Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы персистенции энтеробактерий и влияние на них пробиотиков при дисбиозе кишечника

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Факторы персистенции энтеробактерий и влияние на них пробиотиков при дисбиозе кишечника"

РГ6 ОД 1 О ФЕ8 «97

На правах рукописи

Валышев Александр Владимирович

ФАКТОРЫ ПЕРСИСТЕНЦИИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ И ВЛИЯНИЕ НА НИХ ПРОБИОТИКОВ ПРИ ДИСБИОЗЕ КИШЕЧНИКА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Оренбург -1997

Работа выполнена в Оренбургской государственной медицинской академии и Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской Академии наук.

Научный руководитель

заслуженный деятель науки РФ, академик РАЕН,

доктор медицинских наук, профессор Бухарин О. В.

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Бурмнстрова А. Л.

доктор медицинских наук, профессор Каган Ю. Д.

Ведущая организация

Челябинская государственная медицинская академия

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургской государственной медицинской академии.

Защита состоится

на за , > совета К 084. 51. 02

Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: 460014 г. Оренбург, ул. Советская, 6.

г. в часов

Автореферат разослан

¿У

£2?¿997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

Семченко Ю. П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хорошо известна важная роль нормальной микрофлоры пищеварительного тракта в целом, и кишечника в частности, в создании резистентности к колонизации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, действию токсинов, ферментов защиты и агрессии, витаминном балансе, формировании иммунного гомеостаза, участии в метаболических и ферментативных процессах, антимутагенной и антигенотоксической активности и др. В последние годы наблюдаются значительные качественные и количественные изменения в составе нормальной микрофлоры, вызванные различными неблагоприятными факторами внешней среды, стрессорными воздействиями, широким, бесконтрольным и, нередко, неоправданным применением антибиотиков, химнопрепаратов, как результат лучевой и гормонотерапии [Пинегин Б. В. и др., 1984; Красноголовец В. Н., 1989; Куваева И. Б., Ладодо К. С., 1991; Воробьев А. А. и др., 1996].

Многочисленность факторов, ведущих к нарушениям состояния нормальной микрофлоры, приводит к высокой частоте регистрации дисбиотических нарушений. Так, по данным Российской Академии медицинских наук, почти 90% населения нашей страны в той или иной мере страдает дисбиозами [Воробьев А. А. и др., 1996]. Дисбиоз кишечника выявляется в 70% при патологии гастродуо-денапьной и гепатобилиарной систем, в 100% - при заболеваниях кишечника [Гончарова Г. И., 1986].

Традиционная точка зрения на проблему генеза дисбиоза заключается в том, что при снижении колонизационной резистентности, связанном с уменьшением количества облигатно-анаэробных представителей, происходит значительное увеличение условно-патогенных микроорганизмов; существенную долю среди последних составляют энтеробактерии [Калашникова Г. К. и др , 1978].

В то же время не определены критерии для установления ведущих этиологических агентов дисбиотических нарушений, принимая во внимание, что многие энтеробактерии являются комменсалами и составляют определенную часть кишечного микробиоценоза. Недостаточно учитывается собственный потенциал микроорганизмов: бактериоцины, ферменты защиты и агрессии, токсины и, наконец, факторы, способствующие инактивации механизмов естественной резистентности, т. е. факторы персистенции. Последние, учитывая длительность дисбиотических нарушений и устойчивость к проводимой терапии, занимают особое место.

Коррекцию микробной флоры осуществляют различными биопрепаратами - антибиотиками, бактериофагами и пробиотиками (эубиотиками). Пробио-тики занимают доминирующее положение вследствие физиологичности регулирующего влияния и механизма терапевтической активности. Бактерийные биоло-

гические препараты из нормальной микрофлоры используют для коррекции микроэкологических нарушений при острых и хронических заболеваниях и дисфункциях желудочно - кишечного тракта, при нарушениях обмена, после антибактериальной, гормональной и лучевой терапии, в дооперационный и послеоперационный периоды, при неблагоприятных экологических условиях и т.д.

Однако открь!тым остается вопрос отбора биопрепаратов для купирования конкретных дисбиотических состояний.'Пробиотики назначаются с учетом возраста, количественного соотношения разных групп микроорганизмов и фазы заболевания, чаще всего являясь типичным заместительным средством. Отсутствие объективных данных о возможности переживания производственных штаммов в кишечном биотопе, а также сведений о влиянии на персистентные характеристики основных "причинных" микроорганизмов, вероятно, приводят к низкой эффективности лечебных мероприятий, свидетельством чему может быть необходимость длительных (1.5-2 мес), нередко повторных, курсов биотерапии.

Исследование комплекса персистентных признаков у энтеробактерий, выделенных при дисбиозе кишечника, и влияние на эти свойства биологических бактерийных препаратов, актуально и представляет интерес не только в теоретическом плане, расширяя знания о биологии и микроэкологии энтеробактерий кишечной микрофлоры, но и в прикладном аспекте, обосновывая возможность разработки быстрых и информативных методов оценки состояния микробиоценозов кишечника, а также оптимальные способы коррекции дисбиотических состояний.

Целью настоящего исследования явилось определение биологической роли факторов персистепции микроорганизмов при кишечном дисбиозе и регулирующей функции бактерийных биопрепаратов в отношении энтеробактерий под контролем персистентных свойств.

Основные задачи исследования:

1. Изучить частоту встречаемости и степень выраженности антилизо-цимной (АЛА), "антиинтерфероновой" (АИА) и антикомплементарной (АКА) активности энтеробактерий, выделенных при дисбиозе кишечника.

2. Разработать диагностический критерий дисбиотических нарушений, основанный на определении персистентных признаков энтеробактерий фекальной флоры.

3. Дать характеристику популяционной структуры пробиотиков по пер-систентным свойствам.

4. Определить влияние отдельных пробиотиков на факторы персистен-ции энтеробактерий.

Научная новизна. Впервые изучен комплекс фактором персистеиции (АЛА, АИА, АКА) эитеробактерий фекальной флоры при днсбиозе кишечника. Определение биохимической активности эшерихий позволило выделить две биогруппы кишечных палочек: активные и неактивные Е. соН. Выявлены изменения в популяционной структуре эшерихпозной флоры в зависимости от степени дис-биоза: доля неактивной кишечной палочки возрастала по мере прогрессировать дисбиотических нарушений. Установлена высокая распространенность перси-стентных признаков у эитеробактерий; частота встречаемости средних и высоких значений признака убывала в ряду "антикомплементарная активность - антили-зоцимная активность - "антиинтерфероновая" активность". Обнаружены высокие по сравнению с-фоновым уровнем (для штаммов кишечной палочки) значения АКА и АЛА у условно-патогенных эитеробактерий, что подтвердило их этиологическую роль в развитии дисбиоза кишечника. Обнаружена связь между перси-стентными признаками бактерий и глубиной нарушений в микребиоценозе кишечника: доля штаммов кишечной палочки и некоторых других видов бактерий с высоким уровнем АЛА, АИА и АКА коррелировала со степенью выраженности дисбиоза. Полученные данные послужили теоретической предпосылкой для разработки способа скрининговой диагностики кишечного дисбиоза, основанного на определении "антиинтерфероновой" активности колоний эитеробактерий в посеве фекалий (положительное решение ВНИИГПЭ по заявке на изобретение № 93034438/14 (034024) от 17.04.96.).

Выявлены различия в популяционной структуре производственных штаммов лробиотиков по персистентным признакам. Используя указанные выше методики оценки влияния пробиотнков на факторы персистеиции микроорганизмов, удалось установить особенности изменения уровня антикомплементарной активности бактерий: один и тот же пробиотик оказывал стимулирующее, индифферентное или ингибирующее действие на персистентный признак в зависимости от вида тестируемых микроорганизмов.

Практическая ценность. Полученные в работе данные расширяют теоретические представления о роли факторов персистеиции эитеробактерий в формировании микробных биоценозов кишечника человека.

Практическое значение исследования заключается в возможности использования факторов персистеиции микрофлоры в качестве маркеров дисбио-тического процесса, в частности, при проведении скрипинговых исследований для выявления групп риска.

Разработанный способ выявления кишечного дисбиоза и кишечной инфекции под контролем факторов бактериальной персистеиции апробирован в МСЧ ПО "Стрела" г. Оренбурга.

б

Материалы работы использованы при проведении областного семинара врачей-бактериологов (Оренбург, 1996). ' Предложенные приемы могут быть использованы в работах микроэколо-

гического профиля и при решении медицинских задач.

Положения, выносимые на защиту:

1. Факторы персистенции, широко распространенные у различных представителей кишечной микрофлоры, являются маркерами дисбиотических состояний.

2. Факторы персистенции микроорганизмов регулируются биологическими препаратами (пробиотиками), что должно учитываться при коррекции дисбиозов кишечника.

3. Гетерогенность производственных штаммов пробиотиков по перси-стентным свойствам может быть использована для контроля качества биопрепаратов.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседании городского общества детских враче!') (Оренбург, 1993), Дне врача-бактериолога (Оренбург, 1993), VI областной научно-практической конференции врачей-инфекционистов, микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Оренбург, 1994), Юбилейных научных чтениях, посвященных 90-летию академика В. Д. Тимакова (Москва, 1995), Всероссийской научно-практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики" (Москва, 1996), областной конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, получено положительное решение ВНИИГПЭ по заявке на изобретение № 93034438/14 (034024).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, материалы и методы, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы; указатель литературы, включающий 87 отечественных и 141 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 9 таблицами и 10 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы п методы исследования. При проведении исследований было изучено 262 штамма энтеробактерий, выделенных из фекалий лиц с патологией желудочно-кишечного тракта, гепатобилиарной системы и бактериологически подтвержденным дисбиозом кишечника.

Исследование микробиоценоза кишечника осуществляли в соответствии с методическими рекомендациями "Применение бактерийных биологических

препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника" (М., 1986).

Идентификацию штаммов микроорганизмов проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических и антигенных свойств. Биохимический профиль оценивали с помощью коммерческих тест-систем фирмы LACHEMA (Чехия).

Факторы персистенции (АЛА, АИА и АКА) энтеробактерий изучались по методикам, разработанным О. В. Бухариным и сотрудниками (1984-1992). Для определения АЛА производственных штаммов пробиотиков использовали кинетический метод, определения АКА - метод радиальной диффузии [Брудастов Ю. А. и др., 1996] и кинетический метод [Мисетов И. А., 1993]. Для изучения ан-титрипсиновой активности (ATA) энтеробактерий применяли фотометрическое определение трипсина, гидролизугощего хромогенный субстрат L-TAPA с образованием 4-нитроанилина [Bartik М. et al., 1974, 1980].

Определение популяционнои структуры пробиотиков по персистентным свойствам проводили на 20 клонах каждого препарата, полученных по методике J. Lederberg и Е. М. Lederberg (1952).

Для характеристики гетерогенности популяций, оценки внутриштаммо-вого разнообразия, а также с целью определения обычности и редкости групп с определенным уровнем признака, использовали коэффициент вариабельности [Лакин Г. Ф., 1990], а также индексы разнообразия и выровненности Симпсона и Шеннона [Бигон М. и др., 1989].

Характер влияния пробиотиков на факторы персистенции энтеробактерий выявляли при совместном культивировании последних с производственными штаммами биопрепаратов.

Данные, полученные в результате исследования, были подвергнуты обработке методами вариационной статистики с применением критерия Стыоден-та-Фишера [Ашмарин И. П., Воробьев А. А., 1962]. Кроме того, в отдельных случаях использовался ранговый критерий Уилкоксона (Манна-Уитни) [Лакин Г. Ф., 1990].

Результаты исследования и их обсуждение. Учитывая данные биохимической идентификации по 23 тестам, вся популяция эшерихий была разделена на две биогруппы: активные и неактивные кишечные палочки. Основанием для этого послужили результаты работы сотрудников центра по контролю над заболеваниями (CDC) J. J. Farmer III с соавторами (1985), описавшими биохимические профили представителей семейства Enterobacteriaceae. В большей степени штаммы биогрупп отличались по ферментации лактозы, сахарозы, дульцита, сорбита и рамнозы; по наличию лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы.

аргининдегидролазы, р-галактозидазы; по гидролизу эскулина и продукции индола.

Выявлены изменения в популяционной структуре эшерихиозной флоры в зависимости от степени дисбиоза: доля неактивной кишечной палочки возрастала по мере прогрессирования дисбиотических нарушений (31.9% от общего числа штаммов кишечной палочки при дисбиозе I степени и 66.7% - при дисбио-зе IV степени) (рисунок 1). Эти результаты свидетельствовали об изменении биологических свойств эшерихиозной флоры по мере снижения колонизационной резистентности.

Рисунок 1. Доля Е.соН разных биогрупп (%) при различной выраженности дисбиотнческого процесса.

Оценена информативность персистентных свойств энтеробактерий по частоте встречаемости штаммов с определенными значениями признаков. Проведенные исследования выявили широкое распространение факторов персистен-ции у кишечной палочки и других энтеробактерий фекальной флоры при дисбиозе кишечника; частота встречаемости средних и высоких значений признака убывала в ряду "АКА(79.8±2.5%)-»АЛА(50.0±3.1%)-*АИА (38.9+3.0%)".

Антилизоцимная активность была обнаружена у всех изученных видов энтеробактерий (рисунок 2А). Половина штаммов обладала средней (3-4 мкг/мл) и высокой (5 мкг/мл и более) активностью, другая половина - низкой АЛА (до 2 мкг/мл включительно) или антилизоцимный признак отсутствовал.

А

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Е coli E.coli inactive К.pneumoniae K.oxytoca C.freundii C.diversus E.cloacae E aerogenes E.agglomerans H.alvei

0%

20%

40%

60%

80%

100%,

E.coli E.coli inactive K.pneumoniae K.oxytoca ! C.freundii I C.diversus j E.cloacae j E.aerogenes i E.agglomerans ! H.alvei

1

--^- в 2.1 и > ед. S 1.1-2.0 ед. □ 0-1 ел.

' —

В

0%

20%

40%

60%

80%

100%

E.coli E.coli inactive ^.pneumoniae K.oxytoca C.freundii C.diversus E.cloacae E.aerogenes E.agglomerans H.alvei

Рисунок 2. Распространенность и уровни АЛА (А), "АИА" (Б) и АКА (В) у энтсробактернй фекальной флоры при дисбиозе.

Пояснения в тексте.

Максимальная доля штаммов со средними и высокими значениями АЛА отмечена среди клебсиелл (К. oxytoca - 87.5%, К. pneumoniae - 82.1%) и цитробактеров (С. diversus - 83.3%, С. freundii - 70.0%). Биогруппы кишечной палочки не отличались по антилизоцимному признаку.

Способность к инактивации бактерицидного компонента препарата интерферона - "антиинтерфероновая" активность - была отмечена в основном у эшерихий, клебсиелл и цитробактеров (рисунок 2Б). Средние (1.1-2.0 ед.) и высокие (2Л ед. и более) значения АИА были обнаружены только у 22.1% культур. Биогруппы Е. coli отличались распределением штаммов со средним и высоким уровнями АИА.

Антикомплементарная активность была самым распространенным пер-систентным признаком (рисунок 2В). Уровень АКА у подавляющего большинства изученных энтеробактерий был средним (5.1-15.0 анти-СН50) и высоким (15.1 анти-СН50 и более). На долю таких культур приходилось 79.8% исследованных штаммов. Представители рода Citroba6ter - С. freundii и С. diversus - в абсолютном большинстве (100%) имели средние и высокие значения АКА. Более 80% штаммов клебсиелл (К. pneumoniae, К. oxytoca) и энтеробактеров (Е. cloacae, Е. aerogenes и Е. agglomerans) обладали антикомплементарной активностью не ниже 5Л анти-СН50. Биогруппы кишечной палочки не отличались между собой по антикомплементарному признаку.

Таким образом, штаммы энтеробактерий, выделенные из фекалий от лиц с дисбиозом кишечника, обладают большим набором персистентных признаков. Это касается как индигенных обитателей (кишечная палочка), так и транзитор-ных микроорганизмов (условно-патогенные энтеробактерии). Наличие факторов персистенции у представителей нормальной микрофлоры, вероятно, является адаптационным механизмом в условиях усиленного антимикробного прессинга со стороны макроорганизма при дисбиозе. Более высокие показатели частоты встречаемости средних и высоких значений признаков у клебсиелл, цитробактеров, энтеробактеров, гафний с одной стороны отражают их высокую потенцию к колонизации биотопа, а с другой стороны служат подтверждением этиологической роли энтеробактерий данных родовых групп в возникновении дисбиотиче-ских состояний.

Для оценки связи степени дисбиоза и выраженности персистентных свойств определяли долю штаммов кишечной палочки с высокими значениями АЛА, АИА и АКА (рисунок ЗА). При I и II степени дисбиоза частота встречаемости штаммов находилась в диапазоне от 6.3% для АИА до 13.2% для АКА. При III и особенно при IV степени дисбиоза распространенность штаммов с высоким уровнем признаков резко возрастала: от 30.8 до 53.8% (АЛА), от 31.2 до 56.2% (АИА), от 23.7 до 52.6% (АКА).

[Цоля штаммов, %

Рисунок 3. Связь выраженности персистентных признаков энтеробактерий со степенью дисбиоза кишечника.

Обозначения: по оси абсцисс - степень дисбиоза кишечника.

Крайние степени выраженности дисбиотического процесса достоверно отличались по распространенности высоких значений всех признаков (Р<0.05). Аналогичная тенденция - увеличение доли штаммов с высоким уровнем признаков при значительных изменениях в экосистеме кишечника была отмечена у штаммов К. pneumoniae и С. freundii (рисунок 3, Б и В соответственно).

Обнаруженная связь между персистентными признаками бактерий и глубиной нарушений в микробиоценозе кишечника позволила рассматривать факторы персистенции в качестве маркеров дисбиотического процесса. На основании корреляции доли штаммов энтеробактерий с высокими значениями "антиинтерфероновой" активности и выраженности дисбиоза нами предложен и апробирован в клинических условиях скрининговый способ оценки состояния микробиоценоза кишечника.

Рисунок 4. Связь частоты выявления дисбиоза кишечника (ДБК) с вероятностью обнаружения "антиинтерфероновой" активности у штаммов фекальной микрофлоры.

Обозначения: 1 - острые кишечные инфекции; 2 - пиелонефрит; 3 - бессимптомная бактериурш; 4 - другие соматические заболевания.

"Антиинтерфероновый" тест, основанный на одновременном определении данного признака у всех колоний, выросших на питательной среде с препаратом человеческого лейкоцитарного интерферона при посеве разведения фекалий, оказался информативным: положительные результаты теста были отмечены

%

м

АИА"+

в 78.4±2.8% случаев (рисунок 4). И хотя эта величина оказалась близкой к определению кишечного дисбиоза "классическим" методом (81.2±2.7%), применение разработанного способа было более предпочтительным, так как в 2 раза сокращались сроки исследования.

Выявлено наличие антитрипсинового признака у штаммов кишечной палочки (92.6+5.1% культур), Klebsiella pneumoniae (100%), Klebsiella oxytoca (50.0%), Enterobacter cloacae (100%) и других энтеробактерий. Вероятно, это свидетельствует, что кроме системы "протеолитическая активность транзитор-ной микрофлоры [Трапезов Е. В. и др., 1992; Горская Е. М. и др., 1995] - анти-протеазный потенциал индигенной микрофлоры [Кардашова Е. В. и др., 1996]" существует и другой вариант: "лротеолитический потенциал организма хозяина и индигенных облигатно-анаэробных микроорганизмов - антипротеазная активность условно-патогенной факультативно-анаэробной микрофлоры".

У производственных штаммов широко используемых пробиотиков (колибакгерин, бактисубтил и лактобактерин) были определены персистентные свойства, а также установлены различия в популяционной структуре по антили-зоцимной, "антиинтерфероновой" и антикомплементарной активностям.

У всех штаммов выявлена способность к инактивации лизоцима. Уровень АЛА (по данным кинетического метода) убывал в ряду "лактобактерин -бактисубтил - колибактерин". Среднее значение АЛА (чашечный метод) для Е. coli М-17 составило 1.30±0.11 мкг/мл, для В. cereus IP 5832 - 2 мкг/мл. Популяция Е. coli М-17 в отличие от В. cereus IP 5832 была гетерогенна по антилизо-цимному признаку: 70% клонов имели АЛА 1 мкг/мл, 30% - 2 мкг/мл. Как колибактерин, так и бактисубтил обнаружили низкие значения "антиинтерфероновой" активности - 1 ед.

Антикомплементарный признак варьировал от 0 до 12.9 анти-СН50 у ко-либактерина, и от 0 до 12.5 анти-СН50 у бактисубтнла. Средние значе-ния составили для колибактерина и бактисубтнла соответственно 6.4811.03 и 6.0810.70 анти-СН50. Антикомплементарная активность лактобацилл находилась в диапазоне от 0 до 7.45 lg анти-ЛЕК, средний уровень составил 3.09+0.74 lg анти-ЛЕК (таблица 1).

Учитывая, что размножение производственных штаммов пробиотиков и колонизация ими соответствующей экониши происходит in vivo в микроаэро-фильных и анаэробных условиях пищеварительного тракта, определенный интерес представляло изучить влияние анаэробиоза на антикомплементарную активность колибактерина и бактисубтнла.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что условия анаэробиоза не оказали существенного влияния на средний уровень признака. Однако был обнаружен разнонаправленный характер изменений во внутри-штаммовом разнообразии и выровненности штамма по антикомплементарной

активности для разных пробиотиков (таблица 1). Увеличение индексов Симпсона и Шеннона в опыте с колибактерином было связано с возрастанием равномерности в количественном соотношении разных групп. Снижение индексов Симпсона и Шеннона, характеризующих популяцию штамма бактисубтила, обусловлено уменьшением внутриштаммового богатства, а также снижением выровненности признака. Указанные отличия могут быть связаны как с происхождением штаммов (естественный изолят индигенной флоры или генетический мутант), так и с различными механизмами адаптации к абиотическим факторам в связи с типом дыхания (факультативный анаэроб или аэроб).

Таблица 1.

Характеристика антикомплементарного признака и индексов разнообразия у производственных штаммов пробиотиков

Показатель 1 Колибакте-рин аэробный Колибакте-рин анаэробный Бактисуб-тил аэробный Бактисуб-тил анаэробный Лакто-бактерин

АКА (М±ш) 6.4811.03 анти-СН50 6.14±0.98 анти-СН50 6.08±0.70 анти-СН50 7.09±0.82 анти-СН50 3.09±0.74 1« анти-ЛЕК

с*% 69.39 69.42 50.49 34.66 104.38

Ъ 4.00 4.17 3.51 2.38 2.82

Е 0.80 0.83 0.70 0.79 0.56

Н 1.47 1.49 1.39 0.94 1.24

} 0.91 0.93 0.87 0.86 0.77

Условные обозначения: Су- коэффициент вариабельности; Б - индекс разнообразия Симпсона; Е - индекс выровненности Симпсона; Н - индекс разнообразия Шеннона; ] - индекс выровненности Шеннона.

Полученные данные представляют интерес с точки зрения их колонизационного потенциала, поскольку известно, что штаммы микроорганизмов с высокими показателями АЛА, АИА или АКА переживают в организме более длительное время. Гетерогенность популяции по персистентным свойствам также способна влиять на колонизацию биотопа: однородность микробного сообщества, свидетельствующая о высокой биологической плотности культуры, входящей в препарат, сказывается на снижении адаптивных механизмов всей популяции микроорганизмов. Кроме того, наличие факторов персистенции у производственных штаммов пробиотиков важно и в плане передачи этих признаков от пробиотиков условно-патогенным микроорганизмам, учитывая плазмидный характер детерминации некоторых персистентных признаков.

Изучено влияние трех пробнотиков (колнбактерлна, бактисубтила и лак-тобактерина) на факторы персистенцин 8 видов энтеробактерий. В качестве исследуемых микроорганизмов были выбраны виды энтеробактерии, наиболее часто встречающиеся при дисбиотическнх процессах: Е. coli, К. pneumoniae, К. oxytoca, Е. cloacae, Е. agglomerans, С. freundii, С. diversus и Н. alvei. Сокультиви-рование проводили в бульонных средах с адаптированными к питательной среде суточными агаровыми культурами производственных штаммов: Е. coli М-17 из колнбактерлна, В. cereus IP 5832 из бактисубтила илактобациллами излактобак-тсрина.

При анализе регулирующей функции данных бактерийных биопрепаратов на антилизоцимную и "антнпптерфероновую" активности энтеробактерий не удалось выявить характерных профилей изменения указанных признаков. Ни изменение соотношения количества бактериальных клеток, ни увеличение времени сокультивирования или модификации режима совместного выращивания исследуемых микрорганизмов не позволила оценить влияние пробнотиков на АЛА и АИЛ энтеробактерий. Вероятно, "индифферентность" производственных штаммов связана с низкой чувствительностью использованных методов регистрации персистентных признаков.

Таблица 2.

Характер влияния производственных штаммов пробнотиков на антикомплементарную активность энтеробактерий фекальной микрофлоры при совместном

культивировании in vitro

Вид микроорганизма Бактерийный биологический препарат

Колибактерии Бактисубтил Лактобактерил

Escherichia coli TT t t

j Klebsiella pneumoniae 1 t tt

Klebsiella oxytoca TT tt u

Enterobacter cloacae — 1 tt

Enterobacter agglomerans TT u HO

Citrobacter freundii TT tt IIO

Citrobacter diversus u u HO

Hafnia alvei — u tt

Условные обозначения: тт - повышение ЛКА у 100% штаммов; Т - повышение АКА у > 60% штаммов;--отсутствие изменений уровня ЛКА у > 60% штаммов; 4-4 - снижение ЛКА у 100% штаммов; -I - снижение ЛКА у > 60% штаммов; НО - не определено (антагонистическая активность).

Несколько иная картина была нами получена при изучении способности производственных штаммов пробнотиков влиять на антикомплементарную активность энтеробактерий фекальной флоры при дисбиозе (таблица 2).

Колибактерин оказывал преимущественно ингибирующее влияние на АКА штаммов С. diversus и К. pneumoniae; стимулировал АКА у Е. coli, К. oxytoca, С. freundii, Е. agglomerans и не приводил к существенному изменению уровня признака у Н. alvei и Е. cloacae. Бациллосодержащий препарат бактисуб-тил приводил к снижению АКА более чем у половины штаммов Е. agglomerans, С. diversus, II. alvei и Е. cloacae; стимулировал АКА у подавляющего большинства С. freundii, К. oxytoca, К. pneumoniae и Е. coli. Лактобацнллы из лактобакте-рина вызывали увеличение АКА у К. pneumoniae, Е. cloacae, II. alvei, Е. coli и снижали АКА у К. oxytoca.

Эти данные свидетельствуют, что антагонистическая активность производственных штаммов in vitro, вероятно, не может служить единственным критерием отбора эффективного пробиотика. Действие пробиотика in vivo, вероятно, может приводить к селекции как устойчивых к влиянию производственных 1 штаммов культур микроорганизмов, так и клонов с более высокими, чем средне-популяционный уровень, значениями'персистентных признаков, и, связанному с этим, длительному и трудно поддающемуся коррекции переживанию условно-патогенных микроорганизмов.

Оценивая фактический материал в целом, следует выделить три главных момента.

Во-первых, факторы персистенции широко распространены у различных представителей кишечной микрофлоры. Частота встречаемости и степень выраженности персистентиых свойств тесно связаны с характером микроэкологических нарушений.

Во-вторых, производственные штаммы пробиотиков отличаются как в плане экспрессии отдельных персистентиых признаков, так и по структуре популяций. Факторы персистенции должны быть включены в критерии отбора и контроля штаммов, используемых для конструирования биопрепаратов.

В-третьих, различные пробиотики по-разному влияют на персистентные признаки микроорганизмов транзиторной и, вероятно, инднгенной микрофлоры. Данное обстоятельство необходимо принимать во внимание при обосновании показаний, доз и схем применения препаратов-пробиотиков с целью их микроэкологической адекватности.

ВЫВОДЫ

1. Изучение биохимической активности эшерихий позволило выделить две биогруппы кишечных палочек: активные и неактивные Е. coli. Частота встречаемости представителей каждой биогруппы различна при разных степенях дисбиоза; доля неактивной кишечной палочки возрастает по мере прогрессиро-вания дисбиотических нарушений.

2. Фекальные штаммы энтеробактерий, выделенные при дисбиозе кишечника, имеют набор персистентных свойств (антилизоцимная, "антиинтерфероновая", антикомплементарная активности). У условно-патогенных энтеробактерий выявлены видовые особенности - более высокие показатели распространенности средних и высоких значений признаков по сравнению со штаммами кишечной палочки.

3. Доля штаммов кишечной палочки с высоким уровнем АЛА, АИА и АКА является отражением степени выраженности дисбиоза: частота встречаемости штаммов с высокой экспрессией персистентных признаков возрастает с увеличением нарушений в экосистеме кишечника.

4. У энтеробактерий фекальной флоры обнаружен новый признак - способность к инактивации протеолитического фермента пищеварительного тракта трипсина, отражающий микроэкологические нарушения в кишечнике.

5. Факторы персистенции микроорганизмов фекальной флоры являются маркерами дисбиотических процессов, что позволило разработать способ скри-нинговой диагностики нарушений микробиоценоза кишечника.

6. Установлены особенности популяционной структуры производственных штаммов колибактерина, бактисубтила и лактобактерина по персистентным признакам и определено их влияние на факторы персистенции энтеробактерий. Выявлен неоднозначный характер изменений в зависимости от используемого препарата и видовой принадлежности тестируемых штаммов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Скрининговая диагностика дисбиоза кишечника //Журн. микробиол.-1994.- Приложение (август-сентябрь).- С. 71-74 (соавт. Л. С. Зыкова, М. Е. Кон-нова).

2. Дисбиотические нарушения микрофлоры кишечника при нефропатиях у детей //Тезисы докладов XII итоговой конференции "Молодые ученые - здравоохранению".- Оренбург: ОГМА, 1995.- С. 20-21 (соавт. Г. Г. Громова, А. И. Дьякова).

3. Антикомплементарная активность производственного штамма Bacillus cereus IP 5832 и энтеробактерий при их совместном культивировании //Журн. микробиол,- 1996,- № 3,- С. 91-93 (соавт. IO. А. Брудастов, А. Н. Брудастов).

4. Факторы персистенции энтеробактерий фекальной флоры при дисбио-зе кишечника //Журн. микробиол.- 1996.- № 3,- С. 96-98 (соавт. Ф. Г. Гильмут-динова, С. В. Фомичева).

5. Популяционная характеристика факторов персистенции кишечных палочек, выделенных из различных экониш //Бюл. экспер. биол. - 1996.- № 9.- С. 356-358 (соавт. О. В. Бухарин, Н. В. Немцева).

6. Дисбактериоз у больных с хирургической патологией желчевыводя-щих путей //Актуальные вопросы хирургии.- Сб. научн. работ факультетской хирургической клиники, посвященный 100-летию со дня рождения проф. Кора-бельникова И. Д.- Челябинск, 1996.- С. 36-40 (соавт. Ф. Г. Гильмутдинова, А. А. Третьяков).

7. Способ выявления кишечного дисбиоза и кишечной инфекции //Заявка на изобретение № 93034438/14 (034024).- Положительное решение ВНИИГПЭ о выдаче патента на изобретение от 17.04.96. (соавт. О. В. Бухарин, Л. С. Зыкова, М. Е. Коннова, В. Ю. Соколов, О. Е. Челпаченко).