Популяционная вариабельность микроорганизмов

Хабибуллин, Самат Сиринович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Популяционная вариабельность микроорганизмов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Популяционная вариабельность микроорганизмов"

На-лравак рхцродси

□03055483

ХАБИБУЛЛИН САМАТ СИРИНОВИЧ

ПОПУЛЯЦИОННАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003055483

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета им. Д.И.Менделеева и в Институте микробиологии РАН им. С.Н.Виноградско го

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Эль-Регистан Галина Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Воробьева Лена Ивановна кандидат технических наук Пичугина Татьяна Викторовна

Ведущая организация: НТЦ «Лекбиотех»

Защита состоится 2007 г. в Л? часов на заседании диссертационного

совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., 9 в ауд.443.

С диссертацией можно ознакомиться в информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д. И. Менделеева.

Автореферат разослан « /Г"» ^¿¿СрТУ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13

И.В. Шакир

Актуальность проблемы. Изучение фенотипической изменчивости как генетического феномена, лежащего в основе таких явлений и процессов как изменение скорости микробных синтезов и трансформаций, вирулентность и персистенция патогенных и условно-патогенных бактерий, результативность симбиозов и замещение продуктивных вариантов промышленных штаммов, является одной из наиболее актуальных проблем современной микробиологии. Понимание механизмов внутрипопуляционной изменчивости микроорганизмов и возможность их контроля позволят значительно повысить эффективность существующих микробиологических производств. Известно, что популяция микроорганизмов гетерогенна и характеризуется наличием внутри популяции (одного штамма) клеток, различающихся по ряду колониально-морфологических и физиолого-биохимических свойств и способных к диссоциативным переходам с высокой частотой (lO^-lO"4 на одно клеточное деление) [Милько, Егоров, 1991; Головлев, 1998]. Согласно современным представлениям популяционная вариабельность бактерий обусловлена процессами внутригеномной рекомбинации генетического материала клетки, которые можно отнести к специфическому типу мутаций [Прозоров, 2001]. В появившихся в последние десятилетия экспериментальных работах отмечается повышение фенотипической гетерогенности популяции в стационарной фазе роста, в стареющих и длительно хранящихся микробных культурах [Милько, Егоров, 1991, Kelly et.al., 2001]. Согласно ряду гипотез это связано с состоянием пролиферативного покоя клеток, с включением общего регулона стационарной фазы и действием сигнальных молекул, контролирующих экспрессию генов этой фазы и переход клеток к состоянию покоя [Yildiz&Schoolnik, 1998; Suh et.al., 1999; Andersson et.al., 1999]. Среди внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов такими функциями обладают видонеспецифичные ауторегуляторы: аутоиндукторы анабиоза - факторы dt (производные алкилоксибензолов-АОБ), выделенные и описанные для широкого круга микроорганизмов [Эль-Регистан, 1988; Батраков с соавт., 1993; Мулюкин с соавт., 1996; Бухарин с соавт., 2005]. Возможность использования этих ауторегуляторов для направленной регуляции популяционной вариабельности и стабилизации диссоциантов бактерий представляет интерес для микробиологии, медицины и биотехнологии.

Цель работы: изучить закономерности саморегуляции популяционной вариабельности спорообразующих и неспорообразующих бактерий, разработать приемы направленного контроля диссоциативных переходов.

Задачи исследования:

1. Изучить популяционную вариабельность бактерий Bacillus licheniformis, B.subtilis, Pseudomonas aeruginosa, P.aurantiaca, реализующуюся при прорастании покоящихся форм различных морфотипов.

2. Охарактеризовать выделенные диссоцианты бактерий по их колониально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.

3. Разработать приемы регуляции популяционной вариабельности бактерий с помощью химических аналогов факторов d, - алкилоксибензолов (С7-АОБ и С)2-АОБ).

4. Изучить возможный механизм действия АОБ в процессах диссоциативных переходов бактерий в тесте возврата к прототрофности клеток ауксотрофного штамма B.subtilis trpA5 В1733.

Научная новизна.

1. Впервые изучена фенотипическая диссоциация В.licheniformis шт.103, B.subtilis шт.В1733, Р.aeruginosa шт.К2, P.aurantiaca шт.В1558, выделены и описаны колониально-морфологические варианты этих бактерий. 2. Показана зависимость между типом покоящихся форм (ГГФ) бактерий и степенью вариабельности микробной популяции при их прорастании: у всех изученных бактерий наибольшей нестабильностью генотипа обладали цистоподобные покоящиеся клетки (ЦПК). 3. Впервые разработаны приемы регуляции популяционной изменчивости промышленного штамма В. licheniformis 103 при воздействии ауторегуляторных факторов на эндоспоры. Приемы предусматривают как индукцию выщепления минорных вариантов, так и селективное развитие определенного варианта при обработке эндоспор как инокулируемого материала определенными концентрациями АОБ. 4. Изучены возможные механизмы воздействия АОБ в процессах популяционной вариабельности бактерий. В тесте возврата к прототрофности клеток ауксотрофного штамма B.subtilis trpA5 В1733 показано, что С^-АОБ обладает слабой мутагенной активностью. Обнаружена корреляция между мутагенной активностью С12-АОБ и интенсивностью диссоциативных переходов, которые индуцируются определенными концентрациями АОБ.

исследования показано, что отдельные диссоцианты псевдомонад, отличающиеся стрессоустойчивостью, могут быть использованы в биотехнологических целях, в частности, при конструировании биосенсоров. Разработаны приемы направленной регуляции популяционной изменчивости спорообразующих бактерий путем воздействия на вегетативный или споровый инокулят алкилоксибензолами - химическими аналогами микробных ауторегуляторных факторов d). Установлены концентрационные диапазоны АОБ, предусматривающие как расширение диссоциативного спектра и индукцию выщепления минорных вариантов, так и сужение спектра и селективное развитие определенных из них. Полученные в работе результаты могут быть использованы для: 1) быстрого получения широкого спектра внутрипопуляционных диссоциантов грамположительных и грамотрицательных бактерий; 2) направленного контроля развития необходимого варианта; 3) совершенствования методов хранения коллекционных культур и промышленных штаммов микроорганизмов.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на II Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003). По материалам диссертации опубликовано 5 работ: из них 3 статьи и 2 тезиса.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 149 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 253 публикации отечественных и зарубежных авторов. Материал иллюстрирован 24 таблицами и 30 рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили бактерии Bacillus licheniformis шт. 103, B.subtilis trpA5 шт.В1733, которые поддерживали на косяках с картофельным агаром, а также Pseudomonas aeruginosa шт.К2, P.aurantiaca шт.В1558 - поддерживаемые на МПА.

Среды и культивирование. Для роста и получения покоящихся форм бацилл различных морфотипов использовали следующие среды. Среда №1 (для эндоспорообразования): основной солевой состав (г/л): (NH4)2HP04 - 1,0; KCl - 0,2; MgS04-7H20 - 0,2; СаС12 - 0,2; FeCl3-6H20 - 0,001; MnS04-H20 - 0,0017; МПБ - 20%; глюкоза — 0,2%. Среда №2 (для получения цистоподобных покоящихся клеток - ЦПК): основной солевой состав, бактопептон - 0,3 г/л, глюкоза 4 - 6%. Среда №3 (агаризованная - БСА, для выявления колониально-морфологических вариантов при высеве на плотную среду бактериальных суспензий из ряда разведений): МПБ и сусло в соотношении 1:1, глюкоза - 2%. Среда №4 (среда Спицайзена для роста B.subtilis) (г/л): (NH4)2S04 - 2,0;

КН2Р04 - 6,0; К2НР04 - 14,0; цитрат Na - 1,0; MgS04 -7Н20 - 0,2; глюкоза - 5,0; агар - 20. Среда №5 (для выявления мутагенной активности АОБ при культивировании ауксотрофного по триптофану В. subtilis trpA5 шт. В 1733): среда №4 и триптофан - 50 мг/л. Значение рН после стерилизации 7,2.

Клетки псевдомонад выращивали на 50%-ном МПБ и на среде М 9 (г/л): глюкоза-2; КН2Р04-0,1; (NH4)2S04-0,5; К2НР04-1; CaClr0,2; MgS04-7H20-0,l; дрожжевой экстракт -0,05; микроэлементы (мг/л): FeS04-20; MnClr4H20-20; ZnS04-0,4; В(ОН)3-0,5; CuS04-5H20-0,5; Na2Mo04-2H20-0,2 (среда №6); среде №7 - среде того же состава, но с лимитом по источнику азота — (NH4)2S04-0,1 г/л (для получения ЦПК). Значения рН после стерилизации 7,0. В качестве инокулята использовали: для бацилл - суспензию 3-7 суточных эндоспор, для псевдомонад - клетки фазы линейного роста, начальная ОП 0,2 («Specord», X = бООнм, 1 = 10мм). Культивирование проводили в колбах на 250мл (объем среды 50мл) при температуре 28°С и перемешивании на качалке с 140 об/мин. ЦПК под действием факторов с^ получали внесением в суспензию клеток бактерий фазы замедленного роста химического аналога ауторегулятора С12-АОБ в концентрациях 1x10'5 - 5х10"3М.

Микробиологические методы. Оптическую плотность клеточных суспензий (ОП) определяли на спектрофотометре "Specord" (л=600 нм, С=10мм). Массу сухих клеток (МСК) определяли их высушиванием до постоянного веса в течение 24 часов при температуре 105°С. Численность клеток (жизнеспособных) определяли по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве на агаризованные среды бактериальных суспензий из ряда разведений. Для выделения колониально-морфологических вариантов исследуемых штаммов и изучения их признаков использовали метод многократных пассажей [Кузнецов, 1974] и метод рассева цистоподобных покоящихся клеток. Индекс диссоциации популяций определяли как долю (%) колоний определенного фенотипа к общему числу колоний. Термоустойчивость клеток определяли при прогреве клеточных суспензий в ультратермостате "UV-10" при температуре 85°С в течение 15 минут с последующим определением числа КОЕ. Микроскопические наблюдения проводили на микроскопе "Amplival" (Германия) с фазово-контрастным устройством.

Биохимические и физико-химические методы анализа. В качестве химических аналогов факторов d, использовали С12-АОБ и С7-АОБ - амфифильные соединения (со степенью очистки 99,9%). Выделение ауторегуляторных факторов di из Pseudomonas aeruginosa проводили, как описано ранее [Светличный с соавт., 1986]. Активность

внеклеточных протеаз определяли модифицированным методом Ансона [Грачева, 2003]. Эндогенное дыхание клеток определяли по методу Шольца - Островского на полярографе LP7E в кислородной ячейке объемом 1 мл [Шольц, Островский, 1975].

Генетические методы. Ростингибирующую активность (токсичность) алкилоксибензолов (С7-, С12-АОБ) оценивали по их влиянию на развитие тестерного штамма В1733 Bacillus subtilis trpA5 в жидкой среде с АОБ в сравнении с ростом на контрольной среде без добавления АОБ. Генотоксическое действие алкилоксибензолов выявляли в стандартном тесте без метаболической активации [Marón & Ames, 1983] у ауксотрофного по триптофану штамма В1733 Bacillus subtilis trpA5. Тестирование проводили методом высева на МПА культуры, выросшей в жидкой среде, при внесении соответствующих количеств алкилоксибензолов. Выделение ДНК. Препараты ДНК из клеток B.cereus и В.subtilis выделяли, как описано ранее [Булыгина с соавт., 2002]. ПЦР-фингерпринтинг. Амплификацию геномной ДНК проводили на приборе Cetus 480 (Perkin Elmers, Швеция) с использованием подобранных праймеров, в том числе к элементам IS50 [Sasakawa, 1982]. Выбор праймеров и оптимизация проведения DIR-ПЦР. С помощью ранее разработанного алгоритма [Chaley et al., 1999] был проведен анализ 87 полных геномов микроорганизмов, представленных на тот момент в базе данных Genebank. Это позволило создать набор универсальных олигонуклеотидных праймеров, способных выявлять незначительные изменения в геномах близкородственных бактерий. Для работы были отобраны 24 праймера. Проверку этих праймеров, а также подбор оптимальных условий для DIR-ПЦР проводили на диссоциантах В. cereus и В. subtilis. Амплификацию, выделение и секвенирование 5-концевой области гена 16S рРНК проводили с использованием универсальных праймеров на приборе Cetus 480 (Perkin Elmers, Швеция) с применением термостабильной полимеразы BioTaq ("Диалат ЛТД", Москва) согласно рекомендациям фирмы-производителя и электрофоретическим разделением продуктов ПЦР в 1% агарозном геле. Секвенирование очищенных фрагментов генов 16S рРНК с помощью набора "Silver Sequencing" (производство Promega, США) проводили согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями.

Статистический анализ проводили с использованием стандартных математических методов (t-теста Стьюдента) в программе Microsoft Excel-2000. Критерий вероятности Р<0,05 принимали достаточным для достоверной разницы опытной и контрольной групп данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Внутрипопуляционная вариабельность фенотипов у бактерий Bacillus licheniformis шт.103

1.1 Взаимосвязь фенотипической изменчивости Bacillus licheniformis с типом покоящихся форм

Известно, что в стационарной фазе роста, в стареющих и длительно хранящихся культурах, представленных, в основном, покоящимися клетками, существенно увеличивается фенотипическая гетерогенность популяции, выщепляются минорные варианты. Для микроорганизмов свойственен полиморфизм покоящихся форм (ПФ), образующихся адаптивно к условиям роста культур. В наших исследованиях были проанализированы популяционные спектры суспензий вегетативных клеток В.licheniformis различного физиологического состояния и ПФ разных морфотипов - эндоспор и ЦПК.

Таблица 1. Соотношение вариантов в первом пассаже рассева (БСА) вегетативных

формы клеток индекс диссоциации,%

Rm Rs М S

клетки экспоненциальной фазы 96,3 0,3 0,5 2,9

клетки стационарной фазы 95,8 1,9 0 2,3

ЦПК при действии С]2-АОБ (2,5мМ) 69,2 12,8 1,4 16,6

эндоспоры 91,8 0 6,1 2,1

ЦПК получали в естественном цикле развития бактерий в средах, репрессирующих спорообразование и лимитированных по источнику Ы, что направлено на усиливание биосинтеза факторов (1,, индуцирующих образование ЦПК [Мулюкин с соавт., 1996]. Другим способом получения ЦПК было искусственное повышение уровня факторов с!) внесением химического аналога этих ауторегуляторов - С12-АОБ, в концентрациях 1 -2,5мМ. Анализ популяционных спектров вегетативных культур и суспензий ПФ показал, что доля минорных вариантов при рассеве покоящихся форм разных морфотипов была всегда выше, чем при рассеве вегетативных клеток. При этом среди покоящихся форм наибольшей нестабильностью генома обладали цистоподобные покоящиеся клетки, при высеве которых на плотные питательные среды уже в первом пассаже наблюдалось резкое увеличение индекса диссоциации (до 30% минорных вариантов) (табл. 1).

Клетки клонов, полученных из однотипных колоний пересевали на плотную среду. Вариантом (диссоциантом) считали клон, сохраняющий колониально-морфологические признаки в течение 3-5 пассажей.

Таким образом, на стабильность фенотипа или смену диссоцианта бактерий существенно влияет морфотип покоящихся форм, из которых развивается культура.

1.2 Колониально-морфологические и физиолого-Гшохимические характеристики диссоциантов ВЛскет/омих

Выделенные после рассева на плотной питательной с реле ЦИК, полученных под действием С]г -АОБ или в цикле развития (лимит по Ы). ¡1м-. М-, и З-диссоцианты были тождественны вариантам, которые получали традиционным методом многократных пассажей: и те, и другие обладали сходными колониально-морфологическими признаками. Следует отметить, что для В.ИсИет/огпт характерна высокая стабильность доминантного диссоцианта что обусловливало постоянную рсвсрсию минорных вариантов к доминантному П-м -типу.

8 10 12 14 16 18 20

время, ч

Рис. 1 Кривые роста вариантов В.Ис1гет[огт<5 шт. 103

3 2,5 2 1.5 1

0,5 0

123456709 1011 121314 1516 время, ч

Рис.2 Удельная скорость роста вариантов В. ИсЬ&гй(огУпЫ 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1

0,8 0,6 0,4

0,2 0

□

Ит Э М

Рис.3 Накопление биомассы вариантами В. ИсИеШ/огтк

Рэ М Э Рис.4 Протеолитическая способность вариантов В. ИсИет/огт1$

Выделенные варианты различались длительностью лаг-фазы, удельной скоростью роста и уровнем накопления биомассы при культивировании в стандартных условиях (рис. 1-3).

Помимо показателей роста, варианты существенно различались характеристиками развития культур: спорообразование у диссоциантов при погруженном культивировании имело количественные различия и наблюдалось в разное время. Через 24 часа ^-вариант содержал 100% спорулирующих клеток, доминантный 63%, Б — 50%; выход зрелых спор наблюдался у К5- и 11м-вариантов на 2-е сутки, у Б - на 3-е сутки. Варианты различались физиолого-биохимическими характеристиками: устойчивостью к антибиотикам (8>К>М) и активностью внеклеточных гидролаз (рис. 4). Самый медленно растущий вариант (Б) обладал максимальной протеолитической способностью, что представляет интерес для биотехнологических целей (табл. 2).

Таблица 2. Основные физиолого-биохимические характеристики диссоциантов B.licheniformis шт. 103

~~——Диссоцианты Параметры Rm Rs S М

Продолжительность лаг-фазы ,ч 2 1 4 3

max, Ч 0,45 0,35 0,3 0,35

Урожай (OD) 2,6 1,6 1,5 1,9

Время выхода на стационар, ч 14 10 13 13

Протеолитическая способность (ПС) удельная 0,42 0,37 1,2 0,1

Таким образом, свойство ЦПК бактерий прорастать на плотных средах гетерогенной по диссоциативному спектру популяцией колоний может быть использовано для быстрого скрининга диссоциантов, представляющих биотехнологический интерес. Частые замещения продуктивных промышленных штаммов непродуктивными требуют постоянной селекции. Предлагаемые приемы получения и рассева ЦПК обеспечивают как селекцию, так и хранение штамма; они надежны, быстры и экономичны, что определяет их преимущества перед традиционными.

1.3 Регуляция популяционной вариабельности В. Искет/огпйя Изучение возможности направленного контроля развития необходимого варианта является актуальным для биотехнологических производств. Так как промышленные бациллярные культуры хранят в виде эндоспор, следующей задачей было исследование возможности сужения диссоциативного спектра культур промышленного штамма

В.Нс1гет/огт1з 103 при использовании в качестве инокулята эндоспор доминантного Инварианта. Так как стадийность развития бактериальных культур (переход в стационарную фазу и образование ПФ) связана с накоплением в культурах ауторегуляторных фс1ь ф<12, и изменением их баланса [Эль-Регистан, 1988; 2006], было исследовано влияние химического аналога (С12-АОБ) на диссоциативную активность культур, засеваемых эндоспорами В.НсИет/огт1з. Задачей исследований было изменение диссоциативного спектра и его регуляция, направленная на развитие продуктивного (по протеазам) 8-варианта.

Таблица 3. Основные направления диссоциации доминантного 11-варианта В.Ис1гет/огт1$ шт. 103 при действии на эндоспоры С12-АОБ._

Концентрации С12-АОБ, индуцирующие диссоциацию, % Основные направления диссоциации

1-суточные споры

0 R -> М (1,6%)

0,005 R -> S (1,75%)

0,05 R->R(100%)

0,1 R -> R (100%)

0,2 R -> R (100%)

3-суточные споры

0 R -> S (6.8%)

0,005 R -> S+M (8.76%)

0,05 R -> S+M (4,11%)

0,1 R -> S (1.98%)

0,2 R -> S (8.3%)

7-суточные споры

0 R -> R (100%)

0,005 R -> S (36.6%)

0,05 R -> S (31.18%)

0,1 R -> S (43.2%)

0,2 R -> S (30.43%)

Прединкубация эндоспор различной степени зрелости (1-7 сут) с С12-АОБ в разных концентрациях в течение разного времени (1-3 час) влияла на процент прорастания спор и индекс диссоциации. Был подобран режим с использованием суспензии 7-ми суточных спор и их прединкубацией с С^-АОБ в концентрациях 0,005 - 0,1% в течение 1 часа, обеспечивающий развитие популяции, в которой до 43% клеток было представлено S-типом (табл. 3). Выявленный эффект относится к феномену индукции диссоциативных переходов. В других вариантах опытов при рассеве суспензии эндоспор на агаризованной среде с внесенным в нее С12-АОБ также было обнаружено изменение индекса диссоциации

развивающейся популяции (табл.4). В этом случае индуцируется диссоциативный переход Им—»Б, а также происходит селекция развития Б-варианта условиями культивирования, так как среды различаются концентрацией С1ГАОБ. Третий способ состоял в том, что С]2-АОБ в подобранных концентрациях вносили в среду роста, в которой выращивали культуры до стадии созревания спор. Полученные таким образом споры использовали в качестве инокулята для опытных культур. В этом варианте в развивающейся популяции было до 53% клеток, дающих колонии Б-типа (табл. 5). В этом случае условия прорастания эндоспор и роста клеток были стандартные, но посевной материал различался диссоциативной способностью. Выявленное изменение диссоциативного спектра популяций, вырастающих при рассеве эндоспор, которые были получены в культурах с дополнительно внесенным С12-АОБ, представляет как практический, так и теоретический интерес, так как в этом случае выщепление и развитие альтернативных вариантов (Б-тип 53%) демонстрирует адаптивный потенциал культуры (табл. 5).

Таблица 4. Диссоциация доминантного варианта (Ят) В.Искет/огт1з шт.103 под действием С^-АРБ (внесение в твердую питательную среду), посев 7-суточными спорами

Концентрация С1ГАОБ, % КОЕхЮ7, клеток/мл Индекс диссоциации на различные колониально-морфологические варианты, %

Ят 115 М Б

контроль 8,4±1.59 81.2 2.4 2.3 4.1

0.0005 5,8±1.08 59 1.3 0 39.7

0.001 3,4±0.61 72.6 5.1 1.3 21

Таблица 5. Диссоциация доминантного варианта В.Искет/огт15 шт.103 при прорастании

эндоспор, полученных при развитии культур с дополнительно внесенным Сп-АОБ

В культурах инокулята Индекс диссоциации на различные колониально-морфологические варианты, %

Концентрация С12-АОБ, % КОЕхЮ7, клеток/мл Кт М Б

0(контроль) 60±10.9 81.5 2.1 13.1 3.3

0.00002 40±8.1 67.7 0 11,8 20.5

0.0001 43±8.3 40.5 6.3 0 53.2

0.002 5±0.88 72.2 3.2 0 24.5

Таким образом, показана возможность регуляции популяционной изменчивости бациллярных культур воздействием химического аналога (С^-АОБ) фс^ на эндоспоровый инокулят. Направленным изменением концентрации фс1[ можно индуцировать выщепление вариантов с желаемыми свойствами, или стабилизировать развитие определенных вариантов с необходимыми признаками, что может быть использовано в

биотехнологических целях или для хранения коллекционных штаммов этих микроорганизмов.

1.4 Применение метода DIR-ПЦР для идентификации внутрипопуляционных диссоциантов Bacillus cereus и B.subtilis

Следующая часть работы была посвящена выяснению возможности генотипирования внутрипопуляционных вариантов бацилл, различающихся устойчивыми фенотипическими признаками, в данном случае, колониально-морфологическими свойствами." Для этого были получены ПЦР-фингерпринты ДНК B.cereus и B.subtilis с использованием как одиночных, так и пар праймеров. Практически все фингерпринты отличались между собой по числу, размерам и интенсивности полос. Причем если у диссоциантов B.subtilis происходило исчезновение одного-двух фрагментов при сохранении общей картины фингерпринта, то для диссоциантов B.cereus выявились отличия, наиболее значительные у белого варианта. Чтобы убедиться, что такие различия не являются результатом гетерогенности культур диссоциантов B.cereus, для них были определены нуклеотидные последовательности 5'-вариабельной области гена 16S рРНК. Процентный анализ не выявил по этой характеристике отличий у изучаемых диссоциантов, что подтверждает их культуральную чистоту. Кроме того, стабильность получаемых фингерпринтов проверялась постановкой ПЦР на препаратах ДНК, выделенных из разных пассажей всех типов диссоциантов. Характер полученных паттернов был стабилен, что исключает фактор случайности. Таким образом, эксперименты показали, что проявление и развитие различных типов диссоциантов обусловлено устойчивыми внутригеномными перестройками. В целом, продемонстрированная стабильность получаемых фингерпринтов позволяет использовать метод DIR-ПЦР для идентификации отдельных штаммов бактерий, принадлежащих к вышеуказанным группам, что может быть применено при создании молекулярного паспорта конкретного штамма.

Глава 2. Популяционная вариабельность P.aurantiaca и P.aeruginosa

Зависимость популяционной вариабельности от морфотипа клеток, из которых развиваются микробные популяции, была подтверждена при работе с неспорообразующими бактериями P.aurantiaca шт.В1558 и P.aeruginosa шт.К2. Исследовалась диссоциация культур, развивающихся из вегетативных клеток, а также из

Работа проводилась совместно с сотрудниками центра «Биоинженерия» РАН Б.Б.Кузнецовым, к.б.н. Е.С.Булыгиной и к.б.н. С.И.Цыганковой, за что автор выражает им большую благодарность

цистоподобных покоящихся форм псевдомонад, которые образовывались в естественном цикле развития бактерий или при искусственном внесении химического аналога фактора d[ - С12-АОБ.

2.1 Образование покоящихся клеток P.aurantiaca и P.aeruginosa

Покоящиеся формы P.aurantiaca и P.aeruginosa были получены в цикле развития культур при модификации условий культивирования - создании дисбаланса по источнику азота (лимит N в 5 раз), что было направлено на усиление биосинтеза фактора d,.

В других экспериментах ПФ псевдомонад получали внесением С12-АОБ в культуры начала стационарной фазы роста до конечных концентраций 1х10~4М-5х10'4М. Образующиеся в цикле развития и полученные искусственно ПФ обладали всеми характеристиками цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) бактерий: отсутствием эндогенного дыхания клеток; длительным (1,5 года) сохранением жизнеспособности (КОЕ= 10-45%), особенностями их ультраструктурной организации.

2.2 Колониально-морфологические и физиолого-биохимические свойства фенотипических диссоциантов P.aurantiaca шт. В1558

При рассеве ЦПК P.aurantiaca, полученных в цикле развития бактерий или при воздействии С12-АОБ, наблюдалась диссоциация с выщеплением: более пигментированного Р-варианта и варианта R-типа, отличавшихся по колониально-морфологическим признакам от доминантного S-варианта. Частота появления диссоциантов Р- и R-типа зависела от концентрации С12-АОБ, используемого для образования ЦПК, и возраста (времени хранения) цистоподобных клеток (табл.6). В частности, переход S—>R с частотой 45-67% обеспечивался воздействием С12-АОБ в концентрации 1х10"4М на 3- и 20-суточные ЦПК. Вариант R-типа был менее стабилен, судя по уменьшению частоты его встречаемости по мере хранения ЦПК. Р-вариант выщеплялся со стабильной частотой при рассеве ЦПК, полученных при воздействии С12-АОБ в концентрации 1х10'4М, а при воздействии 2,5х10"4М частота появления Р-варианта возрастала с увеличением возраста ЦПК и он замещал доминантный S-вариант.

Следует отметить, что при высеве контрольных клеточных суспензий без внесения С12-АОБ диссоцианты R- и Р-типа не выявлялись.

Диссоцианты S-, Р- и R-типа различались скоростью роста, устойчивостью к антибиотикам, активностью внеклеточных протеаз (табл. 7).

Таблица 6. Зависимость частоты появления вариантов Р.аигапНаса Я- и Р-типа от концентрации вносимого С|2-АОБ и времени инкубации ЦПК (в контрольных культурах популяция была представлена клетками в-диссоцианта)

Концентрация, С,2-АОБ, М Доля диссоциантов, % от общего числа колоний

3 суток 20 суток 40 суток

1х10"4 Б 8 36 57

Р 25 19 28

Я 67 45 15

2,5х10"4 Б 75 57 20

Р 10 38 80

И. 15 5 0

Таблица 7. Колониально - морфологические и физиолога - биохимические признаки вариантов Р.аигапНаса_

Вар Ростовые характеристики * Устойчивость к антибиотику, мкг/мл Активность внеклеточных протеаз, Ед/л

У Мтах Ч стрептомицин тетрациклин

Я 0,7г/МСК 0,035 1С50Л70 1С7О=310 1С5о=40 1С7о=100 5,3

Б 0,65г/МСК 0,024 1С50Л90 1С70=375 1С50.25 1С7о=75 14,8

Р 1 г/МСК 0,046 1С50=23 5 1С70=405 1С50=65 1С70Л75 13

*Среда с лимитом по азоту

2.3 Колониально-морфологические и физиолого-биохимические свойства фенотипических диссоциантов Р.аегщ1по$а шт. К2

Следующим объектом исследования был другой вид псевдомонад Р.аег^шо^а, включающий биотехнологически важные, а также патогенные штаммы. При рассеве ЦПК, полученных под воздействием Си-АОБ, были селекционированы Б-, Я-, М-варианты. Выделенные варианты были идентичны по своим свойствам вариантам, которые получали традиционным методом многократных пассажей. Варианты различались колониально-морфологическими признаками, скоростью роста, устойчивостью к антибиотикам, активностью внеклеточных протеаз. Наиболее интересно, что диссоцианты различались также продуктивностью синтезируемых АОБ (табл.8).

Полученные данные о различии синтеза АОБ отдельными диссоциантами адекватно объясняли динамику популяционного состава поликультуры (11+М) при засеве клетками II- и М-типов (%, 40:60) (рис.5).

Таблица 8. Колониально-морфологические и физиолого-биохимические признаки

вариантов P. aeruginosa

Вар Описание колоний Устойчивость к тетрациклину, 1С,мкг/мл Активность внеклеточных протеаз, мЕ/мл АОБ, мкг/мл

КЖ клет.

S Гладкие, выпуклые, блестящие, с резко очерченными краями. 1С70=90 98,6 253.7 41.2

R Шероховатые, со складчатой матовой поверхностью, с неровными краями. 1С?о=75 85,3 303 87.8

M Крупные, слизистые, растекающиеся, блестящие, более светлые, чем Б 1С70=60 104 319.1 58.5

зоо

0 250

с 200 -О

150 -

.ж-—*"/

/ .-ж-

„'Ж ' "

л--,

ж4"

.-•Ж----ж-"*

О 50

ч É

-100 а"

50 -

,-д"

..а

л.....а'

•а...

"А

L- О

..д

А -Д----д..

..А"

10 9 8 г 7 6 5 4 3 2 - 1 '■.- 0 -А

0 5 10 24 30 50 70 76 93 126 140 155 163 190 210 234 254

время, час

Рис. 5. Динамика роста и состав популяции бинарной культуры R- и М-диссоциантов P.aeruginosa. 1 - оптическая плотность культуры (ОПхЮО); 2 - рН среды; 3 - удельная доля М-диссоцианта, % КОЕ.

В цикле развития Я+М культуры доля М-клеток в популяции увеличивалась дважды -в лаг-фазе и фазе отмирания культуры. Эти изменения вряд ли были связаны с трофическими факторами, так как в первом случае среда была полноценной, а во втором -истощённой. Возможное объяснение - это селекция М-диссоцианта более стрессоустойчивого и имеющего низкую скорость роста. Повышение уровня АОБ в условиях стресса в лаг-фазе роста (стресс новой среды) и в стареющей культуре (стресс голодания), типичное для динамики развития микробных культур [Светличный с соавт.,

1986; Эль-Регистан с соавт., 2006], может быть причиной индукции диссоциативного перехода и повышения доли (%) М-варианта. Этому объяснению не противоречат данные по устойчивости диссоциантов P. aeruginosa к иммобилизации в полиакриламидный гель. 2.4 Устойчивость диссоциантов P.aeruginosa шт.К2, иммобилизованных в ПААГ Целью экспериментов было определение влияния условий выращивания культур диссоциантов псевдомонад и уровня экзогенного С12-АОБ на жизнеспособность клеток при их иммобилизации в микрообъемах ПААГ (на клеточном микрочипе). *

Варианты P.aeruginosa шт.К2 выращивали на средах, предусматривающих образование ЦПК (при дисбалансе источников питания и lim N и Р). Аликвоты культур, содержащих полученные таким образом клетки, были иммобилизованы в ПААГ и применены при конструировании биочипов. После хранения полученных чипов (20 сут) определяли способность иммобилизованных клеток возобновлять рост и делиться. Маркером был витальный краситель SYTO 9. Флюоресценцию микрочипа регистрировали при 1 возбуждения/регистрации 485/530 нм. Наибольшей устойчивостью обладали клетки М-варианта, выращенные в условиях lim N (рис. 6), что коррелирует с высоким уровнем внеклеточных АОБ, синтезируемых этим диссоциантом (табл.8).

Время, ч

Рис. 6. Сравнительный анализ сохранения жизнеспособности покоящихся клеток разных вариантов P.aeruginosa шт.К2 при иммобилизации в микрообъемах ПААГ (на клеточном микрочипе).

Таким образом, разработаны приемы расширения диссоциативного спектра грамотрицательных бактерий для отбора биотехнологически перспективных вариантов.

Работа проводилась совместно с сотрудниками Института молекулярной биологии РАН Д.О.Фесенко и Т.В.Наседкиной, за что автор выражает им большую благодарность

Приемы включают образование ЦПК, имеющих нестабильный генотип, их рассев на плотные среды и выделение выросших диссоциантов в отдельные клоны, различающиеся свойствами, в том числе стрессоусойчивостью. На примере конкретного исследования показано, что отдельные диссоцианты псевдомонад могут быть использованы в биотехнологических целях, в частности при конструировании биосенсоров.

Глава 3. Участие ауторегуляторных факторов (АОБ) в регуляции популяционной вариабельности бактерий

Последняя часть работы посвящена анализу возможных механизмов участия АОБ в процессах вариабельности бактериальных культур. Ранее, при изучении механизмов действия фс!| бактерий - алкилоксибензолов, был сделан вывод об их полимодальности. АОБ способны непосредственно взаимодействовать с биополимерами (белками и НК). При комплексообразовании с ферментными белками АОБ вызывали изменение их конформации, следствием чего является стабилизация и модуляция функциональной активности [Беспалов с соавт., 1998; Колпаков с соавт., 2000; Мартиросова с соавт., 2004]. Можно предположить аналогичное действие на белковые макромолекулы, вовлеченные в регуляцию диссоциативных переходов на уровне образования транскриптов. Другой вариант участия АОБ в индукции фенотипической диссоциации может быть обусловлен их непосредственным взаимодействием с ДНК [КогиЬек е1.а1., 1999; Давыдова с соавт., 2005; 2006] и, таким образом, влиянием на модификацию генетического материала клетки. Изменения структурной организации ДНК обуславливают возможность индукции обратимых мутаций, понимая под мутациями направленные внутригеномные перестройки [Прозоров, 2001]. Гипотезу, согласно которой контролирующим механизмом диссоциации бактерий на популяционном уровне являются взаимодействия АОБ с ДНК, проверили в тесте реверсии к прототрофности клеток штамма В. БиЬНШ 1грА5 В1733, ауксотрофного по триптофану.

3.1 Влияние (токсичность) факторов с1[ на рост бактерий

Для корректной оценки возможного влияния химических аналогов фс!, (С7-, С12-АОБ) на геном клетки, необходимо было определить интервал концентраций исследуемых веществ, в которых их ростингибирующая активность не перекрывала бы прогнозируемый мутагенный эффект.

Влияние АОБ на рост В. ¡иЫШз 1грА5, культивируемого в жидкой среде, зависело от гидрофобности АОБ и имело дозозависимый характер. С7-АОБ в исследуемом диапазоне (0,005-0,5мМ) концентраций не вызывал ингибирования роста (хотя в высоких

концентрациях обуславливал увеличение времени лаг-фазы) и использовался в указанных концентрациях.

Более гидрофобный С12-АОБ, напротив, оказывал ростингибирующее действие, что коррелирует с данными о возрастании влияния на функциональную активность мембран АОБ с более гидрофобными свойствами [Эль-Регистан с соавт., 2006]. Ростингибирующее действие С12-АОБ выражалось в увеличении времени лаг-фазы (0,05 - 0,005мМ), снижении удельной скорости роста (0,05 и 0,005мМ), снижении выхода биомассы (0,05 - 0,25мМ) и полном отсутствии роста (при концентрации 0,5мМ).

На основании этих результатов в дальнейших исследованиях использовали С]2-АОБ в концентрациях ниже 0,5 мМ.

3.2 Мутагенный эффект АОБ

В опытах был использован штамм В. 5иЫШз 1грА5 В1733. О наличии мутагенного действия АОБ судили по их влиянию на возврат ауксотрофных клеток к прототрофности. Значимым считали двукратное превышение числа ревертантов над спонтанным уровнем реверсий в контроле (без внесения АОБ). Были использованы два гомолога АОБ, различающиеся гидрофобностью.

Суспензии делящихся и стационарных (пролиферативно покоящихся) клеток обрабатывали растворами С7-, С|2-АОБ в концентрациях, не вызывающих ингибирования роста культуры. В вариантах с использованием С12-АОБ частота реверсий в суспензиях активно растущих клеток увеличивалась на порядок в области концентраций свыше 0,025мМ (табл.9). В этих же условиях С7-АОБ проявлял слабый мутагенный эффект, частота реверсий не превышала спонтанный фон более чем в 2-5 раз (табл.10).

В суспензии стационарных клеток С12-АОБ в концентрациях 0,25 - 0,5мМ вызывал повышение частоты возникновения ревертантов в 4 и 125 раз. Отметим, что при концентрации 0,25мМ ростингибирующего эффекта АОБ не было, в отличие от обработки пролиферирующих клеток. В то же время, при обработке суспензий стационарных клеток С7-АОБ не только не проявил мутагенной активности, но, напротив, продемонстрировал антимутагенный эффект (частота реверсий снизилась в 2 раза). Особого внимания заслуживает тот факт, что при внесении как С12-АОБ, так и С7-АОБ в суспензии делящихся или стационарных клеток параллельно с повышением частоты возникновения ревертантов над спонтанным фоном наблюдали и увеличение индекса диссоциации популяций. В варианте добавления в суспензию пролиферирующих клеток Си-АО Б (0,025мМ) частота реверсий возросла в 43 раза при одновременном увеличении доли минорного Б-варианта

до 87,5%. При обработке клеток стационарной фазы С12-АОБ в концентрациях 0,05 и 0,25мМ индекс диссоциации (доля Б варианта) 50 и 84% соответствовал частоте реверсий, превышающей спонтанный фон в 4 и 125 раз соответственно.

Таблица 9. Частота реверсий к прототрофности и диссоциация доминантного варианта (Я) В. яиЬИШ 1грА5 шт.В1733 под действием С12- АО Б

С,2-АОБ, мМ КОЕ/мл, хЮ1 Индекс диссоциации, % Частота реверсий, хЮ'7

Я | Б

Экспоненциальная фаза роста

0 6,6 100 0 2

0,025 113 12,5 87,5 85,6 (43)

0,05 13 100 0 18,7 (9,5)

0,25* 33 31,25 68,8 3300(1650)

Стационарная фаза роста

0 20 100 0 10

0,025 10 100 0 12,5

0,05 20 50 50 40 (4)

0,25 125 16 84 1250 (125)

* не корректно, приведено для сравнения

Таблица 10. Частота реверсий к прототрофности и диссоциация доминантного варианта (Я) В. хиЫШз 1грА5 шт.В1733 под действием С7-АОБ _

С7-АОБ, мМ КОЕ/мл хЮ1 Индекс диссоциации, % Частота реверсий, хЮ"7

Я | Б

Экспоненциальная фаза роста

0 2 75 25 2,1

0,025 2,5 100 0 2

0,05 3,5 71,4 28,6 3,9 (2)

0,25 2 60 40 5 (2,5)

0,5 2,5 20 80 9 (4,5)

Стационарная фаза роста

0 10,5 85,7 14,3 5

0,025 9,5 100 0 3,7

0,05 6 83,4 16,6 1,7

0,25 10 95 5 3,1

0,5 5 100 0 1,5

Полученные результаты подтверждают показанное ранее действие АОБ как мутагенов в тесте Эймса [Маргулис с соавт., 2003]. Важно подчеркнуть, что выявленные эффекты АОБ, обуславливающие внутригеномные перестройки, которые являются причиной диссоциативных переходов в бактериальных популяциях, невидоспецифично. Это открывает практические возможности использования фф (алкилоксибензолов) для направленной регуляции популяционной вариабельности и стабилизации диссоциантов бактерий различных таксонов.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучена фенотипическая диссоциация грамположительных спорообразующих бактерий B.licheniformis шт.ЮЗ, B.subtilis шт.В1733 и грамотрицательных неспорообразующих бактерий P.aeruginosa шт.К2, P.aurantiaca шт.В1558, выделены колониально-морфологические варианты этих бактерий и охарактеризованы по их физиолого-биохимическим свойствам: ростовым характеристикам, стрессоустойчивости, продуктивности внеклеточных гидролаз.

2. Установлена зависимость между типом покоящихся форм и степенью диссоциации бактериальных популяций при их прорастании. Показано, что наибольшей нестабильностью генотипа обладают цистоподобные покоящиеся клетки (ЦПК) спорообразующих и неспорообразующих бактерий. Метод получения ЦПК с их последующим рассевом на плотные среды может быть использован для быстрого скрининга вариантов с необходимыми признаками.

3. На примере B.cereus и B.subtilis продемонстрирована возможность генотипирования популяционных диссоциантов методами DIR-ПЦР с использованием случайных праймеров.

4. Установлено, что изменение уровня АОБ в инокулируемом материале изменяет диссоциативный спектр развивающейся из него популяции. Для спорообразующих бактерий B.licheniformis выявлены концентрации, способствующие расширению диссоциативного спектра, или, напротив, стабилизирующие развитие определенных вариантов.

5. Возможным механизмом действия АОБ в процессах популяционной вариабельности бактерий, по-видимому, является их функционирование как эндогенных мутагенов. В тесте с ауксотрофным штаммом B.subtilis trpA5 В1733 обнаружена корреляция между частотой реверсий и интенсивностью диссоциативных переходов, которые индуцируются определенными концентрациями С12-АОБ.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации 1. Цыганкова С.В., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Хабибуллин С.С., Дорошенко Е.В., Короткое Е.В., Эль-Регистан Г.И. Получение внутрипопуляционных диссоциантов некоторых бацилл и применение метода DIR-ПЦР для их идентификации // Микробиология. - 2004. - Т.73, №3. - С.398-405.

2. Милько Е.С., Хабибуллин С.С., Николаев Ю.А, Козлова А.Н., Эль-Регистан Г.И. Динамика роста и состава популяций смешанных культур R-, S- и М-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa // Микробиология. - 2005. - Т.74, №4. - С.475-482.

3. Хабибуллин С.С., Николаев Ю.А., Лойко Н.Г., Голод Н.А., Милько Е.С., Воейкова Т.А., Эль-Регистан Г.И. Ауторегуляция фенотипической диссоциации у Bacillus licheniformis // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммуннологии. - 2006. - Т.75, №6. - С.9-13.

4. Хабибуллин С.С., Фесенко Д.О., Наседкина Т.В., Голод Н.А., Зайцева А.А. Применение стабилизированных клеток бактерий для создания биочипов // Материалы 1Г0Г0 Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 10-14 ноября 2003. Москва. - Т.2. - С.223-224.

5. Цыганкова С.В., Хабибуллин С.С., Лойко Н.Г., Дорошенко Е.В., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Короткое Е.В., Воейкова Т.А., Эль-Регистан Г.И. Регуляция фенотипической диссоциации бактерий // Материалы 1Г°ГО Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 10-14 ноября 2003. Москва. - T.I. -

С.16-17.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хабибуллин, Самат Сиринович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Метастабильность фенотипа и основные механизмы ее реализации у микроорганизмов.

1.1.1 R-S-M диссоциация.

1.1.2 Влияние внешних факторов на изменчивость диссоциантов бактерий.

1.2 Молекулярные и генетические основы диссоциации бактерий.

1.2.1 Рекомбиногенные перестройки генома бактерий.

1.2.1.1 Конъюгация.

1.2.1.2 Трансдукция.

1.2.1.3 Трансформация, трансфекция.

1.2.2 Изменение свойств бактерий.

1.3 Влияние состояния клеточного покоя на популяционную вариабельность бактерий.

1.3.1 Типы покоящихся форм микроорганизмов.

1.3.2 Ауторегуляторные факторы di и с^ микроорганизмов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования.

2.2 Получение покоящихся форм бактерий.

2.3 Микробиологические методы.

2.4 Биохимические и физико-химические методы анализа.

2.5 Генетические методы.

2.6 Статистическая обработка.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Внутрипопуляционная вариабельность фенотипов у бактерий Bacillus licheniformis.

3.1.1 Взаимосвязь фенотипической изменчивости B.licheniformis с типом покоящихся форм.

3.1.2 Колониально-морфологические и физиолого-биохимические характеристики диссоциантов B.licheniformis шт. 103.

3.1.3 Применение метода DIR-ПЦР для идентификации внутрипопуляционных диссоциантов Bacillus cereus и Bacillus subtilis.

3.1.4 Регуляция популяционной вариабельности В. licheniformis.

3.2 Популяционная вариабельность грамотрицательных неспорообразующих бактерий Pseudomonas aurantiaca и P.aeruginosa.

3.2.1 Образование покоящихся клеток P.aurantiaca и P.aeruginosa при модификации условий культивирования и под воздействием экзогенно вносимого фактора ф.

3.2.2 Колониально-морфологические и физиолого-биохимические свойства фе-нотипических диссоциантов P.aurantiaca шт. В1558.

3.2.3 Колониально-морфологические и физиолого-биохимические свойства фе-нотипических диссоциантов P.aeruginosa шт.К2.

3.2.4 Устойчивость диссоциантов P.aeruginosa шт.К2 иммобилизованных в ПААГ.

3.3 Участие ауторегуляторных факторов di (АОБ) в регуляции популяционной вариабельности бактерий.

3.3.1 Влияние (токсичность) факторов d] на рост бактерий. Функции факторов di как ингибиторов спорового прорастания.

3.3.2 Мутагенный эффект АОБ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Популяционная вариабельность микроорганизмов"

Актуальность проблемы. Изучение фенотипической изменчивости как генетического феномена, лежащего в основе таких явлений и процессов как изменение скорости микробных синтезов и трансформаций, вирулентность и персистенция патогенных и условно-патогенных бактерий, результативность симбиозов и замещение продуктивных вариантов промышленных штаммов является одной из наиболее актуальных проблем современной микробиологии. Понимание механизмов внутрипопуляционной изменчивости микроорганизмов и возможность их контроля позволят значительно повысить эффективность существующих микробиологических производств. Известно, что популяция микроорганизмов гетерогенна и характеризуется наличием внутри популяции (одного штамма) клеток, различающихся по ряду колониально-морфологических и физиолого-биохимических свойств и способных к диссоциативным переходам с высокой частотой (10"2-10"4 на одно клеточное деление) [Милько, Егоров, 1991; Головлев, 1998]. Согласно современным представлениям популяционная вариабельность бактерий обусловлена процессами внутригеномной рекомбинации генетического материала клетки, которые можно отнести к специфическому типу мутаций [Прозоров, 2001]. В появившихся в последние десятилетия экспериментальных работах отмечается повышение фенотипической гетерогенности популяции в стационарной фазе роста, в стареющих и длительно хранящихся микробных культурах [Милько, Егоров, 1991, Kelly et.al., 2001]. Согласно ряду гипотез это связано с состоянием пролифера-тивного покоя клеток, с включением общего регулона стационарной фазы и действием сигнальных молекул, контролирующих переход клеток к состоянию покоя и экспрессию генов этой фазы [Yildiz&Schoolnik, 1998; Suh et.al., 1999; Andersson et.al., 1999]. Среди внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов такими функциями обладают видонеспецифичные ауторегуляторы: аутоиндук-торы анабиоза - факторы di (производные алкилоксибензолов - АОБ), выделенные и описанные для широкого круга микроорганизмов [Эль-Регистан, 1988; Батраков с соавт.,1993; Мулюкин с соавт.,1996; Бухарин с соавт., 2005].

Возможность использования этих ауторегуляторов для направленной регуляции популяционной вариабельности и стабилизации диссоциантов бактерий представляет интерес для микробиологии, медицины и биотехнологии.

Задачи исследования:

3. Разработать приемы регуляции популяционной вариабельности бактерий с помощью химических аналогов факторов di - алкилоксибензолов (С7-АОБ и С]2-АОБ).

Научная новизна.

1. Впервые изучена фенотипическая диссоциация В.licheniformis шт. 103, B.subtilis шт.В1733, P.aeruginosa шт.К2, P.aurantiaca шт.В1558, выделены и описаны колониально-морфологические варианты этих бактерий. 2. Показана зависимость между типом покоящихся форм (ПФ) бактерий и степенью вариабельности микробной популяции при их прорастании: у всех изученных бактерий наибольшей нестабильностью генотипа обладали цистоподобные покоящиеся клетки (ЦГЖ). 3. Впервые разработаны приемы регуляции популяционной изменчивости промышленного штамма В. licheniformis 103 при воздействии ауторегуляторных факторов на эндоспоры. Приемы предусматривают как индукцию выщепления минорных вариантов, так и селективное развитие определенного варианта при обработке эндоспор как инокулируемого материала определенными концентрациями АОБ. 4. Изучены возможные механизмы воздействия АОБ в процессах популяционной вариабельности бактерий. В тесте возврата к прототрофности клеток ауксотрофного штамма B.subtilis trpA5 В1733 показано, что С12-АОБ обладает слабой мутагенной активностью. Обнаружена корреляция между мутагенной активностью С12-АОБ и интенсивностью диссоциативных переходов, которые индуцируются определенными концентрациями АОБ.

Практическая ценность работы. Разработаны приемы расширения диссоциативного спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий для отбора биотехнологически перспективных вариантов. Приемы включают образование ЦПК, имеющих нестабильный генотип, их рассев на плотные среды и выделение выросших диссоциантов в отдельные клоны, различающиеся свойствами. На примере конкретного исследования показано, что отдельные диссо-цианты псевдомонад, отличающиеся стрессоустойчивостью, могут быть использованы в биотехнологических целях, в частности, при конструировании биосенсоров. Разработаны приемы направленной регуляции популяционной изменчивости спорообразующих бактерий путем воздействия на вегетативный или споровый инокулят алкилоксибензолами - химическими аналогами микробных ауторегуляторных факторов dj. Установлены концентрационные диапазоны АОБ, предусматривающие как расширение диссоциативного спектра и индукцию выщепления минорных вариантов, так и сужение спектра и селективное развитие определенных из них. Полученные в работе результаты могут быть использованы для: 1) быстрого получения широкого спектра внутрипопу-ляционных диссоциантов грамположительных и грамотрицательных бактерий; 2) направленного контроля развития необходимого варианта; 3) совершенствования методов хранения коллекционных культур и промышленных штаммов микроорганизмов.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 149 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 253 публикации отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 24 таблицами и 30 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Хабибуллин, Самат Сиринович

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучена фенотипическая диссоциация грамположительных спорообразующих бактерий В.licheniformis шт.103, B.subtilis шт.В1733 и грамотрицательных неспорообразующих бактерий P.aeruginosa шт.К2, P.aurantiaca шт.В1558, выделены колониально-морфологические варианты этих бактерий и охарактеризованы по их физиолого-биохимическим свойствам: ростовым характеристикам, стрессоустойчивости, продуктивности внеклеточных гидролаз.

3. На примере В.cereus и B.subtilis продемонстрирована возможность генотипирования популяционных диссоциантов методами DIR-ПЦР с использованием случайных праймеров.

4. Установлено, что изменение уровня АОБ в инокулируемом материале изменяет диссоциативный спектр развивающейся из него популяции. Для спорообразующих бактерий В.licheniformis выявлены концентрации, способствующие расширению диссоциативного спектра, или, напротив, стабилизирующие развитие определенных вариантов.

5. Возможным механизмом действия АОБ в процессах популяционной вариабельности бактерий, по-видимому, является их функционирование как эндогенных мутагенов. В тесте с ауксотрофным штаммом B.subtilis В1733 обнаружена корреляция между частотой реверсий и интенсивностью диссоциативных переходов, которые индуцируются определенными концентрациями С^-АОБ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Расщепление популяции бактерий на варианты приводит к расширению границ выживаемости вида, это адаптация на уровне популяции. Процесс направленный на самоперестройку популяции при неблагоприятных условиях для роста обеспечивает выживание вида в форме одного из вариантов.

Однако на производстве, гетерогенность микробной популяции при периодическом и непрерывном культивировании зачастую, а в некоторых промышленных процессах, как правило, приводит к тому, что высокопродуктивные штаммы замещаются малопродуктивными или непродуктивными штаммами, снижается эффективность микробного синтеза.

Представленный выше материал показывает, что выщепление определенных вариантов можно контролировать и индуцировать не только при рассеве покоящихся цистоподобных клеток [Дорошенко с соавт., 2001]. Нашими экспериментами показано, что диссоциативная способность культуры проявляется и в период вегетативного роста культуры при действии повышающихся концентраций ауторегуляторных факторов. В системах in vivo это повышение индуцируется действием стрессорных факторов [Эль-Регистан с соавт., 2001].

Подчеркнем, что обнаруженное в настоящей работе действие АОБ на диссоциацию псевдомонад и бацилл не является видоспецифичным, что имеет важное практическое значение.

В работе продемонстрировано, что существуют постоянные коррелятивные зависимости между генетическими, физиолого-биохимическими и морфологическими различиями диссоциантов и что изменения состава микробной популяции можно контролировать, в частности изменяя в популяции содержание факторов dj (аутоиндукторов анабиоза), которые являются видонеспецифичными ауторегуляторами микроорганизмов. На примере химических аналогов факторов di - производных АОБ показано, что они индуцируют генетические перестройки, являющиеся причиной изменения экспрессии генов и развития минорных субпопуляций. Возможность использования этих ауторегуляторов для направленной регуляции популяционной вариабельности и стабилизации диссоциантов бактерий представляет практический интерес для биотехнологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хабибуллин, Самат Сиринович, Москва

1. Азизбекян P.P. Энтомопатогенные бактерии Bacillus thuringiensis и их фаги: генетическая и физиологическая характеристики: Автореф. дис. д-ра биол.наук. М.: 1980

2. Азизбекян P.P., Белых Р.А., Нетыкса Е.М. и др. Сравнительная характеристика штаммов Bacillus thuringiensis, образующих R- и S-формы колоний // Генетический контроль мутационного процесса у микроорганизмов. Тез. Докл. Вильнюс. 1976. - С. 21.

3. Алиханян С.И. Селекция промышленных микроорганизмов. М: Наука. -1968.-С.14.

4. Андреева Е.А. Микрофлора внутренних поверхностей гипербарических комплексов и сравнительная оценка эффективности дезинфицирующих средств. Автореф. дис. канд. мед. наук. М. 2000. - С. 24.

5. Андреюк Е.И., Козырицкая В.Е., Вапагурова Е.В., Чугуй В.А., Карева М.А. Популяционная гетерогенность Streptomeces robeus S-606 продуцента глюкозоизомеразы // Микробиология. - 1991. - Т. 53, № 6. - С. 17-20.

6. Андрюшечкина А.В., Николаева Л.П. Особенности обмена фосфорсодержащих соединений у S- и R-форм некоторых видов микроорганизмов // Микробиология. 1962. - Т. 31, № 4. - С. 643-645.

7. Ануфриев Л.Ф. К вопросу о диссоциации в культуре В. thuringiensis var.dendrolimus в жидких и твердых среды среды. В кн. Биология микроорганизмов и их использование в народном хозяйстве. Иркутск. 1979. -С. 118-121.

8. Астаурова О.Б., Белых Р.А., Азизбекян P.P. Аминирование и биосинтез глутамата у R- и S-форм Bacillus thuringiensis II Микробиология. 1979. -Т. 48, №3.-С. 509-513.

9. Бабусенко Е.С., Эль-Регистан Г.И., Градова Н.Б., Козлова А.Н., Осипов Г.А. Исследование мембранотропных ауторегуляторных факторов метанокисляющих бактерий // Успехи химии. 1991. - Т.60, Вып.11. -С. 2362-2373.

10. Батраков С.Г., Эль-Регистан Г.И., Придачина Н.Н., Ненашева В.А., Козлова А.Н., Грязнова М.Н., Золотарева И.Н. Тиразол ауторегуляторный фактор di дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Микробиология. - 1993. -Т. 62, Вып. 4.-С. 633-638.

11. П.Беккер М.Е., А.И. Раппопорт, Калакуцкий и др. Торможение жизнедеятельности клеток // Рига: 1987. С. 240.

12. Беляков В.Д., Голубев Д.Б., Каминский Т.Д., Тец В.В. Саморегуляция паразитарных систем // JI: 1987. С. 239.

13. Беляков В.Д., Ряпис JI.A., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы // М.: Медицина, 1990. С. 224.

14. Бухарин О.В., Гриценко В.А. Экологическая детерминированность внутривидового разнообразия патогенных бактерий // Журн. микробиол., эпдемиол. и иммунобиол. 2000. № 1. - С. 103-106.

15. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий // М.: Медицина, 2005. С. 96-97.

16. Вельков В.В. Интродукция генетически модифицированных микроорганизмов в окружающую среду: перспективы и риск // Генетика. -1994.-Т. 30(5).-С. 581-592.

17. Волова Т.Г., Терешкова Т.М., Калачева Г.С. и др. Влияние рН среды на рост и физиологию водородокисляющих бактерий // Микробиология. 1986. -Т. 55,№5. -С. 745-749.

18. Воробьева А.А. Микробиология и иммунология. М. - 1999.

19. Воскун С.Е., Новикова А.Ф., Голубев О.А. Адгезивные свойства R- и S-мутантов Salmonella minnesota в процессе периодического культивирования // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиолог. 1992. № 1. - С. 5-7.

20. Высоцкий В.В., Заславская П.Л., Машковцев А.В., Баулина О.И. Полиморфизм как закономерность развития популяций прокариотных организмов // Биол. науки. 1991. № 12. - С. 5-18.

21. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии. М.: ГЕОС. - 2001. - С.56.

22. Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы. М.: Мир. - 1988. - С. 538.

23. Головлев Е.Л. Метастабильность фенотипа у бактерий // Микробиология. 1998. - Т. 67, № 2. - С. 149-155.

24. Горленко В.М., Кеппен О.И., Пучков А.Н. Морфологическая дифференциация несерных пурпурных бактерий // Микробиология. 1976. -Т. 47, Вып. 5.-С. 817-823.

25. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов М.: Элевар. - 2003. -С.111.

26. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Никиян А.Н., Эль-Регистан Г.И. Механизмы взаимодействия между ДНК и химическими аналогами микробных аутоиндукторов анабиоза // Микробиология. 2005. - Т. 74, № 5. -С.533-539.

27. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Эль-Регистан Г.И. Влияние химических аналогов микробных ауторегуляторов на чувствительность ДНК к УФ-облучению // Микробиология. 2006. - Т. 75, № 5. - С. 568-573.

28. Данилевич В.Н., Степаншин Ю.Г., Троицкий А.В. и др. Новый класс мутаций плазмиды RP4, индуцирующих мукоидный характер роста клеток Escherichia coli К-12 // Генетика. 1982. - Т. 18, №6. - С. 896-905.

29. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И., Звягинцев Д.Г. Репродуктивные покоящиеся формы Arthrobacter globiformis// Микробиология. 2000. - Т. 69, № 3. - С. 377-382.

30. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 3. - 383-388.

31. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Горнова И.Б., Климанова Е.В., Эль-Регистан Г.И. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus II Микробиология. 2001. - Т. 70, № 6. - С. 811-819.

32. Дорошенко Е.В. Биоразнообразие покоящихся форм микроорганизмов // Автореферат дисс. . канд. биол.наук., ИНМИ РАН. 2002.

33. Дуда В.И., Пронин С.В., Эль-Регистан Г.И., Капрельянц А.С., Митюшин JI.JI. Образование покоящихся рефрактерных клеток у Bacillus cereus под влиянием ауторегуляторного фактора // Микробиология. 1982. - Т. 51, № 1. -С. 77-81.

34. Егоров Н.С., Коронелли Т.В., Милько Е.С. и др. Сравнение липидного состава R-, S- и М-вариантов Rhodococcus rubropertinctus II Микробиология. 1986. - Т. 55, № 2. - С. 227-230.

35. Жарикова Г.Г. Биология Bacillus brevis var G.-B.M.: Изд-во МГУ. 1968. -С.32.

36. Жарикова Г.Г., Исаева B.C. Биосинтез грамицидина и диссоциация при развитии на синтетических средах с различными источниками углерода // Вестн. Моск.ун-та Сер.биол.почвовед. 1969. - №2. - С.45-50.

37. Жарикова Г.Г., Маркелова С.И. Диссоциация S- и Р-вариантов Bacillus brevis var. G.-B. на синтетической среде с аминокислотами в качестве единственного источника азота // Антибиотики. 1971. - Т. 16, №4. -С.408-410.

38. Здоровенко Г.М., Варбанец Л.Д., Здоровенко Э.Л., Винарская Н.В., Яковлева Л.М. Химико-биологическая характеристика липополисахаридов изколлекционной культуры Pseudomonas syringae pv. maculicola ИМВ 381 // Микробиология. 2004. - T.73, № 6. - С. 790-801.

39. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Зеленихин П.В., Круглова З.Ф., Чойдаш Б., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Влияние аутоиндукторов анабиоза бактерий на геном микробной клетки // Микробиология. 2002. - Т.71, №2. - С. 194-199.

40. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Мулюкин А.Л., Дрейр Ф., Эль-Регистан Г.И. Влияние мембраноактивных микробных ауторегуляторов на рост культуры ras-трансформированных фибробластов // Прикл. биохимия и микробиология. 2000. - Т. 62, № 5. - С. 475-480.

41. Ильичев А.А., Щелкунов С.Н. Высокоэффективный метод трансфекции клеток E.coli ДНК лямбоидных фагов в системе СаСЬ-обработанных клеток // III рабочее совещание по программе "Плазмида". Пущино. 1978. -С. 32-33.

42. Каминский Г.Д. Изменчивость микроорганизмов в процессе фазового преобразования их популяции // Микробиология. 1985. - Т. 54, № 7. -С.111-122.

43. Капрельянц А.С., Антонюк Л.П. Микробная коммуникация // Микробиология. 2006. - Т. 75, № 4. - С. 371-374.

44. Кертис Р. Перенос генов / В кн.: Методы общей бактериологии. М.: Мир. - 1984. В 3-х томах. - Т. 2. - С. 65-127.

45. Козлова О.В., Куприянова-Ашина Ф.Г., Егоров С.Ю., Эль-Регистан Г.И. Влияние химического аналога микробного аутоиндуктора анабиоза на Са2+- ответ мицелиальных грибов // Микробиология. 2004. - Т. 73, № 6. -С. 741-750.

46. Комарова Т.И., Поршнева О.В., Коронелли Т.В. Образование трегалозы клетками R- и S- вариантов Rhodococcus erythropoolis в условиях стресса // Микробиология. 1998. - Т. 67, № 3. - С. 443-446.

47. Кондратьева Т.Ф., В.Н.Данилевич, С.Н.Агеева, Г.И.Каравайко. Взаимодействие хромосомной и плазмидной ДНК у штаммов Acidithiobacillus ferrooxidans, адаптированных к разным субстратам окисления // Микробиология. 2004. - Т. 73, № 3. - С. 368-376.

48. Коновалова Е.Ю., Эль-Регистан Г.И., Бабьева И.П. Динамика и накопление ауторегуляторных факторов di и d2 дрожжами Rhodosporidium toruloidesll Биотехнология. 1985. - № 3. - С. 71-74.

49. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В. Липиды R и S-вариантов Rhodococcus erythropolis II Микробиология. 1995. - Т. 64, № 6. - С. 769-777.

50. Котык А., Янычек К. Мембранный транспорт. М.: Мир. - 1980. -С.82-114.

51. Красильников Н.А. Микроорганизмы и плодородие почв // Изв. АН СССР. сер. биол. 1954. - № 2. - С. 14-39.

52. Кузнецов В.Д. Спонтанная изменчивость актиномицетов продуцентов антибиотиков и стабилизация их биосинтетической активности и таксономических свойств / Док. дис. ИНМИ РАН. - 1974.

53. Лихачева Н.А., Молчанова Е.С., Ким А.А., Ильяшенко Б.Н. Влияние изменений белкового состава клеточной оболочки E.coli К-12 наэффективность плазмидной трансформации и трансфекции // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. 1983. - Т. 1. - С. 15-18.

54. Лысенко С.В., Демина Н.С. Механизмы защиты микроорганизмов от действия ультрафиолетовых лучей // Изв. АН СССР. Сер. Биол. 1981. - №6. -С.845-853.

55. Максимов В.Н. Основные понятия общей экологии // Экология микроорганизмов. М.: Изд-во ACADEMA. 2004. - С. 12- 28.

56. Максимов В.Н., Милько Е.С., Ильиных И.А. Влияние углеродного, азотного и фосфорного питания на рост R-, S- и М-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa И Микробиология. 1999. - Т. 68, № .4. - С. 206-210.

57. Максимов В.Н., Милько Е.С., Ильиных И.А. Влияние углеродного, азотного и фосфорного питания на рост R-, S- и М-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa в смешанных культурах // Микробиология. 1999. -Т. 68, № 4. - С. 485-490.

58. Максимов В.Н., Милько Е.С., Ильиных И.А. Влияние углеродного, азотного и фосфорного питания на рост R-, S- и М-диссоциантов Pseudomonas aeuginosa II Микробиология. 1999 б. - Т.68, № 2. - С. 206-210.

59. Максимов В.Н., Федоров В.Д. Применение методов математического планирования эксперимента. М. 1969.

60. Маргулис А.Б., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Эль-Регистан Г.И. Индукция SOS-ответа клетки под действием ауторегуляторных факторов микроорганизмов // Генетика. 2003. - Т.39, №9. - С. 1180-1184.

61. Мартиросова Е.И., Карпекина Т.А., Эль-Регистан Г.И. Модификация ферментов натуральными химическими шаперонами из микроорганизмов // Микробиология. 2004. - Т. 73, № 5. - С. 609-612.

62. Мартынкина Л.П., Милько Е.С. Ультраструктурные особенности диссоциантов Rhodococcus rubropertinctus и Streptococcus lactis II Микробиология. 1991. - Т. 60, № 2. - С. 334-338.

63. Матора Л.Ю., Серебренникова О.Б., Петрова Л.П., Бурыгина Г.Л., Щеглов С.Ю. Нетипичный характер R-S диссоциации Azospirillum brasilense И Микробиология. 2003. - Т.72, № 1. - С. 60-63.

64. Милько Е.С., Ботвинко И.В., Степанова Р.А., Егоров Н.С. Сравнительное изучение химического состава и некоторых свойств полисахаридов капсул М-, S-, R-вариантов Mycobacterium lacticolum II Микробиология. 1983. -Т. 52, №3. с. 388-391.

65. Милько Е.С. Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации. М.: Изд-во МГУ. 1991. - С. 143.

66. Милько Е.С., Егоров Н.С., Вуйцик Э. Сравнение чувствительности R-, S-и М-вариантов Rhodococcus rubropertinctus к действию антибиотиков // Антибиотики и мед. Биотехнология. 1987а. - №8. - С. 576-578.

67. Милько Е.С., Егоров Н.С. Влияние физико-химических факторов среды на рост диссоциантов некоторых грамположительных бактерий // Биол. науки. 1992. -№ 5. - С. 89-96.

68. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гидрофильно-гидрофобоные и адгезивные свойства диссоциантов Rhodococcus rubropertinctus II Микробиология. -1994. Т.63, № 2. - С. 382-384.

69. Милько Е.С., Ильиных И.А. Влияние пониженных концентраций углерода, азота и фосфора в среде на динамику роста трех диссоциантов Pseudomonas aeruginosa //Микробиология. 2001. - Т. 70, № 5. - С. 607-610.

70. Милько Е.С., Красильиикова Е.Н. Особенности углеводного метаболизма у R-, S- и М-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa II Микробиология. 1999. Т. 68,№ 2.-С. 211-214.

71. Милько Е.С., Мартынкина Л.П. Морфологические и физиолого-биохимические особенности диссоциантов Pseudomonas aeruginosa II Микробиология. 1996. - Т. 65, № 3. - С. 352-356.

72. Милько Е.С., Никитенко JI.A. Влияние физико-химических факторов среды на рост диссоциантов Pseudomonas aeruginosa II Прикл. биохим. и микробиол. 1998. - Т. 34, № 2. - С. 171-174.

73. Могильная О.А., Милько Е.С., Медведева С.Е. Сравнительное электронно-микроскопичекое изучение колоний и клеток диссоциантов родококка // Прикл. биохим. и микробиол. 1994. - Т. 30, № 6. - С. 877-883.

74. Мулюкин A.JL, Козлова А.Н., Капрельянц А.С., Эль-Регистан Г.И. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора d) в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteus II Микробиология. -1996.-Т. 65, № 1.-С. 20-25.

75. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Козлова А.Н., Дужа М.В., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus II Микробиология. 1996. - Т. 65, № 6. - С. 782-789.

76. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Бабусенко Е.С., Козлова А.Н., Дужа М.В., Митюшина Л.А., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм в автолизирующихся суспензиях микроорганизмов // Микробиология. 1997. - Т.66, №1. - С.42-49.

77. Мулюкин A.Jl. Образование покоящихся форм у неспорообразующих микроорганизмов // Автореферат дисс. . канд. биол. наук., ИНМИ РАН -1998.

78. Мурадов М. Фаговая конверсия алкалоидобразования у Pseudomonas aeruginosa I IVI съезд ВМО. Рига. 1980. - №2. - С.26.

79. Николаев Ю.А., Милько Е.С. Адгезивные и ростовые свойства R- и S-диссоциантов Pseudomonas fluorescens II Микробиология. 2000. - Т.69, № 2.- С.293-294.

80. Николаев Ю.А., Мулюкин А.Л., Степаненко И.Ю., Эль-Регистан Г.И. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов // Микробиология. -2006. Т. 75, № 4. - С. 489-496.

81. Нисилевич В.Ф. Физиолого-биохимические и ультраструктурные особенности S- и R-форм Streptococcus pneumoniae: Автореф. дис. канд. мед. наук. М.: 1987.

82. Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И., Светличный В.А., Козлова А.Н., Дуда

83. B.И., Капрельянц А.С., Помазанов В.В. О химической природе ауторегуляторного фактора d Pseudomonas carboxydoflava II Микробиология.- 1985.-Т. 54, вып. 2.-С. 186-190.

84. Павлович С.А. Магниточувствительность и магнитовосприимчивость микроорганизмов. Мн.: Беларусь. - 1981. - С. 172.

85. Прозоров А.А. Поглощение ДНК бактериальной клеткой: естественный процесс и лабораторные приемы // Генетика. 1998. - Т. 34, №5.1. C. 581-592.

86. Прозоров А.А. Геном бактерий: нуклеоид, хромосома, нуклеотидная карта // Микробиология. 1998. - Т.67, №4. - С. 437-451.

87. Прозоров А.А. Рекомбинантные перестройки генома бактерий, и адаптация к среде обитания // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 5. -С.581-594.

88. Прозоров А.А. Горизонтальный перенос генов у бактерий: лабораторное моделирование, природные популяции, данные геномики // Микробиология. 1999. - Т.68, №5. - С. 632-646.

89. Прозоров А.А. Трансформация у микроорганизмов. М.: Наука. 1988.

90. Ряпис J1.A. Клоновая, фазовая изменчивость бактериальных видов и их связь с проявлениями эпидемического процесса // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1995. -№ 1. - С. 109-111.

91. Сабельников А.Г., Ильяшенко Б.Н. Компетентность E.coli, индуцируемая катионами Са при высоких температурах // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. 1983. - Т. 7. - С. 44-47.

92. Светличный В.А., Романова А.К., Эль-Регистан Г.И. Изучение содержания мембраноактивных ауторегуляторов при литоавтотрофном росте Pseudomonas carboxydoflava // Микробиология. 1986. - Т. 55, вып. 1. -С. 55-59.

93. Светличный В.А., Савельева И.Д., Некрасова В.К., Эль-Регистан Г.И., Романова А.К. Органотрофный рост и синтез ауторегуляторного фактора у Pseudomonas carboxydoflava // Микробиология. 1982. - Т.51, №4. -С.606-610.

94. Секерина О.А., Чемерилова В.И. Об адаптивности процесса диссоциации у Bacillus thuringiensis II Микробиология. 2003. - Т. 72, № 5. -С. 689-694.

95. Стабникова Е.В., Милько Е.С., Грегирчак Н.Н. Флотационное фракционирование клеток R- и S-варинтов некоторых бактерий // Микробиология. 1991. - Т. 53, № 4. - С. 52-54.

96. Стасишина Г.Н., Могильная О.А., Волова Т.Г., Гусейнов О.А., Калачева Г.С., Медведева С.Е., Плотников В.Ф., Франк J1.A. Исследование гетерогенности в культуре водородных бактерий Alcaligenes eutrophus II Микробиология. 1999. - Т. 68, №2. - С. 198-205.

97. Тец В.В., Борисов Л.Б. Молекулярно-генетические механизмы антигенной изменчивости микроорганизмов // Успехи современной биологии. 1986. - Т. 101, вып.2. - С. 163-170.

98. Тихомирова Л.П., Бельков В.В. Методы введения чужеродной ДНК в клетку и селекции гибридных плазмид // Итоги науки и техники. Сер. Молекуляр. биология. М.: ВИНИТИ. 1980. - Т. 12 (ч. II). - С. 62-103.

99. Торгунова А.И. Туберкулез. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней. М. 1973. - С. 239-249.

100. Федоров С.Н., Бутвина О.Ю., Симаров Б.В. Изучение симбиотических свойств ауксотрофных и морфологических мутантов Rhizobium meliloti, полученных под действием УФ-света // Всесоюз. симпоз. Молекул, механизмы генет. процессов. М. 1979. - С.136.

101. Филиппова С.Н., Кузнецов В.В., Бадяутдинов Д.Н., Рысков А.П. Изучение внутрипопуляционных спонтанных морфологических вариантов Streptomyces oligocarbophilus ISPS 5589 // Микробиология. 1999. - Т. 68, №3.-С. 375-382.

102. Фурсова П.В., Милько Е.С., Ильиных И.А., Левич А.П. Подходы к управлению составом сообщества диссоциантов Pseudomonas aeruginosa: экспериментальные данные и модельные расчеты // Биотехнология. 2005. №1. С.73-82.

103. Фурсова П.В., Милько Е.С., Ильиных И.А., Максимов В.Н. Левич А.П. Определение потребностей диссоциантов Pseudomonas aeruginosa в углероде, азоте и фосфоре // Микробиология. 2004. - Т. 73, № 1. - С. 45-50.

104. Червинец В.М. Изменчивость эшерихий в условиях экспериментального моделирования флуктуаций геомагнитного поля //

105. Влияние магнитных полей на биологические объекты. Калининград. 1975. -С.54.

106. Чернощеков К.А. Метод изучения влияния геомагнитного поля на жизнедеятельность микроорганизмов семейства кишечных // Микробиология. 1989. - Т. 58, №9. - С.28-34.

107. Шамшина Т.Н., Константинова Г.Е., Кузнецова Н.И., Азизбекян P.P. Внеклеточный фактор Bacillus thuringiensis, подавляющий спорообразование // Биотехнология. 1994. - №5 - С. 11-13.

108. Шевченко Л.С., Командрова Н.А. Популяция Yersinia enterocolitica и их характеристики // Достижения микробиологии практике. VII съезд ВМО. Алма-Ата. - 1985. - Т. 2. - С. 165.

109. Шеховцев В.П., Жарикова Г.Г. Электронно-микроскопическое изучение расположения клеток в колониях бактерий // Биол. Науки. 1984. № 3. С.93-97.

110. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир. - 1987. - С.566.

111. Шольц К.Ф., Островский Д.Н. Ячейка для амперометрического определения кислорода // Методы современной биохимии. М.: Наука. -1975. -С.52-58.

112. Эль-Регистан Г.И. Роль мембранотропных ауторегуляторных факторов в процессах роста и развития микроорганизмов//Док.дис. ИНМИ РАН.- 1988.

113. Эль-Регистан Г.И., Мулюкин А.Л., Николаев Ю.А. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов // Микробиология. 2006. - Т. 75, № 4. - С. 446-456.

114. Эль-Регистан Г.И., Дуда В.И., Светличный В.А., Козлова А.Н., Типисева И.А. Динамика ауторегуляторных факторов d в периодических культурах Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus II Микробиология. -1983. Т. 52, вып. 2. - С. 238-243.

115. Юдина Т.Г., Милько Е.С., Егоров Н.С. Чувствительность диссоциантов Micrococcus luteus к действию сигма-эндотоксинов Bacillus thuringiensis II Микробиология. 1996. - Т.65, № 3. - С. 305-309.

116. Achtman М. Genetics of the F sex factor in Enterobacteriaceae II Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1973. - V. 60. - P. 79.

117. Aertsen A., Van Houdt R., Vanoirbeek K., Michiels C.W. An SOS Response Induced by High Pressure in Escherichia coli II Journal of Bacteriology. 2004. -V.186,№18.-P. 6133-6141.

118. Andersson R.A., Koiv V., Norman-Setterblad C., Pirhonen M. Role of RpoS in virulence and stress tolerance of the plant pathogen Erwinia carotovora subsp. Carotovora // Microbiology. 1999. - V. 145. - P.3547-3556.

119. Appelmelk B.J., Simoons-Smit M. et al. Pathogenesis and Host Response Helicobacter pylori Infections // A.P.Moran, C.A.Morain.—Galway. 1997. -P.43-57.

120. Barnet Y.M. Properties of Rhizobium trifolii isolates surviving exposure to specific bacteriophage // Canad. J. Microbiol. 1979. - V. 25, №9. - P. 979.

121. Belisle J.T., Klaczkiewicz K., Brennan P.J., Jacobs W.R., Inamine J.M. Rough morphological variants of Mycobacterium avium II J. Biol.Chemistry. -1993. -V. 268, № 14. P. 10517-10523.

122. Bergmans H.E.N., Kooyman D.M., Hoekstra W.P.M. Cotransformation of linear chromosomal DNA and plasmid DNA in Escherichia coli II FEMS Microbiol. Lett. 1980. -V. 9. - P. 211-214.

123. Bergmans H.E.N., van Die I.M., Hoekstra W.P.M. Transformation in Escherichia coli: stages in the process // J. Bacteriol. 1981. - V. 146. -P. 564-570.

124. Bourton N.F., Day M.J., Bull A.T. Distribution of bacterial plasmids in clean and polluted sites in South Wales river // Appl. Environ. Microbiol. 1982. -V. 44.-P. 1026-1029.

125. Bramucci M.G., Keggins K.M. et al. Bacteriphage conversion of sporonegative mutants to sporepositive in Bacillus pumilus // J. Virol. 1977. -V. 22, №1.-P. 194-202.

126. Broek D., Chin-A-Woeng F.C., Bloemberg G.V., Lugtenberg J. J. Role of RpoS and MutS in phase variation of Pseudomonas sp. PCL1171 // Microbiology. -2005. V.151. -P.1403-1408.

127. Chaley M.B., Korotkov E.V., Skryabin K.G. The method revealing latent periodicity of the nucleotide sequences modified for a case of small samples. // DNA Res. 1999. - V.6. - P. 153-163.

128. Covacci A., Falkow S., Censini S. et al. Pathogenesis and Host Response in Helicobacter pylori Infections // Galway. 1997. - P.88-100.

129. De Long R. On bacterial dissociation. // J.Theor.Biol. 1977. - V.64. -P.761-764.

130. Driks A. Bacillus subtilis spore coat // Microbiol, and Mol. Biol. Rev. -1999.-V. 63, №1. P. 1-20.

131. Dunlap C.A., Jennifer A. Phylogenetic analysis of the lux operon distinguishes two evolutionarily distinct clades of Photobacterium leiognathi H

132. Archives of Microbiology. -2004. -V. 181, №5. P. 352-361.

133. Dybvig K. DNA rearrangements and phenotypic switching in prokaryotes. Mol. Microbiol. 1993. - V. 10. - P.465-471.

134. Edwards U., Rogall Т., Bloeker H., Ende M. D., Boeettge E. C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA. // Nucl. Acids Res. 1989. - V. 17. -P. 7843-7853.

135. Eze M.O., McElhaney R.N. The effect of alterations in the fluidity and phase state of the membrane lipids on the passive permeation and facilitated diffusion of glycerol in Escherichia coli II J. Gen. Microbiol. 1981. - V. 124. - P. 229-307.

136. Feucht A., Errington J. ftsZ mutations affecting cell division frequency, placement and morphology in Bacillus subtilis //Microbiology. 2005. - V. 151. -P.2053-2064.

137. Flores M., Gonzalez V., Pardo M.A. et al. Genomic instability in Rhizobium phaseoli II J. Bact. 1988. - V. 170, №3. - P. 1191 -1196.

138. Foster P.L. Mechanisms of stationary phase mutation: a decade of adaptive mutation // Annu. Rev. Genet. 1999. - V. 33. - P. 57-88.

139. Fry J.D., Day M.J. (eds.) Bacterial genetics in natural environments. -London.: Chapman and Hill. 1990 -P. 123-130.

140. Gasiorowski K., SzybaK., Brokos В., Kozubek A. Antimutagenic activity of alkylresorcinols from cereal grains // Cancer lett. 1996. - V.106. - P.109-115.

141. Gerard A. Cangelosi G.A., Palermo C.O., Bermudez L.E. Phenotypic consequences of red-white colony type variation in Mycobacterium avium II Microbiology. 2001. - V. 147. - P. 527-533.

142. Germuda J., Khachatourians G.G. Transduction of Escherichia coli in soil // Can. J. Microbiol. 1988. -V. 34. - P. 190-193.

143. Gerritsen L.J., de Raay G., Smits P.H. Characterization of form variants of Xenorhabdus luminescens II Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V.58, №6. -P. 1975-1979.

144. Govan J.R.W., Fyfe J.A., McMillan C. The instability of mucoid Pseudomonas aeruginosa: fluctuation test and improved stability of the mucoid form in shaken culture // J. Gen. Microbiol. 1979. - Vol. 110, №1. - P. 229-232.

145. Guthrie G.D., Sinsheimer R.L. Observations on the infection of bacterial protoplasts with the DNA of bacteriophage XI74 // Biochim. et Biophys. acta. -1963.-V. 72.-P. 290-297.

146. Haas R., Meyer T. The repertoire of silent pilus genes in Neisserial gonorrhoeae: evidence for gene conversion // Cell. 1986. - V. 44, № 1. -P. 107-115.

147. Haga H.S., Sigemore R.K. Incidence of plasmids in marine Vibrio spp. isolated from oil field in western Gulf of Mexico // Appl. Environ. Microbiol. -1981.-V. 41.-P. 199-202.

148. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // Ibid. 1983. - Vol.166, №3. - P.557-580.

149. Havarstein L.S., Hakenbeck R., Gaustad P. Natural competence in the genus Streptococcus: evidence that streptococci can change phenotype by interspecies recombinational exchange // J. Bacterid. 1997. - V. 179, №21. - P. 6589-6594.

150. Henderson, I. R., P. Owen, and J. P. Nataro. Molecular switches—the on and off of bacterial phase variation. Mol. Microbiol. 1999. - V. 33. - P. 919-932.

151. Hersh M.N., Ponder R.G., Hastings P.J., Rosenberg S.M. Adaptive mutation and amplification in Escherichia coli: two pathways of genome // Research in Microbiology. 2004. - V. 155, №5. - P. 352-359.

152. Hilton Т., Rosche Т., Froelich В., Smith В.,Oliver J. Capsular Polysaccharide Phase Variation in Vibrio vulnificus II Applied and Environmental Microbiology. 2006. - V.72, № 11. - P. 6986-6993.

153. Kahman R., Kamp D., Zipser D. Transfection of E.coli by Mu DNA // Mol. Gen. Genet. 1976. - V. 149. - P. 323-328.

154. Kelly A.F., Park S.F., Bovill R., Mackey B.M. Survival of Campylobacter jejuni during stationary phase: evidence for the absence of a phenotypic stationary-phase response // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67, № 5. - P. 2248-2254.

155. Kirisits M.J., Prost L., Starkey M., Parsek M.R. Characterization of Colony Morphology Variants Isolated from Pseudomonas aeruginosa Biofilms // J. Applied and Environmental Microbiology. 2005. - V.71, № 8. - P. 4809-4821.

156. Kozubek A. Resorcinol lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphiphiles and their biological activity // Chem. Rev. 1999. - V.99, №1. -P.l-31.

157. Lachica R. V., Zink D., Ferris W.R. Association of fibril structure formation with cell surface properties of Yersinia enterocolitica II Infec. and Immunol. -1984.-V. 46, № l.-P. 272-275.

158. Laue B.E., Gill R.E. Using a phase-locked mutant of Myxococcus xanthus to study the role of phase variation in development //J. Bacteriol. 1995. - V. 177, №14.-P. 4089-4096.

159. Leblond P., Denuyter Ph., Moutier L., Laakel N., Decaris В., Simonet J.N. Hipervariability, a new phenomenon of genetic instability, related to DNA amplification in Streptomyces ambofaciens И J. Bacteriol. 1989. - V.171, №1. -P.419-423.

160. Lederberg J., Tatum E.L. Novel genotypes in mixed cultures of biochemical mutants of bacteria // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1946. - V. 11. -P. 113.

161. Levy S.B., Miller R.V. (eds.) Gene transfer in the environment. -New.York.: McGraw-Hill. 1989-P.l 11.

162. Li Q., Hobbs M., Reeves P.R. The variation of dTDP-L-rhamnose pathway genes in Vibrio cholerae I I J.Microbiology. 2003. - V. 149. - P. 2463-2474.

163. Lacks S.A. DNA uptake by transformable bacteria. Transport of molecules across microbial membranes // Eds. Broome-Smith J. et al. War. Cambridge University Press. 1999. - P. 139-188.

164. Lorenz M.G., Aardema В., Wackernagel W. Highly efficient genetic transformation of Bacillus subtilis attached to sand grains // J. Gen. Microbiol. -1988.-V. 134.-P. 107-122.

165. Losick R., Stragier P. Crisscross regulation of cell-type-specific gene expression during development in Bacillus subtilis II Nature. 1992. - V. 355. -P. 601-604.

166. Lugtenberg B.J.J., Dekkers L.C. What makes pseudomonas bacteria rhizosphere competent?//Environ. Microbiol. 1999. -V. 1. - P. 9-13.

167. Maron .M., Ames B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test // Mut. Res. 1983. - V. 113. - P. 173-215.

168. Martin D.R. Mucoid variation in Pseudomonas aeruginosa induced by the action of phage // J. Med. Microbiol. 1973. - V.6, №1. - P. 111-118.

169. McClure N.C., Weigthman A.J., Fry J.C. Survival of Pseudomonas putida UWC1 containing cloned catabolic genes in a model activated sludge unit // Appl. Environ. Microbiol. - 1989. - V. 55. - P. 2627-2634.

170. Meyer F., Mackal R.P., Tao M., Evans E.A. Infectious deoxyribonucleic acid from bacteriophage//;. Biol. Chem. 1961. -V. 236. - P. 1141-1143.

171. Mobile DNA / Eds. Berg D.E. et.al.Washington D.C.: Amer.Soc.Microbiol. 1989.-P. 972.

172. Morse M.L., Lederberg E.M., Lederberg J. Transduction in Escherichia coli K12 // Genetics. 1956. - V. 41. - P. 142.

173. Moxon E., Rainey P., Nowak M., Lenski R. Adaptive evolution of highly mutable loci in pathogenic bacteria // Current Biol. 1994. - V.4, №1. - P.24-33.

174. Murphy G., Connel Т., Barrits D., Koomey M., Cannon J. Phase variation of gonococcal protein 2: regulation of gene expression by slipped-strand mispairing of a repetitive DNA sequence // Cell. 1989. - V.56, №4. - P. 539-547.

175. Nej M. Molecular evolutionary genetics. // Columbia University Press. New York, NY. 1987.

176. Nicholos J.M. & Carr N.G. Akinetes of cyanobacteria // Spores VII Eds. Chambliss G. & Vary J.C. Washington D.C.: Amer. Soc. Microbiol. 1978. -P. 335-343.

177. Pashin Iu.V., Bakhitova T.I. Experimental study of the antimutagenic properties of 5-methylresorcinol // Bull. Eksp. Biol. Med. 1985. - V. 100, ISS 7. -P.63-65.

178. Perlak F.J., Thorne C.B. Converting phage for Bacillus thuringiensis II Abstr. Ann. Meet. Amer. Soc. Microbiol. 1980. - P. 135.

179. Perry A., Nicolson I., Saunders J. Structural analysis of the pil E region of Neisseriae gonorrhoeae II Gene. 1987. - V. 60, № 1. - P. 85-92.

180. Posfai G., Plunkett G., Feher Т., Frisch D., Keil G.M. Emergent Properties of Reduced-Genome Escherichia coli II Science. 2006. - V.312. - P.1044-1046.

181. Purevdorj-Gage В., Costerton W.J., Stoodley P. Phenotypic differentiation and seeding dispersal in non-mucoid and mucoid Pseudomonas aeruginosa biofilms // Microbiology. 2005. - V.151. - P. 1569-1576

182. Rajeshwari R., Sonti R.V. Stationary-phase variation due to transposition of novel insertion elements in Xanthomonas oryzae pv. oryzae II J. Bacterid. 2000. -V. 182, № 17.-P. 2248-2254.

183. Reynolds R. В., Thorne C.B. Phage and plasmids of a Bacillus thuringiensis II Abstr. Ann. Meet. Amer. Soc. Microbiol. 1980. - P. 911.

184. Robertson B.D., Meyer Т. Genetic variation in pathogenic bacteria // Trends in Genet. 1992. - V. 8, № 12. - P. 422-427.

185. Rosenberg S. Evolving responsively: adaptive mutation // Nat. Rev. Genet. -2001. V. 2, №7. P. 504-514.

186. Rosso L. Les fondements scientifique de la microbioligie previsionnelle // C.r. Acad. agr. Fr. 2003. - V. 89, № 2. - C. 28-35.

187. Salmond G., Bycroft В., Stewart G., Williams P. The bacterial enigma: cracking the code of cell-cell communication // Mol. Microbiol. 1995. - V.16, №4.-P. 615-624.

188. Sasakawa C, Berg DE. IS50-mediated inverse transposition. Discrimination between the two ends of an IS element. // J Mol Biol. 1982. - V. 159(2). -P. 257-71.

189. Sauer K., Camper A. Characterization of Phenotypic Changes in Pseudomonas putida in Response to Surface-Associated Growth // Journal of Bacteriology. 2001. - Vol. 183, № 22. P. 6579-6589.

190. Saunders J. N. The genetic basis of phase and antigenic variation in bacteria // Antigenic Var. Infec. Diseases. Oxford. 1986. - P.57-76.

191. Saunders J.N., Moxon R.E., Gravenor B.M. Mutation rates: estimating phase variation rates when fitness differences are present and their impact on population structure // Microbiology. 2003. - V. 149. - P. 485-495

192. Seifert H.S. Question about gonococcal pilus phase and antigenic variation // Mol. Microbiol. 1996. - V.21, №3. - P.433-440.

193. Scanlan D.J. Physiological diversity and niche adaptation in marine Synechococcus II J. Advances in Microbial Physiology. 2003. - V.47. - P. 1-64.

194. Schrader J.A., Holmes D.S. Phenotypic switching of Thiobacillus ferrooxidans II J. Bact. 1988. - V. 170, № 9. - P. 3915-3925.

195. Shapiro J.A. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms // Ann. Rev. Microbiol. 1998. - V.52. - P. 81-104.

196. Shibata Т., Himeno M., Morita J., Komano T. Effect of polyethylene glycol on calcium-treatment transfection of Escherichia coli with bacteriophage 1 DNA // Agr. Biol. Chem. 1979. - V. 43. - P. 401-402.

197. Silver S., Misra Т.К. Plasmid-mediated heavy metal resistance // Ann. Rev. Microbiol. 1988. -V. 42. - P. 717-743.

198. Sinha, H., Pain A., Johnstone K. Analysis of the role of recA in phenotypic switching of Pseudomonas tolaasii// J. Bacteriol. 2000. - V.182. - P.6532-6535.

199. Singh U.S., Scannell R.T., An H., Carter B.J., Hecht S.M. DNA cleavage by di- and trihydroxyalkylbenzenes. Characterization of products and roles of 02, Cu (II), and alkaly//J. Am. Chem. Soc. 1995.-V.117, №51. -P.12691-12699.

200. Smirnov S.P., Smirnova E.D., Kudryavtseva A.V., Kuznetsov V.D. Methylation DNA in different phenotypic variants of Streptomyces coeruleorubidus II 9-th International Symposium on the Biology of Actinomycetes. Theses. M. 1994.-P.219.

201. Smith A.M., Guzman C.A., Walker M.J. The virulence factors of Bordetella pertussis-, a matter of control // FEMS Microbiol. Rev. 2001. - V.25, №3. -P.309-333.

202. Solomon J., Grossman A.D. Who's competent and when: regulation of natural genetic competence in bacteria // Trends Genet. 1996. - T.12, №1. -P. 150-155.

203. Stern A., Meyer T. Commn mechanism controlling phase and antigen variation in pathogenic Neisseriae II Mol. Microbiol. 1987. - V.l. - P.5-12.

204. Stewart G.G., Eaton M.W., Johnstone K., Barrett M.D., Ellar D.F. An investigation of membrane fluidity changes during sporulation and germination of

205. Bacillus megaterium K.M. measured by electron spin and nuclear magnetic resonance spectroscopy // Biochim. Biophys. Acta. 1980. - V. 600. - P. 270-290.

206. Stotzky G., Babich H. Survival of, and genetic transfer by genetically engineered bacteria in natural environments // Adv. Appl. Microbiol. 1986. -V.31.-P. 73-138.

207. Swanson J., Bergstrom S., Robbins K., Barrera O., Corwin D., Koomey J. Gene conversion involving the pilin structural gene correlates with pilus lilus changes in Neisseria gonorrhoeae II Cell. 1986. - V.47, №2. - P. 267-276.

208. Suh S-J., Silo-Suh L., Woods D.E., Hassett D.J., West S. E.H., Ohman D.E. Effect of rpoS mutation on the stress response and expression of virulence factors in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 1999. - V.181, №13. - P.3890-3897.

209. Suzuki M., Szalay A.A. Bacterial transformation using temperature-sensitive mutants deficient in peptidoglycan synthesis // Meth. Enzymol. 1979. - V. 68. -P. 331-343.

210. Taguchi G., Wu Y. Introduction to off-line quality controls. // Japan Quality Control Organisation. Nagoya, Japan. 1980.

211. Takahashi Y., Tokumoto U. A Third Bacterial System for the Assembly of Iron-Sulfur Clusters with Homologs in Archaea and Plastids // J. Biol. Chem. -2002. Vol. 277, Issue 32. - P. 28380-28383.

212. Tluscik F., Kozubek A., Mejbaum-Kaizenellenbogen W. Alkylresorcinols in rye (secale cereale L.) grains // Act. Soc. Bot. Pol. 1981. - V.54, №7. -P. 645-651.

213. Torkelson J., Harris R.S., Lombardo M.J., Nagendran J., Thulin C., Rosenberg S.M. Genome-wide hypermetation in a subpopulation of stationary-phase cells underlies recombination-dependent adaptive mutation // EMBO J. -1997.-V. 16.-P. 3303-3311.

214. Uchida I., Sekizaki Т., Hashimoto K. et al. Association of the encapsulation Bacillus anthracis with a 60 megadalton plasmid 11 J. Gen. Microbiol. 1985. -V.131, №2. - P. 363-367.

215. Van de Peer, Y., De Wachter R. TRECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows Environment//Comput. Appl. Biosci. 1994. - V.10.-P. 569-570.

216. Van der Woude M., Braaten B, Low D. Epigenetic phase variation of the pap operon in Escherichia coli II Trends Microbiol. 1996. - V. 4. - P. 5-9.

217. Van der Woude M., Baumler A.J. Phase and Antigenic Variation in Bacteria // Clinical Microbiology Reviews. 2004. - Vol. 17, No. 3. - P. 581-611

218. Van Die I.M., Bergmans H.E.N., Hoekstra W.P.M. Transformation in Escherichia coli: studies on the role of the heat shock in induction of competence // J. Gen. Microbiol. 1983a. - V. 129. - P. 663-670.

219. Van Die I.M., Oosterhout A., Bergmans H.E.N., Hoekstra W.P.M. The influence of phase transition of membrane lipids on uptake of plasmid DNA in Escherichia coli transformation // FEMS Microbiol. Lett. 1983b. - V. 18. -P.127-130.

220. Van Elsas J.D., Govaret J.M., van Veen J.A. Transfer of plasmid pFT30 between bacilli in soil as influenced by bacterial population dynamics and soil conditions // Soil. Biol. Biochem. 1987. - V. 19(5). - P. 639-647.

221. Van Elsas J.D., Nikkei M., van Overbeek L.S. Detection of plasmid RP4 transfer in soil and rhizosphere, and the occurrence of homology to RP4 in soil bacteria//Current. Microbiol.- 1990a. -V. 19. P. 375-381.

222. Van Elsas J.D., Trevors J.T., Starodub M.E., van Overbeek L.S. Transfer of plasmid RP4 between Pseudomonas after introduction into soil; influence of spatial and temporal aspects of inoculation // FEMS Microbiol. Ecol. 1990b. - V. 73.-P. 1-13.

223. Warne S.R., Varley J.M., Boulnois G.J., Norton M.G. Identification and characterization of a gene that controls colony morphology and auto- aggregation in Escherichia coli K12 // J.Gen.Microbiol. 1990. - V. 136, № 3. - P. 455-462.

224. Watanabe K., Shimizu H., Aihara H. et al. Isolation and identification of cholesteroldegrading Rhodococcus strains from of animal origin and theircholesterol oxidase activities // J. Gen. and Appl. Microbiol. 1986. - V.32, №2. -P.137-147.

225. Webb J. S., Lau M., Kjelleberg S. Bacteriophage and Phenotypic Variation in Pseudomonas aeruginosa Biofilm Development // Journal of Bacteriology. December 2004. - Vol. 186, No. 23. - P. 8066-8073.

226. Wellingtonn E.M.H., Cresswell N., Saunders V.A. Growth and survival of Streptomycete noculanrs and extent of plasmid transfer in sterile and nonsterile soil // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56(5). - P. 1413-1419.

227. Weppner W., Leach F. The initial attachment of transforming DNA to competent Bacillus subtilis II Mol. And Gen. Genet. 1978. - Vol. 160, №2. -P.131-138.

228. Wireman J.W., Dworkin M. Morphogenesis and developmental interactions in Myxobacteria II Science. 1975. - V. 189. - P. 516-523.

229. Wolfe J.A., Millikan D.S., Campbel J.M.,Visick K.L. Vibrio fischeri a54 Controls Motility, Biofilm Formation, Luminescence, and Colonization // Applied and Environmental Microbiology. 2004. - V.70(4). - P. 2520-2524.

230. Yildiz F.H., Schoolnik G.K. Role of rpoS in stress survival and virulence of Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 1998. - V.180, №4. - P.773-784.

231. Zaleski P., Wojciechowski M., Piekarowicz A. The role of Dam methylation in phase variation of Haemophilus influenzae genes involved in defence against phage infection// Microbiology.-2005.-V. 151.-P. 3361-3369.

232. Zeph L.R., Oraga M.A., Stotzky G. Transduction of Escherichia coli by bacteriophage PI in soil // Appl. Environ. Microbiol. 1988. - V. 54. -P. 1731-1737.

233. Zinser E.R., Kolter R. Mutations enhancing amino acid catabolism confer a growth advantage in stationary phase // J. Bacteriol. 1999. - V. 181, № 18. -P. 5800-5807.

234. Список работ, опубликованных по материалам диссертации

235. Милько Е.С., Хабибуллин С.С., Николаев Ю.А, Козлова А.Н., Эль-Регистан Г.И. Динамика роста и состава популяций смешанных культур R-, S- и М-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa II Микробиология. 2005. -Т.74, №4. - С475-482.

236. Хабибуллин С.С., Николаев Ю.А., Лойко Н.Г., Голод Н.А., Милько Е.С., Воейкова Т.А., Эль-Регистан Г.И. Ауторегуляция фенотипической диссоциации у Bacillus licheniformis // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммуннологии. 2006. - Т.75, №6. - С.9-13.

Информация о работе

Хабибуллин, Самат Сиринович
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Популяционная вариабельность микроорганизмов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы