Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфологическая гетерогенность колоний Alcaligenes eutrophus и Photobacterium leiognathi

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Морфологическая гетерогенность колоний Alcaligenes eutrophus и Photobacterium leiognathi"

Институт Биофизики Сибирского Отделения Российской Академии Наук

На правах рукописи УДК 576.851

Могильная Ольга Алексеевна

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ КОЛОШтАЬСАЬЮЕМЕБЕиТКОРНШп РНОТОВА СТЕШИМЕЕЮСШ ТН1 (ПОДАННЫМ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ)

03.00.02 - биофизика 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск, 1998.

Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН, г. Красноярск.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

С.Е.Медведева, Институт биофизики СО РАН Официальные оппоненты: доктор биологическх наук

А.В.Брильков,

Институт биофизики СО РАН.

кандидат биологических наук Т.В .Марченкова, Красноярский государственный педагогический университет

Ведущая организация Красноярский государственный

университет.

Защита диссертации состоится "_" _ 1998г. в _часс

на заседании специализированного Совета Д 003.45.01 при Инстит) биофизики СО РАН по адресу: 660036, Красноярск, Академгородок.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инстит) биофизики СО РАН.

Автореферат разослан "_" _ 1998г.

Ученый секретарь Специализированного /у

совета, кандидат физ.-мат.наук УЛ^ Л.Г.Косолапова

Актуальность работы.

Морфология колоний микроорганизмов является важнейшим таксономическим признаком, представляющим наследственную морфогенетическуга структуру на поверхности агара. Долгое время считалось, что все 106-108 клеток, составляющих колонию, одинаковы, однако в последние годы получены данные, свидетельствующие о наличии в колонии нескольких субпопуляций, различающихся по морфологическим и физиологическим признакам (Бакулина,1985; Shapiro, 1995). Предположительно гетерогенность в колонии возникает вследствие градиента питательных веществ и продуктов метаболизма в разных ее участках (Криг, Герхардт, 1983; Шлегель,1987; Wimpenny,1989). Изучение гетерогенности микробных популяций обычно касается жидкой бактериальной культуры (Иванов, Угодчиков, 1984; Милько, Егоров, 1991), сведения о гетерогенности бактериальных колоний немногочисленны и фрагментарны (Бакулина и др.1984; Высоцкий и др., 1984; Новик, Высоцкий, 1995; Shapiro,1985,1987; Tetz,1990). В то же время интерес к данной проблеме растет, что вызвано различными задачами микробиологической практики и биотехнологии, а также имеет и чисто теоретический аспект.

Для решения вопросов гетерогенности микробных колоний в принципе применимы разные подходы, начиная от классических микробиологических, генетических и кончая управляемым культивированием и математическим моделированием популяции (Перт,1978; Печуркин и др.1990; Милько, Егоров, 1991; Белова и др.1995; Брильков,1996; Shapiro,Higgins,1989). В их числе находятся и физические методы исследования биообъектов, среди которых подавляющим преимуществом обладает электронная микроскопия. Разнообразные методы электронной микроскопии позволяют оценить гетерогенность с позиций клеточной биологии, биохимии, генетики и биофизики (Шапиро, 1988; Лихошвай, Христолюбова, 1988), т.е. одновременно наглядно продемонстрировать гетерогенность на субклеточном, клеточном и популяционном уровне.

Цель п задачи исследования.

Цель исследования заключалась в развитии представлений о структуре и гетерогенности бактериальных колоний на примере водородокисляющих Alcaligenes eutrophus 21 и светящихся бактерий Photobacterium leiognathi шт. 54, возможности использования полученных морфологических характеристик как управляемых параметров популяции. В конкретные задачи работы входило:

1. Развитие метода приготовления целых бактериальных колоний для электронно-микроскопических исследований светящихся и водородокисляющих бактерий.

2. Оценка влияния физико-химических факторов среды на морфологические характеристики клеток и их пространственную локализацшо в объеме колоний вариантов РЛею^аЙи шт.54 и А.е1йгорЪш шт.Х\.

3. Сравнительный шалю архитектоники колоний как параметра, характеризующего штамм, вид, род и т.д.

4. Определение рот метаболической активности клетки, действия декомпактизующих ДНК факторов, ни белка в гетерогенности бактериального хроматина.

Научная новизна работы и практическое значение.

Настоящая работа является комплексным исследованием, в результате которого получены новые данные и сформированы новые представления о цитоморфологической гетерогенности популяций и структурной организации бактериальной колонии, зависимости фенотипических характеристик от физико-химических факторов среды. Результаты работы являются существенным продвижением в развитии представлений о временной и пространственной организации биологических систем, в частности, принципов самоорганизации бактериальных колоний как сообщества на твердой поверхности.

Впервые на примере А.еи^орЬив ТА и РЛе'ю^аЙй шт.54 проведено исследование архитектоники бактериальных колоний с применением метода, позволяющего сохранять целостность колонии. При анализе панорамных (обзорных) снимков больших участков колоний, полученных с помощью просвечивающего электронного микроскопа, получены принципиально новые данные о существовании морфологически гетерогенных субпопуляций бактерий в составе одной колонии и их определенной пространственной локализации. Впервые изучено тонкое строение микроорганизмов в колониях диссоциангов водородокисляющих и светящихся бактерий. По ультраструктурной организации идентифицированы определенные морфотипы данных бактерий. Показано, что морфологические признаки колоний определяются сочетанием составляющих ее морфотипов клеток.

Исследование структуры нуклеоида водородокисляющих бактерий показало необычайно высокую степень компактизации хроматина, стабильность обнаруженных уровней упаковки на препаратах выделенное ДНК. Результаты исследования степени компактизации бактериально £ хромосомы водородокисляющих бактерий расширяют аналогии I структурной организации геномов про- и эукариот, подтверждают представления о зависимости структурной организации хроматина от

физиологического состояния бактериальной клетки. Впервые проведенная для A.eutrophus Z1 и P.leiognathi 208 на электронно-микроскопическом уровне иммуноцитохимическая локализация гистоноподобного белка HU на хроматине бактерий in situ свидетельствует об участии данного белка в организации вторичной структуры бактериальной ДНК

Полученные результаты о фенотипических характеристиках популяций водородокисляющих и светящихся бактерий, о функциональной активности генома могут найти приложение в изучении микробного разнообразия, экологии микроорганизмов, в изучении динамики структуры популяции, механизмов действия на нее внешних факторов. Отсюда вытекает возможность прогнозировать изменение состава популяции и тем самым управлять ею. Кроме того, полученные результаты могут иметь практическое значение при создании штаммов-продуцентов биологически активных и ценных веществ, получении различных тестовых систем на основе бактерий.

Положения, выносимые на защиту.

1. Колонии светящихся и водородокисляющих бактерий являются неоднородными по структуре составляющих их клеток. По мере развития колонии идет дифференцировка клеток по определенной программе.

2. .Архитектоника колоний повторяема, т.е. наследственно закреплена.

3. Структурная организация хроматина водородокисляющих бактерий характеризуется высокой степенью компактизации и стабильностью выделенных уровней при различном метаболическом состоянии клетки.

4. Гистоноподобный белок HU участвует в поддержании нуклеосомоподобного уровня организации ДНК ( на примере A.eutrophus Z1 и P.leiognathi шт.208).

Апробация работы. Материалы исследований были доложены на Всесоюзной конференции «Структурно-функциональная организация клеток микроорганизмов» (Пущино,1987), XIII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Звенигород, 1988), заседании Красноярского отделения Всесоюзного микробиологического общества (Красноярск, 1987), заседании Московского отделения Всесоюзного микробиологического общества (Москва, 1990), Всесоюзной школе «Электронная микроскопия в биологии и медицине» (Звенигород, 1990), Всесоюзной конференции «Биотехнология и биофизика микробных популяций» (Алма-Ата, 1991), Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы» (Пермь, 1996), конференции «Автотрофные микроорганизмы» (Москва,1996), VIII Европейском конгрессе по биотехнологии (Будапешт, 1997).

Структура и объем работы.

В главе I анализируются литературные данные по данной проблеме. В главе II описываются материалы и используемые методы. Главы III, IV, V -изложение и обсуждение полученных результатов. Глава VI - заключение и выводы. Работа изложена на 128! стр, включает 7 табл., 36 иллюстраций. Список цитируемой литературы содержит 141 наименование.

Колонии изогенных вариантов светящихся бактерий РЛеюцраНи пгг.54 получены от И.Ю Виделец (КРУ), культура Р.1ею^айп шт.208,563 - от Э.К.Родичевой. Водородокисляющие бактерии получены от Т.Г. Воловой (ИБФ СО РАН). Ряд экспериментов выполнен в совместной работе. А именно, работа по выявлению уровней компактизации ДНК и иммуноцйтохимические исследования проведены совместно с Е.В.Киселевой (ИЦиГ СО РАН), поликлональные моноспецифические антитела против белка Ни Е.соН получены от Н.П Кулыба и А.В. Козлова (С-Петербургский Госуниверситет). Автор глубоко благодарен всем соавторам за сотрудничество.

Материалы и методы Объекты исследования

Объектами изучения явились представители двух систематических групп бактерий с разными путями метаболизма, обладающие уникальными свойствами, являющимися важными в фундаментальных исследованиях и используемыми в практической медицине и биологии. Исследованные светящиеся бактерии являются источником люциферазы, используемой для биолюминесцентного анализа. Водородокисляющие бактерии используются для получения белкового корма и уже зарекомендовавшего себя в медицине полимера поли-Р-оксимасляной кислоты. Первые могут генерировать Б- и II-варианты с различными признаками, а вторые существуют обычно в II-форме. Рассматриваемые в работе штаммы являются перспективными объектами биотехнологии.

Светящиеся бактерии Р. Мо^пагЫ шт. 54 из коллекции Красноярского государственного университета и его наследственные варианты, обозначенные как 541, 5411, 54Ш, 54Г/, 54У, 54У-1 - 54У-5, РЛею^агЫ шт.208, шт.563 (из коллекции Института биофизики СО РАН) выращивали при 28° С на твердой полусшггетической среде. Исследовали 1, 3, 7 суточные колонии. Для более полного контроля за началом формирования клеточных субпопуляций исследовались также 18, 24, 36, 42, 48, 54 и 60-ти часовые колонии исходного варианта Р. 1ею{*паИи шт. 54, а также посевной материал, выращенный в виде штриха, жидкой накопительной культуры и в виде колоний. Для анализа брали колонии одного размера. Для

иммуноцитохимических исследований бактериального нуклеоида бьша использована жидкая накопительная культура P.leiognathi, шт.208. Водородокисляющие бактерии Alcaligenes eutrophus nrr.Zl (из коллекции водородных бактерий ИНМИ РАН) выращивали на твердых средах: минеральной агаризованной среде Шлегеля (Schlegel et al., 1961) в эксикаторе, заполненном газовой смесью в соотношении СОг:02:Н2 = 1:2:7 (автотрофные условия роста) и пептонном агаре (гетеротрофные условия роста). Для анализа структуры колоний в динамике использовали 3-х, 6- и 12-ти суточные колонии при росте в гетеротрофных условиях, 6-и 12-ти суточные колонии, выросшие в автотрофных условиях. Периодическое культивирование A.eutrophus ZI проводили в жидкой минеральной среде Шлегеля в газовой атмосфере в соотношении С02:02:Н2 = 1:2:7 . При гетеротрофном росте в качестве источника углерода и энергии использовали фруктозу в концентрации 0,2%.

Морфологию колоний оценивали визуально, а также в проходящем и отраженном свете с помощью МБЛ-2.

Подготовка клеток и колоний для электронно-микроскопических исследований.

За основу метода взята стандартная заливка биологических объектов в полимерные смолы, пригодные для получения ультратонких срезов с предварительным заключением интактной колонии бактерий в агар. Заключение колоний в агар является необходимым этапом, предохраняющим объект от разрушения при операциях по приготовлению образца для полимеризации в смоле, что позволяет сохранить целостность колонии. Правильное нанесение агара не вызывает видимых на электронно-микроскопическом уровне изменений в колонии. Сохраняется форма колонии, не нарушается взаиморасположение клеток.

Ультратонкие срезы 3-4 колоний каждого варианта получали на ультрамикротоме Reichert UM-03, дополнительно контрастировали 0.5% водным раствором изоцитрата свинца и исследовали в электронном микроскопе JEM-100C при ускоряющем напряжении 80 кв. Монтаж снимков срезов большой площади использовали для создания панорамной картины колонии.

Подготовка ДНК A.eutrophus ZI и P.leiognathi шт. 208 для электронно-иикроскопических исследований.

Для анализа упаковки и пространственной организации бактериального 1уклеоида был использован метод распластывания ДНК на поверхности белкового монослоя для электронно-микроскопического исследования Kleinschmidt, 1968; Киселева и др.,1986). Бьша использована периодическая.

культура R-диссоцианта водородокисляющих бактерий A.eutrophus Z1 растущая в автотрофных и гетеротрофных условиях. Пробы отбирали ( логарифмической и стационарной фаз роста. Также материаихол исследования служила биомасса 3-х суточных колоний R-варианта Декомпактизацию выделенного хроматина из клеток A.eutrophus Z проводили in vitro увеличивая продолжительность времени с момент: осмотического шока до распластывания и фиксации до 45 мин.

В иммуноцитохимических исследованиях . для выяснения мес локализации гистоноподобного белка HU на выделенных препаратах ДН1 водородокисляющих и светящихся бактерий использованы поликлональны моноспецифические антитела против белка HU, полученные проти гистоноподобного белка HU E.coli (Кулыба, Козлов, 1989). Электроннс микроскопическая визуализация специфического комплекса проведена п модифицированному методу Факана (Fakan et al.,1986) с помощью белка Р меченного коллоидным золотом. Комплекс белок А - коллоидное золот приготовлен в Институте цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск).

Для повышения контраста все препараты бактериального хроматин оттеняли круговым напылением сплава платины с палладием (4:1) под утло 7° в установке JEE-4C (JEOL) и просматривали в электронном микроског JEM 100С (JEOL) при ускоряющем напряжении 80 кв.

Результаты и обсуждение

Светящиеся бактерии.

При изучении динамики наследственной изменчивости штамм P.leiognathi 54 выделен ряд наследственных вариантов, возникающих частотами 10"3-10"5, различающихся по интенсивности люминесценции физиолош-биохимическим свойствам (Шендеров и др.,1989; Луцкая,199С (рис.1). Все отобранные варианты достаточно стабильно наследовал рассматриваемые морфологические признаки колоний, уровен люминесценции, активность ряда ферментов.

Трехсуточные колонии исследованных вариантов светящихся бактери P.leiognathi шт.54 имеют отчетливо выраженные морфологические признаю наблюдаемые визуально (табл.1). Они различаются рельефом поверхност) плотностью, цветом и интенсивностью люминесценции.

При электронно-микроскопическом изучении структурной организаци 3-х суточных колоний было обнаружено, что они представлены наборо клеток, различающимися по ультраструктуре и имеющими различну локализацию в объеме колонии.

На основании обнаруженных различий наблюдаемые морфологичесю особенности классифицированы с учетом состояния цитоплазмы, наличия р

характера включений. Клетки первого типа коккобациллы, , внешняя мембрана клеточной стенки имеет слегка волнистый профиль, цитоплазма гомогенная, заполнена рибосомами, тонкофибриллярный нуклеоид. занимает центральную зону. Клетки других типов можно считать производными от первого по следующим морфологическим признакам: а) наличие электронно-прозрачных включений поли-(3-оксимасляной кислоты в цитоплазме, б) наличие электронно-плотных гранул диаметром до 30 нм в нуклеоиде, в) присутствие тех и других включений. В колониях* обнаружены и деградирующие клетки, по ультраструктуре соответствующие четырем вышеуказанным типам, но отличающиеся состоянием цитоплазмы (рис.2).

Таким образом, идентифицировано 8 типов клеток, возникающих в результате различного сочетания признаков. Оказалось, что колонии каждого варианта представляют собой совокупность клеток, являющуюся выборкой из этих 8 морфологических типов, для каждого варианта характерен свой набор. Обнаруживается четкая корреляция между типами клеток, образующими колонию, и морфологическими признаками самой колонии. Основная тенденция расположения клеток у всех изученных вариантов может быть сведена к следующему: активно функционирующие микроорганизмы образуют слои, расположенные по периферии колонии, в центральной части лежат деградирующие клетки, формируя довольно обширный «лизисный» слой. В зоне лизиса клетки плотно сжаты, в периферических слоях они расположены рыхло, встречается много делящихся (рис.3).

Таким образом, электронно-микроскопическое изучение колоний изогенных вариантов РЛеодпаНи пгг.54 показало, что их организация соответствует классическим представлениям микробиологов - колония активно растет и функционирует только по периферии, в центральной части идут процессы распада клеток. Однако колонии других штаммов фотобактерий, РЛеюцпаНи шт.208 и 563, устроены по другому. В них выявляется по 2 типа клеток, отличающихся по структуре от клеток шт.54, нет четко сформированной лизисной зоны, можно лишь отметить преимущественную локализацию того или другого типа клеток.

Анализируя цитоморфологические отличия изогенных вариантов светящихся бактерий РЛею^аЙн шт.54 и процесс формирования колоний, а также физиолого-биохимические характеристики вариантов, их взаимные переходы, можно отметить следующие закономерности: яркосветящийся вариант, формирующий колонии шероховатого типа (54У), является стабильным по свечению, но чрезвычайно гетерогенным по клеточному составу. Темновой вариант (541) с колониями гладкого типа является

гомогенным по морфотипам клеток, но нестабильным по свечению, так как в его популяции с наибольшей вероятностью возникают клоны с разным уровнем свечения, т.е. другие варианты (рис.1). Колонии темнового варианта 541 РЛеюднаЙи состоят из одного типа клеток (с гомогенной цитоплазмой и без включений). Важным является то, что этот тип бактерий обнаруживается, наряду с другими, во всех выделенных вариантах. Кроме того, только такие клетки составляют молодые колонии (18 часов роста) наиболее гетерогенных по составу яркосветящихся вариантов 54 исх. и 54У, когда их (колонии) уже можно увидеть глазом, но они еще не светятся. Жидкая периодическая культура в начале экспоненциальной фазы роста также представлена клетками первого типа. Вероятно, именно этот тип клеток является родоначальным и из него в последующем в процессе роста колонии дифференцируются другие морфотипы.

Таблица 1.

Морфологические признаки и клеточный состав колоний вариантов РЛеодпаЙц 54.__

Клеточный состав

Варианта Морфолог признаки 1-суг. колонии 3-х сут. колонии недельные колонии

54 исх. Шероховатый полупрозрачный беловатый светящийся 5 типов 5 типов 5 типов

541 гладкий прозрачный желтоватый темный 1 тип 2 типа 2 типа

54П гладкий плотный беловатый тусклый 1 тип 3 типа 4 типа

54П1 гладкий прозрачный желтоватый светящийся 1 тип 2 типа

54ГУ гладкий плотный беловатый яркий 2 типа 4 типа 2 типа

54У шероховатый полупрозрачный беловатый очень яркий 5 типов 7 типов б типов

0®@©

и

исх

аятибиог.

токс.в-ва ист. С;

устойч. сохр.

морфотап

Рис.1. Возникновение вариантов РЛею^аИи шт.54 и зависимость их фенотипических свойств от факторов среды.

АВС-к.

Г*/

ЩМк ~:'АЪСп:\

* Ч «.'<&•.

- гI • (\

ус \ 'ш

ц

Рис.2. Различные морфотипы клеток яркосветящегося варианта РЛеюцпаЙи 54У,

9

в колониях изогенного

Рис.3. Панорама сечения колонии дикого штамма РЛеюдпайи 54. (а) слой клеток со стороны воздушной среды, (б) лизисная зона, (в) слой клеток, прилегающий к агару. Части рисунка, обозначенные «х», должны быть соединены.

Рис.4. Схема возникновения Я- и 8- вариантов А.еи^орЬиэ Ъ\ и зависимость их фенотипических характеристик от факторов внешней среды.

Рис.5. Рост Я- и Б-вариантов А.еШгор1шз Ъ\ при периодическом культивировании в авто-трофных условиях. (П)- добавка пептона. Стрелки указывают фазы роста культуры, где исследовали уровни организации ДНК.

время, час

Рис.6. Идентифицированные морфотипы клеток в колониях А.еШгорЬаБ Ъ\. (а) Я-вариант, (б) Б-вариант.

Возможно, что исходным являлся темновой S-вариант и он в природных условиях преобладает, о чем свидетельствуют описания колоний свежевыделенных светящихся бактерий (Чумакова, Гительзон,1975; Nealson, Hastings, 1979). Вероятно, в естественной среде темновой S-вариант, состоящий из «недифференцированных» клеток с полным набором информации, имеет значение для сохранения и стабилизации вида, a R-варианты, более дифференцированные по клеткам и яркосветящиеся, для расселения вида.

Исследованные варианты фотобактерий имеют отличия не только по характеру люминесценции, но и по многим признакам, затрагивающим основные показатели внутриклеточного обмена. В частности, изменение в жирнокислотном составе мембран, а именно, более высокий коэффициент насыщенности у S- вариантов, привели к изменению проницаемости мембран и снижению чувствительности к антибиотикам и другим токсическим веществам (Попова и др., 1994).

Водородокисляющие бактерии.

Опыт многолетнего наблюдения за культурой A. eutrophus Z1 показал, что в различных экстремальных условиях выращивания исходный штамм, на твердой среде образующий колонии R-типа, сохранял свои основные характеристики. Лишь в единичных случаях появлялись варианты, дающие колония S-типа. Однако при определенных условиях ферментации явление диссоциации исходного R-варианта с образованием S-форм стало устойчивым. R-вариант представлял устойчивую популяцию, способную к автотрофному росту, а S-формы росли в жидкой культуре только миксотрофно, в хемостатной культуре R-диссоциант имел преимущество по скорости роста, а S-формы постепенно вымывались. Всестороннее изучение процесса диссоциации в культуре A.eutrophus Z1 выявило существенные различия по ряду физиолого-биохимических показателей между возникшим S-вариантом и исходной R-формой (рис.4,5). Поскольку диссоциация происходила с высокой частотой, приводила к изменению физиолого-биохимических свойств культуры A. eutrophus Z1, были исследованы морфологические характеристики вариантов на примере 3-х, 6-ти и 12-ти суточных колоний.

Различия подтвердились и при морфологических исследованиях на ультраструктурном уровне. Кроме того, анализ ультратонких срезов колоний диссоциантов A.eutrophus Z1 свидетельствовал о выраженном различии бактерий в однотипных колониях (рис.6), каждый диссоциант был представлен характерной для него бинарной популяцией с определенным и повторяющимся расположением клеток в колонии. Обнаруженные

морфологические различия диссоциантов отражают, очевидно, произошедшие изменения общего метаболизма клеток, что подтверждается сравнением ряда изученных у Я- и Б-вариантов фгоиолого-биохимических признаков. По сравнению с исследованными вариантами Р.1ею§пайц шт.54, где выделены зоны активно растущих и деградирующих клеток, архитектоника колоний водородокисляющих бактерий более проста. Микроорганизмы располагаются практически равномерно по объему колонии, не выделяются лизисные зоны. Лизированные клетки располагаются среди активно функционирующих бактерий. Можно говорить о преимущественной локализации выделенных морфотипов клеток, причем пространственная организация колоний не зависит от условий роста вариантов, когда меняется тип метаболизма. На основании общепринятых взглядов, что рост и развитие колоний идет по периферии (Крит, Герхардт,1983; Wшpeшy,1989), полученные результаты не всегда объяснимы. Колонии вариантов водородокисляющих бактерий растут и функционируют по всему объему, вероятно, получая питательные вещества и кислород по сети межклеточных каналов, пронизывающих популяцию.

Процесс диссоциации, наблюдаемый в культуре А.еи1горЬи5 21, укладывается на первый взгляд в классическую схему - при действии факторов внешней среды существенно возросло имевшее место эпизодическое расщепление на варианты. Возникшие варианты отличались скоростью роста, устойчивостью к действию физико-химических факторов, морфологическими характеристиками. Однако, Б-форма не давала реверсии в исходную форму или другие варианты. Оказалось, что Я- и Б- варианты представлены клетками, значительно различающимися по ультраструктуре. По сравнению со светящимися бактериями у А-еий-орЫи Ъ\ не наблюдается одного морфотипа, который присутствовал бы во всех вариантах. Возможно, в результате диссоциации возникли варианты, баланс скоростей образования которых значительно сдвинут в сторону Л- формы. О генетических механизмах этого явления пока можно предполагать. Известно, что большую роль в диссоциативных переходах играют внехромосомные элементы. Действительно, в Я-варианте исследованного штамма присутствует плазмида размером близким к 100 кЪ, а Б- вариант не содержит плазмиды (Капцова, 1991). Исследование уровней компактизации ДНК.

Характерной особенностью бактерий Я-диссоцианта А.еиЦ-орЬив 2\ является не типичный для бактерий электронно-плотный вид нуклеоплазмы на ультратонких срезах клеток, выращенных как в жадкой,' так и на твердых средах. Поэтому проведено исследование структурной организации

нуклеоида разных фаз роста периодической культуры, выращенной в жидкой и на твердой средах, на выделенных препаратах ДНК. 1

В логарифмической стадии роста культуры, которая характеризуется наибольшей функциональной активностью генома, в составе нуклеоида выявляются участки с различной степенью упаковки ДНК: длинные расправленные ДНП-фибриллы (ДНК+протеины), толщиной 7-10 нм, с располагающимися на них транскрипционными комплексами, а также более многочисленные компактные ДНП-фибриллы, диаметром 15-17нм, содержащие гранулы различных размеров и отдельные транскрипционные комплексы. Неактивный розеткоподобный уровень организации ДНК выявлялся при распластывании у небольшой части. . клеток в логарифмической стадии роста культуры. Возможно, это были не- активные, отмирающие клетки популяции. Полное выделение ДНК в виде релаксированных петель наблюдалось в поздней стационарной фазе роста. Известно, что в стационарной стадии роста в культуре А.еиИорИш интенсивно идет накопление запасного полимера поли-Р-оксимасляной кислоты, а белковый синтез частично подавлен (Волова и др. 1992).

В начале стационарной фазы роста выделившийся нуклеоид состоит преимущественно из более толстых ДНП-фибрилл толщиной около 30 нм, нуклеосомоподобных (15-17 нм) и нуклеомероподобных (25-30 нм) гранул. Только отдельные петли выделенного хроматина представлены тонкими фибриллами с редкими транскрипционными комплексами. В составе хромосомы выявляются также структуры с более высоким уровнем компактизации ДНК в виде сферических частиц диаметром до 100 нм, образованных, вероятно, плотно упакованными ДНП-фибрилл ами с предшествующими уровнями компактизации.

При выделении и распластывании ДНК водородокисляющих бактерий, выращенных на твердой среде, на преператах можно было увидеть все уровни упаковки - нуклеосомо- и нуклеомероподобные глобулы, толстые ДНП-фибриллы диаметром около 30 нм, сферические образования, диаметром до 100 нм, состоящие из плотно упакованных фибрилл, т.е. уровни, характерные для стационарной стадии жидкой культуры, отдельные петли ДНК с многочисленными транскрипционными комплексами.

Схема выявленных уровней организации ДНК представлена на рис.7. Следовательно, по результатам исследований можно сказать, что большая часть ДНК в клетках водородокисляющих бактерий находится в неактивном конденсированном виде, на отдельных петлях идут синтетические процессы. Наблюдается дифференциальная декомпактизация хромосом при их выделении из клеток. Выявляемые уровни организации хромосомы

отражают различное функциональное состояние отдельных участков ДНК. Характер выделения и расправления ДНК из клеток свидетельствует о гетерогенности популяции бактерий

Заключение

Привлекая литературные данные, а также собственные результаты исследований бактерий можно утверждать, что бактериальная колония является популяцией определенным образом организованных клеток. Повторяемость этой организации позволяет воссоздавать каждый раз однотипную внутреннюю структуру, что и проявляется на макроуровне как постоянство формы^ плотности, цвета и других характеристик, которые служат таксономическими признаками при росте колоний на однотипных средах. С чем связана пространственная локализация клеток различных морфотипов? Возможно, что организация колоний регулируется прямыми клеточными контактами, взаимодействием клеток и образованным ими цитоскелетом колонии, где передача информации осуществляется через межклеточный матрикс. Последний участвует в поддержании целостности колонии, образуя упорядоченный пространственный остов. Важную роль в постоянстве внутренней организации микробных колоний играют генетические факторы и физико-химические факторы окружающей среды. Анализируя организацию колоний, например, по наличию лизисных зон,

фотобактерий, Е.соН, Ешкпа ЬегЫсо1а (Тикк,1984), также водородокисляющих бактерий и Шюс1ососсит гиЬгореЛтсШэ можно сделать предварительный вывод, что архитектоника колонии является параметром, характеризующим штаммовые различия, и не зависит от изученных факторов среды (рис.8 ). Недостаточность экспериментального материала не позволяет сделать выводы о различиях на уровне вида рода и т.д.

Обобщая наблюдения по организации колоний и ультраструктуре бактерий И- и в-вариантов А.еий-орЬиБ а также изогенных вариантов светящихся бактерий РЛею^аАп шг.54 можно сказать, что полученные результаты согласуются с выводами Н.А.Бакулиной (1985) о существовании субпопуляций в одной колонии. При образовании колоний идет дифференциация дочерних клеток на клоны, обладающих дополнительными, отличительными от материнских, признаками, и обеспечивающими виду выживаемость. Кроме того, возникновение субпопуляций в определенное время развития колоний может говорить о том, что имеется пул недифференцированных особей, которые начинают функционировать при определенных условиях (накопление биомассы, накопление метаболитов). Повторяющаяся картина в строении колоний говорит о том, что их

Рис.7. Схема уровней упаковки хроматина, наблюдаемых при выделении ДНК из клеток АейгорЬиз Zl в мягких осмотических условиях: 1) сферопласт; 2) хроматин на начале выделения из клетки; 3) расправленные фибриллы ДНК (а) с транскрипционными комплексами (б), нуклеосомоподобными глобулами (в), розегковидными (г) и спиральными структурами (д); 4) нуклеомероподобные глобулы; 5) суперскручешше фибриллы с хромомероподобными структурами. Звездочкой отмечены участки выделенного хроматина, где обнаруживается метка на Ни белок .

Р1е'ю(?пяЛ| Р.рЬоярЬогеит Е.соН Ег-^гЛа ЬегЫссИа А.си1гор1ш5 КЬовососсиж

глею^пат! г у 21 г гаЬгорегйчста

Рис.8. Наличие лизисных зон (заштрихованные участей) в колониях бактерий, принадлежащих к различным таксономическим группам.

формирование и развитие является регулируемым наследственно закрепленным процессом. Из полученных данных по изучению морфологической гетерогенности бактериальных колоний исследованных видов, действию на нее внешних факторов можно сделать следующие заключения, немаловажные для практического использования:

1.Варианты P.leiognathi 54, образующие колонии S-типа, являются более гомогенными по клеточному составу, поэтому для решения определенных задач использование их в качестве посевного материала более оправдано, поскольку можно создать набор морфотипов клеток, меняя внешние факторы. Следует учитывать также, что в популяциях R-вариантов в большом количестве присутствуют лизисные формы. Для A.eutrophus Z1 такое заключения сделать нельзя.

2. Варианты P.leiognathi 54 и A.eutrophus ZI, образующие колонии шероховатого типа (R), из-за изменений в липидном составе клеточной стенки и, соответственно, ее проницаемости, более пригодны для создания коллекций штаммов с повышенной чувствительностью к различным классам токсичных веществ. Изменяя факторы среды (например, источник углерода), можно повысить чувствительность штаммов к токсичным веществам.

3. Управлять выходом продукта, например, люцифераз, можно задавая определенную структуру популяции (по клеточным морфотипам).

Гетерогенность популяции бактерий проявляется и на субклеточном уровне. Пространственная организация ДНК в бактериальной клетке имеет важное значение в регуляции работы генов и регуляторных систем. Ориентация участков ДНК в пространстве относительно друг друга, их сближение или удаление влияет на взаимодействие белков, связывающихся с различными участками ДНК.

В настоящей работе проведено комплексное изучение структурно-функциональной организации хроматина водородокисляющих бактерий на разных стадиях роста бульонной периодической культуры, а также культуры, растущей на твердой среде в виде колоний. Показано, что структура хроматина в большей степени определяется фазой роста и прочностью связей ДНК с белками. Кроме того, характер выделения и расправления ДНК из клеток может свидетельствовать о гетерогенности популяции бактерий. Полученные данные согласуются с результатами работ по исследованию организации ДНК в нуклеоиде других микроорганизмов: Bacillus licheniformis (Sloof et al.,1983), Streptomyces fradia (Киселева и др., 1988), E.coli (Лихошвай,1988), что указывает на существование общих принципов упаковки ДНК в геноме прокариот, значительно различающихся по физиологическим и функциональным характеристикам. Следует отметить

сохранение компактного, а значит и метаболически не активного, состояния большей части ДНК на всех стадиях жизненного цикла водородокисляющих бактерий. Такое состояние можно объяснить не только прочностью связей ДНК с белками, но и, возможно, узкой специализацией данных микроорганизмов. Это позволяет предположить, что в лабораторных условиях не реализованы заложенные природой потенциальные возможности водородокисляющих бактерий.

Наличие гистоноподобного белка Ни в клетках водородокисляющих и светящихся бактерий в плотно компактизованных участках выделенной бактериальной ДНК и на тонких фибриллах, содержащих нуклеосомоподобные глобулы, свидетельствует скорее всего о его участии в поддержании компактных образований хроматина. Выводы

1. Метод приготовления целых бактериальных колоний адаптирован для электронно-микроскопического исследования колоний А.еШхорЬиБ Ъ\ и РЛе^паИн шт.54. Это позволило повысить информативную ценность ультратонких срезов большой площади при изучении архитектоники колоний и гетерогенности популяций.

2. Показано, что популяции Б- и Я- вариантов колоний А.еШгорЬиз Ъ\, вне зависимости от факторов внешней среды, являются бинарными и отличаются по ультраструктуре составляющих клеток.

3. Впервые идентифицировано 8 типов клеток, в различных сочетаниях составляющих колонии Б- и Л- вариантов Р.1ею§дайп шт.54. Обнаружено, что структура колоний определяется составляющими ее субпопуляциями бактерий. При этом установлено, что степень гетерогенности колонии возрастает при увеличении интенсивности биолюминесценции.

4. Показано, что колонии Р.Ыо^аШ шт.54 и А.еи1гор}ш8 Ъ\ являются пространственно гетерогенными, о чем свидетельствует зависимость между морфотипами и пространственными координатами объема колонии.

5. Выявлено, что на степень гетерогенности хроматина А.еиЦ-орЬш Ъ\ оказывает влияние фаза и условия роста культуры. Обнаруженная высокая степень компактизации хромосомы может свидетельствовать о неактивном состоянии большей части ДНК данных микроорганизмов в исследуемых условиях.

6. Установлено/ что гистоноподобный белок Ни локализован в компактизованных участках ДНК водородокисляющих и светящихся бактерий, что подтверждает его участие в поддержании компактного состояния хроматина прокариот. ' "

Работы, опубликованные по теме диссертации.

1. Пузырь А.П., Могильная O.A. / Электронно-микроскопическое изучение структуры колоний некоторых видов бактерий. //Препринт N 88Б, Красноярск, 1988. 28с.

2. Стасишина Г.Н., Могильная O.A., Калачева Г.С., Волова Т.Г., Медведева С.Е., Франк JI.A., Гусейнов O.A., Плотников В.Ф. / Исследование гетерогенности в культуре водородных бактерий Alcaligenes eutrophus ZI. //Препринт N 103Б, ИБФ СО АН СССР, Красноярск, 1989.

3. Могильная O.A., Киселева Е.В., Медведева С.Е., Пузырь А.П. /Электронномикроскопическое исследование структурно-функциональной организации нуклеоида водородокисляющих бактерий. // Препринт N 106Б, ИБФ СО АН СССР, Красноярск, 1989. -15с.

4. Mogilnaya O.A., Videlets I.Yu., Puzyr A.P., Medvedeva S.E., Shenderov A.N. Ultrastructural organization of colonies of Photobacterium leiognathi hereditary variants. Folia microbiol. 1989.- Vol. 34, №. 5, P.- 415-416.

5. Плотников В.Ф., Гусейнов O.A., Волова Т.Г., Федорова Я.В., Могильная O.A. /Влияние окиси углерода на метаболизм водородных бактерий Alcaligenes eutrophus ZI. //Микробиология.-1990.-Т.59.вып.2.-С.226-233.

6. Могильная O.A., Киселева Е.В., Медведева С.Е., Пузырь А.П. /Иммуноэлектронно-микроскопическая локализация гистоноподобных белков в хроматине светящихся бактерий. //ДАН АН СССР.-1990.-T.314,N3.-C.726-727.

7. Могильная O.A., Медведева С.Е., Пузырь А.П., Виделец И.Ю., Шендеров А.Н. / Дифференцировка клеток и архитектоника колоний наследственных вариантов Photobacterium leiognathi // Препринт N 168Б, Красноярск, 1991. -28с.

8. O.A.Mogilnaya, E.V.Kiselyova, S.E.Medvedeva, A.P.Puzir, O.A.Guseynov, N.P.Kulyba, A.V.Kozlov / Immunoelectron-microscopic study of the nucleoid structure of hydrogen bacteria.//J.Basic Microbiol. 1992.-V.32.N5. P.381-387.

9. Могильная O.A., Медведева C.E., Пузырь А.П. Структурные особенности клеток, генома и колоний Alcaligenes eutrophus.// Тез.докл. Междунар.конф." Микробное разнообразие", 1996, 8-11 окт., Пермь,Россия, с.70.

Ю.Медведева С.Е., Могильная O.A., Пузырь А.П. Структура колоний и генома бактерий рода Photobacterium. //Тез.докл. Междун. конф. "Микробное разнообразие ", 1996, 8-11 окт., Пермь, Россия, с.66.

11. Стасишина Г.Н., Могильная O.A., Калачева Г.С., Волова Т.Г., Медведева С.Е., Франк JI.A., Гусейнов O.A., Плотников В.Ф. /Исследование гетерогенности в культуре водородных бактерий Alcaligenes eutrophus ZI //Микробиология, 1998 (в печати).

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Могильная, Ольга Алексеевна, Красноярск

Российская Академия Наук Ордена Ленина Сибирское Отделение Институт Биофизики

На правах рукописи УДК 576.851

Могильная Ольга Алексеевна

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ КОЛОНИЙ АЬСАЫвЕШЗ ЕиТИОРНШ и РНОТОВАСТЕКШМ 1ЕЮС1\Л ГШ (ПО ДАННЫМ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ)

03.00.02-биофизика 03.00.07 - микробиология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель: к.б.н., с.н.с. Медведева С.Е.

Красноярск, 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение----------------------------------------------------------------------------стр. — 4

Глава 1. Обзор литературы--------------------------------------------------------------11

1.1. Морфология колоний--------------------------------------------------------12

1.2. Внутренняя организация бактериальных колоний -------------------16

1.3. О бактериальном нуклеоиде----------------------------------------------- 22

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Объекты исследования-------------------------------------------------------32

2.2. Подготовка колоний для ультраструктурных исследований--------33

2.3. Статистическая обработка данных---------------------------------------37

2.4. Подготовка ДНК А.еи^орЬиБ Zl и РЛею^аЙи 208 для электронно-микроскопических исследований-----------------------------------------------37

Глава 3. Морфология колоний и ультраструктура клеток изогенных вариантов светящихся бактерий

3.1 Морфология колоний светящихся бактерий----------------------------- 39

3.2 Морфологические типы клеток в колониях Р.1ею£паЙи 54-----------40

3.3 Изменение структуры популяции в процессе развития----------------52

3.4 Структура популяции секторных колоний-------------------------------54

3.5 Расположение клеток в колониях Р.1ею§па1;Ы шт.54-------------------56

3.6 Межбактериальные связи и внеклеточный матрикс---------------------59

3.7 Процесс дифференцировки колоний---------------------------------------60

Глава 4.Морфология колоний и ультраструктура водородокисляющих бактерий в гетеро- и автотрофных условиях роста на твердой среде.

4.1. Морфология колоний---------------------------------------------------------67

4.2. Я-вариант в гетеротрофных условиях--------------------------------------68

4.3. Я - вариант в автотрофных условиях--------------------------------------74

4.4. Б-вариант в гетеротрофных условиях-------------------------------------79

4.5. Б-вариант в автотрофных условиях----------------------------------------82

4.6. Ультраструктура водородокисляющих бактерий жидкой

периодической культуры----------------------------------------------------------87

Глава 5. Состояние генома водородокисляющих бактерий в различных условиях роста.

5.1. Упаковка ДНК в клетках Я-варианта А.еийгорЬш Ъ\, растущего в жидкой культуре и в виде колоний на твердой среде------------------------90

5.2. Иммуноцитохимические исследования ДНК водородокисляющих

и светящихся бактерий-------------------------------------------------------94

Главаб. Заключение----------------------------------------------------------------------105

Выводы-------------------------------------------------------------------------------------113

Литература---------------------------------------------------------------------------------114

ВВЕДЕНИЕ

Вопросы гетерогенности бактериальных популяций довольно широко освещаются в литературе. Описание морфологической гетерогенности популяций чаще всего касается жидкой бактериальной культуры (Иванов, Угодчиков, 1984: Печуркин и др.1990; Милько, Егоров, 1991), лишь небольшая часть исследований посвящена изучению гетерогенности, возникающей в процессе роста и развития бактериальных колоний (Высоцкий и др., 1984; Бакулина, 1985; Бондаренко и др.,1987; Павлова и др.,1990; Mendelson, Salhi, 1996). Интерес к этой проблеме объясняется возможностью параллельно с изучением гетерогенности популяции исследовать фундаментальные аспекты роста и морфогенеза микроорганизмов (Shapiro,1995). Микробную колонию следует рассматривать с разных точек зрения. Во-первых, это исходный посевной материал для микробиологических, генетических, биотехнологических целей. Во-вторых, колония это простейшее микробное сообщество, обладающее способностью к самоорганизации Исследование архитектоники колоний (совокупность данных об ультраструктуре клеток, их взаимодействии, ориентации и распределении в определенных областях колонии) предоставляет уникальную возможность комплексного изучения фундаментальных аспектов морфогенеза и роста бактериальных популяций. Наконец, колония является простейшим примером реализации генетической программы построения сообщества из одной клетки на твердой поверхности.

В настоящее время наблюдается явный разрыв между данными о гетерогенности бактериальной популяции и интерпретацией экспериментальных результатов по изучению структуры колонии. Так, цитоморфологическое разнообразие популяций признается закономерным и определяющим высокую выживаемость вида в меняющихся условиях среды обитания (Бакулина, 1985; Высоцкий и др.,1985; Новик, Высоцкий, 1996; Shapiro, 1995). Однако вопросы структурной организации и формирования

колоний, условия расщепления исходных бактериальных популяций на варианты с различными свойствами остаются недостаточно исследованными.

Электронно-микроскопическое изучение колоний позволяет наглядно продемонстрировать ультраструктурное разнообразие и дифференцировку бактерий в процессе роста, их локализацию и ориентацию в биомассе колонии, различные способы взаимодействия клеток, что дает возможность составить представление о гетерогенности на популяционном и клеточном уровнях.

Электронно-микроскопическое исследование бактериальной хромосомы дает представление о гетерогенности на субклеточном уровне. Использование бактерий различных таксономических групп в качестве простого и легкодоступного объекта исследований важно для понимания процессов изменчивости микроорганизмов в постоянно меняющихся условиях обитания и их роли в эволюции прокариот.

Актуальность проблемы.

Морфология колоний является одним из важных таксономических признаков, широко используемых в микробиологии. Этот признак можно рассматривать как некую наследственную морфогенетическую структуру на поверхности агара, являющуюся потомством одной клетки, размножающейся простым делением. Долгое время считалось, что все 106-108 клеток, составляющих колонию, одинаковы, однако в последние годы получены данные, свидетельствующие о наличии в колонии нескольких субпопуляций, различающихся по морфологическим и физиологическим признакам (Бакулина,1985; Shapiro, 1995). Предположительно гетерогенность в колонии возникает вследствие градиента питательных веществ и продуктов метаболизма в разных ее участках (Криг, Герхардт, 1983; Шлегель,1987; Wimpenny,1989). Интерес к данным проблемам не ослабевает, что вызвано различными задачами микробиологической практики и биотехнологии, а также имеет и чисто теоретический аспект.

Для решения вопросов гетерогенности микробных колоний в принципе применимы разные подходы, начиная от классических микробиологических, генетических и кончая управляемым культивированием и математическим моделированием популяции (Перт, 1978; Печуркин и др. 1990; Милько, Егоров, 1991; Белова и др. 1995; Брильков,1996; Shapiro,Higgins,1989). В их числе находятся и физические методы исследования биообъектов, среди которых подавляющим преимуществом обладает электронная микроскопия. Разнообразные методы электронной микроскопии позволяют оценить гетерогенность с позиций клеточной биологии, биохимии, генетики и биофизики (Шапиро, 1988; Лихошвай, Христолюбова, 1988), т.е. одновременно наглядно продемонстрировать гетерогенность на субклеточном, клеточном и популяционном уровне.

Известные к настоящему времени данные об ультраструктурной организации бактериальных колоний свидетельствуют в пользу представления о колонии как многокомпонентной, но определенным образом организованной на твердой поверхности структуре и даже "многоклеточном" организме (Бакулина 1985; Shapiro, 1988,1995; Shapiro, Higgins, 1989). Этот аспект является важным для понимания физиолого-биохимической, генетической активности колонии или любой бактериальной популяции на поверхности. С другой стороны, показателем активности генома, а, следовательно, и популяции в целом, является уровень организации хромосомы. В области исследования структурной организации хромосом эукариот достигнуты значительные успехи, прокариоты же в этом плане изучены недостаточно. Небольшие размеры бактериальных клеток и, соответственно, ДНК не позволяют изучать их на уровне светового микроскопа. Всестороннее рассмотрение структурной организации бактериального хроматина, а также цитоморфологических характеристик отдельных субпопуляций колоний стало возможным только с привлечением электронно-микроскопических методов.

Изучение бактериальной нуклеоплазмы, в частности, морфологическими методами приобретает значимость не только в изучении ДНК различных таксономических групп прокариот, но и в связи с исследованием геномов митохондрий и хлоропластов эукариот, имеющих свою белоксинтезирующую систему, подобную бактериальной. Кроме того, бактерии предоставляют уникальную возможность исследования ДНК, находящуюся в неактивном состоянии длительное время (ДНК спор) и готовую начать метаболизировать в течение нескольких минут при наличии подходящих условий окружающей среды.

Актуальность и необходимость изучения А1са^епез еМгоркт 21 и Рко^Ьас1егшт \eiognathi шт. 54 объясняется их практической значимостью на современном этапе развития науки и производства. Исследованные светящиеся бактерии являются потенциальным источником люциферазы, используемой для биолюминесцентного анализа. Водородокисляющие бактерии являются модельным объектом изучения автотрофии микроорганизмов, потенциальным продуцентом белка одноклеточных и полимера поли-(3-оксимасляной кислоты.

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в развитии представлений о структуре и гетерогенности бактериальных колоний на примере водородокисляющих А1са^епез еъйгоркш 21 и светящихся бактерий РкоЮЬаМегшт 1ею^шМ шт. 54, возможности использования полученных морфологических характеристик как управляемых параметров популяции. В конкретные задачи работы входило:

1. Развитие метода приготовления целых бактериальных колоний для электронно-микроскопических исследований светящихся и водородокисляющих бактерий.

2. Оценка влияния физико-химических факторов среды на морфологические характеристики клеток и их пространственную локализацию в объеме колоний вариантов Р.1ею§па1:Ы шт.54 и А.еийгорЬш шг.2\.

3. Сравнительный анализ архитектоники колоний как параметра, характеризующего штамм, вид, род и т.д.

4. Определение роли метаболической активности клетки, действия декомпактизующих ДНК факторов, Ни белка в гетерогенности бактериального хроматина.

Научная новизна работы и практическое значение. Настоящая работа является комплексным исследованием, в результате которого получены новые данные и сформированы новые представления о цитоморфологической гетерогенности популяций и структурной организации бактериальной колонии, зависимости фенотипических характеристик от факторов среды. Результаты работы являются существенным продвижением в развитии представлений о временной и пространственной организиции биологических систем, в частности, принципов самоорганизации бактериальных колоний как сообщества на твердой поверхности.

Впервые на примере А.еийорЬиз Ъ\ и Р.1ею§па1:Ы 54 проведено исследование архитектоники бактериальных колоний с применением метода, позволяющего сохранять целостность колонии. При анализе панорамных (обзорных) снимков больших участков колоний, полученных с помощью просвечивающего электронного микроскопа, получены принципиально новые данные о существовании морфологически гетерогенных субпопуляций бактерий в составе одной колонии и их определенной пространственной локализации.

Впервые изучено тонкое строение микроорганизмов в колониях диссоциантов водородокисляющих и светящихся бактерий. По ультраструктурной организации идентифицированы определенные морфотипы данных бактерий. Показано, что морфологические признаки колоний определяются сочетанием составляющих ее морфотипов клеток.

Исследование структуры нуклеоида водородокисляющих бактерий показало необычайно высокую степень компактизации хроматина, стабильность обнаруженных уровней упаковки на препаратах выделенной ДНК. Результаты исследования степени компактизации бактериальной хромосомы водородокисляющих бактерий расширяют аналогии в структурной организации геномов про- и эукариот, подтверждают представления о зависимости структурной организации хроматина от физиологического состояния бактериальной клетки.

Впервые проведенная для A.eutrophus Z1 и P.leiognathi 54 на электронно-микроскопическом уровне иммуноцитохимическая локализация гистоноподобного белка HU на хроматине бактерий in situ свидетельствует об участии данного белка в организации вторичной структуры бактериальной ДНК.

Полученные результаты о фенотипических характеристиках популяций водородокисляющих и светящихся бактерий, о функциональной активности генома могут найти приложение в изучении микробного разнообразия, экологии микроорганизмов, в изучении динамики структуры популяции, механизмов действия на нее внешних факторов. Отсюда вытекает возможность прогнозировать изменение состава популяции и тем самым управлять ею. Кроме того, полученные результаты могут иметь практическое значение при создании штаммов-продуцентов биологически активных и ценных веществ, получении тестовых систем на основе бактерий.

Положения, выносимые на защиту.

1. Колонии светящихся и водородокисляющих бактерий являются неоднородными по структуре составляющих их клеток. По мере развития колонии идет дифференцировка клеток по определенной программе.

2. Архитектоника колоний повторяема, т.е. наследственно закреплена.

3. Структурная организация хроматина водородокисляющих бактерий характеризуется высокой степенью компактизации и стабильностью выделенных уровней при различном метаболическом состоянии клетки.

4. Гистоноподобный белок HU участвует в поддержании нуклеосомоподобного уровня организации ДНК (на примере A.eutrophus Z1 и P.leiognathi шт.208).

Апробация работы.

Материалы исследований были доложены на Всесоюзной конференции "Структурно-функциональная организация клеток микроорганизмов" (Пущино,1987), XIII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Звенигород, 1988), заседании Красноярского отделения Всесоюзного микробиологического общества (Красноярск, 1987), заседании Московского отделения Всесоюзного микробиологического общества (Москва, 1990), Всесоюзной школе "Электронная микроскопия в биологии и медицине " (Звенигород, 1990), Всесоюзной конференции «Биотехнология и биофизика микробных популяций» (Алма-Ата, 1991), Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы» (Пермь, 1996), конференции «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 1996), VIII Европейском конгрессе по биотехнологии (Будапешт, 1997).

Структура и объем работы.

В первой главе анализируются литературные данные по данной проблеме. В главе 2 описываются материалы и используемые методы. Главы 3, 4, 5 посвящены изложению и обсуждению полученных результатов. Глава 6 -заключение и выводы. Работа изложена на 128 стр., включает 7 таблиц, 36 иллюстраций. Список цитируемой литературы содержит 141 наименование, из них 65 зарубежных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Вопросы популяционной гетерогенности микроорганизмов давно привлекают внимание исследователей. Известно, что микробные сообщества,

о

численностью более 10 клеток не являются однородными. Спонтанные

А о

мутантные формы появляются с частотой 10" -10" . Следовательно, все популяции должны быть гетерогенны. Микроорганизмы в популяции находятся на разных фазах клеточного цикла, кроме того, каждая клетка прошла определенное количество генераций. Соответственно фазе клеточного цикла особи будут отличаться по морфологическим характеристикам, синтезу компонентов клеточной стенки, белков, РЕК и т.д, следовательно, по таким физиологическим показателям как скорость роста, эффективное использование питательных веществ, синтезу биополимеров и т.д. (Работнова, 1975; Иванов, Угодчиков; 1984; Печуркин др., 1990).

Многочисленные исследования позволяют выделить несколько сторон в вопросе неоднородности популяций: возрастную, пространственную, генетическую, цитоморфологическую. Однако следует отметить относительный характер описаний различных типов гетерогенности, который определяется набором используемых методов.

Пространственная гетерогенность в суспензиях микроорганизмов проявляется в объединении клеток с помощью слизи в микроколонии и большие агрегаты. Часто это сопровождается появлением в культуре хлопьев, пленок и т.д. При культивировании неоднородность наблюдается и по объему ферментера (Печуркин, 1978; Воскун и Смирнов, 1984).

В генетическую гетерогенность культуры большой вклад вносят спонтанные и индуцированные мутации, диссоциативные переходы, возникающие в результате переноса