Экологическая роль полигидроксиалканоатов - закономерности биоразрушения в природной среде и взаимодействия с микроорганизмами

Прудникова, Светлана Владиславна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экологическая роль полигидроксиалканоатов - закономерности биоразрушения в природной среде и взаимодействия с микроорганизмами
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Экологическая роль полигидроксиалканоатов - закономерности биоразрушения в природной среде и взаимодействия с микроорганизмами"

На правах рукописи

ПРУДНИКОВА Светлана Владиславна

ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ: ЗАКОНОМЕРНОСТИ БИОРАЗРУШЕНИЯ В ПРИРОДНОЙ СРЕДЕ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С МИКРООРГАНИЗМАМИ

03.01.06 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 5 ОКТ 2012

Красноярск 2012

005053826

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский федеральный университет» (СФУ) и Федеральном Государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики Сибирского отделения Российской академии наук (ИБФ СО РАН).

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Волова Татьяна Григорьевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Градова Нина Борисовна

доктор биологических наук Сомова Лидия Александровна

доктор технических наук, профессор Рязанова Татьяна Васильевна

Ведущая организация Казанский (Приволжский) федеральный

университет

ого

Защита состоится «20» ноября 2012 года в /Ц час. на заседании диссертационного совета Д 003.007.01 при Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д.50, стр.50, ауд. 1-12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан «_ Н » 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Т/

д-р. биол. наук /^(Ьс^^ Л.А.Франк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В результате активной хозяйственной деятельности и на фоне роста населения планеты во все более широком масштабе увеличивается производство и потребление химических веществ. Объемы выпуска синтетических пластмасс приближаются к 300 млн. тонн в год; их основная часть скапливается на свалках, так как повторной переработке в развитых странах подвергается не более 16-20 % (Kïjchavengkul, Auras, 2008; Chanprateep, 2010). Под полигоны и свалки твердых бытовых отходов ежегодно отчуждается до 10 тыс. га земель, в том числе плодородных, изымаемых из сельскохозяйственного оборота. Полиэтиленовый мусор выводит из строя канализационные и дренажные системы городов, загрязняет водоемы. По данным Green Pease, ежегодно в воды Мирового океана попадает до 10% от объемов выпускаемых пластиков (Moore et al., 2001; Tanabe et al., 2004).

Интенсивные технологии ведения сельского хозяйства требуют применения огромного количества разнообразных химических веществ для борьбы с вредителями, сорняками и возбудителями болезней культивируемых видов. При этом не боле 10 % применяемых и вносимых в окружающую среду пестицидов достигает цели; основная масса этих веществ аккумулируется в биологических объектах, загрязняет почвы, водоемы, вызывает гибель полезных организмов и нарушает равновесие в природных экосистемах (Hansen et al., 2004; Hasler et al. 2010).

Традиционное повсеместное применение продуктов химического синтеза, получаемых из невозобновляемых природных ресурсов, приводит к чрезмерному росту количества неутилизируемых отходов, что вступает в противоречие с мероприятиями, натравленными на защиту окружающей среды и создает глобальную экологическую проблему. Одним из путей снижения антропогенного давления на экосистемы является замена синтетических полимеров природными, которые подвержены биологической деструкции и разлагаются в естественной среде, вовлекаясь в круговорот (Kijchavengkul, Auras, 2008; Волова, 2004; Asrar, Gruys, 2002; Штильман, 2006).

Развитие науки и техники приводит к все более широкому внедрению в практику целевых продуктов, синтезируемых микроорганизмами. Ценным продуктом биотехнологии являются микробные полигидроксиалкапоаты (ПГА), которые обладают спектром полезных свойств, в том числе биосовместимостью и биоразрушаемостью. ПГА перспективны в качестве материала и изделий биомедицинского назначения, разрушаемой упаковки пищи и напитков, предметов гигиены и санитарии, изделий и препаратов для коммунального и сельского хозяйства (Sudech, Doi, 2000; Stock et al., 2000; Asrar, Gruys, 2002; Volova, 2004; Hazer et al., 2007).

количество работ, в которых были бы всесторонне рассмотрены различные аспекты разрушения ПГА в природной среде, в целом невелико; большинство исследований выполнено в лабораторных условиях без учета всей сложности этого процесса (Ме^егй е* а1., 1993; ЛепскоБзек е1 а1., 2001, 2002; ВолаПзеуа е1 а1., 2003, \Voolnough е! а!., 2008). Вместе с тем, разрушаемость ПГА зависит от многих составляющих, таких как химический состав и структура полимера, микробная составляющая биоты как главного агента их биодеградации, а также условий среды, которые, в свою очередь, определяются биологическими, гидротермическими, климатическими и погодными условиями. Результаты по разрушаемости ПГА, полученные в лаборатории, не позволяют прогнозировать поведение и разрушение ПГА в сложных и изменяющихся природных экосистемах. Для этого необходимо комплексное исследование, которое даст ответы на ряд ключевых вопросов: 1) как состав микробиоценоза среды влияет на процесс разрушения ПГА и какие микроорганизмы являются истинными и активными деструкторами ПГА применительно к конкретным внешним условиям; 2) какое воздействие на скорость разрушения оказывают химический состав ПГА, способ изготовления изделий, геометрия и размеры образцов; 3) как изменяются макро- и микроструктура ПГА и их свойства (кристалличность, молекулярная масса, полидисперсность) в процессе разрушения; 4) насколько значимо влияние на этот процесс физико-химических условий среды; 5) каким образом процесс разрушения ПГА будет протекать в регионах, различающихся погодными и климатическими условиями.

Необходимость проведения комплексного исследования, позволяющего адекватно и всесторонне изучить этот многофакторный процесс, послужила основанием для настоящей работы, и позволила поставить ее цель и определить задачи.

Пелч и задачи исследования. Цель работы — комплексное исследование взаимодействия ПГА с природными микробиоценозами и выявление закономерностей биоразрушения в различных климатических зонах во взаимосвязи с физико-химической структурой полимеров.

Для достижения цели необходимо решить следующие задачи:

- сконструировать из ПГА различной химической структуры экспериментальные образцы изделий и изучить закономерности их биоразрушения и последствия взаимодействия с микроорганизмами в лабораторных микроэкосистемах;

- исследовать биоразрушение ПГА в природных экосистемах (почвах и водоемах повышенной солености), расположенных в разных климатических зонах (Сибирский регион, тропики);

- изучить особенности микробиоценозов в районах исследования и выделить доминантные микроорганизмы, участвующие в биоразрушении ПГА; с применением индикаторных сред отобрать первичных биодеструкторов;

- идентифицировать на основе кулыуральных, морфо-физиологических и молекулярно-генетических методов доминантные микроорганизмы-

деструкторы ПГА, характерные для конкретных природных микроэкосистем;

— изучить динамику биодеградации ПГА в сопоставлении с микробиологическими и физико-химическими характеристиками среды с учетом химического состава и формы полимерных образцов;

— исследовать изменения микроструктуры и физико-химических свойств ПГА в процессе биодеградации для формирования представлений о механизме разрушения этого класса полимеров;

— оценить эффективность ПГА для конструирования экологически безопасных и адресных препаратов сельскохозяйственного назначения. Научная повизна. Впервые проведено комплексное исследование

закономерностей биоразрушаемости ПГА в природных условиях микробиоценозами различной структуры, функционирующими в различных климатических и погодных условиях, с учетом структуры полигидроксиалканоатов и их физико-химических свойств. Выполнены сравнительные исследования биоразрушения пленок и объемных прессованных форм из ПГА в природных микроэкосистемах: Сибирских и тропических почвах, морской тропической воде, солоноватоводном озере Шира. Установлено, что в почвах разрушение полимеров сопровождается повышением степени кристалличности; в морской воде в условиях тропиков этот показатель не изменяется, аморфная и кристаллическая фазы полимера подвергаются разрушению в одинаковой мере. Доказано, что в почве и морской воде в условиях тропиков происходит более активное разрушение образцов из гомополкмера (поли-3-гидроксибутирата) по сравнению с сополимерными образцами (поли-З-гидроксибутирата-со-З-гидроксивалерата), в то время как в почвах и водоемах Сибири быстрее разрушаются образцы из сополимера. Активное разрушение ПГА имеет место при обсемененности среды не менее 107 КОЕ в 1 г. Установлено, что ПГА стимулируют развитие микрофлоры. Впервые показано, что на поверхности полимерных образцов формируется микробиоценоз, специфичный для конкретной природной среды, качественно и количественно отличающийся от микробиоценозов контрольных образцов почвы. По совокупности культуральных, морфологических, физиологических признаков и результатов анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S и 28S рРНК идентифицированы первичные микроорганизмы-деструкторы ПГА. Во всех исследованных регионах активными деструкторами ПГА являются представители родов Bacillus, Paecilomyces и Pénicillium, остальные микроорганизмы - специфичны для различных природных экосистем. Доминантными деструкторами ПГА в почвах Сибири являются бактерии родов Variovorax, Stenotrophömonas, Acinetobacter, Pseudomonas, Bacillus и Xanthomonas и микромицеты Pénicillium, Paecilomyces, Acremonium, Verticillium и Zygosporium; в тропических почвах - бактерии родов Burkholderia, Bacillus, Cupriavidus, Streptomyces, Nocardiopsis, Mycobacterium, и микромицеты Gongronella, Pénicillium, Acremonium, Paecilomyces и Trichoderma; в

прибрежной воде Южно-Китайского моря — бактерии родов Enterobacter, Bacillus и Gracilibacillus.

Практическая значимость. Комплексное исследование процессов биоразрушения ПГА в природных средах и получение данных, необходимых для прогнозирования сценария биораспада ПГА в природе, составило основу для конструирования долговременных форм сельскохозяйственных препаратов нового поколения. На основе изученных закономерностей биоразрушения ПГА почвенными микробиоценозами сконструированы препараты сельскохозяйственного назначения: гербиццд, азотное удобрение и биофунгицид триходермин. Показана возможность использования ПГА в качестве основы для депонирования препаратов. Установлено, что такие долговременные формы препаратов обеспечивают контролируемый выход активного начала в течение вегетационного периода растений, что позволяет сократить нормы внесения химических веществ в агроценозы и уменьшить негативное воздействие на биосферу.

Положения, выносимые па защиту:

1. Исследованные закономерности биоразрушения полигидроксиалканоатов в различных регионах, определяемые химическими свойствами ПГА и формой полимерного изделия, структурой микробиоценоза и погодно-климатическими условиями.

2. Идентифицированные микроорганизмы - первичные деструкторы полигидроксиалканоатов, специфичные для условий среды и определяющие механизм биоразрушения ПГА.

3. Научная основа для применения полигидроксиалканоатов в качестве матрикса для конструирования долговременных препаратов сельскохозяйственного назначения.

Работа выполнена в рамках плановой тематики СФУ «Изучение закономерностей микробиологического синтеза разрушаемых биопластиков (полимеров гидроксипроизводных алкановых кислот, ПГА) новой структуры и выявление механизмов их взаимодействия с биологическими системами на организменном и экосистемном уровнях» и при поддержке Министерства образования РФ и Американского фонда гразвданских исследований и развития (CRDF) грант REC 002; программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенциала высшей школы», проекты № 2.1.1.528 и РНП-11 «Фундаментальные основы конструирования полимерных микро- и наноносителей биологически активных соединений»; программы «Эколаго> Т-1.3 «Исследование закономерностей деградации биопластиков и устойчивости их к воздействию факторов внешней среды в условиях тропиков»; проекта по постановлению Правительства РФ № 220 «Ведущие ученые» Биотехнологии новых биоматериалов.

Апробация работы: материалы диссертации были представлены на XXXIII Международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, НГУ, 1995), Региональной научной конференции «Методические аспекты экспериментальной работы в исследованиях

агрономического профиля» (Красноярск, КрасГАУ, 1995), Всероссийской научной конференции «Агроэкология и устойчивое развитие регионов», посвященной 45-летию КрасГАУ (Красноярск, КрасГАУ, 1998), IUFRO International Symposium «Larix-98: World Resourses for Breeding, Resistance and Utilization» (Krasnoyarsk, 1998), Южно-Сибирской Региональной научной конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири - 2000 год» (Абакан, ХГУ, 1998), VI региональной научно-практической и методической конференции «Производительные силы Красноярского края в современных социально-экономических условиях» ( Красноярск, 1999), Annual International Research Conference «Methyl Bromide Alternatives and Emissions Reductions» (San Diego, 1999), Международном совещании «Методы оценки состояния и устойчивости сеянцев хвойных» (Красноярск, 1999), I межрегиональном семинаре по мониторингу и защите леса (Красноярск, 2000), 2-й Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии и развития городов» (Красноярск, 2001), Conference «Ecology of Soil Microorganisms» (Prague, Czech Republic, 2011), I и II Международном научном семинаре с молодежной школой «Биотехнология новых материалов и окружающая среда» (Красноярск, СФУ, 2011, 2012), BITs 4th Annual World Congress of Industrial Biotechnology (Dalian, China, 2011), Second International Conference on Recycling and Reuse of Materials (Kottayam, India, 2011), I и II Съезде микологов России «Современная микология в России» (Москва, 2002, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 11 статей, в т.ч. 10 в специализированных журналах, рекомендованных ВАК, 2 работы в сборниках научных статей, 1 монография, 1 патент, 15 учебно-методических работ, 23 работы в сборниках материалов международных и Всероссийских конференций.

Вклад автора: Планирование и проведение экспериментов, проведение всех микробиологических исследований, обработка и анализ полугенных результатов, подготовка публикаций.

Структура работы. Диссертация изложена на 248 страницах машинописного текста и содержит 32 таблицы и 58 рисунков; включает обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения (5 глав), заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 329 источников, в т.ч. 239 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Во введении обоснована актуальность работы и обозначен ее вклад в решение проблемы накопления в окружающей среде продуктов химического синтеза путем замены синтетических полимеров природными биоразрушаемыми соединениями — продуктами жизнедеятельности микроорганизмов.

Аналитический обзор посвящен анализу литературы по проблеме поиска альтернативных экологически безопасных технологий и материалов, способствующих снижению количества тупиковых отходов антропогенного происхождения, накапливающихся в биосфере. Изучен биотехнологический потенциал полигидроксиалканоатов в качестве альтернативы синтетическим полимерным материалам: перспективы наращивания производства и потенциальные сферы применения ПГА. В заключительном разделе анализируется современное состояние исследований процессов биоразрушения полигидроксиалканоатов в лабораторных условиях и природных средах (почвах и водоемах).

Объекты и методы исследования. Исследованы образцы ПГА, полученные по технологии, разработанной и реализованной в НОЦ «Енисей» СФУ: гомополимер 3-гидроксимасляной кислоты и двухкомпонентные сополимеры 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом (концентрация 13 и 27,6 мол%) и 3-гидроксибутирата с 3-гидроксигексаноатом (10,2 мол%). Из ПГА различного состава были сформированы 2-х мерные (2D) пленки, 3-х мерные (3D) плотные прессованные формы и микрогранулы. Пленки получали методом полива и испарения из 4 %-го раствора полимера в хлороформе; объемные формы - методом прямого холодного прессования с помощью лабораторного 25-ти тонного автоматического пресса Carver 3887/4387 (США); микрогранулы — методом микродрогашга из растворов ПГА в осадитель (гексан). Физико-химические свойства полимеров и разработанных изделий изучены с использованием хроматографии (Hewlett Packard, США), дифференциального термического анализа (синхронный термоанализатор STA 449 Jupiter, NETZCSH, Германия), рентгеноструктурного анализа (рентгеноспектрометр D8 ADVANCE, Bruker, Германия), электронной микроскопии (JEM-100C, Япония); физико-механические характеристики образцов регистрировали на универсальной электромеханической испытательной машине Инстрон 5565 (Великобритания).

Исследования процесса биодеградации образцов ПГА выполнены в лабораторных микроэкосистемах, а также в природных условиях в серии полевых сезонов 2005-2012 гг.: в Сибирском регионе — в почвах Сибири (дендрарий Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН) и солоноватоводном озере Шира; в тропиках — в почвах окрестностей Ханоя и Нячанга (Вьетнам) и заливе Дам Бай Южно-Китайского моря. Предварительно взвешенные образцы полимеров в чехлах из мелкоячеистого мельничного газа размещали в почве па глубине 5 см, либо погружали в воду на разную глубину в соответствии со схемой эксперимента. Длительность экспозиции составляла 3-4 месяца в условиях Сибири и 10-12 месяцев — в условиях тропиков. В течение экспозиции регистрировали изменение образцов полимеров различной (массы образцов, молекулярной массы и молекулярно-массового распределения полимеров, соотношения упорядоченной и неупорядоченной фаз) с учетом состояния и характеристик среды (температуры, влажности, pH, солености, окислительно-

восстановительного потенциала), а также микробиологической составляющей почвенных и водных экосистем.

Микробиологические исследования выполнены стандартными методами. Количественное определение численности бактерий и грибов в фоновой среде и на поверхности образцов ПГА проводили высевом серийных разведений на питательные среды. Для выделения бактерий использовали мясо(рыбо)-пептонньтй агар (МПА, РПА), крахмало-аммиачный агар (КАА), агар Эшби, почвенный агар, Plate-count agar (РСА), среду Youschimizu-Kimura (Y-K) для морских микроорганизмов, для выделения грибов - сусловый агар (СА), среды Чапека и Сабуро. Идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами на основании культуральных, морфологических признаков и стандартных биохимических тестов, приведенных в определителях Берджи (1997, 2001, 2005, 2009), Р. Вейанта (1999), Л. Н. Егоровой (1986), Д. Саттона (2001), Т. Watanabe (2002). Для выявления микроорганизмов -первичных деструкторов ПГА использовали метод прозрачных зон (Mergaert et al., 1993), предполагающий посев пробы на минеральный агар, содержащий в качестве источника углерода 0,25% порошкообразного поли-3-гидроксибутирата (рис. 1).

Идентификацию выявленных первичных деструкторов проводили секвенированием 16S рРНК. ДНК выделяли с помощью набора реактивов AquaPure Genomic DNA Isolation (Bio-Rad, США) по рекомендованному производителем протоколу. Ген 16S рРНК был амплифицирован с использованием универсальных праймеров 27F и 1492R, соответствующих позициям 8-27 и 1510-1492 Е. coli соответственно. Для эукариот амплифицировали ген 28S рРНК с использованием праймеров у est D1/D2. ПЦР проводили на амплификаторе Mastercycler Gradient (Eppendorf. Германия). Образцы для определения нуклеотидной последовательности подвергали секвенированию методом Сенгера на генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems, США). Определенные секвенированием нуклеотидные последовательности сравнивали с гомологичными последовательностями штаммов из баз данных GenBank, EMBL и DDBJ с помощью программы NCBI BLAST (Altschul et al., 1990), выравнивая их с

1 Рисунок 1. Проявление Т1ГА-депояимеразной активности бактерий-деструкторов (образование прозрачных зон на диагностической среде с ПГА)

щ. ш

использованием программы ClustalX версии 2.08 (Thompson et al., 1994). Филогенетический анализ выполнен по модели Джукеса и Кантора в пакете программ TREECON версии 1.3Ь. Определенные нуклеотидные последовательности микроорганизмов-деструкторов ПГА депонированы в базе данных GenBank (№№ HQ689679-HQ689694, НМ587328-НМ587333, JQ518340 - JQ518351).

Долговременные формы препаратов гербицида Зеллек-супер (действующее вещество галоксифоп) и азотного удобрения карбамида, депонированных в ПГА-матрикс получали из растворов полимера в хлороформе, смешанных с препаратами в различных концентрациях. Объемные формы изготавливали путем смешивания порошкообразного полимера с порошком удобрения и последующего прямого холодного прессования. В качестве тест-растений использовали Agrostis stolonifera L. и Latuca sativa. Растения выращивали в лаборатории в летний период при естественном освящении и в фитотроне при круглосуточном освеще1ше, мощностью 100 Вт/м2 по технологии, разработанной в лаборатории высших фототрофов ИБФ СО РАН. В ходе экспериментов определяли динамику выхода действующего вещества с учетом степени деградации полимеров. Концентрацию гербицида Зеллек-супер в почве определяли на хроматографе с масс-спектрометрическим детектором GCD plus (Hewlett-Packard, США), количество азота -колориметрическим методом с реактивом Несслера. Эффективность препаратов оценивали, сравнивая биомассу растений в различных вариантах опыта. Исследование возможности иммобилизации спор гриба-антагониста фитопатогенов Trichoderma harziamim Rifai на ПГА-носителе проводили в лабораторных условиях, определяя жизнеспособность спор при различных сроках хранения, а также в модельных почвенных экосистемах, оценивая сохраняемость популяции грибов Trichoderma в почве в течение 4-х месяцев после интродукции. Статистическую обработку результатов проводили по стандартным методикам с использованием программы Microsoft Excel 2007. Для полученных данных рассчитывали среднее арифметическое, среднеквадратичное отклонение, ошибку средней арифметической. Достоверность различий считали при уровне значимости р<0,05.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Конструирование экспериментальных образцов из ПГА и исследование процесса биоразрушеиия в лабораторных условиях

В связи с существующими представлениями о многофакторности процесса биоразрушения ПГА и влиянии на этот процесс не только условий среды, но также структуры полимера и способа переработки в изделия (Jendrossek, 2000; 2002), проведено сравнительное изучение деградации полимерных изделий в виде гибких пленок, прессованных объемных форм и микрогранул, полученных разными методами.

1.1. Получение и характеристика полимерных изделий из ПГА

Для исследования взята серия высокоочшценных образцов ИГА различного состава, из которых были получены экспериментальные образцы в форме пленок (2Б), объемных прессованных форм (ЗВ) и микрогранул (рис. 2).

пленки прессованные формы микрогранулы

Рисунок 2. Экспериментальные образцы изделий из ПГА

Различия основных физических свойств исследуемых полимеров влияли на характеристики полученных изделий. Поверхность пленок из гомогенного поли-3-гидрокисбутирата - плотная, со слабо выраженным нерегулярным рисунком. Поверхность пленок из сополимеров с 3-гидроксивалератом - более гладкая. Пленки из другого типа сополимеров - 3-гидроксигексаноатом, имели наиболее развитую поверхность с неоднородными порами размером от 0,5 до 5 цм. Наличие в составе ПГА помимо 3-гидроксибутирата других мономеров приводило к снижению величин контактных краевых углов смачивания и свободной энергии межфазовой поверхности, а также к увеличению поверхностного натяжения (у) и величины сил сцепления (Й^О, то есть к повышению степени гидрофильности поверхности сополимерных пленок. Пленки из гомогенного ПЗГБ по этим показателям - наиболее гидрофобны (70,0±0,4°). Серия форм, полученных с различным включением 3-гидроксивалерата, имела сходные характеристики как по структуре поверхности, так и по плотности матрикса и величине влагопоглощения. Поверхность прессованных полимерных форм была плотная и гладкая с единичными норами.

Все формы были использованы для исследования биоразрушения в результате взаимодействия с микроорганизмами и в качестве платформы для конструирования долговременных форм препаратов сельскохозяйственного назначения.

1.2. Исследование разрушаем ости ПГА в лабораторных условиях

Исследовано влияние химического состава полимера, геометрии образцов и условий внешней среды на его разрушаемость в лабораторных почвенных микроэкосистемах. В пластиковые контейнеры с почвой были помещены образцы ПГА в виде тонких пленок (0 20 мм) и объемных прессованных форм (0 5 мм, Ь=2 мм), которые экспонировали в течение 120 суток при стабилизации температуры 25±0,1 °С и влажности почвы - 55-60 %.

Установлено, что независимо от химической структуры, все образцы начинали разрушаться после латентного периода, за которым следовал период потери массы образцов. По всей видимости, требуется некоторое время для адаптации микроорганизмов к полимерному материалу как субстрату для синтеза деполимеризующих ферментов, вызывающих деструкцию и последующую утилизацию полимерного материала микробными клетками. Исследование биоразрушения образцов ПГА различного химического состава в виде пленок показало, что сополимерные образцы, имеющие пониженную степень кристалличности, разрушались в лабораторных условиях быстрее, нежели гомополимер, при этом наиболее активно - сополимер с 3-гидрокисгексаноатом. Периоды уменьшения массы образцов на Уз от исходной составили для пленок ПЗГБ и сополимеров ПЗГБ/ЗГВ и ПЗГБ/ЗГГ 20, 15 и 12 суток, соответственно (рис. 4а).

Прессованные объемные образцы ПГА разрушались аналогично пленкам, но более медленно. Потеря массы на Уз от исходной зарегистрирована на 82, 67 и 52 сутки для ПЗГБ и сополимеров ПЗГБ/ЗГВ и ПЗГБ/ЗГТ соответственно. Это практически в 4 раза выше величин, зарегистрированных для Ю форм (рис. 46).

190 %

ав 60 4ц 20 0

1-00 •

80 •

80 -«

го о ■

10 2Й 30 40 1 80 60 80 1

сутки сутки

1 - гоиюпогшмер ПЗГБ: 2 - сополимер ПЗГБ/ЗГВ: 3 - солслимер ПЗГБ/ЗГГ

1Ш %

40 20 О

100

35 -! I

90 -I

85 1

80 4-

-х- 16 "С — —20 "С

-28*

сутки

-35"С

30 45

-х- рН 5,2 -о-рН 5,9

60 75 90 сутки

-рН 7,0 —рН 7,5

Рисунок 4. Изменение массы образцов ПГА (% от исходной) в лабораторных условиях: а — пленки; б — объемные формы; в, г — тент из ПЗГБ

Температура среды в диапазоне 16-35 °С существенно влияла на скорость биодеградации ПГА (рис. 4в). При 16 °С в среднем скорость деградации пленок

была в 1,5 раза ниже, чем при 20 °С; при 26-28 °С деградация увеличилась в 2,5 раза и происходила без ярко выраженной лаг-фазы. Однако при повышении температуры до 35 °С процесс разрушения пленок замедлялся, что связано с ингибируюпщм действием температуры на активность почвенной микрофлоры.

Влияние активной реакции среды в диапазоне 5,2-7,5 на процесс разрушения ПГА в лабораторных условиях не зафиксировано. Независимо от химического состава и физико-химических свойств образцов ПГА они не деградировали в фосфатном буфере при 37 °С в течение 90 суток (рис. 4г). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии водного и химического гидролиза ПГА. Результаты согласуются с современными представлениями о том, что ПГА не подвержены небиологической гидролитической деструкции (Amass et al., 1998; Sudesh et al., 2000). При использовании в качестве модельной среды водопроводной воды, содержащей 1,4x105 клеток/мл аэробной микрофлоры, разрушаемость пленок из ПГА толщиной 0,07 мм была сравнима с разрушением в данных условиях писчей бумаги.

Известно, что микробные ПГА-экзодеполимеразы гидролизуют преимущественно аморфную фазу ПГА, а не высокоупорядоченные С-цепи в кристаллическом состоянии (Jendrossek, 2001; Abe et al., 1996). В сополимерных ПГА по сравнению с высококристалличным ПЗГБ имеет место выравнивание соотношения упорядоченной и неупорядоченной фаз, то есть доля аморфной фазы в них выше. Поэтому сополимеры, обладающие большей площадью аморфных (неупорядоченных) регионов в структуре полимерного материала, как правило, разрушаются быстрее. Преимущественное разрушение аморфной фазы образцов в почвенных микроэкосистемах подтверждено данными рентгеноструктурного анализа: степень кристалличности пленок ПЗГБ/ЗГВ возросла на 17 %, ПЗГБ/ЗГГ - на 22 % по сравнению с исходными значениями (табл. 1).

Таблица I — Изменение степени кристалличности и молекулярной массы образцов ПГА в процессе биодеградации в почве_

Параметр Исходные значения После экспозиции в почве (20 суток)

ПЗГБ ПЗГБ/ ЗГВ 27,6 мол% ПЗГБ/ ЗГГ ПЗГБ ПЗГБ/ ЗГВ 27.6 мол% ПЗГБ/ ЗГГ

Кристалличность С,, % 76 45 36 81 62 58

Молекулярная масса М„, кДа 1200±33,2 1077±24,1 620±22,5 932±31,8 674±28,2 380±18,2

Полидисперсность 1,66±0,02 3,12±0,14 1,80±0,08 1,78±0,06 4,41±0,16 2,83±0,04

Таким образом, на биодеградацию полигидроксиалканоатов, помимо химического состава и формы изделия, существенно влияет температура среды. Наличие в составе ПГА мономеров 3-гидроксивалерата и 3-гидроксигексаноата ускоряет процесс биодеструкции в почве и воде. В стерильных условиях разрушение ПГА не зафиксировано в течение 90 суток.

13. Результаты взаимодействия ПГА с микроорганизмами в процессе биоразрушения в лабораторных микроэкоснстемах

Микроорганизмы по своей физиолого-биохимической природе являются наиболее чувствительными индикаторами любого изменения химико-экологической обстановки окружающей среды (Наливайко, 2000; Мас1ег, 2000). Искусственное внесение в почву любого субстрата вызывает сдвиги в составе и структуре микробного сообщества. Высокая активность той или иной функциональной группы может служить индикатором деградационных процессов, протекающих в почве.

В ходе изучения последствий внесения образцов ПГА в почвенные лабораторные микрокосмы показано положительное влияние на развитие микроорганизмов, обнаружено увеличение количества бактерий, в том числе актинобактерий, на поверхности полимерных образцов (пленок и объемных форм) по сравнению с контролем - фоновой почвой (табл. 2).

Таблица 2 — Общая численность микроорганизмов в лабораторных почвенных микроэкосистемах ___

Варианты опыта Бактерии Актинобактерии Грибы

Фоновая почва (3,4±0,3)х10<' (1,7±1^)х10> (6,6±2,3)х1(У

Поверхность ПЗГБ (пленки) (7,1±1,3)х10* (3,8±0,7)х10ъ (5,4±0,8)х10л

Поверхность ПЗГБ (прессованные формы) (5,3±и)х108 (в.ЪЫ^хЮ5 (7,8±0,5)хЮ'

ПГА как дополнительный источник углеродного питания стимулировал развитие этих групп микроорганизмов в почве. В то же время количество пропагул микромицег'ов во всех образцах оставалось на контрольном уровне. По соотношению функциональных групп микроорганизмов исходная почва характеризовалась законченностью процессов минерализации и зрелым микробным сообществом: коэффициент минерализации составлял 1,25, олиготрофности — 0,04 (табл. 3).

Таблица 3 — Количественные показатели эколого-трофических групп микроорганизмов лабораторных почвенных микроэкосистем__

Варианты опыта Копиотрофы Олиготрофы Прототрофы Коэф. минерализации (КАА/ МПА) Коэф. олиготрофности (ПА/ МПА)

Фоновая почва (3,4±0,3)хЮ6 (1,3±0,2)*105 (4,3±0,8)хЮб 1,25 0,04

Поверхность ПЗГБ (пленки) (7,1±0,1)*108 (2,3+0,6)* 105 (4,6±0,0э)х107 0,04 0,0003

Поверхность ПЗГБ (прессованные формы) (5,3±0,1)х108 (1,9±0,4)х105 (5,5±0,01)х107 0,02 0,0004

Присутствие ПГА в почве стимулировало развитие копиотрофов и прототрофов; в результате этого коэффициенты минерализации уменьшились до 0,02-0,04. Это является свидетельством активных процессов деструкции органического вещества в почве и накопления продуктов распада ПГА в виде ди- и мономеров в качестве дополнительного и доступного для микроорганизмов субстрата. В микробиоценозах пленок обрастания на поверхности полимера увеличивалось количество азотфиксаторов. Вероятно, это связано с изменением соотношения углерод/азот в почве в результате обогащения последней углеродсодержащими продуктами биораспада ПГА.

Из почвенных образцов было выделено и проанализировано 40 изолятов бактерий и 28 изолятов микроскопических грибов. В сравнительном аспекте исследован качественный состав контрольных и сформировавшихся экспериментальных микробиоценозов; выделены и идентифицированы доминирующие бактерии и микромицеты (табл. 4).

Таблица 4 - Соотношение (%) представителей доминирующих микроорганизмов в лабораторных почвенных микроэкосистемах_

Бактерии Поверхность пленок ПГБ Фоновая почва Микромицеты Поверхность пленок ПГБ Фоновая почва

Pseudomonas 8 26 Pénicillium 56 67

Bacillus 25 12 Aspergillus 0 12

Flavobacterium 2 14 Trichoderma 8 9

Cellulomonas 31 0 Acremonium 11 0

Corynebacterium 3 6 Alternaria 7 0

Streptomyces 6 4 Cladosporium 7 5

Arthrobacter 6 13 Mucor 2 7

Planomonospora 2 0 Fusarium 5 0

Acinetobacter 5 10 Gliocladium 2 0

Mycobacterium 7 6 Monilia 2 0

Micrococcus 5 9

Обнаружено, что на поверхности полимерных образцов селективно формируется микробиоценоз, качественно и количественно отличающийся от контрольных образцов почвы. Во всех образцах с поверхности ПГА зафиксировано увеличение количества спорообразующих бактерий, в том числе актинобактерий, на фоне снижения относительно контроля грамотрицательных палочек.

Следует отметить, что доля первичных деструкторов, обладающих ПГА-экзодеполимеразой, в контрольной почве была низкая - около 4 % от общей численности микроорганизмов; на экспериментальных образцах количество ПГА-деструкторов возросло до 38 %. Среди них идентифицированы представители Bacillus cereus П4, Mycobacterium sp. П8, Streptomyces sp. П12, Pseudomonas sp. П6. Остальные бактерии, выделенные из пленок обрастания, не обладали ПГА-экзодеполимеразой. Вероятно, они могли усваивать продукты

биораспада полимера, представляя, таким образом, второй и последующие трофические уровни в сформированном микробиоценозе.

Сведений относительно того, к какому типу ферментов относятся ПГА-экзодеполимеразы (конститутивному или индуцибельному), не опубликовано. Обнаруженный факт значительного увеличения количества микроорганизмов-деструкторов ТТГА в микробиоценозах, формирующихся на поверхности образцов полимера в течение короткого периода времени (30 суток), позволяет рассматривать индуцибельную природу фермента.

В целом, присутствие ПГА в почве стимулировало рост численности микроорганизмов, не снижало видового разнообразия микробных сообществ и приводило к селективному формированию микробных комплексов в пленках обрастания на поверхности образцов полимера.

2. Закономерности биоразрушешга полигадроксиалканоатов почвенными микробиоценозами

Почва является мощным природным резервуаром для деструкции различных соединений, включая ПГА. Однако большинство известных работ по изучению почвенной деструкции ПГА в лабораторных и натурных условиях проведены без учета химической структуры и свойств собственно полимера, прежде всего, молекулярной массы и степени кристалличности. В отношении ПГА в настоящее время отсутствуют четкие представления о взаимодействии полимеров с микробоценозами; мало сведений о систематической принадлежности первичных деструкторов ПГА, выполненных с применением молекулярно-генетических методов.

2.1. Исследование бпоразрушенпя полигидроксиалканоатов в почвах средних широт Сибирского региона

Были взяты образцы полимерных пленок двух типов: ПЗГБ и ПЗГБ/ЗГВ (с включением сополимера 10 мол%), диаметр 30 мм, масса 60±6,5 мг, которые размещали в почве на глубже 5 см в прикорневой зоне лиственницы сибирской (Larix sibirica L.) и березы повислой (Betula pendula L.). Исследования выполнены на территории дендрария Института леса им. В.Н. Сукачева Сибирского отделения РАН (г. Красноярск) в течение двух полевых сезонов: первый - 2 июля - 19 октября 2007 г.; второй — 7 июня - 7 сентября 2010 г. Условия экспонирования образцов отличались в разные полевые сезоны. Второму сезону предшествовала суровая зима, при средней температуре воздуха —22,1 °С, что значительно ниже чем, в предшествующий сезон (— 8,6 °С). Активная реакция почвы под березой (6,5-7,2) и лиственницей (7,2-8,0) не проявляла заметных колебаний в периоды исследований; почва под березой была более сухая (11-23 %).

Исследования показали, что на процесс разрушения ПГА в почве оказали влияние химический состав полимера, характеристика микробиоценоза, а также физико-химические показатели почвы, определяющие численность и активность микроорганизмов.

В 2007 г. разрушение обоих типов полимера происходило активнее в прикорневой зоне лиственницы. Через 109 суток остаточная масса образцов гомополимера ПЗГБ составила 45 %, сополимера ПЗГБ/ЗГВ - 22 % от исходной; период уменьшения массы образцов на '/г от исходной достигал 83 и 68,5 суток соответственно (рис. 5). В почве прикорневой зоны березы разрушение ПГА обоих типов было замедленным. Остаточная масса образцов ПЗГБ составила 84 %, ПЗГБ/ЗГВ — 74 % от исходной. Сополимер разрушался быстрее, чем высококристалличный гомополимер.

100

80 -

20 -

2007 год

• Д.. г

02.07.07 16.07.07 30.07.07 13.08.07 27.08.07 10.03.07 24.09.07 08.10.07 22.10.07 -ПЗГБ (береза) -:-П5ГБ/ЗГВ [береза) -*■ ПЗГБ (лиственница) ПЗГБ/ЗГВ (лиственница)

% 100 ■

90 -

2010 год

60 -

50 —-,-,-,-,-,-,-г

07.06.10 21.06.10 05.07.10 19.07.10 02.08.10 16.08.10 30.08.10 13.09.10

-*-ПЗГБ (береза) -о- ПЗГБ/ЗГВ (береза) -4-ПЗГБ (лиственница) -> ПЗГБ/ЗГВ (лиственница)

Рисунок 5. Изменение массы образцов ПГА (% от исходной) в почве прикорневой зоны березы и лиственницы в условиях Сибири

В 2010 году разрушение пленок протекало не так активно. Через 98 суток остаточная масса образцов ПЗГБ и ПЗГБ/ЗГВ, экспонированных под листвешшцей, составила 89,9 и 84 %, соответственно; масса образцов, под

березой — 91,4 и 89 %. Малые значения убыли массы полимерных образцов в 2010 г. не позволили достоверно выявить отличия в разрушаемое™ исследованных ПГА различного химического состава.

При анализе структуры ПГА в ходе разрушения обнаружено увеличение степени кристалличности полимеров обоих типов, как и в предыдущих исследованиях в модельных почвенных средах. Это свидетельствует о предпочтительном разрушении микроорганизмами аморфной фазы полимеров по сравнению с кристаллической (табл. 5). Для образцов, подвергшихся наибольшей деградации (2007 год), итоговые значения средневесовой молекулярной массы ПГА (Мв) составили 81-97 % от исходной для ПЗГБ и 7982 % - для ПЗГБ/ЗГВ.

Таблица 5 — Изменение степени кристалличности и молекулярной массы образцов ПГА в процессе биодеградации в почве в условиях Сибири_

Параметр Исходные значения После экспозиции в почве (98 суток, лиственница) После экспозиции в почве (98 суток, береза)

ПЗГБ ПЗГБ/ ЗГВ 10 мол % ПЗГБ ПЗГБ/ ЗГВ 10 мол % ПЗГБ ПЗГБ/ ЗГВ 10 мол %

2007 год

Кристалличность С,, % 61 50 65 68 69 54

Молекулярная масса М„ кДа 710±Ю,7 799±24,8 577±26,5 660±17,2 691 ±20,7 633±34,2

Полидисперсность 2,05±0,04 1,77-1-0,08 2,39±0,1 2,41 ±0,06 2,22±0,14 2,23J-0,19

2010 год

Кристалличность Сх, % 61 50 64 62 65 53

Молекулярная масса М„ кДа 710±10,7 799±24,8 692±20,1 660±17,2 704±16,2 628±31,4

Полидисперсность 2,05±0,04 1,77±0,08 2,32±0,07 2,41±0,06 2,25±0,08 2,35±0,06

Таким образом, в условиях резко континентального климата в Сибирской почве биоразрушение образцов пленок из сополимера ПЗГБ/ЗГВ происходило интенсивнее по сравнению с более кристалличными образцами из гомогенного ПЗГБ.

Исследования показали, что течение процесса биодеградации пленок зависело от свойств микробного сообщества в местах размещения образцов. Исходные микробиоценозы почвы в прикорневой зоне обоих деревьев различались по общей численности микроорганизмов и по видовому составу. В более холодном 2010 г. общая численность микроорганизмов в исходной почве была ниже на 1-2 порядка, чем в 2007 г. (табл. 6).

Таблица 6 - Общая численность бактерий в пробах почвы в условиях Сибири__

Образец почвы Общее микробное число. КОЕ в 1 г почвы

2007 г. 2010 г.

CJ Прикорневая зона в момент размещения ПГА (1,47±0,08)*109 (3,1Ш),24)х106

vi >-3 Прикорневая зона в конце сезона (5,11±0,42)*109 (5,28±1,76)хЮ7

Поверхности пленок ПГА (1,60±0,04)х10" (1,35±0,11)х10*

•2 "S s: о Si. Прикорневая зона в момент размещения ПГА (1,33±0,47)х10* (2,67±0,16)хЮ5

Прикорневая зона в конце сезона (2,21±0,24)*109 (6,77±4,51)хЮ7

И) Поверхности пленок ПГА (1,29±0,08)х109 (1,96±0,05)х108

Аналогично лабораторным исследованиям установлено, что на поверхности полимерных пленок формировался специфичный микробиоценоз, отличающийся по составу от микробного сообщества фоновой почвы. В контрольной почве среди грамположителъных бактерий преобладали представители рода Micrococcus, кроме того, были выделены спорообразующие палочки из рода Bacillus и артробактерии. Среди- представителей грамотрицательной микрофлоры выделены бактерии из рода Acinetobacter, Flavobacterium и Pseudomonas (табл. 7).

Таблица 7 — Соотношение (%) представителей доминирующих микроорганизмов в прикорневой зоне лиственницы и березы (сентябрь, 2007)

Образец почвы rpn6w %OT общей Бактерии %OT общей

числ. числ.

1 2 3 4 5

Aureobasidium pullulans 38.9 Micrococcus varians 41.4

L. sibirica -контроль Pénicillium madriti Pénicillium decumbens Pénicillium atrovenetum 16.7 16.7 11.1 Micrococcus roseus Acinetobacter sp. Arthrobacter sp. 35.1 11.7 3.6

Pénicillium adametzioides 5.6 Bacillus alvei 2.7

Paecitomyces lilacinus 5.6

Paecitomyces lilacinus Aureobasidium pullulans 81.5 11.1 Agrobacterium sp. Cellulomonas sp. 24.3 17.5

L. sibirica — Acremonium butyri 3.7 Alcaligenes sp. 6.6

поверхности ПГА Zygosporium masonii Pénicillium novae 1.9 A ureobacterium terregens 4.5

-caledoniae 1.9 Acinetobacter sp. Pseudomonas sp. Arthrobacter sp. 1.9 1.9 1.3

1 2 3 4 5

Pénicillium fusco-flavum 50.0 Micrococcus roseus 49.2

Pénicillium steckii 13.6 Micrococcus varians 24.6

В. pendula - Aureobasidium pullulons 13.6 Actinomyces sp. 6.2

Verticillium lateritium 9.1 Micrococcus luteus 3.1

контроль Trichoderma piluliferum 4.5 Arthrobacter sp. 3.1

Trichoderma sp. 4.5 Bacillus fastidiosus 1.5

Pénicillium aurantio- Pseudomonas sp. 1.5

violaceum 4.5 Flavobacterium sp. 1.5

Pénicillium canescens 47.6 Bacillus fastidiosus 21.1

Pénicillium Arthrobacter sp. 5.3

corylophyloides 33.3 Alcaligenes sp. 5.3

В. pendula — Aureobasidium pidlulans 7.1 Micrococcus luteus 5.3

поверхности ПГА Paecilomyces lilacinus 7.1 Nocardia sp. 5.3

Verticillium lateritium 2.4 Actinomyces sp. 5.3

Nigrospora gallarum 2.4 Pimelobacter 5.3

Bacillus brevis 5.3

Pseudomonas sp. 1.1

Примечание: жирным шрифтом выделены виды грибов-деструкторов ПГА

В составе микробоценозов, сформировавшихся на поверхности полимерных пленок, обнаружено другое соотношение микроорганизмов: в почве прикорневой зоны лиственницы преобладали представители рода Agrobacterium, на втором месте по численности — Cellulomonas, а в почве прикорневой зоне березы доминировали бактерии рода Bacillus.

Для выявления первичных деструкторов ПГА проведен отбор микроорганизмов, обладающих ПГА-экзодеполимеразами, методом прозрачных зон. За два полевых сезона выделено и проанализировано 400 изолятов микроорганизмов. По совокупности морфологических, культуральных, биохимических и молекулярно-генетических признаков идентифицированы доминирующие бактерии — первичные деструкторы ПГА: Variovorax sp.; Stenotrophomonas sp.; Acinetobacter sp.; Pseudomonas sp; Bacillus sp.; Xanthomonas sp. (рис. 6).

При высеве на диагностическую среду наличие ПГА-деполимеразной активности подтверждено также для грибов Pénicillium, Paecilomyces, Acremonium, Verticillium и Zygosporium. Основными деструкторами ПГА в почве прикорневой зоны лиственницы определены Paecilomyces lilacinus, численность которых составила 81,5 %. Этот же вид впервые был описан в качестве основного деструктора ПГА в работе (Sang et al., 2002). Среди грибов-деструкторов ПГА в ризосфере березы доминировали представители рода Pénicillium, суммарная численность которых достигала 81 %.

- Acinetobacter sp. ШР-SLT (НОЬШХХ)

100; Acinetobacter rhizospliaerae I f N60041X) (»2 Acinetobacter calcoaceticus {FJS67364)

inn Acinetobacter schindleri (NR025412) 1ШГ«7 Acinetobacter schindleri (GU339299)

Acinctnbac. sthmdleri IHP-SLIS HQ6S9M kid Acinetobacter radioresistens (Gl! 145275)

Acinetobacter sp. AsK07 (GQ50JJI9) (.3 Aciiictohudcr sp. läPSI.6 (H06S96X7) Acinetobacter sp. IllP-Slll4 (HQ6S9MS) 1H11 Pseudomonas sp. G62 (FN547413) <,,: Pseudomonas sp. IBPSB6 (Н06ШНЦ sx Pseudomonas sp. BIM B-S6 (GU7S4939) Pseudomonas sp. IBPSKS (НП6НШЗ)

82.................. Halomonas \cnusta (A.1306S94g)

' — Pseudoalteromonas sp. (FF409423e)

.........- Thiocapsa roseopersicina (AFI 13000s)

S3 Stenotrophomonas maltophilia (GUI86115) »4; s. nmltiiphilia 1HP-SL14 (HQ6X9694)

Stenotrophomonas maltophilia (GU3S5S70) 9l': Xamhomonas sp. BBCT3S (FF47I219)

Stenotrophomonas maltophilia (F.U0226S9) . Stenotrophomonas rhizophila (GU39I467) 7,-i Stenotrophomonas sp. ЛпЗП ( AJ551 K>S)

Stenotrophomonas rliizophila (FM955S53) it S. rhizophila lltP-SB4(HQ6X9679) Ы1 ,V. rhhjtphiitt 1BP-S117IH06S96-S2) S. rhizophih HIP-SI!1) /106X96X4

Variovorax paradoxus (HQ005420I , Variovorax boronjcumulans (AB300597)

1Ш1

¡(HI 98

f.'A

Agrobacterium sp. CICC10214 (AY790533) \'апслогзч paradoxus (G14861Ü9) HQ005421

Varim-muxparadoxus IIIP-SBS (llQM96St>) Variovorax paradoxus (I:U979329) fttriomnixparadoxus 1KP-S1.S (HIW96H6) li\ С paradoxus J/lP-St.iO <flQ68969l)

' Variovorax paradoxus WP-SL9 (H06Ü969II)

Svnechococcus PCC9005 (ЛР216Ч50Г) 6" Bacillus sp. 1-113 (ЛВ531394)

--------------.'!UaciUus sp. lltPSf.S (И06Н96Х9)

Bacillus cereus 13632F (ÜJ741075)

i Bacillus cereus GBSC29 (GU56S20S) Bacillus sp. IHP-SUI (HQ6S9692) 1IW Chlorobium vibiiotorme F.P240(AM050130c) Prosthecochloris vibnolomiis(EF064312) Methanobacterium ivanovii (AF095261O)

Рисунок 6. Филогенетическое положение бактерий-деструкторов ПГА, выделенных из почв Сибири (показано курсивом), на основе сравнения нуклеотидньи последовательностей гена 16S рРНК методом ближайших соседей. Масштаб соответствует 1 нутеотидной замене на каждые 10 последовательностей. Цифрами показаны значения индекса "bootstrap" 60% и более

2.2. Исследование биоразрушения полигндроксналканоатов в почвах в тропических условиях

Исследования проведены на климатических испытательных станциях (КИС) расположенных вблизи Ханоя (КИС Хоа Лак) и Нячанга (КИС Дам Бай). Образцы полимеров двух типов - гомополимера ПЗГБ и сополимера ПЗГБ/ЗГВ в виде пленок (0 30 мм) и объемных форм (0 10 мм, Ь=3 мм) - размещали в почве на глубине 5 см. Эксперимент длился с 14 мая 2010 по 15 марта 2011 на

КИС Хоа Лак и с 7 мая 2010 по 28 мая 2011 на КИС Дам Бай. Почвенно-климатические условия в районах исследования различались по ряду показателей. Температура и влажность воздуха, температура почвы были близкими в течение периода экспозиции. Однако количество осадков на станции Хоа Лак было практически на порядок выше, чем на станции Дам Бай. Кроме того, для почвы Хоа Лак были характерны более низкие значения pH (5,5), чем для почвы Нячанга (6,6). Эти различия оказали влияние на микробиологические показатели почв и, соответственно, на процессы биоразрушения 111 А.

Биоразрушение образцов ПГА обоих типов происходило активнее в почвах Хоа Лак: пленки из гомополимера разрушились более чем на 98 % через 6 месяцев экспозиции на КИС Хоа Лак и только на 48 % через год на КИС Дам Бай (рис. 7).

% Хоа Лак

-*-ПЗГБ(20-формы) -О-ПЗГБ/ЗГВ {20-формы)

-*- ПЗГБ (ЗО-формы) —с- ПЗГБ/ЗГВ (Зй-формы)

Рисунок 7. Изменение массы образцов ПГА (% от исходной) в почве в тропических условиях

Объемные прессованные формы ПЗГБ за 10 месяцев экспозиции разрушились на 60 и 28 % на Хоа Лак и Дам Бай соответственно. Следует отметить, что в обоих районах исследований зафиксировано более быстрое разрушение образцов пленок и объемных форм, изготовленных из гомополимера ПЗГБ по сравнению с сополимерными образцами ПЗГБ/ЗГВ. Так, длительность периодов, за которые масса пленок уменьшилась на 1Л от исходной, составила для ПЗГБ —46, а для ПЗГБ/ЗГВ - 260 суток в почвах на Хоа Лак. В районе станции Дам Бай образцы из сополимера за год разрушились лишь на 8-14 %.

Полученные результаты отличаются от аналогичных показателей по механизму деградации ПГА, полученных в почвах Сибири, однако они соответствуют ряду работ, в которых также отмечено более быстрое разрушение ПЗГБ по сравнению с ПЗГБ/ЗГВ изолятами бактерий-десгрукторов (Manna, Paul, 2000), актиномицетов (Manna et al., 1999) и грибов (Sanyal et al., 2006; McLellan, Hailing, 1988). Такое расхождение связано с различием микробиоценозов почв и, соответственно, субстратной специфичностью ПГА-экзодеполимераз, продуцируемых микроорганизмами-деструкторами (Manna, Paul, 2000).

В условиях тропиков зафиксировано значительное падете средневесовой молекулярной массы всех образцов ПГА и возрастание полидисперсности, что свидетельствует о происходящем процессе деструкции С-цепей полимера и образовании более мелких фрагментов с различной степенью полимеризуемости (табл. 8).

Таблица 8 — Изменение степени кристалличности и молекулярной массы образ11Рв ПГА в процессе биодеградации я тропических почвах_

Параметр Исходные значения После экспозиции в почве КИС Хоа Лак После экспозиции в почве КИС Дам Бай

ПЗГБ ПЗГБ/ ЗГВ ПЗГБ ПЗГБ/ ЗГВ ПЗГБ ПЗГБ/ ЗГВ

Пленки (2D)

Кристалличность С„ % 60 51 60 58 62 59

Молекулярная массаМ,, кДа 1401±106 1318±85 1162±37 960±6 1075±60 828±17

Полидисперсность 2,0±0,37 2,01±0,23 2,16±0,16 2,22±0,15 2,54±0,21 2,48±0,15

Объемные формы (3D)

Кристалличность С*, % 67 68 70 71 70 68

Молекулярная масса Мв, кДа 1401±106 1318±85 563±18 478±16 502±6 363±6

Полидисперсность 2,0±0,37 2,01±0,23 3,42±0,07 3,60±0,08 3,71±0,27 5,56±1,43

По данным рентгеноструктурного анализа установлено незначительное возрастание степени кристалличности почти всех исследованных образцов ПГА в ходе разрушения. Аналогичный результат был получен при исследовании в сибирских почвах. Однако падение величины средневесовой молекулярной массы (М„) в тропических условиях было более выраженным по сравнению с результатами, полученными в условиях Сибири.

Анализ результатов исследования микробиоценозов контрольных образцов почвы двух исследуемых районов Вьетнама выявил существенные отличия. Так, общая численность бактерий в почвах Хоа Лак составила 16 млн. КОЕ в 1 г, тогда как в почвах станции Дам Бай - 8 млн. КОЕ в 1 г. Численность микромицетов различалась на порядок — 84 тыс. КОЕ в 1 г почвы станции Хоа Лак и 8,0 тыс. КОЕ в 1 г почвы станции Дам Бай (табл. 9).

Таблица 9 — Общая численность микроорганизмов в тропических почвах (ноябрь, 2010 г.) __

Варианты опыта Бактерии Грибы

КИС Хоа Лак КИС Дам Бай КИС Хоа Лак КИС Дам Бай

Фоновая почва (1,б±0,5)х10' (8,0±3,2)х106 (8,4±1,2)х104 (8,0±2,3)*103

Поверхность ГОГБ (20-формы) н/о (3,3±0,3)хЮ8 н/о (з.ьадхю5

Поверхность ГОГБ (ЗЕ)-формы) (6,9±2,1)*108 (9,2±2,0)*108 (2,2±0,6)хЮ(> (1,2±0,4)*106

Поверхность ПЗГБ/ЗГВ (2П)-формы) (1,2±0,1)х108 (7,1±3,6)х108 (2,2±0,8)хЮ6 (3,2±1,3)х104

Поверхность ПЗГБ/ЗГВ (ЗБ-формы) (1,7±1,0)*108 (5,5±1,4)хЮ8 (6,2±1,3)х105 (6,8±2,2)хЮ4

Примечание: «н/о» - показатели не определяли, т.к. образцы деградировали

На поверхности образцов ПГА, аналогично предыдущим исследованиям, численность органотрофных микроорганизмов возрастала по сравнению с показателями фоновой почвы на 1-2 порядка. Таким образом, полимер стимулировал развитие как бактерий, так и грибов в почве, являясь для них дополнительным субстратом.

Видовой состав микробных сообществ также значительно различался. Почвы Хоа Лак характеризовались более разнообразным бактериальным сообществом по сравнению с почвами Дам Бай. Однако доля первичных деструкторов составляла 7,5-10 % от общего количества микроорганизмов, выделенных из пленок обрастания.

На поверхности полимерных образцов формировался микробиоценоз, специфичный для конкретной природной среды, и отличающийся от контрольных образцов почвы (табл. 10). В почвах на станции Дам Бай преобладали бактерии-деструкторы, тогда как в почвах станции Хоа Лак -грибы. По всей видимости, различия видового состава связаны с условиями среды обитания, в том числе с кислотностью почвы. Так, почвы на станции Хоа

Лак — слабокислые, что благоприятно для развития грибов, в то время как на КИС Дам Бай значения рН почвы близки к нейтральному.

Таблица 10 — Доминирующие микроорганизмы в тропических почвах Сноябрь, 2010 г.)__

Образец почвы Виды бактерий Виды грибов

КИС Хоа Лак Acinetobacter calcoaceticus Arthrobacter artocyaneus Bacillus aerophilus, Bacillus megaterium, Bacillus sp. Brevibacillus agri Brevibacillus invocatus Burkholderia sp. Chromobacterium violaceum Cupriavidus gilardii Mycobacterium fortuitum Nocardiopsis sp. Ochrobactrum anthropi Staphylococcus arlettae, Staphylococcus pasteuri Streptomyces sp. Pseudomonas acephalitica Rodococcus equi Aspergillus sp. Aspergillus niger Gongronella butleri Pénicillium sp. Phizopus stolonifer Spicaria sp. Acremonium recifei Paecilomyces lilacinus Trichoderma pseudokoningii

КИС Дам Бай Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides Brevibacillus agri Gordonia terrari Cupriavidus sp. Burkholderia sp. Microbacterium paraoxydans Mycobacterium sp. Streptomyces sp. Gongronella butleri Pénicillium oxalicum Pénicillium sp. Aspergillus sp.

Примечание: жирным шрифтом выделены микроорганизмы-деструкторы ПГА

Определение видового состава первичных деструкторов ПГА показало, что среди бактерий доминировали грамотрицательные палочки, принадлежащие к роду Burkholderia. Эти микроорганизмы были выделены из образцов обоих исследуемых районов. Также в почвах обеих станций обнаружены актинобактерии рода Streptomyces. Кроме этих представителей на станции Дам Бай в качестве деструкторов ПГА определены бактерии родов Bacillus, Cupriavidus и Mycobacterium, а на Хоа Лак — актинобактерии рода Nocardiopsis. Среди грибов-деструкторов ПГА общими для исследуемых районов определены Gongronella butleri и Pénicillium sp. Виды Acremonium recifei, Paecilomyces lilacinus и Trichoderma pseudokoningii встречались только в

почве станции Хоа Лак. Результаты идентификации бактерий и грибов — первичных деструкторов ПГА, проведенные по совокупности культуральных, морфо-физиологических признаков и результатов секвенирования генов 168 и 28Б рРНК, представлены на рисунках 8 и 9.

78 Burkholderia sp. IBP-M1S96 Burkholderia sp. IBP-VEIS29 Burkholderia sp. IBP-VS127 50 Burkholderia cepacia GQ359110 Burkholderia sp. rBP-VHS92 M Burkholderia sp. IBP-VNS150 Burkholderia sp. IBP-VNS59 Burkholderia sp. IBP-VHS23 9JI Cnpriavidus sp. IBP-VNSlrt2 ~100i Cupriavidus sp. GU566329

Cupriavidus metallidurans GU230SS9 1001 Bacillus cereus EF100616 1 Bacillus cereus IBP-VNS39

loo I Streptomyces sp. GQ924534 Streptomyces sp. IBP-\HS4 100; Mycobacterium mucogenicum AY457075 .Mycobacterium sp. IBP-VNS121 - Methanobacterium ivanovii AF095261o

Рисунок 8. Филогенетическое положение изученных штаммов бактерий-деструкторов ПГА, выделенных га тропических почв (показано жирным шрифтом), на основе сравнения нукпеотидных последовательностей гена I6S рРНК методом ближайших соседей. Цифрами показаны значения индекса "bootstrap " 50% и более.

Pénicillium ianthmellum НМ469429 Pénicillium' sp. IBP-VHS26Î Pénicillium sp. IBP-YNS146 Pénicillium sp. GQ169747 Pénicillium sp. IBP-VHS64f -îooj Pénicillium oxalicuin DQ123663 M 1 Pénicillium oxalicum JBP-VNS54f

L Pénicillium sp. IBP-VHS41I ÎW, Pénicillium sp. IBP-VHS20f ' Pénicillium sp. HM3670S3 loo. Acremonium recifei IBP-VIIS68f | I Acremonium recifei HQ232115.1 ¿98, Paecilomvces lilacinus AY213 717 [P Paecilomvces lilacinus IBP-\1IS44f 1 si г Trichoderma pscudokoniugii IBP-YHS7sf ' Trichoderma pseudokoningii AF400740 Gonaronella butleri AF157191 Gongronella butleri IBP-MIS77f Gongronella butleri IBP-VXS102f Gongronella butleri IBP-YXS13f

_100 100 86

- Saccharomvces boulardii AY42SS61.1

Рисунок 9. Филогенетическое положение изученных штаммов микромицетов-деструкторов ПГА, выделенных из тропических почв (показано жирным шрифтом) на основе сравнения нуклеотидных последовательностей гена 28S рРНК методом ближайших сюседей. Цифрами показаны значения индекса "bootstrap " 60% и более.

Таким образом, активность и механизм процессов биоразрушения ПГА в сибирских и тропических почвах зависели от численности и специфичности микробиоценозов, сформировавшихся в анализируемых экосистемах. Активное разрушение ПГА зафиксировано при обсемененности почв не менее чем 107 КОЕ в 1 г.

3. Закономерности биоразрушенпя ПГА в природных водоемах

В важной проблеме оценки последствий постепенной замены синтетических пластмасс разрушаемыми биополимерами наименее изученным аспектом остается биодеградация ПГА в природных водоемах. Ранее сотрудниками Института биофизики СО РАН были проведены исследования деградации ПГА в пресных водоемах в окрестностях Красноярска (Volova et al., 2007). Принимая во внимание тот факт, что акватория Мирового океана превращается в глобальный аккумулятор пластиковых отходов, и это крайне негативно сказывается на состоянии гидросферы, в данной работе исследования были сосредоточены на процессах биоразрушения ПГА в водных экосистемах повышенной солености.

3.1. Исследование биоразрушения полигидроксиалканоатов в морской воде в тропических условиях

Исследование разрушаемости ПГА проведено на морском испытательном стенде в бухте Дам Бай Южно-Китайского (Восточного) моря. Образцы ПГА двух типов (ПЗГБ и ПЗГБ/ЗГВ с включением гидроксивалерата около 10 мол%) в чехлах из мелкоячеистого мельничного газа были закреплены на стандартных стационарных кассетах из нержавеющей стали, которые помещали в шлюзовую камеру платформы. Глубина погружения образцов в море составила 120 см. Эксперимент проведен в период с 11 марта по 27 июля 2009 г. За это время гидрохимические показатели морской воды изменялись незначительно: температура воды 28,5±1,5 °С; рН 7,0-7,5; соленость около 34 %о, концентрация растворенного кислорода 5,4-8,3 мг/мл

Потеря массы образцов ПГА в течение первых 60 суток экспозиции происходила медленно, без резких гаменений. За этот период происходило формирование биопленок обрастания на поверхности образцов и адаптация микроорганизмов к субстрату. Затем убыль массы изделий га ПГА быстро увеличивалась, при этом пленочные образцы, имеющие большую площадь поверхности, разрушались быстрее объемных форм (рис. 10). Остаточная масса пленок гомополимера через 140 суток экспозиции в морской воде составила 28,5 %, сополимера — 42,5 %, при периодах уменьшения массы образцов на Уг от 127 до 133 суток. Остаточная масса прессованных форм была выше и составила к концу эксперимента 63,5 и 86,7 % для ПЗГБ и ПЗГБ/ЗГВ соответственно. В тропической морской воде, также как и в тропических почвах, образцы из ПЗГБ разрушались быстрее, чем ПЗГБ/ЗГВ.

Изменение морфологии поверхности прессованных форм в процессе биоразрушения проявлялись менее значительно по сравнению с поверхностью пленок (рис. 11).

100

С= = г=0----

11.03.09 31.03.09 20.04.09 10.05.09 30.05.09 19.06.09 09.07.09 2S.07.09 -¿г-ПЗГБ (20-формы) -О-ЛЗГБ/ЗГВ (20-формы)

-А- ПЗГБ (ЗО-формы) -О- ПЗГБ/ЗГВ (ЗО-формы)

Рисунок 10. Изменение массы обращов ПГА (% от исходной) в морской воде Южно-Китайского моря

-г"-"-'}

- - .

2а

¡¡¡[26 Г '

« р

'„ ¡¡гаШ ир в

ШЗ

Ш ШШ НМя

Рисунок 11. Изменение структуры поверхности ПЗГБ в виде пленок (1) и объемных форм (2): а — исходные образцы; б — после экспозиции в морской воде Южно-Китайского моря 28

Молекулярная масса образцов всех типов в процессе разрушения снизилась, а значение полидисперсности увеличилось (табл. 11). Эти данные аналогичны результатам, полученным в предыдущих экспериментах. Тем не менее, анализ рентгенограмм ПГА не выявил изменения степени кристалличности. Это позволяет говорить о том, что в процессе биодеградации ПГА в морской среде в исследованных условиях происходило разрушение микроорганизмами обеих фаз, как аморфной, так и кристаллической, в результате чего интегральный показатель степени кристалличности ПГА не изменился.

Таблица 11 — Изменение степени кристалличности и молекулярной массы образцов ПГА в процессе биодеградации в морской воде Южно-Китайского моря_

Параметр Исходные значения После экспозиции в морской воде

ПЗГБ | ПЗГБ/ЗГВ ПЗГБ | ПЗГБ/ЗГВ

Пленки (2D)

Кристалличность Сх, % 71 69 70 69

Молекулярная масса М„ кДа 1401±106 1318 ±85 1040 ±33 1114 ±80

Полидисперсность 2,00 ± 0,37 2,01 ± 0,23 2,26 ± 0,20 2,00 ± 0,22

Объемные формы (3D)

Кристалличность Сх, % 70 71 71 69

Молекулярная масса Мв, к Да 1359 ±63 1427 ±46 1090 ±87 610 ±25

Полидисперсность 1,83 ±0,11 2,06 ±0,12 2,57 ±0,51 2,41 ±0,11

Микробиологические исследования показали, что в морской воде бухты Дам Бай общая численность гетеротрофных бактерий на среде Y-K составляла 1,6*103 КОЕ в 1 мл, численность микроскопических грибов — 1,2* 102 КОЕ в 1 мл. На поверхности полимерных образцов, экспошгрованных в морской воде в течение 140 суток, сформировались биопленки, в которых регистрировали более высокую численность и большое разнообразие микроорганизмов. Грамотрицательные палочки доминировали во всех образцах, составляя от 60 до 65 % (табл. 12).

Исследование способности выделенных микроорганизмов к гидролизу ПГА показало, что их значительная доля не проявляла ПГА-деполимеразной активности. Выделенные штаммы-деструкторы ПГА идентифицированы как Enterobacter cloacae IBP-V001, Bacillus sp. IBP-V002 и Gracilibacillus sp. IBP-V003 (рис. 13).

Результаты идентификации доминирующих микроорганизмов-деструкторов представлены на рисунке 12.

Таблица 12 — Доминирующие микроорганизмы в морской воде ЮжноКитайского моря (июль, 2009 г.)__

Бактерии Грибы

Морская вода Поверхность образцов ПГА Морская вода Поверхность образцов ПГА

Pseudomonas Flavobacterhim Enterobacter Bacillus Halobacterium Propionibacterium Pseudomonas Pseudoalteromonas Enterobacter Cellulomonas Bacillus Gracilihacillus Corynebacterium Staphylococcus Planococcus Micrococcus Arthrobacter Aspergillus Verticillium Mucor Aspergillus Penicillium Trichoderma Verticillium Mucor Malbranchea

Примечание: жирным шрифтом выделены микроорганизмы-деструкторы ПГА

«. Bacillus sp. 64!C,Q24'J! 02) 'ем-iltuisp. G2BM-61 (DQ4i6m> - Bacillus sp. Itcrjil<wssi>si> ■ Bacilli« sp. IBP-tW! Jtucillas sp Cxms ¡4 04 (1Ю44Х7}3) mSBaemwsp.SAOU /(EUmiSSi шиш sp. SAOU 2 ттш Bacillus tat CV'JSa Ш7ГЗЯЗ) Bacillus firitiuA 309im-D2 (А.ШМИП) BKcHlusßrmus 1? (FJ613603) Baättmfinma 47-5 (FM'ÖJ'J) 4. Отс1ИЫкШизив1Ши$ ГШ9Ш9(Е071ИМ\ *!' 1 Oracilibacillm .то. JSM07SW3 (FJ425901) 2 \ ПGracihbacillm sp. ТГ2-8 /FJIS22I4) |

"^.GnKilihacUliaartentalhEJ-tStJWmlb) i, 1 üracätha. Utas ark-пыШ XH-63T ШЮМ7161 I

II!

Д— Grucilihuctllus tip. IBP- i 003

' GrmiiihiaHmsp. Dsllll-I fAli30S317l GracBibMillus sp. Dstll -l MB305319)

Enterobacter cloacac 279-ЗЛ (SH(12X912) Enterobacter cloacae FR IEUSJ9019; Entcrabacter chiKutr SJ 6 lFl.7'4.421 Enterobacter cloacae TV 1(104263231 EmenthjcterJimilnn.-- LMC, 2r,S3Г7.ШП)

EnUTobactcr cloucvc suhsp {liswherrs tnOV$SS23j - Enterobacter cloacae IBP- 1 'HOI Etilerobacier ci'hK-oc lh-35!EF5Sj3f>4i Enterobacter sp. Л SUA 2 (TJSfiW*/ - E'clwrkhit, coli л ТСС К 73'/

Рисунок 12. Филогенетическое положение изученных штаммов бактерий -деструкторов ПГА, выделенных из морской воды (показано жирным шрифтом), на основе сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК методом ближайших соседей. Масштаб соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 10 последовательностей. Цифрами показаны значения индекса "bootstrap" более 65%. Размер шкалы — 5 мкм

Исследование деполимеразной активности микроскопических грибов в отношении ПГА показало, что из всех выделенных видов способностью к биодеградации обладает только один - \falhranchea Таким образом, в процессах морской деструкции ПГА в тропических условиях в основном принимают участие бактерии.

3.2. Исследование деградации ПГА в солоноватоводном озере Шира

Особенностью озера Шира является глубинная стратификация по температуре, химическому составу, а также характеристикам биоты (Ка1асЬеуа й а1., 2002; Саеуэку е1 а1., 2002; Пименов с соавт., 2003; гасЗегееу, То1отееу, 2007). Образцы пленок (0 30 мм), изготовленных из ПГА двух типов (ПЗГБ и ПЗГБ/ЗГВ с включением гидроксивалерата около 10 мол%), погружали на различную глубину с учетом горизонтов стратификации озера. Глубина 3 м соответствует эпилимниопу (теплые верхние воды, летние температуры порядка 20 °С, оксигенные процессы); глубина 9м — гиполимниону (холодные воды под термоклином, летние температуры порядка 6 °С, оксигенные процессы); глубина 13 м - хемоклину (зона перехода от оксигенных к аноксигенным условиям, температура порядка 2 °С, как оксигенные так и аноксигенные процессы); 20 м - монимолимниону (неперемешивающиеся воды под хемоклином, аноксигенные процессы, температура порядка 1 °С).

Эксперимент проведен с 13 июня по 29 августа 2007 г. В этот период регистрировали изменение физико-химических параметров водоема. Температура воды в эгашимнионе составляла от 13 °С в начале эксперимента до 23-24 °С в середине июля; на глубине 9 м температура была подвержена меньшим колебаниям - от 12 до 18 °С; в хемоклине и монимолимнионе в среднем составляла 5,0-6,0 и 1,5-2,0 СС, соответственно. Соленость воды варьировала от 10,6-11 96о на верхних горизонтах до 12-12,5 %а — ниже хемоклина; значения рН составляли от 8,9 до 8,5.

Характер уменьшения массы пленок го ПГА на разных глубинах озера указывал на то, что практически во всех случаях имела место латентная фаза от 20 до 40 суток, как и при биодеградации образцов ПГА в морской воде.

Наиболее активно разрушение ПГА происходило на глубине 3 м, где через 50 суток экспонирования масса пленок из гомополимера (ПЗГБ) уменьшилась на 9,0 % от исходной, масса образцов из сополимера — на 15,8 % (рис. 13). По данным Н.В. Пименова с соавт. (2003) на этом горизонте регистрируется высокая концентрация бактерий планктона, а поскольку основной механизм разрушения ПГА в окружающей среде связан с ферментативной активностью бактерий, поэтому в верхних горизонтах водоема возникали благоприятные условия для его деградации.

На глубине 9 м достоверного изменения массы образцов пленок обоих типов 111А не обнаружено. Это объясняется преобладанием автотрофных микроорганизмов и небольшой долей деструкторов, т.к. на данном горизонте оз. Шира находится зона активного фотосинтеза с максимальной

концентрацией хлорофилла и биомассы цианобактерий и зеленых водорослей (ваеуБку е1 а1., 2002).

сутки

Рисунок 13. Изменение массы пленок из ПГА (% от исходной) в озере Шира, экспонированных на различных глубинах: 1 - ПЗГБ, 2 - ПЗГБ/ЗГВ

Примечательно, что деградация образцов зафиксирована также в монимолимнионе (20 м), для которого характерны отсутствие кислорода, наличие сероводорода и низкие температуры. В конце периода наблюдения на этом горизонте отмечено снижете массы гомополимера ПЗГБ на 9,2%, сополимера - на 16,2 % от исходных величин. Это свидетельствует об активном участии анаэробной микрофлоры в ассимиляции ПГА в водоемах.

В связи с малыми значениями убыли массы пленок проанализированы (с использованием ВЭЖХ) и определены средневесовая, среднечисловая молекулярная массы, а также степень полидисперсности ПГА (табл. 13).

Таблица ¡3- Изменение степени кристалличности и молекулярной массы образцов ПГА в процессе биодеградации в озере Шира

Параметр

Кристалличность С^,

Молекулярная масса Ма, кДа__

Полидисперсность

Исходные значения

После экспозиции на различной глубине 3 м | 9м | 13 м | 20м"

Пленки, ПЗГБ

884±19

2,1 ±0.1

874+38

2,6±0,1

863±29

2,3±0,1

796±40

2,4±0,1

808±17

2,5±0,1

Пленки, ПЗГБ/ЗГВ

Кристалличность С„

Молекулярная масса М„кДа_

872±41

Полидисперсность

2,2±0,1

785±44

3,0±0,2

795±67

718±32

2,4±0,1 2,9±0,1 2,3±0,2

670±34

Зафиксированное снижение молекулярной массы на всех горизонтах является свидетельством протекания процесса биоразрушения ПГА в озере Шира на глубине до 20 м, как в оксигенных, так и в аноксигенных зонах водоема.

4. Конструирование и оценка эффективности долговременных форм сельскохозяйственных препаратов, депонированных в матрикс из ПГА

Использование биоразрушаемых полимеров в качестве платформы для депонирования и доставки препаратов сельскохозяйственного назначения -новое направление исследований, ориентированное на снижение риска неконтролируемого распространения химических соединений в биосфере. Такие формы позволяют сократтпъ объемы вносимых в почву препаратов и обеспечить их длительную и контролируемую доставку в течение вегетационного сезона (РПегэка, 2005; Капатрш, 2009).

Анализ данных, полученных при исследовании закономерностей биоразрушения ПГА в почвах, свидетельствует о постепенном развитии этого процесса, что позволяет использовать полимеры этого класса для конструирования долговременных форм сельскохозяйственных препаратов нового поколения. Исследования выполнены на примере трех типов препаратов: гербицида, азотного удобрения и биофунгицида на основе гриба Тг1сИос1егта.

4.1. Долговременная форма гербицидного средства, депонированного в матрикс из ПГА

В качестве гербицида исследован системный препарат Зеллек-супер (действующее вещество - галоксифоп); спектр гербицидной активности -однолетние и многолетние злаковые. Для депонирования гербицида использовали сополимер 3-гидроксибутирата и 3-гидроксивалерата (ПЗГБ/ЗГВ), который разрушается в сибирских почвах быстрее, чем гомополимер (ПЗГБ). Были получены экспериментальные формы гербицида в виде пленок и микрогранул. Соотношение «полимер : гербицид» в пленке составило 25 : 75 (в % от общей массы). Из полученных пленок высекали фрагменты размером 5x5 мм. Для получения микрогранул использовали раствор гербицида и сополимера в дихлорметане, осаждая его в гексане методом микродропинга. Получено два вида микрогранул с соотношением «полимер : гербицид» - 60 : 40 и 90 : 10 (в % от общей массы).

Эффективность действия разработанных форм гербицида оценивали в лабораторных условиях. Одновременно с посевом семян модельных растений Л^гох^я $1о1от/ега в контейнеры с почвой вносили экспериментальные препараты. Отрицательный контроль — вариант без гербицида, положительный контроль - рекомендованная форма обработки, опрыскивание раствором гербицида в фазе начала кущения.

Убыль массы гранул варьировала в зависимости от степени нагруженности препарата гербицидом (рис. 14). Так, через 19 суток после начала эксперимента остаточная масса гранул, в которых соотношение

«полимер : гербицид» было 60 : 40, составила 87 %, в то время, как для гранул с соотношением, равным 90:10, эта величина составила 56 %. Однако, через 42 суток в обоих вариантах опыта остаточная масса гранул сравнялась и составила 28 % от исходной. С увеличением содержания гербицида в форме увеличивалась скорость его выхода. Конечная концентрация препарата составила 30 мкг/ г почвы для более нагруженных Зеллеком гранул, и 17 мкг/г -для гранул с меньшей натруженностью.

100 75 50 25

1а

19 42

Время, сутки 16

о 10 10 30 40

Время, сутки

I ю

100 76 50 25

19 42

Время, сутки . 18

20 30 40 Время, сутки

19 42 Время, сутки

20 30 40 Время, сутки

Рисунок 14. Динамика биоразрушения в почве матрикса из ПЗГБ/ЗГВ в виде пленок и микрогранул (1) и оттока гербицида Зеллек-супер (2):

микрогранулы с соотношением «полимер : гербицид» - 60:40 (а) и 90:10 (б); пленки с соотношением 75:25 (в)

Деградация пленочных образцов происходила медленнее по сравнению с гранулами: к концу эксперимента остаточная масса полимера составила 67 % (рис. 14в). В отличие от гранулированной формы выход гербицида из полимерной пленки был более активным и неравномерным. В первые 19 суток выход препарата составил 142 мкг на 1 г почвы, что соответствует 91 % от включенного. Выход гербицида в этот период происходил за счет диффузии препарата через полимерный матрикс и был связан с тем, что пленки обладают большей площадью контакта по сравнению с гранулами. Далее процесс высвобождения препарата замедлился на фоне начавшейся деградации полимера.

Микробиологический анализ показал, что экспериментальные формы препарата не подавляли развитие почвенной микрофлоры. Численность микроорганизмов в контрольной почве составляла (2,38±0,09)хЮ10 КОЕ/г. в опытных вариантах с внесением экспериментальных форм препаратов - почти в 3 раза превышала численность микрофлоры в контрольных образцах. Добавление гербицида в концентрации 15 мкг на 1 г почвы не оказывало достоверного влияния на рост микроорганизмов.

По мере разрушения полимерного матрикса, выхода препарата в почву и его доставки к корневой системе растений количество ростков постепенно снижалось, всходы быстро увядали и высыхали (рис. 15).

10 20 30 сутки

Рисунок 15. Подавление роста растения (А^оэНэ БЫот/ега Ь.) гербицидом Эеллек: 1 - контроль (без применения гербицида), 2 — традиционная форма обработки (опрыскивание раствором гербицида), 3 - форма гербицида в виОе микрогранул, 4 -форма гербицида в виде пленок

Подавление роста растений, оцениваемое по количеству биомассы в конце периода наблюдения, составило 96-99 % по сравнению с биомассой в контроле. Обработка растений препаратом Зеллек-супер методом опрыскивания в рекомендованных дозах оказалась менее эффективной. Этот способ не препятствовал фазе прорастания семян и не снижал всхожесть, так как обработке подвергали вегетируюпше растения в фазе начала кушения и рост прекращался в более поздние сроки, через 23-25 суток после высева семян. Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности разработанной формы гербицидного средства в виде пленок. В этом варианте более эффективный выход препарата из активно разрушающегося полимерного матрикса создавал высокую концентрацию препарата в почве и полностью подавлял развитие тестового растения.

4.2. Использование ИГА для разработки пролонгированной формы азотных удобрений

Высокие концентрации азотных удобрений, вносимые в почву, не усваиваются в полной мере растениями и попадают в грунтовые воды вместе со стоками, вызывая эвтрофирование природных водоемов и массовое развитие цианобакгерий. Использование удобрений, депонированных в полимерный матрикс, позволяет уменьшить концентрации вносимых препаратов и обеспечивает снижение азотной нагрузки на агроценозы. Однако необходимо определить, насколько соответствует скорость разрушения полимерного матрикса и оттока азота в почву потребностям растений.

Разработаны и исследованы две экспериментальные формы пролонгированного азотного удобрения (на примере карбамида): в виде пленок и объемных прессованных форм на тестовом растении — салате листовом (Latuca sativa) — в условиях фитотрона. Использовали также отрицательный контроль — без внесения удобрения, и положительный контроль - полив раствором карбамида в рекомендованных дозах.

Анализ показал, что процесс разрушения полимерных матриксов обоих форм препарата протекал практически одинаково. Спустя 7-8 суток от начала наблюдения убыль массы пленок и гранул составила 35-40 % от исходной; через 12-14 суток - 50 %; к концу наблюдения (28 суток) остаточная масса была на уровне 30-35 %.

Результаты измерения концентрации азота в почве показали отличия в разных вариантах используемой формы доставки удобрения. Концентрация азота в почве в положительном контроле резко нарастала и достигла на 7-е сутки 0,1 мг/ г почвы. В опыте с пленочной формой депонированного карбамида профиль выхода азота был аналогичным, однако

зарегистрированный максимум его концентрации в почве составил 0,06 мг/г. Выход азота из прессованной формы и его накопление в почве были на уровне 0,047 мг/г, что практически в 2 раза ниже по сравнению с внесением свободного карбамида. В течение последующих 6-8 суток концентрация азота в

почве сравнялась во всех вариантах. За период наблюдения из полимерных форм выход азота составил около 70 % (рис. 16).

од -

0,08 -

з- 0,06 -

0,04

X 2

о Контроль + а Контроль - в Пленки ■ Прессованные формы

Рисунок 16. Динамика концентрации азота в почве при различных способах доставки карбамида

Анализ концентрации азота в дренажных водах показал, что при внесении удобрения в свободном виде и в виде пленок, часть азота в первые 7 суток эксперимента была вынесена из системы дренажными водами, и таким образом была потеряна для растений. Потери азота, депонированного в объемные формы, были существенно ниже (рис. 17).

0,0160

0,0120 -

0,0080 -

0,0040 -

□ Контроль + а Контроль - В Пленки

сутки

Прессованные формы

Рисунок 17. Динамика концентрации азота в дренажных водах при различных способах доставки карбамида

При определении влияния формы подачи азота на урожай тестового растения было установлено, что в первые две недели количество образованной биомассы было близким при всех способах внесения азотного удобрения.

Важно отметить, что в начальный период, несмотря на то, что основная масса карбамида была связана в полимерном матриксе, отставания в росте салата не было. К концу наблюдения (28 сутки) отмечено достоверное увеличение биомассы при использовании экспериментальных форм карбамида на 18-25 % (рис. 18).

14 21 28 сутки

□ Контроль + н Контроль- с Пленки ■ Прессованные формы

Рисунок 18. Динамика прироста биомассы растений batuca sativa при различных способах доставки карбамида

Микробиологический анализ образцов почвы показал, что в период вегетации в контрольной почве без удобрений, количество микроорганизмов изменилось незначительно по сравнению с исходной. В варианте с внесением карбамида поливом в виде раствора наблюдали тенденцию к незначительному снижению численности органотрофных бактерий и микромицетов в почве по сравнению с контролем (табл. 14).

Таблица 14 -- Количественный состав микрофлоры в почвенных образцах

при различных способах доставки азота

Варианты опыта Численность микроорганизмов, КОЕ в 1 г почвы

Бактерии (МПА) Актинобактерии (КАА) Грибы (CA)

Исходная почва (начало опыта) (5,6±1,9)*10' (3,6±0,5)хЮ5 (4,O±l,3)x]0J

Отрицательный контроль(почва без внесения карбамида) (2,7±1,1)хЮ' (2,8±1,1)х105 (3,6±1,2)*104

Внесение карбамида в свободной форме (1,4±0,5)хЮ' (4,1±0,7)хЮ6 (1,8±0,6)хЮ4

Карбамид, депонированный в пленках (4,3±2,0)х109 (5,3±1,6)хЮ7 (3,4±1,3)х104

Карбамид, депонированный в объемных формах (1,4±0,5)х10' (1,3±0,3)хЮ7 (3,1±1,3)хЮ4

Депонирование карбамида в ПГА-матрикс привело к достоверному увеличению численности бактерий по сравнению с контролем. Наибольшая численность бактерий зарегистрирована в варианте с внесением карбамида в пленках и достигала (4,3±2,0)*109 КОЕ в 1 г почвы. Достоверного изменения численности микромицетов в опытных вариантах зарегистрировано не было. Анализ соотношения эколого-трофических групп микроорганизмов в опытных и контрольных вариантах показывает характер протекания и сбалансированность процессов минерализации азот- и углеродсодержащего вещества, поступающего в почву. Исходная и контрольная почва, в которую не виосили карбамид, характеризовались законченностью процессов деструкции органического вещества, с коэффициентами минерализации 2,61 и 1,15 соответственно (табл. 15). При внесении раствора карбамида в почве резко возрастала численность прототрофов, использующих аммонийный азот, в то же время количество копиотрофов и азотфиксаторов сохранялось на контрольном уровне. Высокий коэффициент минерализации свидетельствовал об изменении соотношения С/Ы в сторону повышения количества азота.

Таблица 15 — Соотношение эколого-трофических групп почвенных

Варианты опыта Численность эколого-трофических групп, КОЕ в 1 г почвы

Копиотрофы Прототрофы Азотфиксаторы Коэффициент минерализации

Исходная почва (начало опыта) (5,6±1,9)х10' (1,4±0,2)ХЮ!< (4,2±0,6)х 105 2,61

Отрицательный контроль(почва без внесения карбамида) (2,7±1,1)хЮ7 (3,1±1,0)хЮ7 (3,4±1,1)хЮ6 1,15

Внесение карбамида в свободной форме (1,4±0,5)х10' (2,7±1,0)х10* (1,4±0,6)хЮ6 19,29

Карбамид, депонированный в пленках (4,3±2,0)х109 (9,0±0,3)х Ю8 (1,8±0,6)хЮ5 0,21

Карбамид, депонированный в объемных формах (1,4±0,5)*109 (1,0±0,3)хЮ8 (1,7±0,6)хЮ' 0,07

При внесении в почву карбамида, депонированного в прессованные формы, коэффициент минерализации понижался до 0,07. Связано это с тем, что выход азота из объемных матриксов был более медленным, чем из пленок, сдвиг соотношения С/Ы был направлен в сторону увеличения поступления углеродсодержащей органики за счет полимера. В варианте с внесением карбамида в виде пленок сдвиг С/Ы был менее значительным, поскольку повышение концентрации углеродсодержащего вещества компенсировалось

поступлением аммонийного азота и приводило к увеличению всех групп микроорганизмов в почве.

В аналогичном опыте с использованием экспериментальных форм карбамида, депонированного в полимерный матрикс ПЗГБ в виде пленок и гранул, оценили эффективность препаратов на тестовом растении Лgrostis .чю1от/ега !.. при естественном освещении. В результате было вьивлено позитивное влияние исследуемых форм удобрений на рост биомассы растения. В экспериментальных группах биомасса растений (по абсолютно сухому веществу) на 22-е сутки относительно негативного контроля была выше в 1,31,5 раза. Биомасса растений в вариантах с экспериментальными формами удобрений достоверно не различалась между собой и с положительным контролем, т.е. скорость выхода не лимитировала развивающееся растение (рис. 19).

12 3 4

□ 7 суток В15 суток ■ 22 суток

Рисунок 19. Прирост биомассы растений Аgrostis йо1от/ега Ь. при различных способах доставки карбамида: 1 - отрицательный контроль без внесения удобрения; 2 - положительный контроль; 3 - карбамид, депонированный в гранулы; 4 -карбамид, депонированный в пленки

Таким образом, депонированная форма азотного удобрения по своей эффективности не уступает свободной форме, и в то же время динамика разрушения полимерного матрикса обеспечивает адекватный потребностям культуры отток препарата, исключая возникновения лимита для растений по азоту.

5. Конструирование новых форм биологических препаратов защиты растений на основе иммобилизованных спор грибов ТпсИоёегта

Биологические препараты на основе грибов Тпскойегта эффективны в отношении широкого круга фитопатогенов и широко применяются для защиты сельскохозяйственных и лесных культур. Их действие сопоставимо и даже в ряде случаев превосходит эффект химических фунгицидов. Учитывая, что распространение химических средств защиты растений приводит к развитию резистентности у патогенов, существует острая необходимость замены

слабоактивных и опасных для окружающей среды химических пестицидов биологическими средствами. Особенно актуально применение биопрепаратов при ведении органического сельского хозяйства.

В России разработано и запатентовано около 20 препаратов, содержащих биомассу (споры или мицелий) гриба. Они используются для борьбы с возбудителями болезней растений и обладают высокой антагонистической активностью к широкому спектру грибных фитопатогенов, относящихся к родам Fusarium, Rhizoctonia, Helminthosporium, Colletotrichum, Alternaria, Sclerotinia, Verticillium, Botrytis, Phytophtora и др. (Тюльпанова с соавт. 1997; Гайдашева с соавт., 2008; Громовых с соавт., 2002; Гродницкая, Сорокин, 2006; Справочник..., 2011)

5.1. Эффективность биопрепаратов на основе штаммов грибов рода Trichoderma в защите сеянцев хвойных в лесопитомниках

В полевых опытах вегетационных периодов 1997 и 1998 гг., проведенных в Мининском лесопитомнике Красноярского края, оценивали действие биофунгицида на основе гриба Т. harzianum, вносимого в ризосферу сеянцев ели, на фоне естественного микробиоценоза. Опытные варианты включали следующие формы: внесение Т. harzianum в почву вместе с посевным материалом в виде чистых спор, а также в виде препарата триходермин-БЛ на твердом носителе (зерна ячменя). Инфекционная нагрузка при внесении чистых спор гриба составляла 150 тыс. спор на 1 см2 почвы, а при внесении триходермина-БЛ использовали два варианта: 600 и 1200 тыс. спор на 1 см2.

Как показали исследования, при внесении спор Т. harzianum масса корневой системы сеянцев увеличилась на 36,7 %, а при внесении разных концентраций триходермина-БЛ - на 10,2 и 34,7 % по сравнению с контролем. Длина и биомасса надземной части достоверно не изменялись при всех видах обработки. Наибольшее количество здоровых сеянцев получено при внесении в почву Т. harzianum в виде спор и составляло 84,1 %. В этом же варианте было меньше всего погибших сеянцев — 9,1 %. При внесении триходермина-БЛ 600 тыс. спор на 1 см2 число здоровых сеянцев составляло 73,6 %, а при дальнейшем увеличении инфекционной нагрузки спор Т. harzianum количество здоровых сеянцев уменьшалось до 34,1 % и увеличивалось число поврежденных и погибших сеянцев. Таким образом, биологически активные вещества, выделяемые грибами Т. harzianum, стимулировали развитие корневой системы и повышали выход здоровых сеянцев ели. Однако, высокая инфекционная нагрузка гриба Т. harzianum в ризосферной почве негативно отражалась на развитии надземной части сеянцев.

Микробиологический анализ почвенных образцов показал, что обогащение ризосферы ели грибами Т. harzianum не привело к изменению численности популяций сапротрофных микромицетов, оказало оздоравливающее действие на микробиоценоз и позволило уменьшить численность фитопатогенов в опытных образцах. Тем не менее, высокий титр вносимого биопрепарата оказал угнетающее действие на развитие почвенных

бактерий, что привело к снижению общей численности органотрофных бактерий в первый месяц после внесения биопрепарата на 38,1% по сравнению с контролем. В последующие месяцы при снижении титра биологического агента до уровня контрольной почвы угнетающее действие не обнаруживали и численность бактерий в опытных вариантах не отличалась от контрольной.

Учитывая, что высокая инфекционная нагрузка гриба T. harzianum в ризосферной почве угнетающе действует на рост бактерий, а также может негативно отразиться ira развит™ надземной части растений, возникает необходимость в контролируемом поступлении действующего начала биопрепарата в окружающую среду.

5.2 Оценка эффективности новых форм биопрепаратов на основе штаммов грибов рода Trichoderma, иммобилизованных на носителе ИГЛ

Для сохранения биологической активности препаратов на основе грибов Trichoderma применяются методы иммобилизации. В качестве носителей используют зерно пшеницы и ячменя, торф, отходы сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности (солома, гречневая шелуха, топинамбур, опилки, кора и т.п.) (Апсите с соавт., 1989; Лунева, 2006; Ким, 2001; Свиридова с соавт., 2001).

В настоящей работе изучена жизнеспособность грибов рода Trichoderma, при разных способах хранения: в виде порошка сухих спор и при иммобилизации на гранулах ПЗГБ. За анализируемый период времени отмечено достоверное снижение жизнеспособности спор у разных штаммов: на 17-26 % через год хранения в иммобилизованном состоянии, на 21-33 % - при хранении в виде сухой споровой массы. Таким образом, длительное хранение препарата приводит к снижению его эффективности, что в сочетании с неблагоприятными условиями для прорастания спор и развития гриба может привести к потере ожидаемого эффекта и развитию болезни растений.

По результатам исследований сконструирована экспериментальная форма биопрепарата иммобилизованного на микрочастицах ПЗГБ в качестве носителя для спор гриба Trichoderma. Эксперимент проводили в модельных опытах в лабораторных почвенных микроэкосистемах. В контейнеры с почвой вносили споры гриба T. harzianum штамм «Универсальный» в чистом виде и иммобилизованные на микрочастицах. Титр чистых спор составлял 1 х Ю10 в 1 г, соотношение спор и микрочастиц в иммобилизованном препарате - 1:5. Инфекционная нагрузка - 1,5 х 105 спор на 1 см2 почвы. Сохраняемость популяции грибов в почве при интродукции определяли в динамике (рис. 20).

Исходная почва содержала аборигенные штаммы гриба Trichoderma в количестве 0,5±0,1 тыс. КОЕ в 1 г почвы. Через 7 суток после интродукции численность популяции триходермы увеличилась в 2 раза при интродукции чистых спор и в 9,7 раза - при интродукции спор, иммобилизованных на ПГБ. Вероятно, полимер служит дополнительным субстратом для питания микроорганизмов и обеспечивает более быстрое развитие гриба в почве.

М Исходная плчеа ^И-Чистьшспоры —>»Илдмобилизоазнные на ПГБ

Рисунок 20. Динамика численности грибов ТпсИос/егта в модельных, почвенных микроэкосистемах после интродукции

Через месяц после интродукции наблюдали максимум развития популяции триходермы: от 28,3 до 42,5 тыс. КОЕ в 1 г почвы в разных вариантах опыта. Через 2 месяца численность грибов в контрольном варианте резко снижалась, а в опытном варианте стабилизировалась. Как следует из результатов эксперимента, иммобилизация спор на носителе позволила обеспечить постепенное плавное развитие популяции гриба Тгккойегта в почве без резкого подъема численности и сохранить эффективную дозу контролирующего агента в течение периода вегетации.

Таким образом, ПГА эффективны в качестве матриксов для создания долговременных форм различных сельскохозяйственных препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное комплексное исследование по изучению взаимодействия полигидроксиалканоатов с природными дппсробиоценозами почвенных и водных экосистем, актуализированное необходимостью перехода на экологичные биоразрушаемые материалы, альтернативные продуктам химического синтеза, и перспективами расширения сфер применения ПГА, выявило характерные особенности в динамике биодеструкции изделий из ПГА различной химической структуры в регионах, отличающихся погодными и климатическими условиями. Было показано, что климатические условия не являются решающим фактором при определении продолжительности периодов деградации ПГА-изделий, поскольку ключевая роль в реализации процесса трансформации ПГА в окружающей среде принадлежит микроорганизмам. Активное разрушение тонких пленок и объемных прессованных форм ПГА обеспечивают высокая численность микроорганизмов (не менее чем 107 КОЕ в 1 г) и их физиологическая активность при стабильной температуре и влажности. Отличия в динамике биоразрутаения изделий из гомополимера ПЗГБ и сополимеров ПЗГБ/ЗГВ в Сибирском регионе и в тропиках связаны с

тем, что в исследуемых районах доминируют разные виды микроорганизмов -первичных деструкторов, синтезирующие специфические ПГА-экзодеполимеразы.

Во всех случаях начальный процесс разрушения образцов полимера характеризуется выраженным латентным периодом, длительность которого составляет от нескольких суток до 1-1,5 месяцев. На продолжительность периода биодеградации оказывают влияние способ изготовления и форма полимерного изделия - двумерные пленки разрушаются быстрее, чем объемные прессованные образцы. Специфичен и характер трансформации изделий разной геометрии: разрушение пленок происходит по всей поверхности, а у прессованных образцов образуются полости и каналы на стыках гранул полимера, и развивается глубинная деструкция.

Важной особенностью биоразрушения ПГА является равномерное и постепенное течение этого процесса, что дает возможность использовать такого рода полимеры для создания долговременных форм сельскохозяйственных препаратов нового поколения. Выявленные закономерности разрушения ПГА в почвах и водоемах позволяют конструировать изделия различной геометрии из гомо- или сополимеров, предназначенные для использования в конкретных регионах.

ВЫВОДЫ:

1. Из полигидроксиалканоатов (ПГА) различной химической структуры, отличающихся физико-химическими свойствами, сконструированы экспериментальные образцы изделий в виде пленок, объемных форм и микрогранул; изучена их биоразрушаемость в лабораторных микроэкосистемах. Установлено положительное влияние ПГА как дополнительного субстрата на рост и развитие микроорганизмов в почве; зависимость процесса биодеградации от температуры среды в диапазоне 1635 °С; отсутствие деградации изделий из ПГА при рН 5,2-7,5 в стерильных условиях.

2. Изучена динамика биодеградации изделий из ПГА в природных экосистемах, расположенных в различных регионах и климатических условиях, и установлено, что периоды, в течение которых масса изделий из полимеров уменьшается на 1Л от исходной, могут варьировать от 68,5 до 270 суток в почвах Сибири, от 16 до 380 суток в тропических почвах Вьетнама; от 73 до 324 суток в солоноватоводном озере Шира; от 127 до 220 суток в морской воде Южно-Китайского моря. Продолжительность периода биодеградации ПГА существенно зависит от численности и физиологической активности микроорганизмов, определяемых характеристикой природной среды, прежде всего, температурным режимом и влажностью, а также от таксономической характеристики микробиоценозов, сформировавшихся в природных экосистемах районов исследований.

3. Установлено, что на поверхности полимерных образцов формируются микробиоценозы, специфичные для конкретной природной среды, качественно

и количественно отличающиеся от микрофлоры контрольных образцов фоновой воды и почвы. С использованием диагностических сред установлено, что количество микроорганизмов - первичных деструкторов, обладающих ПГА-экзодеполимеразами, в 10-15 раз ниже общего количества микроорганизмов, участвующих в ассимиляции изучаемых полимеров.

4. Основываясь на культуральных, морфо-физиологических признаках и результатах определения нуклеотидных последовательностей гена 16S (28S) рРНК идентифицированы первичные микроорганизмы-деструкторы ПГА, характерные для микробиоценозов анализируемых экосистем. Во всех районах исследований как первичные деструкторы ПГА определены бактерии го рода Bacillus и микромицеты из родов Paecilomyces и Pénicillium. Доминантными деструкторами ПГА в почвах Сибири являются: бактерии родов Variovorax, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Pseudomonas, Bacillus и Xanthomonas и микромицеты Pénicillium, Paecilomyces, Acremonium, Verticillium и Zygosporium; в тропических почвах: бактерии родов Burkholderia, Bacillus, Cupriavidus, Streptomyces, Nocardiopsis, Mycobacterium, и микромицеты Gongronella, Pénicillium, Acremonium, Paecilomyces и Trichoderma; в прибрежной воде Южно-Китайского моря: бактерии родов Enterobacter, Bacillus и Gracilibacillus, микромицеты рода Malbranchea.

5. Исследованы изменения микроструктуры и физико-химических свойств ПГА различного состава в процессе биодеградации. Установлено, что разрушение изделий из ПГА сопровождается снижением молекулярной массы полимеров и возрастанием полндисперсности, что свидетельствует о деструкции С-цепей в полимере и увеличении количества фрагментов с различной степенью полимеризуемости. В почвах разрушение полимеров сопровождается повышением степени кристалличности как показателя преимущественного взаимодействия ПГА-экзодеполимераз с аморфной фазой полимера; в морской воде ферментативной атаке деполимеразами одновременно подвергаются обе фазы, кристаллическая и аморфная, в связи с чем степень кристалличности ПГА не изменяется.

6. Установлено, что механизм биоразрушения ПГА различного химического состава отличается в районах исследований: в условиях тропиков быстрее разрушаются образцы из гомополимера 3-гидроксибутирата, в условиях Сибири — образцы из сополимера 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом. Выявленные закономерности объясняются различием видового состава ключевых микроорганизмов-деструкторов и связаны со специфичностью действия микробных ПГА-экзодеполимераз.

8. На основе изученных закономерностей биоразрушения ПГА почвенными микробиоценозами сконструированы и положительно оценены экспериментальные формы препаратов сельскохозяйственного назначения — гербиццда (Зеллек), азотного удобрения (карбамида) и грибного биопрепарата (триходермина), - депонированных в полимерный матрикс из ПГА. Разработашшю формы препаратов обеспечивают контролируемый и локальный выход активного вещества в течение вегетационного периода растений, не

проявляют ингибирующего действия на развитие почвенной микрофлоры и не уступают по эффективности традиционным формам. Использование данных препаратов позволяет без снижения эффективности действия сократить нормы внесения химических веществ в среду и их аккумуляцию в биосфере.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Статьи

1. Шмарловская (Прудникова) С. В. Использование биологического контроля против возбудителей корневых гнилей зерновых культур / C.B. Шмарловская, Т.И. Громовых, В.М. Гольд, В А. Тюльпанова / Сб. науч. тр. Регуляция численности беспозвоночных и фитопатогенов. - Новосибирск, 1997. - С. 114119.

2. Громовых Т. И. Trichoderma harzianum Rifai aggr. как фактор повышения устойчивости томатов к возбудителям корневой гнили / Т.И. Громовых, В.М. Гукасян, Т.И. Голованова, C.B. Шмарловская // Микология и фитопатология. -1998.-Вып. 2.-С. 72-76.

3. Громовых Т. И. Оценка антагонистической активности некоторых штаммов гриба Trichoderma harzianum в отношении возбудителей сосудистых микозов сеянцев хвойных / Т.И. Громовых, C.B. Шмарловская, Е.А. Гусева / Депонирована в ВИНИТИ за № 466-В98 от 17.02.98 г.

4. Громовых Т.И. Новые аборигенные штаммы грибов рода Trichoderma распространенные на территории Средней Сибири / Т.И. Громовых, C.B. Прудникова, B.C. Громовых, O.A. Могильная // Микология и фитопатология. -2001.-Вып. 1. - С. 56-61.

5. Громовых Т. И. Видовой состав и свойства возбудителей фузариоза в питомниках Красноярского края / Т.И. Громовых, C.B. Прудникова, Ю.А. Литовка, О.Н. Андреева, Т. А. Корянова // Лесоведение. - 2002. - № 6. - С. 68-71.

6. Volova T.G. Biodegradation of polyhydroxyalkanoates (PHAs) in tropical coastal waters and identification of PHA-dcgrading bacteria / T.G. Volova, A.N. Boyandin, A.D. Vasiliev, V.A. Karpov, S.V. Prudnikova, O.V. Mishukova, U.A. Boyarskikh, M.L. Filipenko, V.P. Rudnev, Bùi Bá Xuân, Vü Viêt Düng, I.I. Gitelson // Polymer Degradation and Stability. - 2010. - Vol. 95. - P. 2350-2359.

7. Волова Т. Г. Биодеградация полигпдроксиалканоатов (ПГА) в восточном море и идентификация ПГА-деградирующих бактерий / Т.Г. Волова, А. Н. Бояндин, А. Д. Васильев, В. А. Карпов, ИВ. Кожевников, C.B. Прудникова, В. П. Руднев, Суан Буй Ба, Зунг By Вьет, И. И. Гительзон // Микробиология. - 2011. - Т. 80. -№2.-С. 266-274.

8. Бояндин А.Н. Биодеградация полигпдроксиалканоатов почвенными микробиоценозами различной структуры и выявление микроорганизмов-деструкторов / А.Н. Бояндин, C.B. Прудникова, М.Л. Филипенко, Е.А. Храпов, АД. Васильев, Т.Г. Волова // Прикладная биохимия и микробиология. - 2012. -Т. 48. - № 1. - С. 35-44.

9. Жила Н.О. Деградация пленок из полигидроксиалканоатов в солоноватоводном озере Шира / НО. Жила, C.B. Прудникова, Е С. Задереев, Д.Ю. Рогозин // Журнал СФУ. Серия Биология. -2012. - Т. 5. - № 2. - С. 196-202.

10. Прудникова C.B. Закономерности биоразрушения полигидроксиалканоатов в природных условиях. / C.B. Прудникова, К.И. Коробихина, А Н. Бояндин, Т.Г. Волова//Журнал СФУ. Серия Биология. - 2012. -Т. 5. - № 3. - С. 290-297. '

11. Прудникова C.B. Долговременные системы доставки удобрений на основе полигидроксиалканоатов./ С В. Прудникова, В Ц Цыремпилов // Журнал СФУ. Серия Биология. -2012. - Т. 5. - № 3. - С. 298-303.

Монография

12. Прудникова C.B. Экологическая роль полигидроксиатканоатов: закономерности биоразрушения в природной среде и взаимодействия с микроорганизмами / C.B. Прудникова, Т.Г. Волова. - Красноярск: Красноярский писатель, 2012. — 184 с.

Патент

13. Громовых Т.Н. Штамм гриба Trichoderma sp. МГ-97, используемый для защиты сеянцев от фузариозов. / Т.И. Громовых, C.B. Прудникова, В.А. Тюльпанова, B.C. Громовых. - Патент № 2171580 от 10.08.2001. - Москва, 2001.

Учебно-методические работы

14. Гукасян В.М. Микробиология. Руководство для работ по малому практикуму. Часть 3. / В.М. Гукасян, Т.И. Громовых, C.B. Шмарловскпя. - Красноярск: РИД КрасГУ, 1997. - 19 с.

15. Громовых Методы выделения, изучения и культивирования микроорганизмов: Учебное пособие / Т.И. Громовых, C.B. Прудникова, В.А. Тюльпанова, В.М. Гукасян. - Красноярск: Изд-во СибГТУ, 2002. - 152 с.

16. Прудникова C.B. Руководство для работ по малому практикуму: Учебное пособие / С. В. Прудникова, В. М. Гукасян, Н. И. Сарматова. - Красноярск: КрасГУ, 2004. - 105 с.

17. Громовых Т.И. Методы выделения, изучения и культивирования микроорганизмов: Учебное пособие для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальности «Биотехнология» / Т.И. Громовых, C.B. Прудникова, В.А. Тюльпанова, В.М. Гукасян. - Красноярск: СибГТУ; КрасГУ, 2006.-160 с.

18. Микробиология с основами вирусологии: методы микроэкологического исследования наземных, водных и воздушных экосистем [Электронный ресурс] : лаб. практикум / С. В. Прудникова, Н. И Сарматова, H. Н. Реммель и др. ; Сиб. федерал, ун-т. - Версия 1.0. - Электрой, дан. (5 Мб). - Красноярск : ИПК СФУ, 2008. - 151 on-line. - (Микробиология с основами вирусологии : УМКД X» 1422007 / рук. творч. коллектива Н. Д. Сорокин) (Электронная библиотека СФУ. Учебно-методические комплексы дисциплин). - Загл. с титул, экрана. - ISBN 978-5-7638-1483-5 (лабораторного практикума) : Б. ц. - № гос. регистрации в ФГУП НТЦ «Информрегистр» 0320802766.

19. Микробиология с основами вирусологии: методы микроэкологического исследования наземных, водных и воздушных экосистем : лабораторный практикум / сост. С. В. Прудникова, H И Сарматова, H. Н. Реммель и др. -Красноярск : Информационно-полиграфический комплекс СФУ, 2008. - 155 с.

20. Современные аппаратура и методы исследования биологических систем : учебное пособие / Авт.колл.: Т.Г. ВолоБа, Н.В. Зобова, Л.А. Франк, П.В.

Миронов, C.B. Прудникова и др. / Под ред.: Э. Д. Списки, Т. Г. Волова. -Красноярск: Красноярский писатель, 2011.-479с.

21. Прудникова C.B. Микробиология с основами вирусологии [Электронный ресурс] : электрон, учеб -метод, комплекс дисциплины / C.B. Прудникова, Н. Д. Сорокин, Н. И. Сарматова, H. Н. Реммель, Г.А. Выдрякова. - Сиб. федерал, ун-т. - ВерсиАо. - Электрон, дан. (180 Мб). - Красноярск : ИПК СФУ, 2008.

22. Микробиология с основами вирусологии. Версия 1.0 [Электронный ресурс] : учеб. программа дисциплины / сост. Н. Д. Сорокин, С. В. Прудникова, Н. И. Сарматова и др. - Электрон, дан. (1 Мб). - Красноярск : ИПК СФУ, 2008!

23. Микробиология с основами вирусологии. Банк тестовых заданий. Версия 1.0 [Электронный ресурс] : контрольно-измерительные материалы / С. В. Прудникова, Н. И. Сарматова, H. Н. Реммель. - Электрон, дан. (80 Мб). -Красноярск : ИПК СФУ, 2008.

24. Григорьев Ю.С. Биологический контроль состояния окружающей среды [Электронный ресурс] : электрон, учеб.-метод. комплекс дисциплины Сиб. федерал, ун-т. - Версия 1.0. / Ю.С. Григорьев, Н.В. Пахарькова, C.B. Прудникова, O.E. Крючкова - Электрон, дан. (150 Мб). - Красноярск : ИПК СФУ, 2008.

25. Микробиология с основами вирусолопш : учеб. программа дисциплины / сост. Н. Д Сорокин, С. В. Прудникова, H И Сарматова и др. - Красноярск : ИПК СФУ, 2008. - 27 с.

26. Микробиология с основами вирусологии: конспект лекций / сост.: С. В. Прудникова. - Красноярск : ИПК СФУ, 2008. - 93 с.

27. Микробиология с основами вирусологии : метод, указания к самостоятельной работе / сост. : С. В. Прудникова, Н. И. Сарматова, H. Н. Реммель. - Красноярск : ИПК СФУ, 2008.-64 с.

28. Микробиология с основами вирусологии : организац.-метод. указания / сост. : Н. И. Сарматова, С. В. Прудникова Н. Д Сорокин. - Красноярск : ИПК СФУ, 2008. -20 с.

Материалы конференций

29. Шмарловская С. В. Эффективность новых форм биологических препаратов в борьбе с корневыми гнилями яровой пшеницы / С. В. Шмарловская // Тез. Всерос. студ. науч. конф. "Экология и проблемы защиты окружающей среды". -Красноярск: Изд-во КГУ, 1994. - С. 14.

30. Шмарловская С. В. Экологические аспекты интродукции штаммов грибов Trichoderma в агроценозах / С. В. Шмарловская, Н. Г. Сазикова // Студент и научно-технический прогресс. Мат. ХХХШ Междунар. студ. конф. - Новосибирск: Изд-во НГУ, 1995.-С. 13.

31. Голованова Т. И. Действие грибов рода Trichoderma на компоненты агроценозов томатов / Т. И. Голованова, В. М. Гукасян, Т.И Громовых, C.B. Шмарловская // Методические аспекты экспериментальной работы в исследованиях агрономического профиля: Мат. регион, науч. конф. - Красноярск: Краснояр. гос. агр.ун-т, 1995.-С. 56-57.

32. Громовых Т. И. Эффективность использования биологических препаратов против корневых гнилей злаков в лесостепной зоне Красноярского края / Т. И. Громовых, В.А. Тюльпанова, В.М. Гукасян, C.B. Шмарловская, А.П. Халанская // Методические аспекты экспериментальной работы в исследованиях

агрономического профиля: Мат. регион, науч. конф. - Красноярск: Краснояр. гос агр. ун-т, 1995. - С. 47-48.

33. Шмарловская C.B. Сравнительная оценка действия биопрепарата на основе гриба Trichoderma harzianum на ризосферную микобиоту в различных биоценозах / C.B. Шмарловская // Мат. Всерос. науч. конф. "Агроэкология и устойчивое развитие регионов", посвящ. 45-лет КрасГАУ. - Красноярск: Краснояр. гос. агр. ун-т, 1998. - С. 41-43.

34. Gromovykh Т. I. Perspectives of biopreparations use in increase of Larix sibirica seedling keeping. / T. I. Gromovykh, V. M. Gukasyan, T. I. Golovanova, S. V. Shmarlovskaya, Shilkina E. A. // "Larix-98: World Resourses for Breeding, Resistance and Utilization" IUFRO Int. Symp., - Sept. 1-5, Krasnoyarsk, 1998 - P 3637.

35. Громовых В. С. Перспективы использования аборигенных штаммов рода Trichoderma против фузариозов в лесопитомниках Южной Сибири / В. С. Громовых, Е. Г. Махова, С. В. Шмарловская // Мат. Южно-Сибирской Региональной научной конференции студентов и молодых ученых 11-13 ноября 1998, г. Абакан "Экология Южной Сибири - 2000 год". Абакан, 1998. - С. 94.

36. Gromovykh Т. Use of different formes of Trichoderma as a soil fumigant Picea obovata/T. Gromovykh, S. Shmarlovskaya, T. Coijanova, A. Malinovsky// Ann. Int. Research Conf. On Methyl Bromide Alternatives And Emissions Reductions. -November 1-4, - San Diego, 1999. - P. 38/1-38/5.

37. Gromovykh T. Strains of Trichoderma benifit for biological control seedlings pathogens/ T. Gromovykh, V. Tulpanova, S. Shmarlovskaya, V. Gromovykh, H. Makhova // Ann. Int. Research Conf. On Methyl Bromide Alternatives And Emissions Reductions. - November 1-4, - San Diego, 1999. - P. 39/1-39/4.

38. Громовых Т.Н. Перспективы использования биометода для лесовозобновления в Сибири Мат. VI регион, научно-практ. и метод, конф. "Производительные силы Красноярского края в современных социально-экономических условиях". / Т.И Громовых, C.B. Прудникова, Т.И. Голованова, Т А. Корянова Шилкина Е.А. -Красноярск, 1999. - С. 44.

39. Гукасян В.М. Микробы-антагонисты как фактор устойчивости сеянцев хвойных / В.М. Гукасян, Т.И. Громовых, Т.И. Голованова, C.B. Шмарловская, Е.Г. Махова // Тез. докл. Международного совещания "Методы оценки состояния и устойчивости сеянцев хвойных". - 5-9 августа, Красноярск, 1999. - С 43-45.

40. Громовых Т.И. Опьгг применения различных форм триходерминов в лесопитомниках Красноярского края / ТИ. Громовых, B.C. Громовых, В В. Солдатов, C.B. Шмарловская, И.С. Коссинская, А.Л. Малиновский // Сб.тезисов I межрегионального семинара по мониторингу и защите леса. -Красноярск, 2000. - С. 23-26.

41. Громовых Т. И. Обоснование использования биологического контроля при выращивании посадочного материала / Т. PI. Громовых, C.B. Прудннкова, Ю.А. Литовка, A.B. Гребенник, А.Я. Ковальская // Сб. ст. по материалам 2-й Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии и развития городов», Красноярск, 2001. - Т. 1. - С. 65-69.

42. Прудникова C.B. Биологические свойства сибирских штаммов рода Trichoderma / C.B. Прудникова, Т.И. Громовых, Е.А. Шилкина, O.A. Тулина //Сб. тез. I Съезда микологов России «Современная микология в России». -Москва, 11-13 апреля, 2002 г. -М., 2002. - С. 240-241.

43 Прудникова C.B. Изучение влияния сопутствующей микрофлоры на рост и плодоношение грибов рода Pleurotus при использовании метода высокотемпературной ферментации субстрата / C.B. Прудникова, А.Л. Малиновский, А.В. Рудь, Е.С. Привалихин // Сб. тез. I Съезда микологов России «Современная микология в России». - Москва, 11-13 апреля, 2002 г. - М„ 2002. -С. 286-287.

44. Прудникова C.B. Влияние высокотемпературной ферментации субстрата, инокулированного термофильными бактериями на его селективность при выращивании вешенки / C.B. Прудникова, А.Л. Малиновский // Иммунопатология, инфектология, аллергология. - 2009. - № 2. - С. 64.

45 Prudnikova S.V. Biodégradation of polyhydroxyalkanoates by soil microorganisms / S V Prudnikova, T.G. Volova, M.L. Filipenko II Abstracts of Conf. Ecology of Soil Microorganisms, April 27-May 1,2011, Prague, Czech Republic. -P. 87.

46 Прудникова C.B. Почвенные микромицеты - биодеструкторы полигидроксиалканоатов / C.B. Прудникова // Тезисы Межд. научн. семинара с молодежной школой "Биотехнология новых материалов и окружающая среда", 2-7 июня 2011 г, Красноярск. - С. 112.

47 Коробихина К.И. Изучение процессов биодеградации полигидроксиалканоатов почвенными бактериями. / К.И. Коробихина, C.B. Прудникова // Тезисы Межд. научн. семинара с молодежной школой "Биотехнология новых материалов и окружающая среда", 2-7 июня 2011 г, Красноярск. - стр. 113.

48 Gitelson J.I. Biodégradation of polyhydroxyalkanoates (PHAs) in tropical coastal waters / J.I., Gitelson T.G. Volova, A.N., Boyandin A.D. Vasiliev, V.A. Karpov, S.V. Prudnikova, O.V. Mishukova, U.A. Boyarskikh, M.L. Filipenko, V.P. Rudnev, Bùi Bâ Xuân, Vû Viçt Dung // Abstracts of BITs 1st Annual World Congress of Marine Biotechnology, - 25-30 April 2011, Dalian, China. - P. 181.

49 Boyandin A.N. Biodégradation of polyhydroxyalkanoate films in natural environments / A.N. Boyandin, V.P. Rudnev, V.N. Ivovin, S.V. Prudnikova, M.L.Filipenko, T.G. Volova // Abstracts of Second International Conference on Recycling and Reuse of Materials, 5-7 August 2011, Kottayam, India - P. 8-9.

50 Прудникова C.B. Участие грибов в биодеградации микробных полиэфиров / C.B. Прудникова // Сб. тез. II Съезда микологов России «Современная микология в России». - Москва, 2012.

51. Прудникова C.B. Сравнительные аспекты микробиологической деградации полигидроксиалканоатов в почвах различных климатических зон / C.B. Прудникова // 2-й Семинар с международным участием «Биотехнология новых материалов и окружающая среда». 12-17 июня, 2012. -Красноярск. - С. 143-145.

Подписано в печать 20.09.2012 Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 3,1. Тираж 100. Заказ №78

Отпечатано в типографии Института физики СО РАН 660036, Красноярск, Академгородок 50, стр. 38, ИФ СО РАН

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Прудникова, Светлана Владиславна, Красноярск

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский федеральный университет»

На правах рукописи

05201350072

ПРУДНИКОВА Светлана Владиславна

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Т.Г. Волова

Красноярск, 2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................9

1.1. Негативные последствия накопления в биосфере продуктов химического синтеза..........................................................................................10

1.1.1. Синтетические пластики - глобальная экологическая проблема.... 10

1.1.2. Биологическая опасность загрязнения биосферы ксенобиотиками 15

1.2. Эколого-биотехнологические альтернативы продуктам химического синтеза.................................................................................................................17

1.2.1. Перспективность разрушаемых пластиков........................................18

1.2.2. Экологический потенциал биопрепаратов.........................................23

1.3. Биотехнологический ресурс полигидроксиалканоатов как альтернативы синтетическим полимерным материалам............................31

1.4. Производство и сферы применения ПГА..............................................42

1.4.1. Состояние и перспективы наращивания объемов выпуска ПГА.....42

1.4.2. Потенциальные сферы применения ПГА...........................................45

1.5. Закономерности биодеградации ПГА...................................................50

1.5.1. Механизм биоразрушения ПГА в лабораторных исследованиях.... 50

1.5.2. Исследования биодеградации ПГА в природных условиях.............59

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...................................68

2.1. Объекты исследования.............................................................................68

2.1.1. Синтез и выделение полигидроксиалканоатов..................................68

2.1.2. Изготовление экспериментальных образцов

полигидроксиалканоатов и их характеристика...........................................70

2.2. Методы исследования свойств полимеров............................................71

2.2.1. Исследование химической структуры ПГА.......................................71

2.2.2. Исследование структуры поверхности, физико-химических и физико-механических свойств полимерных образцов...............................71

2.3. Методы исследования биодеградации образцов полигидроксиалканоатов...................................................................................73

2.3.1. Исследование биоразрушаемости образцов ПГА в лабораторных условиях...........................................................................................................74

2.3.2. Исследование биоразрушаемости образцов ПГА в натурных экспериментах.................................................................................................75

2.4. Микробиологические исследования.......................................................79

2.5. Молекулярно-генетические исследования............................................82

2.6. Конструирование и исследование долговременных форм сельскохозяйственных препаратов, депонированных в матрикс из ПГА.... 83

2.6.1. Методика депонирования препаратов в полимерный матрикс.......84

2.6.2. Исследование динамики оттока препаратов в почву........................86

2.6.3. Исследование эффективности разработанных долговременных форм препаратов............................................................................................87

2.7. Конструирование биофунгицидов, иммобилизованных на микроносителях из ПГА, и исследование их эффективности.......................88

2.7.1. Методы оценки эффективности биопрепарата на основе спор гриба Т. harzianum для защиты сеянцев Picea obovata (Ledeb.)............................88

2.7.2. Методы определения потенциала ПГА в качестве микроносителя для создания биофунгицидов нового поколения.........................................89

2.8. Статистическая обработка результатов..................................................91

ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОБРАЗЦОВ ПГА И ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА БИОРАЗРУШЕНИЯ В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ.........................................................................92

3.1. Получение и характеристика полимерных изделий из ПГА...............92

3.2. Исследование разрушаемости ПГА в лабораторных условиях...........97

3.3. Последствия взаимодействия ПГА с микроорганизмами в процессе биоразрушения в лабораторных микроэкосистемах....................................103

ГЛАВА 4. ЗАКОНОМЕРНОСТИ БИОРАЗРУШЕНИЯ ПОЛИГИДРОКСИ-АЛКАНОАТОВ ПОЧВЕННЫМИ МИКРОБИОЦЕНОЗАМИ.....................112

4.1. Исследование биоразрушения полигидроксиалканоатов в почвах средних широт Сибирского региона..............................................................112

4.2. Исследование биоразрушения полигидроксиалканоатов в почвах в тропических условиях.....................................................................................130

ГЛАВА 5. ЗАКОНОМЕРНОСТИ БИР A3 РУШЕНИЯ ПГА В ПРИРОДНЫХ ВОДОЕМАХ........................................................................................................148

5.1. Исследование биоразрушения полигидроксиалканоатов в морской воде в тропических условиях..........................................................................148

5.2. Исследование деградации ПГА в солоноватоводном озере Шира... 162

ГЛАВА 6. КОНСТРУИРОВАНИЕ И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ДОЛГОВРЕМЕННЫХ ФОРМ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ, ДЕПОНИРОВАННЫХ В МАТРИКС ИЗ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ..................................................................170

6.1. Долговременная форма гербицидного средства, депонированного в матрикс из ПГА...............................................................................................170

6.2. Использование ПГА для разработки пролонгированной формы азотных удобрений...........................................................................................177

ГЛАВА 7. КОНСТРУИРОВАНИЕ НОВЫХ ФОРМ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ НА ОСНОВЕ

ИММОБИЛИЗОВАННЫХ СПОР ГРИБОВ TRICHODERMA......................190

7.1. Эффективность биопрепаратов на основе штаммов грибов рода Trichoderma в защите сеянцев хвойных в лесопитомниках........................190

7.2. Оценка эффективности новых форм биопрепаратов на основе штаммов грибов рода Trichoderma, иммобилизованных на носителе

ПГА..................................................................................................................198

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................204

ВЫВОДЫ.............................................................................................................208

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...........................................211

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы обусловлена критическим состоянием природной среды, подверженной антропогенной нагрузке в результате чрезмерного применения продуктов химического синтеза и необходимостью перехода на новые, экологически безопасные технологии производства средств жизнеобеспечения.

В результате активной хозяйственной деятельности и на фоне роста населения планеты во все более широком масштабе увеличивается производство и потребление химических веществ. Объемы выпуска синтетических пластмасс приближаются к 300 млн. тонн в год; их основная часть скапливается на свалках, так как повторной переработке в развитых странах подвергается не более 16-20 % (Kijchavengkul, Auras, 2008; Chanprateep, 2010). Под полигоны и свалки твердых бытовых отходов ежегодно отчуждается до 10 тыс. га земель, в том числе плодородных, изымаемых из сельскохозяйственного оборота. Полиэтиленовый мусор выводит из строя канализационные и дренажные системы городов, загрязняет водоемы. По данным Green Pease, ежегодно в воды Мирового океана попадает до 10% от объемов выпускаемых пластиков (Moore et al., 2001; Tanabe et al., 2004).

Традиционное повсеместное применение продуктов химического

синтеза, получаемых из невозобновляемых природных ресурсов, приводит к

чрезмерному росту количества неутилизируемых отходов, что вступает в противоречие с мероприятиями, направленными на защиту окружающей среды и создает глобальную экологическую проблему. Одним из путей снижения антропогенного давления на экосистемы является замена синтетических полимеров природными, которые подвержены биологической деструкции и разлагаются в естественной среде, вовлекаясь в круговорот (Kijchavengkul, Auras, 2008; Волова, 2004; Asrar, Gruys, 2002; Штильман, 2006).

Развитие науки и техники приводит к все более широкому внедрению в практику целевых продуктов, синтезируемых микроорганизмами. Ценным продуктом биотехнологии являются микробные полигидроксиалканоаты (ПГА), которые обладают спектром полезных свойств, в том числе биосовместимостыо и биоразрушаемостью. ПГА перспективны в качестве материала и изделий биомедицинского назначения, разрушаемой упаковки пищи и напитков, предметов гигиены и санитарии, изделий и препаратов для коммунального и сельского хозяйства (Sudech, Doi, 2000; Stock et al., 2000; Asrar, Gruys, 2002; Volova, 2004; Hazer, Steinbüchel, 2007).

Наблюдаемые сегодня наращивание объемов выпуска и расширение сфер применения ПГА делают необходимым изучение способности окружающей среды к трансформации этого вида биологической продукции. Однако количество работ, в которых были бы всесторонне рассмотрены различные аспекты разрушения ПГА в природной среде, в целом невелико; большинство исследований выполнено в лабораторных условиях без учета всей сложности этого процесса (Mergeret et al., 1993; Jendrossek, 2001, 2002; Bonartseva et al., 2003, Woolnough et al., 2008).

Вместе с тем, разрушаемость ПГА зависит от многих составляющих,

таких как химический состав и структура полимера, микробная

составляющая биоты как главного агента их биодеградации, а таюке условий

среды, которые, в свою очередь, определяются биологическими,

гидротермическими, климатическими и погодными условиями. Результаты

по разрушаемое™ ПГА, полученные в лаборатории, не позволяют прогнозировать поведение и разрушение ПГА в сложных и изменяющихся природных экосистемах. Для этого необходимо комплексное исследование, которое даст ответы на ряд ключевых вопросов: 1) как состав микробиоценоза среды влияет на процесс разрушения ПГА и какие микроорганизмы являются истинными и активными деструкторами ПГА применительно к конкретным внешним условиям; 2) какое воздействие на скорость разрушения оказывают химический состав ПГА, способ изготовления изделий, геометрия и размеры образцов; 3) как изменяются макро- и микроструктура ПГА и их свойства (кристалличность, молекулярная масса, полидисперсность) в процессе разрушения; 4) насколько значимо влияние на этот процесс физико-химических условий среды; 5) каким образом процесс разрушения ПГА будет протекать в регионах, различающихся погодными и климатическими условиями.

Цель работы - комплексное исследование взаимодействия полигидроксиалканоатов с природными микробиоценозами и выявление закономерностей биоразрушения в различных климатических зонах во взаимосвязи с физико-химической структурой полимеров.

Для достижения цели необходимо решить следующие задачи:

- исследовать биоразрушение ПГА в природных экосистемах (почвах и водоемах повышенной солености), расположенных в разных

климатических зонах (Сибирский регион, тропики);

- идентифицировать на основе культуральных, морфо-физиологических и молекулярно-генетических методов доминантные микроорганизмы-деструкторы ПГА, характерные для конкретных природных микроэкосистем;

- изучить динамику биодеградации ПГА в сопоставлении с микробиологическими и физико-химическими характеристиками среды с учетом химического состава и формы полимерных образцов;

- исследовать изменения микроструктуры и физико-химических свойств ПГА в процессе биодеградации для формирования представлений о механизме разрушения этого класса полимеров;

- оценить эффективность ПГА для конструирования экологически безопасных и адресных препаратов сельскохозяйственного назначения.

Работа проводилась в комплексе с сотрудниками лаборатории хемоавтотрофного биосинтеза Института биофизики СО РАН. Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. Т. Г. Воловой за постоянную поддержку и помощь в работе, искреннюю признательность коллегам и сотрудникам лаборатории А. Н. Бояидину, Г. С. Калачевой, Н. О. Жила, А. В. Горевой, Е. Д. Николаевой за предоставленный материал и участие в комплексных экспериментах, изложенных в совместных публикациях. Особая благодарность за помощь при выполнении целого ряда работ по теме диссертации и научные консультации сотрудникам Института химической биологии и фундаментальной медицины СО ?АН М. Л. Филипенко и Е. А. Храпову (молекулярно-генетические исследования), с.н.с. лаборатории кристаллофизики Института физики им. Киренского СО РАН А.Д. Васильеву (исследование физико-химических свойств ПГА), сотрудникам Тропцентра Н. Л. Филичеву, А.Л. Левину, Нгуен Куанг Тан и Ле Тхи Ми Хиеп (исследование биодеградации ПГА в тропиках).

ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Концепция устойчивого развития, являющаяся основополагающей идеей XXI века, предполагает ведение новых форм хозяйствования, которые обеспечат сокращение темпов потребления невозобновляемых ископаемых видов сырья, сохранив их для будущих поколений, более эффективное использование энергоресурсов, переход на новые функциональные и экологически чистые материалы, подлежащие рециклингу, а также освоение принципиально новых средств и технологий для защиты окружающей среды и рационального природопользования.

Охрана окружающей среды является неотъемлемым компонентом устойчивого развития. В результате активной хозяйственной деятельности в настоящее время под угрозой находятся биотические и абиотические компоненты окружающей среды. На фоне роста населения планеты во все более широком масштабе возрастает производство и потребление химических веществ. В связи с этим неуклонно увеличивается количество проблем, связанных с охраной окружающей среды.

Таким образом, традиционное применение синтетических пластиков вступило в противоречие с проблемой защиты окружающей среды. Несмотря на все возрастающие усилия по предотвращению накопления отходов и содействию их рециркуляции, масштабы ущерба, причиняемого окружающей среде в результате чрезмерного потребления, количество образующихся отходов и степень неустойчивого природопользования увеличиваются. Загрязнение окружающей среды во многих регионах достигло критического предела. Это диктует необходимость перехода на новые технологии и средства, не наносящие вреда окружающей среде, то есть «дружественные» природе.

1.1. Негативные последствия накопления в биосфере продуктов химического синтеза

С момента своего зарождения человеческое общество в процессе хозяйственной деятельности нарушало равновесие в природе: уничтожало крупных животных, выжигало леса для охоты, пастбищ, земледелия, а также загрязняло почвы и водоемы в местах поселения и пр. Поэтому перед ним всегда стояла проблема окружающей среды. В результате промышленной, сельскохозяйственной и бытовой деятельности человека возникают различные изменения состояния и свойств окружающей среды, в том числе крайне неблагоприятные. С развитием и интенсификацией промышленной и сельскохозяйственной деятельности в XX веке стали ощущаться пределы естественной продуктивности биосферы, - истощаются природные ресурсы, источники энергии, все более ощущается дефицит пищи, чистой воды и воздуха. Загрязнение окружающей среды во многих регионах достигло критического предела.

Загрязнение планеты отходами, наряду с интенсивным потреблением природных ресурсов, ведет к разрушению механизма саморегулирования биосферы с непредсказуемыми последствиями. Академик Н. Н. Моисеев еще в конце 70-х годов прошлого века писал: «Главной проблемой глобальной экологии является устойчивость биосферы, нарушение ее устойчивости практически означает ликвидацию человечества на планете Земля» (цит. по Любешкина, 2007).

1.1.1. Синтетические пластики - глобальная экологическая проблема

Синтетические полимерные материалы стали неотъемлемой частью

современн

Информация о работе

Прудникова, Светлана Владиславна
доктора биологических наук
Красноярск, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Экологическая роль полигидроксиалканоатов - закономерности биоразрушения в природной среде и взаимодействия с микроорганизмами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Экологическая роль полигидроксиалканоатов - закономерности биоразрушения в природной среде и взаимодействия с микроорганизмами - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы