Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Технико-технологические основы биосинтеза резервных полигидроксиалканоатов водородными бактериями

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Технико-технологические основы биосинтеза резервных полигидроксиалканоатов водородными бактериями"

На правах-рукописи

Киселев Евгений Геннадьевич

ТЕХНИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОСИНТЕЗА РЕЗЕРВНЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ ВОДОРОДНЫМИ БАКТЕРИЯМИ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

10 ЯНВ 2013

Красноярск-2012

005048206

Работа выполнена в лаборатории хемоавтотрофного биосинтеза Института биофизики СО РАН и базовой кафедре биотехнологии ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Волова Татьяна Григорьевна

Официальные оппоненты:

Величко Надежда Александровна, доктор технических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет», институт пищевых производств, директор

Литовка Юлия Александровна, кандидат биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет», доцент кафедры химической технологии древесины и биотехнологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт химии и химической технологии Сибирского отделения Российской академии наук»

Защита состоится «¿?<Г» uutufct2012 года в ifl^ ч на заседании диссертационного совета Д 212.253.01 при ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет» по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира, 82, аудитория Ц-110 (зал заседаний).

Отзывы на автореферат в двух экземплярах с подписями, заверенными печатью, просим направлять по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира 82, Сибирский государственный технологический университет, учёному секретарю. E-mail: dissovetsibgtu01@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского государственного технологического университета.

Автореферат разослан « &с? 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор технических наук, профессор

Исаева Елена Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Биотехнологические процессы обеспечивают производство широкого спектра целевых продуктов медицинского, пищевого, кормового, и технического назначения. Ценным продуктом биотехнологии являются макромолекулы запаснэй природы - полимеры гидроксипроизводных алкановых кислот (полигид-роксиалкапоаты) - термопластичные линейные полиэфиры, характеризующиеся способностью разрушаться в биологических средах до конечных продуктов, безопаспых для природы. Актуальность перехода на новые, экологические чистые материалы связана с тем, что объемы выпуска синтетических пластмасс приближаются к 300 млн. тонн в год; основная их часть скапливается на свалках и аккумулируется в Мировом океане, создавая глобальную экологическую проблему. Острота пробпшы связана также с экономической ситуацией, так как до 98 % полимерных материалов производится из невозобновляемого ископаемого сырья - нефти и газа, запасы которых истощаются.

В настоящее время все бспыпее значение приэбретают экологически чистые материалы, источником которых служат биомасса растений и продукты микробиологического синтеза (так называемые биополимеры). Фундаментальные исследования потенциала биологических агентов и биосжтем, оригнгированные на получение научной основы для развития индустрии экологически чистых полимерных материалов -актуальное и высокорейтинговое направление критических технологий мирового уровня. Освоение биополимеров реализуется в рамках междисциплинарных исследований, главными цзлями которых являются: поиск и изучение новых биополимеров; получение фундаментальной основы для конзтруирования биологических систем, эффективно синтезирующих полимеры с заданными свойствами.

Среди применяемых и активно разрабатываемых новых биоразрушающихся полимеров, наряду с полшиктидами, — тлигидроксиалканоахы (ПГА). Эта полимеры активно исследуются за рубежом; в сфере коммерциализации ПГА заняты многие фирмы и промышленные компании («Монсанго К°», «Mstabolix Inc.», «Tepha», «Procter & Gambeb и др.). В России индустрия разрушаемых полимеров не создана; исследования, направленные на разработку биотехнолопмеских процессов синтеза собственно ПГА - в сфере внимания нескольких академических институтов (Институт физиологии и биохимии микроорганизмов РАН, Институт биохимии им. АЛ База РАН, Инстшуг биофизики СО РАН).

Решающим фактором для широкомасштабного получения и применения ПГА является снижение их стоимости. В связи с тем, что 40-50 % затрат приходится на долю исходного углеродного сырья и до 18-20 % — на процесс экстракции и очистки полимера, магистральное направление исследований, определяющее стратегию промышленного производства ПГА, связало с возможностями расширения сырьевой базы, а также поиском высокопродуктивных штаммов-продуцентов и разработкой эффективных биотехнологий синтеза.

Одними из перспективных продуцентов ПГА являются водородокисляющие бактерии, обладающие способностью синтезировать полимеры различного состава с высокими выходами па смесях СОг и Нг и также на органических субстратах (Завар-зив, 1979; Шабанов с соавт., 2005). Исследовали; закономерностей синтеза ПГА m

различных субстратах, проведение сравнительной оценка эффективности технологических режимов необходимы дня разработки эффективных технологий получения этих цгнных макромолекул. Это определило тематику настоящей работы, направленной на разработку технологии синтеза ПГА за счет привлечения новых штаммов и субстратов, отработки процесса экстракции полимера, проведение технико-экономических исследований в качестве научной основы для получения исходных данных, необходимых для масштабирования технологии.

Цель и задачи исследования: Разработка технико-технологических характеристик процессов биосинтеза полигидроксиалканоатов водородными бактериями ш различных субстратах в качестве основы для разработки технологии их получения.

Для достижения цели сформулированы следующие задачи:

- изучение кинетических и продукционных показателей бактерий СирпсмАя еШтрИия в лабораторных условиях с использованием авютрофного (смеси Н2, СОг и СУ и гетеротрофного (глюкоза) субстратов;

- исследование и отработка режимов (хемостатного, шриодического, проточно-периодического) выращивания бактерий на смеси Н2, СОг и СЬ для повышения выходов ПГА и сокращения длительности процесса;

- изучение влияния физиологической активности инокулята, исходной концентрации клеток в инокуляте на продуктивность синтеза ПГА культурой С. еиЬюрИия на глюкозе;

- разработка и реализация режимов культивирования бактерий С. еШгорки для получения ПГА, различающихся составом мономеров;

- сравнительный анализ методов экстракции ПГА с применением различных реагентов

- технико-экономический анализ биотехнологических процессов синтеза ПГА на различных субстратах;

- получение исходных данных и разработка технологии производства ПГА

Научная новизна: Исследована культура бактерии С. еийгорЪиь в различных

режимах выращивания; получены новые данные о закономерностях синтеза полигидроксиалканоатов, составившие основу для разработки технологии их получения. Изучены кинетические и продукционные характеристики культуры в условиях автотроф-ного (смеси Н2, СОг и 0£) и гетеротрофного (глюкоза) питания; определены затраты субстратов на образование ПГА и эффективность их использования. Установлены оптимальные для условия биосинтеза: исходная концентрация и физиологическая активность инокулята, режимы подачи лимитирующего субстрата (азота), стимулирующего внутриклеточную аккумуляцию ПГА Это позволило разработать хемосташо-периодические режимы синтеза ПГА в ашшрофном и гетеротрофном, режимах. Изменение режима углеродного пшания, заключающегося в регламентированной подаче в культуру второго углеродного субстрата (валерата, гексаноата, у-бугиролактона), позволило разработать и реализовать технологию получения полимеров, различающихся физико-химическими свойствами. На основании сравнительного исследования режимов экстракции ПГА из биомассы с применением растворителей и поверхностно-активных веществ предложены методы, обеспечивающие полноту извлечения полимера свыше 96 % без существенного изменения молекулярно-массовых характеристик различной чистоты.

Практическая значимость: Выполнен сравнительный технико-экономический анализ лабораторных процессов синтеза ПГА кушлурой С. еШторЬт при различных субстратных сценариях. На основе полученных экспериментальных результатов культивирования бактерий на глюкозе разработала технология, позволяющая повысить выход продукта более, чел в два раза. Технология опытного производства полимеров (ПГА) реализована в проекте «Лаборатория биотехнологии новых биоматериалов».

Положения, выпосимые на защиту: В рамках специальности 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология) (п.З - изучение и разработка технологических режимов выращивания микроорганизмов-продуцентов направленного биосинтеза биоразрушаемых полимеров, изучение их состава, технико-экономических критериев оценки; п.4 - изучение и разработка процессов сгущения биомассы, экстракции выделения, фракционирования, очистки контроля целевых продуктов) на защиту выносится:

- кинетические и продукционные характеристики хемостатной и периодической культуры СирпаясЬз еи1горЬиз, выращиваемся в аптотрофных (СС^СЬ^Ь) и гетеротрофных (глюкоза) условиях питания, на основе которых разработаны режимы культивирования с содержанием ПГА, соответственно, (75±5) и (85±5) % при достигнутых урожаях биомассы до 50 и 110 гУщ

- результаты сравнительного исследования методов экстракции ПГА из биомассы бактерий и предложенные методы, обеспечивающие более полное извлечение полимера из биомассы бактерий (96 %) для различных областей применения;

- технико-экономический анализ биотехнологаческих процессов синтеза ПГА на различных субстратах; технология синтеза полимеров на глюкозе.

Работа выпалвгна в рамках плановой тематики ИБФ СО РАН (государственная регистрация № 01.200703092) и базовой кафедры биотехнологии СФУ в рамках инновационного проекта «Организация производства разрушаемых биополимеров и изделий из них па новых субстратах, продуктах переработки низкосортных углей» (проект № 31 2008 г.); Программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенциала высшей школы» (2008-2011 г.г. проект РНП-11); проекта ККФНПДиНД «Создание (ЗМР пилотного производства разрушаемых биопластиков «Биопластоган» (2011 г.); мега-граптов по Постановлению Правительства РФ от 9.04.2010 г., № 219 «Развитие системы инфраструктурной поддержки исследовательской, инновационной и образовательной деятельности, а так же инновационных проектов и комплексных программ на приоритетных направлениях научно-технического развития, реализуемых по инициативе СФУ на базе технологических платформ» (договор № 13.G38.31. 0009) и № 220 «Для государственной поддержки тучных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в Российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования» (договор № 1 Ю34.31.0013).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международном научном семинаре с молодежной школой «Биотехнология новых материалов и окружающая среда» (Красноярск, 2012); «Лесной и химический комплексы - проблемы и решения» (Красноярск, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, в т.ч. 1 статья в специализированном журнале перечня ВАК

Вюид автора; Планирование и проведение экспериментов по исследованию кинетических и продукционных характеристик культуры, способам экстракции полимеров; обработка и анализ результатов, выполнение ТЭО процесса, участие в проектирований опытного производства полимеров; подготовка публикаций.

Структура работы. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и содержит 19 таблиц, 31 рисунок, 3 приложения; включает обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результаты и их обсуждение (5 глав), заключение, вывода. Список цитируемой литературы включает 149 источников, в т.ч. 114 зарубежных.

Содержание работы

Во введении обоснована актуальность работы и ее вклад в решение проблемы создания тучной основы для биогехнологаческого производства материалов нового поколения — разрушаемых полиэфиров гидрокиеалкановых кислот (патигидроксиал-капоатов).

В первой главе - литературном обзоре - представлен анализ литературы по проблеме поиска альтернативных экологически безопасных технологий синтеза экологически чистых материалов нового поколения взамен аккумулируемым в природе синтетическим полимерам. Рассмотрены продуценты, субстраты и биотехнологические способы синтеза ПГА продуцентами различных таксонов на индивидуальных соединениях и отходах; свойства и потенциал этих биополимеров. Охарактеризованы современные масштабы производства ПГА и области применения. Проанализированы и выделены ключевые факторы, влияющие на технико-экономические показатели производства и стоимость полимеров этого класса. В заключительном разделе представлен анализ потенциала водородокисляющих микроорганизмов, способных к синтезу ПГА на различных субстратах.

Во второй главе описаны объекты и методы исследования. Исследован штамм водородокисляющих бактерий, зарегистрированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов: Cupriavidus etitrophus В-10646 (прежнее систематическое название Ralstoma eutrvphus), обладающий устойчивостью к •у-буторолак-тону, солям алкашвых кислот и характеризующийся способностью к синтезу ПГА различного химического строения в автотрофных и гетеротрофных условиях. Для выращивания бактерий за основу принята солевая среда Шлегеля (Schlegel, 1961). При авютрофном культивировании в качестве основного ростового субстрата использовали газовую смесь в соотношении СОг: О2: Н2 = 1:2 :7 по объему, при гетеротрофном -ппокозу.

Для процессов культивирования использовалось следующие оборудование: шейкер-инкубатор bmcrva 44, автоматизированные ферментационные комплексы BioFlo 115 «New Brunswick Scientific» (США), самостерилизуемый ферментером NLF 22 фирмы «Bioengmeetmg» (Швейцария). Внутриклеточную концентрацию ПГА, остаточных липидов и жирных кислот определяли ва хромато-масс-спектрометре «Agilent 7820»; молекулярную массу ПГА - с использованием системы гель-проникающей хроматографии «Agilent 1200». Ренггеноструктурный ашлиз и определение степени кристалличности образцов ПГА выполнены на рептгеноспгктромегре

D8 ADVANCE «Вшкег» (Германия). Термические свойства наследованы методам ДСК с использованием прибора фирмы «NETZCH» (Германия).

В третьей, четвертой и пятой главах - обсуждение результатов.

1 Кинетические и продукционные характеристики автотрофной культуры водородокисляющих бактерий Cupriavidus eutrophus в режиме синтеза резервных полигидр оксилака! шагов

В связи с тем, что ПГА синтезируются при несбалансированном росте и используются клетками в качестве эндогенного депо энергии и углерода, получение высоких выходов по биомассе с высоким внутриклеточным содержанием полимера проблематично. Факторы, обеспечивающие суперпродукцию ПГА, видо- и пггаммоспецифич-ны, поэтому основополагающей задачей для биотехнологии этих биомолекул является исследование и нахождение условий, максимизирующих выходы ПГА у конкретных штамме®.

Характеристики автотрофной культуры бактерий С. eutrophus В-10646 в режиме аккумуляции ПГА в хемостате.

Ограничение роста бактерий, вызвашюе дефицитом минеральных элементов, изменяло соотношение внутриклеточных макромолекул в сторону аккумуляции резервных соединений, ПГА представленных гомополимером 3-щзроксимасляной кислоты - поли-3-гвдфоксибутиратом (ПЗГБ). Содержание полимера составило максимально (около 40 %) при азотном лимите; до 20-25 % при лимитировании роста бактерий по сере и фосфору, наименьшее содержание полимера наблюдалось при лимитировании калием и магнием. Наиболее высокие значения внутриклеточной концентрации ПГА на моноуглеродном субстрате (СОг), были получены при снижение удельной скорости роста бактерий (jx) до 0,1 ч"1.

Положительным моментом хемостатнош режима является возможность получения целевого продукта неограниченно во времени, пггативным - весьма низкое содержание биомассы в культуре (не более 5 %) и полимера в клетках (около 40 %). При этом возникает необходимость введения в технологическую цепочку непрерывно работающего энергоемкого блока разделения низкоплотной (не выше 0,05 %) культу-ралыюй среды. Дальнейшее углубление лимита по элементам и вытекающее из этого снижение скорости протока среды повышает вероятность контаминации.

Характеристики роста и синтеза ПГА бактериями С. eutrophus В-10646 при гетеротрофных условиях питания. Продукционные характеристики автотрофной культуры С. eutrophus В-10646 сопоставимы с характеристиками культуры R.eutropha В-5786, поэтому изучение различных режимов выращивания проводилось на бактериях С. eutrophus В-10646. Отличие режимов заключалось в варьировании входного потока лимитирующего элемента (азот) и длительности процесса (рисунок 1).

Первый режим при отсутствии лимитирования по азоту, обеспечил накопление биомассы до 30 г/л за 70 ч, содержание ПЗГБ составило 55 % (рисунок 1а).

Второй режим осуществлялся в два этапа; первый - 35 ч на полной питательной среде с непрерывной подачей азота в культуру (120 мг/г биомассы); второй - в без-аэотной среде. В конце первого этапа содержание полимера в клетках не превышало 35 %. Второй этап - 45 ч обеспечил увеличение внутриклеточного содержания ПЗГБ в

т, ч

а) полная среда

б) ¡-полная среда; П-без соота

Кг^.Ц.ч'. ч'\ ШГБ, %

* >:Я: | XV

—- 'пзгк ,«'1

У Г /

/ Л / * /' / К * 1 1 1А

£ ? У /Ъ П1

В 10 ?В 19 40 69 ш -о

г, ч

в) I— 50 % лимит по азоту; В— без азота

/¿-удельная скорость роста, ч1; ПЗГБ- концентрация, %;

Х—шщентраци биомассы, зЬ; Цгпгб -удельная скорость синтеза ПЗГБ, %

Рисунок 1 - Исследованные режимы выращивания С. е1йюрЫ.ч в режиме синтеза ПЗГБ

клетках до 70 % (рисунок 16).

На рисунке 1в приведены результаты третьего режима периодического культивирования бактерий, при кагором на первом этапе подача азота в культуру была снижена до 50 мг/г биомассы. На первом этапе (30-35 ч) на фоне снижения удельной скорости роста бактерий от 0,19 до 0,1 ч"1, концентрация биомассы достигла 15 г/л, содержание ПЗГБ (45 ± 5) %. При этом удельная скорость синтеза ПЗГБ увеличивалась от 0,09 до 0,27 ч"1.

На втором этапе процесса, в хода выращивания бактерий на среда без азота, концентрация полимера в клетках возрастала на фоне падения удельной скорости синтеза. Концентрация биомассы составила (45±2) г/л, содержание полимера (70±5) %. Общая продуктивность по биомассе и ПЗГБ: 0,7 и 0,55 г/л-ч соответственно, время ферментации - 70 ч.

Полный цикл процгсса, включая этап получения инокулята в колбочной культуре (20-24 ч), составляет (90±5) ч.

Синтез ПГА С. еШюрНия В-10646 в хемостстно-периодическам процессе культивирования. На основании полученных результатов предложен и исследован новый авготрофный двусгадийный хемо-статно-периодический процесс культивирования бактерий С. еи!гор1шя дня излучения ПГА На первом этага осуществляли проточный хемосгатный режим с подачей полной солевой среда и азота на уровне 80-90 % от полной физиологической потребности при скорости протока ОД ч"1. Это позволило получить посевной материал с концентраций биомассы в культуре и внутриклеточном содержании полимера (4±1) т/л и (8±2) %, соответственно. Далее проточный режим прекращали и переходили на лимитированную подачу азота (50 мг/г биомассы). Спустя 25 ч подачу азота в культуру останавливали.

Далее процесс проводили на среде без подачи азота в течение 35-40 ч. К концу опыта содержание полимера в клетаах составило (70±5) %, концентрация биомассы (45±2) г/л.

Предложенный режим сократил стадию получения инокулята и первый этап периодического процесса и позволил в течение 70 ч получить высокие выходы продукта при общей концентрации биомассы до (45±2) г/л. Продуктивность процесса составила: по биомассе 0,7 г/л-ч, по полимеру 0,55 г/л-ч.

2 Характеристики роста и синтеза ПГА бактериями С. еШгоркш В-10646 при гетеротрофных условиях питания

Ранее процесс культивирования на глюкозе не был реализован, так как штамм Кеи^орЬа В5786 из Сахаров утилизировал только фруктозу, а Кеи^орка В8562 имел небольшой интервал границ физиологической устойчивости (концентрация глюкозы 5 - 10 г/л), что приводило к неустойчивому росту. Бактерии исследуемого штамма С. еШгоркш В-10646 способны к росту на сахарах (фруктоза, глюкоза), органических кислотах, аминокислотах спиртах и др.

Установлено, что концентрация глюкозы для данного штамма в периодической культуре не должна бьггь ниже 5 и выше 35 г/л, последнее значительно выше, чем у ранее полученного штамма И еи/го/>/кг В8562 (15 г/л).

Влияние физиологической активности посевного материала на длительность лаг-фазы, удельную скорость бактерий, выходы ПГА и урожай биомассы. Результаты исследования влияния внутриклеточного пула ПГА на длительность пзпб.%,х,г/л лаг-фазы и последующую динамику

накопления биомассы и ПЗГБ в культуре показаны на рисунке 2.

В зависимости от исходной концентрации полимера в клетках (5, 10, 25 и 40 %) длительность лаг-фазы составляла от 2-4 до 8-10 ч и более. Если исходная концентрация полимера в посевном материале была равной 5 и 10 %, через 2-4 ч регистрировали увеличение концентрации биомассы. Конечная концентрация биомассы зависела от показателей первой фазы "процесса, на которую влияла исходная концентрация полимера в инокуляте.

При содержании полимера свыше 10 % (25 и 40 %) физиологическая активность инокулята снижена, длительность лаг-фазы составила, соответственно 6 и 8 ч, что негативно сказывалось на продукционных показателях культуры. В первые часы отмечено снижение внутриклеточной концентрации полимера в результате его эндогенной утилизации, и только после снижения концентрации полимера в клетках до 10 % начинался рост клеток. В

1 \ о

- '/Д

- / у

¿А /У ►

4 1 * V "о II «

Рисунок 2 - Влияние исходной концентрации ПЗГБ в посевном материале С. еШгоркш на длительность лаг-фазы и динамику накопления биомассы (кривые 1,2,3 и 4 соответственно) и выходы полимера (5, 6, 7)

цепом за процесс ферментации (60 ч) концентрация биомассы в зависимости от содержания ПЗГБ в инокуляте составит от 45 до 65 г/л.

Влияние концентрации клеток в посевном материале на кинетические и продукционные характеристики культуры С. еМгорЬш. Применение более концентрированного инокулята, наращивание которого в условиях колбочной культуры на качалке неизбежно сопровождается увеличением содержания полимера, приводит к увеличению длительности лаг-фазы и снижению продукционных показателей культуры. Для повышения продуктивности процесса инокулят выращивали до получения концентрации клеток не выше (1,0±0,2) г/л и содержаниям полимера в них (8±2) %. Далее в стерильных условиях инокулят концентрировали и переносили в ферментёр.

На рисунке 3 представлено влияние исходной концентрации клеток в инокуляте на конечную концентрацию биомассы. Использование более концентрированного посевного материала позволило увеличить конечную концентрацию биомассы до 120 г/л.

Продуктивность процесса при стартовой концентрации инокулята 4,8; 8,3 и 15,0 т/л составила: по биомассе 1,13; 1,46; 2,00 г/л-ч, по ПГА0,87; 1,20; 1,70г/л-ч, соответственно. Затраты глюкозы - (2,7±0,1) г/г биомассы и (2,9±0,1) г/г полимера.

Таким образом, исследованы процессы синтеза ПГА в различных условиях питания в культуре С. еиТгорких В-10646 и показано, что автоарофный процесс позволяет получать концентрацию биомассы (45£2) гУл с содержанием полимера до (75±5) %. В гетеротрофном процессе на глюкозе возможно получение до 120 г/л биомассы с содержание полимера 90 % и выше.

2 Г

>/ /1 ? о

Р

¿и/ V У

1/о

1

/с

'А

4

1-15 г/л; 2-8,3 г/л; 3-4,8 г/л Рисунок 3 - Влияние концентрации клеток в инокуляте на динамику накопления биомассы

3 Технология культивирования водородных бактерий для получения ПГА различного химического строения

Специфичность биосинтеза сополимерных ПГА, связанная с необходимостью внесения в культуру дополнительных С-субстратов, токсичных для бактерий, негативна сказывается на урожае биомассы и общем выходе полимера, потери которых, в зависимости от типа синтезируемого второю мономера и величины его включения в сополимер, могут достигать 30 %.

Разработан процесс для получения сополимерных ПГА за счёт изменения источника углеродного питания. При введении в культуру бактерий добавок солей алка-новых кислот, которые являются предшественниками для образования мономеров различного строения С-цепи, синтезирована линейка ПГА различного химического строения. Величина и режим дозированного введения в культуру второго углеродного субстрата реализованы с учётом их предельно допустимых концентраций для бактерий С-субстратов.

Культивирование С. еШгорЪт В10646 на смешанном углеродном субстрате (гшокоза+валерат калия), который вносили в конце первого этапа (25-30 ч), обеспечил получение сополимеров 3-гадроксимасляной и 3-гадроксивалериановой кислот (ПЗГБ/ЗГВ) [-СЩСгНзН^Нг-С^а Синтез сополимеров З-гвдроксибупфата/З-гидроксигексаноата (ПЗГБ/ЗГТ) [-0-СН(С3Н7)-СН2-СО-]11 вследствие более высокой токсичности для бактерий гексаноата - трудно реализуемая задача. В авготрофной культуре при добавлении гексаноата в среду получены образцы ПЗГБ/ПГ с включением ЗГГ до 5-10 мол.%. Гетеротрофный режим на глюкозе с добавлением в культуру, помимо гексаноата калия, акрилата - ингибитора кетотиолазы, фермента, расщепляющего С-цсгш мономеров, в частности гексаноата, позволил получил ъ более широкую линейку сополимеров ПЗГБ/ЗГГ. Четвертым синтезированным типом ПГА стали сополимеры 3-гадрокисмасляной и 4-гадроксимасляной кислот (ПЗГБ/4ГБ) [-О-СЕЬ-СЬ Тг-СНг-ССН,

С использованием разработанных режимов культивирования штамма С. eut.ro-рИия В10646, в условиях авготрофного и гетеротрофного роста на средах, содержащих в качестве источника углерод различные субстраты (СО2, глюкоза, масляная кислота и у-бутиролактон), синтезированы образцы сополимеров ЗГБ/4ГБ с включением мономеров 4ГБ от 6 до 28 мол %. Результаты сравнительного исследования физико-химических свойств ПГА различного химического состава показаны на рисунок 4.

т«, °с 180

' х*

» *х

60

С,, "г 80

60

40

20

• 0

¿ж

20

40

♦ пзгв

• згв

А ЗГГ

Х4Г6

60

00

Содержание второго мономера, мол % Рисунок 4 - Зависимость температуры плавления (а) и степени кристалличности (б) согкши-мерных ПГА от типа и величины фракции второго мономера

Включение в цепь ПЗГБ звеньев 4ГБ, ЗГВ или ЗГТ снижает температуры плавления и термической деградации, относительно этих величин у гомогенного ПЗГБ, с сохранением термостабилъности. Степень кристалличности сополимерных ПГА в целом ниже, чем у ПЗГБ (75±5) %. Выраженность влияния на соотношение аморфной и кристаллических фаз у сополимерных образцов усиливается в ряду:

3-пздро^ива11ерат^З-гидрокшге1есш1оаг-+4-п1дро1ссибугират. Самые низкие значения степени кристалличности (ниже 20 %) зарегистрированы у сополимеров 3-гидроксибутирата с 4-щдроксибутиратом.

Таким образом, используя разработанный двустадийный периодический режим культивирования бактерий, без существенной перестройки технологического процесса

в целом, варьируя условия углеродного питания С. еъф-оркш В10646, реализованы способы получения образцов ПГА с различным соотношением мономеров, существенно различающиеся физико-химическими свойствами.

4 Сравнительное исследование методов экстракции ПГА из биомассы клеток с применением различных методов и экстрагентов

Вторым по значимости и затратности элементом технологии производства ПГА является способ выделения полимера из биомассы клеток. Известные методы экстракции ПГА не отвечают всем необходимым требованиям (экологичность, невысокие затраты на реагенты, полнота извлечения и чистота полимера), это актуализирует совершенствование методов экстракции как необходимое условие повышения эффективности процесса в целом и снижения стоимости полимера как конечного продукта биотехнологии.

Экстракция ПГА органическими растворителями. Исследовано влияние на выход и чистоту ПГА таких факторов как: соотношение биомасса : растворитель, температура, кратность экстракции.

Экстракция ПГА из биомассы клеток растворителями, при варьировании состава экстрагентов, позволяет достичь полноты извлечения полимера (87±5) % и минимизировать примеси (таблица 1).

Добавление к хлороформу или дихлорметану этилового спирта и проведение трёхкратной экстракции с нагреванием повышает выход ПЗГБ до 92 %, однако при последующем добавлении гексана для осаждения полимера, образуется азеотропная смесь гексан - этанол. Полученные образцы содержали остаточные липиды и жирные

кислоты в количестве 2 %. Молекулярная масса (Мв) образцов составила 5,8 - 6,4 г/моль, коэффициент полидисперсности (ПД) (3,3±0,5).

Применение предварительной обработки биомассы щелочным спиртом с последующей обработкой ацетоном позволило повысить выход и чистоту полимера, однако имело значительное падение молекулярной массы полимера от 6,2-105 до 3,4-105 г/моль (рисунок 5).

Для получения высокоочшценного полимера необходима вторая стадия очистки, которая заключается в повторном растворении и осаждении, что приводи к двойному расходу растворителей. Образование азеотропных смесей делает невозможным возврат растворителей в процесс и сопряжено с образованием больших объёмов органических отходов.

Molar masa fD]

Рисунок 5 - Мшекулярно-массовое распределение ПЗГБ выделенного модифицированным методом

Таблица 1 - Результаты экстракции ГОГБ органическими растворителями различными способами

Способ экстракции, экстрагенты Время экстракции, ч Выход ПЗГБ, % Чистота ПЗГБ,% Используемые реагентьЕ экетрагент, осадите®. Расход реагентов, кг/кг ПЗГБ

без регенерации с учётом регенерации

Экстракция настаиванием Хлороформ 1:20 24 74 97,0 Хлороформ Гексан 24,5 49,0 24,5 49,0*

Экстракц ия настаиванием Дихлорметан 1:20 24 76 97,5 Дихлорметан Гексан 21,5 43,0 2,5 4,5

Трёхкратная экстракция нагреванием Хлороформ 6 82 97,8 Хлороформ Гексан 33,1 66,0 33,1 66,0

Трёхкратная экстракция нагреванием Дихлорметан 6 83,5 97,6 Дихлорметан Гексан 29,4 58,7 3,0 4,8

Трёхкрашая экстракция нагреванием Дихлорметан - этанол 6 923 98,0 Дихлорметан Этанол Гексан 17.7 10,4 52.8 2,8 10,1" (52,8)'"

Модифицированный метод: предварительная обработка биомассы спиртом при рН 10 -11 и ацетоном Дихлорметан 8 94,8 100 Этанол Ацетон Дихлорметан ШОН Гексан 10,2 2,04 12,9 0,01 22,6 3,0 2,04"" 2,8 0,01 4,8

* - азеотропная смесь хлороформ гексан (72:28); ** - азеотропная смесь этиловый спирт-дихлорметан (3,5:96,5); *** - азеотропная смесь гекеан-этанол (79:21); **** - азеотропная смесь ацетон-вода (88:12)

«Безреагентный» метод экстракции. Исследован метод выделения полимера с применением поверхностно-активных веществ, обработкой клеточной массы различными концентрациями додецилсульфата натрия (ДЦС-Ыа) при различных температурах и времени обработки (таблица 2).

Таблица 2 - Выход полимера ПЗГБ после обработки биомассы ДДС-Ыа

Номер образ- Концентрация ДДС№, Температура, "С Выход полимера, % Содержание при- Содержание липи- М.-103 1/модь ПД

ца % несен, % дов, %

1 1 20 96,42 16,65 7,5 3,4 7,1

2 Я5 20 94,83 14,37 53 3,5 6,9

3 5 20 93,14 12,92 4,8 3,9 4,2

4 1 40 95,31 14,91 4,8 4,2 4,5

5 2,5 40 92,21 12,94 2,1 4,9 3,8

6 5 40 90,13 9,91 1,9 5,8 3,4

7 1 60 93,11 12,78 1Д 5,1 2,9

8 2$ 60 89,53 9,30 0,8 6,2 2,7

9 5 60 87,38 7,07 0,4 6,3 2,7

Данный метод позволил получить образцы полимера с низким остаточным содержанием липидов (0,4 - 0,6 %), однако в полимере помимо липидов и жирных кислот, зафиксировано наличие белковых веществ в концентрации до 6 %.

С целью повышения полноты извлечения полимера и снижения количества примесей в нем исследован комбинированный метод, при котором биомассу предварительно обрабатывали раствором 5 %-го ДЦС-Ыа в течение часа при 60 С, затем центрифугировали и отмывали водой. Далее проводили очистку дихлерметанем с последующим осаждением ПЗГБ текстом. Для этого полимер, полученный па первой стадии, трёхкратно экстрагировали равными порциями дихлорметава в соотношении 1:10 при нагревании:

В полученных образцах примеси отсутствовали Степень извлечения ПЗГБ составила 98 — 99 %. Молекулярная масса составила от 6Д-105 - 6,8-105 г/моль, коэффициент псотидисперсности дня образцов лежал в пределах 2,9 - 3 X

Учитывая сложность процесса экстракции ПГА из биомассы бактерий, выполнена оптимизация технологии, основанная на регрессионном анализе многофакторного эксперимента. Найдены оптимальные параметры процесса: концентрация ДЦС-Ыа 5 %; температура 60 °С, время обработки 40 мин

5 Технология синтеза ПГА и её технико-эюшомичеасое обоснование

Технология опытного производства ПГА Получены исходные данные для проектирования опытного производства, основанные ш экспериментально достигнутых показателях синтеза ПГА культурой С. еийърЫи В-10646 ш глюкозе, которые включают: хемостатно-периодический, двустадийный процесс (лимит азота/среды без азота); стартовая концентрация инокулята (10±2) т/л; время культивирования 65 ч; выход

биомассы (11Ш0) г/л; содержали; ПГА (85±5) %; расход глюкозы (2,9±0,1) кг/кг ПГА; расход воздуха 20 ПГА; способ экстракции комбинированный, продуктивности процгсса го биомассе и ПГА, соответственно, 1,7 и 1,4 т/л-ч; расход ДЦС-№ 0,61 га/кг ПГА; расход органических растворителей 4,4 кг/кг ПГА.

На основании анализа полученных результатов и выполненного технико-экономического анализа лабораторных процессов синтеза ПГА дня масштабирования выбран вариант процесса, реализуемый на глюкозе. Разработана технологическая схема процгсса (рисунок 6).

На предфсрмстггалиоттой стадии осуществляется подготовка и стерилизация оборудования водяным паром в течение 60 мин при давлении 0,12 МПа. Для получения пара используется электрический парогенератор (2), производительностью 50 кг/ч. Стеклянные колбы, а также маточные растворы стерилизуются в автоклаве (3). Для приготовления среды используют пять растворов А, Б, В, Г, Д (Раствор А - К^РО^ №зЮ4, М£304; Раствор Б - СбНзОДе-пЩ); ЩЗО,; Раствор В - СийО,,; гпБО,; МС12; СоС12; МпС12; ЫаМо04; Раствор Г - (КЩгСО; Раствор Д - СвН^Эв или сингеэ-газ)

После стерилизации в колбах (емкость 2 л) готовят среду и вгосят культуру С. еи-ЬюрИш В10646. После чего колбы устанавливают в шейкер-ипкубатор (4) и инкубируют в течение 20 - 22 ч при 30 °С. Затем полученный инокуляг переносят в фермен-тёр-инокулятор (5), в котором уже находится приготовленная среда в количестве 10 л. Процесс выращивания биомассы в ферметёре-инокуляторе длится 4 - 6 ч в режиме хемостата. Это позволяет получить необходимое для засева производственного аппарата количество ипокулята, который концентрируют на центрифуге (8). Полученный инокуляг в количестве 100 л по стерильной посевной линии поступает в производственный ферментёр (10). Культивирование происходит в две стадии. На первой стадии происходит накопление биомассы в течение 24 ч до концентрации 40 - 50 г/л. На данном этапе используются подпитывающие растворы карбамида и глюкозы. На второй стадии лимитируют подачу азота (подпитывающий раствор карбамида). В этот момент концентрация биомассы перестаёт увеличиваться, а содержание полимера в клетках растёт. Длительность стадии составляет 30 ч.

После процесса ферментации полученная культуральная жидкость сливается в сборник (11), откуда далее поступает в вакуум-выпарную установку (12), где концентрируется до 300 - 350 г/л, а затем перистальтическим насосом (6) подается в сборник упаренной суспензии (18). Упареную суспензию подвергают дальнейшему концентрированию в цгнтрифуге (17). Полученная паста с влажностью 50 % подаётся в экстрактор (15); туда же из сборника чистого растворителя (13) подается 5 %-й раствор дрдецштсульфата натрия в количестве 4-5 л/кг пасты. Процесс экстракции ведут при температуре 60 °С в течение часа, с постоянным перемешиванием.

Затем полимер отделяют от экстракта в центрифуге (17), полученный фугат направляют на очистку, а полимер подаётся в сборник (16), оснащенный мешалкой, где промывается дистиллированной водой. От промывной жидкости готовый полимер отделяется в центрифуге (17), затем сушится и стерильно упаковывается. Для получения высокоочищеппого полимера, производят его доочистку при растворении в дихлорме-тане с последующим осаждением гексаном.

Отработаны* аоч^т как га к»ый

Оборудование: 1 - компрессор; 2 - парогенератор; 3 - автоклав вертикальный 4 - шейкер-инкубатор; 5 - ферментёр-иинощ/лятор; 6 - насос перистальтический; 7, 9, 11, 13, 14 —ёмкости; 8, 17—центрифуга; 10-производственный ферментёр; 12 — вакуум-выпарная установка; 15 — экстрактор с мешалкой; 16- ёмкость с мешалкой; 20 - аквадистиплятор электрический.

РастворА-К3РО4, ЫазРО4 М^4; Раствор Б-СцН^е^О; Н3В03; Раствор В - Си304; 7Ж)4; МС12; СоС12; МпС12; ЫаМо04; Раствор Г- (ЫН^СО

Рисунок 6 - Технологическая схема процесса производства ПГА

Технико-экономическое обоснование. Реализация устойчивых и регламентированных процессов синтеза ПГА бактериями С. еиЬгорЬия В10646 в масштабированном варианте (в биореакторах объемом от 12 до 60 л) позволило определить материальные затраты и выполнить предварительную технико-экономическую оценку способов получения полимеров при использовании различных субстратов.

Расчеты выполнены с учетом достигнутых продукционных показателей при различных субстратных сценариях, прогнозируемый объем производства 100 ООО т/г (таблица 3).

Таблица 3 - Технико-экономические показатели производства ПГА

Экономический шжазатсль Глюкоза Фруктоза Газовый

субстрат

Капитальные затраты, рубУкг ПГА 45,44 45,44 50,62

Оплата труда, рубУкг ПГА 7,36 7,36 7,85

Административные расходы, рубУкг 111А 2,88 2,88 2,88

Стоимость сырья, рубУкг ПГА 148,4 208,4 635,0

Коммунальные платежи, рубУкг ПГА 13,44 13,44 13,44

Утилизация отходов, рубУкг ПГА 11,2 1U 11,2

Себестоимость, рубУ кг ПГА 228,7 288,7 721,4

Платежи по налогам, рубУкг ПГА 26,9 18,1 -

Рентабельность при ценз реализации 350 рубУкг, % 47 18 -

Срок окупаемости, год зд 8,0 -

Прогнозная себестоимость продукта по выполненным расчетам может составить в зависимости от типа субстрата от 229 до 290 рубУкг ПГА Вариант производства на газовом субстрате при использовании модельных газов приводит к высокой себестоимости продукта и оказывается не рентабельным. Наиболее перспективным субстратом из Сахаров является глюкоза, фруктоза имеет более высокую стоимость.

ВЫВОДЫ

1. Изучены кинетические и продукционные характеристики культуры Сирпсмдиз еи(горЬш В10646 и при автогрофных и гетеротрофных условиях питания в режиме синтеза резервных тлшидрокеиалканоатов; показана, что максимальные выходы полимеров на газовом субстрате (смеси Н2, СОг и Ог) составляют (75±5) % при экономических коэффициентах по Нь Ог, СО*= 1,1; 0Д5; 0,36; на глюкозе - (90±5) % при экономическом коэффициенте 0,3.

2. На основе сравнительною исследования проточного и периодического способов выращивания С.еи&орИт№ в автотрофной культуре в ферментере с коэффициентом массоперепоса по кислороду 460 ч", различающихся режимом подачи в культуру потока лимитирующего субстрата (азота), стимулирующего аккумуляцию шшигидро-ксиалкапоатов, предложен хемостатно-периодический процесс, обеспечивающий продуктивность процесса по биомассе и полимеру до 0,71 и 0,57 г/л-ч при длительности ферментационного цикла не более 70 ч.

3. Реализован и исследован периодический процесс синтеза полищдроксиалка-ноатов культурой C.eutrophus на глюкозе при изменении внутриклеточного пула полимера, физиологической активности и плотности инокулята. Установлено, что при текущей концентрации глюкозы от 5 до 35 г/л и исходном содержании полимера в инокуляте не выше 10 %, концентрация биомассы и содержание полимера достигают (110±10) г/л и (90±5) % при продуктивности процесса 1,7 и 1,45 гУл ч, соответственно, что в 2 раза выше ранее достигнутых показателей A eutophus В5786 на фруктозе.

4. Разработаны режимы синтеза полигадроксиалканоатов различного химического состава, включающие дозированную подачу в культуру второго углеродного субстрата - солей алкановых кислот (валерата, гексаноата) и ■у-бутиролактопа, в пределах установленных допустимых концентраций Синтезированы образцы, различающиеся степенью кристалличности (от 12 до 76 %) и термостабильносгао.

5. На основании проведённых исследований процессов экстракции полигадроксиалканоатов из биомассы клеток разработан метод обеспечивающие выход высоко-очшценного полимера более 96% без существенного изменения молекулярно-массовых характеристик.

6. Выполнено технико-экономическое обоснованна производства при различных субстратных сценариях. Показано, что в зависимости от типа ростового субстрата (электролизный водородЮОг+Ог), сингез-газ+Оь глюкоза или фруктоза затраты на получение полимера варьируют от 230 до 730 руб./кг.

7. На основании экспериментальных д анных и их анализа разработана технология эффективного синтеза ПГА на глюкозе с использованием водородных бактерий С. eutrophus. Технология реализована в проекте опытного производства «Лаборатория биотехнологии новых биоматериалов». Проект прошел государственную экспертизу (положительное заключение экспертизы № 24-1-50196-12).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Fundamental basis of production and application of biodegradable polyhydroxyal-kanoates / T.G. Volova, E.I Shishatskaya, N.O. Zhila, E.G. Kiselev. P.V. Mironov, AD. Va-siüev, IV. Peterson, AJ. Sinskey II Journal Siberian Federal university, ser. Biol. - 2012 -T.5. - № 3. - C. 280-299, автора - 0,15 пл.

2. Киселев, Е.Г. Технико-технологические основы производства разрушаемых полигадроксиалканоатов / ЕР. Киселев, О.Н Шишацкий, Э.Дж. Сивгки // Журнал Сибирского федерального университета, сер. Биол. -2012.-Т.5. - № 3. - С.300-310, автора-ОД 1 tul

3. Киселев, Е.Г. Оптимизация процесса экстракции ПГА из биомассы / Е.Г. Киселев // Биотехнология новых материалов и окружающая среды: материалы П-го науч. семинара. - Красноярск СФУ,2012.-С. 21-23, автора-0,19 пл.

4. Физико-химические свойства полигадроксиалканоатов различного химического строения / НО. Жила, Е.И. Шишацкая, ЕГ. Киселев. АД. Васильев, ПВ. Миронов, AJ. Sinskey //Биотехнология новых материалов и окружающая среды: материалы П-го науч. семинара. - Красноярск СФУ, 2012. - С. 24-25, автора - 0,02.

5. Киселев, Е.Г Разработка процессов экстракции иоли-3-гидроксибутирата из биомассы ИаЫота ЕийорЬа / Е.Г Киселев // Лесной и химический комплексы-проблемы и решения: материалы всерос. пауч.-практ. копф. — Красноярск: СибГТУ, 2012.-С. 153-155, автора-0,19 пл.

Подписано в печать «26» ноября 2012 Формат 60 х 84/16 Усл. п.л. 1 Заказ № 385. Тираж 100 экз.

Типография «ДарМа-печать» 660036 Красноярск, Академгород, 50/28, оф. 156 тел. 290-72-32

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Киселев, Евгений Геннадьевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 Обзор литературы

1.1 Синтез разрушаемых биополимеров - актуальные направления исследований

1.2 Разрушаемые полигидроксиалканоаты: продуценты, субстраты, условия и эффективность биосинтеза

1.2.1 Продуценты и условия биосинтеза полигидроксиалка-ноатов

1.2.2 Субстраты для синтеза полигидроксиалканоатов

1.2.3 Технологические факторы, влияющие на эффективность процессов биосинтеза полигидроксиалканоатов

1.2.4 Современные масштабы производства полигидроксиалканоатов и сферы применения

1.3 Потенциал водородокисляющих бактерий для получения полигидроксиалканоатов

ГЛАВА 2 Объекты и методы исследования

2.1 Объекты исследования и методы культивирования водородокисляющих бактерий

2.2 Методы контроля и определения параметров процесса выращивания бактерий в режиме синтеза полигидроксиалканоатов

2.3 Статистические методы обработки результатов

ГЛАВА 3 Кинетические и продукционные характеристики водородокисляющих бактерий в режиме синтеза резервных полигидроксилаканоатов

3.1 Характеристики роста и синтеза полигидроксиалканоатов автотрофной культурой бактерий Сирг1аУ1с1т еШгоркш В-10646 в режиме аккумуляции

3.1.1 Характеристики автотрофной культуры бактерий С. еШгоркт В-10646 в режиме аккумуляции полигид-роксиалканоатов в хемостате

3.1.2 Исследования режимов автотрофного периодического выращивания Сирг1см1с1и8 еШгоркт В-10646 с целью увеличения выходов полигидроксиалканоатов и сокращения длительности процесса

3.1.3 Синтез полигидроксиалканоатов С. еШгоркт В-10646 в хемостатно-периодическом процессе культивирования

3.2 Характеристики роста и синтеза полигидроксиалканоатов бактериями С. еШгоркш В-10646 при гетеротрофных условиях питания

3.2.1 Влияние физиологической активности посевного материала С. еШгоркш 5-10646 на длительность лаг-фазы, урожай биомассы и выходы полигидроксиалканоатов

3.2.2 Влияние концентрации клеток в посевном материале на рост и синтез полигидроксиалканоатов культурой С. еи^оркиз В

3.3 Принципы организации процесса культивирования водородных бактерий для получения полигидроксиалканоатов различного химического строения

Резюме

ГЛАВА 4 Сравнительное исследование методов экстракции полигидроксиалканоатов из биомассы бактерий

4.1 Экстракция полигидроксиалканоатов органическими растворителями

4.2 Исследование безреагентного метода экстракции по-лигидроксиалканоатов

4.3 Разработка комбинированного методы экстракции полигидроксиалканоатов

Резюме

ГЛАВА 5 Технология синтеза полигидроксиалканоатов и её технико-экономическое обоснование

5.1 Исходные данные для проектирования опытного производства полигидроксиалканоатов

5.2 Технология производства полигидроксиалканоатов

5.2.1 Блок-схема цикла опытного производства

5.2.2 Технологическая схема опытного производства

5.3 Материальные затраты на синтез полигидроксиалканоатов

5.4 Технико-экономическя оценка процессов синтеза полигидроксиалканоатов бактериями С. еи^орЬиБ В

Резюме

Введение Диссертация по биологии, на тему "Технико-технологические основы биосинтеза резервных полигидроксиалканоатов водородными бактериями"

Биотехнологические процессы обеспечивают производство широкого спектра целевых продуктов медицинского, пищевого, кормового, и технического назначения. Ценным продуктом биотехнологии являются макромолекулы запасной природы - полимеры гидроксипроизводных алкановых кислот полигидроксиалканоаты (ПГА) - термопластичные линейные полиэфиры, характеризующиеся способностью разрушаться в биологических средах до конечных продуктов, безопасных для природы. Актуальность перехода на новые, экологические чистые материалы связана с тем, что объемы выпуска синтетических пластмасс приближаются к 300 млн. т/год; основная их часть скапливается на свалках и аккумулируется в Мировом океане, создавая глобальную экологическую проблему [119, 33]. Острота проблемы связана также с экономической ситуацией, так как до 98 % полимерных материалов производится из невозобновляемого ископаемого сырья - нефти и газа, запасы, которых истощаются.

В настоящее время все большее значение приобретают экологически чистые материалы, получаемые из возобновляемого сырья, источником которых служат биомасса растений и продукты микробиологического синтеза (это так называемые биополимеры). Фундаментальные исследования потенциала биологических агентов и биосистем, ориентированные на получение научной основы для развития индустрии экологически чистых полимерных материалов - актуальное и высокорейтинговое направление критических технологий мирового уровня. Конструирование биополимеров реализуется в рамках междисциплинарных исследований, главными целями которых являются: поиск и изучение новых биополимеров; получение фундаментальной основы для конструирования биологических систем, эффективно синтезирующих полимеры с заданными свойствами.

Среди применяемых и активно разрабатываемых новых биоразрушаю-щихся полимеров, наряду с полилактидами важное место занимают полигидроксиалканоаты. Эти полимеры активно исследуются за рубежом; в сфере коммерциализации ПГА заняты многие фирмы и промышленные компания («Монсанто К°», «Metabolix Inc.», «Tepha», «Procter & Gambel» и др). В России индустрия разрушаемых полимеров не создана; исследования, направленные на разработку биотехнологических процессов синтеза собственно ПГА - в сфере внимания нескольких академических институтов (Институт физиологии и биохимии микроорганизмов РАН, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Институт биофизики СО РАН).

Решающим фактором для широкомасштабного получения и применения ПГА является снижение их стоимости. В связи с тем, что 40-50 % затрат приходится на долю исходного углеродного сырья и до 18-20 % - на процесс экстракции и очистки полимера, магистральное направление исследований, определяющее стратегию промышленного производства ПГА, связано с возможностями расширения сырьевой базы, а также поиском высокопродуктивных штаммов-продуцентов и разработкой эффективных биотехнологий синтеза.

Одним из перспективных продуцентов ПГА являются водородокис-ляющие бактерии, характеризующиеся способностью синтезировать полимеры различного состава с высокими выходами на смесях СОг и Н2 и также на органических субстратах [22, 23, 35]. Исследование закономерностей синтеза ПГА на различных субстратах, проведение сравнительной оценки эффективности технологических режимов является важнейшей фундаментальной задачей, решение которой составит научно-практическую основу для создания в будущем отрасли производства этих биополимеров.

В ИБФ СО РАН имеется значительный задел по биотехнологии ПГА. В 2005 г. было создано опытное производство на фруктозе с использованием культуры R.eutophus В5786, производительностью до 50 кг в год при выходах по биомассе и ПГА до 50 г/л и 80-85 %. Полученные продукционные показатели значительно ниже достигнутых к настоящему времени за рубежом.

Это определило тематику настоящей работы, направленной на разработку эффективной технологии синтеза ПГА за счет привлечения новых штаммов и субстратов, отработки процесса экстракции полимера, проведение технико-экономических исследований в качестве научной основы для получения исходных данных, необходимых для масштабирования технологии.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Киселев, Евгений Геннадьевич

ВЫВОДЫ:

1. Введен в культуру штамм С ирпатйиБ еШгоркш В10646. Изучены кинетические и продукционные характеристики культуры при автотрофных и гетеротрофных условиях питания в режиме синтеза резервных полигидроксиалканоатов, показано, что максимальные выходы полимеров на газовом субстрате (смеси Н2, С02 и 02) составляют (75±5) % при экономических коэффициентах по Н2, 02, С02= 1,1; 0,25; 0,36; на глюкозе -(90±5) % при экономическом коэффициенте 0,3.

2. На основе сравнительного исследования проточного и периодического способов выращивания С.еМгоркт в автотрофной культуре в ферментере с коэффициентом массопереноса по кислороду 460 ч"1, различающихся режимом подачи в культуру потока лимитирующего субстрата (азота), стимулярующего аккумуляцию полигидроксиалканоатов, предложен хемостатно-периодичсский процесс, обеспечивающий продуктивность процесса по биомассе и полимеру до 0,71 и 0,57 г/л-ч при длительности ферментационного цикла не более 70 ч.

3. Реализован и исследован периодический процесс синтеза полигидроксиалканоатов культурой С.еШгоркт на глюкозе при изменении внутриклеточного пула ПГА, физиологической активности и плотности инокулята, режима транспорта кислорода. Установлено, что при текущей концентрации глюкозы от 5 до 35 г/л и исходном содержании полимера в инокуляте не выше 10 %, при регулируемой подаче воздуха в культуру по ходу ее развития, концентрация биомассы и содержание полимера достигают (110±10) г/л и (90±5) % продуктивность процесса, 1,7 и 1,45 г/л-ч соответственно, что в 2 раза выше ранее достигнутых показателей культурой Я. еШоркш В5786 на фруктозе.

4. Разработаны режимы синтеза полигидроксиалканоатов различного химического состава, включающие дозированную подачу в культуру второго углеродного субстрата - солей алкановых кислот (валерата, гексаноата) и у-бутиролактона, в пределах установленных допустимых концентраций, без изменения схемы ведения двустадийного периодического режима культивирования при лимитировании роста бактерий по азоту. Синтезированы образцы, различающиеся степенью кристалличности, от 12 до от 76 % и термостабильностью.

5. На основании проведённых исследований процессов экстракции из биомассы клеток с использованием поверхностно-активных веществ, неполярных растворителей, их смесей с этанолом при варьировании параметров процесса. Разработан метод экстракции, обеспечивающий выход высокоочищенного полимера свыше 96 % без существенного изменения молекулярно-массовых характеристи к

6. Выполнено технико-экономическое обоснование производства при различных субстратных сценариях. Определены основные затраты на синтез полигидроксиалканоатов автотрофном и гетеротрофном режимах. Показано, что в зависимости от типа ростового субстрата (глюкоза, фруктоза или (Н2+С02+02)), затраты на получение полимера варьируются от 230 до 730 руб/кг, при прогнозной производительности 100 ООО т/г.

7. На основании экспериментальных данных и их анализа разработана технология эффективного синтеза ПГА на глюкозе с использованием водородных бактерий С. еиКоркиБ.

Технология реализована в проекте опытного производства «Лаборатория биотехнологии новых биоматериалов». Проект прошел государственную экспертизу (положи тельное заключение экспертизы № 241-50196-12).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена технико-технологическим исследованиям биотехнологического процесса получения биоразрушаемых полимеров - полигидроксиалканоатов (ПГА). Актуальность перехода на новые, экологические чистые материалы связана с глобальной экологической проблемой аккумуляции в биосфере не разрушаемых синтетических пластмасс. Поэтому экологически чистые материалы, источником которых служат биомасса растений и продукты микробиологического синтеза (биополимеры) приобретают все большее значение. Освоение новых биополимеров реализуется в рамках междисциплинарных исследований, главными целями которых являются: поиск и изучение новых биополимеров; получение научной основы для конструирования биологических систем, эффективно синтезирующих полимеры с заданными свойствами.

ПГА - термопластичные линейные полиэфиры, характеризующиеся способностью разрушаться в биологических средах до конечных продуктов, безопасных для природы, активно исследуются за рубежом; количество опытных и промышленных предприятий с 2000 г. увеличивается экспоненциально.

Решающим фактором для широкомасштабного получения и применения ПГА является снижение их стоимости. В связи с тем, что 4050 % затрат приходится на долю исходного углеродного сырья и до 18-20 % -на процесс экстракции и очистки полимера, магистральное направление исследований, определяющее стратегию промышленного производства ПГА, связано с возможностями расширения сырьевой базы, а также поиском высокопродуктивных штаммов-продуцентов и разработкой эффективных биотехнологий синтеза.

Водородокисляющие бактерии, характеризующиеся способностью синтезировать полимеры различного состава с высокими выходами на смесях С02 и Н2 и также на органических субстратах, являются одним из наиболее перспективных продуцентов ПГА. Исследование закономерностей синтеза

ПГА на различных субстратах, проведение сравнительной оценки эффективности технологических режимов является важнейшей фундаментальной задачей, решение которой обеспечит научно-практическую основу для создания в будущем отрасли производства этих биополимеров.

В ИБФ СО РАН имеется значительный задел по биотехнологии ПГА. В 2005 г. было создано опытное производство на фруктозе с использованием культуры Я.еШорНш В5786, производительностью до 50 кг в год при выходах по биомассе и ПГА до 50 г/л и 80-85 %. Полученные продукционные показатели значительно ниже достигнутых к настоящему времени за рубежом.

Это определило тематику настоящей работы, направленной на разработку эффективной технологии синтеза ПГА за счет привлечения новых штаммов и субстратов, отработки процесса экстракции полимера, проведение технико-экономических исследований в качестве научной основы для получения исходных данных, необходимых для масштабирования технологии.

В работе исследован новый штамм водородокисляющих бактерий -Сирпау1с1из еМгоркш В-10646, обладающий способностью к росту на глюкозе, устойчивостью к у-бутиролактону, солям алкановых кислот и характеризующийся способностью к синтезу ПГА различного химического строения в автотрофных и гетеротрофных условиях. Штамм введен в культуру и исследованы в различных режимах выращивания бактерии; получены новые данные о закономерностях синтеза резервных полигидроксиалканоатов (ПГА), необходимые для разработки технологии их получения. Изучены кинетические и продукционные характеристики культуры в условиях автотрофного (смеси Н2, С02 и 02) и гетеротрофного (глюкоза) питания; определены эффективность использования субстратов и материальные затраты на образование ПГА. Установлены оптимальные для биосинтеза стартовая концентрация и физиологическая активность инокулята, режимы подачи кислорода и лимитирующего субстрата (азота), стимулирующего внутриклеточную аккумуляцию ПГА. Это позволило разработать хемостатно-периодические режимы с выходами биомассы клеток и ПГА до (40±10) г/л и (75±5) % в автотрофном режиме и (110±10) г/л и (90±5) % на глюкозе. Изменение режима углеродного питания, заключающегося в регламентированной подаче в культуру второго углеродного субстрата (валерата, гексаноата, у-буторолактона), позволило получить образцы, различающиеся физико-химическими свойства в широких пределах.

Вторым по значимости и затратности элементом технологии производства ПГА является способ выделения полимера из биомассы клеток. Известные методы экстракции ПГА не отвечают всем необходимым требованиям (экологичность, невысокие затраты на реагенты, полнота извлечения и чистота полимера). Это актуализирует совершенствование методов экстракции как необходимое условие повышения эффективности процесса в целом и снижения стоимости полимера как конечного продукта биотехнологии.

В результате выполненного сравнительного исследования различных методов экстракции ПГА из биомассы бактерий, показано, что различные реагенты и технология ведения процесса по-разному влияют на самые важные показатели - полноту извлечения полимера и степень его чистоты.

Применение хлороформа делает необходимым использование большого количества летучих и токсичных реагентов. При использовании дихлорметана полнота извлечения повышается, но возникает необходимость в реализации процедуры разделения смеси «экстрагент-осадитель». В результате работы подобрана пара растворитель - осадитель (дихлорметан -гексан), которая не образует между собой азеотропную смесь, что делает возможным вернуть в процесс до 90 % реагентов. В результате снижается расход растворителей с 73,5 кг/кг ПГА (хлороформ - гексан) до 63,7 кг/кг ПГА (дихлорметан - этанол - гексан). При исключении из этого состава этанола возможно снижение расхода до 7,8 г/г ПГА, но в этом случае необходима дополнительная обработка биомассы с целью разрушения мембранных комплексов, или последовательная обработка сначала спиртом, а затем дихлорметаном.

Безреагентный метод позволяет более экономичным способом получать высокие выходы полимера, не загрязненного примесями жирных кислот липополисахаридной фракции клеточных мембран. Этот полимер пригоден для технических целей, но не пригоден для биомедицины. Разработанный комбинированный метод позволяет снизить количество загрязнений в полимере и расход реагентов.

В результате использования комбинированного метода удалось сократить объём органических растворителей используемых в процессе и как итог снизить их расход до 4,4 кг/кг ПГА. Комбинированный метод позволил достичь высокой степени извлечения ПГА - порядка 98,5 - 99,0 %; конечный продукт полученный таким способом не содержит эндогенных примесей и может применяться в медицинских целях.

При обработке данных многофакторного эксперимента получено уравнение регрессии, описывающие влияние факторов на параметр оптимизации.

У=82,574+0,875-Х1+0,046 Х2+0,050-Х3

Установлено, что полученное уравнение множественной регрессии в целом является статистически значимым и адекватно описывает изучаемое явление

Используя метод крутого восхождения по поверхности отклика, найдены оптимальные параметры процесса: концентрация ДДС-ГчГа - 5 %; температура 60 °С; время обработки 40 минут.

Анализ молекулярно-массового распределения показал, что ПЗГБ выделенный из биомассы, имеет очень большую полидисперсность от 2,8 до 3,5 и Мв от 6,5-105 до 7,0-105, г/моль. Использование многократной экстракции позволяет осуществить разделение ПЗГБ на более узкие фракции по молекулярной массе. Такое фракционирование может быть полезно в процессе изготовления различных изделий. Так низкомолекулярные фракции могут использоваться для создания наноструктур, а более высокомолекулярные могут применяться в производстве тканых материалов и изделий получаемых методами литья из расплавов или растворов.

На основе полученных экспериментальных данных определены удельные затраты на синтез ПГА основного ростового субстрата при различных режимах выращивания, которые отличаются на порядок. На производства целевого продукта (гомополимера 3-гидроксимасляной кислоты, ПЗГБ) в автотрофном процессе в качестве основного ростового субстрата расходуется газовая смесь С02/02/Н2; при гетеротрофном -глюкоза (или фруктоза) и воздух. С учетом достигнутых продукционных показателей и определенных экспериментально удельных затрат при прогнозировании производства объемом 100 000 т/год при различных субстратных сценариях проведепы расчеты, показавшие возможность получения продукта стоимостью от 228 до 721,4 руб/кг.

Анализ полученных результатов и выполненные расчеты лабораторных процессов синтеза ПГА в автотрофном и гетеротрофном режимах показал целесообразность выбора для масштабирования вариант процесса, реализуемой на глюкозе в качестве основного ростового субстрата. В основе проекта - экспериментально достигнутые показатели процесса синтеза ПГА культурой С. eutrophus В10646 на глюкозе, которые включают хемостатно-периодический двустадийный (лимит азота/среда без азота) процесс при стартовой концентрации инокулята (10±2) г/л в течение 65 ч до выхода по X, г/л и ПГА %, соответственно, (110±10) г/л и (85±5) %, при расходе глюкозы (2,9±0,1) кг/кг и воздуха 200 м /кг; при комбинированном способе экстракции полимера; продуктивности процесса по биомассе и ПГА, соответственно, 1,7 и 1,4 г/л ч.

Получены исходные данные, основанные на экспериментально достигнутых показателях синтеза ПГА культурой С. eutrophus В10646, на основе которых разработан проект опытного производства. Реализация проекта позволит масштабировать процесс для получения опытных партий ПГА в количествах, способных полностью обеспечить и завершить все исследования, провести стандартизацию специализированной продукции и начать выпуск малыми партиями.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Киселев, Евгений Геннадьевич, Красноярск

1. Аналитическая химия. Химические методы анализа/ Под. ред. Петрухина О.М. М.: Химия, 1992. 400 с.

2. Ашмарин, И.П. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов/ И.П. Ашмарин, H.H. Васильев, В.А. Амбросов. Издательство ленинградского университета, 1971. - 80 с.

3. Барсуков, Л.И. Как собрать мембрану (солюбилизация и реконструкция мембран)/ Л.И. Барсуков// Соросовский образовательный журнал. Т. 8, №1.Серия биология, 2004. С. 10 - 16.

4. Варфоломеев, С.Д. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов / С.Д. Варфоломеев, C.B. Калюжный. М.: Высш. шк., 1990.-296 с.

5. Волова, Т.Г Биотехнология / Т.Г Волова. Новосибирск : Изд-во СО РАН, 1999.-253 с.

6. Волова, Т.Г. Влияние лимитирования роста на накопление полиоксибутирата у водородокисляющих бактерий / Т.Г. Волова // Всес. конф. Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов Пущино. -1989.-С. 16-24.

7. Волова, Т.Г. Биосинтез на водороде/ Т.Г. ВоловаII Новосибирск : Изд-во СО РАН, 2004. - 397 с.

8. Волова, Т.Г. Получение и исследование микробных гетерополимерных полиоксиалканоатов/ Т.Г. Волова, О.Г. Беляев, И.И. Гительзон, Г.С. Калачева, С.Г. Луковенко, В.Ф. Плотников // Докл. РАН. -1996, а.-Т. 346.-С. 558-561.

9. Волова, Т.Г. Опытное производство разрушаемых биополимеров/ Т.Г. Волова, H.A. Войнов, B.C. Муратов, Н.В. Бубнов, К.В! Гурулев// Биотехнология. 2006. - №6. -С. 28-34.

10. Волова, Т.Г. Синтез сополимеров З-гидроксибутирата-со-4-гидроксибутирата водородокисляющими бактериями/ Т.Г. Волова, Н.О. Жила, Г.С. Калачёва, В.А. Соколенко, Э.Дж. Сински // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. - Т. 47. - С. 494-499.

11. Волова, Т.Г. Динамика активности ферментов клеточного цикла полигидроксиалканоатов у Ralstonia eutropha/ Т.Г. Волова, Г.С. Калачёва, О.В. Горбунова, Н.О. Жила // Прикладная биохимия и микробиология. -2004.-Т. 40.-С. 201-209.

12. Волова, Т.Г. Синтез сополимеров гидроксибутирата и гидроксивалерата поли(ЗГБ/ЗГВ). бактериями Ralstonia eutropha/ Т.Г. Волова, Г.С. Калачёва // Микробиология. 2005. - Т. 74, № 1. - С. 63-69.

13. Волова, Т.Г. Полиоксиалканоаты-биоразрушаемые полимеры для медицины/ Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов, Е.И. Шишацкая; под ред. ак. В.И. Шумакова. 2-е изд., перераб. и доп. Красноярск: Изд-во Платина 2006.

14. Волова Т.Г., Способ лечения паховых грыж/Т.Г. Волова, A.B. Яковлев, Е.И. Шишацкая, Ю.С. Винник, Н.М. Маркелова// Патент РФ № 2427326. 2011 г.

15. Волова, Т.Г. Микробиологический синтез на водороде /Т.Г. Волова, И.А. Терсков, Ф.Я. Сидько. Новосибирск: Наука. - 1985. - 116 с.

16. Воробьёва, Л.И. Промышленная микробиология / Л.И. Воробьёва. -Изд-во МГУ, 1989. 294 с.

17. Гительзон, И.И. Производство белка на водороде/ И.И. Гительзон. -Новосибирск: Наука, 1980.-150 с.

18. ГН 2.1.6.1338-03 Предельно допустимые концентрации (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населённых мест, 2003.

19. Емнова, Е.Е. Гидрогеназная активность термофильной водородокисляющей бактерии Pseudomonas thermophila/ Е.Е. Емнова, А.К. Романова //Микробиология, 1977. т.46, №4, С.619-623.

20. Заварзин, Г.А. Водородные бактерии и карбоксидобактерии/ Г.А. Заварзин. М.: Наука, 1975. - 202 с.

21. Заварзин, Г.А. Литотрофные микроорганизмы/ Г.А. Заварзин. М.: Наука, 1972.-340 с.

22. Мальцева, П.М. Основы научных исследований/ П.М. Мальцева, H.A. Емельянова. Киев: Вища школа, 1982.- 190 с.

23. Огородников, С.К. Азеотропные смеси/ С.К. Огородников, Т.М. Лестева, В.Б. Коган. Справочник, Л., 1971. - 848 с.

24. Ошина, Л.А. Промышленные хлорорганические продукты: Справочник/ Л.А. Ошина. М.: Химия, 1978. - 656 с.

25. Перт, С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток/ С.Дж. Перт. Москва: Мир, 1978. - 259 с.

26. Печуркин, Н.С. Популяционные аспекты биотехнологии// Н.С. Печуркин, A.B. Брильков, Т.В. Марченкова. Новосибирск: Наука Сибирское отделение, 1990. - 172 с.

27. Савельева, Н.Д. Отношение водородных бактерий к окиси углерода/ Н.Д. Савельева// Микробиология. 1979. - Т. 48, вып. 2. - С. 360-362.

28. Савельева, Н.Д. К систематике водородных бактерий/ Н.Д. Савельева, Т.Н. Жилина // Микробиология. 1968. - Т. 309. - N. 1. - С. 223226.

29. Семчиков, Ю.Д. Высокомолекулярные соединения/ Ю.Д. Семчиков. Москва. Академия., 2008. - 368 с.

30. Стасишина, Г.Н. Штамм бактерий Alcaligenes eutrophus-продуцент белковой биомассы / Г.Н. Стасишина, Т.Г. Волова // Патент РФ № 2053292. -БИ. 1996. - № 1.

31. Фомин, В.А. Биоразлагаемые полимеры, состояние и перспективы использования / В.А. Фомин, В.В. Гузеев // Пластические массы. 2001.-№ 2.-С.42-46.

32. Холмберг, К. Поверхностно-активные вещества и полимеры в водных растворах / Йёнссон Б., Кронберг Б., Линдман Б. М. Бином, 2010. — 528 с.

33. Шабанов, В.Ф. Фундаментальные основы комплексной переработки углей КАТЭК для получения энергии, синтез-газа и новых материалов с заданными свойствами / В.Ф. Шабанов, Б.Н. Кузнецов, М.Л. Щипко, Т.Г. Волова. Новосибирск. Изд-во Наука. - 2005. -231 с.

34. Akiyama, М. Environmental life cycle comparison of polyhydroxyalkanoates produced from renewable carbon resources by bacterial fermentation/ M. Akiyama, T. Tsuge Y. Doi // Polym. Degrad. Stab. 2003. - Vol. 80.-P. 183-194.

35. Anderson, A.J. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates / A.J. Anderson, E.A. Dawes // Microbiol. Rev. 1990. - Vol. 54. - P. 450-472.

36. Ashby, R.D. Poly(hydroxyalkanoate) biosynthesis from triglyceride substrates/ R.D. Ashby, T.A. Foglia // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. -Vol.49.-P.431-437.

37. Audic, J.L. Non-food applications of milk components and dairy co-products: a review/ J.L. Audic, B. Chaufer, G. Daufin // Lait. 2003. - Vol. 83. -P. 417^138.

38. Avelle, M. Review Properties of blends and composites based on poly(3-hydroxy)butyrate (PHB) and poly(3-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate) (PHBV) copolymers/ M. Avelle, E. Martuscelli, M. Raimo // J. Materials Science. 2000 a. - Vol. 35. - P. 523-545.

39. Borman, E.J. Growth-associated production of polyhydroxybutyric acid by Azotobacter beijernckii from organic nitrogen substrates/ E.J. Borman, M. Leibner, B. Beer // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. - Vol. 48. - P. 8488.

40. Braunegg, G. Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and engineering aspects (Rewiew article)/ G. Braunegg, G. Lefebvre, K. F. Genzer, // J. of Biotechnol. 1998. - Vol. 65. - P. 127-161.

41. Breitenbach, A. Biodegradable semi-crystalline comb polyesters influence the microsphere production by means of a supercritical fluid extraction technique (ASES)/ A. Breitenbach, D. Mohr, T. Kissel // J. Control. Rel. 2000. - V. 63,1.1-2. - P. 53-68.

42. Chanprateep, S. Biosynthesis and biocompatibility of biodegradable poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)/ S. Chanprateep, K. Buasri, A. Muangwong, P. Utiswannakul // Polymer Degradation and Stability. 2010. -Vol. 95.-P. 2003-2012.

43. Chen, G.Q. A microbial polyhydroxyalkanoates (PHA) based bio- and materials industry/ G.Q. Chen // Chem. Soc. Rev. 2009. - Vol. 38. - P. 24342446.

44. Chen, G.Q. Plastics Completely Synthesized by Bacteria: Polyhydroxyalkanoates in Plastrics from Bacteria-Natural Functions and Applications/ G.Q. Chen, Steinbüchel, A. Chen // New York. 2010. - P. 17-37.

45. Chen, G.Q. Industrial scale production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)/ G.Q. Chen, G. Zang, S.J. Park, S.Y. Lee // App. Microbiol. Biotechnol. 2001. - Vol. 57. - P. 55-55.

46. Chen, H.J. Identification and Characterization of a Novel Intracellular Poly(3-Hydroxybutyrate) Depolymerase from Bacillus megaterium/ H.J. Chen, S.C. Pan, G.C. Shaw // Appl. Environ. Microbiol. 2009. - Vol. 75. - P. 52905299.

47. Choi, J. Efficient and economical recovery of poly-(3-hydroxybutyrate) from recombinant Escherichia coli by simple digestion with chemicals/ J. Choi, S.Y Lee. // Biotechnol. Bioeng. 1999, a. - Vol. 62. - P. 546-553.

48. Choi, J. Factors affecting the economics of polyhydroxyalkanoate production by bacterial fermentation/ J. Choi, S.Y Lee. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, b. - Vol. 51. - P. 13-21.

49. Choi, J. Process analysis and economic evaluation for poly(3-hydroxybutyrate) production by fermentation/ J. Choi, S.Y Lee. // Bioprocess Eng.- 1997.-Vol. 17.-P. 335-342.

50. Cromwick, A.M. The microbial production of poly(hydroxyalkanoates) from tallow/ A.M .Cromwick, T. Foglia, R.V. Lenz // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - Vol. 46. - P. 464-469.

51. De Koning, G. Poly(hydroxyalkanoates) from fluorescent Pseudomonas in retrospect and prospect/ G. De Koning, M. Kellerhals, C. Van Meurs, B Witholt // J. Environ. Polym. Degrad. 1996. - Vol. 4. - P. 243-251.

52. Devdatt, L. High temperature PHA extraction using PHA-poor solvents/ L. Devdatt F. Kurdikar, E. Strauser, A.J. Solodar, D.P. Mark // US Patent 6087471.- 2000.

53. Durner, R. Accumulation of poly(R)-3-hydroxyalkanoates. in Pseudomonas oleovorans during growth in batch and chemostat culture with different carbon sources/ R. Durner, M. Zinn, B. Witholt, T. Egli // Biotechnol. Bioeng. 2001. - Vol. 72. - P. 278-288.

54. Elbahloul, Y. Large-scale production of poly(3-hydroxyoctanoic acid) by Pseudomonas putida GPol and a simplified downstream process/ Y. Elbahloul, A. Steinbüchel // Appl. Environ. Microbiol. 2009. - Vol. 75. - P. 643-651.

55. Füchtenbuch, B. Biosynthesis of polyhydroxyalkanoates from low-rank coal liquefaction products by Pseudomonas oleovorans and Rhodococcus rubber/ B. Füchtenbuch, A. Steinbüchel // Appl Microbiol Biotechnol. 1999. -Vol. 52. - P. 91-95.

56. Fukui, T. Efficient production of polyhydroxyalkanoates from plants oils by Alcaligenes eutrophus and recombinant strain/ T. Fukui, Y. Doi // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. - Vol. 49. - P. 333-336.

57. Gurtovenko, A.A. Interaction of ethanol with biological membranes: The formation of non-bilayer structures within the membrane interior and their significance/ A.A. Gurtovenko, J. Anwar // J. Phys. Chem. B. 2009. V. 113. P. 1983-1992.

58. Hahn, S.K. Optimization of microbial poly(3-hydroxybutyrate) recovery using dispersion of sodium hypochlorite solution and chloroform/ S.K. Hahn, Y.K. Chang, B.S. Kim, H.N Chang, // Biotechnol. Bioeng. 1994. - Vol. 44. - P. 256261.

59. Hazenberg, W. Efficient production of medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoates) from octane by Pseudomonas oleovprans: economic considerations/ W. Hazenberg, B. Witholt // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1997.-Vol. 48.-P. 588-596.

60. Hazer, B. Increased diversification of polyhydroxyalkanoates by modification reactions for industrial and medical applications/ B. Hazer, A. Steinbüchel //Appl Microbiol Biotechnol. 2007 . - Vol. 74. - P. 1-12.

61. Hepner, L. Cost analysisnof fermentation processes //Chimia.-1996.-V.50.-P.442-443.

62. Horowitz, D. Methods for purifying polyhydroxy alkanoates // US Patent 6340580.-2002.74. http://en.european-bioplastics.org/75. http://rosagrobiz.com/news/worldapk/76. http://www.chemport.ru/data/chemipedia/article2244.html

63. Huijberts, G.N.M. Production of poly(3-hydroxyalkanoates) by Pseudomonas putida KT2442 in continuous cultures/ G.N.M. Huijberts, G. Eggink // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - Vol. 46. - P. 233-239.

64. Ishizaki, A. Microbial production of poly-D-3-hydroxybutyrate from C02/ A. Ishizaki, K. Tanaka, N. Taga // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. -Vol. 57.-P. 6-12.

65. Jian Yu. // US Patent 7514525. 2009.

66. Jung, K. Two-stage continuous process development for the production of medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoates)/ K. Jung, W. Hazenberg, M. Prieto, B. Witholt // Biotechnol. Bioeng. 2001. - Vol. 72. - P. 19-24.

67. Kim, D.Y. Bacterial Poly(3-hydroxyalkanoates) Bearing CarbonCarbon Triple Bonds/ D.Y. Kim, Y.B. Kim, Y.H. Rhee // Macromol. 1998. -Vol. 32.-P. 4760-4763.

68. Kim, S.W. High production of poly-*-hydroxybutyrate (PHB) from Methylobacterium organophilum under potassium limitation/ S.W. Kim, P. Kim, H.S. Lee, G.M. Lee, H.S. Lee, J.H. Kim, // Biotechnol. Lett. 1996. - Vol. 18. -P. 25-30.

69. Kumar R., Singh S., Singh O.V. Bioconversion of lignocellulosic biomass: biochemical and molecular perspectives // R. Kumar, S. Singh, O.V. Singh / J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2008. - Vol. 35. - P. 377-391.

70. Lee, S.Y. Bacterial polyhydroxyalkanoates / S.Y. Lee // Biotechnol. Bioeng. 1996, a. - Vol. 49. - P. 1-14.

71. Lee, S.Y. High cell density cultivation of Escherichia coli/ S.Y. Lee // Trends Biotechnol. 1996, c. - Vol. 14. - P. 90-105.

72. Lee, S.Y. Plastic bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria / S.Y. Lee // Trends Biotechnol. -1996, b. Vol. 14. - P. 431-438.

73. Lee, S.Y. Poly(3-hydroxyalkanoate) production from xylose by recombinant E. coli/ S.Y. Lee // Bioprocess Engin. 1998. - Vol. 18. - P. 397-399

74. Lee, S.Y. Production of poly(3-hydroxybutyric acid) by recombinant Escherichia coli strains: genetic and fermentation studied/ S.Y. Lee, H.N. Chang // Can J. Microbiol.-1995.-V. 41 Suppl 1.-P. 207-215.

75. Madison, L.L. Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates): from DNA to plastic/ L.L. Madison, G.W. Huisman // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. - Vol. 63. - P. 21-53.

76. Nagata, M. Synthesis, Characterization, and Enzymatic Degradation Studies on Novel Network Aliphatic Polyester/ M Nagata, T Machida, W. Sakai, N. Tsutsumi //. Macromol. -1998.-V.32.-P. 6450-6454.

77. Natano, R.V. Integrated production of biodegradable plastic, sugar and ethanol/ R.V. Natano, P.E. Mantelatto, C.E. Rossell // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - Vol. 57. - P. 1-5.

78. Neto, J. New strategies in the production of polyhydroxyalkanoates from glycerol and meat and bone meal: PhD thesis. Graz University of Technology, 2006.

79. Nöda, I. Biodegradable copolymers and plastic articles comprising biodegradable copolymers // US patent 5489470. 1996, b.

80. Nöda, I. Biodegradable copolymers and plastic articles comprising biodegradable copolymers of 3-hydroxyhexanoat // US patent 5536564. 1996, a.

81. Nöda, I. Films and absorbent articles comprising a biodegradable polyhydroxyalkanoate comprrising 3-hydroxybutyrat and 3-hydroxyhexanoat comonomer units // US Patent 5990271. 1999.

82. Nöda, I. Preparation and properties of a novel class of polyhydroxyalkanoates copolymers //1. Nöda, P.R. Green, M.M. Satkowski, L.A. Schechtman / Biomacromolecules. 2005. - Vol. 6. - P. 580-586.

83. Oeding, V. Ketothiolase from Hydrogenomonas eutropha H 16 and its significance in the regulation of poly-3-hydroxybutyrate metabolism / V. Oeding, H.G. Schlegel // Biochem. J. -1973.-V.134.-P. 239-248.

84. Omar, S. Optimization of cell growth and poly(3-hydroxybutyrate) accumulation on date syrup by a Bacillus megaterium strain/ S. Omar, A. Rayes, A. Eqaab, I. Viss, A. Steinbüchel // Biotechnol. Lett. 2001. - Vol. 23. - P. 1119-1123.

85. Page, W.J. Growth of Azotobacter vinelandii UWD in fish peptone medium and simplified extraction of poly-/?-hydroxybutyrate/ W.J. Page, A. Comnish // Appl Environ Microbiol.-1993.-V. 59.-P. 4236-4244.

86. Pazur, R.J. Crystal Structure of Syndiotactic Poly(-hydroxybutyrate) from X-ray Fiber and Powder Diffraction Analyses and Molecular Modeling/ R.J. Pazur, P.J. Hocking, S. Raymond, R.H. Marchessault // Macromol.-1998.-V. 32.-P. 6485-6492.

87. Poliakoff, M. Plastic bags, sugar cane and advanced vibrational spectroscopy: taking green chemistry to the third world/ M. Poliakoff, I. Nöda // Green Chem. 2004. - Vol. 6. P. G37-G38.

88. Ramsay, B.A., Ramsay J., Berger E., Chavarie C., Braunegg G. Separation of poly-.beta.-hydroxyalkanoic acid from microbial biomass// B.A. Ramsay, J. Ramsay, E. Berger, C. Chavarie, G. Braunegg / US Patent 5110980,1989.

89. Ramsay, J.A. Extraction of poly-3-hydroxybutyrate using chlorinated solvents/ J.A. Ramsay, E. Berger, R. Voyer, C. Chavarie, B.A. Ramsay // Biotechnol. Tech.-1994.-V. 8.-P. 589-594.

90. Ramsay, J.A. Hemicellulose as a potential substrate for production of poly(beta-hydroxyalkanoates)/ J.A. Ramsay, M.C.A. Hassan, B.A. Ramsay // Can. J. Microbiol. 1995. - Vol. 41. - P. 262-266.

91. Rehm B.H. PHA synthases— the key enzymes of PHA synthesis // B.H. Rehm, A. Steinbüchel / Biopolymers Eds.: A. Steinbüchel, Y. Doi. Verlag Wiley, Polyesters I, 3a, 2001. - P. 173-215.

92. Rigaud, J.-L. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: Application to energy-transducing membrane proteins/ J.-L. Rigaud, B. Pitard, D. Levy // Biochim. et biophys. acta. 1995. Vol. 1231. P. 223-246

93. Rodrigues, M.F.A. Byosinthesis of poly(3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxypentoic acid) from unrelated substances by Burkholderia sp./ M.F.A.

94. Rodrigues, L.F. Silva, J.G.C. Gomez, H.E. Valentin, Steibüchel A. //Appl Microbiol Biotechnol.-1995.-V. 43.-P. 880-886.

95. Ryu, H.W. Production of poly(3-hydroxybutyric acid) in cell density fed-batch culture of Alcaligenes eutrophus with phosphate limitation/ H.W. Ryu, S.K. Hahn, Y.K. Chang H.N. Chang, // Biotechnol. Bioeng. 1997. -Vol. 55.-P. 28-32.

96. Schlegel, H.G. Bin Submersverfahren zur Kultur wasserstoffoxydierenden Bakterien: wachstumphysiologische Untersuchung/ H.G. Schlegel, H. Kaltwasser, G. Gottschalk// Arch. Mikrobiol. 1961. -Bd.38. - P. 209-222.

97. Senior, P.G. The Regulation of poly-/?-hydroxybutyrate metabolism in Azotobacter beijerinckii/ P.G. Senior, E.A. Dawes // Biochem. J.- 1973.-V.134.- P.225-238.

98. Solaiman, D.K.Y. Conversion of agricultural feedstock and coproducts into poly(hydroxyalkanoates)/ D.K.Y. Solaiman, R.D. Ashby, T.A. Foglia, // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. - Vol. 71. - P. 783-789.

99. Solaiman, D.K.Y. Medium-chain-length poly(ß-hydroxyalkanoate) synthesis from triacylglycerols by Pseudomonas saccharophila/ D.K.Y. Solaiman, R.D. Ashby, T.A. Foglia, // Current Microbiology. 1999. -Vol. 38. -P. 151-154.

100. Stein R.S. Polymer recycling: opportunities and limitations/ R.S. Stein //Proc.Natl.Acad. Sci.-1992.-V. 89.-P.835-838.

101. Steinbüchel, A. Considerations on the structure and biochemistry of bacterial polyhydroxyalkanoic acids inclusions/ A. Steinbüchel, K. Aerts, W. Babel, C. Föllner, M. Liebergesell, M.H. Madkour, F. Mayer, V. Pieper-Fürst, A.

102. Pries, H.E. Valentin, R. Wieczorek //Can. J. Microbiol.- 1995a.-V.41.-№ 1.-P.94-105.

103. Steinbüchel, A. Biochemical and molecular basis of microbial synthesis of polyhydroxyalkanoates in microorganisms/ A. Steinbüchel, S. Hein // Adv Biochem Eng Biotechnol. 2001. - Vol. 71. - P. 81- 123.

104. Steinbüchel, A. Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids/ A.Steinbüchel, H.E. Valentin//FEMS Microbiol Lett.-1995 b.-V. 128.-P.219-228.

105. Sun, Z. Fed-batch production of unsaturated medium-chainlength polyhydroxyalkanoates with controlled composition by Pseudomonas putida KT2440/ Z. Sun, J. Ramsay, M. Guay, B. Ramsay // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009. - Vol. 82. - P. 657-662.

106. Sun, Z.Y. Carbon-limited fed-batch production of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates from nonanoic acid by Pseudomonas putida KT2440 / Z. Y. Sun, J. A. Ramsay, M. Guay, B. Ramsay // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, c. - Vol. 74. - P. 69-77.

107. Tamer, L.M. Optimization of poly(3-hydroxybutyric acid) recovery from Alcaligenes latus: combined mechanical and chemical treatments/ L.M. Tamer, M. Moo-Young, Y. Chisti // Bioprocess Enginner. -1998.-V. 19.-P.459-468.

108. Tan, I.K.P. Saponified palm kernel oil and its major free fatty acids as carbon substrates for the production of polyhydroxyalkanoates in

109. Pseudomonas putida PGA1/ I.K.P. Tan, K. Sudesh, M. Theanmalar, S.N. Gan, I.B. Gordon // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - Vol. 47. - P. 207-211.

110. Tanaka, K. Production of poly(D-3-hydroxybutyrate) from C02, H2 and 02 by high cell density autotrophic cultivation of Alcaligenes eutrophus/ K. Tanaka, A. Ishizaki, T. Kanamaru, T. Kawano // Biotechnol. Bioeng. 1995. - Vol. 45. - P. 268-275.

111. Topiwala, H.C.G. Temperature relationship in continuous culture / H. Topiwala, C.G. Sinelaiz // Biotechnol. Bioeng. 1971. -Vol.13. - P.795-813.

112. Volova, T.G. Autotorophic synthesis of PHAs by Ralstonia eutropha in the presence of carbon monoxide/ T.G. Volova, G.S. Kalacheva, O.V. Altuhova // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002-Vol. 58. - № 5. - P. 675-678.

113. Volova, T.G. Hydrogen-Based Biosynthesis / T.G. Volova // Nova Science Pub.Inc. NY, USA, 2009. 287 p.

114. Volova, T.G. Polyhydroxyalkanoates-Plastic Materials of the 21st Century: production, properties, application/ T.G. Volova // NY: Nova Science Pub, 2004. 282 p.

115. Wallen, L.L. Poly-j-hydroxyalkanoate from activated sluge/ L.L. Wallen, W.K. Rohwedder//Environ. Sei. Technol.- 1974.-V.8.-P.576-579.

116. Wang, F. High cell density culture of metabolically engineered Escherichia coli for the production of poly(3-hydroxybutyrate) in a defined medium/ F. Wang, S.Y. Lee // Biotechnol. Bioeng. -1998.-V.58.-P.325-328.

117. Wong, H.H. Poly(3-hydroxybutyrate) production from they by high density cultivation of recombinant Escherichia coli/ F. Wang, S.Y. Lee // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. - Vol. 50. - P. 30-33.140. www.un.org//russian/conferen/wssd/agenda21 ./

118. Yamane, T. Cultivation engineering of microbial bioplastics production/ T. Yamane // FEMS Microbiol. Rev. 1992. - Vol. 103. - P. 257-264.

119. Yamane, T. Yield of poly-D(-)-3-hydroxybutyrate from various carbon sources: a theoretical study/ T. Yamane // Biotechnol. Bioeng. 1993. - Vol. 41. -P. 165-170.

120. Yamane, T. Increased PHB productivity by high-cell-density fed-batch culture of Alcaligenes latus, a growth-associated PHB producer/ T. Yamane, M. Fukunage, Y.W Lee // Biotechnol. Bioeng. 1996. - Vol. 50. - P. 197-202.

121. Yang, Y.H Improved detergent-based recovery of polihydroxyalkanoates (PHAs) / Y.H. Yang, C. Brigham, L. Willis, C. Rha, A. Sinskey// Biotechnol Lett. 2011,- V 33: 937-942.

122. Yu, Ga-er. Characterization of low molecular weight poly(3-hydroxybutyrate)s from alkaline and acid hydrolis/ Ga-er Yu. R.H. Marchessault //-2000.-V. 41.-P. 1087-1098.

123. Yun, Y.H. Hyaluronan microspheres for sustained gene delivery and site-specific targeting/ Y.H. Yun, D.J. Goetz, P. Yellen // Biomaterials. 2004. -Vol. 25.-P. 147-157.

124. Zinn, M. Biosynthesis of medium-chain-kength poly(R)-3-hydroxyalkanoates. // Microbiol. Monogr. Plastics from bacteria. Natural functions and applications / Eds. G.-Q. Chen, A. Steinbüchel. Springer. -2010.-Vol. 14.-P. 213-236.