Люминесцентный микробиотест: возможные пути его оптимизации и расширение сферы использования

Шмырина, Ирина Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Люминесцентный микробиотест: возможные пути его оптимизации и расширение сферы использования
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Люминесцентный микробиотест: возможные пути его оптимизации и расширение сферы использования"

На правах рукописи

РГ6 0*-"

? 5'СЕН Ш

ШМЫРИНА Ирина Леонидовна

ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МИКРОБИОТЕСТ: ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ ЕГО ОПТИМИЗАЦИИ И РАСШИРЕНИЕ СФЕРЫ

ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 2000

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, Пермь

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Р.А.Пшепичнов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Э.С.Горовиц,

кандидат биологических наук В.Д.Семенова

Ведущая организация - Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук, Оренбург

на заседании диссертационного совета Д 200.46.01 Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г.Пермь, ул. Голева, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Автореферат разослан Об... июня 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Защита состоится М. июля 2000 г, в часов

Е о р

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Увеличение антропогенной нагрузки на окружающую среду выдвигает в число первоочередных задач разработку и применение простых, надежных, экспрессных и общедоступных способов контроля за состоянием природы (Леванова и др., 1999). Биотестирование с использованием в качестве микробиодетекторов люминесцентных бактерий позволяет по реакции ингибирования свечения автоматически и реально учитывать эффекты суммирования, взаимоусиления, ослабления действия отдельных токсикантов и их смесей. Сущность данного подхода определяется тем, что независимо от конкретной точки действия ксенобиотиков (метаболические пути, генетический аппарат, мембрана бактериальной клетки), стехиометрическое соответствие числа молей субстратов, потребляемых в реакции люминесценции, обусловливает изменение интенсивности свечения клетки пропорционально токсичности образца (Постникова и др., 1992; Хрипач и др., 1998).

Интерпретация уровня люминесценции целых клеток более многогранна по сравнению с люциферазными ферментами клеточных экстрактов (Мег gh.cn, 1991). Широко представленные данные о влиянии индивидуальных химических соединений разных классов на люминесценцию бактерий в тесте <'<М1'сго1ох» (Кшгег е1 а/., 1990) с высокой степенью коррелируют с биотестами на основе эукариот (цит. по Хрипач и др., 1998).

В России аналогом таких люминесцентных тест-систем выступает лиофилизированный генно-инженерный биосенсор «Эколюм», разработанный на кафедре микробиологии МГУ им. М.В.Ломоносова под руководством профессора В.С.Данилова. Возможности отечественного препарата и других подобных сенсоров исследованы значительно хуже, отмечается недостаточная чувствительность к малым концентрациям тяжелых металлов (Хрипач и др., 1998) и другим классам соединений (Постникова и др., 1992; Попова, Калачева, и др., 1994). Среди субпопуляций штамма регулярно регистрируют, так называемые, темновые варианты, частота возникновения и свойства которых, влияют на общий уровень свечения культур и сенсоров, получаемых на их основе. Тип и качество питательных сред существенно определяют вышеназванные штаммоспецифичные характеристики, что может сказаться на свойствах генсора (чувствительности люминесценции к токсикантам).

Это породило ряд вопросов, требующих дополнительного изучения итамма и препарата, условий воспроизведения теста. Постоянная необходимость исследования воздействия разного рода физических, шмических и биологических агентов на микроорганизмы обусловили топытки использования реакции ингибирования биолюминесценции для зешения нового круга вопросов.

Цель работы. На основе углубленного фенетико-популяционного анализа оптимизировать условия культивирования и стабилизации генно-инженерного штамма Escherichia coli lum+ для получения сенсора с улучшенными характеристиками и расширенной сферой его использования.

Основные задачи исследования

1. Морфо-физиологическая характеристика популяции генно-инженерного штамма Е. coli lum+ на примере его световых и темновых вариантов, изучение их биохимической активности и антибиотикорезистентности.

2. Сравнительная характеристика и подбор питательных сред, условий, оптимальных для развития культур, накопления биомассы и максимального свечения. Проведение направленной клоновой селекции вариантов с высоким и стабильным уровнем люминесценции.

3. Исследование факторов, способствующих повышению чувствительности люминесценции Е. coli lum+ к токсикантам. Определение температурного оптимума воспроизведения микробиолюминесцентного теста.

4. Расширение сферы применения реакции ингибирования свечения для оценки критических ситуаций при температурном и алкогольном шоке, а также для испытания антимикробных препаратов, в том числе антибиотиков, фаговой инфекции.

Научная новизна работы

Сравнительно исследованы динамика накопления биомассы, уровни общего и удельного свечения и чувствительность люминесценции к стандартным токсикантам Е. coli lum+ в условиях различных питательных сред и режимов выращивания. Показано, что клоновая селекция колоний на однотипной среде способствует получению культур с более стабильной общей и удельной люминесценцией. Определены факторы, влияющие на чувствительность Е. coli lum+ в соответствии со степенью ингибирования свечения.

Лиофилизация препарата проведена с использованием оригинального стабилизатора и режима сушки «Колибактерина». Разработаны подходы определения рабочей концентрации готового препарата, учитывающие уровень свечения и дозозависимость степени ингибирования биолюминесценции токсикантами в диапазоне средних значений шкалы «Биотокса-6». Основные положения включены в заявку на патент «СпосоС изготовления Микробиолюминесцентного Индикатора Токсичности (МИТ для определения загрязнения окружающей среды» (Приоритетна} справка № 2000302199 от 21 января 2000 г).

Показано, что биолюминесценция может быть дополнительны! критерием при оценке критических состояний культуры. Существуе-адекватное реагирование люминесцентной системы в ответ на физические химические (этанол, антибиотики) и биологические (фаговая инфекция воздействия.

Практическая значимость работы

Предложена схема оптимизации сенсора на основе люминесцентных бактерий и разработана технология получения препарата с лучшими индикационными свойствами.

Составлены технические условия на модифицированный сенсор «Микробиолюминесцентный индикатор токсичности» (ТУ 846-00104538050-00) и утверждены рекомендации по его применению «Наставления по применению препарата Микробиолюминесцентного Индикатора Токсичности - МИТ».

Проведенные исследования способствуют расширению сферы использования реакции ингибирования биолюминесценции.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертационной работы доложены на конференции молодых ученых-экологов Уральского региона «Современные проблемы популяционной, исторической и прикладной экологии», Екатеринбург, 1998; Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды - 98», Москва, 1998; Региональной конференции «Проблемы экологии Уральского региона», Оренбург, 1998; Региональной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 1999.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на <?2 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 таблицами и 34 рисунками; состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, приложения. Список литературы включает 208 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Структура популяции генно-инженерного штамма Е. coli lum+ определяется соотношением темнового и светящегося вариантов, имеющих особенности морфологии и физиологии. Свечение зависит от условий культивирования и типа среды. Чувствительность Е. coli lum+ к стандартным токсикантам в соответствии со степенью гашения свечения изменяется на разных стадиях развития культуры, зависит от температурного режима.

2. Разработанная схема оптимизации сенсора, используемого в люминесцентном микробиотестировании, позволяет получать препарат с более стабильными свойствами.

3. Реакция биолюминесценции служит показателем действия агентов физической, химической, биологической природы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты, материалы и методы исследований

Использованные штаммы. Е. coli lum+ (штамм, выделенный клоновой селекцией из штамма биолюминесцентной системы «Эколюм», разработанной в МГУ им. М.В.Ломоносова профессором Даниловым B.C.), Е. coli К 12 (дикий тип) предоставлен Ткаченко А.Г. (ИЭГМ УрО РАН). Основные среды, их ингредиенты. Мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный бульон (МПБ) (НПО «Биомед»), агар Эндо (НПО «Питательные среды»), питательный агар сухой (РПА), питательный бульон сухой (РПБ) (НИИ питат.сред), М9, хлористый натрий, глицерин, глюкоза, сахароза («Biotech», Пермь), желатиноль.

Стандартные токсиканты. цинк сернокислый (ZnS04x7H20), уксуснокислый кадмий (Cd(CH3C0OH)2x2H2O); нитрат свинца (Pb(N03)2) («чда», «Реахим», г.Ленинград). Навески солей растворяли в дистиллированной воде в концентрациях 1-10 мг/л в расчете на тяжелый металл.

Методы исследования. Культуральный анализ светящихся и темновых вариантов штамма проводился по классической схеме. Поверхность колоний исследовали фотометрическим методом (Пшеничнов и др., 1975; Лебединский и др., 1977). Биохимическая активность оценивалась на основании микротеста "Láchema" (Энтеротест 1 и 2 для дифференциации кишечных бактерий) (Lachema о.р., Brno, Chechoslovakia, "Chemapol", Praha). Антибиотикорезистентность определялась методом разведений и дискодиффузионным методом (Гинвенталь и др., 1982). Ультраструктура суточных культур исследовалась методами электронной микроскопии (Gosh et al.,1967).

Клетки Е. coli lum+ выращивали в условиях периодического культивирования. В качестве инокулята использовали суточную культуру со среды Эндо или МПА. Варианты опытов: а. Различные питательные среды: жидкие (МПБ, М-9, РПБ); твердые (Эндо, РПА, МПА). б. добавление в МПБ 0,4% глюкозы, 0,3% глицерина, в. внесение в МПБ антибиотиков: хлорамфеникол в концентрациях 0,1; 10; 1000 мг/л; канамицин - 0,1; 10; 1000 мг/л; бензилпенициллин - 102; 104; 106 ед/мл. Тепловой шок вызывали путем перенесения культур на соответствующих фазах развития на водяную баню (1ч) с температурой в пределах 40-60°С при встряхивании. Алкогольный шок воспроизводили добавлением к культуре 6, 8,10% этанола при 37°С с последующим его отмыванием через 1 час 20-минутным центрифугированием. Бактериофаг Коли жидкий вносили в МПБ с культурой в соотношении фапклетка приблизительно 10:1, культивирование проводилось на термостатированной качалке при 120 об/мин и 37°С.

В ходе опытов через 5, 15, 30 мин. и каждые 1-2 часа регистрировались оптическая плотность (ОД, ед.опт.пл.), общая (I, А) и удельная (1/ОД, А/ед.опт.пл.) интенсивность свечения 1мл пробы (опыты А-Е) (Биотокс-6),

относительная степень изменения свечения образца по сравнению с контролем (TMk-Io/Tkx 100%, где Ik - свечение контроля, 1о - свечение опыта). Т>0 свидетельствовала об ипгибировании люминесценции опытных культур, Т<0 - об ее стимуляции.

Определение чувствительности культуры по степени ингибирования свечения стандартными токсикантами проводилось в соответствии с «Методическими рекомендациями...» (1996). Количество жизнеспособных клеток вычисляли путем их высева на среду Эндо или МПА (Мейнелл и др., 1983), в случае необходимости регистрировали процент темновых колоний (частота возникновения темновых вариантов). Число фагов в фильтратах определяли методом бляшек (Методы общей бактериологии, 1983).

Отбор клонов осуществляли визуально (Стейниер и др., 1979) по размеру колоний и свечению. Проводилась сравнительная характеристика культур сенсора «Эколюм» и культур, прошедших клоновуга селекцию.

Лиофилизация проводилась по регламенту «Колибактерина» на базе НПО «Биомед» (Несчисляев, 1998).

Экспериментальные серии препарата МИТ использовались для оценки эффективности действия аугментина, Хилак Форте. С помощью реакции ингибирования биолюминесценции исследовались бактерицидные свойства желчи при хронических и обостренных холангитах.

Повторность трехкратная. Статистическая обработка проводилась с использованием программ Stat (описательная статистика, по критерию Стьюдента), Excel 5.0. В ряде описаний приведены данные типичного опыта, отражающего основные закономерности проведенной серии экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Морфо-фпзиологическая характеристика популяции генно-инженерного

штамма Е. coli lum+

По способности излучать свет популяция бактерий Е. coli lum+ качественно дифференцируется на два варианта: темновой (К) и обладающий способностью излучать свет.

Проведение культурального анализа показало, что колонии темнового варианта на среде Эндо отличаются большими размерами по сравненшо со светящимися. У обоих вариантов они были поверхностными, круглыми. На более поздних сроках у темнового варианта край колоний был ровным, у светящегося - слегка волнистым. Структура колоний однородная, консистенция мягкая. Исследование профилей негативов фотометрическим методом показало, что контуры обоих вариантов были волнистыми, через 36 ч у темнового варианта более широкого, уплощенного вида.

Результаты исследования ультраструктуры суточных культур позволили выявить, что оба варианта представляют собой палочки с закругленными концами. Двухслойная клеточная стенка извилистого

профиля является признаком грамотрицательных бактерий. Нуклеоид светящегося варианта занимал центральное положение в клетке, и был несколько вытянут вдоль продольной оси. Между клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной было заметно периплазматическое пространство либо в виде тонкого контура, либо увеличенное на полюсах у части клеток. На основании последнего в литературе высказывается предположение о локализации люциферазы в периплазматическом пространстве (Сальников и др., 1984; Кудрявцева и др., 1993).

Нуклеоид темнового варианта занимал центральное положение и был представлен тяжистой, грубоволокнистой структурой с компактными электронно-плотными образованиями на фоне просветленных участков. Возможно, в связи с этим у большего числа клеток по сравнению со световым вариантом на одном из полюсов отмечалось увеличенное периплазматическое пространство. Встречались лизированные клетки.

Результаты исследований биохимических особенностей темнового и светящегося вариантов генно-инженерного штамма Е. coli lum+ не выявили отличий между ними. Антибиотикочувствительность у Е. coli К12 и Е. coli lum" по 13 исследованным антибиотикам была одинакова. Светящиеся клетки отличались лишь полной устойчивостью к ампициллину и карбенициллину.

Эти наблюдения и ряд других, подробно изложенных в диссертации, позволили подтвердить принадлежность данного микроорганизма к группе Е. coli.

Динамика роста и свечения Е. coli lum+ на различных питательных средах

Генно-инженерные штаммы со встроенными генами lux обладают штаммоспецифичными особенностями роста и биолюминесценции, зависящими от не всегда идентифицированных компонентов питательной среды (Гительзон и др., 1984; Марквичев, Мельниченко и др., 1991).

В ходе опытов по исследованию динамики роста и свечения на синтетических и органических средах выяснилось, что культура на МПБ и РПБ достигала стационарной фазы гораздо быстрее, чем на М9, где рост продолжался и через 24 ч.

Люминесценции на М9 в первые часы имела минимальное значение (рис.1). Отмечен небольшой ее латентный период, а затем возрастание через 7 ч культивирования. Период индукции люминесценции на начальных фазах может контролироваться комплексно действием ингибиторов среды, индуцибельным синтезом а- и ß-субъединиц люциферазы и полипептидов редуктазы жирных кислот, синтезом автоиндуктора люминесценции (Meighen., 1991). Удельная люминесценция бактерий на М9 снижалась до перехода культуры в фазу стационарного роста. Это происходило, вероятно, вследствие лимитирования альдегидным субстратом, разобщения цепи переноса электронов на люциферазу (Егорова и др., 1998).

В то же время культуры на органических средах (МПБ и РПБ) характеризовались отсутствием явного латентного периода свечения, вероятно, обусловленного согласно Гительзон и др. (1984) наличием в них неидентифицированных автоиндукторов люциферазной реакции. Большее удельное свечение культуры на МПБ в первые три часа позволили рекомендовать ее для быстрого получения культур с высоким уровнем свечения. На полных средах быстрое затухание биолюминесценции наблюдалось после достижения высокой плотности популяции клеток, связанное, очевидно, с исчерпанием некоторых питательных субстратов и накоплением ингибирующих аутометаболитов в среде. Длительное поддержание клеток в подобных условиях приводит к накоплению клеток со сниженным уровнем биолюминесценции (Максимова, Попова и др., 1998).

Рис. 1. Динамика удельного свечения Е. coli lum+ на минеральной и органических средах: 1-МПБ, 2-РПБ, 3-М9.

На интенсивность свечения и рост люминесцентных бактерий влияют и дополнительные источники углерода, такие как глюкоза и глицерин. Последний в концентрации 0,3% оптимизирует рост и свечение природных вариантов светящихся бактерий (Гительзон и др., 1984). На развитие штамма Е. coli lum+ глицерин практически не оказывал влияния, но вызывал небольшую стимуляцию свечения в фазе адаптации и стационарной.

Добавление глюкозы в МПБ вызывало большее накопление биомассы по сравнению с контролем и стимуляцию свечения в течение первых 2-х часов роста. Все это, вероятно, обусловлено непосредственным включением глюкозы в энергетический метаболизм клетки. Но она вызывает катаболитную репрессию ряда оперонов, к их числу относится и lux-оперон светящихся бактерий (Данилов и др., 1990; Максимова, Попова и др., 1997) в

результате чего конкурентно подавляется люминесцентная система. С этим, вероятно, и был связан быстрый спад свечения культуры Е. coli lum+ в наших наблюдениях без последующего восстановления.

Периодическое культивирование Е. coli lum+ на плотной питательной среде Эндо показало, что на 16-18 ч роста культура достигала стационарной фазы развития. Максимальное удельное свечение отмечалось на 6-8ч. Дальнейшее его небольшое снижение, вероятно, было связано с возрастанием доли темновых реакций при исчерпании субстратов люциферазной реакции (восстановленного флавина и альдегида) (Егорова и др., 1998). Появления и дальнейшее размножение клеток, потерявших способность излучать свет (K-вариантов), по-видимому, и обусловили падение удельного свечения культуры в целом через 8 ч.

Для поддержания рекомбинантных штаммов с высоким уровнем люминесценции необходимо управлять структурой популяции и специально подбирать условия культивирования. Исследования соотношения двух вариантов (светящего и темнового) в популяции Е. coli lum+ при пассажах на разнотипные и однотипные среды показали, что частота возникновения темновых вариантов зависит от степени сходства используемой среды в пассажах. Так, число колоний, утративших свечение, возрастало в ряду Эндо-МПА-РПА (рис. 2). Если исходить из того, что возникновение К-вариантов связано с нарушениями метаболизма клетки, то, культуры с высоким и стабильным свечением, вероятно, можно получить путем постоянного пассирования на однотипной среде. Наименьший процент клеток, утративших свечение, на среде Эндо объясняется ее предварительным использованием при пересевах микроорганизмов, в ходе которого, очевидно, произошли адаптивные перестройки.

Результаты наблюдений позволили установить, что плотность культур также может определять частоту возникновения темновых вариантов (соответственно и удельное свечение культуры). На всех исследованных средах (Эндо, РПА, МПА) с увеличением разреженности колоний на чашках уменьшался процент K-вариантов, возможно, из-за снижения влияния ингибирующих, токсических веществ, продуктов метаболизма (Гительзон и др., 1984) или исчерпания кислорода.

Необходимость кислорода для роста и свечения культуры Е. coli lum+ была показана в условиях интенсивного массообмена, где культура развивалась быстрее, достигала больших значений биомассы и характеризовалась более высоким уровнем люминесценции по сравнению с культурой в микроаэрофильных условиях.

Нарастание биолюминесценции в обоих случаях происходило при достижении одних и тех же значений количества биомассы. Это связывают с синтезом какого-то минимального количества субстрата люциферазной реакции, которое зависит от плотности растущей культуры клеток (Чиркова и

др., 1991), или наличием видоспецифического индуктора люминесценции (Meighen, 1999).

Рис. 2. Частота возникновения темновых вариантов Е. coli lum+ при пересевах с агара Эндо на разнотипные среды.

У темновых вариантов генно-инженерного штамма отмечено свойство спонтанного появления колоний, способных светиться, характерное для светящихся бактерий. Больший процент колоний с исходным фенотипом на среде Эндо по сравнению с МПА и РПА, вероятно, свидетельствовал о более благоприятных условиях для микроорганизмов, которые пассируются на однотипных средах (адаптации и формирование оптимального фенотипа для среды). Таким образом, использование в качестве питательного субстрата среды Эндо и постоянное на ней культивирование ведет к более стабильному и высокому свечению клеток

Все вышесказанное было учтено нами при выборе сред и условий для поддержания лабораторных культур и использования генно-инженерного штамма Е. coli lum+ при конструировании соответствующего сенсора.

Некоторые пути селекции культуры по признаку чувствительности люминесценции к токсикантам и попытка ее последующей стабилизации

Исходя из результатов предыдущих наблюдений, проведение в течение двух лет пассирования наиболее крупных, интенсивно светящихся колоний на среде Эндо показало, что через 40 пассажей микроорганизмов культура Е. coli lum+ ДС (дополнительно селекционированная) характеризовалась

большими показателями общего и удельного свечения, меньшим числок темновых вариантов при практически одинаковых значениях биомассы ш сравнению с культурой «Эколюм» (табл. 1). По данным других авторо] селекцией клонов светящихся бактерий можно значительно стабилизировал их свечение (Ulitzur et al., 1978; Weiser et al., 1981). Приведенные результата подтверждают возможность использования вышеуказанного подхода и да генно-инженерного штамма Е. coli lum+.

Таблица 1.

Сравнительная характеристика суточных культур сенсора «Эколюм» и Е. col, lum+ ДС, выращенных на среде Эндо

Показатели Культура из сенсора 'Эколюм", КультураЬ'.со// 1шп+ (40 пассажей)

ФЭК, ед.опглл. 1,32+0,06 р<0,05 1,30±0,06 р<0,05

Общее свечение, А 337380+28100 р>0,05 427536+711 р<0,05

Уд. свеч, А/едоптях 259591+50600 р>0,05 328874±15700 р<0,05

Частота возникновения темшвыхвариашов,% 13,3+4,0 р>0,05 0,57±0,4 р>0,05

Ишибирование свечения ТоБО) 0,5мг/л, % 13,7+3,9 р>0,05 17,4+2,4 р>0,05

Ингибирование свечения 7п504 1,0мг/л.% 37,8+11,1 р>0,05 42,5+1,1 р<0,05

По ингибированию свечения отмечалась повышенная чувствительност культуры ДС к стандартным токсикантам по сравнению с исходно культурой «Эколюм». Согласно Поповой и др. (1994), выбирая оптимальны условия выращивания и обработки тест-объекта, можно повысить поре чувствительности биолюминесценции к токсическим соединениям.

В ходе наблюдений выяснилось, что степень ингибировани свечения Е. coli lum+ стандартными токсикантами зависит от фаз: периодического культивирования, дополнительного источника углерода энергии (Попова и др., 1994). Отмечено повышение чувствительное! люминесценции к токсикантам в период адаптации (в первые час культивирования) и к концу стационарной фазы. Добавление же в состг среды глюкозы и глицерина вызывало более сильное ингибироваш свечения цинком, причем в случае глюкозы действие было 6оле выраженным (рис. 3).

Степень гашения люминесценции токсикантами повышалась в десятки раз, особенно в первые часы культивирования, и обнаруживала более четкие концентрационные зависимости после отмывания культуры от метаболитов. Положительное влияние вышеуказанных процедур на признак чувствительности свечения бактерий было использовано в схеме оптимизации сенсора на этапе активации.

Возраст культуры, ч

Рис. 3. Чувствительность люминесценции Е. coli lum+ к токсиканту (Z11SO4 -7,5мг/л) в процессе периодического культивирования на разных питательных средах: 1 - МПБ, 2 - МПБ+глюкоза, 3 - МПБ+глицерин.

Помимо дополнительных источников углерода и энергии и физико-химические условия, в частности температура выращивания, вероятно, оказывают влияние на физиологические характеристики культуры, чувствительность люминесценции к токсикантам. Тем более что в данном случае идет речь о генно-инженерном штамме со встроенным lux-опероном морских светящихся бактерий, имеющих температурный оптимум развития в диапазоне 10-30°С (Гительзон и др., 1984).

Исследования показали, что удельное свечение растущих клеток рекомбинанта было максимальным при температурах оптимальных для донора lux оперона (20°С) и значительно снижалось при повышении температуры в зону, оптимальную для клеток-реципиента (37°С). Причин этому может быть две. Во-первых, унаследованный от донора преимущественный синтез изоформ ферментов люциферазного комплекса с оптимумом действия 20°С. Во-вторых, частичная термоинактивция лтоциферазы с ростом температуры выращивания культуры и индикации токсикантов (30, 37°С).

При рассмотрении данного вопроса следует учитывать оптимальные условия для реципиента, что может оказать влияние на сенсорных свойствах культуры. Результаты проведенных исследований выявили, что при увеличении температуры возрастала чувствительность люминесценции клеток ко всем концентрациям испытанных токсикантов (рис. 4). Возможное объяснение этого явления заключается в том, что происходит термоинакгивация люциферазы. Интенсификация обмена веществ клеток при увеличении температуры среды до оптимальных для реципиентов 1их-оперона делает их более чувствительными к действию неблагоприятных, в том числе токсических факторов.

Рис.4. Чувствительность люминесценции суточной культуры Е. coli lum+ к

стандартным токсикантам при различных температурных условиях выращивания и индикации токсикантов: 1,2, 3 - Z11SO4 (0,5; 2,5; 5,0 мг/л); 4 -Pb(N03)2 (0,5 мг/л); 5 - Cd (СН3СОО)2 (1,5 мг/л).

Использование в экологическом мониторинге лиофилизированных препаратов бактерий обусловили соответствующие исследования. Высушивание группы бактерий, обладающих способностью свечения, требует индивидуального подхода в разработке условий сублимации применительно к конкретным штаммам (Выпияч и др., 1995).

Результаты исследований выявили, что общее свечение бактери* незначительно снижалось в ходе вышеуказанного процесса. Вероятно положительную роль в сохранении этого свойства оказывают защитная сред; с определенным составом и соотношением компонентов: желатиноль сахароза (70%), хлористый натрий (0,9%) (1:2:7), а также использован» режима сушки «Колибактерина» (Несчисляев, 1998).

На основании проведенных исследований основные, оригинальные приемы (дополнительная селекция, этап активации сенсора, подтитровка его рабочей концентрации) были суммированы и представлены в виде схемы. Большая часть положений включены в заявку на патент «Способ изготовления Микробиолюминесцентного Индикатора Токсичности (МИТ) для биоиндикации загрязнения окружающей среды».

Схема.

Стадии и этапы оптимизации люминесцентного сенсора I. Подготовка штамма

II. Получение препарата

III. Анализ и стандартизация готового препарата

В соответствии со схемой были изготовлены экспериментальные серии препарата, которые по предварительным данным имели ряд преимуществ при сравнении с исходным препаратом «Эколюм», что указывает на успешность реализации предложенного принципа оптимизации. Свечение культур в рабочем разведении было не менее 100000А на фоне соответствия дозы токсиканта и степени угнетения им свечения в диапазоне средних значений Т (%) Биотокса.

Моделирование ряда критических условий для Е. coli lum+ и возможные пути расширения сферы применения реакции ингибировання биолюминесценции.

Центральное место участников реакции биолюминесценции в метаболизме клетки открывает широкие возможности использования люминесценции при изучении физиологии клетки (Данилов и др., 1990). Уровень свечения может характеризовать общий физиологический статус организма и его изменение под влиянием антибактериальных факторов.

Исследования показали, что при повышении температуры в диапазоне 40-60°С уровень свечения закономерно снижался, причем это наблюдалось уже с первых минут температурного воздействия и совпадало с торможением скоростей развития и гибелью клеток.

^ h В i; M £ 4 s 3 , £ 3 S . 2 К 3/^ W5 6 ______-—e

и 2 о

л 5 1 *0

0 2 4 6 8 10 12 14 Возраст культуры, ч 16

Рис.5. Влияние температур на удельное свечение культур Е. coli lum+: 1 -контроль (37°С), 2 - 40°С, 3 - 45°С 4 - 50°С, 5 - 54°С, 6 - 60°С. Стрелкой указан срок действия повышенных температур.

У доноров lux-генов при температуре 45°С весь белок инактивируется необратимо, в том числе и люцифераза (Tyulkova et al., 1996). У Е. coli lum+ отмечается больший диапазон температур, при которых отсутствует необратимая денатурация. Так, вплоть до 54°С, после прекращения воздействия теплового шока (ТШ) биолюминесценция клеток возвращалась на исходный уровень, сравнимый с контролем. Только при 60°С падение свечения до фоновых значений имело самый острый и необратимый характер. Это позволяет предположить участие белков теплового шока (БТШ) в защите люциферазы при повышенных температурах (Леонтьева и др., 1996; Dolan et al., 1992; Kleine/ al., 1998).

Культуры реагировали на прогревание в диапазоне указанных выше температур уменьшением интенсивности биолюминесценции, как в фазе ускорения роста, так и на стационарной. Судя по уровшо ингибирования свечения, первичный ТШ при 50°С не формировал выраженных адаптивных реакций, влияющих на люминесценцию бактерий при повторном ТШ.

Исследования влияния этанола (агента химической природы) на биолюминесценцию культуры К coli 1шп+ подтвердили большое сходство ответа с ТШ и выявили все закономерности, отмеченные для свечения при воздействии повышенных температур.

В связи с широким использованием антибиотиков для лечения и профилактики инфекционных заболеваний и учитывая возможность привыкания микроорганизмов к их действию, существует постоянная необходимость выявления, синтеза, испытания и отбора новых, более эффективных препаратов, обладающих антимикробным действием.

Среди антибиотиков были выбраны канамицин, хлорамфеникол как агенты, соответственно обладающие преимущественно бактерицидным или бактериостатическим действием по отношению к II coli lum+, а также бензилленлциллин - антибиотик, к которому штамм проявлял устойчивость.

Исследования динамики роста и свечения К coli lum+ при добавлении канамицина показали соответствие между его концентрацией и замедлением роста, гибелью бактерий, что сопровождалось ингибированием биолюминесценции. При действии 0,1 мг/л канамицина удельное свечение падало незначительно. Более высокие концентрации антибиотика 10 и 1000 мг/л вызывали заметное гашение люминесценции через 5 ч без последующего восстановления (рис. 6).

Несмотря на бактериостатический характер действия хлорамфеникола, что подтверждалось сравнимым с контролем числом КОЕ/мл (Ю6) после суточного контакта, по ингибированию свечения регистрировалось и его неблагоприятное воздействие на клетки К coli 1шп+ в высоких концентрациях, где люминесценция бактерий через 24 ч приближалась к уровню фонового. В остальных же вариантах удельное свечение находилось на уровне контроля и даже немного превышало его.

Динамика свечения, накопление биомассы и количество КОЕ/мл контрольных и опытных вариантов практически не отличались в среде с бензилпенициллином. Таким образом, по ингибированию свечения можно с высокой степени точности определить наличие, уровень влияния антибактериального препарата на представителей вида К. coli.

Бактериостатические и бактерицидные агенты неизменно подавляют биолюминесценцию, что было подтверждено при испытании таких препаратов, как аугментин, Хилак Форте и других.

Рис. 6. Влияние канамицина на удельное свечение культуры Е. coli lum+ : 1 -0,1 мг/л канамицина; 2-10 мг/л канамицина; 3.- 1000 мг/л канамицина.

В медицинской практике при воспалительных инфекциях в случае их микробной этиологии, где одними из наиболее часто встречающихся микроорганизмов являются энтеробактерии, успешно используется фаговая инфекция. При исследовании динамики биолюминесценции Е. coli lum+ в данных условиях, отмечался сложный ответ. Ингибирование свечения культуры через 2,5 ч совпадало с высоким содержанием бактериофагов и падением ее оптической плотности.

Таким образом, нами показано, что использование генно-инженерного штамма Е. coli lum+ со встроенными lux генами позволяет экспрессно регистрировать перестройки общего метаболизма клеток при воздействии агентов различной природы по изменению свечения.

Применение теста ингибирования люминесценции для исследования антибактериальных свойств биологических жидкостей, в частности желчи, дает возможность дифференцировать ее бактерицидные свойства при хронических и обостренных холециститах, а также холангитах. При этом стимуляция и ингибирование свечения совпадают с относительно высоким (более 78,9 мкмоль/мл мин) и низким (менее 56,8 мкмоль/мл мин) содержанием в желчи каталазы, соответственно. Реакция гашения биолюминесценции позволяет диагностировать бактерицидные свойстве желчи и прогнозировать развитие гнойного холангита.

Заключение

Микробиотесты на основе бактерий, обладающих способностью свечения, характеризуются быстродействием и высокой чувствительностью.

Существенным препятствием их дальнейшего внедрения является нестандартность выпускаемых сенсоров. В этих условиях типизация, дополнительное исследование штамма, использование дифференциально-диагностических сред для постоянного искусственного отбора обеспечили получение клонов Е. coli lum+ с лучшим и более стабильным свечением. Определенный срок культивирования на полных средах, температурный режим, условия интенсивного массообмена, удаление метаболитов, мягкие условия сушки способствовали сохранению, в некоторых случаях улучшению свойств сенсора.

Получение более стабильных культур и препаратов Е. coli lum+ открывает широкие возможности их применения в скрининговых исследованиях загрязнения окружающей среды и создания комплекса тестов, сочетающих традиционные методы на основе индикаторных штаммов Escherichia coli и способы с использованием их гешю-инженерных штаммов для разностороннего контроля качества среды обитания.

По нашим данным, бактериальные системы с генами свечения в качестве тест-объектов достаточно полно отражают влияние различных факторов на биологическую систему в целом и могут служить основой дальнейшего расширения сферы применения люминесцентного микробиотеста.

Выводы

1. Среди изученных питательных сред установлено, что среда Эндо обеспечивает меньшую частоту возникновения темновых вариантов и более стабильное свечение культуры Е. coli lum+, вероятно, в результате прохождения адаптивных физиологических перестроек и лучшего соответствия обменных характеристик клеток качеству среды обитания. Полные органические среды в условиях аэрации формируют оптимальное соотношение уровня биомассы и свечения, способствуя стабильному выявлению действия токсикантов.

2. Показано, что в период адаптации и стационарной фазы роста увеличивается степень ингибирования свечения Е. coli lum+ поллютантами. Отмечается более высокая чувствительность люминесценции культур, выращенных и тестированных при температуре, оптимальной для клеток-реципиента (37°С). Максимальная биолюминесценция регистрируется при более низких температурах, типичных для клеток-донора lux-оперона.

3. Расширен круг химических и абиотических факторов, влияние которых регистрируется и в динамике описывается по реакции ингибирования микробиолюминесценции. Впервые показано, что повышение температуры и присутствие этанола экспрессно выявляются по гашению свечения. Подтвержден градиентный тип реакции на данные факторы.

4. Впервые выявлено соответствие между чувствительностью сенсора на основе культур Е. coli lum+ к широкому спектру антибиотиков и степенью ингибирования ими биолюминесценции. Исследования динамики свечения при действии новых антибиотиков (аугментина), пробиотиков и фаговой инфекции свидетельствуют о возможности и целесообразности применения рекомендуемого теста для контроля качества средств лечения, профилактики коли инфекций.

5. Разработана схема оптимизации сенсора, предусматривающая этапы дополнительной селекции штамма, активации, подтитровки рабочей концентрации препарата. Эти положения отражены в заявке на патент, технических условиях и в утвержденном «Наставлении ...» по его применению.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Пшеничнов Р.А., Колотов В.М., Шмырина И.Л. Динамика развития генно-инженерного варианта Escherichia coli lum+ в разных питательных средах//Пермский медицинский журнал. - 1998,- Т.15, № 3,- С. 14-16.

2. Шмырина И.Л. Температурная зависимость чувствительности Escherichia coli lum+ ктоксикантам/ЯТермский медицинский журнал. - 1998-Т.15, № 4.- С. 26-28.

3. Пшеничнов Р.А., Колотов В.М., Шмырина И.Л. Экотоксикологический мониторинг природных вод Западного Урала и оценка качества их методом микробиолюминесценции//Междунар. конф. «Проблемы загрязнения окружающей среды ». - Тезисы докл. - 1998, Москва. - С. 161.

4. Шмырина И.Л. Возможные пути совершенствования экотоксикологического контроля в тесте микробиолюминесценции с культурой Escherichia coli 1иш+//Междунар. конф. «Проблемы загрязнения окружающей среды ». - Тезисы докл. - 1998, Москва. - С. 175.

5. Пшеничнов Р.А., Колотов В.М., Никитина Н.М., Шмырина И.Л. Экстремальные зоны. Динамика биолюминесценции Escherichia coli lum+ при тепловом шоке//Регион. конф. «Проблемы экологии Уральского региона». -Тезисы докл. - 1998, Оренбург. - С. 21-22.

6. Шмырина И.Л. Поиск путей стабилизации и лучшей экспрессии оперона lum сенсора Escherichia coli lum+//B сборнике: «Современные проблемы популяционной, исторической и прикладной экологии», Екатеринбург. - 1998. - С. 266-267.

7. Шмырина И.Л., Колотов В.М., Никитина Н.М. Экстремальные зоны. Динамика биолюминесценции при этаноловом шоке культуры Escherichia coli 1ига+//Регион. конф. молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии». - Тезисы докл. - 1999, Пермь. - С. 114-115.

8. Шмырина И.Л. Оценка бакгериостатических и бактерицидных свойств антибиотиков по гашению биолюминесценции Escherichia coli 1ит+//Регион. конф. молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии». - Тезисы докл. - 1999, Пермь. - С. 112-113.

9. Пшеничное Р.А., Колотов В.М., Никитина Н.М., Куксина С.А., Лялина О.Г., Шмырина И.Л. Мониторинг общей токсичности природных вод и оценка их очистки методом микробиолюминесценции//Экология. -1999. -№3,-С. 228-230.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шмырина, Ирина Леонидовна

Основные обозначения и сокращения

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Феномен биолюминесценции, его механизм и связь с общим метаболизмом клетки - основа люминесцентных микробиотестов.

1.2. Фенетико-популяционный анализ реципиента и возможных доноров /шг-оперона. Свечение в различных условиях обитания.

1.3. Возможные пути оптимизации сенсоров на основе люминесцентных бактерий.

1.4. Влияние критических условий на свечение люминесцентных бактерий. 'N>; •

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Морфо-физиологическая характеристика популяции генно-инженерного штамма Escherichia coli lum+.

3.2. Динамика роста и свечения Escherichia coli lum+ на различных питательных средах.

3.3. Некоторые пути селекции культуры по признаку чувствительности люминесценции к токсикантам и попытка ее последующей стабилизации.

3.4. Воспроизведение ряда критических состояний для Escherichia coli lum+ и возможные пути расширения сферы применения реакции ингибирования биолюминесценции. g9 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 119 ВЫВОДЫ 12з

Основные обозначения и сокращения

А . - относительные единицы «Биотокса-6» АТФ - аденозинтрифосфат , АШ - алкогольный шок | ' БОЕ ^ - бляшко-образующие единицы БТШ - белки теплового шока БХШ - белки холодового шока ГХЦГ - гексахлорциклогексан ДГТ - дегидрогеназы ДС - дополнительная селекция Е -люцифераза ЖКТ - желудочно-кишечный тракт ИТ - индекс токсичности К - темновой вариант КОЕ - колонии образующие единицы ЛПС - липополисахариды

МИТ - Микробиолюминесцентный Индикатор Токсичности

МПК - минимальная подавляющая концентрация

ПАВ - поверхностно-активные вещества

ПДК - предельно допустимая концентрация

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ТШ - тепловой шок

Ф.р. - физиологический раствор

РМИ - флавинмононуклеотид

МАО(Р)- никотинамидадениндинуклеотид(фосфат)

Ьу - свет

Введение Диссертация по биологии, на тему "Люминесцентный микробиотест: возможные пути его оптимизации и расширение сферы использования"

Актуальность

Достижением XX века является необычайно быстрое развитие промышленности, оборотная сторона которого - возрастающее загрязнение окружающей среды химическими соединениями. Многие из них обладают опасными для живых организмов токсическими, мутагенными и канцерогенными свойствами (Хрипач и др., 1998). Хотя за период 1992-1997гг. общий объем выбросов в РФ стабилизировался и даже снизился из-за резкого спада промышленного производства, но старение существующих очистных сооружений, малые вложения в их строительство и модификацию неизменно увеличивают антропогенную нагрузку на окружающую среду (Онищенко, 1997).

Это выдвигает в число первоочередных задач разработку и применение простых, надежных, экспрессных и общедоступных способов контроля за состоянием природы (Леванова и др., 1999). В целом необходимо решить что, как и чем контролировать.

Во всем мире ведутся работы по определению наиболее значимых загрязняющих факторов и созданию общедоступных средств для измерения их концентраций. Но к 1997 году число зарегистрированных химических соединений уже превысило 13 миллионов, по литературным данным около 10% из них обладают выраженным обще- и генотоксическим действием на биоту (Пшеничнов и др., 1990), более 300.000 находятся в обращении на международном торговом рынке (Румянцев и др., 1997).

До недавнего времени основным, а чаще и единственным путем определения токсикантов в среде являлись химические анализы. Они и сегодня доминируют при проведении соответствующих исследований. Отдавая им должное, не следует закрывать глаза на ряд недостатков этой системы контроля. Во-первых, она не универсальна и отработана только для ограниченного числа (около 1000) доминирующих или высокотоксичных соединений на уровне ГОСТов, ПДК (Безель и др., 1992; Пшеничнов и др., 1995; Леванова и др., 1999). Во-вторых, выявление и количественное определение поллютантов требуют использования разнообразных и достаточно сложных методик, часто набора высокоточной и дорогостоящей аппаратуры, иногда импортных реактивов, что не всегда посильно даже крупным специализированным, а тем более, практическим лабораториям Госсанэпиднадзора. Развернутый химический анализ нескольких образцов лишь по основным параметрам занимает длительное время, является дорогостоящим. В-третьих, интегративная оценка влияния суммы присутствующих токсикантов требует использования сложного математического аппарата, который к тому же не всегда применим.

Поэтому за последнее десятилетие в экотоксикологических исследованиях все большее применение получает биотестирование. Во Франции подобная оценка качества водной среды является обязательной в «Системе контроля качества пресных вод» на межведомственном уровне. Многотесторная система биологического анализа токсичности вод введена в США (Захарченко и др., 1994), рекомендована в РФ (Методические рекомендации , 1996), используется в экологическом аудите в Голландии.

Биотестирование выгодно отличается от химических анализов. Оно позволяет определить не только присутствие, но эффект действия токсикантов на организмы. Биотестирование в одинаковой мере пригодно как для оценки влияния отдельных, так и суммы токсикантов, в том числе тех, которые не определяются общепринятыми химическими анализами или являются неизвестными, но присутствующими в пробах.

Идеальный» контроль предусматривает оценку действия токсикантов на наиболее чувствительный компонент конкретного биоценоза, обусловливающий доминирующий вклад в круговорот веществ и энергии в природе. В соответствии с этим разработано более 200 типов биотестов с использованием около 70 видов лабораторных и природных моделей

Унифицированные методы исследования качества вод, 1983; Захарченко и др., 1994).

В практике наибольшее признание и применение нашло микробиотестирование. При наличии качественных микробиодетекторов система относительно проста, экспрессна, не требует существенных затрат и поэтому доступна рядовым баклабораториям Госкомприроды - и Санэпиднадзора. К таковым относятся методы с использованием люминесцентных бактерий. Здесь система учета общепринята (Ribo et al., 1987; Методические рекомендации, 1996), универсальна для всех токсикантов и их смесей. Будучи выражена через Индекс токсичности (ИТ, %), она автоматически и реально учитывает эффекты суммирования, взаимоусиления, ослабления действия отдельных токсикантов в смесях. Поэтому не требуется сложная математическая интегративная обработка результатов, применяемая при химических анализах.

Три основных обстоятельства определяют перспективность использования биолюминесценции для анализа: 1. Современные методы детекции излучения в оптическом диапазоне хорошо разработаны и достигли чувствительности, позволяющей считать отдельные кванты (Stanley, 1981); 2. Высокая специфичность, которая определяется тем, что в основе метода лежит ферментативная реакция; 3. Энергетическое обеспечение биолюминесценции осуществляется через общие метаболические пути клетки, поэтому уровень свечения характеризует общий физиологический статус организма и его изменение под влиянием токсикантов.

Субстраты бактериальной люминесцентной системы пиридиннуклеотиды, флавины, алифатические альдегиды, кислород) занимают ключевые позиции в обмене веществ. Предполагается конкурентное функционирование люминесцентной и дыхательной цепей (02, FMN-H2), а также других шунтирующих люциферазу окислительных систем (Данилов и др., 1990). В связи с чем, ксенобиотики могут уменьшать уровень восстановленных нуклеотидов (Хрипач и др., 1998), конкурировать с эндогенным FMN-H2 и альдегидом за активный центр люциферазы. Гидрофобные токсические вещества действуют на синтез альдегидного фактора (Гительзон и др., 1984).

Но независимо от конкретной точки действия ксенобиотиков (метаболические пути, генетический аппарат, мембрана бактериальной клетки), точное стехиометрическое соответствие числа молей субстратов, потребляемых в реакции люминесценции, обусловливает снижение интенсивности свечения клетки пропорционально токсичности образца (Постникова и др., 1992; Хрипач и др., 1998).

Поэтому интерпретация уровня люминесценции целых клеток более многогранна по сравнению с ферментами клеточных экстрактов (Meighen, 1991). При использовании живых систем появляется возможность прямо и опосредовано (через рост, деление, метаболизм) воздействовать на излучающую систему, при этом класс анализируемых веществ расширяется (Гительзон и др., 1984). Перспективным представляется разработка биосенсоров, чувствительным элементом которых является цельная клетка, что обусловлено большей толерантностью к субоптимальным величинам температуры и рН, большей стабильностью при функционировании и хранении (Корпан и др., 1995).

Наиболее распространенным вариантом такой тест-системы на Западе является лиофилизированный препарат морских бактерий Photobacterium phosphoreum (Microtox) (EPS, 1990). В литературе широко представлены данные об изучении влияния более 300 индивидуальных химических соединений разных классов на люминесценцию бактерий в тесте «Microtox» (Kaizer et ai, 1990). Выявлена высокая степень корреляции с биотестами на основе эукариот (цит. по Хрипач и др., 1998).

В настоящее время «Microtox» используется в качестве первичного скринингового метода в подавляющем большинстве реализуемых в мировой практике научно-исследовательских и коммерческих программ по изучению безопасности проб окружающей человека среды (Хрипач и др., 1998).

В России пионером таких работ выступил Институт биофизики Сибирского отделения РАН. Здесь создан каталог морских светящихся бактерий (Каталог светящихся культур, 1997). На основе Р. phosphoreum создан j отечественный коммерческий препарат «Микробиосенсор В17 677F», который | прошел широкие лабораторные испытания (Кузнецов и др., 1998).

Вместе с тем следует отметить, что галофильные морские бактерии могут быть обоснованно использованы только для анализа морских или засоленных объектов. В других ситуациях они оказываются как бы вырванными из естественных условий обитания. Вероятно, поэтому при экотоксиколргических исследованиях гигиенисты отдавали предпочтение общепринятым санитарным микробным индикаторам типа Е. coli commune.

Указанный вид широко и массово распространен во всех окружающих нас средах - почве, пресных водах, промышленных стоках, воздухе. Он постоянно в высоких концентрациях присутствует в организме людей и животных, где прямо или опосредовано подвержен действию окружающих токсикантов, подлежащих анализу.

Развитию этого нового направления немало способствовало и глубокое разностороннее изучение наследственной структуры этих бактерий, построение полных генетических карт микроба, отработка способов внутри- и межвидового переноса отдельных и групп оперонов, формирование генной инженерии как науки. Все это формировало мнение о возможности и целесообразности получения рекомбинантных штаммов Е. coli с клонированным опероном люциферазы как основы возможного индикатора для тестирования пресных вод методом ингибирования биолюминесценции, а также для выявления отдельных, суммы токсикантов в промышленных сбросах и других объектах окружающей среды (Родичева и др., 1998). В России впервые такой генно-инженерный штамм был получен на кафедре микробиологии МГУ им.

М.В.Ломоносова профессором Даниловым B.C. с сотрудниками, и на его основе разработан биосенсор «Эколюм», рекомендованный для тестирования объектов окружающей среды (Методические рекомендации, 1996).

С одной стороны, достаточно широкое его использование подтвердило рациональность такого подхода, с другой - породило ряд вопросов, требующих j дополнительного изучения штамма и препарата, условий воспроизведения J теста. К их числу относятся:

1.Стабильность сформированного генома. Так, среди субпопуляций штамма регулярно регистрируют, так называемые, темновые варианты, частота возникновения и свойства которых, влияют на общий уровень свечения культур и сенсоров, получаемых на их основе;

2.Есть основания считать, что тип и качество питательных сред существенно влияют на динамику развития клеток, накопление биомассы и общее свечение культур, что определяет свойства сенсора (чувствительность люминесценции к токсикантам);

3.Должная стабилизация препарата достигается лиофилизацией. Возникает необходимость подбора оптимальных криозащитных сред и режимов лиофилизации, воспроизводимых в условиях производства;

4. Реципиент lux-оперона - Е. coli - наиболее полно реализует свои физиологические функции при 37°С, доноры имеют оптимумы развития 10-30°С. Оставалось не ясным, как это сказалось на физиологии генно-инженерного штамма и чувствительности его свечения к токсикантам, от чего может зависеть выбор температурного режима индикации.

Перечень вопросов можно было бы продолжить, но хотелось бы отметить одно обстоятельство, усугубляющее сложность их решения. В связи с коммерциализацией науки, формированием рыночной экономики, когда практически любое достижение научной мысли, имеющее практический выход - новый продукт - является коммерческой, тщательно оберегаемой тайной. В данном случае штамм не патентуется и не передается, как обычно, с характеристикой в Российскую Национальную коллекцию промышленных микроорганизмов, технология приготовления соответствующего препарата является собственностью автора, а накопленная информация не публикуется, кроме рекламы продукта и сферы его использования. Это вынуждает исследователей, заинтересованных в совершенствовании препарата, возможном | расширении сферы его использования, более глубоком познании проблемы в 1 j целом, возвращаться к характеристике штамма, дополняя ее, и лишь затем переходить к решению новых вопросов.

Основные задачи исследования

2. Сравнительная характеристика и подбор питательных сред, условий, оптимальных для развития культур, накопления биомассы и максимального ее свечения. Проведение направленной клоновой селекции вариантов с высоким и стабильным уровнем люминесценции.

Научная новизна работы

Сравнительно исследованы динамика накопления биомассы, уровни общего и удельного свечения и чувствительность люминесценции к стандартным токсикантам Е. coli lum+ в условиях различных питательных сред и режимов выращивания. Показано, что клоновая селекция колоний на ; I однотипной среде способствует получению культур с более стабильной общей j и удельной люминесценцией. Определены факторы, влияющие на чувствительность Е. coli lum+ в соответствии со степенью ингибирования свечения.

Лиофилизация препарата проведена с использованием оригинального стабилизатора и режима сушки «Колибактерина». Разработаны подходы определения рабочей концентрации готового препарата, учитывающего уровень свечения и дозозависимость степени ингибирования биолюминесценции токсикантами в диапазоне средних значений шкалы «Биотокса-6» . Основные положения включены в заявку на патент «Способ изготовления Микробиолюминесцентного Индикатора Токсичности (МИТ) для определения загрязнения окружающей среды» (Приоритетная справка № 2000302199 от 21 января 2000 г).

Показано, что биолюминесценция может быть дополнительным критерием при оценке критических состояний культуры. Существует адекватное реагирование люминесцентной системы в ответ на физические (ТШ), химические (этанол, антибиотики) и биологические (фаговая инфекция) воздействия.

Практическая значимость работы

Составлены технические условия на модифицированный сенсор «Микробиолюминесцентный индикатор токсичности» (ТУ 846-001-04538050

00) и утверждены рекомендации по его применению «Наставления по применению препарата Микробиолюминесцентного Индикатора Токсичности -МИТ».

Апробация работы и публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 171 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 таблицами и 34 рисунками; состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, приложения. Список литературы включает 208 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шмырина, Ирина Леонидовна

ВЫВОДЫ:

Заключение

Микробиотесты на основе люминесцентных бактерий вполне отвечают требованиям, предъявляемым современными условиями к разработкам подобного типа. Такие системы уже получили права гражданства и широко используются во всем мире (Гительзон др., 1983; Шендеров и др., 1985; I

Бержанская и др., 1987; Попова и др., 1991; Bulich, 1982; iBulich et al., 1990). Они характеризуются быстродействием, высокой чувствительностью и корреляцией результатов с данными определения острой и хронической токсичности на млекопитающих, поскольку основные метаболические пути, обеспечивающие поддержание структуры клетки и ее жизнедеятельности, в принципе, одинаковы для бактерий и клеток высших организмов (Ревазова и др., 1997)

По данным литературы и результатам предварительных лабораторных исследований показана необходимость стабилизации характеристик тестовых „ культур люминесцентных бактерий и генно-инженерных штаммов с lux генами. Предлагаются разные подходы для ее реализации.

В современных условиях предварительная типизация рекомендуемых штаммов и дополнительное их описание является необходимым условием успешной работы, и диссертация содержит ряд таких наблюдений. В наших экспериментах отмечено, что на эффективность люминесценции и адекватную чувствительность свечения к токсикантам оказывают влияние многие факторы.

Использование дифференциально-диагностических сред и постоянный искусственный отбор обусловили получение клонов с лучшим, более стабильным свечением. Определенный срок культивирования на полных питательных средах, температурный режим выращивания оптимальный для клеток-реципиента, наличие интенсивного массообмена, удаление метаболитов, мягкие условия сушки способствовали сохранению, а в некоторых случаях улучшению свойств культуры Е. coli lum+.

На основании собственных экспериментов, а также опыта работы лаборатории с учетом данных литературы, предложена общая схема возможной оптимизации сенсоров на основе люминесцентных генно-инженерных штаммов бактерий, включающая ряд оригинальных этапов: дополнительную двухлетнюю искусственную селекцию светящихся вариантов, подбор оптимальных сред и условий их культивирования, удаление экзометаболитов, лиофилизацию препарата по оптимальной методике. Далее определение рабочей концентрации препарата и условий адекватного реагирования люминесценции на неблагоприятные факторы.

Схема.

Стадии и этапы оптимизации люминесцентного сенсора I. Подготовка штамма

II. Получение препарата

III. Анализ и стандартизация готового препарата

В соответствии со схемой, изготовлены экспериментальные серии препарата, которые, по предварительным данным, имеют ряд преимуществ в сравнении с исходным препаратом «Эколюм», что указывает на успешность реализации предложенного принципа оптимизации. Свечение культур в рабочем разведении было не менее 100000 отн.ед. на фоне соответствия дозы токсиканта и степени угнетения им свечения в диапазоне средних значений шкалы Т (%) «Биотокса-6». Наши наблюдения подтверждены результатами -независимой экспертизы, материалы которой представлены в приложении.

Основные положения выполненной работы и включающие этапы приведенной выше схемы отражены в заявке на патент «Способ изготовления Микробиолюминесцентного Индикатора Токсичности (МИТ) для биоиндикации загрязнения окружающей среды» - приоритетная справка №2000302199 от 21.01.2000 и ТУ на МИТ №846-001-04538050-00. Указания по применению изложены в «Наставлении по применению препарата Микробиолюминесцентного Индикатора Токсичности - МИТ» (см.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шмырина, Ирина Леонидовна, Пермь

1. Авакян A.A., Кац J1.H., Павлова И.Б. Атлас анатомии бактерий патогенных для животных и человека. М.: Медицина. 1972. - 180 с.

2. Баранова H.A., Данилов B.C., Егоров Н.С. Особенности функционирования биолюминесцентной цепи «тусклого» штамма Photobacterium fischeri/ZJlAH СССР. 1980. - Т.252, № 4. - С. 1009-1012.

3. Баранова H.A., Данилов B.C., Егоров Н.С. NADH-зависимое свечение и эффективность деятельности люминесцентных систем различных видов морских бактерий//Микробиология. 1984. - Т.53, № 2. - С. 896-901.

4. Басс М.Г., Худяков П.Г., Шелегедин В.И. Метод биотестирования сточных вод на основе бактерий Escherichia coli К 12//Биотехнология. 1993. - № 7. -С. 36-40.

5. Безель B.C., Кряжимский Ф.В., Семериков Л.Ф., Смирнов Н.Г. Экологическое нормирование антропогенных нагрузок//Экология. 1992. -№6. -С. 3-12.

6. Белогурова Н.Г., Мосолова Т.П., Калюжный C.B., Варфоломеев С.Д. Кинетические закономерности роста, метаболизма культуры Clostridium thermosaccharoluticiim. Выделение и характеристика плазмид//Микробиология. 1991. - Т.60, вып.2. - С. 245-252.

7. Березин И.В., Угарова Н.И., Бровко Л.Ю., Филиппова Н.И. Перспективы применения биолюминесценции с целью медицинской диагностики/ЛВ кн. Биолюминесценция в Тихом океане. Красноярск. 1982. - 417с., ил.

8. Бержанская Л.Ю., Постникова О.Н., Кривошеин Ю.С. Биосенсор для количественного определения в воде синтетических поверхностно-активных веществ//Авт. св-во, № 1335569, кл G 12 Q V*. 1987. - 8с.

9. Берия Л.В., Исмаилов А.Д., Данилов B.C. Стимуляция биолюминесцентной активности бактериальной люциферазы продуктами Fe 2+-индуцированного перекисного окисления липидов//Биохимия. 1991. - Т.56, вып.З. - С. 477485.

10. Благой Ю.П. Взаимодействие ДНК с биологически активными веществами (ионами металлов, красителями, лекарствами)//Соросовский образовательный журнал. 1998. - № 10. - С. 18-24.

11. П.Варфоломеев С.Д., Калюжный C.B. Биохимическая кинетика процессов репликации плазмид/УБиохимия. 1991. - Т.56, вып.Ю. - С. 1731-1747.

12. Вахитов Т.Я., Петров JI.H. Выживаемость клеток Escherichia coli при хранении в суспензиях различной концентрации//Микробиология. 1992. -Т.61, вып.6. - С. 1087-1095.

13. Вельков В.В. Нестабильность рекомбинантных молекул//Генетика. 1983. -Т. 19, № 10.-С. 1575-1581.

14. Н.Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. M.: 1972. 252с.

15. Волков В.Я. К вопросу о физиологических и физико-химических механизмах устойчивости микроорганизмов к замораживанию и высушиванию//Микробиология. 1994. - Т.63, вып.1. - С. 5-15.

16. Выпияч А.Н., Маркелова С.И. Жизнеспособность и биолюминесценция лиофильно высушенных клеток морских бактерий в процессе хранения/УВестник Моск. Ун-та, сер. 16, Биология. 1995. - № 3. - С. 33-37.

17. Высоцкий Е.С., Заворуев В.В., Межевикин В.В., Родичева Э.К. Люминесценция светящихся бактерий при диауксии//Изв. СО АН СССР. Сер. биол. 1982. - № 15, вып.З. - С. 69-71.

18. Высоцкий Е.С., Заворуев В.В., Межевикин В.В., Фиш A.M. Связь между ростом и люминесценцией в периодической культуре светящихся бактерий//Биохимия и биофизика микроорганизмов: Межвузовский сборник. 1978.-С. 111-115.

19. Гершанович В.Н. Биохимия и генетика транспорта ионов у бактерий. АМН СССР, М.: Медицина. 1980. - 176с., ил.

20. Гинвенталь Н.И;, Соболев В.Р., Ведьмина Е.А., Богданова Л.Ф., Воробьева Л.С. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с полуколичественной оценкой полученных результатов//Лаб. дело. 1982. - № 1. - С. 44-48.

21. Гительзон И.И., Воробьева Т.И., Шендеров А.Н., Виделец И.Ю., Сименская Т.Ф. Штамм бактерий Photobacterium leiognathi, используемый в качестве тест-культуры на токсичность ксенобиотиков//Авт. св-во № 1097947, кл G 01 № 33/18,- 19,- 1983.- 7с.

22. Гительзон И.И., Родичева Э.К., Медведева С.Е., Примакова Г.А., Барцев С.И., Кратасюк Г.А., Петушков В.Н., Межевикин В.В., Высоцкий Е.С., Заворуев В.В., Кратасюк В.А. Светящиеся бактерии. Новосибирск: Наука. Сиб. Отд-е. - 1984. - 275с.

23. Глемжа А., Рузгине А., Вашкайте В., Рузгите Р., Дилявитюче Я. Исследование условий биосинтеза люциферазы культурой Photobacterium phosphoreum 430//Прикладная биохимия и микробиология. 1994. - Т.30, вып.4-5. - С. 582-588.

24. Горлатова И.В., Крючкова Е.Г., Акименко Л.В., Вельков В.В. Влияние регуляторных генов бактериофага X с lrex АВ на физиологию Escherichia coli К-12//Биотехнология. 1991. - № 4. - С. 13-16.

25. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий.-М.: Мир. 1982. - 310с.

26. Грагеров А.И., Миркин С.М. Влияние сверхспирализации ДНК на основные генетические процессы у прокариот//Молекулярная биология. 1980. - Т. 14, вып. 1. - С. 8-33.

27. Данилов B.C., Егоров Н.С. Бактериальная биолюминесценция. М.: Изд-во МГУ, - 1990.- 152с., ил.

28. Данилов B.C., Исмаилов А.Д., Малков Ю.А., Егоров Н.С. Взаимодействие алифатического альдегида с цитохромом Р-450 в реакциях бактериальной люциферазы//Биоорганическая химия. 1981. - Т.7, № 1. - С. 68-74.

29. Данилов B.C., Малков Ю.А. Влияние гемовых лигандов СО и цианида на реакцию, катализируемую бактериальной люцйферазой//Биохимия. 1986. -Т.51,вып.5.-С. 782-787.

30. Дементьева Е.И., Угарова H.H., Кобболд П.Х. Изменение АТФ в интактных клетках Escherichia coli, содержащих рекомбинантную люциферазу светляков//Биохимия. 1996. - Т.61, вып.7. - С. 1285-1293.

31. Дужий Д.Е., Завильгельский Г.Б. Бактериофаг À,:lux: Конструирование и экспрессия биолюминесценции в клетках Е. со/г7/Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1994. - № 3. - С. 36-38.

32. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: Учеб. для студентов биолог, спец. ун-тов.- 4-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 1986. - 448с.,ил.

33. Егорова Т.С., Исмаилов А.Д. Факторы, регулирующие люминесцентную активность Photobacterium phosphoreum при глубинном культивировании//Микробиология. 1998. - Т.67, № 2. - С. 182-187.

34. Жолданов И.А., Даллакян Г.А., Максимов В.Н. Морские люминесцентные бактерии как тест-объект для исследования изолированного и комбинированного действия тяжелых металлов//Вестник Моск. Ун-та, сер. 16, Биология. 1989. - № 2. - С. 64-68.

35. Зубарева H.A. Инфекция в патологии и хирургии билиарной системы при желчнокаменной болезни//Автореф. дис. на соис. уч. ст. д.м.н. Пермь. -1999. -34с.

36. Зубарева H.A., Ершов О.Ю., Соснин Д.Ю., Сандаков П.Я., Терехина H.A. Способ диагностики холангита//Патент № 2109283 от 20.04.1998.

37. Иванов В.Н., Угодчиков Г.А. Клеточный цикл микроорганизмов и гетерогенность их популяций. Киев: Наукова думка. - 1984. - 280с.

38. Илларионов Б.А., Протопопов М.В. Клонирование и экспрессия генов люминесцентной системы Photobacterium /ezogwa/М/Молекулярная генетика. 1987. - Т. 13, № 8. - С. 41-46.

39. Инструкция по применению дисков для определения чувствительности к антибиотикам. 1986.

40. Исмаилов А. Д., Берия JI.B., Данилов B.C. Ферментативный и неферментативный процессы перекисного окисления липидов в бесклеточном экстракте Vibrio harveiyf/Микробиология. 1994. - Т.63, вып.З. -С. 466-471.

41. Какорин С.А., Ровнов Н.В., Рыбальченко О.В., Сорвин C.B., Трусов A.A. Структура бактериальной суспензии Escherichia со////Биофизика. 1991. -Т.36,вып.6. -С. 1043-1047.

42. Каргатова Т.В., Максимова Е.Е., Попова Л.Ю., Брильков A.B., Печуркин Н.С. Фенотипическая изменчивость популяции рекомбинантного люминесцентного штамма Escherichia coli в водных микрокосмах//Микробиология. 1997. - Т.66, № 1. - С. 101-106.

43. Каталог светящихся культур. Под ред. Э.К.Родичевой: Новосибирск: Наука. Сиб. предприятие РАН. - 1997. - 125с.

44. Квасников Е.И., Нестеренко O.A. Молочнокислые бактерии и пути их использования. М., 1975. - 389с., ил.

45. Корпан Я.И., Ельская A.B. Микробные сенсоры: достижения, проблемы, перспективы//Биохимия. 1995. - Т.60, вып. 12. - С. 1988-1998.

46. Кратаскж В.А. Люциферазное биотестирование: биофизические основы, методы и применение//Автореф. дисс. на соиск. уч.ст.д.б.н. Красноярск.: ИБФ СО РАН. 1994.-31с.

47. Кудрявцева O.A., Барцев С.И., Охонин В.А., Межевикин В.В. Локализация люминесцентной системы светящихся бактерий//Биофизика. 1993. - Т.38, вып.З.-С. 435-440.

48. Кудряшева Н.С., Зюзикова Е.В., Гутник Т.В., Кузнецов A.M. Действие солей металлов на бактериальные биолюминесцентные системы различной сложности//Биофизика. 1996. - Т.41, вып.6. - С. 1264-1269.

49. Кудряшева Н.С., Шалаева Е.В., Задорожная E.H., Кратасюк В.А., Балаян А.Э., Стом Д.И. Закономерности ингибирования бактериальной биолюминесценции in vitro хинонами и фенолами компонентами сточных вод//Биофизика. - 1994. - Т.39, вып.З. - С. 455-464.

50. Кузнецов A.M., Родичева Э.К., Медведева С.Е. Использование светящихся бактерий в биотестировании окружающей среды//Материалы Международной конференции, 12-18 сентября, 1998. Москва, Пермь. 1998.-С. 395.

51. Лебедев B.C., Веселовский A.B., Федоров Ю.И. Роль кислорода в ингибировании дыхания Escherichia coli ионами меди//Изв. Акад. Наук, Сер. Биол. 1990. - № 5. - С. 782-785.

52. Лебедева М.Н. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. М.: Медицина. 1973. - 313с.

53. Леванова Г.Ф., Юшин А.С., Кашников С.Ю. Метод сравнительного биотестирования питьевой воды с помощью индикаторных штаммов бактерий//Гигиена и санитария. 1999. - № 2. - С. 77-79.

54. Ленцнер А.А. Лактобациллы микрофлоры человека//Автореф. дис. д-ра. мед. наук. Тарту. - 1973. - 30с.

55. Ленцнер А.А. Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э., Тюри М.Э., Бримне Т.А., Брилис В.И., Левков А.А. Лактофлора и колонизационная резистентность//Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987. - № 3. -С. 173-179.

56. Леонтьева О.В., Угарова Н.Н. Участие шаперона Dna К и АТФ в сворачивании in vivo люциферазы светляков, синтезируемой клетками Escherichia со////Биохимия. 1996. - Т.61, вып.4. - С.721-725.

57. Лохвицкий С.В., Абеузов М.Е., Щепеткина Л.В. Лизоцимообразовательная функция печени при осложненном остром холецистите//Вестник хирургии им. Грекова. 1989. - № 5. - С. 29-30.

58. Ляхович В.В., Цырлов И.В. Структурные аспекты биохимии монооксигеназ. Новосибирск. Наука. 1978. - 238с., ил.

59. Максимова Е.Е., Попова Л.Ю., Каргатова Т.В., Шпагина В.В. Регулируемая экспрессия генов бактериальной люминесценции, клонированных в многокопийной рекомбинантной плазмиде//Микробиология. 1997. - Т.66, № 2. - С. 223-227.

60. Манниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.:Мир. 1984. - 480с., ил.

61. Манухов И.В., Дужий Д.Е., Завильгельский Г.Б. Клонирование генов lux А и lux В Vibrio harveyi и экспрессия биолюминесценции в клетках Escherichia coli и Bacillus ^¿»¿///¿•//Биотехнология. 1996. - № 1. - С. 3-8.

62. Марквичев Н.С., Мельниченко Е.Г., Бержанская Л.Ю., Кривошеин Ю.С., Манаков М.Н. Изучение кинетики роста и светопродукции генно-инженерного штамма Escherichia coli (1иш)//Биотехнология. 1991. - № 6. -С. 12-15.

63. Маянский Д.Н. Клетка Купфера и система мононуклеарных фагоцитов.-Новосибирск.: Наука. 1981. - 169с., ил.

64. Медведева С.Е., Выдрякова Г.А., Пузырь А.П., Могильная O.A. Морфологические особенности роста светящихся бактерий Photobacterium и Vibrio на агаризованных средах различной вязкости//Изв. СО РАН, Сиб. биол. журнал. 1993. - вып.6. - С. 18-23.

65. Медведева С.Е., Медведев А.Н., Примакова Г.А., Сальников М.В. АТФ-азная активность светящихся бактерий и их темновых вариантов//Изв. СО РАН СССР, серия биол. наук. 1982. - вып.2,№ 10. - С. 113-117.

66. Медведева С.Е., Могильная O.A., Пузырь А.П. Структура колоний и генома бактерий рода Photobacterium!Í.Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения,экологические проблемы: Материалы Международной конференции, 8-11 окт., Пермь. 1996. - 276с.

67. Межевикин В.В., Высоцкий Е.С., Заворуев В.В. Метаболическая организация люминесцентной системы у светящихся бактерий//ДАН СССР. 1983. - Т.272, №6. - С. 1485-1487.

68. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология. М.: Мир. -1967.-347с.

69. Методические рекомендации. Определение токсичности воды и водных экстрактов из объектов окружающей среды по интенсивности биолюминесценции бактерий. Утв. Зам. председателя Госкомсанэпиднадзора России Г.Г.Онищенко 26.02.96, № 01-19/16.17. 9с.

70. Методы общей бактериологии: Пер. с англ. Под ред. Ф. Герхардта и др. М.: Мир. 1983.- 536с.

71. Нахаба В.А., Полюдов С.И. Использование микроЭВМ при определении чувствительности бактерий к антибиотикам//Лабораторное дело. 1990. -№3.-С. 60-63.

72. Несчисляев В.А. Колибактерин сухой (Colibacterinum siccumy/Регламент производства №737-98, Пермь. 1998. - 35с.79.0нищенко Г.Г. О санитарно-эпидемиологической обстановке в России//Гигиена и санитария. 1997. - № 6. - С. 4-12.

73. Петушков В.И., Кратасюк Г.А., Кратасюк В.А., Белобров П.И. Термоинактивация бактериальной люциферазы//Биохимия. 1982. - Т.42, вып. 11.- С. 1773-1777. . .

74. Пехов А.П. Генетика бактерий. Изд. 2. М.: Медицина. 1977. - 408с.

75. Попова Л.Ю., Калачева Г.С., Могильная O.A., Медведева С.Е., Печуркин Н.С. Штамм светящихся бактерий с повышенной чувствительностью к гексахлорциклогексану//Прикладная биохимия и микробиология. 1994. -Т.ЗО, вып.4-5. - С. 650-656.

76. Попова Л.Ю., Луцкая Н.И., Жуков А.Г. и др. Микробные тест-системы для оценки степени токсичности химических соединений. Красноярск. - 1991. -31с.-Препр. № 163Б.

77. Попова Л.Ю., Медведева С.Е., Могильная O.A., Пузырь А.П., Печуркин Н.С. Использование светящихся бактерий для создания тест-системы на гексахлорциклогексан//Прикладная биохимия и микробиология. 1991. -Т.27, вып.6.- С. 905-910.

78. Постникова О.Н., Кривошеин Ю.С., Бержанская Л.Ю. Влияние поверхностно-активных веществ на люминесцентную систему светящихся бактерий//Биотехнология. 1992. - № 4. - С. 56-59.

79. Примак A.B., Кафаров В.В., Качиашвили К.И. Системный анализ контроля и управления качеством воздуха и воды. Киев: Наукова думка. 1991. - 360с.

80. Примакова Г.А., Сандалова Т.П. Влияние pH на константу скорости затухания люминесценции у различных видов светящихся бактерий//Прикладная биохимия и микробиология. 1991. - Т.27, вып.1. -С. 142-145.

81. Птицын Л.П., Фатова М.А., Степанов А.И. Экспрессия генов биолюминесцентной системы Photobacterium leiognathi в Е.^////Молекулярная генетика. 1990. - № 2. - С. 26-29.

82. Пшеничнов P.A., Закиров Ф.Н., Никитина Н.М. Микробиотест для оценки мониторинга загрязнения почв//Экология. 1995. - № 4. - С. 332-334.

83. Пшеничнов P.A., Пашин Ю.В., Захаров И.А. Современные тест-системы выявления мутагенов окружающей среды. Свердловск: УрО АН СССР. -1990.- 135с.

84. Пшеничнов P.A., Соколова H.A., Лебединский А.И. Фотометрический метод изучения морфологии бактериальных колоний//Экология и популяционная генетика микроорганизмов. Сб. статей. Свердловск. 1975. - С. 35-41.

85. Ревазова Ю.А., Ингель Ф.И., Цуцман Т.Е., Хрипач Л.В., Кривцова Е.К., Юрченко В.В., Геворкян Н.М. Методология проведения комплексных генетико-токсико логических исследований//Вестник Российской АМН.-1997. -№ 7. С. 18-24.

86. Рощина Е.К., Петров Л.И. Выделение белка во внеклеточное пространство как неспецифическая реакция Escherichia coli на стресс//Микробиология. -1997.-Т.66,№2.-С. 179-184.

87. Рузгене А., Глемжа А., Текорене Р. Влияние разных аминокислот на рост Photobacterium phosphoreum и синтез люциферазного комплекса//Вiologiya. 1996.-№ 1.-С. 39-43.

88. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Практическое пособие. Под ред. Н.С.Егорова.-2 изд-е.-М.: Изд-во Моск. ун-та. 1983. -215с.

89. Румянцев Г.И., Новиков С.М. Проблемы прогнозирования токсичности и риска воздействия химических веществ на здоровье населения//Гигиена и санитария. 1997.-№ 6. - С. 13-18.

90. Сальников М.В., Высоцкий Е.С., Заворуев В.В., Межевикин В.В. Изменение периплазматического пространства светящихся бактерий в зависимости от интенсивности люминесценции//Микробиология. 1984. -Т.53, № 5. - С. 744-748.

91. Сахаров Г.Н., Исмаилова А.Д., Данилов B.C. Температурные зависимости реакции бактериальной люциферазы из Вепескеа harveiy и Photobacterium fischeril/Биохимия. 1988. - Т.53, вып.6. - С. 891-898.

92. Соболев А.Ю., Исмаилов А.Д., Данилов B.C. Кинетика биолюминесценции в реакции бактериальной люциферазы с различными алифатическими альдегидами//Биохимия. 1989. - Т.54, вып.2. - С. 20612065.

93. Сорокин В.А., Валеев В.А., Гладченко Г.О., Сыса И.В. Изучение взаимодействия ионов кадмия с нуклеотидами и природной ДНК//Биофизика. 1997. -Т.42, вып.1. - С. 105-116.

94. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрэм Дж. Мир микробов. Т.1, 2, 3. М.: Мир. 1979.

95. Суходолец В.В. Регуляторный отбор как альтернатива теории нейтральности//Генетика. 1995. - Т.31, № 12. - С. 1589-1597.

96. Титов А.Н., Романова H.A., Данилова Т.М., Бровко Л.Ю., Угарова H.H., Толстых П.И. Биолюминесцентный метод определения чувствительности микрофлоры к антибиотикам//Лабораторное дело. 1990. - № 10. - С. 61-66.

97. Тихомирова М.М., Мазур Е.Л., Баранова Л.В., Мамон Л.А. Температурная модификация мутационного процесса и белки теплового шока//Генетика. 1993. - Т.29, № 2. - С. 280-287.

98. Ткаченко А.Г., Чудинов A.A., Чурилова Н.С. Влияние физиологического состояния Escherichia coli на ультраструктуру нуклеоида в условиях стрессовых воздействий//Известия академии наук СССР. Серия биологическая. 1992. - № 1. - С. 42-51.

99. Тюлькова Н.А., Сандалова Т.П. Сравнительное исследование влияния температуры на бактериальные люциферазы//Биохимия. 1996. - Т.61, вып.2. -С. 275-287.

100. Унифицированные методы исследования качества вод. Часть III. Методы биологического анализа вод. М. 1983. - 372с.

101. Ураков И.И., Волков В.Я., Боровик Р.В. Функциональное состояние и механизмы повреждения микроорганизмов в процессе приготовления бактериальных препаратов//Биотехнология. 1988. - Т.4, № 4. - С. 420-432.

102. Хрипач JI.B., Ревазова Ю.А., Ходжаян А.Б. Оценка суммарной токсичности тяжелых металлов на основе люминесцентного бактериального теста//Гигиена и санитария. 1998. - № 4. - С. 67-72.

103. Чернова Т.А., Завильгельский Г.Б. Клонирование генов lux-регулона Vibrio fischeri в клетках Escherichia со////Биотехнология. 1991. - № 3. -С. 17-18.

104. Четина Е.В. Влияние некоторых физиологических и генетических факторов на процесс перехода энтеротоксигенных штаммов E.coli в некультивируемое состояние//Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1997. - № 1. - С. 8-14.

105. Чумакова Р.И., Гительзон И.И. Светящиеся бактерии. М.: Наука. 1975. -104с.

106. Шендеров А.Н., Виделец И.Ю., Луцкая Н.И., Гуревич В.Б., Светлаков А.В. Физиолого-биохимические свойства наследственных вариантов, возникающих в популяции Photobacterium /е/о^па?/гг//Микробиология. -1989. Т.58, вып.6. - С. 1000-1006.

107. Шендеров А.Н., Попова Л.Ю., Виделец И.Ю. Механизмы регуляции синтеза ферментов люминесцентной системы у Photobacterium leiognathi и Вепескеа harveyi//B кн. Биолюминесценция в Тихом океане. Красноярск. -1982.-417с., ил.

108. Шендеров А.Н., Сименская Т.Ф., Виделец И.Ю. Способ биоиндикации загрязнения водной среды//Авт. свид. СССР №1097947; кл. G 01 № 33/48. -1985. 7с.

109. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем.- М.: Мир. 1987. - 567с., ил.

110. Щелкунов С.Н. Клонирование генов. Новосибсрск: Наука. 1986. - 228с.

111. Щелкунов С.Н. Конструирование гибридных молекул ДНК. Новосибирск: Наука. 1987. - 168с.

112. Backhaus Т., Grimme L.H. The toxicity of antibiotic agents to the luninescent bacterium Vibriofischeri/fChemospherQ. 1999. - V.38, N 14. - P. 3291-3301.

113. Baldwin Т.О., Nicoli M.Z., Becvar J.E., Hastings J.W. Bacterial luciferase. Binding of oxidized FMN//J. Biol. Chem. 1975. - V.250, N 8. - P. 2763-2768.

114. Balny C., Hastings J.W. Fluorescence and bioluminescence of bacterial luciferase intermediates//Biochemistry. 1975. - V.14, N 21. - P. 4719-4723.

115. Bennett A., Lenski R. Escherichia coli. Evolutionary adaptatiom to temperature: V. Adaptive mechanism and correlated responses in experimental lines of Escherichia coli// Evolution (USA). 1996. - V.50, N 2. - P. 493-503.

116. Bennett A., Lenski R. Evolutionary adaptation to temperature 6. Phenotyric acclimation and its evolution in Escherichia co////Evolution. 1997. - V.51, N 1. -P. 36-44.

117. Berger В., Carty C.E., Ingram L.O. Alcohol-induced changes in the phospholipid molecular species of Escherichia coli/U. Bacteriol. 1980. - V.142. -P. 1040-1044.

118. Billard P., DuBow M.S. Bioluminescence-based assay for detection and characterization of bacteria in clinical laboratories//Clinical Biochemistry. 1998. - V.31, N 1. -P. 1-14.

119. Bridges B.A., Ashwood-Smith M.J., Munson R.I. Correlation of bacterial sensitivities to ionizing radiation and mild heating//J. Gen. Microbiol. 1969. -V.58.-P. 115-124.

120. Bucheder F., Broda E. Energy-dependent zink transport by E.colillJ. Biochem. 1974.-V.45.-P. 555-559.

121. Bulich A.A. A practical and reliable method for monitoring the toxicity of aquatic samples. Process Biochem. 1982. - V.17. - P. 45-47.

122. Bulich A.A., Tung K.K., Scheibner G. The luminescent bacterial toxicity test, its potential as an in-vitro alternative//!. Biolumin. Chemilum. 1990. - V.5. -P. 71-78.

123. Conrad R.S., Galanos C.//Antimicr. Agents and Chemotherapy. 1989. - V.33, N 10.-P. 1724-1728.

124. Delong E.F., Steinhauer D., Israel A., Nealson K.H. Isolation of genes from Photobacterium leiognathi and expression in E.coli/IGenQ. 1987. - V.54. -P. 203-210.

125. Drahos D.J., Hendrix R.W. Effect of bacteriophage lambda infection on the synthesis of groE protein and other Escherichia coli proteins//J.Bacteriol. 1982. -V. 149.-P. 1050-1063.

126. Drlica K. Biology of bacterial deoxyribonucleic and topoisomerases//Microbiol. Rew. 1984. - V.48, N 4. - P. 273-276.

127. Dolan K.M., Greenberg E.P. Evidence that Gro EL, not sigma 32, is involved in transcriptional regulation of the Vibrio fisheri luminescence genes in Escherichia colil/J. Bacteriol. 1992. - V.174, № 15. - P. 5132-5135.

128. Eley M., Cormier M.//J. Biochem and Biophys. Res. Commun. 1968. - V.32, N3,- P. 454-460.

129. Engebrecht J.K., Nealson H., Silverman M. Bacterial bioluminescence: isolation and genetic analysis of function from Vibrio fisheri!/Cell. 1983. - V.32. -P. 773-781.

130. Engebrecht J.K., Silverman M. Identification of genes and gene products necessary for bacterial bioluminescence//Proc. National, Acad. Sci. USA. 1984. -V.81.- P. 4154-4158.

131. EPS, Guidance Document on Control of Toxicity Test Precision Using Reference Toxicants. Report EPS1/RM/12, August 1990, Environmental Protection, Conservation and Protection, Environment Canada. 1990. - 85p.

132. Esterbauer H. Free radicals, Lipid peroxidation and cancer//Eds D.S. McBrien, T.F.L.Slater. N.Y.: Acad. Press. 1982. - 102 p.

133. Eymers J.G., Van Schouwenburg K.L. On the luminescence of bacteria. 3. Futher quantitative data regarding spektra connected with bioluminescence//Enzymologia. 1937. - V.3. - P. 235-241.

134. Farewell A., Neidhardt F.C. Effect of temperature on in vivo protein synthetic capacity in Escherichia colillL of Bacteriology. 1998. - V. 180, N 17. - P. 47044710.

135. Gunsalus I.C., Sligar S.G.//Adv. Enzymol. 1978. - V.47, N 1. - P. 1-44.

136. Gosh B.K., Murray R.G. Fine structure of Listeria monocytogenes in relation to protoplast formation//J. Bacteriol. 1967. - V.93, N 1. - P.411-426.

137. Halegona S., Inouye M. Translocation and assembly of outer membrane proteins of Escherichia coli/ll. Mol. Biol. 1979. - V.130. - P. 39-61.

138. Hastings J.W. Oxigen concentration and bioluminescence intensity. 1. Bacteria and fungi//J. Cell. Comp.Physiol. 1952. - V.39. - P. 1-30.

139. Hastings J.W. The chemistry and biology of bacterial light emission//Photochem. Photobiol. 1978. - V.27, N 4. - P. 397-404.

140. Hastings J.W., Nealson K.H. Bacterial bioluminescence//Ann. Rev. Microbiol. 1977.-V.31.-P. 549-595.

141. Hayashi Y., Hayashi M.//Biochemistry. 1971. -N 10. - P. 4212-4218.

142. Hendrix R.W. Purification and properties of gro E, a host protein involved in bacteriphage assembly//! Mol. Biol. 1979. - V.129. - P. 375-392.

143. Holzman T.F., Baldwin T.O.//Biochemistry. 1983. - V.22, N 12. - P. 28382846.

144. Ianda I., Opekarova M. Long-term preservation of active luminous bacteria by liophilization//J. Biol. Chem. 1989. - V.3. - P. 27-29.

145. Ingram L.O., Buttke T.M. Effect of alcohol on microorganisms//Advance in Microbial Physiology. 1984. - P. 26-28.

146. Jones R.P. Biological principles for the effect of ethanol//Enzyme and Microbial Technol. 1989. - V.ll. - P. 130-153.

147. Kaiser R.L.E., Palabrica V.S. Pkotobacterium phosphoreum. Toxicity Data Index//Water Poll. Res. J. Canada. 1991. - V.26, N 3. - P. 361-431.

148. Karl D.M., Nealson K.H. Regulation of cellular metabolism during synthesis and expression of the luminous system in Beneckea and Photobacterium//. Gen. Microbial. 1980. - V.117. - P. 357-368.

149. Klein G., Zmijewski M., Krzewska J., Czeczatka M., Lipinska B. Cloning and characterization of the dna K heat shock operon of the marine bacterium Vibrio harveyi//Molecular and General Genetics. 1998. - V.259, N 2. - P. 179-189.

150. Klein G., Walczak R., Krasnowska E., Biaszczak A., Lipinska B. Characterization of heat-shock response of the marine bacterium Vibrio harveyi/Mol Microbiol. 1995. - V.16, N 4. - P. 801-811.

151. Kochan J., Murialdo H. Stimulation of groE synthesis in Escherichia coli by bacteriophage lambda infection//J.Bacteriol. 1982. - 149. - P. 1166-1170.

152. Korpela M., Mantsala P., Lilius F. et al/U. Biolumin. Chemilumin. 1989. -V.4.-P. 551-554.

153. Lemaux P.G., Herendeen S.L., Bloch P.I., Neidhardt F.C. Transient rates of synthesis of individual polypeptides in E.coli following temperature shifts//Cell. -1978. V. 13.-P. 427-434.

154. Lezoi A., Bennett A., Lenski R. Temperature acclimation and competitive fitness: an experimental test of the beneficial acclimation assumption//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. - V.91, N 5. - P. 1917-1921.

155. Magner Y. et al. Characterization of bioluminescent bacteria by studies of the inductors of luciferase synthesis//Biol. Bull. 1972. -N 6. - P. 143-169.

156. Makiguchi N., Arita M., Asai Y. Isolation, identification and several characterization of luminous bacteria//J. Gen. Appl.Microbiol. 1979. - V.25. -P. 387-396.

157. Makiguchi N., Arita M., Asai Y. Optimum cultural condition for strong light production by Photobacterium phosphor eumlll. Gen. Appl. Microbiol. 1980. -V.26. -P. 75-83.

158. Marr A.G., Ingraham J.L. Effects of temperature on the composition of fatty acids in Escherichia coli//L Bacteriol. 1962. - V.84. - P. 1260-1267.

159. Meighen E.A. Autoinduction of light emission in different species of bioluminescent bacteria//Luminescence. 1999. - V. 14, N 1. - P. 3-9.

160. Meighen E. Molecular biology of bacterial bioluminescence//Microbiol. Rev. -1991. V.55, N l.-P. 123-142.

161. Meighen E.A., Hastings J.W. Binding site determination from kinetic data//J.Biol. Chem. 1971. - V.246. - P. 7666-7674.

162. Minton K.W., Karmin P., Hahn G.M., Minton A.D. Nonspecific stabilization of stress-susceptible proteins by stress-resistant proteins: A model for a biological role of heat shock protein//Proc.Nat. Acad. Sci. 1982. - V.79. - P. 7107-7111.

163. Miyamoto C.M., Byers D., Graham A.F., Meighem E.A. Expression of bioluminescence in E.coli by recombinant Vibrio harveyi DNA//J. Bacteriol. -1987. V.169,№ l.-P. 247-253.

164. Moran L.A., Chawin M., Kennedy M.E., Korri M., Lowe D.G. et al. The major heat shock proteins (hsp 70) gene family. Related sequences in mouse, Drosophila and yeast//Can. J. Biochem. Cell. Biol. 1982. - V.61. - P. 488-499.

165. Murray I.A., Show W.V. O-acetyltransferases for chloramphenicol and other natural products//Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1997. - V.41,№ 1. -P. 1-6.

166. Nealson K.H. Autoinduction of bacterial luciferase: occurence, mechanism and significance//Arch. Microbiol. 1977. - V.l 12. - P. 73-79.

167. Nealson K.H. Isolation, identification and manipulation of lumonous bacteria//Methods in Enzymology. Acad.Press. N.Y. 1978. - V.57. - P. 153-166.

168. Nealson K.H., Hastings J.W. Bacterial bioluminescence: its control and ecological significance//Microbiol. Rev. 1979. - V.43, N 4. - P. 496-518.

169. Nealson K.H., Markowitz A. Mutant analysis and enzyme subunit complementation in bacterial bioluminescence in Photobacteriumf/J. Bacteriol. -1970.-V.104, N1.-P. 313-322.

170. Neidhardt F.C., Van Bogelen R.A., Lau E.T. The high temperature regulon in Escherichia coW/Sqq Ref. 1982. - V. 131. - P. 139-145.

171. Neidhardt F.C., Van Bogelen R.A., Vaughn V. The Genetics and Regulation of Heat-shock proteins//Ann. Rev. Genet. 1984. - V. 18. - P. 295-329.

172. Pellon Y.R. Heat damage and repair in the Escherichia coli nucleoid kinetics based on sedimentation analysis//Expan. Fisiol. 1983. - V.39. - P. 321-326.

173. Presswood R.P., Shannon P., Spencer R. et al. Effect of deuterium substitution of the C carbon of decanal in the bacterial luciferase reaction//Flavins and Flavoproteins. Tokyo. 1980. - P. 155-160.

174. Ribo M.J., Kaizer R.L. Photobacterium phosphoreum Toxicity Bioassay//Toxic. Asses. Int. Quart. 1987. - V.2. - P. 305-323.

175. Rick P.D.//Cell and Mol. Biol. 1987. - V.l. - P. 648-662.

176. Ryter A., Chang A. Localization of transcribing genes in the bacterial cell by high resolution autoradiography//!. Mol .'Biol. 1975. - V.98. - P. 797-803.

177. Schroder H., Langer T., Hartl F.U., Bukau B.//EMBOJ. 1993. - V.12. -P. 4137-4144.

178. So A., Davie E.W. The effect of organic solvents on protein biosynthesis and their influence on the aminoacid code//Biochemistry. 1964. - V.3. - P. 11651169.

179. Stanley P.E. Overview of application of bioluminescence//Bioluminescence and Chemiluminescence. Acad. Press . N.Y. 1981. - P. 275-282.

180. Sugino A., Higgins N.P., Brown P.O. et al. Energy coupling in DNA gyrase and the mechanism of action of novobiocin//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1987. -V.75,N 10.-P. 4838-4845.

181. Szittner R.A., Meighen E.A. Nucleotide sequence, expression and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium//!. Biol. Chemr- 1990. -V.265, N 27. P. 16581-16587.

182. Tolner B., Poolman B., Konings W.N. Adaptation of microorganisms and their transport system to high temperature//Physiology. 1997. - V. 118, N 3. - P. 423428.

183. Tyulkova N.A., Sandalova T.P. Comparative study of temperature effects on bacterial luciferase//Biochemistry-Moscow. 1996. - V.61, N 2. - P. 205-214.

184. Ulitzur S. Established technologies and new approaches in applying luminous bacteria for analytical purposes//J. Of Bioluminescence and Chemiluminescence. -1997.-V.12,N4.-P. 179-192.

185. Ulitzur S. Factors affecting the cellular expression of bacterial luciferase//Arch. Microbiol. 1981. - V. 129. - P. 67-71.

186. Ulitzur S., Hastings J. Growth, luminescence, respiration and ATP pool during autoinduction in Beneckea harveyil/1. Bacteriol. 1978. - V.133, N 3. - P. 13071313.

187. Ulitzur S., Heller M. A new fast and very sensitive bioluminescent assay for phospholipases a and al//Anal. Biochem. 1978. - V.91, N 2. - P. 421-431.

188. Vaara M. Agents that increase the permeability of the outer membrane//Microbiol. Rev. 1992. - V.56. - P. 395-411.

189. Wagner A., Winkler U., Lummen P//J. Biolum. And Chemilum. 1989. - V.4. -P. 342-345.147

190. Заявка на патент «Способ изготовления Микробиолюминесцентного Индикатора Токсичности (МИТ) для биоиндикации загрязнения окружающей среды». Приоритетная справка № 20003021199 от 21.01.2000.

191. МПК С 12 С 11/00 в 01 N33/18 Способ изготовления микробиолюминисцентного индикаторатоксичности для определения загрязнения окружающей среды

192. Изобретение относится к токсикологии, биологическим методам контроля качества окружающий среды и может быть использовано для количественного определения отдельных и суммы токсикантов в объектах окружающей среды.

193. Недостатками известного способа получения препарата Эколюм является недостаточно высокая чувствительность, стабильность препарата при хранении(срок годности не более 1 года), общее низкое свечение, недостаточно стабильное значение биолюминисценции

194. Способ изготовления осуществляется следующим образом.

195. Надосадочная жидкость отбрасывается, а клеточный седимент развойся в прежнем объеме стабилизатором следующего состава: 20% сахарозы 0%), 10% Зкелатиноля, 70% - охлажденного до 4°С физиологического рас-ора (Ф.Р.).

196. Обеспечивает шестизначный уровень свечения контроля или не менее 100.000А,

197. Степень ингибирования свечения токсикантами в испытанных разведениях (1-2,5 мг/л) должна приходиться на наиболее достоверный средний - диапазон шкалы люминометра (20-75%), см.график.

198. В пределах указанных концентраций токсикантов должна наблюдаться прямая линейная зависимость между концентрацией токсиканта и степенью ингибирования уровня свечения.(см.график)

199. Способ изготовления микробиолюминисценгного индикатора токсичности

200. Изобретение относится к токсикологии, биологическим методам кон-юля качества окружающий среды и может быть использовано для количе-венного определения отдельных и суммы токсикантов в объектах окру-ающей среды.

201. Физиологический раствор остальное,последующей сублимационной сушкой в течение 55-65 часов и подтитроь-кой готового продукта с выбором его оптимальной рабочей концентрации.

Информация о работе

Шмырина, Ирина Леонидовна
кандидата биологических наук
Пермь, 2000
ВАК 03.00.07

Диссертация

Люминесцентный микробиотест: возможные пути его оптимизации и расширение сферы использования - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы