Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Синтез полиэфиров гидроксипроизводных жирных кислот (полигидроксиалканоатов) и характеристика состава липидов сине-зеленых, светящихся и водородокисляющих прокариот
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации по теме "Синтез полиэфиров гидроксипроизводных жирных кислот (полигидроксиалканоатов) и характеристика состава липидов сине-зеленых, светящихся и водородокисляющих прокариот"
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ Институт биофизики Сибирского отделения Российской академии наук (ИБФ СО РАН)
На правах рукописи
005050578
КАЛАЧЕВА Галина Сергеевна
СИНТЕЗ ПОЛИЭФИРОВ ГИДРОКСИПРОИЗВОДНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ (ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ) И ХАРАКТЕРИСТИКА СОСТАВА ЛИПИДОВ СИНЕ-ЗЕЛЕНЫХ, СВЕТЯЩИХСЯ И ВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ ПРОКАРИОТ
03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук
Красноярск-2012
005050578
Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики Сибирского отделения Российской академии наук (ИБФ СО РАН) и научно-образовательном центре «Енисей» Сибирского Федерального университета
Научный консультант: Волова Татьяна Григорьевна,
доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией ИБФ СО РАН
Официальные оппоненты: Белобров Петр Иванович,
доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник ИБФ СО РАН
Судачкова Нина Евгеньевна
доктор биологических наук, профессор,
ведущий научный сотрудник ИЛ СО РАН
Жукова Наталья Владимировна
доктор биологических наук,
ведущий научный сотрудник ИБМ ДВО РАН
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного Отделения РАН (ТИБОХ ДВО РАН)
« »
7 год", в /О -00 час. на заседанм
Защита состоится
диссертационного совета /Д ¿603.007.01 при Федеральном Государственно! бюджетном учреждении науки Институте биофизики Сибирского отделени Российской академии наук по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д.5С стр.50, конференц-зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федеральног Государственного бюджетного учреждения науки Института биофизик Сибирского отделения Российской академии наук.
Научный доклад разослан «_
2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета д.б.н.
Л.А.Франк
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Многообразие форм живой материи и новые знания в области физики и химии живых систем позволяют конструировать биологические системы различной степени сложности и организации для синтеза широчайшего спектра макромолекул. Ценным продуктом биотехнологии являются резервные соединения липидной природы - полимеры гидроксипроизводных жирных кислот (полигидроксиалканоаты, ПГА), которые обладают широким спектром ценных свойств, включая биосовместимость и биоразрушаемость, и перспективны для различных сфер применения (Anderson, Dawes, 1990; Madison, Huisman, 1999; Steinbüchel, Lütke-Everson, 2003; Chen, 2010; Волова, Шишацкая, 2011).
Микроорганизмы являются источником для получения разнообразных целевых продуктов пищевого, кормового, медицинского и технического назначения. Знание закономерностей влияния физико-химических условий среды на рост и синтез клеточных макромолекул является научной основой для разработки новых биотехнологий. Процессы микробного синтеза делятся на два типа: 1) связанные с ростом клеток и образованием биомассы и происходящие со скоростью размножения клеток; 2) и происходящие или ускоряющиеся при замедлении скорости роста клеток (Перт, 1978; Работнова, 1975, 1984). Оптимизация обоих типов процессов осуществляется различными путями в зависимости от того, насколько совпадают скорости роста конкретного продуцента со скоростью синтеза макромолекул той или иной природы. Процесс микробного роста - это процесс синтеза первичных метаболитов (аминокислот, органических кислот, витаминов, нуклеотидов, промежуточных продуктов катаболизма) и их сборка в основные клеточные макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты). Оптимизация накопления биомассы клеток в культуре и синтеза первичных продуктов обмена сводится к оптимизации условий питания и созданию условий для сбалансированного роста продуцента. Накопление продуктов обмена запасной природы (полифосфатов, полисахаров, липидов) имеет место при несбалансированном росте вследствие исчерпания из среды какого-либо компонента питания для клеток и ограничения роста и синтеза основных (азотсодержащих) клеточных компонентов. Оптимизация процесса синтеза запасных соединений более сложна, так как требует специальных знаний о закономерностях образования этих макромолекул и специфических подходов в каждом конкретном случае. При ограничении роста микроорганизмов субстратными компонентами происходит замедление скорости роста клеток, сопровождающееся значительными изменениями химического состава, главным образом, соотношения основных и запасных макромолекул. Выявление принципиальных закономерностей этих изменений открывает широкие возможности для направленного синтеза клеточных макромолекул и получения целевых продуктов микробиологического процесса.
Изучение фундаментальной основы для разработки эффективных технологий получения целевых продуктов требует комплексных подходов. Ключевые задачи, решение которых необходимо для разработки и реализации эффективных технологий биосинтеза полигидрокисалканоатов, вытекают из следующих особенностей биотехнологии этих ценных макромолекул:
Первое, прокариотические микроорганизмы синтезируют полимеры гидроксипроизводных жирных кислот (ПГА) в специфических условиях несбалансированного роста в качестве эндогенного депо энергии и углерода. Эти условия специфичны: для одних продуцентов таковыми является дефицит азота в среде, для других - дефицит фосфатов, кислорода или иных компонентов субстрата (Lee, 1996; Steinbüchel, Füchstenbusch, 1998; Kessler, Witholt, 2001; Park et al., 2011). Поэтому для эффективного получения ПГА необходим поиск и оценка новых продуцентов и выявление факторов, максимизирующих выходы полимеров.
Второе, ПГА - это семейство полимеров различного состава, физико-химические свойства которых (молекулярная масса, кристалличность, скорости разрушения в биологических средах) значительно варьируют в зависимости от химического строения (Сох 1994; Ashraf et al., 1999; Chia et al., 2010). Выявление микроорганизмов и условий, позволяющих получать полимеры различного химического состава - необходимая часть разработки способов синтеза новых полимеров с заданными свойствами.
Третье, масштабы производства и широкого применения Г1ГА во многом зависят от их стоимости, определяемой, прежде всего, видом и стоимостью используемых субстратов (Нерпег, 1996; Hazenberg, Witholt, 1997; Choi, Lee, 1999). Поэтому изыскание штаммов-продуцентов, способных синтезировать ПГА на доступном сырье, включая отходы производств, - важная задача биотехнологии
этих ценных макромолекул.
Это определило направление исследований настоящей работы, ориентированной на выявление новых штаммов-продуцентов и комплексное исследование закономерностей и условий эффективного синтеза ПГА.
Цель и задачи исследования - поиск новых продуцентов ПГА среди представителей фото- и хемолитоавтотрофных прокариотических микроорганизмов и выявление факторов, усиливающих продукцию полигидроксиалканоатов в качестве научной основы для эффективной технологии биосинтеза.
Для достижения цели сформулированы следующие задачи:
- выбор штаммов, обладающих способностью к синтезу и внутриклеточной аккумуляции ПГА среди сине-зеленых, светящихся, аэробных карбоксидобактерий и водородокисляющих прокариот;
- сравнительное исследование особенностей состава липидов и выходов ПГА у сине-зеленых, светящихся и водородокисляющих прокариот -потенциальных продуцентов ПГА;
- изучение влияния условий культивирования на синтез внутриклеточных компонентов запасной и основной природы и выявление факторов, усиливающих продукцию ПГА у отобранных штаммов-продуцентов;
- исследование закономерностей функционирования клеточного цикла ПГА, протекторной роли и влияния ПГА на физиолого-биохимические характеристики штамма-продуцента;
- определение условий для синтеза полимеров различной химической структуры в качестве научной основы для эффективной продукции ПГА, в том числе на новых субстратах.
Научная новизна. Получены новые данные по составу липидов светящихся, водород- и СО-окисляющих бактерий — потенциальных продуцентов ПГА. Установлен характер ответа культур бактерий на воздействие условий, заключающийся в изменении состава жирных кислот липидов как фактора адаптации к воздействию экстремальных факторов. Неоптимальные значения физических параметров среды (температура, рН), условия газового субстрата (Н2, С02, 02) и присутствие ингибитора роста (СО) не вызывают существенных перестроек конструктивного метаболизма. При лимитировании роста бактерий минеральными макроэлементами (К, 8, Р, К, Мц) происходит перераспределение в составе клеточных макромолекул в сторону усиления синтеза резервных соединений липидной природы — полигидроксиалканоатов (ПГА). Выявлена взаимосвязь между физиологическим состоянием бактерий ЯаЫота еи/гор/ш, внутриклеточным пулом полимера 3-гидроксимасляной кислоты (ПЗГБ) и активностью ключевых ферментов клеточного цикла ПЗГБ. Представлены доказательства обратимости физиологического состояния неделящихся клеток, заполненных гранулами полимера на 90 %. Доказана возможность синтеза природными штаммами прокариот гетсрополимерных ПГА, содержащих в своем составе коротко - и среднецепочечные мономеры.
Практическая_значимость. Комплексное исследование
микробиологических процессов синтеза ПГА обеспечило разработку и реализацию технологии получения ценных полимеров различного состава в условиях опытного производства на различных субстратах, включая уникальный процесс синтеза ПГА на синтез-газе из бурых углей. Полученные экспериментальные ПГА позволили организовать широкие исследования полимеров и изделий из них для различных сфер применения.
Положения, выносимые на защиту:
1. К наиболее перспективным продуцентам ПГА относятся водородокисляющие бактерии и, в меньшей степени, светящиеся бактерии.
2. Адаптивная реакция к воздействию экстремальных факторов проявляется на уровне мембран: стимулируется синтез циклопропановых кислот, варьирует насыщенность липидов. Отклонения физических параметров среды (температура, рН) от оптимальных значений и присутствие ингибитора роста (СО) не вызывают существенных перестроек конструктивного метаболизма. При лимитировании роста бактерий минеральными макроэлементами происходит перераспределение в составе клеточных макромолекул: на фоне снижения концентрации основных (азотсодержащих) компонентов отмечено усиление синтеза резервных макромолекул - соединений липидной природы - полигидроксиалканоатов.
3. Доказана обратимость физиологического состояния неделящихся клеток, практически полностью заполненных гранулами полимера, то есть возможность их перехода к активному физиологическому состоянию в результате деградации и усвоения ПГА.
4. При добавках углеводородных кислот природные штаммы хемолитотрофных водородокисляющих бактерий синтезируют гетерополимерные Г1ГА, содержащих в своем составе мономеры с короткой и средней длиной углеродной цепи.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на YII, X, XI Всесоюзных совещаниях по вопросу круговорота веществ в замкнутой системе на основе жизнедеятельности низших организмов (г. Канев, 1972, 1079, 1981); на XI научно-координационном совещании по теме 1-84 (г. Ташкент, 1974); на Всесоюзном совещании по управлению биосинтезом водородных бактерий и других хемоавтотрофов (г. Красноярск, 1976); на II Всесоюзной конференции по биосинтезу и метаболизму липидов и микроорганизмов (г. Москва, 1979); на 7-ом симпозиуме по подготовке биологических проб для хроматографии (Швеция, Лунд, 1995); на 13 Международном симпозиуме по растительным липидам (Испания, Севилья, 1998); на Международном симпозиуме по биополимерам ISBP02 (Германия, Мюнстер, 2002); на 20М Конгрессе Европейских Микробиологов (FEMS, Испания, Мадрид, 2006); на 4-ом Европейском симпозиуме по биополимерам ESBP07 (Турция, Кусадаси, 2007); на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов с международным участием «Биохим-2008» (Новосибирск, 2008); на V международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды (Ростов-на-Дону, 2009); на 14-м Европейском Конгрессе по биотехнологии (Испания, Барселона, 2009).
Работа выполнена в рамках плановой тематики НИР ИБФ СО РАН (№№ государственной регистрации: 01201000937; 0120.0404601; 01.200703092) и базовой кафедры биотехнологии Сибирского федерального университета в рамках научно-образовательного центра «Енисей» при поддержке Министерства образования РФ и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) (гранты REC 002, RUX0-002-KR-06, BG5202, BG8102); Международного научно-технического центра (МНТЦ-ISTC, проект № 2218); РФФИ (гранты M« 05-04-08024офи-а, 07-03-00112-а, РФФИ-КФН 02-04-97701); Красноярского краевого фонда науки (ККФН) (гранты №№ 9F154C, 13G028, 15G104, 16G104); Программы Интеграционных программ Сибирского отделения РАН (проекты № 96 «Фундаментальные основы биотехнологического получения целевых продуктов и препаратов»); Программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенциала высшей школы» (проекты №№ 2.1.1.528; РНП-11); мега-гранта по Постановлению Правительства РФ № 220 от 9 апреля 2010 г. «Для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в Российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования» (проект «Биотехнология новых биоматериалов», договор 11 G34.31.0013).
Благодарности. Автор выражает благодарность и глубокую признательность всем коллегам, оказавшим помощь и поддержку на разных этапах выполнения данной работы, и в первую очередь, своему научному консультанту д.б.н., профессору Воловой Татьяне Григорьевне, с которой начинали работать еще в далекие 80-годы и без поддержки которой данная работа
вряд ли состоялась; д.б.н. Шишацкой Екатерине Игоревне, к.б.н. Жиле Натальи Олеговне, к.б.н. Бояндину Анатолию Николаевичу. Отдельная благодарность д.б.н. Сущик Надежде Николаевне за ценные советы и замечания в оформлении рукописи. Я благодарна ведущим специалистам в области исследования липидов за счастливую возможность учиться у них высокому уровню научного ремесла чл.-корр. РАН Васьковскому Виктору Евгеньевичу; д.б.н., профессору Костецкому Эдуарду Яковлевичу; к.б.н. Латышеву Николаю Алексеевичу.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 70 работ, включая 60 статей в центральных РФ и зарубежных журналах, из них 60 статей в журналах, входящих в список ВАК.
Вклад автора: Планирование и проведение экспериментов, проведение всех химических анализов, обработка и анализ полученных результатов, подготовка публикаций.
Структура работы. Научный доклад изложен на 71 странице машинописного текста и содержит 30 таблиц и 16 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования
Для выявления потенциальных продуцентов ПГА исследован широкий спектр прокариотиых микроорганизмов с различным типом питания -хемоавтотрофы, фотоавтотрофы и гетеротрофы из коллекций: ИБФ СО РАН CCIBSO 836; Сибирского федерального университета, зарегистрированной во Всемирном центре баз данных микроорганизмов (WDCM) под № 936; литотрофных культур Института микробиологии АН СССР.
Для непрерывного автотрофного культивирования бактерий применяли аппараты, работающие в режимах хемостата или турбидостата, сконструированные в ИБФ СО РАН (Пономарев и др., 1969; 1974); периодический процесс осуществляли в строго стерильных условиях с использованием модульного настольного автоматизированного
ферментационного комплекса Bio-Flo 110 («New Brunswick Sei, Inc.», США) и качалки.
Химический состав клеток определяли общепринятыми методами (Ермаков и др., 1972).
Липиды из сырой биомассы выделяли по методу Фолча смесью хлороформа и метанола (2:1 по объему). В полученном экстракте ПГА отделяли от липидов осаждением двойным объемом гексана. Экстракт липидов высушивали на роторном испарителе и в дальнейшем подвергали метанолизу для получения метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК). Для получения жирных кислот, входящих в ЛПС клеточной стенки, обезжиренную биомассу омыляли 1 N раствором КОН в 95% этаноле при нагревании на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа. Затем добавляли двойной объем воды, подкисляли, экстрагировали жирные кислоты гексаном и синтезировали МЭЖК. Метанолиз жирных кислот проводили в смеси метанола и серной кислоты (50:1 по объему) при температуре 90°С в течение двух часов. МЭЖК анализировали на хромато-масс-спектрометре GCD Plus ("Hewlett Packard", США) или 6890/5975С ("Agilent Technologies", США) (Kalacheva et al., 2002). Идентификацию жирных
кислот проводили сравнением их времен удерживания и масс-спектров с таковыми имеющихся стандартов; использовали насыщенные, моноеновые, диеновые, триеновые, тетраеновые кислоты. Положение двойных связей моноеновых кислот определяли после получения диметилдисульфидных (ДМДС) производных соответствующих МЭЖК (Christie, 1989). Наличие в цепи ЖК пропанового кольца идентифицировали после бромирования гидрированных образцов (Кейтс, 1975; Christie, 1989). Идентификацию длинноцепочечных ß-гидроксикислот подтверждали также анализом соответствующих триметисилильных (ТМС) производных (Kalacheva et al., 2002).
Качественный и количественный анализ классов липидов определяли с помощью микротонкослойной хроматографии (ТСХ) (Svetashev, Vaskovsky, 1972): идентификацию классов липидов - с помощью стандартов и химическими методами (Кейтс, 1075). Количественный анализ отдельных липидных фракций проводили бихроматным методом (Amenta, 1964). Количество фосфолипидов определяли по фосфору (Gerlach, Deuticke, 1963).
Для определения общего содержания ПГА в биомассе и состава мономеров проводили экстракцию биомассы хлороформ-метанолыюй смесью (2:1, по объем)') с последующим отделением полимера от липидов осаждением гексаном. Далее проводили метанолиз ПГА и анализировали полученные метиловые эфиры мономеров на хромато-масс-спектрометре 6890/5975С ("Agilent Technologies", США). Идентификацию мономеров проводили по их временам удерживания и масс-спектрам.
Энзимологические исследования выполнены на грубых бесклеточных экстрактах. Определяли активность ключевых ферментов клеточного цикла ПГА: /?-кетотиолазы (/МСТ), ацетоацетил-КоА-редуктазы (АА-КоА-редуктазы) и ПГА-сиитазы, ГБ-дегидрогеназы (Oeding, Schlegel, 1973). Активность гранулосвязанной ПГА-деполимеразы определяли в выделенных из клеток нативных гранулах полимера.
Статистическая обработка результатов проведена общепринятыми методами с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel. Проведены кластерный и корреляционный анализы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Полигидроксиалканоаты - это резервные внутриклеточные макромолекулы, синтезируемые прокариотами сложным многоступенчатым путем, каждую стадию которого катализируют специфические ферменты, ключевыми при этом являются: /7-кетотиолаза (/5-KT), ацетоацетил-КоА-редуктаза (АА-КоА-редуктаза) и ПГА-синтаза. Список микроорганизмов, способных синтезировать ПГА с различной эффективностью, насчитывает свыше 300 организмов, среди которых -аэробные и анаэробные бактерии, гетеротрофы, хемооргано- и хемотрофы, фототрофные прокариоты, олиготрофные полипростековые бактерии, архебактерии, анаэробные фототрофные бактерии и другие. Однако для использования рассматривается очень небольшое число микроорганизмов, которые отвечают требованиям, предъявляемым к промышленным продуцентам.
В качестве критериев для выбора потенциального продуцента ПГА принято рассматривать следующие показатели: химический состав и выход полимера, тип углеродного субстрата и затраты на его получение, продуктивность процесса. Поиск эффективных продуцентов ПГА и технологий биосинтеза - актуальная задача биотехнологии.
1. Скрининг штаммов светящихся бактерий, цианобактерий и водородокисляющих прокариот на предмет способности к синтезу и внутриклеточному накоплению ПГА
В настоящей работе в качестве потенциальных продуцентов ПГА исследованы следующие группы микроорганизмов:
-светящиеся бактерии, не изученная в отношении синтеза ПГА группа микроорганизмов с энергообменом, продуктом которого является светоизлучение;
-цианобактерии, группа характеризующаяся способностью к синтезу клеточных макромолекул, включая ПГА, за счет оксигенного фотосинтеза, без затрат органических субстратов;
-хемолитотрофные водородокисляющие бактерии, характеризующиеся способностью синтезировать различные по строению ПГА с высокими выходами, а также широким органотрофным потенциалом;
-аэробные карбоксидобактерии, малоизученная группа СО-резистентных хемолитотрофов, открывающая возможность использования в качестве субстрата техногенных источников водорода.
1.1. Светящиеся бактерии в качестве продуцента ПГА
До настоящих исследований светящиеся бактерии ни в одном из имеющихся фундаментальных обзоров, посвященных разнообразию продуцентов ПГА, не рассматривались в качестве потенциального продуцента этих макромолекул.
Скрининг продуцентов ПГА среди этой группы выполнен на основе коллекции светящихся бактерий CCIBSO 836 ИБФ СО РАН. Способность к синтезу ПГА оценена у 20 штаммов, включая 9 штаммов Photobacterium leiognathi, 8 - Vibrio harveyi, 2 - Photobacterium phosphoreum, и 1 - Vibrio fischeri (таблица 1.1). Способность к синтезу ПГА на твёрдых средах отмечена для всех исследованных штаммов (таблица 1.2.), однако выходы полимера значительно различались и составляли от 0.4 до 18.1% (к весу сухого вещества).
Самые высокие выходы полимера зафиксированы у Ph. leiognathi 208. Анализ хроматограмм показал, что полимер, синтезированный большинством штаммов на плотной среде, был гомогенным и состоял из мономера fi-гидроксимасляной кислоты (3ГБ). Наличие в ПГА включения ¡3-гидроксивалериановой (ЗГВ) кислоты отмечено только для двух штаммов (Ph. leiognathi 683, V. harveyi 72).
Таблица 1.1. Исследованные штаммы светящихся бактерий
Вид Штамм Источник выделения Место выделения
Photobacterium leiognathi 208 Морская вода Тихий океан
307 Морская вода Тихий океан
543 Желудок рыбы Sumbolophorus Индийский океан
683 Желудок рыбы Diaphus lucidus Индийский океан
1504 Морская вода Индийский океан
1612 Морская вода Индийский океан
1680 Морская вода Индийский океан
1759 Кишечник каракатицы Sepia Индийский океан
2117 Морская вода Индийский океан
Photobacterium phosphoreum 1856 Световой орган рыбы Onisthonroctus soleatus Индийский океан
1883 Световой орган рыбы Opisthoproctus soleatus Индийский океан
Vibrio fischeri 1231 Кишечник бычка (Gobius) Индийский океан
Vibrio harveyi 72 Морская вода Тихий океан
162 Морская вода Тихий океан
328 Морская вода Южно-Китайское море
767 Поверхность моллюска Conus ebraeus Аравийское море
974 Желудок голотурии Индийский океан
1024 Кишечник моллюска (Gastropoda) Индийский океан
1175 Кишечник моллюска Nerita Южно-Китайское море
2303 Морская вода Индийский океан
Таблица 1.2. Продукция ПГА на плотных средах светящимися бактериями (3ГБ -__/?-гидроксибутират, ЗГВ - yg-гидроксивалерат)._
Вид Штамм Содержание ПГА, % cvxoro вещества Состав ПГА, мол. %
Photobacterium leiognathi 208 18.1 3ГБ-100%
307 5.0 3ГБ-100%
683 10.4 3ГБ - 99.13%; ЗГВ - 0.87%
1504 0.4 3ГБ-100%
1612 0.4 3ГБ-100%
1680 1.7 3ГБ-100%
1759 0.7 3ГБ-100%
2117 1.2 п/д
Photobacterium phosphoreum 1856 4.0 3ГБ-100%
1883 7.4 3ГБ -100%
Vibrio fischeri 1231 0.5 н/д
Vibrio harveyi 72 4.8 3ГБ - 99.25%; ЗГВ - 0.75%
162 0.5 н/д
328 0.5 3ГБ-100%
767 0.6 н/д
974 0.7 н/д
1024 0.8 п/д
1175 1.1 н/д
2303 0.9 3ГБ - 100%
Примечание: н/д - не определено
Таким образом, впервые проанализированы светящиеся бактерии в качестве потенциальных продуцентов ПГА, и выделены наиболее продуктивные штаммы для последующих исследований.
1.2. Исследование цианобактерии в качестве продуцентов ПГА
Цианобактерии играют значительную роль в трофических сетях водоемов и являются перспективным объектом для биотехнологии в связи со способностью синтезировать органические вещества различной химической природы, включая ПГА (Stal, 1992; Hein et al., 1998; Asada et al., 1999; Taroncher-OIdenberg, 2000; Xiao, Jiao, 2011).
Изучены альгологически чистые штаммы цианобактерий Synechococcus elongatus Näg., Coccopedia sp., выделенные из гидротерм острова Кунашир (Терешкова и др., 1973), Spiridina platensis (Nordst.) Geitl., полученная из ВНИИ биотехника, и 16 штаммов из коллекции культур цианобактерий Сибирского федерального университета, зарегистрированной во Всемирном центре баз данных микроорганизмов (WDCM) иод № 936 (Кожевников и др., 2009), систематическая принадлежность которых проведена на основании морфо-биохимических характеристик и идентификации состава ЖК липидов (Быстрых, 2011) (таблица 1.3).
Таблица 1.3. Исследованные штаммы цианобактерий
Штамм* Таксон Способность к азотфиксации Географическое происхождение
Подсекция I Chroococcales
ACCS002 Flolopedia irregularis - Красноярское водохранилище, 2007
ACCS019 Chroococcus limneticus - Река Карабула (приток р. Апгара), 2008
ACCS056 Synechocystis sp. - Река Аладыша (приток р. Ангара), 2008
Подсекция III Oscillaíoriales
ACCS007 Leptolyngbya sp. - н. и.
ACCSOIO Pseudanabaena sp. - Красноярское водохранилище, 2007
ACCS033 Phormidium subfuscum - Река Ильбинчик (приток р. Кап), 2008
Подсекция IV Nostocales
ACCS014 Nostoc linckia + Река Усолка (приток р. Кан), 2008
ACCS022 Trichormus variabilis + Река Лижа (приток р. Кан), 2008
ACCS029 Trichonmts variabilis + Река Карабула (приток р. Ангара), 2008
ACCS039 Trichormus variabilis + Озеро Большое Буровое (Ванкор), 2008
CCS0S9 Anabaena aequalis + н. и
ACCS045 Wollea saccata + Река Енисей (вблизи г. Игарка), 2008
ACCS051 Cylindrospermum stagnate + Река Енисей (вблизи г. Игарка), 2008
ACCS053 Nostoc spongiaejorme + Река Большая Хета, 2008
ACCS060 Trichormus variabilis + Река Большая Хета, 2008
ACCS077 Nostoc paludosum + Река Базаиха (приток р. Енисей), 2008
• АССЭ - акроним Коллекции культур цианобактерий Сибирского федерального университета, зарегистрированной во Всемирном центре баз данных микроорганизмов (\VDCM) под № 936. Обозначения: н.и. - не известно.
Восемь из исследованных четырнадцати штаммов показали наличие в клетках ПГА (таблица 1.4).
Таблица 1.4. Содержание ПГА в цианобактериях (% от веса сухой биомассы) при _____________росте на полной среде________
I ЛСС5 ! АССБ АССБ ( АССБ 1 АССБ | АССБ ЛСС5 ; АССБ I 014 ] €02 | 010 I 019 I 033 056 | 022 ! 029
АССЯ 1 АССБ ( АССЭ АС СБ 039 045 051 1 053
¡ао8 | н.о. Г ооб ] (170 ■" но. ! 0.21 ; о.о?
АССБ АССБ 060 077
0.21 0.13
Обозначение: Н о. - не обнаружено
Однако внутриклеточное содержание полимера было низким и варьировало от 0.05 до 0.7 % от сухого вещества клеток. Самое низкое содержание ПГА получено у Мм/ос зроп&ае/огте (АСС8053), а самое высокое - у СИгоососсш ИтпеНсиэ (АСС8019). В термофильных штаммах 5. е1ощШт Ыац., СоссоресНа Бр.и спирулине в условиях оптимального роста ПГА не обнаружено.
1.3. Водородокисляющие бактерии в качестве продуцента ПГА
Исследованы штаммы из коллекции литотрофных культур Института микробиологии АН СССР, любезно предоставленные академиком РАН Заварзиным Г.А.: карбоксидобактерии БеНЬепа сагЪохуйокуйго^епа 21062 (Санжиева, Заварзин, 1971), водородные бактерии АкаИ^епе.ч еии-орИт Ъ\ (исходный штамм) (Савельева, Жилина, 1962), и отселектированный в ИБФ СО РАН вариант исходного штамма ЯаЫота еШгорИа В5786. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных продуцентов (ВКПМ).
Отселектированные по скорости роста быстрорастущие водородные бактерии и карбоксидобактерии при оптимальных условиях ферментации синтезировали биомассу с высокой концентрацией белка и минимальным содержанием ПГА. Однако специфика анаболизма Н2-окисляющих бактерий заключается в переходе в середине линейной фазы роста с белкового синтеза на синтез ПГА (таблица 1.5).
Таблица 1.5 Содержание ПГА в хемолитотрофных бактериях (% от сухой _биомассы)_
Штамм Полная среда
А1саИ%епея еШгорИия Ъ\ 40-50
БеИЪепа сагЪоху(1окуйго%епа7Лй(>1 20
КаШопш еШгорИа В5786 30-40
Выполненный анализ выявил штаммы, обладающие способностью к синтезу ПГА, у всех исследованных групп прокариот в неспецифических условиях роста, ориентированных на продукцию этих резервных макромолекул.
Самые низкие выходы ПГА характерны для цианобактерий, относительно высокие - у светящихся бактерий и самые высокие - у водородных бактерий. Для дальнейших исследований отобраны наиболее перспективные штаммы: Н2-окисляющие бактерии и некоторые представители светящихся бактерий.
2. Характеристика состава липидов водородокнсляющих, светящихся бактерий н цианобактерий
ИГА входят в состав внутриклеточных липидов и ассоциируются в клетках в виде гранул. Условия, обеспечивающие направленность конструктивного обмена клеток в сторону синтеза и аккумуляции ПГА, определяются окислительно-восстановительным состоянием цитоплазмы, внутриклеточной концентрацией ацетил-КоА и свободного КоА (Oeding, Schlegel, 1973; Senior, Dawes, 1973). При несбалансированном росте, например, при отсутствии одного из конструктивных элементов в среде (азота, кислорода и др.), ацетил-КоА не включается в цикл трикарбоновых кислот, а уровень свободного КоА при этом низок. Это является благоприятным условием для активизации ферментов синтеза ПГА.
Для ряда бактерий синтез ПГА тесно связан с метаболизмом липидов и жирных кислот, при чем источником мономеров полимера являются промежуточные метаболиты синтеза или бета-окисления жирных кислот (Kessleer, Witholt, 2001; Zinn, 2010). Поэтому при выборе перспективного продуцента ПГА, необходимо, прежде всего, изучить особенности состава липидов исследуемых бактерий.
2.1. Состав липидов и жирных кислот водородокнсляющих бактерий и карбоксидобактерий
Общее содержание липидов в бактериях, выращенных автотрофно в условиях интенсивного роста, колебалось от 6 до 9-10 % на сухое вещество. В автотрофных условиях на полной питательной среде бактерии синтезировали следовые количества запасного углеродного компонента - ПГА. Липидная фракция исследованных автотрофов была представлена в основном полярными липидами (ПЛ), среди которых превалировали фосфолипиды (ФЛ) (таблица 2.1, рис. 2.1).
Среди нейтральных липидов всех исследованных бактерий были выявлены диацилглицерины (ДАГ), свободные жирные кислоты (СЖК), в следовых количествах найдены коэнзим Q8, идентификация которого была подтверждена масс-спектрометрией, и в некоторых представителях карбоксидобактерий -метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК). Неидентифицироваиные соединения составляли до 20 % от липидов.
Таблица 2.1 Состав липидов водородокисляющих бактерий и карбоксидобактерий (% от суммы липидов)
Бактерии ПЛ ДАГ СЖК 0* МЭЖК X
г\ 75.9±6.1 1.3±0.2 3.6±0.6 Сл.* И.о.** 19.2±0.9
Ъ1062 68.7±1.0 3.0±0.3 6.2±0.8 Сл. 2.9±0.3 19.2±0.2
*Сл. - следы; **Н.о. - не обнаружено.
Рис. 2.1. ТСХ экстрагируемых липидов Alca!igenгs еШгоркш 7,1. Система растворителей: гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (85:15:1 по объему). С - стандарт, Б - бактериальные липиды. 1 -ПЛ; 2 - ДАТ; 3 - стерины; 4 - СЖК; 5 -триацилглицерины (ТАГ); 6 - МЭЖК; 8. 10 неидентифицированные фракции; 9 - эфиры стеринов
Рис. 2.2. ТСХ полярных лшшдов водородных бактерий. I направление: хлороформ-метанол-вода (65:25:4 по объему); II направление - хлороформ-метанол-аммиак (14:6:1 по объему). 1 -фосфатидилсерин; 2 ~ фосфатидилхолин; 3 -фосфатидилэтанол-амин; 4 -
фосфатидилглидерин; 5 -
диацштфосфатидилглицерин, 6 — лшо-фосфагилсерин; 7 - лизофосфатилэтанол-амин; 9 - фосфатидная кислота; 8, 10. 11, 12 - непдентифицированы
В липидном экстракте А. егйгорИш Ъ\ определены фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилглидерин (ФГ) и диацилфосфатидилглицерин или кардиолипин (ДФГ), являющиеся основными липидными фракциями, формирующие бактериальную мембрану (рис. 2.2, таблица 2.2). Эти ФЛ являются структурными компонентами цитоплазматических мембран многих грам-отрицательных бактерий, и в частности - главными ФЛ Я ешгорка Н-16 - организма, интенсивно изучаемого за рубежом.
Таблица 2.2 Содержание фосфолипидов в водородокисляющих бактериях _(% от суммы ФЛ)_________
Объект ФЭ ФГ ДФГ ФХ ФС Неид.
г\ 66.5±0.5 21.6±0.4 9.6±0.4 3.0±0.2 Сл. Но.
г Ю62 39.6±0.4 Ю.2±0.8 7.2±0.6 17.2±0.4 5.6±0.6 20.0±0.9
Фосфатидилсерин (ФС) найден в следовых количествах. ФС, основной фосфолипид дрожжей и других эукариот, функционирует в бактериальных клетках, как интермедиат в синтезе ФЭ и редко определяется в детектируемых количествах. Необычным для липидов А. еМгорИт являлось присутствие
Б С
V , Р» О л10
I 12 11 4
I а | •
г • • .
1 ^ ? •■ С 1 1
- 1 1
- О 9 и - 6
А. еиР-орИиз 5. сагЬохуск)ку<^о§егш
фосфатидилхолина (ФХ). До недавнего времени считалось, что бактерии практически не синтезируют ФХ, доминирующий фосфолипид эукариог. Этот липид был найден только в нескольких бактериях с развитой внутримембранной структурой или бактериях, живущих в эукариотном организме (/\ktas « а1., 2010). Однако к настоящему времени, когда проведен полный геномный сиквенс более 100 бактерий, показано, что гены, отвечающие за синтез ФХ, встречаются во многих бактериях и их распределение не связано со спецификой микроорганизмов. В геноме II ешгорка Н-16 выявлены все последовательности генов ферментов синтеза ФЭ, ФГ и ДФГ, но гены, отвечающие за синтез ФХ, отсутствуют или пока не определены (РоЫтапп сЧ а1., 2007). Однако в ранних работах ТЫе1е и (Д)1е\еу (1981) было показано, что водородокислятошие бактерии могут синтезировать ФХ.
Состав полярных липидов карбоксидобактерий существенно отличался от А. еМгорИш. Эти отличия определялись, во-первых, тем, что в штаммах Ъ1062 более 20 % ПЛ не идентифицированы (рис. 2.2, таблица 2.2). Качественная идентификация этих соединений показала, что в составе их молекул присутствуют фосфор и углеводные остатки. Следовательно, эти фракции могут быть отнесены к фосфогликолипидам, одному из классов липидов, часто определяемых в бактериальных клетках. Во-вторых, основными лнпидами этих микроорганизмов являлись ФЭ и ФХ (таблица 2.2). ФГ и ДФГ были обнаружены в небольших количествах.
Важной характеристикой состава липидов являются жирные кислоты. Жирные кислоты исследованных микроорганизмов определены в основном в составе сложных липидов - ПЛ и липополисахаридов (ЛПС). Доля свободных жирных кислот была небольшой (3-6 % от липидов) (таблица 2.1).
Для идентификации структуры жирных кислот было использовано несколько подходов, которые показаны на примере К. еШгорИа. Наличие в углеродной цепи двойных связей подтверждалось сравнением хроматограмм метиловых эфиров жирных кислот до и после гидрирования (рис.2.3).
После бромирования гидрированных МЭЖК пики на хроматограмме, соответствующие кислотам с циклопропановым кольцом, исчезали (рис. 2.4).
Рис. 2.3. Хроматограмма МЭЖК А еШгорка до и после гидрирования
JWWAA гго* че 5р«миро* юте
10СРС0С
.irtviwi it Л If
-чу|<.|М> гпдрстр^ЕЯЫ2Ы »-17.«
оССЮССО
Рис.2.4. Хроматограмма МЭЖК Я euiropha до и после бромирования
ГИ ППИППИПНШЛЧ: nnnmRftnHKTX
Идентификация жирных кислот в дальнейшем была подтверждена масс-спектрометрией. Основные масс-спектральные характеристики моноеновых ЖК и гидроксикислот липидов водородных бактерий, приведены в таблице 2.3.
Для идентификации положения двойных связей в моноеновых кислотах и определения длины цепи длинноцепочечных ^-гидроксикислот были получены диметилдисульфидные (ДМДС) или триметилсилильные (ТМС) производные соответствующих фракций ЖК. На рис. 2.5 приведены масс-спектры ДМДС метиловых эфиров основных моноеновых кислот - пальмитолеиновой (16:1ш7) и цис-вакценовой (18:1со7).
На основании этих данных осуществлена идентификация жирных кислот в липидах водородных и карбоксидобактерий. В спектре ЖК экстрагируемых и прочносвязанных липидов (ПСЛ) идентифицированы в основном четные жирные кислоты с длиной цепи от 12 до 18 атомов углерода. Основной насыщенной кислотой ЭЛ являлась пальмитиновая (16:0), составляющая 37- 42 % от суммы жирных кислот (таблица 2.4). Доля миристиновой кислоты (14:0) колебалась в небольших пределах от 0.7 до 2 %, а стеариновой - от 0.4 до 1.8 %. Остальные насыщенные кислоты (12:0, 15:0, 17:0) отнесены к минорным компонентам, доля которых не превышала 0.1 %. Отмечено присутствие в спектре разветвленных жирных кислот с изо- и антеизо- положением метальных групп, но содержание этих кислот было следовым. Доминирующими моноеновыми кислотами были 16:1со7 и 18:1<»7, доли которых в общей сумме ЖК составляли 28 и 22 %, соответственно. На основании масс-спектров исходных образцов МЭЖК получены их молекулярные массы 268 и 296, соответственно. Кроме того, обнаружены и их изомеры, доля которых в общем ЖК спектре составляла для 16:1 и 18:1 около 1.5%. Остальные моноеновые кислоты (14:1, 15:1, 17:1) отнесены к минорным компонентам и их относительное содержание колебалось от следов до 1.5 %. Результаты масс-спектрометрии подтвердили наличие в ЖК составе ПСЛ длинноцепочечных ^-гидроксикислот. Для метиловых эфиров подобных кислот диагностическим фрагментом был m/z = 103 (таблица 2.3). Однако молекулярная масса этих кислот не определялась, поэтому длина цепи была установлена на основании сравнения времен удерживания /?-ОН кислот исследуемого образца со стандартами /?-ОН-14:0, /?-ОН-12:0, /?-ОН-16:0 («Sigma», США) и хроматографированием ТМС-производных жирных кислот. Масс-спектры ТМС-гидроксикислот практически совпали с литературными данными (Christie, 1989), а их основные характеристики приведены в таблице 2.3. Доминирующей гидроксикислотой в ПСЛ водородных бактерий определена /?-
С)Н-14:0, более 46 % от суммы ЖК. В ПСЛ карбоксидобактерий доминировала более короткая /ЮН-12:0 Доля /?-ОН-16:0,/?-ОН-18:0 не превышала 1.3%.
Среди гидроксикислот водородных бактерий обнаружены кислоты с другим положением гидроксилыгой группы - 2-ОН-14:0, с молекулярной массой 258, доля которой составляла от 5 до 14 %, и минорная 2-ОН-16:0, относительное содержание которой не превышало 0.4 %.
Таблица 2.3 Основные масс-спектральные характеристики метиловых офиров _жирных кислот липидов 1Ы.ч1ота еШгор/ш В5786__
Жирная кислота мэжк ДМДС и ТМС производные M0H0eH0Ri.ix и Й-ОН-МЭЖК
Молекул, ион Базовый ион Молекул, ион m/z диагност, фрагментов
14:1т5 240 334 217, 117
15:1мб 254 348 217, 131
16:1о)7 268 362 217, 145
16:1ш5 268 362 245, 117
17:1 оэ9 282 376 203, 173
17:1 соб 282 376 245, 131
17:1ю8 282 376 217, 159
Р- ОН-12:0 103 302 73,89, 175,287
2-ОН-14:0 258 330 73, 89, 103,271,315
18:1о)7 296 390 245, 145
18:1со9 296 390 217. 173
2-ОН-16:0 286 358 73. 89, 103. 299, 343
/?-ОН-14:0 103 Г ззо 73, 89. 175, 315
/ЮП-16:0 103 358 73, 89. 175, 343
/?-ОН-18:0 103 386 73, 89, 175,371
Им.г», ц—т.
Рис.2.5. МС ДМДС производных метиловых эфиров пальшгголеиновой (а) и цис-вакценовой (б) кислот
Состав жирных кислот липидов цитоплазматической мембраны (легко экстрагируемые липиды) и клеточной стенки (ПСЛ) существенно различались. Экстрагируемые липиды ацилированы в основном 16:0, моноеновыми и циклопропановыми кислотами. На их долю приходится более 95 %. Раннее установлено, что у грам-отрицательных бактерий ПСЛ представлены компонентами липополисахаридов клеточной стенки, а спектр жирных кислот, ацилирующих липид А, отличается от внутриклеточного состава жирных кислот (Rick, 1987). Действительно, состав жирных кислот ПСЛ водородных бактерий характеризуется высоким содержанием длинноцепочечных гидроксикислот, доля которых превышала 50 %, и повышенным содержанием 14:0 (более 20 % от суммы ЖК ПСЛ). Циклопропановые кислоты в ЛПС не обнаружены.
При сравнении исходного штамма Z1 и его варианта В5786 не обнаружено отличий в качественном составе жирных кислот легко экстрагируемых липидов. Изменилось несколько соотношение основных кислот - в штамме В5786 увеличилась доля 16:0 (около 40 % по сравнению с Z1 - 31 %) и снизилась доля моноеновых кислот (16:1ш7 - 28 и 32 %, 18:1ш7 - 22 и 28.5 %, соответственно у штаммов В5786 и Z1). Данные, полученные для штамма В5786, согласуются с результатами, представленными в работе (Galbraith et al., 1999). Для состава жирных кислот ПСЛ двух штаммов Ralstonia, NCIMB 40529 и NCIMB 11842, характерно высокое содержание 14:0 (15-18 %), 2-ОН-14:0 (14-16 %) и/МЭН-14:0 (59 %). Однако наличие других гидроксикислот авторы не выявили. Это может быть связано со штаммовыми отличиями, или с тем, что авторы исследовали состав -жирных кислот в чистых ЛПС, выделенных фенолом.
Таким образом, в настоящей работе достоверно идентифицированы все жирные кислоты хемолитотрофных Н2- и СО-окисляющих бактерий и показано их распределение по основным липидным фракциям. Эти знания должны позволить оценить источник загрязнения ПГА и, соответственно, выбрать стратегию очистки полимера.
2.2. Состав липидов и жирных кислот светящихся бактерий
Состав липидов изучен у двух штаммов светящихся бактерий рода Photobacteria leiognathi при периодическом культивировании на средах с глицерином (штаммы отличались по характеру свечения). В процессе роста содержание липидов у этих бактерий увеличивалось с 5 до 7.5 % от сухого веса. По мере старения культуры отмечено увеличение в биомассе и ПГА - с 3.2 до 12.0 % - у светящегося штамма и с 1.3 % до 7.8 % - у темнового варианта (таблица 2.6).
В липидах Ph. leiognathi фракция фосфолипидов - основная (таблица 2.7). Нейтральные липиды представлены только СЖК, ДАГ. Доля неидентифипированных компонентов не превышала 6 %. Доминирующим фосфолипидом являлся ФЭ, содержание которого составило 63 - 65 % от ФЛ.
Таблица 2.4. Состав жирных кислот липидов микроорганизмов (% от суммы ЖК)
Хсмолнтотрофы Гстсротрофы (светящиеся бактерии) Фотопвтотро )ы (цианобаюерии)
Жирная КИСЛОТ II Ъ\ В57К6 гю62 133 131 136 142 150 151 54 44 чскеп АССЙ 033 АСС5 022 АССЭ 029 АССБ 039 АССБ 060 АСС5 045 АССБ 051 5. ¿Ьн^ппн Соссо-рЫ1а 5. р1а-
тт 11 0.1 1.8 0.5 05 09 08 0.5 09 1.4 06 1.4 0.2 0.9 0,2 0.2 02 0.1 25 26 0,2 Но.
140* 2.1 1.9 0 8 3.6 4.8 1.8 1.7 1.7 3.9 2.2 2.8 1.8 5.5 0.5 1.7 1.1 1.0 2 1 08 18 0 8 0 3
14:1 0.5 0.1 0.7 20 25 08 0.7 0.7 14 0.9 0 7 0.9 Н.о Но 0.5 Но Но. Но Но. Но Н.о. Но
ли-15 0 Сл. 0.1 Но Н о Но. Н.о Но Но Н о Но. Но. Но. 0.3 Но. Н.о Но 02 0.1 Но, Но Но. Н.о.
и-150 Сл. 02 Н.о. Но. Н.о. Но Н.о. Но Н.о. Н.о. Но. Но, 05 Но. 0.1 0.2 0 1 0 2 0 1 Но. Но. Но.
15:0 0.7 0 1 1.3 05 1.2 1.0 1.9 1 8 2 9 4 0 6,0 1.0 29 0.1 0 6 05 04 1.0 0.3 Но. Но. Но
15:1 Сл. Сл. 0.1 0.6 1.1 0.7 0,7 0.5 1.5 0.2 1.1 07 Но. Но. 0.1 Но 0.0 0 1 Но. Но. Но. Но.
и-16:0 Сл, 0.2 И.о. Н.О. Но Н.о. Н.о Но 11.0. Но Н.о. Но Но. Н.о Н.о. 0.1 Но Но. Но 0.7 0 4 Но
16:0 31 1 42.1 268 9 8 8.9 9.2 13 9 14.0 142 154 21.5 16 3 45.6 27,8 41,7 365 39.3 37,8 46 9 51.4 39.6 56.8
16 1ш7 32 1 27 8 23 7 64.9 66.7 69.2 63.8 61.7 60,4 54.1 40,6 58.3 17 2,5 2 8 2 7 16,5 2 6 2.2 10.5 0.2 2.7
16:1 м5 1.0 05 0,4 5.6 2 6 0.5 3.6 2 2 Но Но, Но.
аи-17:0 Н.о, Но. Но Н о Но Но Но. Н о Но Но Но Но Но. Н.о. 0.1 Сл 0 1 Н.о. Но. Но. Н.о. Н.о.
16 2о>4 Но. Но. Н.о. Но. Но Н.о Но. Н.о Но Но. Но Но Н.о. 7.9 2.4 2.8 Но 3.0 1.5 Н.о Н.о Но.
и-170 Но. Н.о Н.о. Но Но Но. Н.о. Но Н.о Н.о. Но, Но 0.5 Н.о. 0 1 0 1 0,1 0 1 0.1 Но. Н.о, Но.
16:2 Но. Н.о. Н.о. Но. Но Но. Н.о. Но Но, Н.о. Но. Н.о. Но. Н.о. 0 1 0.1 0,1 0 1 Сл. Но, Н.о. Но.
17:0 0.3 0.1 0.6 0 1 0.1 0 2 0.5 04 15 10 1.4 0.7 2 1 0.3 05 0.6 05 0 8 0.8 0 7 06 Но.
17:1 Сл. 1.5 Сл. Но. Но Но. Н.о. Но Н.о. Н.о Но. Но. Но Но Но 0.3 0,1 Но Н.о. Но. Но. Н.о
С-С|7 0" 2.8 0.9 13.8 10,4 7.8 3.2 13 3.4 1.9 12.5 11.2 1.7 Н.о, Но. Но Н.о. Но. Но Но. Но. Но Н.о.
16:ЗшЗ Но Н.о. Но Но Но Н.о Но Но Но Но Н.о Но Н.о. 9.2 2.4 4.2 И.о. 4.9 2.4 Но. Но. Но
17:2 Но Но. Но. Но. Но. Н.о. Н.о. Н.о Но Но. Н.о Н.о Н.о. 0.1 Н.о. 0 1 Но. Но. Н.о. Н.о, Но Но.
18.0 0.8 12 2 6 0.2 Сл. 0 1 0 1 0,2 1.8 02 03 1.4 18 9 2.3 3.6 2 8 40 6.0 3 9 4,8 7.2 1.6
18:1019 0 6 2.9 2.6 4.2 2.5 10.9 3,4 5 3 27 5 16.0 4.5
IX 1о)7 28.5 22(1 21.6 6.9 6.5 12.0 14.3 152 96 7.7 13.4 15 8 0,8 0 7 08 1.4 2.2 0.5 0 4 Сл. Сл. Сл.
С-С|0[| Сл. Сл 6.2 Н.о. Но Н.о. Н.о. Но. Н.о. Но. Но. Но Н.о. Н.о. Но. Н.о. Н.о. Н.о, Но. Н.о. Н.о. Но.
18:2о)6 Но Н.о. Но Но. Но. Н.о. Н.о. Н.о. Н.о Но Но. Но. 0.7 22.9 15.4 8.7 7.9 8,2 67 Но. 35 2 14.9
18:3мб Н.о. Н.о. Но. Но. Н.о. Но. Но Но, Но Н.о Н.о Но. Н.о. Н.о. Но Н.о. 1.0 Но. Но. Но Н.о. 19.4
19:0 Н.о, Н.о. Но, 07 Но 0.2 0.3 0.3 Но. 0.4 0.4 Сл. 1.2 Но. 0.1 Но. 0.1 0,1 Но. Н.о, Но Но.
18:3(113 Н.о, Н.о. Но, Но. Но Но. Но, Н.о. Н.о Н.о. Н.о Но 17 216 14.3 зо 1 6.0 21.3 25.5 Но Но. Н.о.
|8:4иЗ Н.о Но Н.о. Н.о. Но, Но. Но, Н.о. И.о. Н.о. Н.о Но Н.о. Но. 0.1 Н.о. 6 2 Н.о, Н.о. Н.о. Но. Н.о,
ЕДЦ Н.о. Н.о, Но. Но. Но Но. Но. Но, Н.о. Но. Н.о. Но. 1.0 2.1 2.4 2.7 4.0 1.0 5 4 Н.о. Н.о. Н.о.
£КЦ - сумма ЖК, длина цепи которых меньше 14 атомов С; * - первая цифра указывает число атомов углерода, вторая - число двойных связей, третья —положение двойной связи с метального конца; ** - щшкшропановая кислота; £ДЦ - сумма ЖК, длина цепи которых больше 19.
Относительное содержание ФГ менялось от 9.2 до 15.6 % и было минимальным в стационарную фазу роста. ДФГ составлял 11-15 % от ФЛ, и его доля возрастала к концу культивирования. Снижение уровня ФГ и увеличение ДФГ в стационарной фазе роста выявлено для многих бактерий (Сгоиал, 1968; De Siervo, 1969). В этот же период увеличивалось относительное содержание и лизо-форм фосфолипидов.
Таблица 2.6. Содержание липидов и ПГА (% сухой биомассы) в светящимся и темновом штаммах Ph. leiognathi при периодическом культивировании
Фазы роста Светящийся штамм Темновой штамм
Липиды ПГА Липиды ПГА
Линейная 5.1±0.5 1.2±0.9 5.2±0.4 1.5±0.2
Стационарная 7.5±2.4 12.3±2.1 6.6±1.2 7.8±2.3
Таблица 2.7. Состав липидов Ph. leiognathi при периодическом
Фаза % от липидов % от ФЛ
ФЛ ДАТ СЖК Неид. ФЭ ФГ ДФГ Лизо-ФЭ+ ДФГ Неид.
Линейная 91.3±2.1 1.9±0.4 1.0±0.5 5.8±1.0 63.8±1.4 13.8±1.8 11.5±0.4- 6.3±1.1 3.8Ü.4
Стационар. 94.3±2.3 1.3±0.4 1.5±0.6 2,7±0.6 65.Ш.5 11.0±0.8 13.5±1.5 9.2±3.3 5.1±1.8
Нами было высказано предположение о связи метаболизма ПГА и люминесцентной реакции (Калачева и др., 1987). Интенсивность люминесценции достигала своего максимального значения в ранней стационарной фазе. Накопление ПГА наблюдали только после того, как уровень свечения падал на 50-80 %. Возможно, это связано с тем, что люминесцентная система конкурирует за восстановленные НАДФН+ и, несмотря на то, что в стационарной фазе синтез полимера индуцирован, содержание его в клетках остается на низком уровне, либо синтез и распад ПГА каким-то образом сопряжен с бактериальной люминесценцией через участие [¡-гидроксибутиратдегидрогеназы в восстановлении ФМН.
Состав ЖК липидов был изучен у 9 представителей светящихся бактерий (таблица 2.4). Психрофилы выращивали при 15°С, а мезофилы - при 26-28°С.
Установлено, что светящиеся бактерии синтезировали тот же набор ЖК, что и водородокисляющие бактерии. Основной насыщенной кислотой определена 16:0, доля которой колебалась от 9 до 21.5 %, в зависимости от штамма. Вторая по количеству была более короткая 14:0, относительное содержание которой не превышало 4.8 %. В составе ЖК идентифицирована С,7-циклопропановая кислота. Моноеновые кислоты представлены в основном 16:1ы7 и 18:1со7. Для всех исследованных светящихся бактерий 16:1со7 -доминирующая. В мезофильных штаммах доля этой кислоты была на уровне 40-58 %, а в психрофильных - выше 60-70 %. Относительное содержание 18:1и7 не превышало 15 %. Таким образом, выявленной особенностью
светящихся бактерий оказалась высокая ненасыщенность их липидов за счет преимущественного синтеза 16:1со7. Возможно, это обусловлено местом их обитания. В последнее десятилетие появились работы, подтверждающие результаты, полученные нами в середине 80-х годов (Youshizova et al., 2009; Kim et al., 2011; Lucena et al., 2011).
2.3. Общая характеристика липидов и жирных кислот некоторых цианобактерий
По характеру своей организации цианобактерии представляют самостоятельную эволюционную ветвь и осуществляют фотосинтез с выделением кислорода. В результате жизнедеятельности цианобактерии синтезируют и выделяют в окружающую среду органические вещества различной химической природы и биологической активности, что делает их перспективными объектом биотехнологии (Abed, 2009). Выбор цианобактерий как потенциального продуцента ПГА обоснован их способностью аккумулировать различные биомолекулы, включая ПГА, с помощью оксигенного фотосинтеза (Sharma, 2007). Эта особенность может значительно сократить затраты субстрата на синтез ПГА, так как для роста цианобактерии нуждаются только в свете и минеральных элементах. Еще одно важное качество цианобактерий - быстрый рост (время генерации 13 часов) в фотоавтотрофных условиях.
В природе цианобактерии занимают различные экологические ниши, поэтому в работе проанализирован состав липидов и жирных кислот цианобактерий, выделенных из разных источников местообитания -термофилы с острова Кунашир и мезофилы из водоемов бассейна р. Енисей.
Установлено, что в условиях автотрофного роста исследованные цианобактерии синтезировали небольшое количество липидов - от 8.3 до 10.5 % (таблица 2. 9).
Таблица 2.9. Состав липидов цианобактерий
Объект Лшпщы, % сухой биомассы % от липидов % от сухого веса
Омыл. Неомыл. Гидроф.* Омыл. Неомыл. Гидроф.
S. elongatiis 10.5±1.5 43.3±0.8 9.5±2 6 47.2±2.2 4.5 1.2 4.8
Coccopedia 8.3+0.9 49 6±6.0 13.7±3.3 Зб.7±6.8 4.1 1.2 3.0
S. platensis 10 0±1.6 28.4±2.1 8.2±1.б 63.4±1.7 2.8 0.8 6.4
*- Гидроф. - гидрофильные компонента липидов
Следует отметить, что липидные экстракты большинства фотосинтезирующих микроорганизмов характеризуются высоким содержанием гидрофильных компонентов, что обусловлено тссным контактом мембранных липидов с белками, углеводами и другими соединениями нелипидной природы, которые выделяются при экстракции вместе с липидами (Клячко-Гурвич, 1976). Следовательно, практически только омыггяемые (в основном ЖК) и
неомыляемые соединения можно отнести к липидной фракции, суммарное содержание которых не превышало 7.5 % от сухой биомассы клеток.
Отобранные для исследований цианобактерии в основном синтезировали полярные (структурные) липиды (таблица 2.10).
Таблица 2.10. Состав классов липидов цианобактерий (% от липидов)
Объект Полярные липиды Зеленые пигменты СТ СЖК ЭСТ Неиден.
S. etongatus 59.7±1.2 21.2±2.9 2.8±0.7 5.1±0.1 Сл. 9.3±1.3
Coccopedia 57.7±1.2 22.5±1.0 2.2±0.1 3.5±0.7 2.2+0.7 12.1±0.9
S. platensis 58.6±2.4 12.6±2.1 0.9±0.1 10.0±1.5 Сл. 18.2±1.7
В липидном экстракте цианобактерий большую долю составляла фракция зеленых пигментов. И в небольших количествах обнаружены стерины (СТ), их эфиры (ЭСТ) и СЖК.
Полярные липиды были представлены галактолипидами, сульфолипидами и фосфолипидами (рис. 2.6).
МГДГ оказался основным липидом исследованных цианобактерий, его содержание составило 35.5±3.0 % от структурных липидов. Содержание ДГДГ было несколько ниже - 28.3±1.9 %, сульфолипидов - 17.5 %. На долю ФГ приходилось около 15 % от структурных липидов.
Рис. 2.6. ТСХ структурных липидов S. platensis. 1 направление: хлороформ-ацетон-метанол-муравьиная кислота-вода (150:43:43:8,5:1 но объему); 2 направление - ацетон-бекзол-муравъиная кислота-вода (200:27:2.7:8.5). CJ1 -сульфолштад; ФГ - фосфатидилглицерин; МГДГ' -моногалактозилдиглицерин; ДГДГ -дигалактозилдиглицерин
Чаким ойразом, состав липидов исследованных цианобактерий, отличающихся температурным оптимумом роста, рН, оказался довольно близок по всем перечисленным параметрам.
Наиболее существенные отличия в липидах цианобактерий были обнаружены при изучении состава жирных кислот (таблица 2.4).
Так, представитель подсекции Synechococcaceae S. elongates, выделенный из термальных вод, синтезировал только насыщенные и моноеновые кислоты. Основной насыщенной клелотой была 16:0, относительное содержание которой превышало 50 %. Из ненасыщенных кислот этот термофил синтезировал только моноеновые кислоты - 16:1ш7 и 18:1со9. Такой набор жирных кислот для
термофильных штаммов синехококкусов, выделенных из разных источников, показан другими авторами (Маслова и др., 2004; Jing et al., 2007).
В жирнокислотном спектре Coccopedia sp. найдены насыщенные, моноеновые и диеновая 18:2со6 кислоты. Другой представитель подсекции Chroococcales, штамм ACCS019 (Chroococcus limneticus), синтезировал небольшое количество 18:2со6, но для него было характерна большая доля (более 20 %) короткоцепочечных ЖК и некоторое количество триеновой 18:ЗсоЗ
Представители подсекции Nostocales, к которым относятся Trichormus variabilis (ACCS022, ACCS029, ACCS060, ACCS039), Wollea saccata (ACCS045) Cylindrospernmm stagnate (ACCS051), синтезировали весь набор ЖК, характерный для микроводорослей. При этом отмечена большая вариабельность в составе ЖК. Общим для всех штаммов этой подсекции являлись высокие уровни насыщенных (40.6-53.5 % от суммы ЖК) и полиненасыщенных (34.8-47.3 %) ЖК, в то время как уровни мононенасыщенных ЖК были существенно ниже (9.6-19.2 %). В составе ЖК этих штаммов отмечена достаточно большая доля 18:2ш6 (6.7-16.8 %) и 18:ЗюЗ (14.2-30.1 %). Практически все штаммы синтезировали полиненасыщенные кислоты Ci6 ряда. Однако штамм ACCS039 отличался способностью синтезировать 18:Зсо6 (1.0 % от суммы ЖК) и 18:4ыЗ (6.2 % от суммы ЖК). Содержание 18:ЗшЗ (6.0 % от суммы ЖК) и 16:ЗшЗ у него было низким по сравнению с другими штаммами порядка Nostocales. Штамм ACCS051 вообще не синтезировал полиены С^-ряда. Среди моноеновых кислот С[6 ряда изомер 16:1ы5 был основным. Относительное содержание 18:3<а3 (2.5 %) было существенно ниже, чем у других представителей этой подсекции.
Штаммы подсекции Oscillator tales, в которую входили Leptolyngbya sp. (ACCS007), Phormidium subfuscum (ACCS033) и 5. platensis, существенно отличались по соотношению и содержанию моноеновых и полиеновых ЖК. Так в липидах ACCS007 превалировали мононенасыщенныс 16:1ю7 и 18:1ю9 (38.1 %) и полиненасыщенные (32.2 %) кислоты. У штамма ACCS033 общая сумма мононенасыщенных кислот незначительна (6.1 %), а доля полиненасыщенных кислот составляла 62.1 %. В отличие от ACCS007, у ACCS033 штамма в достаточно большом количестве были определены полиненасыщенные кислоты Скгряда. Состав ЖК 5. platensis характеризовался высоким содержанием насыщенных кислот, в основном 16:0 (58 %), отсутствием синтеза полиеновых кислот Cie-ряда и активным синтезом у-линолеповой кислоты.
Такое многообразие состава ЖК этой группы прокариот не является уникальным, многочисленные исследования свидетельствуют о большой неоднородности состава ЖК липидов цианобактерий (Lie et al., 2003; Wada, Murata, 2004; Iliev et al., 2011). Еще в работах Кеньона были установлены четыре метаболотеские группы одноклеточных и нитчатых штаммов цианобактерий относительно ЖК состава: 1 - штаммы, синтезирующие
незначительное количество либо вообще не синтезирующие полиеновые кислоты; 2 - штаммы, синтезирующие а-линоленовую кислоту (18:ЗсоЗ); 3 -штаммы, синтезирующие у-линоленовую кислоту (18:3ш6); 4 - штаммы, синтезирующие октадекатетраеновую кислоту (18:4шЗ) (Кепуоп, 1972; Кепуоп et al., 1972). Авторы этих работ показали, что цианобактерии отличаются ЖК составом от всех остальных прокариотических организмов, которые содержат почти исключительно насыщенные и мононенасыщенные ЖК. Следует отметить, что для многих штаммов группы 1 наличие бактериального типа (анаэробного) синтеза мононенасыщенных ЖК не может быть совершенно исключено. Однако некоторые из этих штаммов синтезируют небольшое количество 18:2ш6, которая никогда не была обнаружена у бактерий. Вследствие этого, возможно, что цианобактерии весьма различаются механизмами синтеза ЖК; для некоторых штаммов может быть присущ бактериальный тип синтеза ЖК; некоторые могут иметь ферментативные системы и бактериального и водорослевого типов; некоторые могут иметь только водорослевый аэробный путь синтеза ненасыщенных ЖК.
Таким образом, исследованные микроорганизмы, относящие к разным таксономическим группам, синтезируют липиды, характерные для бактерий. Все они, независимо от типа метаболизма, преимущественно образуют структурные компоненты клеточных мембран - фосфолипиды у водородокисляющих и светящихся бактерий, или фосфолипиды и гликолипиды - у цианобактерии. Доминирующим фосфолипидом у бактерий был фосфатидилэтаноламин, и в меньшей степени фосфатидилглицерин и дифосфатидилглицерин. В цианобактериях основными липидными классами были моногалактозилдиглицерин, дигалактозилдиглицерин, сульфолипид и в меньшей степени, фосфатидилглицерин. В качестве запасного вещества липидной природы исследованные микроорганизмы могут накапливать ПГА. Представители грам-отрицательных бактерий, к которым относятся водородокисляющие и светящиеся микроорганизмы, синтезируют ограниченный набор жирных кислот, среди которых основными являются прямоцепочечные насыщенные и моноеновые кислоты С1б и С]8 ряда, циклопропановые кислоты и /?-гидроксикислоты. Но для каждой группы отмечены свои особенности в соотношении этих кислот. Так, для светящихся бактерий характерен преимущественный синтез 16:1со7, а водородокисляющие и СО-окисляющие бактерии синтезируют 16:1со7 и 18:1со7 приблизительно в равных пропорциях. Группа цианобактерий отличается большим разнообразием состава жирных кислот и среди них встречаются организмы, синтезирующие только насыщенные и моноеновые кислоты, либо синтезирующие полиненасыщенные ЖК с разным числом и положением двойных связей в молекуле.
1062 5786
133
134 136 142
150 VI
151 54 44
/ССБОЗЗ Ассэогг АССв029 АССЕОЗЭ А2СБС45 Д:СЭ051 АСС506С Э-е. С.Б Б-р.
-1-1
--^ —I —
Рис.2.7. Дендрограмма, полученная на основе ЖК состава бактерий. (7Л —А. еШгорки.ч\ 1062 - 51. carЪoxydohydrogena\ 5786 -й. еШгорка; 133-151-психрофильные штаммы светящихся бактерий; У.Г -V. 54 - Рк
1сю^па11й\ 44 - V. Иагхеуг, Я.е.- 5. е1о^аП1.ч\ С.э. -СоссоресНа 5р.; 8.р. — Л" р1аею&, АССЭОЗЗ-ОбО -цианобактерии из коллекции СФУ
15
ипкаде Э'^^гсе
Для выявления возможной связи состава ЖК липидов исследованных прокариот с их таксономической принадлежностью проведен кластерный анализ, результаты которого отражены дендрограммой, представленной на рисунке 2.7. По этому признак}' микроорганизмы разделились на три группы. Первая группа включала водород- и СО-окисляющие бактерии, хотя эти организмы относятся к разным таксонам. Вторая группа представлена светящимися бактериями (133-151, УХ, 44, 54). Третья - слабо кластеризующая группа цианобактерий, в которой только 4 штамма, принадлежащих к одной подсекции, образуют единый кластер.
3. Синтез клеточных макромолекул (основной и запасной природы) как фактор адаптации прокариот к меняющимся условиям среды, обеспечивающий суперпродукцию ПГА
Для выявления взаимосвязи между условиями роста и направленностью конструктивного обмена на примере водородокисляющих микроорганизмов (водородных бактерий и карбоксидобактерий) проведен обширный цикл исследований, включающий выращивание Ака^епея ешгоркиь 21 и БеИЬепа carboxydohydrogena 21062 при варьировании в широких пределах концентрации основных ростовых субстратов (СО2 - субстрат конструктивного метаболизма; Н2 - энергетический субстрат), элементов минерального питания (азот, фосфор, сера, калий, магний), физико-химических параметров (рН и температура), добавлении ингибитора (СО) как компонента газового субстрата.
3.1. Влияние физико-химических факторов среды на рост и конструктивный обмен водородокисляющих прокариот
Рост и размножение микроорганизмов существенным образом зависят от температуры и активной реакции среды - рН. Водород- и СО-окисляющие бактерии широко распространены в природе, поэтому естественно ожидать наличие среди них форм, способных сохранять способность к росту и размножению при различных физико-химических условиях среды.
Культивирование при разной температуре среды позволило установить, что бактерии A. eutrophns сохраняют способность к росту при изменении этого параметра в достаточно широком диапазоне, однако зависимость удельной скорости роста бактерии от температуры - экстремальна. Оптимальной температурой для роста бактерий определен узкий диапазон - 30 - 33.5°С; температура, равная 41 °С, является максимально возможной; ниже 22°С рост бактерий прекращался. В отношении карбоксидобактерий получена сходная картина. Культура S. carboxydohydrogena сохраняла способность к росту при изменении температуры среды от 17 до 41°С, имея большую адаптацию к пониженным температурам по сравнению с водородными бактериями. Наиболее высокие значения удельной скорости роста у карбоксидобактерий зафиксированы в узком интервале температур (32.5-35°С). Повышение температуры культивирования выше 35°С резко ингибировало рост карбоксидобактерий; увеличение температуры на 5°С от оптимальных значений (до 40°С) приводило к остановке роста. Снижение температуры среды на 3-4"С от оптимума приводило к уменьшению удельной скорости роста от 0.37-0.40 до 0.20 - 0.28 ч"1 у обеих культур и снижению энергоэффективности роста. Экономический коэффициент бактерий по водороду при повышенных и пониженных температурах уменьшался в 2-2.5 и более раз, до 0.3-0.5 г/г (от 1.97-2.24 г/г при оптимальной температуре).
Механизм влияния экстремальной температуры на микроорганизмы различен. Наблюдаемое в ответ на изменение температуры среды падение скорости роста может возникать вследствие уменьшения скорости ферментативных реакций, торможения синтеза РНК и других компонентов клетки (Преображенская, Шноль, 1965; Логинова и др., 1973; Перт, 1978). Для водородных бактерий и карбоксидобактерий субоптимальные температуры в исследованном диапазоне не вызывали глубоких перестроек в синтезе клеточных макромолекул, имеющих место при действии повышенных температур у ряда других организмов. Изучение химического состава А. eutrophus и S. carboxydohydrogena, растущих при повышенной температуре (40.5-41°С), зафиксировало снижение концентрации РНК в клетках (таблица 3.1). При уменьшении температуры до минимальной изменений в синтезе белков практически не происходило. Известно, что этот показатель в сравнении с нуклеиновыми кислотами в экстремальных температурных условиях у микроорганизмов подвержен меньшим колебаниям (Hunter, Rose, 1979). Вероятно, это можно объяснить тем, что на фоне ингибированного синтеза РНК в клетках в течение какого-то времени синтез белка может реализоваться за
счёт РНК и рибосом, синтезированных ранее при оптимальных условиях (Позмогова, 1985).
Рост водородных бактерий и карбоксидобактерий при экстремальных температурах сопровождался изменениями в синтезе липидов. При повышенных температурах культивирования суммарное содержание липидов в биомассе бактерий возрастало (у водородных бактерий, в том числе за счёт небольшого усиления синтеза полимера /?-гидроксимасляной кислоты, ПЗГБ), а при пониженных - падало (таблица 3.1).
Температура роста очень существенно влияла на состав жирных кислот бактериальных липидов (таблица 3.2). Повышение температуры приводило к увеличению доли насыщенных ЖК, в основном, за счет усиления синтеза 16:0, и снижению суммы ненасыщенных. При этом соотношение насыщенных и ненасыщенных ЖК возрастало.
Таблица 3.1. - Влияние температуры культивирования на химический состав
бактерий
Содержание компонента (% сухой биомассы)
т°с белок РНК углеводы липцды ПЗГБ
A. eutrophus ZI
23.5 59.5 10.6 4.1 4.0 0.7
26.0 58.5 9.4 4.4 6.5 Сл.
30.0 58.0 10.8 4.3 6.8 Сл.
31.5 57.5 11.0 4.2 7.5 Сл.
33.0 55.0 8.8 4.0 8.5 4.0
35.5 58.0 9.2 4.3 9.4 4.3
38.0 56 5 8.7 4.4 8.5 3.2
40.5 56.0 8.6 4.0 6.3 1.3
S. carboxydohydrogenaZ1062
17.0 60.0 10.0 _* 3.4 Сл.
22.5 60.2 9.4 - 4.1 0.9
25.0 61.0 10.0 - 4.0 Сл.
33.0 60.8 10.4 - 6.7 Сл.
35.5 61.0 - - 7.8 Сл.
38 0 60.0 9.2 - 5.2 Сл.
41.0 58.0 8 6 - 10.5 Сл.
*(-) - параметр не определяли
И, напротив, при снижении температуры сумма насыщенных жирных кислот в липидах бактерий уменьшалась, в основном, за счёт содержания 16:0 и Сп-циклопропановой кислот; доля моноеновых кислот 16:1ю7 и 18:1ш7 при этом возрастала. Эти изменения связаны, вероятно, с модификацией структуры клеточных мембран, направленной на сохранение функциональных свойств клеток при экстремальных температурах. О тесной связи между температурным режимом культивирования микроорганизмов и составом жирных кислот липидов свидетельствует обширный экспериментальный материал (Перт, 1978; Работнова, Позмогова, 1979; Diefenbach and Keweloh, 1994; Holtwick et al., 1997; Junker and Ramos 1999; Keweloh and Heipieper, 1996; Ramos et al., 1997, 2001). Обычно регуляция текучести мембран происходит благодаря изменению
отношения насыщенных к ненасыщенным ЖК, или вариациям в их длине цепи, или изменению отношения изо- и антиизо- разветвленных цепей жирных кислот и протонированием или депротонированием головных групп фосфолипидов (Denich et al., 2003; Suutari and Laasko, 1994). Cis/trans изомеризация также включается в адаптивный процесс к изменению температуры у Pseudomonas и Vibrio spp. и некоторых метилотрофов (Makula, 1978; Morita et al., 1993; Okuyama et al., 1990), при этом происходит изменение текучести мембран (Okuyama et al., 1991).
Таблица 3.2 Влияние температуры и pH среды на состав жирных кислот
бактерий
A .eutronhus ZI
pH 7 0 T T pH pH
Жирная кислота T 30 °c 24 °C 40 °C 4.2 8.6
12:0 1.4 И.о. Сл. Сл. 0.4
и-14:0 1.9 Сл. 0.3 Сл. 1.0
14:0 1.0 0.3 0.8 Сл. 2.9
14:1 3.0 Сл. 0.4 0.6 0.5
15:0 0.2 Сл. Сл. 2.6 Сл.
16:0 33.7 29.5 46.1 34.4 20.8
16:1 33.1 43.5 38.1 30.6 48.0
17:0 Сл. Сл. Сл. Сл. Сл.
C-С17 0 3.7 0.4 0.8 9.3 0.3
18:0 2.7 0.7 2.9 Сл. Сл.
18:1 19.3 25.6 10.4 14.4 26.0
C-С i9:o H.o. H.o. Но. 6.7 Н.о.
19:0 И.о. H.o. Но. 1.4 Но.
Хттасыщ. 0.81 0.45 1.05 1.19 0.30
Ьненасыщ.
i S. carboxydohydrosena ZI062
pH 7.0 T Т pH рн
Жирная кислота T 33 °C 17 °C 41 °С 4.2 8.0
14:0 0.5 0.2 0.3 2.9 1.0
14:1 0.7 0.1 0.3 0.7 0.3
15:0 0.1 0.1 0.3 Сл. 1.4
15:1 0.3 Сл. Сл. Сл. 1.7
16:0 27.6 17.7 40.1 39.0 26.8
16:1 31.1 43. 30.4 37.8 26.3
17:0 0.2 8.5 Сл. 0.2 2.3
C-С 170 1.7 1.0 3.6 7.0 3.3
18:0 1.0 0.5 2.3 0.5 2.6
18:1 36.3 36.7 21.6 11.2 33.9
C-С 190 0.5 0.5 1.2 02 Сл.
19:0 H.o. H.o. Сл. 0.3 Но.
Хнасыщ. 0.43 0.24 0.91 1.00 0.59
Хненасыщ.
Итак, совершенно очевидно, что сложная структура мембран микроорганизмов строго регулируется температурой среды (Beney and Gervais, 2001; Denich et al., 2003), что позволяет поддерживать взаимосвязь между структурой и функцией мембраны, а этот фактор является решающим для выживания организмов (Beney and Gervais, 2001; Vigh et al., 1998). Vigh et al.
(1998) предположили, что изменения в текучести мембран могут являться сигналом в регуляции экспрессии специфических генов, таких как десатуразы, cis/trans изомеразы (Kiran et al., 2004), генов температурного шока и т.д. (Lehel et al., 1993; Vigh et al., 1998; Los et al., 2008; Shivaji and Prakash, 2010). Полагают, что все эти механизмы обеспечивают оптимальную степень текучести липидных компонентов клеточной мембраны (Byrne, Chapman, 1964; Parrel, Hose, 1967; Chapman, 1967). Липиды термофильных микроорганизмов в сравнении с мезофильными имеют более высокие температуры плавления и в них доминируют насыщенные жирные кислоты (Kaneda, 1963; Ray et al., 1971). Отмеченные изменения ЖК состава микробных липидов в ответ на увеличение или снижение температуры роста обеспечивают регуляцию физических свойств мембран и, тем самым, способность клеток функционировать при неоптимальных температурах.
Полученные результаты показали, что водородные бактерии и карбоксидобактерии при действии экстремальных температур снижают удельную скорость роста и перераспределяют синтез клеточных компонентов, в основном, за счёт состава жирных кислот в липидах. Изменения метаболизма ЖК позволяют бактериям адаптироваться и сохранять способность к росту и размножению в достаточно широком температурном диапазоне.
Концентрация ионов водорода (pH среды) также оказывает существенное воздействие на рост и метаболизм клеток. Концентрации гидроксониевых и гидроксильньгх форм воды, варьирующие в щелочных и кислых средах, играют важную роль в регулировании сольволиза, ионного состояния питательных компонентов среды, её коллоидных свойств и т.д. Поэтому активная реакция среды - один из важнейших факторов в жизнедеятельности микроорганизмов.
Влияние pH на скорость роста, экономический коэффициент и химический состав водородных бактерий и карбоксидобактерий изучены при их непрерывном культивировании в режиме рН-стата. Рост Л. eutrophus и S.carboxydohydrogena возможен при изменении pH среды в достаточно широких пределах, от 4.2-4.5 до 8.0-8.6, однако оптимальные для роста бактерий значения активной реакции среды лежат в узком диапазоне — 6.5-7.5. Зависимости удельной скорости роста водородных бактерий и карбоксидобактерий от величины pH в общем подобны; сдвиг pH среды в кислую сторону только на одну единицу приводил к уменьшению удельной скорости роста бактерий практически в 2 раза от исходной величины. Избыток гидроксильных ионов в среде ингибировал рост бактерий ещё значительнее -увеличение pH среды до 8.0, то есть только на 0.5 единицы от оптимального значения, сопровождалось уменьшением скорости роста водородных бактерий до 0.24 ч"1 и полным прекращением роста карбоксидобактерий.
Рост водородных бактерий и карбоксидобактерий при экстремальных значениях pH, как в кислой, так и в щелочной среде, сопровождался значительными изменениями в скорости окисления и эффективности использования энергетического субстрата. Потребление водорода в расчёте на единицу синтезированной биомассы при этом резко возрастало, и эффективность его использования падала. Так, экономический коэффициент по
водороду при крайних кислых и щелочных значениях рН составлял у водородных бактерий и карбоксидобактерий не более 0.4-0.5 г/г. Это в 3-4 раза ниже его исходных значений при рН 7.0. Отношение объёмов водорода и кислорода, потребленных культурами бактерий при неблагоприятных для роста значениях рН, уменьшалось, что также свидетельствует о более выраженном блокировании энергопотребляющих синтетических процессов в клетках по сравнению с процессами окисления энергетического субстрата.
Рост водородных бактерий при низких значениях рН сопровождался незначительным снижением внутриклеточной концентрации азотсодержащих компонентов и увеличением доли липидов. В карбоксидобактериях аналогичные изменения зарегистрированы в щелочной среде (таблица 3.3).
Таблица 3.3. Химический состав бактерий при изменении активной реакции среды
Содержание компонента (% сухой биомассы)
pH белок общий азот липиды ПЗГБ
A. eutrophus Z1
4.2 49.0 8.15 • 6.8 2.3
4.6 52.5 8.07 9.8 Сл.
5.2 57.0 9.46 11.5 0.6
7.0 56.0 9.54 7.5 Сл.
7.6 61.0 9.20 - Сл.
7.8 57.0 9.59 7.1 Сл.
8.0 61.0 9.64 7.6 Сл.
8.5 - ■ - 6.7 0.3
S. carboxydohydrogena ZI062
4.5 58.9 11.6 6.5 0.9
4.8 59.0 11.2 7.6 3.4
5.8 64.0 11.9 8.4 1.5
7.0 65.1 12.6 6.8 0.5
8.0 48.5 10.0 9.0 4.5
Существенные перестройки выявлены и в жирнокислотном составе липидов бактерий (таблица 3.2). В кислой среде у бактерий стимулировался синтез насыщенных и циклопропановых жирных кислот. Так, содержание Сп-циклопропановой кислоты в липидах водородных бактерий и карбоксидобактерий возрастало до 9.3 и 7.0 %, соответственно. Зафиксировано наличие в составе липидов С^-циклопропановой кислоты. Высокий уровень циклопропановых кислот в спектре жирных кислот бактерий, как известно, характерен для тиобацилл, развивающих при низких значениях pH, и других экстремальных ацидофилов (Levin, 1971). Синтез циклопропановых кислот является основным фактором защиты Е. coli от кислотного шока (Chang, Cronan, 1999). Эти кислоты синтезируются из соответствующих моноеновых кислот путем переноса метальных групп из ^-аденозил-Ь-метионина на двойные связи цепей, ацилирующих мембранные фосфолипиды (Grogan, Cronan, 1997). Введение циклопропанового кольца в молекулу жирной кислоты снижает текучесть мембран, делая ее менее проницаемой для токсичных
молекул и протонов, и, тем самым, помогает клеткам адаптироваться к неблагоприятным воздействиям окружающей среды (Kim et al., 2005; Grandvalet et al., 2008; Thi et al., 2011). Повышение насыщенности и циклизация липидов у водородных бактерий и карбоксидобактерий в кислой среде можно связать с проявлением защитных механизмов клеток в ответ на воздействие данного экстремального фактора.
В щелочной среде, когда клетке приходится удерживать ионы водорода или исключать гидроксильные ионы, в синтезе ЖК липидов у водородных бактерий отмечена противоположная направленность: снижение концентрации циклопропановых кислот и увеличение содержания ненасыщенных ЖК (1б:1со7 и 18:1 со7). Соотношение насыщенных и ненасыщенных ЖК снижалось в 1.2 и 1.9 раза по сравнению со значением при нейтральном pH. Чётких изменений в синтезе жирных кислот у карбоксидобактерий при щелочных значениях pH не выявлено. В последние годы выделено огромное количество алкалифильных микроорганизмов (Tiago et al., 2004). Обращает на себя внимание то, что качественный состав жирных кислот описанных штаммов мало отличался от бактерий, входящих в те же таксономические группы, но не способных выживать в щелочной среде. Так для двух представителей грамм-отрицательных бактерий рода Alkalimonas, выделенных из щелочных озер Китая и Южной Африки, характерен стандартный для грам-отрицательных бактерий набор ЖК: 16:0, 16:1 и 18:1 (Ма et al., 2005). В грам-положительных бактериях, выделенных из рапы, доминирующими кислотами были разветвленные И-С15 и и-С17 (Derekova et al., 2007). Влияние щелочных pH на состав ЖК практически не исследовано. Известно, что алкалифильный штамм Bacillus sp. YN-2000 синтезировал существенно больше ненасыщенных ЖК, чем Bacillus subtilis и облигатный алкилофил Bacillus alcalophilus. Однако при выращивании клеток YN-2000 при pH 10 содержание ненасыщенных кислот и отношение антиизо/изо кислот снижалось по сравнению с нейтральной pH. Это сопровождалось изменениями морфологии поверхности клеток (Yumoto et al., 2000). Следовательно, не только низкие значения pH, но и щелочная среда может существенно влиять на состояние мембранных компонентов клетки, а именно, ЖК состав.
В результате экспериментов, найдены оптимальные для роста исследованных штаммов водородных бактерий и карбоксидобактерий значения pH и температуры среды и изучены особенности метаболизма бактерий при действии экстремальных значений этих параметров. У водородокисляющих бактерий изменение температуры и pH среды приводит к уменьшению удельной скорости роста и эффективности использования энергетического субстрата. На этом фоне в клетках изменяется насыщенность жирных кислот в липидах: при повышении температуры она возрастает, при снижении - падает; в кислой среде стимулируется синтез циклопропановых жирных кислот и возрастает насыщенность липидов, в щелочной среде насыщенность липидов уменьшается. Данные изменения в ответ на воздействие неблагоприятных факторов среды позволяют бактериям сохранить способность к росту и
размножению в достаточно широком диапазоне температур и активной реакции среды, однако, без существенного перераспределения в составе основных и запасных клеточных макромолекул.
3.2. Влияние конструктивного и энергетического субстратов на рост и метаболизм водородных бактерий и карбоксидобактерий
Концентрации питательных веществ, в первую очередь источников энергии и углерода - факторы наиболее существенные и определяющие кинетику и направление конструктивного обмена у микроорганизмов. Основные ростовые субстраты водородокисляющие микроорганизмы получают из газовой фазы через стадию растворения газов в околоклеточной среде. Кислород и, особенно водород, являются малорастворимыми газами, поэтому непрерывный рост микробной культуры возможен только в условиях интенсивной искусственной аэрации. При этом транспорт газовых компонентов из газовой фазы в жидкую является основным фактором, ограничивающим рост микроорганизмов. Всё это определяет важность для водородокисляющих бактерии условий газового питания и обуславливает специфику методов их культивирования и управления процессом.
Для определения степени влияния источников углеродного и энергетического питания на физиолого-биохимические характеристики водородных бактерий и карбоксидобактерий проведена серия экспериментов, в ходе которых бактерии выращивали в непрерывной турбидостатной культуре, поддерживая объёмную концентрацию газов на уровне насыщения, и все остальные параметры среды - на уровне оптимальных. Установлено, что удельная скорость роста бактерий не зависела от остаточной концентрации диоксида углерода в культуре в широком диапазоне значений, от 6 до 250 мг/л и составила 1/2 от максимальной в области лимитирования при концентрации С02 в культуре 2 мг/л. В области ингибирования падение удельной скорости роста до 1/2 от ц тах, наступало при концентрации С02, равной 350 мг/л. Зависимость бактерий от концентрации растворённого кислорода в обеих культурах - экстремального характера. Границы физиологического действия 02 для бактерий лежат в довольно узком диапазоне, 2-5 мг/л. Удельная скорость роста бактерий не зависела от концентрации водорода в культуре свыше 0.6 мг/л; факт ингибирования бактерий водородом не установлен. Падение удельной скорости роста бактерий на 1/2 от ртах получено при концентрации растворённого водорода в культуре, равной 0.14 мг/л.
За исключением водорода, неоптимальные условия газового питания влияли на показатели газообмена бактерий, увеличивая расход газового субстрата на синтез биомассы и снижая эффективность его использования. При лимитировании и ингибировании роста бактерий по углероду и кислороду в результате рассопряжения энергетического и конструктивного метаболизма траты водорода и кислорода на биосинтез возрастали. При дефиците водорода эффективность его как энергетического субстрата возрастала; лимитирования роста бактерий по водороду не выявлено.
Таблица 3.4. Химический состав бактерий при изменении условий газового питания
Условия Удельная Химический состав клеток, % сухой биомассы
газового питания скорость
роста, ц ч"' Общий азот Белок Липиды ПЗГБ
Я. еШгорИа
Оптимум 0.38 11.3 70.5 8.0 Сл.
Лимит 02 0.09 9.5 59.4 5.6 3.4
Лимит Нт 0.06 12.1 75.6 7.1 3.8
Лимит СОг 0.09 10.4 65.0 6.6 4.4
Ипгибирование О2 0.09 12.4 77.5 7.9 1.3
8. сагЪохуйакус1го%епа
Оптимум 0.38 11.6 65.0 9.1 Сл.
Лимит От 0.15 11.0 51.5 8.1 Сл.
Лимит 1Ь 0.17 11.8 70.0 96 Н.о.
Лимит СО? 0.14 11.0 62.0 7.5 Сл.
Ипгибирование О2 0.16 10.4 67.0 7.2 0.1
Таблица 3.5. Влияние условий газового питания на состав жирных кислот __бактерий (% от суммы ЖК)___
Жирная кислота оптимум Лимит Ипгибирование о2
о2 | Н2 | со2
К еи&орИа
12:0 1.4 0.2 Сл. 0.2 Сл.
14:0 2.9 1.2 1.1 1.2 0.8
14:1 3.0 0.7 0.4 0.7 Сл.
15:0 0.2 0.1 Сл. 0.1 Сл.
16:0 33.7 36.2 36.1 35.9 35.4
16:1 35.1 34.9 38.1 34.9 36.4
17:0 Сл. 0.4 Сл. 0.4 0.2
С-С 170 1.7 0.4 0.8 0.4 1.3
18:0 2.7 1.1 2.9 1.1 1.0
18:1 19.3 25.1 20.4 25.1 24.9
Хнасыщ. Гненасыщ. 0.76 0.65 0.71 0.81 0.63
£ сагЬохус/о1гус1го%епа
14:0 0.4 0.5 Сл. 0.4 Сл.
15:0 Сл. Сл. Сл. Сл. Сл.
15:1 Сл. Сл. Сл. Сл. Сл.
16:0 29.6 25.6 30.4 29.6 29.9
16:1 34.7 27.0 35.6 35.7 34.3
17:0 Сл. Сл. Сл. Сл. 0.7
С-С170 4.7 Сл. 2.3 4.7 4.9
18:0 1.6 Сл. 1.1 1.6 1.0
18:1 26.6 30.6 28.4 27.6 28.3
19:0 2.4 Сл. 2.2 0.4 0.9
С-С|9;0 Сл. Сл. Сл. Сл. Сл.
Инасьпц. £ненасыщ. 0.63 0.75 0.56 0.57 0.60
Концентрация и соотношение в клетках азотсодержащих компонентов (общего азота и белка) и запасных макромолекул (ПГА) мало изменялись при неоптимальных условиях газового питания (за исключением лимитирования роста бактерий по кислороду, при котором происходило некоторое снижение концентрации белка в клетках) (таблица 3.4). Суммарное содержание линидов и их ЖК состав также не зависели от условий газового питания (таблица 3.4, 3.5).
В целом, показано, что изменение в широких пределах концентрации С02 и Н2 в культуре не влияет на удельную скорость роста водородных и карбоксидобактерий; однако зависимость удельной скорости роста бактерий от концентрации СЬ имеет выраженный экстремальный характер с узким оптимумом. Показано, что, несмотря на нарушение сопряженности конструктивного и энергетического обменов при неоптимальном газообеспечении, синтез клеточных макромолекул мало изменялся, и существенных перестроек в метаболизме ЖК не выявлено (таблица 3.5).
3.3. Рост и конструктивный метаболизм водородных бактерий и карбоксидобактерий под воздействием монооксида углерода как компонента газового субстрата
Ингибиторы - наиболее сильные регуляторы метаболизма. Изучение биологического действия ингибиторов представляет большой теоретический интерес, так как способствует познанию пределов устойчивости и физиологической изменчивости микроорганизмов, а также позволяет направленно воздействовать на метаболизм с целью получения нужных продуктов.
Монооксид углерода является дыхательным ядом. У микроорганизмов мишенью СО служат железосодержащие ферменты цепи переноса электронов. Под воздействием СО может иметь место нарушение процессов окисления субстрата и образования энергии, снижение скорости роста клеток и изменение их химического состава. Возможность выращивания микроорганизмов в присутствии СО открывает пути для разработки новых биологических технологий на водороде различного происхождения. Это позволит существенно расширить сырьевую базу и снизить затраты на основной ростовой субстрат.
Рост бактерий А. вШгорИи.ч Ъ\ и S.carboxydohydrogena 7,1062 изучен в проточной турбидостатной культуре при изменении концентрации СО (все остальные параметры стабилизировали на уровне оптимальных). В отсутствии СО, рост карбоксидобактерий был сравним с ростом быстрорастущих водородных бактерий А. еМгорИия ТА, и величина ц у карбоксидобактерий на смесях водорода и диоксида углерода оказалась сопоставимой с таковой у водородных бактерий, составив 0.38±0.01 ч'1. Увеличение концентрации СО в газовой фазе свыше 10 % ингибировало рост бактерий обоих видов и вызывало монотонное снижение удельной скорости роста. Полученные экспериментальные зависимости р(8со) для А. ехигоркиь и 5. carboxydohydrogвna подобны; при этом зона устойчивого роста у карбоксидобактерий несколько шире, чем у водородных бактерий. Рассчитанные по экспериментальным
кривым значения К; по СО для А. еи1горИия и 5. сагЬохусЬИу&оеепа составили 2.5 и 4.7 мг/л, соответственно.
Под воздействием ингибиторов, как правило, направление метаболизма у микроорганизмов изменяется и эффективность расходования энергетического субстрата снижается (Перт, 1978). В культурах водородных бактерий и карбоксидобактерий с увеличением концентрации СО траты ростового субстрата врзрастали (таблица 3.6). При предельных для бактерий концентрациях СО, когда р была ниже 0.1 ч"1, экономические коэффициенты по водороду не превышали 20-30 % от исходных значений удельной скорости роста бактерий, выращиваемых без СО. Дополнительное расходование водорода связано с увеличением метаболических трат и возрастанием "холостого окисления".
Таблица 3.6. Показатели газообмена и химический состав А. еШгорЬия Ъ\ и 5". сагЬохуйокусЬо^епа Ъ1062 при изменении концентрации СО в культуре
Стехиометрия Химический состав клеток,
Концентрация газопоглощения % сухой биомассы Ьнасыщ.
СО, % об культурой Гненасыщ.
С02:02:Н2 Белок Липиды ПЗГБ
А. еи&орИи$Ъ\
0 1 1.4: 4.7 57.2 10.3 Сл. 0.53
10 1 3.4: 11.0 60.2 10.1 0.6 0.63
20 1 3.2 : 9.1 60.0 10.1 Сл. 0.96
30 1 5.6 : 20.0 59.4 10.0 Сл. 0.89
5. сагЬохусЬИу&о^епа 1062
0 1 2.0 : 5.5 58.7 ' 9.1 Сл. 0.68
10 1 2.5 : 6.5 59.5 11.0 0.2 0.74
20 1 4.0 : 10.0 58.0 10.6 Сл. 0.86
30 1 4.2 : 12.0 59.2 11.0 2.2 0.87
40 1 6.0 : 18.0 60.2 Н/д 1.2 0.92
При анализе химического состава А. еи/горЬил и X сагЬоху(1оИусЬг>£епа (таблица 3.6), не выявлено влияния СО на синтез запасных веществ. Содержание общего азота и белка в бактериях во всём диапазоне исследованных концентраций СО и, следовательно, скоростей роста составляло 10.5-11.5 и 60-65 %, соответственно, то есть практически было максимальным. Ингибирующсе воздействие СО, сопровождающееся существенным повышением трат энергетического субстрата культурой, по всей вероятности, и обеспечивало нормальное функционирование анаболических систем, включая фиксацию С02 и синтез мономеров в клетках. В итоге, в клетках сохранялась белковая "программа" синтеза макромолекул. При ингибировании роста водородных бактерий и карбоксидобактерий СО, несмотря на значительное снижение скорости роста бактерий при больших концентрациях СО (ц составляла менее 0.1 ч"'), клетки не накапливали запасных продуктов в виде ПЗГБ.
Суммарное содержание липидов в биомассе также было постоянным. Однако в составе ЖК обнаружены изменения (таблица 3.7). При ингибировании СО в бактериях активизировался синтез насыщенных и циклопропановых кислот. Концентрация Сп-циклопропановой кислоты возрасталау А.еМгоркия и 5. сагЬохус1оИус1^епа до 4.9 и 9.5 % (таблица 3.7)
Таблица 3.7. Состав жирных кислот липидов бактерий под воздействием _ монооксида углерода_
Жирная кислота СО. % об.
A. eutrophus 0 10 20
12:0 Сл. Сл. Сл.
14:0 0.6±0.21 0.4±0.06 0.7±0.12
14:1 0.9±0.35 0.3±0.04 0.4±0.13
15:0 0.2±0.02 0.2±0.01 0.1±0.05
15:1 0.2±0.05 0.1±0.02 0.9±0.22
16:0 30.9±2.45 33.0±2.11 37.3±0.86
16:1 33.2±3.56 32.6±1.56 23.4±0.54
17:0 Сл. Сл. Сл.
С-С 17:0 1.7±0.88 0.5±0.32 4.9±0.63
18:0 1.4±0.71 1.1±0.54 5.2±1.03
18:1 30.7±2.89 29.8±1.82 26.2±1.55
С-С 19:0 Но. _ 2.0±0.54 0.9±0.07
Жирная кислота СО % об.
S. carboxydohvdrogena 0 10 20 30
14:0 0.6±0.12 Сл. Сл. Сл.
14:1 Сл. Сл. Сл. Сл.
15:0 0.3±0.02 0.5±0.14 0.4±0.22 0.7±0.21
15:1 0.8±0.10 Сл. Сл. Сл.
16:0 35.6±2.22 30.7±1.2 34.4±0.91 33.7±0.54
16:1 40.5±3.32 35.1±2.11 36.9±0.99 36.0±1.02
17:0 Сл. Сл. Сл. Сл.
С-С 17:0 2.2±0.56 8.1 ±2.22 9.5±0.81 9.5±0.71
18:0 1.1±0.53 2.7±0.34 2.2±0.54 1.8±0.бб
18:1 17.6±1.57 22.5±2.34 16.6±2.66 17.9±1.27
С-С 19:0 Но. 0.4±0.35 Сл. 0.4±0.28
и отмечался синтез С^-циклопропановой кислоты. На этом фоне содержание ненасыщенных ЖК снижалось. Соотношение насыщенных/ненасыщенных ЖК при ингибировании роста бактерий СО повышалось, у водородных бактерий от 0.55 до 0.96, у карбоксидобактерий - от 0.68 до 0.92 (таблица 3.6). Известно, что усиление синтеза циклопропановых и насыщенных жирных кислот у микроорганизмов обеспечивает определённую степень текучести и "жёсткости" мембраны, делают её более устойчивой к воздействию неблагоприятных факторов (Brock, 1967; Singleton, 1973).
Таким образом, показано, что под воздействием монооксида углерода в бактериях A. eutrophus и S. carboxydohydrogena повышается гидрогеназная активность, усиливаются синтез цитохромов, изменяется мембранный аппарат, возрастают траты на биосинтез энергетического субстрата, при этом белковая
"программа" синтеза внутриклеточных макромолекул не нарушается. Впервые обнаруженное явление циклизации и повышенная насыщенность липидов у водородных бактерий и карбоксидобактерий под воздействием СО, по всей видимости, направлены на защиту клеточных структур от повреждающего воздействия монооксида углерода.
3.4. Рост и метаболизм водородокисляющих микроорганизмов при дефиците в среде минеральных макроэлементов
Растущая микробная культура является многофакторной системой. Скорость роста и физиолого-биохимические свойства бактерий зависят не только от доступности и концентрации в среде источников энергии и углерода, но существенным образом определяются условиями минерального питания. Химические элементы влияют на динамику ферментативных реакций в клетках, обмен различных соединений и формообразовательные процессы. Изменение в среде соотношения C/N, как правило, очень значительно влияет на соотношение основных и запасных клеточных макромолекул, что является источником для получения разнообразных целевых продуктов биотехнологии.
Водородные бактерии А. eutrophus и карбоксидобактерии S. carboxydohydrogena на полной питательной среде синтезируют в основном азотсодержащие компоненты и в незначительных количествах - липиды и углеводы. В начальный период активного изучения водородных бактерий было показано, что при дефиците азота в среде в клетках усиливается синтез резервного соединения липидной природы - полимера 3-гидроксимасляной кислоты, концентрация которого может достигать высоких значений (до 70% от сухой биомассы) (Schlegel, Bartha, 1961). Было установлено, что синтез этого полимера - процесс менее энергоёмкий для клетки, нежели синтез белка (Gottshalk, 1964). Других сведений о взаимосвязи химического состава А. eutrophus и условий минерального питания к началу наших исследований получено не было.
В цикле работ были определены потребности культур А. eutrophus и S. carboxydohydrogena в макроэлементах, азоте, сере, фосфоре, калии и магнии, определены границы физиологического действия и исследовано, как влияет лимитирование роста клеток дефицитом этих элементов на метаболизм клеточных макромолекул.
Установлено, что снижение скорости роста бактерий при дефиците того или иного элемента происходит по-разному. Так, уменьшение удельной скорости роста бактерий от 0.4 (на полной минеральной среде) до 0.04-0.06 ч"1 получено при 40-50 %-й обеспеченности клеток азотом и 20 %-й серой и фосфором. Более низкие значения ц (0.02-0.03 ч"1) получены при 50 %-й обеспеченности клеток калием и 10 %-й магнием (таблица 3.8).
Рост бактерий при обеспеченности азотом на 50 % от потребности сопровождался снижением экономического коэффициента по водороду от 1.12 до 0.85 г/г. При этом внутриклеточная концентрации белка падала до 48 %; практически наполовину сократилось содержание в клетке большинства
аминокислот. Количество нуклеиновых кислот также снизилось от 10.0 до 6.3 %, а доля ПЗГБ возросла более чем в 10 раз (до 22 % от сухого веса). Параллельно с увеличением концентрации полимера в лимитированных по азоту клетках отмечено увеличение содержания липидов (на 70 % от исходной величины) и углеводов (на 100 % по сравнению с ростом на полной питательной среде).
Ограничение роста бактерий дефицитом серы также снижало эффективность использования бактериями водорода и влияло на химический состав. При 20 %-й обеспеченности клеток элементом экономический коэффициент по водороду составил 0.81 г/г. При этом сократилось содержание азотсодержащих компонентов в клетках; изменился аминокислотный состав белка. Очень значительно, до 33.2 %, возросла концентрация в клетках полимера. Лимитирование роста водородных бактерий по фосфору также снижало эффективность использования культурой энергии окисления водорода. При обеспеченности клеток фосфором на 18 % от установленной потребности экономический коэффициент по водороду составлял около 63 % от исходной величины.
Таблица 3.8. Физиолого-биохимические показатели культур бактерий при лимитировании роста минеральными элементами
Б™ м. % от Химический состав, % сухого веса
Элемент %от Ут, г/г Белок Углево | Лили- 1 РНК+ ПЗГБ
потреб- исходной ды ! ДЫ ДНК
ности
А. еЫгоркия 7Л
N 100 100 1.12 76.1 7.5 5.2 10.0 0.1
75 80 1.23 60.0 13.8 7.6 - 10.9
50 30 0.85 48.0 16.7 8.7 6.3 22.0
Б 100 100 1.13 76.1 7.4 6.6 12.0 0.1
40 60 1.12 73.1 7.2 5.9 - 0.5
20 35 0.81 49.5 6.0 4.1 5.0 33.2
Р 100 100 1.08 76.2 7.5 6.9 12.5 0.2
35 40 0.82 73.6 7.3 5.7 - 0.2
20 20 0.69 56.4 9.3 5.1 5.9 23.0
К 100 100 1.12 76.7 7.0 4.0 12.3 0.2
80 60 0.98 71.1 7.5 4.3 - 5.3
50 10 0.54 59.2 10.1 5.4 10.0 15.5
100 100 1.29 78.0 6.6 6.0 12.0 0.3
50 80 1.26 72.5 5.4 5.8 - 2.1
10 15 0.78 63.6 6.4 5 0 11.5 14.6
5. сагЬохуёокуЛ-ояепа 21062
Контроль N 100 50 100 25 1.75 0.87 75.0 56.0 2.7 4.9 6.0 7.6 10.9 6.4 Сл 9.6
5 20 28 0.86 38.1 10.0 6.0 4.4 28.3
Р 40 23 0 66 61.0 4.8 9.1 7.8 1.5
Недостаток фосфора ограничивал синтез белка и нуклеиновых кислот в 1.3 и 2.2 раза, соответственно. Торможение синтеза азотсодержащих компонентов в клетках приводило к компенсаторному увеличению запасных веществ. Концентрации ПЗГБ и углеводов возросли от 0.2 до 23 % и от 7.5 до 9.3 %, соответственно. При дефиците магния в среде у водородных бактерий также отмечено падение экономического коэффициента по водороду и перераспределение внутриклеточных макромолекул в сторону образования в клетках запасного энергетического материала - ПЗГБ. Однако снижение было менее значимым, чем при дефиците в среде серы или фосфора. Максимальное увеличение полимера составило 14.65 % от сухого веса. Изменение концентрации калия в питательной среде резко тормозило рост водородных бактерий, но в значительно меньшей степени нарушало химическую "программу" синтеза макромолекул. Незначительно (в 1.2 раза) падало внутриклеточное содержание нуклеиновых кислот и белка. Параллельно в клетках возросло содержание ПЗГБ (до 15 %) и незначительно - углеводов.
Химический состав карбоксидобактерий 5. сагЬ охус1окус1го«е па исследован при ограничении роста дефицитом в среде азота, серы и фосфора. Снижение удельной скорости роста бактерий до 0.08-0.10 ч"1 и экономического коэффициента по водороду в 2 раза, по сравнению с таковой на полной питательной среде, наступало при различной обеспеченности элементами: на 40-50 % азотом и фосфором и на 20 % серой (таблица 3.8). На этом фоне десятикратно увеличивалось содержание в клетках ПЗГБ; несколько ниже, на 25 %, возрастало содержание липидов. При дефиците серы в среде изменения в метаболизме карбоксидобактерий были более выраженными, на фоне падения содержания белка, в 2 раза возрастало содержание углеводов и весьма существенно, до 28.3 %, ПЗГБ. При лимитировании роста карбоксидобактерий дефицитом фосфора направленность в перераспределении клеточных макромолекул была аналогичной, но количественно выражена в меньшей степени.
Лимитирование роста минеральными элементами существенно влияло на метаболизм ЖК липидов водородных бактерий и карбоксидобактерий (таблица 3.9; 3.10). Снижение подачи азота в культуру до 50 % от потребности клеток приводило к ограничению синтеза ненасыщенных кислот, что сопровождалось усилением синтеза соответствующих циклопропановых кислот. Относительное содержание насыщенных кислот, в основном 16:0, также возрастало. При лимитировании роста водородных бактерий по сере отмечены те же изменения в спектре жирных кислот, что и при азотном лимите, но выраженные более ярко. Дефицит в среде фосфора и магния мало влиял на соотношение жирных кислот липидов водородных бактерий. Недостаток калия же вызвал существенную перестройку в жирнокислотном спектре. Значительно увеличилась доля короткоцепочечных кислот (12:0, и-14:0, 15:0) и 18:1со7, снизилось относительное содержание кислот С16 ряда, как насыщенной, так и моноеновой. При всех видах лимитирования увеличивалось отношение насыщенных кислот к ненасыщенным по сравнению с контролем.
Некоторое повышение соотношеня насыщенных к ненасыщенным ЖК было отмечено и в липидах карбоксидобактерий при лимитировании роста по азоту, фосфору и сере (таблица 3.10). Нужно отметить, что все эксперименты по влиянию лимита биогенных элементов на рост карбоксидобактерий проводили в отсутствии СО, что отразилось на более низком уровне циклопропановых кислот по сравнению с выше приведенными результатами. Выращивание бактерий в условиях лимига несколько стимулировало синтез этих кислот и их доля возрастала до 4 % (в контроле - 2.1%).
Таблица 3.9. Состав жирных кислот липидов водородных бактерий Д. еШгорка при лимитировании роста дефицитом минеральных макроэлементов
(% от суммы ЖК)
Полная Лимитирующий элемент (% от потреоности)
Жирная среда К Р N в
кислота (30) (10) (20) (50) (20)
12:0 1.2±0.6 4.5±1.1 0.2±0.1 0.4±0.2 0.1±0.1 0.4±0.1
и-14:0 0.7±0.5 2.6±0.8 2.1±0.8 0.1 ±0.1 2.3±0.6 0.6+0.2
14:0 0.3±0.2 0.4±0.1 0.2±0.1 0.2±0.1 0.2±0.1 0.7±0.4
14:1 0.7±0.5 0.5±0.3 0.4±0.2 1.2±0.4 0.2±0.1 0.7±0.3
15:0 0.7±0.4 7.7±1.4 0.1±0.1 0.1±0.1 0.1±0.1 0.4±0.2
16:0 32.9±1.1 24.3±2.2 35.7±1.6 44.5±2.2 46.1±1.1 38.6±0.8
16:1 32.5±1.0 11.7±0.9 29.6±0.9 22.7±1.8 19.7±2.1_ 29.7±1.1
17:0 0.2±0.1 0.1±0.0 0.2±0.1 0.1 ±0.1 0.1±0.1 0.1±0.1
2.8±0.6 4.2±0.5 2.5±1.3 4.3±0.6 15.9±2.2 8.5±1.2
18:0 1.2±0.4 1.2±0.3 0.7±0.2 1.9±0 5 0.5±0.3 О.9±0.3
18:1 27.4±0.8 39.6±1.1 28.3±1.4 24.5±1.6 13.8±1.6 19.6±1.2
Но. 2.1±0.3 Но. И.о. 1.0±0.6 Но.
1насыщ. 0.65 0.93 0.71 1.06 1.97 1.00
Хненасьпц..
Таблица 3.10. Состав жирных кислот липидов карбоксидобактерий при лимитировании роста минеральными элементами (% от суммы ЖК)
Жирная кислота Контроль Лимтирующий элемент
N Р 5
12:0 Сл. Сл. Сл. Сл.
14:0 1.0±0.2 Сл. Сл. 0.4±0.2
14:1 0.4±0.1 Сл. Сл. Сл.
15:0 0.5±0.3 Сл. Сл. Сл.
15:1 0.5±0.1 0.9±0.4 1.5±0.6 0.1±0.0
16:0 26.2±2.3 39.0±2.7 38.5±2.8 38.9±1.5
16:1 28.1±3.4 35.0±3.1 43.7±3.4 39.3±2.3
17:0 Сл. 0.1±0.1 Сл. 0.1±0.1
С-С170 2.1±1.1 4.2±0.5 4.1±1.3 2.6±2.4
18:0 3.6±0.5 Сл. Сл. Сл.
18:1 37.2±2.2 20.8±1.5 12.2±2.2 18.6±1.7
Хнасыщ. Хненасьпц. 0.50 0.65 0.63 0.72
Таким образом, установлен характер ответа культур водородокисляющих бактерий и карбоксидобактерий на неоптимальные условия выращивания. В зависимости от типа воздействия реакция была разной. Вариации всех исследованных параметров среды приводили к соответствующим адаптивным изменениям в составе жирных кислот липидов бактерий. Отклонения от оптимальных значений (температуры, pH) среды и присутствие ингибитора роста (СО) не вызывали существенных перестроек конструктивного метаболизма; в этих условиях сохранялась высокая белок-синтезирующая активность. Воздействие неоптимальных концентраций компонентов газового субстрата (С02 и Н2), а также 02 практически не затрагивало программу синтеза основных и запасных клеточных компонентов. При лимитировании роста бактерий минеральными макроэлементами происходило перераспределение в составе клеточных макромолекул: на фоне снижения концентрации основных (азотсодержащих) компонентов отмечено усиление синтеза резервных макромолекул - соединений липидной природы - полигидроксиалканоатов.
3.5. Влияние условий культивирования и состава питательной среды на синтез ПГА светящимися бактериями
Из анализа литературы известно, что для большинства охарактеризованных к настоящему времени продуцентов ПГА, за исключением Alcaligenes latus, значительное накопление полимера имеет место при несбалансированном росте. В отношении светящихся бактерий такая информация отсутствует. Поэтому для нахождения условий, стимулирующих аккумуляцию ПГА в Ph. leiognathi, в ходе выращивания бактерий варьировали параметры среды, включая концентрацию пептона (от 0.5 до 15 г/л), обеспеченность культуры азотом, наличие дополнительного источника углерода (глицерин или глюкоза), соленость среды.
Увеличение концентрации пептона с 0.5 до 1.0 г/л на среде с глицерином значительно повысило урожай биомассы бактерий в культуре и также положительно влияло на выход полимера, содержание которого в биомассе достигало 42.5 % (таблица 3.11). При повышении концентрации пептона в среде до 5 г/л (азота, соответственно, до 375 мг/л) урожай бактерий вырос до 920 мг/л, однако концентрация полимера снизилась до 22.2 %. При внесении азота в среду в форме (NH4)2HP04 (0.5 г/л) синтез полимера резко падал (до 3.7 %). Это позволяет сделать вывод о том, что для стимулирования синтеза ПГА следует ограничивать рост светящихся бактерий дефицитом азота.
Варьирование источников углеродного питания не дало положительного эффекта: концентрация пептона 15 г/л ингибировала рост бактерий и синтез ПГА; замена глицерина глюкозой, независимо от концентрации пептона в среде, не стимулировала рост бактерий и также негативно влияла на синтез полимера. Снижение солености среды, а именно уменьшение концентрации хлорида натрия до 1% (для данного вида принято 3 %), негативно влияло на урожай, синтез полимера и свечение культуры.
Таблица 3.11. Выходы и состав ПГА в культуре Рк Ыо%паМ 208, в
зависимости от условий культивирования
Пептон, г/л Источник углерода ПГА, % сухого веса Урожай биомассы, г/л Выход ПГА, г/л Состав ПГА, мол. %
0.5 Глюкоза 9.6% 0.13 0.01 3ГБ - 100%; ЗГВ - следы
1 Глюкоза 17.5% 0.30 0.05 3ГБ-99.9%; ЗГВ-0.1%
5 Глюкоза 7.8% 0.92 0.07 3ГБ - 98.3%; ЗГВ - 1.2%; ЗГТ* - 0.5%
15 Глюкоза 0.7% 0.31 0.002 3ГБ-100%
0.5 I 'лицерин 37.7% 0.10 0.04 3ГБ - 99.3%; ЗГВ - 0.4%; ЗГГ - 0.3%
1 Глицерин 42.5% 0.23 0.10 3ГБ - 99.5%; ЗГВ - 0.2%; ЗГГ - 0.3%
5 Глицерин 22.2% 0.92 0.20 3ГБ - 100%, ЗГВ - Сл.; ЗГГ - Сл.
15 Глицерин 2.75% 0.58 0.02 |ЗГБ — 100%
*- ЗГТ - 3-гидроксигексаноат
Таким образом, наибольшие выходы ПГА (37-42%) в культуре Рк Шо%пмЫ 208 получены на среде с пептоном (0.5-1.0 г/л) и глицерином (3 г/л), однако, при сравнительно низком урожае биомассы, что являлось следствием специфичности процесса синтеза ПГА, активно протекающего только при несбалансированном росте микроорганизмов. Следует отметить, что результаты были получены для физиологически неактивных штаммов, в основном хранившихся в музее. Последующее культивирование этих организмов с многократными пересевами, вероятно, позволит повысить физиологическую активность и получить более продуктивные по выходу ПГА штаммы.
Полимер, синтезированный культурой Рк Ыо%пШЫ 208 на среде, содержащей в качестве углеродного субстрата пептон и глицерин (или глюкозу), в отсутствие индуцирующих синтез гетерополимерных ПГА добавок углеводородных кислот (валерата, гексаноата и т.д.), содержал в качестве минорных включений мономеры ЗГВ и ЗГГ (таблица 3.13). Это позволяет рассматривать данный штамм не только в качестве потенциального продуцента гомогенного поли-3-гидроксибутирата, но также и многокомпонентных ПГА. Эти положительные результаты послужили основанием для развития исследований светящихся бактерий в качестве продуцента ПГА.
В культуру были введены еще 7 штаммов светящихся бактерий, представители Рк 1е\о&шМ, V. Иатеуг, V. /исИеп и Рк рИозрИогеит, (таблица 3.12), отобранные после анализа содержания в них ПГА на плотных средах и наиболее продуктивные по синтезу полимера. На среде с пептоном и глицерином (5 и 3 г/л, соответственно), все штаммы показали значительное увеличение внутриклеточной концентрации ПГА, за исключением V. рскеп и Рк рИасркогеит, периодические культуры которых накапливали ПГА на уровне эксперимента на плотных средах. Наибольшие выходы полимера зарегистрированы у Рк при этом у штаммов №№ 543 и 683 - весьма
значительные, 47.1 и 71.0 %. Анализ масс-спектров показал, что ПГА, синтезированные штаммами Рк Ыо&шМ 208, 543 и 683, а также V. кап'еуч 72, были многокомпонентными и содержали в качестве доминантного мономера 3ГБ и минорные включения ЗГВ и ЗГГ.
Таблица 3.12. Продукция ПГА светящимися бактериями при периодическом культивировании (5 т/л пептона и 3 г/л глицерина в среде)
Вид Штам M Содержание ПГА, % сухого веса Выход ПГА, г/л Состав ПГА, мол. %
Photobacterium leiognathi 208 22.2 0.20 3ГБ -100%; ЗГВ - Сл.; ЗГГ - Сл
307 0.2 <0.001 3ГБ-100%
543 47.1 0.62 3ГБ -99.8%; ЗГВ-0 2%
683 71.0 1.36 3ГБ - 99.3%; ЗГВ - 0.5%; ЗГГ -0.2%
Photobacterium phosphoreum 1856 5.1 0.014 3ГБ- 100%
1883 1.3 <0.002 3ГБ-100%
Vibrio fischeri 1231 0.4 0.003 3ГБ-100%
Vibrio harveyi 72 12.3 0.20 31Ъ - 99.2%; ЗГВ - 0.4%; ЗГГ -0.4%
Полученные результаты позволяют положительно оценить светящиеся бактерии в качестве продуцента ПГА. Выделены наиболее продуктивные штаммы и определены условия, обеспечивающие достаточно высокие выходы полимера в периодической культуре. Обнаружена способность представителей Ph. leiognathi и V. harveyi синтезировать двух- и трехкомпонентные полимеры, что является значимым для биотехнологии ПГА.
3.6. Влияние состава питательной среды на выходы ПГА у цианобактерий
Исключение азота из состава питательной среды и внесение дополнительного источника углерода, ацетата натрия в концентрации 8.2 г/л способствовало более высокой аккумуляции ПГА в клетках некоторых цианобактерий (Panda et al., 2006; Sharma et al., 2005; 2007), но незначительно влияло не выход полимера у изученных нами штаммов (таблица 3.13).
Таблица 3.13. - Содержание ПГА в цианобактериях при исключении из среды азота (% от сухой биомассы)
ACCS019 6.6
ACCS022
Но.
ACCS029 Н.о.
ACCS039
ТбТ
ACCS053 ~0/7
ACCS051 0.2
ACCS060 OÜ5
У нескольких штаммов в этих условиях синтез ПГА активизировался наиболее значительно у Chroococcus limneticus (ACCS019), в клетках которого наблюдали увеличение ПГА почти в 10 раз по сравнению с контролем (с 0.7 до 6.6 %). У других штаммов, Trichomas variabilis (ACCS039) - в 8 раз (с 0.075 до 0.63 %); у Nostoc spongiaeforme (ACCS053) - в 14 раз (0.05 до 0.7 %). При этом у Trichormus variabilis (ACCS060) содержание ПГА уменьшилось с 0.21 до 0.05% при добавлении ацетата.
Следует отметить, что все штаммы, оцененные на способность аккумулировать ПГА в специальных условиях, за исключением Chroococcus
limneticus (ACCS019), для которого получены самые высокие выходы ПГА, являются азотфиксирующими. Вследствие этого, очевидно, что в проведенных экспериментах данные штаммы не были лимитированы по азоту, хотя этот элемент отсутствовал в среде. Поэтому следует сделать вывод о том, что изученные штаммы цианобактерий не пригодны для биотехнологического использования в связи с низким содержание ПГА. Возможно, дальнейшее культивирование цианобактерий при варьировании условий среды позволит
получить более значимые результаты.
Таким образом, в результате проведенных исследований можно заключить, что только светящиеся бактерии и в еще большей степени -водородокисляютцие прокариоты, отвечают критериям отбора, предъявляемым к эффективным продуцентам ПГА.
4. Закономерности синтеза ПГА в культурах прокариотических микроорганизмов как научная основа для разработки и реализации эффективной биотехнологии получения целевого продукта биотехнологии - разрушаемых биополимеров
В связи с тем, что ПГА синтезируются микроорганизмами (за исключением Alcaligenes latus) только в условиях несбалансированного роста, а также служат субстратом эндогенного дыхания, то есть подвержены эндогенной деградации, получение высоких выходов полимеров в медленно растущих культурах проблематично. Для выявления условий, обеспечивающих формирование внутриклеточного депо резервных макромолекул с максимальными выходами ПГА, необходим массив данных об этом процессе, начиная от самых ранних этапов синтеза и накопления ПГА в клетках до процесса эндогенной деградации полимера.
4.1. Влияние внутриклеточного пула ИГА на физиолого-биохимические характеристики бактерий Ralstonia eutropha и рост в неоптимальных условиях среды
Для выявления взаимосвязи между физиологическим состоянием бактерий R. eutropha, внутриклеточным пулом полимера 3-гидроксимасляной кислоты (ПЗГБ) и активностью ключевых ферментов клеточного цикла ПЗГБ, проведена серия экспериментов. Планировалось получение ответа на следующие вопросы: 1) как изменяются внутриклеточное содержание ПЗГБ, размеры клеток и количество гранул в них в различные фазы роста культуры; 2) как при этом изменяется физиологическая активность клеток, включая активность ферментов цикла ПЗГБ, 3) каково протектирующее значение внутриклеточного пула ПЗГБ для роста бактерий в экстремальных условиях?
На рис. 4.1 представлены характеристики культуры R. eutropha В5786, в режиме накопления полимера при дефиците азота в среде в периодическом автотрофном режиме. Анализ внутриклеточного содержания ПЗГБ у музейной культуры, хранящейся на скошенной агаризованной минеральной среде при
5 "С, показал, что пул полимера в клетках не превышал 6-9 % от сухого веса. Таким образом, питательную среду инокулнровали клетками с содержанием полимера ниже 10 %. Спустя 8-10 ч от засева среды содержание ПЗГБ в клетках снижалось до следовых количеств (проба I); клетки гранул полимера не содержали (рис. 4.2).
В течение последующих 30-40 ч происходило увеличение концентрации клеток в культуре и внутриклеточного содержания в них ПЗГБ; в клетках были отчетливо видны гранулы диаметром 0.2-0.4 мкм в количестве от 2 до 8 на клетку. К середине линейной фазы роста культуры (проба II) содержание полимера в клетках достигло порядка 50 %, размеры гранул составило 0.5 мкм; а в стационарной фазе содержание полимера достигло 86.0 % (проба III). Клетки в культуре равномерно и практически полностью были заполнены гранулами полимера, диаметр которых достигал 0.6 мкм, а их количество зависело от размера клетки и составляло до 12 и более на клетку. Концентрация белка в клетках при этом составляла лишь 8.1 %. При переходе культуры из стационарной фазы в фазу отрицательного роста происходило сокращение внутриклеточного пула полимера; к концу наблюдаемого периода (проба IV) концентрация ПЗГБ в клетках сократилась практически в 4 раза, до 19.3 %, а концентрация белка при этом возросла до 39.8 %. Содержание общих липидов в бактериях при этом существенно не менялось, варьируя в пределах 7-8 %.
Выше (раздел 1.1) было показано, что при росте на полной среде в липидах бактерий К еМгорИа доминировали моноеновые и насыщенные кислоты, при этом содержание циклопропановых кислот невелико (не более
in
Рис. 4.1. Накопление биомассы (1),полимера (2) (а) и активность ферментов сшггеза (б) (3 - /?-кетотиолаза, 4 - ацетоацетил-КоА-редуктаза, 5 - ПЗГБ-синтаза) и впутриклеточной деградации (в) (6 -гидроксибутиратдегидрогеназа, 7 - ПЗГБ-делолимераза) ПЗГБ R. eutropha В5786 в автотрофных условиях: I - лаг-фаза (4 ч), I] -линейная фаза (40 ч), III - стационарная фаза (72 ч), IV - фаза деградации полимера (104 ч)
0 4%). При неблагоприятных условиях выращивания состав ЖК липидов водородных бактерий в той или иной мере перестраивался, но характер этих изменений, как правило, однонаправлен, - на фоне снижения содержания ненасыщенных жирных кислот наблюдалось увеличение содержания насыщенных и циклопропановых кислот.
В режиме синтеза и аккумуляции клетками ПГА при дефиците азота основные изменения в составе ЖК связаны с уменьшением относительного содержания 1б:1со7 (с 27.8 до 10.5 %) на фоне увеличения С„ -циклопропановой кислоты (с 0.9 до 21.6 %). Отмечено также усиление циклизации другой моноеновой кислоты - 18:1ш7. Относительное содержание С19-Циклопропановой кислоты увеличивалось от следовых значении до 2.8 /о (таблица 4 1) При этом содержание в липидах основной насыщенной кислоты -16 0 - мало менялось. Соотношение насыщенных к ненасыщенным ЖК увеличилось более чем в 2 раза, в основном за счет циклизации моноеновых кислот Как известно, при неблагоприятных условиях роста, моноеновые кислоты количественно конвертируются в циклопропановые кислоты под контролем циклопропансинтазы, использующей в качестве субстратов ЖК-остатки, ацилирующие фосфолипиды цитоплазматических мембран грамотрицательных бактерий (Сгоцап, Сгопап, 1997).
Микроскопические исследования клеток, находящихся в различных фазах роста периодической культуры, выявили возникновение размерной гетерогенности в популяции, проявляющееся по-разному в зависимости от возраста культуры и концентрации ПЗГБ в клетках (рис.4.2). В суточной культуре Я егИгор/га. практически не содержащей полимера, доминировали (9-> % от общего числа клеток) морфологические однородные клетки длиной (Ь) от 1.0 до 3.0 мкм; в середине линейной фазы роста, при увеличении концентрации ПЗГБ до 45-50 %, доля клеток с нарушенным делением длиной до 4 мкм составила 34 % от общего числа; кроме того, в популяции зафиксированы и более длинные клетки - 6 мкм. С наступлением стационарной фазы культуры в популяции доминировали клетки с нарушенным делением (64 %); среди них клетки длиной до 4 мкм составили 42 %■ длиной от 5 до 10 мкм - 20 %; в единичных количествах в популяции встречались гигантские клетки длиной 20-30 мкм. Однако при переходе культуры из стационарной фазы в фазу отрицательного роста, где содержание полимера падало, отмечено перераспределение особей в популяции и возвращение соотношения клеток по размерам к состоянию, характерному для начальной культуры.
В популяции, находящейся в фазе отрицательного роста и активно деградирующей полимер (проба IV), зафиксирована выраженная гетерогенность клеток не только по размерам, но и по содержанию гранул в них Среди клеток присутствовали особи (около 15 %) с множественными крупными гранулами диаметром 0.5-0.6 мкм. Однако в большей части клеток популяции, деградирующей полимер, количество гранул и их размеры уменьшились (до 0.2-0.3 мкм). Отмечено также наличие особей с единичными мелкими гранулами, а также клеток, практически лишенных
пула ГТЗГБ. Это является свидетельством того, что полимер разрушался, однако не в одинаковой степени в отдельных клетках. Размеры основной массы клеток в культуре при этом уменьшились до 2.5-3.0 мкм. Этими экспериментами впервые представлены доказательства обратимости физиологического состояния неделящихся клеток, практически полностью заполненных гранулами полимера, то есть возможности их перехода в результате деградации и усвоения ПЗГБ к активному физиологическому состоянию, для которого характерны размеры клеток от 1-2 до 3-4 мкм.
Рис. 4.2. РЭМ фотографии клеток Я. еШгорИа В5786 из различных фаз роста периодической культуры в период накопления ПЗГБ в автотрофных условиях: а - 4-часовая культура, клетки без полимера (проба I); б- 10-часовая культура, ПЗГБ -26 % (начало линейной фазы); в -40-часовая культура, ПЗГБ - 54% (середина линейной фазы, проба II); г - 72-часовая культура, ПЗГБ - 86 %; РЭМ фотография гигантской клетки (1) и нормальной клетки (2) (д) и фрагмент гитантской клетки (е) Н. еи&орка В5786 из стационарной фазы роста; гетерогенная по размерам клеток и гранул в них кулыура из фазы деградации полимера (104-часовая культура, проба IV)
Полагают, что метаболизм ПГА носит циклический характер, при этом синтез и биодеградация полимера происходят в клетках одновременно (Оси й а1.,1990; ТшсП е1 а]., 1995). Однако прямых доказательств течения процессов внутриклеточной деградации полимера в литературе до настоящих исследований представлено не было, не была также описана динамика активности ПГА-деполимеризующих ферментов. Трудности определения активности внутриклеточных ПГА-деполимераз микроорганизмов связаны с тем, что эти ферменты могут взаимодействовать только с некристаллизованным полимером, находящимся внутри клеток. Однако, как только полимер извлекается из клеток, начинается процесс его кристаллизации, он становится недоступным для атаки фермента.
Таблица 4.1
Состав жирных кислот липидов бактерий Я еШгорка В5786 при различных режимах выращивания
Жирная кислота Накопление ПГА (лимит по азоту + СО) Время от начала культивирования (ч) 12 2 4 3 6 40 60 70 Накопление ПГА (лимит по азоту без СО) Время от начала культивирования (ч) 12 2 4 3 6 4 8 60 70 Инг. СО Лимит азота
10:0 0.32 0.04 0.04 0.08 0.04 0.05 0.18 0.03 0.04 Сл. 0.03 0.01 Сл. Сл.
12:0 0.19 0.08 0.03 0.09 0.14 0.16 0.15 0.04 0.05 0.03 0.04 0.01 Сл. 0.10
13:0 0.18 0.03 0.06 0.09 0.04 0.10 0.04 0.03 0.02 Сл. 0.02 Сл. Сл. 2.30
и-14:0 0.07 0.04 0.06 0.09 0.09 0.14 0.04 0.05 0.09 0.07 0.10 0.07 Сл. Сл.
14:1 0.10 0.04 0.03 Сл. Сл. Сл. 0.06 0.02 0.02 0.01 Сл. Сл. 0.40 0.20
14:0 2.71 1.28 1.04 1.79 2.28 2.24 1.89 0.91 0.95 0.80 1.02 0.71 0.07 0.20
аи-15:0 0.16 0.24 0.28 0.47 0.50 0.69 0.15 0.63 1.05 0.94 2.34 1.82 Сл. Сл.
и-15.0 0.21 0.11 0.14 0.10 0.15 0.13 0.24 0.31 0.39 0.31 0.57 0.39 Сл. Сл.
15:0 0.20 0.09 0.09 0.14 0.17 0.21 0.12 0.05 0.07 0.07 0.07 0.06 1.00 0.10
и-16:0 0.16 Сл. 0.15 0.26 0.19 0.28 0.16 0.28 0.38 0.41 0.77 0.74 Сл. Сл.
1б:1ш7 29.03 28.31 20.50 12.81 9.48 7.50 27.77 27.50 27.49 23.43 17.42 10.49 24.10* 19.70*
16:1м9 1.31 1.13 2.32 0.54 0.88 0.67 1.0 0.62 0.92 0.73 0.22 0.57
16:0 46.69 46.14 47.68 58.45 58.54 61.32 42.04 38.72 37.79 40.17 40.01 37.37 38.10 46.10
17:1ш 8 0.29 0.20 0.28 0.45 0.48 0.61 1.45* 1.06* 0.90* 1.17* 0.35* 0.24 Сл. Сл.
17:1(а11 0.87 0.83 0.46 1.81 Сл. 2.20 Сл. Сл.
С-Сп:0 1.29 1.73 5.50 2.81 10.00 4.27 0.89 0.87 1.64 1.03 13.02 21.63 4.90 15.90
17:0 0.10 0.06 0.04 0.10 0.07 0.06 0.09 0.08 0.12 0.08 0.06 0.09 Сл. 0.10
18:1(о7 14.86 18.70 20.28 19.07 15.38 18.22 22.56 27.70 27.19 28.74 22.19 22.25 26.20 13.80
18:0 1.16 0.84 0.65 0.64 0.60 0.69 1.17 0.92 0.72 0.92 0.55 0.73 5.20 0.50
с-Сщ-о 0.06 0.13 0.38 0.21 0.79 0.45 И.о. 0.18 0.18 1.09 1.22 2.83 Сл. 1.0
Хиасыщ. 53.54 50.79 56.13 65.32 73.78 70.8 47.18 43.10 44.48 47.09 59.82 66.45 49.47 66.3
Еиечасыщ. 46.46 49.21 43.87 34.68 26.22 29.2 52.84 56.90 56.52 52.91 40.18 33.55 50.0 33.7
Хнасыщ. Хненасыщ. 1.15 1.03 1.28 1.88 2.81 2.42 0.89 0.76 0.79 0.89 1.49 1.98 0.97 1.97
* - сумма изомеров
В данной работе активность ключевых ферментов клеточного цикла ПГА впервые исследована в динамике в культуре бактерий R. eutropha, находящейся в режиме синтеза ПГА, от первых часов активизации этого процесса в клетках до поздней стационарной фазы и фазы отмирания, когда в клетке доминирует процесс биораспада и эндогенной утилизации ПГА (рис. 4.1). Динамика активности ферментов, участвующих в синтезе полимера, представлена на рис. 4.16. Наиболее высокая активность всех ферментов зафиксирована в течение первых 15-20 ч культивирования бактерий при минимальной концентрации полимера и наиболее высоких значениях удельной скорости роста клеток. Активность ß-KT составляла 3.57-4.26, АА-КоА-редуктазы - 0.98-1.23, ПЗГБ-синтазы - 0.08-0.10 Е. По мере увеличения содержания внутриклеточного сополимера, несмотря на положительную динамику скоростей синтеза ПЗГБ, зарегистрировано снижение активности ферментов. К концу первого этапа культивирования активности ß-KT, АА-КоА-редуктазы и ПГБ-синтазы снизились до 1.29-1.34, 0.66-1.13, 0.009-0.015 Е, соответственно. Далее, на фоне увеличения пула ПЗГБ активность АА-КоА-редуктазы и ПГБ-синтазы стабилизировалась на достигнутом уровне, а для /?-КТ (катализирующей первый эта л синтеза и последний этап эндогенной деградации ПЗГБ) отмечена тенденция к некоторому снижению активности в последние 20-25 ч.
Для анализа ферментов деполимеризующей ветви клеточного цикла ПЗГБ измерены активности ПЗГБ-деполимеразы и ЗГБ-дегидрогеназы в разных фазах. Деполимеразная активность, измеренная в реакции автогидролиза выделенных из клеток R. eutropha В 5786 нативных гранул полимера, колебалась в ходе опыта от 0 до 0.0057 мг/мин (рис. 4.1 в). Наибольшей автогидролизной активностью обладали гранулы, выделенные из клеток 5-25-ти часовой культуры с наименьшим содержанием полимера. Далее активность ПГБ-деполимеразы падала. Саморазрушения гранул, выделенных из клеток с высоким содержанием полимера (свыше 50-60 %), не наблюдали. Это позволяет говорить о низкой деполимеразной активности клеток в стадии активной аккумуляции полимера. Подтверждением этому служат результаты измерения активности другого фермента, участвующего в эндогенной деградации ПЗГБ, - ЗГБ-дегидрогеназы. Наибольшая активность ЗГБ-дегидрогеназы (0.18-0.22 Е) также зафиксирована в первые часы опыта, когда была относительно высока активность ПЗГБ-деполимеразы. В процессе активного синтеза ПЗГБ активность ЗГБ-дегидрогеназы длительное время (около 40-50 ч) составляла около 0.06-0.10 Е, однако к концу опыта упала до 0.01-0.03 Е. Зарегистрированный уровень удельной активности ферментов синтеза ПЗГБ сопоставим с имеющимися данными для R. eutropha, измеренными в период максимального накопления полимера. Так, при разовых замерах по данным ряда авторов получены величины активности для ß-KT от 0.3-1.8 до 2.5-18.8 Е (Haywood et al., 1988а; Jung et al., 2000); для АА-КоА-редуктазы - от 0.18-0.31 до 1.18-2.24 Е (Senior, Dawes, 1973; Haywood et al., 1988b; Schubert et al., 1988; Jung et al., 2000), a
ПЗГБ-синтазы - от 0.04 до 0.76 Е (Haywood et al., 1989; Jung et al., 2000;
Valentin, Steinbüchel, 1994).
Нельзя не отметить, что выявление закономерностей эндогенной деградации ПГА представляет один из ключевых фундаментальных вопросов в понимании организации и функционировании цикла этих макромолекул и имеет важное практическое значение, поскольку соотношение процессов аккумуляции и деградации полимера в клетке в конечном счете определяет выход полимера и его свойства, главным образом, характеристики молекулярной массы, степени полимеризуемости и полидисперсности. Несмотря на очевидную важность вопроса, анализ литературы показал практически полное отсутствие публикаций по этой теме.
Были проведены специальные эксперименты, в ходе которых бактерии выращивали в режиме, позволяющем моделировать условия для внутриклеточных процессов: «синтез-деструкция-ресинтез» полимера. Для анализа путей синтеза и миграции продуктов распада полимера использовали меченый углеродный субстрат в виде 1,2-14С-ацетата. Эксперимент продолжался 256 ч: с 24 ч по 135 ч - в режиме аккумуляции полимера на среде с дефицитом азота; на 136 ч была сделана добавка в культуру азота, и в течение 2.5 суток культура находилась в режиме деградации полимера и синтеза азотсодержащих соединений; по исчерпании азота из среды далее, еще в течение 2 суток, происходило снижение содержания основных макромолекул на фоне ресинтеза полимера. Проанализированы исходная радиоактивность среды, скорость включения метки клетками и динамика радиоактивности в общей биомассе, а также распределение метки во фракциях: липидах, полимере и в «активной» части биомассы (вся биомасса минус полимер и липиды) (рис.4.3). В биомассе определяли содержание общих липидов, полимера и общего азота. В эксперименте с ацетатом в качестве основного субстрата, после добавки 14С-метки в среду (0.02 мкКю/мл) через 2 ч более 80 % радиоактивности включилось в биомассу. В первые часы после добавления метки активность была зафиксирована во всех анализируемых фракциях: около 40-50 % метки включилось в полимер, столько же - во фракцию азотсодержащих компонентов и около 2-4 % - в липиды. В течение последующих 112 ч бактерии культивировали в режиме аккумуляции полимера (его концентрация возросла с 50 до 80 %) на фоне падения азотсодержащих макромолекул (от 6.0 до 2.0 %). Удельная радиоактивность биомассы в период накопления полимера оставалась практически на одном уровне (1 400-1 600 имп/мин/мг). Динамика удельной радиоактивности полимера повторяла динамику таковой биомассы -наибольшая активность зафиксирована в период аккумуляции полимера (от 700-1600 имп/мин/мг полимера). Максимальная удельная активность фракции азотсодержащих соединений также зарегистрирована в этот период (8 000-15 000 имп/мин/мг), а удельная радиоактивность фракции липидов колебалась в пределах 700-2000 имп/мин/мг. Распределение метки в период максимального накопления полимера было аналогичной начальному периоду.
После добавления азота в среду (период деградации полимера) в течение 74 ч произошло сокращение полимерного пула более чем в 2 раза (с 80-88 до 35 %) на фоне активизации синтеза азотсодержащих соединений (концентрация общего азота составила 4.5 %). При этом по мере прироста общей биомассы произошло разбавление удельной радиоактивности в 2-3 раза, до 400-500 имп/мин/мг. Аналогичная динамика была характерна для полимера и липидов; в период деградации полимера зарегистрированы минимальные значения радиоактивности (около 300). Удельная радиоактивность фракции азотсодержащих соединений упала до 300-400 имп/мин/мг, однако общее включение метки в данной фракции от общей активности биомассы составило 84 %, то есть увеличилось примерно в ] .5 раза. Через 74 ч (210 ч эксперимента) начался этап прекращения синтеза белка и роста бактерий и накопления в них полимера. За 46 ч содержание полимера возросло с 35 до 65 %, а общего азота упало с 4.5 до 1-2 %. Перераспределение метки было следующим: снижение содержания в «активной биомассе» до 25-30 % и увеличение в полимере до 40-65 % от общей активности биомассы. Следует отметить, что изменяющиеся ростовые
Рис. 4.3. Показатели культуры Ä eutropha и динамика удельной
активности (С,4-ацетат) в общей биомассе и во фракциях клеточных
макромолекул при смене режимов (биосинтез -деградация - ресинтез ПГЛ) в условиях роста на ацетате
100 150 200
2000 1000
50 100 150 200 250
условия существенно влияли на соотношение полимера и общего азота в клетках, при этом содержание липидов оставалось практически постоянным на протяжении всего опыта и составляло 5-7 %.
Таким образом, основной поток углеродсодержащих продуктов, образующихся при эндогенной деградации полимера, перенаправляется на синтез азотсодержащих соединений и, наоборот, при исчерпании азота наступает фаза ресинтеза полимера. В период эндогенной деградации полимера его содержание в клетках может резко снизиться (от 70-80 до 40-50 % и менее), при этом молекулярная масса в течение короткого периода времени (6-12 ч) резко падает в 2-3 раза (от 1000 до 150-300 кДа и более). Эти результаты важны для технологии получения ПГА, как в части общих выходов ПГА, так и его характеристик.
4.2. Протектирующая роль внутриклеточного пула ПГА
В неблагоприятных условиях среды для сохранения физиологической активности и жизнеспособности клетки нуждаются в дополнительных тратах энергии. ПГА являются резервным депо энергии и углерода и выполняют протекторную роль при попадании клеток в условия стресса. Известны немногочисленные примеры позитивной роли внутриклеточного пула ПЗГБ для сохранения жизнеспособности клеток и регулирование окислительно-восстановительное состояние клеток (Anderson, Dawes, 1990), защита нитрогеназы при повышенном содержании кислорода (Stamm et al„ 1986), участие в регуляции внутриклеточной концентрации и транспорте ионов кальция, а также ДНК (Reusch, Sadoff, 1983; Reusch, 1989), участие в процессах репарации клеток при воздействии УФ облучения, окислительного и теплового стресса (Ayub et а!., 2004; Zhao et а!., 2007).
Для выявления протектирующей роли ПЗГБ изучен рост бактерий К eutropha в неоптимальных условиях культивирования с различным исходным содержанием полимера. Для засева среды использовали клетки, отобранные из различных фаз периодической культуры с различным внутриклеточным пулом ПЗГБ. В качестве стрессовых для культуры факторов были взяты следующие: неоптимальные для роста бактерий R. eutropha значения pH среды, кислая (5.2) и щелочная (7.5), при оптимуме 6.9-7.1; пониженная (25 °С) и повышенная (37 °С) температура при оптимуме 29-30 °С, а также отсутствие экзогенного источника углерода или энергии (рис. 4.4). При неонтимальных значениях pH, как в кислой (5.2), так и в щелочной (7.5) среде, клетки с внутриклеточным пулом ПЗГБ порядка 45 % обеспечили получение урожая существенно превосходящего, в 2.0-2.5 раза, таковой у контрольной культуры, исходно не содержащей полимера (рис.4.4 а, б). Рост клеток с высоким (74 %) исходным содержанием полимера характеризовался наличием некоторой фазы задержки в начальный период ферментации что связано, видимо, с необходимостью некоторого периода времени для внутриклеточной деградации и усвоения полимера, приводящих к переходу клеток к активному состоянию. Анализы показали, что внутриклеточная
концентрация ПЗГБ через сутки упала в обоих вариантах до следовых значений. Далее, на фоне роста культуры отмечено повышение содержания ПЗГБ, что является типичным для культуры К. еШгорЪа.
□ без ПЗГБ 145% ПЗГБ I 80% ПЗГБ
2 ■
5 1,6 ■
¥ 1,2 " и
I 0,8
о
Ш 0,4
0
А
1
24
48
72
1,6
£.1,2 ■ го
(0
¡0,4 ш
0
гшЛ
У
24
48
72
т
о 24 72 120 Время культивирования (ч)
0 24 72 120 Время культивирования (ч)
Рис. 4.4. Урожай биомассы Я еиГгор/т В5786 с различным исходным содержанием ПЗГБ в различных условиях: рН 5.2 (а) и 7.5 (б), 37°С (в) и 25°С (г), отсутствие Н2 (д) и С02 (е)
Аналогичная картина получена при изменении температурного режима. Клетки, обогащенные запасами полимера (45 и 74 %), при пониженной (25 °С) и повышенной (37°С) температуре обеспечили получение значительно более высокого урожая по сравнению с клетками, не содержащими ПЗГБ (рис. 4.4 в, г). При пониженной температуре сокращение внутриклеточного пула полимера происходило в течение 24 ч; при повышенной - медленнее, за 48 ч.
Показано, что исходные клетки посевного материала, обогащенные полимером, имели пониженное содержание общего азота. Это свидетельствует о нарушениях в системах синтеза азотсодержащих компонентов (аминокислот, белков, нуклеиновых кислот) при сшггезе клетками запасных макромолекул, в частности ПЗГБ. Несмотря на это, их размножение при неоптимальных условиях среды не только проходило при достаточно высоких скоростях роста, но и способствовало активизации синтеза азотсодержащих компонентов. Во всех опытах по мере увеличения концентрации клеток в культуре содержание азотсодержащих компонентов (НК и белка) в клетках возрастала. Это позволяет сделать вывод не только о позитивной роли ПЗГБ для поддержания процессов роста и размножения в экстремальных условиях среды, но и о его позитивной роли для репарации процессов синтеза азотсодержащих компонентов.
Как известно, газовый субстрат и его растворимость в среде являются главными факторами, определяющими кинетику роста газоиспользующих микроорганизмов. В связи с тем, что кислород и особенно водород представляют собой трудно растворимые газы, рост водородных бактерии возможен только в условиях интенсивной газовой вентиляции при непрерывном поступлении данных субстратов в систему ферментации. Таким образом, при отсутствии экзогешшх источников углерода и энергии рост водородных бактерий, даже остаточный, невозможен.
Данные представленные на рис. 4.4 (д, е), свидетельствуют о том, что клетки R. eutropha, лишенные запасов ПЗГБ, не росли при отсутствии экзогенных источников углерода или энергии. Более того, в таких условиях с первых же суток наблюдали снижение концентрации клеток в культуре, что является следствием гибели части клеток. Напротив, клетки, обогащенные запасами ПЗГБ, после некоторой фазы задержки размножались, обеспечивая за 2 0-2 5 суток удвоение биомассы в условиях полного отсутствия экзогенных источников углерода и энергии. По мере увеличения концентрации клеток в культуре отмечено закономерное снижение внутриклеточной концентрации ПЗГБ. При отсутствии внешнего источника энергии (водорода) прироста биомассы водородных бактерий не наблюдали. Это характерно для клеток, как со средним, так и с высоким содержанием ПЗГБ Однако концентрация клеток в культуре длительное время (до 140 ч) оставалась на уровне исходной. Это позволяет говорить о том, что клетки не погибали а использовали в качестве источника энергии полимер, запасы которого'в клетках очень быстро сокращались. При этом зафиксировано изменение внутриклеточной концентрации белка. Если исходная концентрация белка в клетках была достаточно низкой - не более 20-30 %, то через 72 ч культивирования, несмотря на отсутствие прироста биомассы в целом его концентрация возросла практически в 2 раза (до 50-60 %). Это позволяет предположить, что при отсутствии внешнего энергического источника - водорода, внутриклеточная деградация полимера обеспечивала клетки энергией не только для поддержания жизни, но и для синтеза
азотсодержащих компонентов, требующих, как известно, значительных энергозатрат.
В целом, продемонстрирована позитивная роль внутриклеточного пула ПЗГБ для восстановления способности к синтезу азотсодержащих компонентов и продуктивному росту бактерий Л еШгорИа в неоптимальных условиях среды.
4.3. Синтез ПГА различного химического строения
На основе изученных закономерностей синтеза и эндогенной деградации ПГА во взаимосвязи с физиологической активностью клеток разработан режим культивирования бактерий, позволяющий стабильно получать высокие выходы полимера-3-гидрокисмасляной кислоты (свыше 80-85 %) в автотрофной периодической культуре. Режим включает две стадии: на первом этапе бактерии выращивают на среде с лимитирующей концентрацией азота, а на втором - на среде без азота. В результате, на первом этапе накапливается достаточная биомасса с содержанием полимера в клетках на уровне 40-50 %. Поэтому длительность второй стадии существенно сокращается, и общее время ферментации не превышает 60-70 ч (Патент РФ № 5024753/13 (000787)).
Гомополимер 3-гидроксимасляной кислоты (ПЗГБ) - наиболее изученный представитель семейства ПГА; это высококристалличный (степень кристалличности - свыше 70 %) термопласт. Недостатком ПЗГБ является то, что он кристаллизуется неупорядоченно, поэтому его весьма сложно перерабатывать, а полученные изделия характеризуются низкой ударной прочностью, жесткостью и «старятся» во времени. Однако ПГА - это семейство полимеров, образованных мономерами с различной длиной Сцепи, среди которых полимеры, имеющие различные базовые свойства, от жестких термопластов до конструкционных эластомеров. Свойствами ПГА можно управлять, варьируя в процессе ферментации состав среды и задавая тем самым ту или иную химическую структуру. Сополимерные ПГА более перспективны, однако получение ПГА различного химического состава -весьма сложная технологическая задача, решение которой невозможно без фундаментальных знаний о закономерностях структурно-функциональной организации клеточного цикла синтеза ПГА и зависимости физико-химических свойств полимеров от химического состава. В зависимости от строения известные типы ПГА подразделяют на три группы: короткоцепочечные, образованные мономерами с длиной С-цепи от С3 до Cs; среднецепочечные (Сё-С!6) и длинноцепочеченые (С17 и выше) (Anderson! Dawes, 1990; Nakamura et al., 1991; Whitholt, Kessler, 1999; Zhang et al„ 2004; Hazer, Steinbüchel, 2007).
Известно, что жирные кислоты, поступая в клетки бактерий простой диффузией через мембраны или с помощью энергозависимой ферментной системы, активируются ацил-КоА-синтазой и переправляются в процесс ß-
окисления. Первым этапом окисления активированных жирных кислот является их дегидрирование с помощью ацил-КоА-дегидрогеназы. Далее продукт первой реакции - 2-транс-еноил-КоА гидратируется, и образуется Ь-/?-гидроксиацил-КоА, который и является предшественником мономеров, включающихся в полимер. Однако в синтезе полимеров участвуют только Г> изомеры гидроксикислот. Бактерии легко эпимеризуют Ь-изомер в П-изомер. В бактериях все ферменты ¿-окисления, кроме первой дегидрогеназы, представлены единым комплексом, в состав которого, кроме 2-еноил-гидратазы, 3-гидроксиацил-КоА-дегирогеназы и кетотиолазы, входят 3-гироксиацил-КоА-эпимераза и 3,2-еноил-КоА-изомераза. Таким образом, при добавках жирных кислот /3-окисление является наиболее вероятным источником мономеров для синтеза гетерополимеров.
При изменении источника углеродного питания разработанный в работе режим получения ПЗГБ может быть модифицирован для получения сополимерных ПГА. Так, при введении в культуру бактерий Я. егШорЪа В5786, синтезирующих полимер, добавок солей алкановых кислот в качестве предшественников мономеров, возможно получение более технологичных сополимеров 3ГБ и ЗГВ кислот (ПЗГБ/ПЗГВ), сополимеров - 3ГБ и ЗГГ кислот и др.
Сополимеры 3ГБ и ЗГВ (ПЗГБ/ПЗГВ) в отличие от гомогенного ПЗГБ обладают сниженной степенью кристалличности, поэтому изделия, изготовленные из них, обладают большей эластичностью и механической прочностью. С целью определения условий контролируемого синтеза сополимеров этого типа исследованы закономерности образования ПГА культурой Я.еШгор/ш В5786, выращиваемой на смешанном углеродном субстрате (рис. 4.5). При внесении добавок валерата в культуру бактерий зарегистрирована способность штамма утилизировать этот субстрат и включать в полимер мономеры ЗГВ. Уже спустя 1.5-2.0 ч после добавки валерата его концентрация в культуре была следовой. При этом независимо от используемого источника углерода (автотрофного или гетеротрофного), включение фракции ЗГВ в полимер зафиксировано уже спустя 30 мин после подачи валерата в культуру. Далее фракция ЗГВ в полимере возрастала на фоне снижения фракции 3 ГБ. Максимальное содержание ЗГВ в сополимере наблюдали спустя 10-15 ч после добавки валерата в культуру. В общих чертах динамика накопления биомассы, общего выхода сополимера мало отличались от таковых в культуре, синтезирующей гомополимер ПЗГБ на
моноуглеродном субстрате.
Расчет баланса углерода, выполненный по результатам опытов при росте бактерий на смешанном углеродном субстрате (С.02 + валерат или фруктоза+валерат), показал, что практически весь поданный в культуру валерат (2 г/л - при автотрофном росте и 1 г/л - при гетеротрофном) через 10-15ч включился в сополимер. Общая концентрация полимера в культуре к этому сроку составила около 8-10 г/л (60 % в биомассе), а молярная фракция ЗГВ в полимере - 28 и 13 мол% (2 и 1 г/л) при автотрофном и гетеротрофном росте, соответственно. Таким образом, включение валерата в полимер от
поданного составило практически 100 %. Вероятно, это связано с тем, что короткоцепочечные жирные кислоты, такие как бутират и валерат, напрямую превращаются в Э-/?-ОН-кислоты в процессе /^-окисления. Эти два мономера характеризуются высоким сродством к ПГА-синтазе, поэтому не вовлекаются в дальнейший цикл окисления жирных кислот, а переправляются на синтез полимера. Однако в ходе дальнейшего культивирования бактерий величина молярной фракции ЗГВ в сополимере падала на фоне повышения общего содержания сополимера и молярной фракции 3ГБ. Спустя 25-35 ч после подачи валерата в культуру содержание фракции ЗГВ сократилось до 19 мол %. При этом абсолютное содержание валерата в культуре (г/л) оставалось практически постоянным до конца эксперимента после достигнутого максимального значения. Поэтому
наблюдаемое снижение молярной фракции ЗГВ в сополимере вызвано не его деградацией, а разбавлением концентрации в результате продолжающегося синтеза 3ГБ и отсутствием синтеза ЗГВ, вызванного отсутствием субстратов.
4 -т
7
0.02 - 0.01 0.00
20
40
СО
I
80
100
50
Рисунок 4.5. Динамика показателей культуры Ла/шпш еШгорИа (А),, активности ферментов синтеза ПГА (Б) и состав сополимера (В) в условиях смешанного углеродного питания: 1 - общая биомасса, г/л; 2 - ПГА, г/л; 3 - ПГА, %; 4 - общая скорость синтеза ПГА (V) г/ч; 5 - удельная скорость синтеза ПГА (ц) ч"'. Активности: 6- ПГЛ-синтазы; 7 - /?-кетотиолазы; 8 -ацетоацетил-КоА-редуктазы в мкмолъ/мин на мг белка (Н); б - 3ГБ, в - ЗГВ
20
40
СО
80
С целью повышения включения ЗГВ в сополимер с учетом токсичности для культуры Я. еШгорка В5786 валерата в концентрации, свыше 2 г/л, исследованы режимы культивирования бактерий с дробной подачей субстрата - предшественника для образования мономеров ЗГВ. Таким
образом, выявленный факт нестабильности соотношения молярных фракций ЗГВ и 3ГБ в сополимере ПЗГБ/ПЗГВ, синтезируемом бактериями R. eutropha В5786, исследованная динамика образования сополимера, с учетом установленной предельно допустимой концентрацией валерата в среде, позволили определить условия и реализовать режимы культивирования бактерий для получения сополимера ПЗГБ/ПЗГВ с различным соотношением мономеров. Сочетанием количества добавок валерата в культуру (1, 2 , 3 и более) и последующего времени культивирования выявлены условия, при которых возможен синтез сополимеров этого типа с варьированием соотношения мономеров 3ГБ и ЗГВ в широких пределах, от 99:1 до 70:30 (мол%) (Патент РФ №5025741/13 (000837)).
Следующим был вопрос, связанный с возможностью синтеза Н2-окисляющими бактериями ПГА, содержащих в своем составе не только мономеры 3ГБ и ЗГВ, но также и мономеры с более длинной углеродной цепью. Следует отметить, что до недавнего времени считалось, что ПГА-синтазы высоко специфичны к субстрату (Steinbüchel, Valentin, 1995). В связи с этим полагали, что природные штаммы не способны синтезировать полимеры, содержащие в своем составе одновременно мономеры короткой (С3-С5) и средней (С6-С12) длины С-цепи.
Для выявления способности природных штаммов бактерий R. eutropha В5786 и S. carboxydohydrogena Z1062 синтезировать одновременно коротко- и среднецепочечные ПГА бактерии культивировали на смешанном углеродном субстрате, содержащем углекислоту и добавки солей разных жирных кислот (гексановой, гептановой, октановой, нонановой) в качестве предшественника синтеза мономеров различного строения. В данном случае в хемотрофных водородокисляющих бактериях реализуется путь образования ПГА, связанный с циклом ^-окисления жирных кислот. При этом поступающие в клетку субстраты-предшественники, - летучие жирные кислоты, активируются переносом на КоА и в виде таких производных переправляются в цикл ß-окисления. Промежуточные продукты этого цикла, - 3-гидроксикислоты, служат мономерами для синтеза ПГА.
Практически сразу после внесения в культуру кислот бактерии начинали их утилизацию; спустя 1.5-2.0 ч остаточная концентрация кислот в культуральной среде падала в 2-3 раза от исходной, а спустя 4-5 ч - до следовых концентраций. Определены предельно допустимые для роста бактерий концентрации данных кислот в среде вследствие их токсичности, доза одноразовых добавок которых в культуру не должна превышать 0.5-0.7 г/л. В периодические культуры бактерий, лимитированные дефицитом азота, вносили добавку одной из жирных кислот; ферментацию продолжали в течение 15-25 ч. Выращивание бактерий на смешанном углеродном субстрате сопровождалось накоплением в клетках ПГА, концентрация и состав которых имели различные значения в зависимости от условий эксперимента. Оба штамма показали способность к синтезу полимеров, содержащих в своем составе различные типы мономеров (рис. 4.6-4.7). Независимо от типа используемой жирной кислоты, как с четным, так и
нечетным числом атомов углерода в цепи, исследованные штаммы синтезировали в качестве доминирующего компонента 3ГБ и включали в качестве сополимеров два мономера - ЗГВ и ЗГГ. У водородных бактерий при использовании ими в углеродном питании кислот с нечетным числом атомов углерода (С7 и С9) в составе ПГА практически всегда обнаруживали включения ЗГВ, однако его доля с увеличением длины углеродной цепи субстрата-предшественника падала. Так, при внесении в культуру в качестве добавки гептановой кислоты включение ЗГВ достигала 10-15 мол.% и выше, но при использовании нонановой кислоты - ниже на порядок. Помимо 3ГБ и ЗГВ, в составе ПГА, синтезируемых данным штаммом при росте на гептановой или нонановой кислотах, идентифицированы также в небольших концентрациях включения ЗГГ, однако эти включения не носили регулярного характера.
с40'
' 20 -
5 В„
£ ^ 60
е;
х' с 40
3
"^50-
О
0-
1
• I 5 з Г 1
б 1
I-
Рис. 4.6. Динамика синтеза трехкомпонентных ПГА бактериями Я. еШгорИа В 5786: концентрация в культуре полимера, % (1), биомассы, г/л (2); а, б, в — сополимеры, соответственно, 3ГБ, ЗГВ и ЗГГ
Рис. 4.7. Динамика синтеза трехкомпонентных ПГА бактериями 5.
carboxydohydrogena г1062: концентрация в культуре полимера, % (1), биомассы, г/л (2); а, б, в -сополимеры,
соответственно, 3ГБ, ЗГВ и ЗГГ
При использовании водородными бактериями в качестве добавок кислот с четным числом атомов углерода (С6, С8 и Сю) в составе ПГА с большей регулярностью обнаруживали включения ЗГГ и нерегулярные включения - ЗГВ. Доля данных включений, однако, не превышала 1-2 мол.%, следовательно, их можно классифицировать как минорные. В отдельных экспериментах у водородных бактерий при наличии в среде октановой кислоты наблюдали включение в качестве сополимера 3-гидроксиоктаноата (ЗГО), при этом его доля в ПГА составляла, как правило,
менее 1 мол.% (Рис. 4.6).
Карбоксидобактерии, в отличие от водородных бактерий (рис. 4.7), при росте с аналогичными добавками жирных кислот мономеры ЗГВ в ПГА в заметных количествах включали не всегда, а, как правило, только при добавлении кислот с нечетным числом атомов углерода в цепи. При этом доля фракции ЗГВ в полимере была невысокой (единицы и десятые доли мол.%).
Включение ЗГГ, однако, было более выраженным, его доля в полимере достигала в отдельных экспериментах 20 мол.% и более, однако включения ЗГО в состав ПГА у карбоксидобактерий не отмечено. Все это позволяет говорить о специфичности микробного метаболизма жирных кислот в бактериях при различных путях синтеза ПГА. При использовании режима выращивания бактерий, предложенного в ходе оптимизации синтеза сополимера ПЗГБ/ПЗГВ по величине фракции ЗГВ, и варьировании количества добавок гексаноата в культуру, получена серия образцов многокомпонентных ПГА с макровключениями ЗГГ (таблица 4.3).
Таблица 4.3. Состав многокомпонентных ПГА, образованных мономерами 3ГБ, ЗГВ, ЗГГ, 3-гидроксигептаноата (ЗГГеп) и ЗГО, синтезированных
ЯеиР-орЬа В5786
№ образца Состав 111 А, мол.%
3ГБ ЗГВ ЗГГ ЗГО ЗГГеп
1 11.22 88.46 0.13 0.16 0.04
2 36.01 63.64 0.12 0.21 0.02
3 49.50 50.01 0.34 0.09 0.06
4 52.25 47.33 0.09 0.33 Н.о.
5 59.36 40.48 0.07 0.09 0.1
6 81.81 3.69 13.8 Н.о. 0.74
7 88.38 4.47 6.63 Н.о. 0.52
8 90.63 2.29 6.52 Н.о. 0.56
9 91.70 4.60 2.50 Н.о. 1.20
10 41.94 56.30 0.71 0.98 0.06
11 93.31 3.34 2.38 Н.о. 0.97
12 100.00 0.24 Н.о. Н.о. Н.о.
Рис. 4.8. Хроматограммы полимеров, выделенных из биомассы Ralstonia eutropha В5786 с добавкой валерата (верх) и октаноата (зеркально внизу) и масс-спектры соответствующих мономеров: 3ГБ с временем удерживания 7 37' ЗГВ - 8 42- ЗГТ - 9 4Я-ЗГГеп-10.75; ЗГО-11.95 ' ' '
На рис. 4.8 представлена ионная хроматограмма ГТГА, образованного мономерами 3ГБ, ЗГВ, ЗГТ, ЗГгеп и ЗГО; идентификация мономеров подтверждена масс-спектрами.
Полученные в работе результаты, доказавшие возможность синтеза природными штаммами хемолитотрофных водородокисляющих бактерий гетерополимерных ПГА, содержащих в своем составе как коротко-, так и среднецепочечные мономеры, подтверждены зарубежными коллегами спустя пять лет (Green et al., 2002).
4.4. Водородсодержащие субстраты для биосинтеза ПГА
Тип основного ростового субстрата, используемого для получения ПГА, определяется исходя из физиолого-биохимических свойств продуцентов и экономической целесообразности выбранной стратегии с учетом области применения полимера. В связи с тем, что ПГА перспективны для использования в медицине, фармакологии, пищевой промышленности, сельском и коммунальном хозяйстве, масштабы производств полимеров могут быть самыми разными, от десятков килограммов (для медицины и фармакологии), до сотен тысяч тонн в год. Поэтому требования, предъявляемые к качеству и стоимости сырья для различных объемов производств и областей применения, также различны. Потенциально сырьем для получения ПГА могут быть самые разные субстраты с различными степенью восстановленное™, энергосодержанием и, конечно, стоимостью. Среди субстратов - индивидуальные соединения (сахара различной природы,
спирты, кислоты, углекислота, углеводороды) и комплексные субстраты, включая отходы промышленных и сельскохозяйственных производств.
Для получения полигидроксиалканоатов возможно привлечение разнообразных субстратов. Среди известных - индивидуальные соединения (углекислый газ и водород, сахара, спирты, органические кислоты), отходы спиртовой, сахарной, гидролизной промышленности, производства оливкового и пальмового масла и др. (Tanaka et al.,1995; Cromwick et al., 1996; Lee,1998; Sugimoto et al., 1999), а также необычные субстраты, включая токсичные. Например, установлена возможность синтеза ПГА на плохо растворимом и токсичном октане и октаноате, бензоате натрия и феноле, метакриловой кислоте (Lee et al., 1997; Hagnberg, Witholt, 1997; Durner et al„ 2000).
В настоящее время все чаще появляются работы, рассматривающие в качестве субстрата для биотехнологических производств угли и продукты их переработки (Fakoussa, Hofrichter, 1999). В связи с огромными запасами и относительно низкой стоимостью данный субстрат потенциально представляет интерес и для будущих крупнотоннажных производств микробных биопластиков (Füchtenbuch, Steinbüchel, 1999). Как было показано выше, среди водородных бактерий есть организмы, обладающие СО-резистентностью. Возможность выращивания названных организмов на техногенных источниках водорода, содержащих в своем составе монооксид углерода, (конвертированном газе и продуктах газификации углей и лигнина), показана пионерными работами ИБФ СО РАН (Патент № 2207375 RU 2207375).
Исходя из этого, в работе сформулирована задача оценить возможность синтеза ПГА водородокисляющими бактериями на источниках водорода (например, синтез-газе), содержащих в своем составе высокотоксичный монооксид углерода. Общеизвестно, что высокие выходы ПГА у водородных бактерий могут быть получены в условиях несбалансированного роста при ограничении реакций белкового синтеза и избытке углерода и энергии. Наиболее ярко это проявляется в условиях дефицита азота, при котором концентрация ПГА может составить до 80% и выше от сухого вещества.
Последствия двухфакторного воздействия (дефицита азота в сочетании с ингибированием СО) в отношении бактерии A. eutrophus, а также других микроорганизмов, не изучены. Исследованы выходы полимера и активность ключевых ферментов синтеза ПГА. Исходя из ранее полученной кинетической зависимости ц/S, бактерии А. eutrophus выращивали в режиме аккумуляции ПГА на модельных газовых смесях, содержащих СО в диапазоне 5-25 % об. Установлено, что в присутствии СО, независимо от концентрации ингибитора в газовой смеси, в клетках А. eutrophus происходило накопление полимера до 70-75 % от сухого вещества при сохранении общего урожая биомассы практически на уровне контроля (рис. 4 9) Незначительное снижение урожая отмечено при повышении концентрации СО в газовой смеси свыше 20 % об. В ходе опытов исследована динамика активностей ключевых ферментов синтеза ПГА (¿¡-KT,
АА-КоА-редуктазы, бутиратдегидрогеназы и ПГБ-синтазы) и установлено, что СО не ингибирует внутриклеточную систему синтеза ПГА у бактерий А. еипоркт. Проявление активности всех ферментов зарегистрировано в клетках во всех фазах роста в ходе накопления ПГА как при отсутствии, так при наличии СО в среде.
Показатели газообмена культуры мало зависели от концентрации СО в газовой фазе. Примечательно, что стехиометрия потребления компонентов (С02:02:Н2), характеризующая количественную связь между исходным субстратом и образуемым продуктом и являющаяся у водородных бактерий показателем эффективности использования энергетического субстрата, также не претерпевала существенных изменений относительно показателей культуры, лимитированной по азоту и аккумулирующей ПГА в периодическом режиме выращивания. Таким образом, воздействие СО не влияло на кинетические и продукционные характеристики культуры, лимитированной азотом и находящейся в режиме аккумуляции ПГА, и не ухудшало данные показатели.
Защитная реакция клеток на воздействие СО в определенной мере может быть связана с состоянием и проницаемостью клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, которые во многом определяются составом жирных кислот липидов.
Контроль
' 1 1 I I—1—I—I—I—I—I
О 3 М 31 40 К ¡0 Л> 81
15 %СО
I. -н
Ь]ч\гд ни.
Рис. 4.9. Показатели выхода биомассы и ПГА и активности ферментов клеточного цикла ПГА у бактерий А. еШгорИих в режиме синтеза ПГА в присутствии СО
При сопоставлении состава ЖК липидов А. eutrophus, аккумулирующих ПГА на средах без СО и в присутствии ингибитора (таблица 4.1), не обнаружено существенного влияния изучаемых факторов на общее содержание мембранных липидов, а также ЖК ЛПС клеточных стенок, состав которых практически не изменялся. Однако выявлены некоторые отличия в направленности изменения состава жирных кислот мембранных липидов бактерий при сопоставлении одно- и двухфакгорного воздействия. При сочетанном воздействии на культуру двух неблагоприятных факторов (СО + дефицит азота), аналогично однофакторному лимитированию по азоту в культуре А. eutrophus, по мере увеличения концентрации полимера в клетках также происходило повышение насыщенности липидов, практически в 2 раза. Однако это повышение было связано с существенным увеличением доли насыщенной 16:0 кислоты (с 46.7 до 61.3 %) и в меньшей степени - циклизацией соответствующих моноеновых кислот, в отличие от азотного дефицита и аналогично ингибированию СО. Доля циклопропановых кислот при этом возрастала незначительно (от 1.3 до 4.3-5.5 %), и только в 60-часовой культуре составила 10 %. Отмечено значительное снижение относительного содержания моноеновой 16:1ю7 (с 29.0 до 7.5 %). Доля 18:1ш7 при этом практически не менялась и была значительно ниже, чем в условиях дефицита азота. При ингибировании роста культуры СО в турбидостате направленность в изменении ЖК спектра была аналогичной - происходило увеличение степени насыщенности мембранных липидов за счет увеличения доли 16:0 и некоторого повышения доли циклопропановых кислот (таблица 4.1).
Таким образом, выявленное более выраженное изменение насыщенности ЖК мембранных липидов бактерий под воздействием СО, при котором мембрана становится более жесткой и менее проницаемой, возможно, защищает клеточные структуры от повреждающего воздействия окиси углерода. Такая защита в свою очередь, может служить причиной отсутствия существенных изменений физиолого-биохимических характеристик культуры, синтезирующей ПГА в присутствии монооксида углерода. На этой основе исследован процесс образования ПГА на водородсодержащих продуктах, получаемых газификацией гидролизного лигнина или бурых углей КАТЭК, и впервые в биотехнологической практике реализован процесс биосинтеза ПГА на синтез-газе (патент РФ №2207375).
В результате выполненного цикла работ исследованы закономерности синтеза и накопления ПГА в культурах высокопродуктивных водородокисляющих прокариот, определены условия, обеспечивающие высокие выходы полимеров (свыше 80-85 %), в том числе различного химического строения. Результаты использованы для масштабирования технологии и ее реализации в условиях опытного производства.
Выводы
1. Проведен поиск продуцентов ПГА среди светящихся, водородокисдяющих и цианобактерий. Выявлены перспективные штаммы' обладающие способностью к синтезу ПГА, в таксономических группах водородных и светящихся бактерий.
2. В сравнительном аспекте исследован состав липидов у прокариот, относящихся к разным таксономическим группам, и показано, что все они синтезировали преимущественно структурные компоненты клеточных мембран: водородокисляющие и светящиеся бактерии - фосфолипиды, цианобактерии - фосфолипиды и гликолипиды. Доминирующими фосфолипидами у изученных штаммов являлись фосфотидилэтаноламин, и в меньшей степени, фосфатидилглицерин и диацилфосфатидилглицерин. В составе липидов цианобактерий доминировали моногалактозилдиглицерин, дигалактозилдиглицерин, сульфолипид и, в меньшей степени! фосфатидилглицерин.
3. Показано, что водородокисляющие и светящиеся бактерии синтезировали ограниченный набор жирных кислот, среди которых основными являются прямоцепочечные насыщенные и моноеновые кислоты С16 и С15 ряда - пальмитиновая, пальмитолеиновая и цис-вакценовая - и циклопропановьте кислоты. Для каждой группы обнаружены свои особенности в соотношении этих кислот. Для светящихся бактерий характерен преимущественный синтез пальмитолеиновой кислоты, водородокисляющие и СО-окисляющие бактерии синтезировали пальмитолеиновую и цис-вакценовую кислоты в равных пропорциях. Изученные цианобактерии отличались большим разнообразием состава жирных кислот и среди них встречались организмы, синтезирующие только насыщенные и моноеновые кислоты, насыщенные моноеновые, диеновые и триеновые кислоты с разным положением двойных связей в молекуле и тетраеновые кислоты.
4. Изучены особенности роста и конструктивного обмена Н2- и СО-окисляющих бактерий при действии экстремальных значений температуры и рН среды, которьге приводили к уменьшению удельной скорости роста и эффективности использования энергетического субстрата. Обнаружено, что насыщенность жирных кислот в липидах возрастала при повышении температуры, при снижении - падала; в кислой среде стимулировался синтез циклопропановых жирных кислот и возрастала насыщенность липидов, в щелочной среде насыщенность липидов уменьшалась. Данные изменения позволяют бактериям сохранить способность к росту и размножению в достаточно широком диапазоне температур и активной реакции среды, однако, без существенного перераспределения в составе основных и запасных клеточных макромолекул.
5. При неоптимальных условиях газового питания (Н2, С02 и 02) концентрация и соотношение в клетках азотсодержащих компонентов (общего азота и белка) и запасных макромолекул (липидов и ПГА), включая суммарное
содержание липидов и их жирнокислотный состав, практически не изменялись.
6. Присутствие в газовом субстрате ингибитора - монооксида углерода вызывало адаптивную реакцию мембран бактерий А. еШгорИт и 5. сагЬоху(1оЬуйго&епа: стимулировался синтеза циклопропановых кислот, повышалась насыщенности липидов, усиливался синтеза цитохромов, что в итоге сохраняло неизменным соотношение основных и запасных веществ в клетке.
7. Лимитирование роста минеральными макроэлементами (М, Р, 8, К, существенно влияло на метаболизм жирных кислот липидов водородных
бактерий и карбоксидобактерий, вызывая увеличение насыщенности липидов за счет синтеза циклопропановых кислот и снижения доли моноеновых кислот. Наряду с этим, при лимитировании роста происходило значительное перераспределение в составе клеточных макромолекул в сторону усиления синтеза ПГА - резервных макромолекул липидной природы. В режиме аккумуляции ПГА выход полимера у бактерий Я еиГгорИа достигал 86 % и выше.
8. Накопление и деструкция полимера сопровождалась возникновением размерной гетерогенности клеток. Наибольшая активность ключевых ферментов синтеза ПГА - Д-кетотиолазы, АА-СоА-редуктазы и ПГА-синтазы - зафиксирована в начальный период синтеза полимера; далее она снижалась и мало менялась в ходе накопления ПГА. Активность деполимеризующих ферментов в период синтеза ПГА низка, но отчетливо проявлялась в фазу эндогенной деградации полимера.
9. Доказана протекторная роль внутриклеточного пула ПЗГБ, обеспечивающая рост и размножение клеток Я еиП-орИа при неоптимальных условиях среды и отсутствии экзогенного источника углерода.
10. Доказана возможность синтеза природными штаммами хемолитотрофных водородокисляющих бактерий гетерополимерных ПГА, содержащих в своем составе мономеры с коротко- и среднецепочечной длиной углеродной цепи и различным соотношением мономеров.
11. На основе изученных закономерностей роста и конструктивного метаболизма отобранных культур светящихся и водородных бактерий, разработаны и реализованы эффективные технологии синтеза ПГА различного состава с высокими выходами (до 80-90 %) на различных субстратах.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Публикации по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК:
1. Трубачев И.Н. Биохимический состав водородных бактерий в зависимости от условий роста. /Трубачев И.П., Калачева Г.С., Андреева Р.И., Войтович Я.В.// Микробиология.-1971.-40, № 3. -С.424-427.
2. Трубачев И.Н. Биохимический состав некоторых синезеленых водорослей и хлореллы. / Трубачев И.Н., Гительзон И.И., Калачева Г.С., Барашков В.А., Белянин В.Н., Андреева Р.ИУ/ Прикладная биохимия и микробиология. -1976 -К" 12 -С 196202.
3. Волова Т.Г. О росте водородных бактерий при ингибировании окисью уг лерода. /Волова Т.Г., Калачева Г.С., Стасишина Г.Н., Касаева Г.Е. // Микробиология -1980 -49, в.4. -С.465-471.
4. Калачева Г.С. Исследование состава липидов карбоксидобакгерий. /Калачева Г.С., Волова Т.Г., Трубачев И.Н. // Микробиология. -1980. -49, в.5. -С.727-733.
5. Калачева Г.С. Изменение жирнокислотного состава светящихся бактерий Photobacterum leiognathi при периодическом культивировании. / Калачева Г.С., 905С°ЦКИЙ Е С ' Р°ДИЧеВа Э К'' Фиш А М'11 Микробиология. -1980. -49, в.6. -С.902-
6. Калачева Г.С. Состав жирных кислот липидов светящихся бактерий. / Калачева Г.С., Примакова Г.А., Воробьева Т.И., Фиш A.M. //Микробиология -1981 -50 в 5 -С.796-800. ' ' '
7. Калачева Г.С. Липиды светящихся бактерий. / Калачева Г.С., Высоцкий Е.С., Родичева Э.К., Фиш A.M. // Микробиология. -1981. -50, в. 1. -С.79-83.
8. Калачева Г.С. Липиды синезеленой водоросли Synechococcas elongatus. / Калачева Г.С., Трубачева И.Н. //Физиология растений.-1981. -28, в.З. -C.5I9-524.
9. Волова Т.Г. Влияние экстремальных температур на метаболизм водородокисляющих бактерий. / Волова Т.Г., Трубачев И.Н., Калачева Г.С., Барашков В.А. // Микробиология. -1982. -51, в.З. -С.386-391.'
10. Калачева Г.С. Изменение липидов и их жирнокислотного состава при периодическом культивировании светящихся бактерий. / Калачева Г С Высоцкий Е.С.7/ Микробиология. -1984. -53. -С.932-937.
11. Калачева Г.С. Состав липидов люминесциругощего бесклсточного экстракта из светящихся бактерий. / Калачева Г.С., Высоцкий Е.С., Межевикин В В // Биохимия. -1985. -50. -С. 1811-1816.
12. Волова Т.Г. Влияние pH среды на рост и физиологию водородокисляющих бактерий. / Волова Т.Г., Терешкова Г.М., Калачева Г.С.. Сальников М.В // Микробиология. -1986. -55, в. 5. -С.745-750.
14. Волова Т.Г. Влияние условий газового питания на рост и метаболизм карбоксидобакгерий. / Волова Т.Г., Калачева Г.С., Касаева Г.Е.. Терешкова Г.М. // Микробиология.-1986. -55, в.6. -С.938-943.
15. Волова Т.Г. Влияние физико-химических факторов среды на рост и биохимический состав карбоксидобактерий. /Волова Т.Г., Калачева Г.С., Касаева Г.Е., Терешкова Г.М., Федорова Я.В. // Микробиология. -1987. -56, в. 6. -С973-978.
16. Волова Т.Г. Исследование физиолого-биохимических характеристик карбоксидобактерий при лимитировании минеральными элементами. / Волова Т.Г., Калачева Г.С., Трубачев И.Н., Филиппова В.К. // Микробиология. -1988. -57, в.1. -С.61-64.
17. Волова Т.Г. Особенности метаболизма и ультратонкой организации карбоксидобактерий при выращивании с СО. / Волова Т.Г., Гусейнов O.A., Калачева Г.С., Кондратьева Е.И., Пузырь А.П., Медведева С.Е. // Микробиология -1988.-57, в.5.-С.793-798.
18 Волова Т.Г. Влияние условий роста на накопление полиоксибутирата водородными бактериями. / Волова Т.Г., Калачева Г.С., Пузырь ATI., Константинова В.М. // Прикладная биохимия и микробиология. -1992. -28, в.2. -С 221-229
19 Volova Т G Effect of carbon monoxide on metabolism and ultrastructure of carboxydobacteria. / Volova T.G., Guseinov O.A., Kalacheva G.S., Mcdvedeva S.E. and Puzyr A A // World Journal of Microbiology and Biotechnology. -1993. - 9. -1J. 160-K.J.
20 Гладышев М.И. Состав свободных жирных кислот в культуралыюй среде синезеленой водоросли Spirulina platensis. / Гладышев М.И., Калачева I .С., Сущик H H // Докл. АН . -1993. -329, № 4. -С. 521-523.
21 Калачева ГС. Состав жирных кислот Spirulina platensis в зависимости от возраста и минерального питания культуры. / Калачева Г.С. Сущик Н.Н. // Физиол. растений. -1994. -41, № 2. -С.275-282.
22 Попова Л Ю Штаммы светящихся бактерий с повышенной чувствительностью к гексахлорциклогексану. / Попова Л.Ю., Могильная О.А., Медведева С.Е Калачева Г.С., Нечуркин Н.С. // Прикладная биохимия и микробиология. -1994. -30, в.4-5. -С.650-656.
23 Волова Т.Г. Исследование синтеза полиоксибутирата СО-окисляющими бактериями Seliberia carboxydohydrogena. / Волова Т.Г., Калачева Г.С., Константинова В.М. // Микробиология. -1994. -63, в.2. -С.211-216
24 Sushchik NN. Rapid assay of fatty acid composition using a portable highperformance liquid chromatograph for monitoring aquatic ecosystems / Sushchik N.N., Gladyshev M.I., Kalachova G.S., Guseynova V.E. // 3. Chromatography A. -1995. -695. -P.223-228.
25 Барашков B.A. Исследование биологическои ценности шротов водородокисляющих бактерий. / Барашков В.А., Волова Т.Г., Калачева Г.С. // Биотехнология. -1996. № 1. -С.40-43.
->6 Барашков В А. К вопросу комплексного использования бшстериалыюи биомассы. / Барашков В.А., Калачева Г.С. // Сибирский экологический журнал. -1997. -5. -С.533-536.
27 Волова ТГ Получение и исследование микробных гетерополимерных полиоксиалканоатов. / Волова Т.Г., Беляева О.Г., академик Гительзон И.И., Калачева Г.С., Плотников В.Ф., Луковенко С.Г. // Докл.АН. -1996. -347. -С.256-258.
28 Волова ТГ Исследование роли полиоксибутирата для роста водородных бактерий в неоптимальных условиях. / Волова Т.Г., Калачева Г.С., Пузырь А.П. // Микробиология. -1996. -65, в.5. -С.346-351.
29 Сущик Н.Н. Внеклеточные свободные жирные кислоты в периодическои культуре Spirulina platensis при пониженной и повышенной температуре. / Сущик H H., Гладышев М.И., Калачева Г.С. // Докл.АН. -1996. -347, №6,- С.843-846.
30 Волова Т Г Исследование разрушаемости микробных полиоксиалканоатов. / Волова Т.Г., Беляева О.Г., Калачева Г.С., Луковенко С.Г. // Сибирскии экологический журнал. -1997, №5. -С.505-510.
31. Сущик Н.Н. Динамика биомассы микроводорослей и состава внеклеточных жирных кислот в экспериментальных микроэкосистемах. / Сущик Н.Н., Гладышев М.И., Калачева Г.С., Плаксина И.В. // Известия АН. Серия Биологическая. -1998, №6. -С.738-744.
32. Сущик Н.Н. Влияние температуры на состав внеклеточных свободных жирных кислот культур зеленой и сипезеленой водорослей. / Сущик Н.Н., Гладышев М.И., Калачева Г.С. // Докл.АН. -1999. -367, № 4. -С.567-570.
33. Sokolova I.V. Analysis of the ratio of quantum yield and fatty acid formation of Photobacterium leiognathi bioluminescence. /Sokolova I.V., Tyulkova N.A., Kalacheva G.S. //Вестник МГУ. -2000. -41. -P.118-121.
35. Волова Т.Г. Исследование гетерогенности в культуре водородных бактерий. / Волова Т.Г., Стасишина Г.Н., Калачева Г.С., Могильная О.А., Гусейнов О.А., Медведева С.Е., Франк JI.A., Плотников В.Ф. // Микробиология. -1999 -68 X» 2 -С.205-212.
36. Зотина Т.А. Влияние солености среды на рост и биохимический состав цианобактерий Spirulina platensis. / Зотина Т.А., Калачева Г.С., Болсуновский А.Я. // Биотехнология. -2000, № 1. -С.85-88.
37. Сущик Н.Н. Особенности прижизненного выделения свободных жирных кислот прокариотической и эукариотической водорослями при повышенной и пониж-енной температурах. / Сущик Н.Н., Гладышев М.И., Калачева Г.С. // Микробиология. -2001.-70, №5. -С.629-635.
38. Волова Т.Г. Автотрофный синтез полиоксиалканоатов бактериями Alcaligenes eutrophus в присутствии моноокиси углерода. / Волова Т.Г., Калачева Г.С., Алтухова О.В. //Микробиология. -2001. -70, №6. -С.745-752,
39. Шишацкая Е.И. Гигиеническая оценка полиоксиалканоатов - природных иолиэфиров нового поколения. / Шишацкая Е.И., Есимбекова Е.Н., Волова Т.Г., Калачева Г.С., Кратасюк В.А. //Гигиена и санитария. -2002, №4. -С.59-63.
40. Volova T.G. Autotrophic synthesis of poiyhydroxyalkanoates by the bacteria Ralstonia eutropha in the presence of carbon monoxide. / Volova T.G., Kalacheva G.S., Altukhova O.V. // Appl. Micribiol. Biotechnol. -2002. -58. -P.675-678.
41. Сущик Н.Н. Влияние температуры на состав внутри- и внеклеточных жирных кислот зеленых водорослей и цианобактерий. / Калачева Г.С., Жила Н.О., Гладышев М.И., Волова Т.Г. // Физиология растений. -2003. -50, № 3. С. 420-427.
42. Sevastianov V.I. Production of purified polyhydroxyalcanoates (PHAs) for applications in contact with blood. / Sevastianov V.I., Perova N.V., Shishatskaya E.I., Volova T.G., Kalacheva G.S. // J. Biomater. Sci. Polymer Edn. -2003 -24. - P.4353-4264.
43. Волова Т.Г. Динамика активности ферментов клеточного цикла полигидроксиатеаноатов у Ralstonia eutropha. / Калачева Г.С., Горбунова О.В., Жила Н.О. // Прикладная биохимия и микробиология. -2004. -40, в. 2. -С.170-177.
44. Волова Т.Г. Синтез сополимеров гидроксибутирата и гидроксивалерата [поли(2ГБ/ЗГВ)] бактериями Ralstonia eutropha. / Волова Т.Г., Калачева Г.С. // Микробиология. -2005. -74, № 1. -С. 1-7.
45. Волова Т.Г. Физиолого-биохимические свойства и способность к синтезу полиоксиалканоатов у глюкозоусваивающего штамма водородных бактерий RALSTONIA EUTROPHA В8562. / Волова Т.Г., Кожевников И.В., Долгополова Ю.Б., Трусова М.Ю., Калачева Г.С., Арефьева Ю.В. // Микробиология. -2005. -74, № 6. -С.788-794.
46. Волова Т.Г. Метаболическая активность ключевых ферментов клеточного цикла полигидроксиалканоатов у Ralstonia eutropha В5786. / Волова Т.Г., Кожевников И.В.. Калачева Г.С., Жила Н.О.. Горбунова О.В. // Вестник КГУ -2005. -С.215-223.
47 Волова Т.Г. Опытное производство биоразрушаемых полимеров. / Волова Т.Г, Воинов Н А., Муратов B.C., Бубнов Н.В., Гурулев К.В., Кагтачева Г.С., Горбунова Н.В. Плотников В.Ф. Жила Н.Ь. Шишацкая Е.И. Беляева О.Г. Кожевников И.В. // Биотехнология. -2006, №6. -С.28-34.
48 Volova Т G Physiological-biochemical properties and the ability to synthesize poiyhydroxyalkanoates of the glucose-utilizing strain of the hydrogen bacterium Ralstonia eutropha B8562. /Volova Т.О., TrusovaM.Y., Kalacheva G.S., Kozhevmcov IV. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2006. -73. -P.429-433.
49 Вопова ТГ Биосинтез многокомпонентных полигидроксиалканоатов бактериями Wautersia eutropha. i Волова Т.Г., Калачева Г.С. // Микробиология. -2007. -76. №6. -С. 797-804.
50. Калачева Г.С. Состав жирных кислот липидов Wautersia eutropha. / Калачева Г С Волова Т.Г. //Микробиология. -2007. -76, №5. -С.608-614.
51 Volova Т G Biosynthesis of Multi-Component Poiyhydroxyalkanoates by the Baterium Wautersia eutropha. / Volova T. G„ Kalacheva G.S., Steinbüchel A. //
Macromol. Symp. -2008. -269. -P.l-7. .
52 Volova Tatiana G„ Kalacheva Galina S., and Alexander Steinbüchel Biosynthesis ot Multi-component Poiyhydroxyalkanoates by the Bacterium Wautersia eutropha. /Volova Tatiana G., Kalacheva Galina S, and Alexander Steinbüchel // Журнал Сибирского Федерального Университета. Серия «Биология». -2008. -1. -Р.91-101.
53 Бояндин А.Н. Синтез резервных полигидроксиалканоатов светящимися бактериями. /Бояндин А.Н., Калачева Г.С., Родичева Э.К, Волова Т.Г. // Микробиология. -2008. -77, .V«3. -С.364-369.
54 Шишацкая Е.И. Распределение и резорбция полимерных микрочастиц в тканях внутренних органов лабораторных животных при внутривенном введении. / Шишацкая Е.И., Горева A.B., Калачева Г.С., Волова Т.Г. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2009, № 11. -С.542-546.
55 Воинова О.Н. Микробные полимеры в качестве разрушаемой основы для доставки пестицидов. / Войнова ОН, Калачева Г.С., Гродницкая И.Д., Волова Т.Г. Н Прикладная биохимия и микробиология. - 2009.-45, №4. - С. 427-431.
56 Shishatskaya, Ekaterina I. Distribution and Resorption of Intravenously Administrated Polymer Microparticles in Tissues of Internal Organs of Laboratoiy Animals / Shishatskaya, Ekaterina I.; Goreva, Anastasya V.; Kalacheva, Gahna S.; Volova, Tatiana G. // Журнал Сибирского Федерального Университета. Серия «Биология».-2009.-2, №4.-С.453-465. .
57 Zhila N Synthesis of biodegradable polymers (poiyhydroxyalkanoates) ot given structure by Ralstonia eutropha. / Zhila N.. Kalacheva G„ Volova T. // New biotechnology. -2009. -25. -P.254-255.
58 Boyandin A Production of poiyhydroxyalkanoates by luminous bacteria. /Boyandin, A " Kalacheva, G„ Volova, T. //NEW BIOTECHNOLOGY. -2009. -25.-P.S59-S60.
59. Shishatskaya E.I. Biocompatability and resorption of intravenously administered polymer microparticles in tissues of internal organs of laboratory animals. / Shishatskaya E.I., Goreva A.V., Kalacheva G.S., Volova T.G. // J. Polym. Sei: Polym. Ed.-2011. -22, IS.2.-P.2185-2203.
60 Волова Т.Г. Синтез сополимеров З-гидроксибутирата-со-4-гидроксибутирата водородокисляющими бактериями / Волова Т.Г., Жила Н.О., Калачева Г С, Соколенко В.А., Сински Э.Дж. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2011. -47,№5.-С. 544—550.
Тезисы докладов и материалов конференций:
1. Калачева Г.С. Влияние условий минерального питания на жирнокислотный состав водородокисляющих бактерий. К кн.: Непрерывная культура водородокисляющих бактерий как средство биосинтеза белка. -1974. -С.53-60.
2. Калачева Г.С. Липиды водородных бактерий. / Калачева Г.С., Трубачев И.Н. И Сб. "Хемосинтез в непрерывной культуре". Новосибирск. -1978. -С.89-96.
3. ВоловаТ.Г. Исследование карбоксидобактерий как потенциального компонента замкнутых систем жизнеобеспечения. / Волова Т.Г., Трубачев И.Н., Сидько Ф.Я., Калачева Г.С., Барашков В.А. //Материалы X Всесоюзного Совещания по вопросу круговорота веществ в СЖО на основе жизнедеятельности низших организмов Киев. -1979. -С.232-234.
4. Калачева Г.С., Липиды некоторых автотрофных микроорганизмов - возможных компонентов СЖО. / Калачева Г.С., Трубачев И.Н. // Материалы XI Всесоюзного Совещания по вопросу круговорота веществ в СЖО на основе жизнедеятельности микроорганизмов. Киев. -1983. С.45-47.
5. СтасишинаГ.П. Исследование гетерогенности в культуре водородных бактерий. / Стасиншна Г.Н., Могильная О.А„ Калачева Г.С., Волова Т.Г., Медведева С.Е., Франк Л.А., Гусейнов O.A., Плотников В.Ф. // Препринт. 103Б. Красноярск. -1989.
6. Волова Т.Г. Влияние лимитирования роста на накопление полиоксибутирата у водородокисляющих бактерий. / Волова Т.Г., Федорова Я.В., Калачева Г.С. // В кн.: Материалы Всес. Конф. Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов Пущино.-1989. С. 16-24.
7. Волова Т.Г. Полиоксибутират - термопластичный биодеградируемый полимер. / ВоловаТ.Г., Калачева Г.С. //Препринт. 131Б. Красноярск. -1990.
8. Волова Т.Г. Регуляция синтеза микробного полиоксибутирата параметрами среды. / ВоловаТ.Г., КалачеваГ.С., ФедороваЯ.В. // В сб.: Микробная конверсия -1990. С. 119-129.
9. Жила Н.О Синтез биоразрушаемых полимеров заданного состава бактериями Ralstonia eutropha / Жила Н.О., Г.С. Калачеваа, Т.Г. Волова И Тезисы доклада V международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды. 1-5 июня 2009. Ростов-на-Дону. С. 174
Патенты:
1. Волова Т.Г., Калачева Г.С., Константинова В.М. Способ получения гетерополимеров ß-оксимаслянной н ß-оксивалериановой кислот. Заявка № 5025741/13 (000837) от 08.01.92
2. Волова Т.Г., Калачева Г.С. Способ получения полимера ß-оксимаслянной кислоты. Заявка № 5024753/13 (000787) от 08.01.92
3. Волова Т.Г., Гительзон И.И., Кузнецов Б.Н., Шабанов В.Ф., Калачева Г.С. Патигг на изобретение № 2207375 Способы получения полимера ß - оксимасляной кислоты. RU 2207375 С2 От 27.06.2003.1-10 с.
Подписано в печать 20.11.2012 Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 4.4 Тираж 100. Заказ N2 95
Отпечатано в типографии Института физики СО РАН 660036,Красноярск, Академгородок 50,стр.38, ИФ СО РАН
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Калачева, Галина Сергеевна, Красноярск
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ Институт биофизики Сибирского отделения Российской академии наук (ИБФ СО РАН)
На правах рукописи
Л_
КАЛАЧЕВА Галина Сергеевна
СИНТЕЗ ПОЛИЭФИРОВ ГИДРОКСИПРОИЗВОДНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ (ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ) И ХАРАКТЕРИСТИКА СОСТАВА ЛИПИДОВ СИНЕ-ЗЕЛЕНЫХ, СВЕТЯЩИХСЯ И ВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ ПРОКАРИОТ
03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук
Краен оярск-2012
Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики Сибирского отделения Российской академии наук (ИБФ СО РАН) и научно-образовательном центре «Енисей» Сибирского Федерального университета
Научный консультант: Волова Татьяна Григорьевна,
доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией ИБФ СО РАН
Белобров Петр Иванович, доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник ИБФ СО РАН
Судачкова Нина Евгеньевна доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник ИЛ СО РАН
Жукова Наталья Владимировна доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник ИБМ ДВО РАН
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного Отделения РАН (ТИБОХ ДВО РАН)
Защита состоится «_»__года в_-00 час. на заседании
диссертационного совета Д 003.007.01 при Федеральном Государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики Сибирского отделения Российской академии наук по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д.50, стр.50, конференц-зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального Государственного бюджетного учреждения науки Института биофизики Сибирского отделения Российской академии наук.
Научный доклад разослан «_»_2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета д.б.н.
Официальные оппоненты:
Ведущая организация:
ст
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Многообразие форм живой материи и новые знания в области физики и химии живых систем позволяют конструировать биологические системы различной степени сложности и организации для синтеза широчайшего спектра макромолекул. Ценным продуктом биотехнологии являются резервные соединения липидной природы - полимеры гидроксипроизводных жирных кислот (полигидроксиалканоаты, ПГА), которые обладают широким спектром ценных свойств, включая биосовместимость и биоразрушаемость, и перспективны для различных сфер применения (Anderson, Dawes, 1990; Madison, Huisman, 1999; Steinbüchel, Lütke-Everson, 2003; Chen, 2010; Волова, Шишацкая, 2011).
Микроорганизмы являются источником для получения разнообразных целевых продуктов пищевого, кормового, медицинского и технического назначения. Знание закономерностей влияния физико-химических условий среды на рост и синтез клеточных макромолекул является научной основой для разработки новых биотехнологий. Процессы микробного синтеза делятся на два типа: 1) связанные с ростом клеток и образованием биомассы и происходящие со скоростью размножения клеток; 2) и происходящие или ускоряющиеся при замедлении скорости роста клеток (Перт, 1978; Работнова, 1975, 1984). Оптимизация обоих типов процессов осуществляется различными путями в зависимости от того, насколько совпадают скорости роста конкретного продуцента со скоростью синтеза макромолекул той или иной природы. Процесс микробного роста - это процесс синтеза первичных метаболитов (аминокислот, органических кислот, витаминов, нуклеотидов, промежуточных продуктов катаболизма) и их сборка в основные клеточные макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты). Оптимизация накопления биомассы клеток в культуре и синтеза первичных продуктов обмена сводится к оптимизации условий питания и созданию условий для сбалансированного роста продуцента. Накопление продуктов обмена запасной природы (полифосфатов, полисахаров, липидов) имеет место при несбалансированном росте вследствие исчерпания из среды какого-либо компонента питания для клеток и ограничения роста и синтеза основных (азотсодержащих) клеточных компонентов. Оптимизация процесса синтеза запасных соединений более сложна, так как требует специальных знаний о закономерностях образования этих макромолекул и специфических подходов в каждом конкретном случае. При ограничении роста микроорганизмов субстратными компонентами происходит замедление скорости роста клеток, сопровождающееся значительными изменениями химического состава, главным образом, соотношения основных и запасных макромолекул. Выявление принципиальных закономерностей этих изменений открывает широкие возможности для направленного синтеза клеточных макромолекул и получения целевых продуктов микробиологического процесса.
Изучение фундаментальной основы для разработки эффективных технологий получения целевых продуктов требует комплексных подходов. Ключевые задачи, решение которых необходимо для разработки и реализации эффективных технологий биосинтеза полигидрокисалканоатов, вытекают из следующих особенностей биотехнологии этих ценных макромолекул:
Первое, прокариотические микроорганизмы синтезируют полимеры гидроксипроизводных жирных кислот (ПГА) в специфических условиях несбалансированного роста в качестве эндогенного депо энергии и углерода. Эти условия специфичны: для одних продуцентов таковыми является дефицит азота в среде, для других - дефицит фосфатов, кислорода или иных компонентов субстрата (Lee, 1996; Steinbüchel, Füchstenbusch, 1998; Kessler, Witholt, 2001; Park et al., 2011). Поэтому для эффективного получения ПГА необходим поиск и оценка новых продуцентов и выявление факторов, максимизирующих выходы полимеров.
Второе, ПГА - это семейство полимеров различного состава, физико-химические свойства которых (молекулярная масса, кристалличность, скорости разрушения в биологических средах) значительно варьируют в зависимости от химического строения (Сох 1994; Ashraf et al., 1999; Chia et al., 2010). Выявление микроорганизмов и условий, позволяющих получать полимеры различного химического состава - необходимая часть разработки способов синтеза новых полимеров с заданными свойствами.
Третье, масштабы производства и широкого применения ПГА во многом зависят от их стоимости, определяемой, прежде всего, видом и стоимостью используемых субстратов (Нерпег, 1996; Hazenberg, Witholt, 1997; Choi, Lee, 1999). Поэтому изыскание штаммов-продуцентов, способных синтезировать ПГА на доступном сырье, включая отходы производств, - важная задача биотехнологии этих ценных макромолекул.
Это определило направление исследований настоящей работы, ориентированной на выявление новых штаммов-продуцентов и комплексное исследование закономерностей и условий эффективного синтеза ПГА.
Цель и задачи исследования - поиск новых продуцентов ПГА среди представителей фото- и хемолитоавтотрофных прокариотических микроорганизмов и выявление факторов, усиливающих продукцию полигидроксиалканоатов в качестве научной основы для эффективной технологии биосинтеза.
Для достижения цели сформулированы следующие задачи:
- выбор штаммов, обладающих способностью к синтезу и внутриклеточной аккумуляции ПГА среди сине-зеленых, светящихся, аэробных карбоксидобактерий и водородокисляющих прокариот;
- сравнительное исследование особенностей состава липидов и выходов ПГА у сине-зеленых, светящихся и водородокисляющих прокариот -потенциальных продуцентов ПГА;
- изучение влияния условий культивирования на синтез внутриклеточных компонентов запасной и основной природы и выявление факторов, усиливающих продукцию ПГА у отобранных штаммов-продуцентов;
- исследование закономерностей функционирования клеточного цикла ПГА, протекторной роли и влияния ПГА на физиолого-биохимические характеристики штамма-продуцента;
- определение условий для синтеза полимеров различной химической структуры в качестве научной основы для эффективной продукции ПГА, в том числе на новых субстратах.
Научная новизна. Получены новые данные по составу липидов светящихся, водород- и СО-окисляющих бактерий - потенциальных продуцентов ПГА. Установлен характер ответа культур бактерий на воздействие условий, заключающийся в изменении состава жирных кислот липидов как фактора адаптации к воздействию экстремальных факторов. Неоптимальные значения физических параметров среды (температура, рН), условия газового субстрата (Нг, СО2, Ог) и присутствие ингибитора роста (СО) не вызывают существенных перестроек конструктивного метаболизма. При лимитировании роста бактерий минеральными макроэлементами (КГ, Б, Р, К, М§) происходит перераспределение в составе клеточных макромолекул в сторону усиления синтеза резервных соединений липидной природы - полигидроксиалканоатов (ПГА). Выявлена взаимосвязь между физиологическим состоянием бактерий ЯаШота егйгорка, внутриклеточным пулом полимера 3-гидроксимасляной кислоты (ПЗГБ) и активностью ключевых ферментов клеточного цикла ПЗГБ. Представлены доказательства обратимости физиологического состояния неделящихся клеток, заполненных гранулами полимера на 90 %. Доказана возможность синтеза природными штаммами прокариот гетерополимерных ПГА, содержащих в своем составе коротко - и среднецепочечные мономеры.
Практическая_значимость. Комплексное исследование
микробиологических процессов синтеза ПГА обеспечило разработку и реализацию технологии получения ценных полимеров различного состава в условиях опытного производства на различных субстратах, включая уникальный процесс синтеза ПГА на синтез-газе из бурых углей. Полученные экспериментальные ПГА позволили организовать широкие исследования полимеров и изделий из них для различных сфер применения.
Положения, выносимые на защиту:
1. К наиболее перспективным продуцентам ПГА относятся водородокисляющие бактерии и, в меньшей степени, светящиеся бактерии.
2. Адаптивная реакция к воздействию экстремальных факторов проявляется на уровне мембран: стимулируется синтез циклопропановых кислот, варьирует насыщенность липидов. Отклонения физических параметров среды (температура, рН) от оптимальных значений и присутствие ингибитора роста (СО) не вызывают существенных перестроек конструктивного метаболизма. При лимитировании роста бактерий минеральными макроэлементами происходит перераспределение в составе клеточных макромолекул: на фоне снижения концентрации основных (азотсодержащих) компонентов отмечено усиление синтеза резервных макромолекул - соединений липидной природы - полигидроксиалканоатов.
3. Доказана обратимость физиологического состояния неделящихся клеток, практически полностью заполненных гранулами полимера, то есть возможность их перехода к активному физиологическому состоянию в результате деградации и усвоения ПГА.
4. При добавках углеводородных кислот природные штаммы хемолитотрофных водородокисляющих бактерий синтезируют гетерополимерные ПГА, содержащих в своем составе мономеры с короткой и средней длиной углеродной цепи.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на УП, X, XI Всесоюзных совещаниях по вопросу круговорота веществ в замкнутой системе на основе жизнедеятельности низших организмов (г. Канев, 1972, 1079, 1981); на XI научно-координационном совещании по теме 1-84 (г. Ташкент, 1974); на Всесоюзном совещании по управлению биосинтезом водородных бактерий и других хемоавтотрофов (г. Красноярск, 1976); на II Всесоюзной конференции по биосинтезу и метаболизму липидов и микроорганизмов (г. Москва, 1979); на 7-ом симпозиуме по подготовке биологических проб для хроматографии (Швеция, Лунд, 1995); на 13 Международном симпозиуме по растительным липидам (Испания, Севилья, 1998); на Международном симпозиуме по биополимерам 18ВР02 (Германия, Мюнстер, 2002); на 20М Конгрессе Европейских Микробиологов (БЕМБ, Испания, Мадрид, 2006); на 4-ом Европейском симпозиуме по биополимерам Е8ВР07 (Турция, Кусадаси, 2007); на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов с международным участием «Биохим-2008» (Новосибирск, 2008); на V международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды (Ростов-на-Дону, 2009); на 14-м Европейском Конгрессе по биотехнологии (Испания, Барселона, 2009).
Работа выполнена в рамках плановой тематики НИР ИБФ СО РАН (№№ государственной регистрации: 01201000937; 0120.0404601; 01.200703092) и базовой кафедры биотехнологии Сибирского федерального университета в рамках научно-образовательного центра «Енисей» при поддержке Министерства образования РФ и Американского фонда гражданских исследований и развития (СТШР) (гранты ЫЕС 002, ЬШХ0-002-КК-06, ВС5202, ВС8102); Международного научно-технического центра (МНТЦ-18ТС, проект № 2218); РФФИ (гранты №№ 05-04-08024офи-а, 07-03-00112-а, РФФИ-КФН 02-04-97701); Красноярского краевого фонда науки (ККФН) (гранты №№ 9П54С, 13С028, 150104, 16С104); Программы Интеграционных программ Сибирского отделения РАН (проекты № 96 «Фундаментальные основы биотехнологического получения целевых продуктов и препаратов»); Программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенциала высшей школы» (проекты №№ 2.1.1.528; РНП-11); мега-гранта по Постановлению Правительства РФ № 220 от 9 апреля 2010 г. «Для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в Российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования» (проект «Биотехнология новых биоматериалов», договор 1 Ю34.31.0013).
Благодарности. Автор выражает благодарность и глубокую признательность всем коллегам, оказавшим помощь и поддержку на разных этапах выполнения данной работы, и в первую очередь, своему научному консультанту д.б.н., профессору Воловой Татьяне Григорьевне, с которой начинали работать еще в далекие 80-годы и без поддержки которой данная работа
вряд ли состоялась; д.б.н. Шишацкой Екатерине Игоревне, к.б.н. Жиле Натальи Олеговне, к.б.н. Бояндину Анатолию Николаевичу. Отдельная благодарность д.б.н. Сущик Надежде Николаевне за ценные советы и замечания в оформлении рукописи. Я благодарна ведущим специалистам в области исследования липидов за счастливую возможность учиться у них высокому уровню научного ремесла чл.-корр. РАН Васьковскому Виктору Евгеньевичу; д.б.н., профессору Костецкому Эдуарду Яковлевичу; к.б.н. Латышеву Николаю Алексеевичу.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 70 работ, включая 60 статей в центральных РФ и зарубежных журналах, из них 60 статей в журналах, входящих в список ВАК.
Вклад автора: Планирование и проведение экспериментов, проведение всех химических анализов, обработка и анализ полученных результатов, подготовка публикаций.
Структура работы. Научный доклад изложен на 71 странице машинописного текста и содержит 30 таблиц и 16 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования
Для выявления потенциальных продуцентов ПГА исследован широкий спектр прокариотных микроорганизмов с различным типом питания -хемоавтотрофы, фотоавтотрофы и гетеротрофы из коллекций: ИБФ СО РАН CCIBSO 836; Сибирского федерального университета, зарегистрированной во Всемирном центре баз данных микроорганизмов (WDCM) под № 936; литотрофных культур Института микробиологии АН СССР.
Для непрерывного автотрофного культивирования бактерий применяли аппараты, работающие в режимах хемостата или турбидостата, сконструированные в ИБФ СО РАН (Пономарев и др., 1969; 1974); периодический процесс осуществляли в строго стерильных условиях с использованием модульного настольного автоматизированного
ферментационного комплекса Bio-Flo 110 («New Brunswick Sei, Inc.», США) и качалки.
Химический состав клеток определяли общепринятыми методами (Ермаков и др., 1972).
Липиды из сырой биомассы выделяли по методу Фолча смесью хлороформа и метанола (2:1 по объему). В полученном экстракте ПГА отделяли от липидов осаждением двойным объемом гексана. Экстракт липидов высушивали на роторном испарителе и в дальнейшем подвергали метанолизу для получения метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК). Для получения жирных кислот, входящих в ЛПС клеточной стенки, обезжиренную биомассу омыляли 1 N раствором КОН в 95% этаноле при нагревании на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа. Затем добавляли двойной объем воды, подкисляли, экстрагировали жирные кислоты гексаном и синтезировали МЭЖК. Метанолиз жирных кислот проводили в смеси метанола и серной кислоты (50:1 по объему) при температуре 90°С в течение двух часов. МЭЖК анализировали на
хромато-масс-спектрометре GCD Plus ("Hewlett Packard", США) или 6890/5975C ("Agilent Technologies", США) (Kalacheva et al., 2002). Идентификацию жирных кислот проводили сравнением их времен удерживания и масс-спектров с таковыми имеющихся стандартов; использовали насыщен�
-
Калачева, Галина Сергеевна
-
доктора биологических наук
-
Красноярск, 2012
-
ВАК 03.01.06
- Технико-технологические основы биосинтеза резервных полигидроксиалканоатов водородными бактериями
- Технико-технологические характеристики процесса биосинтеза биоразрушаемых полимеров и реализация опытного производства
- Морфологическая гетерогенность колоний Alcaligenes eutrophus и Photobacterium leiognathi
- Влияние газового субстрата на гидрогеназную активность и концентрации цитохромов в клетках водородокисляющих бактерий
- Метаболические аспекты биосинтеза полигидроксибутирата/валерата аэробными метилобактериями
