. - V. 8. - P. 471-476.
388. Williams S.F., Martin D.P., Horowitz D.M., Peoples O.P. PHA applications: addressing the price performance issue. I. Tissue engineering // Int. J. of Biol. Macromol. 1999.-V. 25.-№ 1-3. - P. 11-121.
389. Williams S.F., Martin D.P. Therapeutic uses of polymers and oligomers composing gamma-hydroxybutyrate// PCT Patent Application № WO 01/19361A2. 2001.
390. Williams S.F., Martin D.P. Applications of PHAs in Medicine and Faar-maacy // in Series of Biopolymers in 10 vol. Ed A. Steinbiichel. Wiley-VCY Verlag GmbH. 2002. V. 4. -P. 91-121.
391. Williams S.K., Martin D., Horowitz D.M. Peoples O.P. PHA applicationsA addressing the price performance issue. I. Tissue engineering//Int. J. Biol. Mac-romol.-1999.-V.25, №l-3.-P.l 11-121
392. Wong A, Chan C. Drug-eluting stents: the end of restenosis // Ann Acad Med Singapore. 2004. - V. 33. - № 4. - P. 423-431.
393. Yamamoto H., Mimura Y., Hayakawa N., et al. Diagnosis and management of benign biliary strictures with percutaneous transhepatic cholangioscopy (PTCS). Nippon Geka Gakkai Zassh. 1992; V.93,№ 9.-P. 1138-1141.
394. Yamane H., Terao K., Hiki S. et al. Processing melt spun Polyhydroxybu-tyrate Fibers // Polymer. 2001a. - V. 42. - P. 3241-3249.
395. Yamane H., Terao K., Hiki S., et al. Enzymatic degradation of bacterial homo-poly(3-hydroxybutyrate) melt spun fibers // Polymer. 2001b. - V. 42. -P. 7873-7878.
396. Yamasaki H., Sakai H. Osteogenic response to porous hydroxyapatite ceramics under the skin of dogs// Biomaterials.-1992.-V.5.-P.308 -312.
397. Yang Z., Yuan H., Tong W. Osteogenesis in extraskeletal implanted porous calcium phosphate ceramics variability among different kinds of animals// Biomaterials.-1996.-V.17.-P.2131 -2137.
398. Yen H., Huang Y. Injectable biodegradable polymeric implants for the prevention of postoperative infection // Am J Drug Deliv. 2003. - V. 1. - P. 1-8.
399. Ying Т., Ishii D., Mahara A. Scaffolds from elastromspun PHA-copolymers//Biomaterials.-2008.-V.29.-P.1307-1317.
400. Yoshioka Т., Sakaguchi H., Yoshimura H., et al.Expandable metallic biliary endoprostheses: preliminary clinical evaluation. // Radiology. 1990. N 117. — P. 253-257.
401. Yoon J.S., Oh S.H., Kim M.N. Compatibility of poly(3-hydroxybutyrate)/poly (ethylene-co-vinyl acetate) blends // Polymer. 1998. -V. 39. - P. 2479-2487.
402. Yoon J.S., Lee W.S., Jin H.-J. et al. Toughening of poly(3-hydroxybutyrate with poly(cw-1,4-isporen) // Europ. Polymer J. 1999. - V. 35. - P. 781-788.
403. Yoon J.S., Lee W.S., Kim K. et al. Effect of poly(ethylene glycol)-block-poly(L-lactide) on the poly(R)-3-hydroxybutyrate./poly(L-lactid) blends // Eur. Polymer J. 2000. - V. 36. -P. 435-442.
404. Yoshie N., Goto Y.,Inoe Y. et al. Biosynthesis and NMR studies of poly(3-hydroxybutyrate) produced by Alcaligenes eutrophus HI6 // Int. J. Biol, Mac-romol. 1992. -V. 14.-P. 118-121.
405. Zadar E., Krzan A. SEC-MAILS Characterization of Microbial Polyhydroxyalkanoates // Biomacromol. 2004. - V. 5. - P. 628-636.
406. Zinner G., Behrend D., Schmitz K.P. The hemostasis system as an indicator of hemocompatibility of implantant materials // Biomed. Tech. 1998. - V. 43. -P.432-433.
407. Zhao K., Deng Y., Chen G.-Q. Effects of surface morphology on the bio-compatibility of polyhydroxyalkanoates // Biochemical Engineering J. 2003. -V. 16.-P. 115-123.
408. Zorlutuna P, Builles N, Damour O, Elsheikh A, Hasirci V. Influence of kera-tocytes and retinal pigment epithelial cells on the mechanical properties of polyester-based tissue engineering micropatterned films// Biomaterials. -2007.-V.28.-P.3489-3496.
409. Zorlutuna P, Tezcaner A, Hasirci V. A novel construct as a cell carrier for tissue engineering// J Biomater Sci Polym Ed. -2008.-V.19.-P.399-410.
410. Zund G., Hoerstrup S.P, Schoeberlein A. et al. Tissue engineering: a new approach in cardiovascular surgery; seeding of human fibroblasts followed by human endothelial cells on resorbable mesh // Eur. J. Cardo. Thorac. Surg. -1998.-V. 13. P. 160-164.
411. Zhao K., Deng Y., Chen J.C. et al. Polyhydroxyalkanoate (PHA) scaffolds with good mechanical properties and biocompatibility // Biomaterials. 2003. -V. 24. - P. 1041-1045.
412. Zhu K.J., Zhang J.X., Wang C. et al. Preparation and in vitro release behaviour of 5-fluorouracil-loaded microspheres based on poly(L-lactide) and its carbonate copolymers //J. Microencapsulation. 2003. - V. 20. - P. 731-743.
-
Шишацкая, Екатерина Игоревна
-
доктора биологических наук
-
Красноярск, 2009
-
ВАК 03.00.23
- Экологическая роль полигидроксиалканоатов - закономерности биоразрушения в природной среде и взаимодействия с микроорганизмами
- Технико-технологические основы биосинтеза резервных полигидроксиалканоатов водородными бактериями
- Технико-технологические характеристики процесса биосинтеза биоразрушаемых полимеров и реализация опытного производства
- Синтез полиэфиров гидроксипроизводных жирных кислот (полигидроксиалканоатов) и характеристика состава липидов сине-зеленых, светящихся и водородокисляющих прокариот
- Свойства резорбируемых матриксов из полигидроксиалканоатов различного химического состава
