Пробиотики: микробиологические и технологические аспекты получения, контроля и конструирования препаратов

Несчисляев, Валерий Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Пробиотики: микробиологические и технологические аспекты получения, контроля и конструирования препаратов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Пробиотики: микробиологические и технологические аспекты получения, контроля и конструирования препаратов"

На правах рукописи

НЕСЧИСЛЯЕВ Валерий Александрович

ПРОБИОТИКИ: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОЛУЧЕНИЯ, КОНТРОЛЯ И КОНСТРУИРОВАНИЯ ПРЕПАРАТОВ

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Пермь -2005

Работа выполнена в отделении препаратов бактериотерапии и лаборатории биорегуляторов филиала Федерального государственного унитарного предприятия «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития РФ «Пермское НПО «Биомед»

Научный консультант:

академик РАН и РАМН Черешнев Валерий Александрович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Горовиц Эдуард Семенович доктор медицинских наук, профессор Бондаренко Виктор Михайлович доктор медицинских наук, профессор Королюк Александр Михайлович

Ведущая организация:

Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва

«о

Защита состоится « » д^игдУ/ь? 2005 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 004.0l9.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс (342) 244-67-11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан « СИ » рьо^а^а 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, член-корреспондент РАН / /"" /л Ившина Ирина Борисовна

у-

---з

^ ^ ^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современные условия жизнедеятельности человека характеризуются постоянным влиянием неблагоприятных био-, техно-и социогенных факторов, интенсивность воздействия которых часто превышает компенсаторные возможности микроэкологической системы макроорганизма (Черешнев и др., 2001; Шендеров, 2001; Бондаренко, Воробьев, 2004; Orrhage, Nord, 2000). Нарушения микробиоценоза играют существенную роль в патогенезе большого количества заболеваний различной этиологии, что позволяет рассматривать проблему коррекции дисбиозов как общемедицинскую (Барановский, Кондрашина, 2000; Калмыкова, 2001; Федотова и др., 2001; Циммерман, 2005). Этим обусловлена необходимость обеспечения практического здравоохранения широким арсеналом эффективных и доступных ггробиотических препаратов, предназначенных для поддержания и восстановления симбиотических микробиоценозов человека (Коршунов и др., 2000; Roberfroid, 2000; Elmer, 2001). Актуальной задачей для отечественного производства пробиотиков является выпуск конкурентоспособных препаратов, которые по своим потребительским характеристикам не должны уступать импортным аналогам. Основными направлениями прикладных исследований в области пробиотиков являются: создание препаратов с повышенной биологической активностью, разработка новых лекарственных форм и совершенствование технологического процесса (Шендеров, Степанчук, 1999; Храмцов, Виноградская, 2000; Тимербаева и др., 2000; Молохова, 2002).

Клинические исследования последних лет открывают новые стороны позитивного воздействия пробиотиков на организм человека (Воробьев, Лыкова, 1999; Бондаренко и др, 2003; Шульпекова, 2003; Isolauri et al., 2000; Matsuzaki, Chin, 2000). Это позволяет расширять сферу их применения (акушерство и гинекология, стоматология, дерматология и др.) и определяет необходимость создания лекарственных форм, адекватных новым способам аппликации и требованиям к потребительским свойствам препаратов (суппозитории, мази, кремы, порошки, капсулы, таблетки) (Поспелова и др., 1990; Рожкова, Кравцов, 1990; Famularo, Pieluigi, 2001). В связи с этим разработка и усовершенствование технологий указанных фармакопейных форм, являются актуальными для производства пробиотиков, которые выпускаются в основном в виде сухой биомассы во флаконах (ампулах).

Проблема повышения эффективности производства пробиотических препаратов предполагает решение задач, связанных с усовершенствованием всех стадий технологического процесса, включая накопление биомассы, стабилизацию бактериальных культур и непосредственное изготовление лекарственных форм. В условиях массового производства пробиотиков возникает необходимость оптимизации способов и метогточеских подходов,

РОС. НАЦИОНАЛЫ- ' БИБЛИОТЕКА J С.Пе оэ

vinuibivt I

используемых при контроле их специфической активности (Осипова, 1997). Решению данной проблемы будет способствовать разработка малозатратных и экспрессных тестов биоиндикации (Бондаренко и др., 2004; Пшеничнов и др., 2005).

Эффективность бактерийных препаратов определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в их состав (Горская и др., 1992; Лыкова, 2000; Алмагалметов и др., 2002; Чупринина, 2002; Буряко и др., 2004). Повышение и расширение спектра биологической активности пробиотиков может быть достигнуто за счет разработки комплексных препаратов на основе специально подобранных бактериальных композиций, включающих совместимые и взаимодополняющие штаммы. Создание препаратов многовидового микробного состава является перспективным направлением в бактериотерапии (Алешкин, Тихонова, 2002; Соколова и др., 2002).

При разработке пробиотиков нового поколения в качестве перспективных рассматривают также препараты на основе биологически активных метаболитов бактерий - представителей нормальной микрофлоры организма человека (Вахитов, Петров, 2002; Вахитов и др., 2004). Экзометаболиты индигенных бактерий стимулируют рост резидентной микрофлоры, подавляют патогенные микроорганизмы, способствуют регенерации эпителия слизистой оболочки и оказывают иммуномодулирующее действие (Шендеров, 1998; Белобородова, Белобородов, 2000; Adebawo et al., 2000; Sablón et al., 2000; McAuliffe et al., 2001). В связи с известной биологической активностью метаболитов лактобактерий (Ленцнер, 1987; Бондаренко и др., 2003; Bogovic, Rogelj, 1999; Ganzle et al., 2000) и потребностью практической медицины в препаратах, обладающих комплексным пробиотическим и иммуномодулирующим действием, разработка нового лекарственного средства на основе продуктов жизнедеятельности лактобактерий представляется весьма актуальной.

Цель настоящего исследования - усовершенствование способов получения и контроля пробиотиков, разработка новых препаратов на основе лактобактерий и их метаболитов.

Основные задачи исследования

1. Разработать эффективные технологические приемы накопления биомассы, стабилизации бактериальных культур и приготовления лекарственных форм, а также унифицировать однотипные операции, применяемые при изготовлении различных пробиотических препаратов: лактобактерина, ацилакта, бифидумбактерина, бификола, колибактерина.

2. Разработать унифицированный комплекс сывороточно-дрожжевых питательных сред для контроля специфической активности пробиотиков и

новые способы определения их антагонистических свойств, позволяющие ограничить использование патогенных тест-штаммов.

3. Провести сравнительную оценку биологических и технологических свойств известных производственных штаммов лактобактерий, сконструировать бактериальную композицию с учетом их совместимости и разработать технологию комплексного пробиотика с повышенной биологической активностью.

4. Разработать способы выделения и стабилизации низкомолекулярных метаболитов лактобактерий для получения нового пробиотического препарата, исследовать его биологическую активность.

Научная новизна. Разработан научно-методологический подход к оптимизации производства пробиотиков, сочетающий использование принципов технологической унификации и учета биологической специфики получаемых препаратов.

Обоснована возможность унификации процесса глубинного реакторного культивирования производственных штаммов бактерий с использованием универсальных основ применяемых питательных сред и рабочих растворов. Для улучшения биологических показателей сухой биомассы разработаны приемы подготовки бактериальных суспензий к лиофилизации, основанные на комплексном применении трофических и протективных свойств обезжиренного молока. Сконструированы составы защитных сред для использования единого режима сублимационного высушивания. Установлено, что применение ксеропротектора, содержащего аэросил, способствуй улучшению технологических характеристик лиофилизированной биомассы. Разработан способ получения сухой биомассы лактобактерий, пригодной для изготовления препарата «Лактобактерин порошок».

В качестве альтернативы сублимационному высушиванию предложен способ стабилизации жидкой бактериальной культуры, обеспечивающий длительное сохранение жизнеспособности клеток и предназначенный для изготовления мягких лекарственных форм пробиотиков. На основе разработанного способа получен препарат «Лактобактерин, суппозитории вагинальные» (Патент на изобретение РФ № 2132690, приоритет от 30.01.1997), а также мазь на основе лактобактерий «Эмулакт» (Патент на изобретение РФ № 2183963, приоритет от 10.08.1999). Показана возможность получения стабильной микрогранулированной биомассы иммобилизированных лакто-, коли- и бифидобактерий (Патент на изобретение РФ № 2076722, приоритет от 29.06.1994).

контроля пробиотических препаратов с применением непатогенных культур в тесте отсроченного антагонизма на плотной питательной среде (патент на изобретение РФ № 2177152, приоритет от 02.12.1999) и предложен новый методический подход для оценки его результатов. Показана возможность использования данного теста для исследования совместимости штаммов в бактериальных композициях. Разработан оригинальный способ определения антагонистической активности пробиотиков на основе реакции угнетения микробиолюминесценции (Патент на изобретение РФ № 2187801, приоритет от 10.07.2000) и предложен экспресс-тест для его применения.

Сконструирована бактериальная композиция из известных производственных штаммов лактобактерий и разработан способ получения на ее основе нового комплексного пробиотика «Лактобактерин-БИЛС сухой», обладающего высокой биологической активностью (Патент на изобретение РФ № 2200566, приоритет от 26.06.2001). Предложен способ выделения и стабилизации метаболитов лактобактерий (Патент на изобретение РФ № 2224018, приоритет от 21.11.2001), с помощью которого получен новый препарат «Микростим», обладающий широким спектром бактериотропного действия. Показана возможность использования метаболитов лактобактерий в технологии пробиотиков при накоплении биомассы и изготовлении лекарственных форм (Патент на изобретение РФ № 2187994, приоритет от 26.10.2000).

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о биотехнологическом потенциале производственных штаммов бактерий, а также возможных способах стабилизации бактериальных культур и методах исследования их антагонистических свойств, методологии конструирования комплексных пробиотических препаратов, диапазоне бактериотропного действия метаболитов лактобактерий и перспективах их применения. Определены закономерности процесса накопления биомассы и стабилизации бактериальных культур в условиях унификации однотипных технологических операций. Результаты исследований свидетельствуют о возможности получения адекватной информации об антагонистической активности пробиотиков без использования патогенных тест-культур.

Практическая значимость работы определяется разработанными эффективными и экономичными технологическими приемами, позволяющими адаптировать процессы изготовления и контроля пробиотиков к условиям массового производства препаратов, а также созданием новых пробиотических препаратов, расширяющих спектр лекарственных средств для нормализации микроэкологического статуса человека.

Разработанные способы накопления биомассы и стабилизации бактериальных культур используются в производстве пробиотиков и включены в нормативную документацию на препараты: «Лактобактерин сухой», «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», «Бифидумбактерин сухой», выпускаемые в Пермском НПО «Биомед». Предложенные методические подходы для контроля антагонистической активности пробиотиков отражены в проектах новых редакций фармакопейных статей предприятия на препараты, включая «Колибактерин сухой» и «Бификол сухой».

Разработана технология новой лекарственной формы лактобактерина -дозированный порошок в пакетах. Предложен состав и технология нового комплексного пробиотического препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой». В результате исследования биологической активности препарата выявлены его существенные преимущества по сравнению с лактобактерином и ацилактом. Показана возможность использования экзометаболитов лактобактерий для получения пробиотиков. Охарактеризована биологическая активность разработанного препарата «Микростим», содержащего метаболиты лактобактерий штамма Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ.

Положения, выносимые на защиту

1. Использование разработанных технологических приемов, включающих применение унифицированных питательных и защитных сред, а также различных вариантов стабилизации бактериальных культур при изготовлении лекарственных форм пробиотиков отвечает потребностям массового производства пробиотических препаратов и способствует повышению его экономической эффективности.

2. Для проведения контроля специфической активности пробиотиков наиболее целесообразно применять унифицированный комплекс питательных сред на основе молочной сыворотки и дрожжевого аутолизата. Использование способа определения антагонистических свойств препаратов, предусматривающего оценку изо- и гомоантагонистической активности, а также экспресс-теста ингибирования микробиолюминесценции, позволяет ограничить применение патогенных тест-культур при их контроле.

3. Биологическая активность комплексного пробиотика «Лактобактерин-БИЛС», разработанного на основе лактобактерий L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus К3Ш24,превосходит таковую препаратов-аналогов (лактобактерин, ацилакт).

4. Новый препарат «Микростим», содержащий низкомолекулярные метаболиты лактобактерий, обладает стимулирующим влиянием на бактерии нормофлоры, а также антибактериальным действием по отношению к ряду патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Научной конференции «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии», Томск, 1991; Научной конференции «Экспериментальная и прикладная иммунология», Пермь, 1991; Научно-практической конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994; Конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 1995; Международной научно-практической конференции «Дисбактериозы и эубиотики», Москва, 1996; I и II Международных конференциях «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы», Пермь, 1996, 2005; Международной научной конференции «Современная вакцинология», Пермь, 1998; Международной научной конференции «Фармация в XXI веке: инновации и традиции», Санкт-Петербург, 1999; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Уфа, 2000; VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2000; Всероссийской конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологаческих и фармацевтических препаратов», Томск, 2001; V Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды», Волгоград-Пермь, 2001; V Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», Санкт-Петербург, 2001; Международной научно-практической конференции «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», Пермь, 2003; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2004; XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2004; Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания», Москва, 2004.

Диссертация апробирована и рекомендована к защите на расширенном заседании Научно-технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и CP РФ «Пермское НПО «Биомед».

По теме диссертации опубликованы 53 печатные работы, из них 8 патентов РФ на изобретение.

«Микроген» МЗ и CP РФ «Пермское НПО «Биомед» (номер госрегистрации: 01.9.80.0.07822,01.200.1.08828,01.200.1.08829).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 277 страницах, содержит 55 таблиц и 29 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 415 источников, из них 236 отечественных и 179 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В экспериментальных исследованиях использовали производственные штаммы: Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, L. fermentum 90T-C4, L. acidophilus K3m24, L. acidophilus NKi, L. acidophilus ЮОаш, Escherichia coli M-17, Bifidobacterium bifidum 1,5. bifidum 791, B. adolescentis MC-42; препараты на их основе: «Лактобактерин сухой», «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», «Бифидумбактерин сухой», «Ацилакт сухой», «Колибактерин сухой», «Бификол сухой» производства «Пермского НПО «Биомед», а также экспериментальные серии разработанного нами нового комплексного пробиотика «Лактобактерин-БИЛС сухой» и препарата «Микростим» из культуральной жидкости лактобактерий.

Глубинное производственное культивирование бактерий проводили периодическим способом в реакторах с применением казеиново-дрожжевых сред. Лиофильное высушивание предварительно замороженных бактериальных культур осуществляли в сублиматорах ТГ-50 (Германия). В качестве ксеропротекторов использовали различные модификации сахарозо-желатино-молочной (СЖМ) среды и новые варианты защитных сред. При разработке технологии порошков и мягких лекарственных форм препаратов применяли вспомогательные вещества, разрешенные к использованию в фармацевтической промышленности. Сыпучесть порошков определяли по массовой скорости истечения (Вальтер, 1983) на приборе ВП-12А (Россия). Определение гигроскопичности образцов порошков проводили весовым методом: навеску порошка выдерживали в эксикаторе (100% влажность) и вычисляли прирост поглощения влаги.

Физико-химические параметры сывороточно-дрожжевых (СД) сред для контроля пробиотиков определяли согласно ФС 42-3874-99 «Физико-химические, химические, физические, иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов» и «Методическим указаниям по применению физико-химических методов контроля питательных сред» (Москва, 1977); биологические показатели (чувствительность, скорость роста и стабильность основных свойств микроорганизмов) исследовали в сравнении с

регламентированными плотными, полужидкими и жидкими питательными средами в соответствии с «Методическими рекомендациями к контролю питательных сред по биологическим показателям» (Москва, 1980).

Изучение специфической активности пробиотиков проводили с использованием регламентированных питательных сред: МРС-1, МРС-2, МРС-4, МРС-5, Гаузе № 2, обезжиренного молока, Блаурокка (производства «Пермского НПО «Биомед»), агара Эндо (производства «НПО «Питательные среды»). Активность кислотообразования пробиотиков исследовали титриметрическим методом, количество жизнеспособных клеток (колонииобразующих единиц - КОЕ) в дозе препарата определяли методом инокуляции и инкубации десятикратных разведений бактериальной культуры, антагонистическую активность изучали с помощью теста отсроченного антагонизма на плотной питательной среде (ФСП 42-0028220301, ФСП 42-0028220201, ФСП 42-0028208401, ФСП 42-0028208301). В качестве тест-культур при определении антагонистических свойств пробиотиков использовали 26 штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов видов: Shigella sonnei, S. flexneri, E. coli, Proteus vulgaris, P. mirabilis, Staphylococcus aureus, S. epidermidis/ Candida albicans, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Enterococcus faecalis (музейных и выделенных из клинического материала в лечебных учреждениях г. Перми). При разработке способа определения антагонистической активности препаратов на основе реакции ингибирования биолюминесценции применяли Микробиолюминесцентный Индикатор Токсичности (МИТ), содержащий лиофилизированную культуру штамма Е. coli lum+ С-50, разработанный профессором Р.А. Пшеничновым с соавт. (1996). Величину подавления пробиотиками свечения МИТ определяли на биолюминометре «Биотокс-6» (Россия) и оценивали с помощью индекса антагонистической активности (ИАА), численно равного проценту ингибирования люминесценции по сравнению с исходным уровнем.

Адгезивность культур лактобактерий изучали на модели эритроцитов человека 0 (I) Rh (+) по методике В.И. Брилис с соавт. (1986) и оценивали с помощью среднего показателя адгезии (СПА). Адгезивность считали низкой при СПА меньше 2, средней - от 2 до 4, высокой - свыше 4.

Антибиотикочувствительность микроорганизмов определяли

дискодиффузионным методом в соответствии с методическими указаниями (Москва, 1983) с использованием набора антибиотиков (оксациллин, цефалексин, гентамицин, тетрациклин, доксициклин, эритромицин, левомицетин, нистатин, клотримазол, рифампицин, канамицин, олеандомицин, стрептомицин, линкомицин) производства НИЦФ, Санкт-Петербург. Для оценки устойчивости и стабильности в секретах желудочно-кишечного тракта

препараты инкубировали при 37 °С в течение 2 ч с соком желудочным натуральным «Эквин» («Иммунопрепарат», Уфа) и желчью медицинской консервированной (ОАО «Омский мясокомбинат») с последующим определением количества жизнеспособных клеток или сохранения биологических свойств.

Физико-химические свойства препарата «Микростим» (сухой остаток, плотность, pH, содержание пептидов, аминный азот) изучали с использованием методов, изложенных в Государственной Фармакопее (ГФ XI) и ФС 42-3874-99. Анализ фракционного состава проводили методом жидкостной хроматографии низкого давления с использованием прибора «LKB» (Швеция). УФ-спектр исследовали на спектрофотометре СФ-46 (Россия) в диапазоне длин волн 240-350 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм при разведении препарата в 50 раз водой очищенной.

Минимальную подавляющую и минимальную бактерицидную концентрации (МПК и МБК) препарата «Микростим» по отношению к патогенным микроорганизмам определяли методом разведений в жидкой и плотной питательной средах (Биргер, 1982). Влияние препарата «Микростим» на метаболизм энтеробактерий оценивали по степени угнетения микробиолюминесценции тест-пггамма Е. coli lum+ С-50. Пробиотическое действие препарата «Микростим» оценивали по влиянию на активность кислотообразования, антагонистическую активность лактобактерий и динамику роста культур лакто- и бифидобактерий. Накопление биомассы оценивали по изменению оптической плотности культур с помощью фотоэлектроколориметра КФК-2 (Россия).

Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики (Гланц, 1999). Статистическую значимость различий между группами оценивали с использованием непарного t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Результаты в таблицах и на рисунках представлены в виде средней арифметической, ее стандартной ошибки (М+ш) и коэффициента корреляции (г).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Усовершенствование способа получения пробиотических препаратов

Данный раздел работы включает разработку технологических приемов, направленных на повышение эффективности и экономичности процесса изготовления пробиотиков. Объектами исследования являются основные технологические стадии (накопление биомассы, стабилизация бактериальной культуры, приготовление лекарственных форм препаратов) в производстве достаточно широкой группы препаратов (лактобактерин, ацилакт, бифидумбактерин, бификол, колибактерин). Методический подход при этом

базируется на сочетании принципа унификации однотипных технологических операций и учета специфики свойств производственных штаммов различной таксономической принадлежности. Оптимизация способа производственного культивирования бактерий предполагает усовершенствование состава питательных сред и параметров (режимов) накопления биомассы. Принцип унификации в данном случае реализован в виде использования универсальной питательной основы производственных сред, а также путем ограничения номенклатуры рабочих растворов, применяемых при периодическом реакторном культивировании (табл. 1).

Таблица 1

Унифицированние реакторное культивирование бактерий в производстве

пробиотиков

Питательная среда Рабочие растворы Уровень накопления биомассы, КОЕ/мл

Препарат Углеводная добавка РН-корректор

Лактобактерин Казеиново-дрожжевая Глюкоза Аммиак 10'°

Бифидумбактерин Казеиново-дрожжевая Глюкоза Аммиак 108- 109

Ацилакт Казеиново-дрожжевая Глюкоза Аммиак ю9

Бификол Казеиново-дрожжевая Глюкоза Аммиак ю8

Колибактерин Казеиново-дрожжевая Глюкоза Аммиак 10'°

Из ранее разработанных (Несчисляев, 1989) унифицированных комплексов производственных питательных сред нами отобраны для практического использования казеиново-дрожжевые (КД) среды, которые отвечают требованиям массового выпуска пробиотических препаратов по совокупности биологических, технологических и экономических параметров. Их модификация включает в основном балансировку состава питательной основы, состоящей из дрожжевого аутолизата и казеинового гидролизата, с учетом трофических потребностей производственных штаммов и необходимости снижения расхода указанных компонентов.

Для изготовления лактосодержащих пробиотиков (лактобактерин, ацилакт) нами предложена единая КД среда с относительно низким содержанием дрожжевого аутолизата (25-30%) и казеинового гидролизата (1015%), которая обеспечивает достаточно высокий (Ю9-Ю10 КОЕ/мл) уровень накопления биомассы производственных штаммов в процессе глубинного

культивирования. Единая КД среда использована нами при разработке реакторного способа культивирования ацидофильных лактобактерий в ходе освоения выпуска ацилакта в НПО «Биомед». При этом изучен характер роста штаммов L. acidophilus К3Ш24, L. acidophilus NK1; L. acidophilus ЮОаш как в монокультурах, так и в ассоциации. Установлено, что КД среда обеспечивает практически одинаковый уровень накопления биомассы этих штаммов. Переход от стационарного к управляемому процессу глубинного культивирования позволяет существенно повысить содержание жизнеспособных клеток в бактериальной взвеси с 108 до 109 КОЕ/мл, а также значительно сократить продолжительность операции.

Для получения бифидосодержащих пробиотиков (бифидумбактерин, бификол) нами модифицирована среда КД № 5 (Поспелова, 1979). Предложенный вариант отличается уменьшенным в 2 раза содержанием компонентов питательной основы и возможностью использования наряду с лактозой и других углеводов при реакторном культивировании бифидобактерий. Данная среда не уступает прототипу по эффективности и обеспечивает высокий уровень (108-109 КОЕ/мл) накопления клеток. При этом оба варианта среды позволяют получать монокультуру В. bifidum 1 (бифидумбактерин), содержащую 109 КОЕ/мл, а в смешанной культуре (бификол) этот показатель составляет 108 КОЕ/мл, что подтверждает более высокую эффективность раздельного накопления биомассы штаммов в производстве комплексного препарата.

Предложенная для изготовления колибактерина КД среда является модификацией казеинового бульона для культивирования Е. coli М-17 (Красик, 1972). Этот вариант среды, содержащий 30-40% казеинового гидролизата и 10-20% дрожжевого аутолизата в качестве частичной замены более дорогого компонента питательной основы, не уступает указанному бульону по эффективности.

Для предотвращения ухудшения ростовых свойств КД сред при термической обработке нами исключено внесение углевода на этапе их приготовления, а необходимая концентрация этого компонента обеспечивается в ходе реакторного культивирования с помощью подачи стерильного раствора. Такой подход не оказывает существенного влияния на уровень накопления клеток и способствует улучшению физических свойств готовых препаратов (цвет и структура сухой биомассы). При сравнительном применении нескольких углеводов в процессах реакторного культивирования производственных штаммов установлено, что по совокупности показателей эффективности и экономичности эти рабочие растворы можно ранжировать следующим образом: глюкоза>сахароза>лактоза. Нами разработан способ получения комплексного корригирующего раствора, содержащего углеводный

компонент и рН-корректор (раствор аммиака). Приготовление такого раствора исключает необходимость термической обработки углевода, а его стерильность обеспечивает 2-6-часовая экспозиция раствора перед использованием.

Получаемые с помощью унифицированных приемов культивирования бактериальные взвеси использовали в исследованиях, связанных с процессом лиофилизации, которая является основным способом стабилизации клеточной биомассы в производстве пробиотических препаратов. Эти исследования включают разработку унифицированного комплекса защитных сред и новых способов подготовки бактериальных культур к сублимационному высушиванию, а также получение сухой биомассы с улучшенными технологическими свойствами для изготовления различных лекарственных форм пробиотиков.

Повышение эффективности процесса лиофилизации предполагает сокращение длительности высушивания препаратов за счет более «жестких» условий сублимации, связанных с интенсивным подогревом биомассы. Это обстоятельство диктует более высокие требования к защитным средам, которые должны обеспечить необходимый биопротективный и структурообразующий эффект. Варианты ксеропротекторов, содержащих желатин, натрий-карбоксиметилцеллюлозу (Ыа-КМЦ), крахмал, поливинилпирролидон (ПВП), а также сахарозу и обезжиренное молоко, для получения флаконных (ампульных) форм пробиотиков апробировали на модели бактериальной суспензии штамма Ь. р1аМагит 8Р-АЗ, которая отличается низкой автектикой и высоким содержанием клеток. Лучший результат отмечен при использовании СЖМ среды, которая, не уступая аналогам по биопротективному действию, обеспечивает получение лактобактерина с необходимой структурой (внешний вид) сухой массы, отвечающей требованиям НД. Это послужило основой разработки для каждого выпускаемого в НПО «Биомед» пробиотика своего варианта СЖМ среды. Использование унифицированного комплекса защитных сред и единого «жесткого» режима сублимации позволило получить выраженный технологический эффект, связанный с сокращением на 20-30% средней продолжительности цикла высушивания каждого препарата.

Высокая влагосорбционная активность обусловливает низкую сыпучесть измельченной сухой биомассы производственных штаммов, особенно лактобактерий, что делает ее малопригодной для изготовления порошков и других лекарственных форм пробиотиков. Для улучшения технологических свойств лиофилизированных субстанций разработан вариант защитной среды, из состава которой исключен структурообразующий высокомолекулярный компонент. Экспериментально подтверждено, что желатин и другие апробированные высокомолекулярные вещества негативно влияют на показатель сыпучести сухой биомассы лактобактерий, а его повышению

способствует введение в состав ксеропротектора аэросила. Защитную сахарозо-молочную среду с добавлением аэросила использовали при разработке технологии препарата «Лактобактерин порошок» (табл. 2).

Таблица 2

Влияние состава ксеропротектора на сыпучесть сухой биомассы лактобактерий

Состав защитной среды

№ Структурообразующий компонент Сахароза Молоко Аэросил лиофилизированной биомассы, г/сек

1 Желатин + + - зависает

2 Иа-КМЦ + + - 1,6±0,2

3 Крахмал + + - 1,5±0,3

4 ПВП + + - 1,8±0,1

5 - + + - 2,1 ±0,2

6 - + + 4,0+0,1**»

Примечание. *** - р<0,001 по сравнению с другими составами.

Подготовка бактериальных культур к высушиванию, помимо внесения ксеропротекторов, составляющих до 40% объема получаемых суспензий, может включать ряд дополнительных операций, направленных на повышение концентрации или устойчивости клеток в материале для лиофилизации. Наш подход при разработке новых способов такой подготовки базировался на комплексном использовании протективных и трофических свойств обезжиренного молока как основного компонента защитной СЖМ среды. На модели штамма В. Ьг/Шит 1, не обладающего способностью сквашивать данный субстрат, показана целесообразность предварительного накопления биомассы бифидобактерий на молоке, что не приводит к ухудшению его защитных свойств. Применение обогащенного клетками протектора способствует повышению содержания жизнеспособных бифидобактерий в получаемой суспензии и, соответственно, в дозе сухого препарата.

Другой вариант комплексного использования молока апробирован на модели штамма Ь. р1аМагит 8Р-АЗ и включает предварительный перевод («трансфазинг») бактериальной культуры из стационарной в лаг-фазу роста. Двукратное разбавление бактериальной взвеси молоком с последующей короткой (2-3 ч) инкубацией суспензии при 37 °С способствует сохранению жизнеспособности клеток при лиофилизации. Разведение бактериальной культуры полностью компенсируется повышением устойчивости

лактобактерий, что позволяет снизить расход клеточной взвеси на 1 дозу сухого лактобактерина (табл. 3).

Таблица 3

Влияние состава и подготовки бактериальной суспензии на сохранение жизнеспособности лактобактерий

Состав бактериальной суспензии Продолжи- Содержание

Вариант Бактериальная взвесь, % Молоко, % Среда СЖ, % тельность трансфазинга, ч жизнеспособных лактобактерий, КОЕ/доза

Опыт 40 40 20 2-3 (2,3±0,15)х10®

Контроль (аналогичный состав) 40 40 20 - (1,7±0,17)х109**

Контроль (производственный вариант) 65 15 20 - (2,3±0,14) хЮ'*

Примечание. * - рХ),05; **-р<0,01 по отношению к опыту.

Способы стабилизации, позволяющие длительно сохранять жизнеспособность клеток при изготовлении препаратов, могут быть основаны как на обезвоживании бактериальных культур, так и на использовании иных физико-химических методов. В качестве альтернативы лиофилизации показана возможность получения сухой биомассы в виде микрогранул с применением вакуумного высушивания, а также разработан способ изготовления мягких лекарственных форм пробиотиков без обезвоживания бактериальных культур. Оба варианта включают иммобилизацию, позволяющую повысить устойчивость клеток к неблагоприятным воздействиям и значительно увеличить продолжительность их жизненного цикла (Синицын, 1994). Способ получения микрогранул, содержащих иммобилизованные бактерии, основан на способности полимерного носителя коагулировать при изменении pH раствора. Бактериальную взвесь смешивают с раствором ацетилфталилцеллюлозы (АФЦ) в растворе натрия гидрокарбоната и вызывают коагуляцию добавлением уксусной кислоты. Образовавшиеся микрогранулы отделяют от жидкой фазы и подвергают 6-8-часовому вакуумному досушиванию. Получаемые при этом образцы микрогранул, содержащие Е. coli М-17, L. plantarum 8Р-АЗ и В. bifidum 1, отличаются повышенной устойчивостью клеток к секретам ЖКТ и стабильностью при длительном хранении. Они могут быть использованы в качестве самостоятельной дозированной лекарственной формы или для изготовления таблеток и капсул.

Изготовление мягких лекарственных форм пробиотиков можно рассматривать как процесс иммобилизации бактериальных культур в массе

носителя (суппозиторная или мазевая основа). Добавление ПАВ в жидкую бактериальную взвесь и смешивание полученной суспензии с носителем создает диффузионные препятствия массообменным процессам клетки, пролонгируя сохранение ее жизнеспособности. Отработка такого подхода на модели штамма Ь. р1аШагит 8Р-АЗ позволила получить суппозитории и мазь с необходимым (12 мес) сроком годности и исключить лиофилизацию при изготовлении данных лекарственных форм лактобактерина.

Полученные результаты исследований в сфере технологии пробиотиков способствовали усовершенствованию производственного процесса и 4-кратному увеличению объема выпуска указанных препаратов в НПО «Биомед» при значительном сокращении расхода сырья и материалов на единицу продукции.

Оптимизация контроля специфической активности пробиотиков

Следующий раздел данной работы включает исследования, связанные с разработкой комплекса питательных сред для определения биологических параметров препаратов, новыми методическими подходами при проведении и оценке теста отсроченного антагонизма, а также с изучением и практическим использованием реакции ингибирования биолюминесценции.

Проблема ограничения номенклатуры актуальна не только для питательных сред для производственного культивирования бактерий, но и для сред, используемых для контроля пробиотиков. С этой целью разработан унифицированный комплекс питательных сред на основе молочной сыворотки и дрожжевого аутолизата, сочетание которых позволяет удовлетворить основные трофические потребности производственных штаммов, входящих в состав лакто-, коли-, бифидумбактерина, бификола и ацилакта. Использование молочной сыворотки обусловлено высоким содержанием в ней азотистых соединений, углеводов, минеральных солей, витаминов, микроэлементов (Алексеева, 1986; Горбатова, 1997). Технологическая обработка молочной сыворотки при получении питательной основы направлена на сохранение ее трофической ценности и включает термообработку и осветление. Способ изготовления СД сред предусматривает раздельную подготовку компонентов питательной основы и их соединение с учетом необходимой концентрации аминного азота (рис. 1). Контроль специфической активности пробиотиков предполагает использование жидких, полужидких и плотных питательных сред, которые, помимо универсальной СД основы, при необходимости должны включать дополнительные компоненты (переменная составляющая), способствующие проявлению и выявлению биологических свойств производственных штаммов. Поэтому состав базовых вариантов сред, содержащих питательную основу и уплотняющее вещество, дополнялся и

подвергался коррекции по результатам апробации. Варианты СД сред испытывали при определении всех параметров специфической активности пробиотиков (препараты и штаммы для их изготовления), а в качестве объектов сравнения использовали регламентированные среды.

Рис. 1. Схема получения сывороточно-дрожжевой питательной среды.

Результаты апробации показали, что СД среды не уступают по чувствительности и эффективности регламентированным средам, обеспечивают стабильность морфологических, биохимических и культуральных свойств микроорганизмов (табл. 4, 5).

Разработанный унифицированный комплекс включает 5 питательных

сред:

1) жидкая среда СД-1 - для определения активности кислотообразования лактобактерина, ацилакта и бифидумбактерина;

2) полужидкая среда СД-2 - для определения КОЕ в 1 дозе лактобактерина, ацилакта и бифидумбактерина;

Активность кислотообразования в жидких питательных средах

Сухой препарат, лиофилизированный штамм Кол-во опытов Кислотообразование, °T

Среда СД-1 Среда МРС-1 Среда Блаурокка Обезжиренное молоко

Лактобактерин 13 252,1515,29* 259,2315,72 - -

Lfermentum 90Т-С4 10 260,7016,00* 262,6015,66 - -

L. plantation 8Р-АЗ 10 258,7017,00* 260,0016,52 - -

Бифидумбактерин 19 111,6912,83* - 112,9212,75 -

В. bifidum 1 10 118,3014,73* - 119,4014,42 -

Ацилакт 15 244,69+4,67* 243,3816,72 - 256,1515,31

L. acidophilus К3Ш24 10 256,9018,38* 257,0018,38 - 264,4018,00

L. acidophilus NKi 10 256,6016,50* 258,5017,53 - 263,7016,80

L. acidophilus 100аш 10 246,1015,86* 247,2016,13 - 253,70+6,34

Примечание. * - р>0,05 по отношению к регламентированной питательной среде.

Сравнительная характеристика полужидких питательных сред для лактобактерий

Сухой препарат, лиофилизи-рованный штамм Кол-во опытов Среда СД-2 Среда МРС-2 Обезжиренное молоко

КОЕ/ доза, хЮ9 Время появления колоний, ч Морфология колоний КОЕ/ доза, хЮ9 Время появления колоний, ч Морфология колоний КОЕ/ доза, хЮ7 Время появления сгустка, ч

Лакто-бактерин 10 4,70± 0,62* 24-48 «Гвоздики», «тяжи» 4,50± 0,69 24-48 «Гвоздики», «тяжи» - -

L. fermentum 90Т-С4 10 4,33± 0,85* 24-48 «Гвоздики», «тяжи» 4,67± 0,76 24-48 «Гвоздики», «тяжи» - -

L. plantarum 8Р-АЗ 10 4,89± 0,65* 24-48 «Гвоздики», «тяжи» 4,56± 0,77 24-48 «Гвоздики», «тяжи» - -

Ацилакт 16 17,82± 6,32#' 48-72 «Крошки», «клубочки» 18,45± 6,81л1 48-72 «Крошки», «клубочки» 17,55± 5,87 72-96

L. acidophilus К3Ш24 10 13,00± 4,71#' 48-72 «Крошки», «клубочки» 14,87± 5,22л' 48-72 «Крошки», «клубочки» 14,07+ 4,53 72-96

L. acidophilus NK, 10 12,25± 4,47#' 48-72 «Крошки», «клубочки» 14,00± 4,%л1 48-72 «Крошки», «клубочки» 13,25± 4,32 72-96

L. acidophilus ЮОаш 10 13,79± 4,99#' 48-72 «Крошки», «клубочки» 15,86± 5,51л' 48-72 «Крошки», «клубочки» 14,93± 4,78 72-96

Примечание. ' - КОЕ/доза, х 107; * - р>0,05 по отношению к среде МРС-2: # - р>0,05 по отношению к среде МРС-2 и обезжиренному молоку; л - р>0,05 по отношению к обезжиренному молоку.

3) полужидкая среда СД-2А, содержащая дополнительно 0,1 г/л азида натрия для подавления роста кишечной палочки - для определения КОЕ бифидобактерий в 1 дозе бификола;

4) плотная среда СД-3 - для определения КОЕ в 1 дозе колибактерина;

5) плотная среда СД-4 - для определения антагонистической активности лактобактерина, ацилакта, колибактерина и бификола в тесте отсроченного антагонизма, а также КОЕ в 1 дозе лактобактерина.

Применение разработанного комплекса питательных сред позволит ограничить номенклатуру контрольных сред и исходных субстратов для их изготовления, будет способствовать унификации и снижению затратности методов определения биологических параметров пробиотиков.

Тест отсроченного антагонизма с использованием регламентированного набора патогенных и условно-патогенных контрольных штаммов является наиболее распространенным при контроле антагонистических свойств пробиотиков (Осипова, 1997). Представляется целесообразным при его проведении ограничить применение патогенных культур и использовать универсальный вариант плотной питательной среды (СД-4).

В искусственно созданных in vitro условиях межпопуляционного взаимодействия подавляющая активность испытуемой бактериальной культуры проявляется в виде гетеро-, гомо- и изоантагонизма в зависимости от таксономической принадлежности тест-штаммов (Гольдина, Соколова, 1975). Из этого следует, что оценить антагонистическую активность пробиотиков можно по любой ее составляющей или их совокупности, а для определения гетеро- и гомоантагонизма не исключено использование наряду с патогенными микробами и сопоставимых с ними по чувствительности непатогенных бактерий, в т.ч. производственных штаммов.

При сравнительном изучении изо-, гомо- и гетероантагонизма пробиотиков на общепринятых средах и среде СД-4 применялись регламентированные условия проведения теста отсроченного антагонизма и соответствующий расширенный набор контрольных культур. Результаты исследований позволили отметить более выраженную ингибирующую активность испытуемых культур в отношении гетерологичных патогенных и непатогенных штаммов по сравнению с антагонизмом внутри вица и рода, а также установить количественные параметры и их соотношение для всех составляющих антагонистической активности пробиотиков с учетом применяемой питательной среды. По нашим данным, показатели изо-, гомо- и гетероантагонизма на регламентированных средах Гаузе №2 и МРС-5 коррелируют с аналогичными показателями на испытуемой среде (г>0,7) и не имеют от них достоверных отличий (р>0,05), что подтверждает возможность использования и универсальность среды СД-4 для данного теста (табл. 6, 7).

Антагонистическая активность Е. coli М-17

Зона задержки роста тест-штаммов, мм

Тест- Среда Гаузе №2 Среда СД-4

штамм Сухой препарат (колибактерин) Сухой препарат (бификол) Лиофилизиро-ванная культура штамма Сухой препарат (колибактерин) Сухой препарат (бификол) Лиофилизиро-ванная культура штамма

S. sonnei 1776 18Д7±0,25 17,73±0,41 17,90±0,64 18,10+0,33# 18,03±0,36# 18,10±0,51#

5. flexneri 337 18,33±0,23 17,77±0,41 18,47±0,68 19,00±0,30# 18,70±0,43# 18,80+0,59#

S. flexneri 170 18,87±0,32 17,60±0,43 17,57±0,48 18,17±0,33# 18,50±0,43# 17,90±0,48#

E. coli 157 18,20±0,32 17,33±0,41 17,60±0,39 18,53±0,38# 18,30±0,41# 18,40±0,69#

P. vulgaris 177 17,67±0,31 17,10±0,38 17,40±0,44 18,93±0,31# 18,33±0,39# 18,80±0,46#

P. mirabilis 249 17,93±0,33 17,40±0,32 17,33±0,46 19,13±0,34# 18,60±0,44# 18,73±0,53#

E. coliM-П 17,07±0,24А 16,5310,20* 17,13±0,34л 15,90±0,34*# 15,47±0,39*# 15,90±0,39*#

L. plantarum 8P-A3 L.fermentum 90T-C4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Примечание. * - р<0,05 по отношению к штаммам из стандартного набора; Л - р>0,05 по отношению к штаммам из стандартного набора; # - р>0,05 по отношению к антагонизму на регламентированной питательной среде.

Антагонистическая активность L. plantation 8Р-АЗ

Зона задержки роста тест-штамма, мм

Тест-штамм Среда МРС-5 Среда СД-4

Сухой Лиофилизиро-ванная культура штамма Сухой Лиофшшзиро-ванная культура штамма

препарат препарат

S.flexneri 170 26,81±0,39 27,17±0,55 25,33±0,44л 25,83±0,64А

S.ßexneri 337 25,83±0,22 26,53±0,71 24,97±0,37л 25,00±0,78А

S. sonnei 1776 26,92±0,39 27,37+0,47 25,81+0,43л 25,83±0,75л

E. coli 157 26,78±0,43 26,70±0,60 25,58+0,37л 25,17±0,59л

P. vulgaris 177 26,25±0,49 26,17±0,63 25,78±0,29л 24,63±0,56л

P mirabilis 249 2б,97±0,43 26,13±0,77 25,64±0,46л 24,43±0,52л

S aureus 209 24,94±0,38 25,20±0,71 24,19±0,47л 24,50±0,51л

E coli M-17 30,39±0,43 29,89±0,65 30,36±0,48л 30,07±0,86л

L. plantarum 8P-A3 16,08±0,38* 16,07±0,36» 12,22±0,24*# 12,97±0,44*#

Lfermentum 90T-C4 16,50±0,87* 16,27±0,32* 12,47±0,25*# 12,97±0,43*#

Примечание. * - р<0,05 по отношению к штаммам из стандартного набора; А - р>0,05 по отношению к антагонистической активности на регламентированной питательной среде; # - р<0,05 по отношению к антагонистической активности на регламентированной питательной среде.

Высокая степень корреляции показателей изо-, гомо- и гетероантагонизма позволяет модифицировать методические подходы при контроле производственных штаммов и препаратов на их основе. Контроль штаммов, основанный на оценке активности по отношению к патогенным и условно-патогенным культурам, целесообразно дополнить определением изо-, а также, при необходимости, гомо- или гетероантагонизма с использованием непатогенных тест-штаммов. Рациональный подход к контролю серий коммерческих препаратов предполагает определение изо-, гомо- и (или) гетероантагонизма без применения патогенных и условно-патогенных культур, что позволяет исключить необходимость использования специальных помещений и оборудования, а также дезинфекцию отработанных материалов.

Анализ результатов и методических основ постановки теста отсроченного антагонизма позволяет сделать вывод, что проявление антагонистических свойств у испытуемой бактериальной культуры не вызывает сомнений, если

величина зон подавления роста гетеро- и (или) гомологичных штаммов превышает аналогичный показатель в отношении изологичного штамма, ингибирование роста которого связано, очевидно, с функционированием системы «чувство кворума» (Гинцбург, 2003; Gary, 1997).

Развитие in vitro бактериальной культуры, обладающей антагонистической активностью, сопровождается продукцией комплекса метаболитов, ингибирующих функциональную активность и развитие других популяций. Следовательно, оценить антагонистические свойства пробиотиков можно не только по подавлению роста, но и по степени угнетения отдельных функций тест-культур. Наш подход базируется на использовании феномена ингибирования микробиолюминесценции, фиксируемого с помощью люминометра. В качестве объекта воздействия пробиотиков применяли культуру Е. coli lum+ С-50, которая является биоиндикатором люминесцентной тест-системы «Эколюм», разработанной P.A. Пшеничновым с соавт.

После определения оптимальных условий совместной экспозиции изучено влияние препаратов и их разведений на люминесценцию сенсора (рис. 2).

и О ъс

I цельный препарат Iконтроль

■ свечение с цельным препаратом

■ свечение с разведенным в 5 раз

] разведенный в 10 раз

- свечение с разведенным в 2 раза

- свечение с разведенным в 10 раз

Рис. 2. Динамика биолюминесценции и выживаемости МИТ при контакте с лактобактерином на основе штамма Ь. р1аШагит 8Р-АЗ.

Полученные результаты позволяют выявить зависимость уровня свечения тест-культуры от концентрации каждого пробиотика и продолжительности совместной экспозиции. Установлено, что цельные препараты, за исключением бифидумбактерина, быстро и необратимо с первых минут экспозиции ингибируют микробиолюминесценцию. Уменьшение концентрации препарата

сопровождается снижением данного эффекта. При разведении в 10 раз все пробиотики, за исключением колибактерина, на протяжении длительного периода или до конца экспозиции (24 ч) вызывают стимуляцию свечения биосенсора. Цельные препараты существенно влияют на жизнеспособность клеток сенсора, отмиранию которых предшествует угнетение свечения. Показатели ингибирования биолюминесценции (% снижения свечения по сравнению с контролем) и количество КОЕ биосенсора находятся в сильной обратной зависимости, что подтверждает высокую индикативность культуры Е coli lum+ С-50 для исследования антагонистических свойств пробиотиков. При сопоставлении результатов ингибирования биолюминесценции (на 30 мин и 2 ч экспозиции) и показателей отсроченного антагонизма в отношении штамма Е. coli lum+ С-50 выявлена сильная прямая корреляция между величиной угнетения свечения и размером зон подавления роста сенсора у всех цельных пробиотиков (г>0,7).

Для практического применения реакции ингибирования микробиолюминесценции нами предложен вариант теста, включающий 2-часовую экспозицию пробиотика и сенсора для определения параметров и динамики гашения его свечения. Проведенные исследования позволяют установить количественные показатели угнетения люминесценции, характеризующие уровень антагонистической активности препарата (табл. 8).

Таблица 8

Критерии оценки антагонистической активности пробиотиков в

тесте ингибирования биолюминесценции

Уровень антагонистической активности препарата Угнетение люминесценции тест-штамма Е. coli lum+ С-50 (ИАА), %

Продолжительность совместной экспозиции

0,5 ч 2ч

Высокий >70 >80

Средний 50-70 60-80

Низкий <50 <60

Сопоставляя общеизвестные и предлагаемый способ контроля антагонизма пробиотиков, следует отметить следующие достоинства разработанного теста: экспрессность (регистрация эффекта при кратковременной экспозиции), универсальность (оценка препаратов из разных видов бактерий), экономичность (без использования питательных сред и патогенных культур). Данный тест может быть применен в качестве основного или дополнительного при контроле пробиотических препаратов.

Разработка комплексного пробиотического препарата «Лактобактерин-БИЛС»

Наряду с усовершенствованием способов получения и контроля известных препаратов, настоящая работа включает исследования по созданию новых пробиотиков на основе лактобактерий и их метаболитных комплексов. Известно, что моновидовые пробиотики, в т.ч. лактосодержащие, обладают ограниченными биологическими свойствами, обусловленными потенциалом одного вида бактерий, и уступают по терапевтической эффективности комплексным препаратам (Алешкин, 2002). Конструирование новых пробиотиков не исключает использование потенциала известных производственных штаммов, оптимальное сочетание которых существенно влияет на качественные характеристики комплексных препаратов. С целью создания нового комплексного препарата из известных производственных культур лактобактерий проведено сравнительное изучение биологических и технологических свойств штаммов L. plantarum 8Р-АЗ, L. fermentum 90Т-С4, L. acidophilus К3Ш24, L. acidophilus ЮОаш, L. acidophilus NK[. Исследование биологических свойств включало оценку активности кислотообразования, адгезивности, устойчивости к антибактериальному действию биологических жидкостей (желудочный сок, желчь), антагонистической активности и антибиотикочувствительности.

Результаты изучения адгезии на модели человеческих эритроцитов свидетельствуют о низкой степени активности производственных штаммов лактобактерий. При сравнительной оценке не выявлено достоверных различий между адгезивными свойствами L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90Т-С4, а также у штаммов внутри вида L. acidophilus. Последние даже в низком диапазоне адгезивности значительно уступают L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90Т-С4 (р<0,05).

При изучении устойчивости штаммов к секретам ЖКТ подтверждена высокая резистентность L. plantarum 8Р-АЗ к желудочному соку и желчи. Лактобактерии вида L. acidophilus проявляют меньшую устойчивость по сравнению с L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90Т-С4. Отмечена более высокая устойчивость к воздействию биологических жидкостей штамма L. acidophilus К3Ш24 среди вида L. acidophilus.

Изучение кислотообразования производственных штаммов позволило выявить особенности динамики этого процесса в зависимости от питательного субстрата и видовой принадлежности бактериальных культур. По эффекту сквашивания молока (среда для определения активности кислотообразования) выявлены значительные различия в дозах инокулята, что позволяет дифференцировать штаммы видов L. fermentum, L. plantarum и L. acidophilus (табл. 9).

Таблица 9

Активность кислотообразования и сквашивание молока лактобактериями

Штамм Кислотообра-зование, °Т Разведение дозы инокулята (108 КОЕ/мл)

10"' Ю-2 Ю-3 Ю-4 Ю-5 ю-6 ю-7 ю-8

L. acidophilus ЮОаш 253,7016,34* + + + + + + + 1

L. acidophilus NK, 263,70±6,80* + + + + + + + 1

L. acidophilus КзШ« 264,4018,00* + + + + + + + ±

L. fermentum 90Т-С4 140,6013,17 + + + + + 1 - -

L. plantarum 8P-A3 134,0013,14 + + + 1 - - - -

Примечание. + - образование сгустка; * - р>0,05 по отношению к другим штаммам этого вида.

Антагонистическую активность производственных штаммов лактобактерий определяли in vitro методом отсроченного антагонизма на плотной питательной среде МРС-5 в отношении стандартного набора тест-штаммов, используемых при контроле пробиотиков. Установлено, что наибольшей ингибирующей активностью обладают штаммы L. fermentum 90Т-С4 и L. plantarum 8Р-АЗ. Лактобактерии вида L. acidophilus слабее подавляют рост тест-культур (р<0,01), внутри вида достоверных различий по антагонистической активности не выявлено.

При изучении антибиотикочувствительности лактобактерий к ряду препаратов, часто применяемых в лечебной практике, установлено, что штаммы вида L. acidophilus проявляют чувствительность почти ко всем использованным антибиотикам, кроме канамицина и линкомицина. Штаммы L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90Т-С4 показали значительную устойчивость к выбранным антибиотикам, за исключением левомицетина, рифампицина и олеандомицина. По резистентности бактериальных культур к антибиотикам производственные штаммы лактобактерий можно разделить на две группы: устойчивых (L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90Т-С4) и чувствительных (L. acidophilus). Внутри групп достоверных различий по чувствительности не обнаружено.

в процессе хранения. По уровню накопления биомассы при глубинном культивировании с использованием казеиново-дрожжевой среды выявлено преимущество L. plantarum 8Р-АЗ по сравнению с другими штаммами. Накопление биомассы у трех штаммов L. acidophilus не имело существенных различий, но значительно уступало L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90Т-С4 (рис. 3).

■*— L acidophilus К3Ш24 L acidophilus ЮОаш *— L acidophilus NKl Wt-L fermentum 90T-C4 L plantarum SP-Ai

3 4 5 6

Время культивирования, ч

Рис. 3. Динамика накопления биомассы лактобактернй.

Результаты определения количества живых клеток в сухой культуре после лиофилизации свидетельствуют, что по чувствительности к неблагоприятному воздействию данного фактора исследуемые штаммы вполне сопоставимы, потеря жизнеспособных клеток составляет около 50%. В процессе хранения сухих культур в течение 12 мес при температуре (б±2) °С количество живых клеток уменьшается не более, чем на 24%.

Анализ совокупности биологических и технологических свойств исследованных штаммов лактобактерий, а также исходные требования к комплексному препарату позволили определить перспективные в производственном отношении двухкомпонентные бактериальные композиции: L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus NKi; L. plantarum 8P-A3 и L. acidophilus К3Ш24; L. plantarum 8P-A3 и L. acidophilus ЮОаш. С помощью теста отсроченного гомоантагонизма на плотной питательной среде изучен уровень совместимости штаммов в указанных композициях. По результатам анализа нами выбрана композиция, включающая L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus JC3HI24. Эти культуры оказывают наименьшее ингибирующее влияние друг на друга по сравнению с другими вариантами композиций. Выбор бактериальной

композиции позволил перейти к технологическому этапу создания нового препарата, получившего название «Лактобактерин-БИЛС».

В ходе разработки технологии нового препарата нами унифицирован процесс приготовления маточных культур лактобактерий на основе использования питательной среды МРС-1 для трех последовательных пассажей каждого штамма. При сравнительном изучении качественных показателей маточных культур, изготовленных по общепринятому и предлагаемому способам, получены сопоставимые результаты, достоверных отличий не отмечено. Данный способ приготовления маточных культур позволяет упростить приемы работы, связанные с использованием различных питательных сред, а также исключить применение сред МРС-4, МРС-2 (L. plantation 8Р-АЗ) и обезжиренного молока (L. acidophilus К3Ш24).

При изучении возможности совместного реакторного культивирования выбранных штаммов лактобактерий применялась КД среда. Установлено, что, развиваясь в ассоциации, штамм L. plantarum 8Р-АЗ достигает уровня накопления биомассы, достоверно сопоставимого с монокультурой, при этом показатель выживаемости ацидофильных лактобактерий уступает монокультуре в среднем на один порядок. Поэтому в технологию препарата включен метод раздельного культивирования (табл. 10).

Таблица 10

Эффективность процессов культивирования лактобактерий

Количество жизнеспособных клеток, lg КОЕ/мл

Раздельное культивирование Совместное культивирование

L. plantarum L. acidophilus L. plantarum L. acidophilus

8Р-АЗ К3Ш24 8Р-АЗ К3Ш24

10,1710,07* 9,2110,28** 10,2510,02 8,3010,66

Примечание. * - р>0,05 по отношению к совместному культивированию, ** - р<0,05 по отношению к совместному культивированию.

При получении препарата в виде сухой биомассы во флаконах в качестве защитной среды для высушивания бактериальной суспензии нами применялась СЖМ среда, обеспечивающая необходимые физические свойства нового пробиотика. Стандартизация препарата включала апробацию регламентированных методов контроля лактосодержащих пробиотиков и выбор наиболее адекватных. Методы определения биологических показателей, используемые при контроле лактобактерина (исключая определение количества жизнеспособных клеток в дозе препарата), позволяют достоверно оценить свойства лактобактерина-БИЛС, поэтому они включены в НД на новый препарат.

Раздельный количественный учет бактериальных составляющих препарата был предусмотрен на этапе конструирования композиции, в его основу положены существенные видовые отличия штаммов по характеру роста на питательных средах и по ферментативной активности. Штамм L. plantarum 8Р-АЗ достоверно обнаруживается в композиции с помощью стандартных методов контроля на средах МРС-2 и МРС-4, предусмотренными НД на препараты «Лактобактерин сухой» и «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», присутствие штамма L. acidophilus К3Ш24 в данных условиях не влияет на результат анализа. Количество бактерий штамма L. acidophilus К3Ш24 в препарате позволяет определить метод, представленный в НД на «Ацилакт сухой», по эффекту сквашивания обезжиренного молока.

Так как лактобактерин- БИЛ С включает штаммы, применяемые при изготовлении лактобактерина и ацилакта, при исследовании биологической активности нового препарата данные пробиотики применялись в качестве препаратов сравнения. В рамках доклинического изучения лактобактерина-БИЛС определены следующие характеристики: активность кислотообразования, антагонистические свойства, адгезивность, чувствительность к антибактериальному воздействию.

При исследовании кислотообразования установлено, что лактобактерин-БИЛС по динамике и достигаемому уровню кислотности (> 200°Т) культуральной среды не уступает аналогам и превосходит лактобактерин при инкубации в молоке (р<0,05). В комплексном препарате не отмечено негативного взаимовлияния штаммов на активность кислотообразования.

При исследовании устойчивости препаратов к действию секретов ЖКТ (желудочный сок, желчь) отмечено снижение чувствительности в составе комплексного препарата штамма L. acidophilus К3Ш24 по сравнению с монокультурой. Этот эффект, вероятно, связан с протективным действием в смешанной популяции метаболитов штамма L. plantarum 8Р-АЗ, который отличается высоким уровнем устойчивости. Анализ показателей чувствительности препаратов к антибиотикам подтвердил зависимость этого параметра от исходных свойств производственных штаммов, входящих в их состав. По нашим данным ацилакт проявляет устойчивость только к канамицину и линкомицину. Лактобактерин-БИЛС и лактобактерин обладают широким спектром устойчивости, соответствующей штамму L. plantarum 8Р-АЗ.

По антагонистической активности новый препарат, как показали результаты тестов отсроченного антагонизма и ингибирования микробиолюминесценции, значительно превосходит препараты сравнения. На среде МРС-5 величина зон подавления роста патогенных и условно-патогенных тест-штаммов, в том числе выделенных из клинического материала, у лактобактерина-БИЛС всегда превышает 30 мм и в 2 раза выше

показателей ацилакта. Лактобактерин также существенно уступает новому препарату по параметрам воздействия на все группы контрольных культур (р<0,01) (табл. 11).

Таблица 11

Антагонистическая активность препаратов

Тест-штаммы Зоны задержки роста тест-штаммов, мм

Лактобактерин Ацилакт Лактобактерин-БИЛС

S.flexneri 170 26,81±0,39 15,87±0,41 36,5010,93-''*

S. sonnei 177 б 26,92±0,39 16,10±0,42 37,8810,70**

S flexneri 337 25,97±0,44 15,73±0,28 33,5010,48**

E. coli 157 26,78±0,43 15,23±0,44 35,4110,37**

P. vulgaris 177 26,25±0,49 15,0010,37 33,2510,67**

P. mirabilis 249 26,97±0,43 15Д7±0,27 37,7510,81**

S. aureus 209 24,94±0,38 15,60±0,42 33,1210,24**

В. cereus ATCC 10702 32,50±1,08 15,50±0,81 38,3310,92**

E coli ATCC 25922 30,83±0,96 15,5011,12 35,5611,06**

P. aeruginosa ATCC 9027 31,25+0,75 12,6710,55 40,0510,47**

S. aureus ATCC 65-38-P 27,67±0,66 9,51+0,32 35,5611,06**

S. flexneri 3a № 652 31,5010,92 - 39,0010,77**

S. typhimurium № 619 29,00±0,88 - 36,1010,68**

K. pneumoniae № 154 29,50±0,78 - 35,5010,62**

P. mirabilis № 257 29,00+0,82 - 36,1010,93**

E. coli № 969 28,50±0,74 - 38,4010,65**

S. aureus № 1655 27,50±0,98 - 36,ЗОЮ,77**

S epidermidis № 159 27,50+0,76 - 33,4010,61**

Примечание. ** - р<0,01 по отношению к препаратам-аналогам.

Изучение адгезивных свойств препаратов свидетельствует о том, что показатели лактобактерина и ацилакта соответствуют диапазону низкой адгезивности. Лактобактерин-БИЛС превосходит препараты-аналоги по СПА, величина которого позволяет оценить степень его адгезивности как среднюю, обусловленную эффектом суммации и характеризующую взаимовлияние штаммов в новом пробиотике (табл. 12).

Адгезивные свойства препаратов

Препарат Средний показатель адгезии Степень адгезивности

Лактобактерин 1,50±0,15 низкая

Ацилакт 0,56±0,13 низкая

Лактобактерин-БИЛС 2,44±0,16** средняя

Примечание. ** - р<0,01 по отношению к другим препаратам.

Результаты исследования биологических свойств препаратов свидетельствуют о том, что лактобактерин-БИЛС по большинству параметров превосходит пробиотики-аналоги. Это позволяет предполагать более высокую терапевтическую эффективность нового комплексного препарата.

Получение пробиотического препарата «Микростнм» из культуральной жидкости лактобактерий

Наряду с конструированием комплексного бактерийного препарата проведены исследования по разработке пробиотика на основе низкомолекулярного метаболитного комплекса лактобактерий. Культуральная жидкость (КЖ) лакто- и бифидобактерий, которая в ряде случаев является отходом производства, содержит комплекс биологически активных метаболитов, обладающих пробиотическим и иммуномодулирующим действием (Шендеров, 1998; Белобородова, 2000; Хавкин, 2003; Messens, 2002), что определяет целесообразность ее применения в качестве сырья для изготовления лекарственных препаратов.

Для получения препарата «Микростим» нами использована КЖ производственного штамма лактобактерий L. plantarum 8Р-АЗ, выбор которого обусловлен высокой иммунобиологической активностью его метаболитов и их значительным содержанием в исходном сырье. Технология препарата включает отделение низкомолекулярной фракции КЖ по окончании фазы логарифмического роста культуры путем концентрирования бактериальной взвеси методом ультрафильтрации и последующую термическую обработку ультрафильтрата при 110 °С в течение 30 мин. Установлено, что термообработка ультрафильтрата КЖ не только обеспечивает стабильность его биологических свойств на протяжении длительного срока хранения (4 года), но и повышает специфическую активность препарата (табл. 13). Термическое воздействие, вероятно, вызывает инактивацию супрессорных метаболитов, не влияя на стимуляторы роста бактериальной культуры, которые по данным ряда исследователей (Sanders et al., 1999; Diep et al., 2000; Scheunemann, Poquet, 2003) устойчивы к нагреванию.

Микростим представляет собой прозрачную жидкость светло-коричневого цвета, которая содержит 10-11 мг/мл сухих веществ, в том числе 4,5-5,5 мг/мл пептидов. Максимум поглощения в УФ-спектре равен 265±5 нм.

Таблица 13

Влияние термической стерилизации на биологическую активность ультрафильтрата культуральиой жидкости лактобактерий

Показатели Ультрафильтрат культуральной жидкости лактобактерий

До термообработки После термообработки

Коэффициент стимуляции роста лактобактерий 2,12±0,07 2,68±0,21*

Коэффициент стимуляции кислотообразования лактобактерий 1,52±0,04 1,6710,05*

Коэффициент стимуляции антагонистической активности лактобактерий по отношению к Е. coli 157 1,23+0,03 1,40±0,04**

Примечание. * - р<0,05; ** - р<0,01 в сравнении с ультрафильтратом до термообработки.

При гельхроматографии на сефадексе 0-25 в препарате «Микростим» определяются 2 пика с молекулярной массой менее 1450 Д (рис. 4 а), которые не выявляются при исследовании ультрафильтрата КД среды (рис. 4 б), используемой для культивирования лактобактерий. Последнее свидетельствует о том, что наличие данных пиков обусловлено присутствием бактериальных метаболитов.

По нашим данным микростим обладает широким спектром бактериотропного действия, в том числе проявляет выраженную пробиотическую активность. Препарат стимулирует рост и кислотообразование лакто- и бифидобактерий (табл. 14). Следует отметить эффект значительного повышения под действием микростима антагонизма лактобактерий к патогенным и условно-патогенным микробам, так как именно ингибирующая активность нормофлоры обеспечивает колонизационную резистентность (Воробьев, 1999; Черкасов, 2001) (табл. 15). Препарат оказывает стимулирующее влияние на показатели антагонистической активности как культуры-продуцента, так и других штаммов лактобактерий. При этом микростим стимулирует только гетероантагодичм дгцстрбактерий и не изменяет их ингибирующую активность по от

БИБЛИОТЕКА С. Петербург 08 30« акт

Е, 206 нм у0 <| 50-

403020

Л I I

0 I I I I I II И I I I I I I I I I I И I I

10 20 30

.............

40 50

Номер фракции

Рис. 4. Хроматографический профиль препарата «Микростим» (а) и ультрафильтрата питательной среды (б) на сефадексе С-25.

Стандарты: У0 - свободный объем колонки (голубой декстран); 1 - ингибитор трипсина (6500 Д); 2 бацитрацин (1450 Д); 3 - 8ис-А1а-А1а-А1а-р№ (415 Д).

Таблица 14

Стимулирующее влияние препарата «Микростим» на рост и активность кислотообразования лакто- и бифидобактерий

Штамм

Контроль

Препарат «Микростим»

Величина прироста оптической плотности через 24 ч, В540

Ь. р1апгагит 8Р-АЗ Ь. /егтепШт 90Т-С4 В. Ы/гс1ит 1

0,14+0,01 0,13±0,01 0,20+0,03

0,3510,02*** 0,34±0,01*** 0,31+0,04*

Величина прироста кислотности через 24 ч, °Т

Ь. р1апшгит 8Р-АЗ 16,92±0,62 27,3810,90***

1. /егтепШт 90Т-С4 21,33±0,84 34,0011,53***

В. Ы/^ит 1 5,13±0,77 8,88+1,36***

Примечание. Здесь и в табл. 15, * - р<0,05; *** - р<0,001 относительно контроля. ■ ■ • ,

Таблица 15

Влияние препарата «Микростим» на антагонистическую активность Ь. р1ап1агит 8Р-АЗ к патогенным микроорганизмам

Тест-штамм Зона задержки роста тест-штамма, мм

Контроль Микростим

S. sonnei 177 б 26,80±0,41 42,6010,65***

S flexneri 337 25,80+0,58 39,6011,50***

Е coli 157 26,83±0,60 37,5011,09***

Р. vulgaris 177 27,8010,37 36,40Ю,51***

P. mirabilis 249 28,17Ю,60 35,6710,33***

S aureus 209 29,0010,52 38,1710,87***

Положительный эффект получен при использовании микростима в качестве растворителя сухих пробиотиков. Препарат повышает биологическую активность лактобактерина и бифидумбактерина, а также увеличивает резистентность бифидобактерий к желудочному соку и желчи (рис. 5).

3 3 | цЭ

□ "Бифидумбактерин", регидратированный 0,9% раствором натрия хлорида (контроль)

□ "Бифидумбактерин", регидратированный препаратом "Микростим"

I ■ " " 11 I

Исходное После 30 мин После 2 ч количество инкубации в инкубации в бактерий желудочном желчи соке

Рис. 5. Влияние препарата «Микростим» на устойчивость бифидобактерий к секретам желудочно-кишечного тракта.

** - р<0,01; *** - р<0,001 в сравнении с исходным показателем; ш - р<0,001 в сравнении с показателем в контроле после инкубации в желудочном соке и желчи.

лактобактерий, что, вероятно, связано с благоприятным действием низких концентраций желудочного сока на общий метаболизм молочнокислых бактерий. Таким образом, при пероральном приеме возможно повышение пробиотической активности препарата.

Культуральная жидкость лактобактерий содержит целый комплекс антимикробных метаболитов (летучие жирные кислоты, перекись водорода, этанол, лизоцим, бактериоцины, бактериоциноподобные вещества и другие соединения) (Бухарин, 2002; Блинкова, 2003; Doeschel, 1989; Christi, 1992), поэтому нами проведены исследования по оценке влияния микростима на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы. Установлено, что препарат оказывает антибактериальное действие на возбудителей инфекций, таких как шигеллы, кишечная палочка, протей, клебсиеллы, синегнойная палочка, золотистый стафилококк и другие. К действию препарата чувствительна как грамотрицательная, так и грамположительная микрофлора. Минимальная подавляющая концентрация микростима при внесении в мясопептонный бульон составляет - 30-50%, а при внесении препарата в мясопептонный агар -10-30%. Бактерицидный эффект микростима развивается быстро, в течение первых 5 мин контакта бактерий с препаратом (рис. 6).

Время инкубации

Рис. 6. Кинетика бактерицидного действия препарата «Микростим» на Е.соП 1иш+ С-50.

а - контрольная проба (инкубация без препарата); б - 10% препарата в среде культивирования; в - 30%; г - 40%; д - 50%; е - инкубация в цельном препарате

Полученные данные позволяют предположить, что мишенью действия низкомолекулярных метаболитов лактобактерий, содержащихся в препарате,

служит цитоплазматическая мембрана бактериальной клетки. Это согласуется с данными других исследователей (Егоров, 1999; McAuliffe et al., 2001), согласно которым большинство лантибиотиков оказывает антимикробное действие путем нарушения структуры цитоплазматической мембраны с образованием в ней мультимерных пор.

Проведенные исследования показали, что микростим угнетает общий метаболизм энтеробактерий Е. coli lum+ С-50, что проявляется снижением интенсивности биолюминесценции. Установлено, что при совместной экспозиции с МИТ микростим (pH 4,5±0,2, цельный и разведенный в 2, 5 и 10 раз) с первых минут необратимо и полностью угнетает свечение биосенсора. При разведении препарата в 100 раз получены результаты, свидетельствующие о том, что в контрольных точках экспозиции (30 мин, 2 ч) он ингибирует биолюминесценцию МИТ не менее, чем на 50% (рис. 7).

s я

и в ж

100

80 *

60 -

40 -

20 ■

6f.

5 мин 30 мин 1ч 2 ч

Время экспозиции

Рис. 7. Влияние препарата «Микростим» на биолюминесценцию Е. coli Inm+ С-50.

а - препарат, разведенный в 10 раз; б - разведенный в 100 раз.

микробов (рис. 8 а). Микростим повышает чувствительность и к антибиотикам, являющимися ингибиторами синтеза белка, таким как гентамицин, тетрациклин и доксициклин. В этом случае положительный эффект препарата реализуется, по-видимому, за счет повышения проницаемости клеточной стенки микроорганизма для антибиотика.

I '■ I

нистатин клспримазол

оксашшшн шфапексин гентамицин тетрациклин □ Контроль □ Инкубация с препаратом 'Микростим"

Рис. 8. Влияние препарата «Микростим» на антибнотикочувствительность 5. aureus 209 (а) и С. albicans АТС С 885-653 (б).

По оси ординат: диаметр зоны задержки роста. *** - р<0,001 относительно контроля.

При изучении действия препарата на антибнотикочувствительность дрожжеподобных грибов, отличающихся повышенной устойчивостью к антибиотикам и метаболитам лактобактерий, установлено, что микростим статистически значимо повысил чувствительность Candida albicans АТСС 885-653 к нистатину и клотримазолу - антибиотикам, нарушающим целостность цитоплазматической мембраны грибов (рис. 8 б).

Высокая биологическая активность ультрафильтрата КЖ лактобактерий может быть использована в технологии пробиотиков, в частности, бифидумбактерина. Применение микростима в качестве компонента питательных сред позволяет снизить риск развития контаминантной микрофлоры при культивировании бифидобактерий.

Наряду с изучением бактериотропного действия, в ходе доклинических испытаний препарата исследована его безопасность и иммунобиологическая активность. В настоящее время препарат «Микростим», так же как препарат «Лактобактерин-БИЛС», прошел предварительную экспертизу в Государственном институте стандартизации и контроля медицинских иммунобиологических препаратов им. Л.А. Тарасевича.

ВЫВОДЫ

1. Разработана адаптированная к условиям массового производства технология пробиотиков, предусматривающая применение унифицированных питательных и защитных сред, а также единого режима сублимации для получения препаратов в виде сухой биомассы во флаконах. Разработанная технология обеспечивает увеличение объема выпускаемой продукции и снижение ее себестоимости.

2. Разработан эффективный ксеропротектор, содержащий аэросил и способствующий улучшению технологических свойств лиофилизированной биомассы лактобактерий. Экспериментально обосновано, что введение аэросила в состав защитной среды снижает скорость процесса влагопоглощения и повышает степень сыпучести сухой биомассы.

3. Разработан оригинальный способ получения мягких лекарственных форм (суппозитории, мазь) лактобактерина, содержащих жидкую бактериальную культуру штамма L. plantarum 8Р-АЗ. Стабилизирующие свойства веществ, входящих в состав мазевых и суппозиторных основ, способствуют длительному сохранению жизнеспособности лактобактерий, что позволяет получать препарат со сроком годности 12 мес.

4. Сконструирован унифицированный комплекс жидких, полужидких и плотных питательных сред на основе молочной сыворотки и дрожжевого аутолизата, предназначенный для контроля специфической активности пробиотиков (лактобактерина, ацилакта, бифидумбактерина, бификола и колибактерина). Сфера его применения включает определение показателей кислотообразования, отсроченного антагонизма и количества жизнеспособных клеток в дозе пробиотического препарата.

5. Разработан способ определения антагонистической активности пробиотических препаратов с применением непатогенных контрольных штаммов в тесте отсроченного антагонизма на плотной питательной среде. Впервые показана возможность использования реакции ингибирования микробиолюминесценции для экспресс-тестирования антагонистических свойств пробиотиков.

6. Сконструирована бактериальная композиция и разработан способ получения комплексного препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой», содержащего штаммы лактобактерий L plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus К3Ш24 Предложен способ контроля специфической активности нового пробиотика, предусматривающий количественный учет каждого бактериального компонента его композиции. Выявлены преимущества разработанного препарата по сравнению с биологической активностью препаратов-аналогов -ацилакта и лактобактерина.

7. Разработан новый пробиотический препарат «Микростим», полученный оригинальным способом из культуральной жидкости лактобактерий, стимулирующий рост, кислотообразование, антагонистическую активность лакто- и бифидобактерий, оказывающий антибактериальное действие на ряд патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и повышающий их антибиотикочувствительность. Препарат сохраняет бактериотропную активность при воздействии секретов желудочно-кишечного тракта и стабилен в процессе хранения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Несчисляев В .А., Кравцова Н.Б. Технологические перспективы в производстве препаратов для бактериотерапии/ЛЗ кн.: Актуальные вопросы медицинской биотехнологии: Матер, научн. конф. - Томск, 1991. - С. 133-134.

2. Несчисляев В.А., Логинов С.В., Харченко Д.А., Кравцова Н.Б. К вопросу концентрирования бактериальных суспензий в производстве препаратов для бактериотерапии//В кн.: Экспериментальная и прикладная иммунология: Тез. докл. научн. конф. - Пермь, 1991. - С. 22.

3. Шарипова И.С., Сергевнин В.И., Красинский Э.Л., Федяева А.П., Несчисляев В.А., Кравцова Н.Б. Оценка лечебно-профилактического действия свечей с лактобактерином на микробиоценоз кишечника детей//Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 1993. - № б. - С. 30-31.

4. Чупринина Р.П., Евлашкина В.Ф., Несчисляев В.А. Стабильность жизнеспособности лактобактерина//В кн.: Дисбиотические состояния человека, пути профилактики и лечения: Тез. докл. научно-практ. конф. - Пермь, 1993. -С. 22-23.

5. Шарипова И.С., Поспелова В.В., Несчисляев В.А., Красавина H.A., Ханина Г.И. Применение биопрепаратов в ректальных суппозиториях для коррекции дисбактериозов кишечника у детей//В кн.: Медицинские аспекты микробной экологии. - Выпуск 7/8. - 1993/1994. - Москва, 1994. - С. 210-213.

6. Молохова Е.И., Тарасевич В.Н., Несчисляев В.А. Разработка состава суппозиториев с лактобактерином//Фармация. - 1994. - № 2. - С. 28-30.

7. Пучнин B.C., Чугунова H.H., Молохова Е.И., Несчисляев В.А. К вопросу стабилизации биомассы при изготовлении лекарственных форм препаратов для бахтериотерапии//В кн.: Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии: Матер, докл. научно-практ. конф. - Пермь, 1994. -С. 30-31.

8. Молохова Е.И., Несчисляев В.А., Пучнин B.C., Пшенникова Г.В., Чугунова H.H. Проблемы создания лекарственных форм препаратов лакто- и бифидобактерий//В кн.: Человек и лекарство: Тез. докл. II Рос. национального конгресса. - Москва, 1995. - С. 321.

9. Несчисляев В.А., Пучнин B.C., Чугунова H.H., Молохова Е.И. Способы стабилизации биомассы при изготовлении лекарственных форм эубиотиков//В кн.: Дисбактериозы и эубиотики: Тез. докл. научно-пракг. конф. - Москва, 1996. -С. 26.

10. Петров В.Ф., Несчисляев В.А. Технологические аспекты крупносерийного производства эубиотиков//Там же. - С. 29.

11. Несчисляев В.А., Пучнин B.C., Чугунова H.H. К вопросу повышения эффективности эубиотиков//В кн.: Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы: Тез. докл. I Междунар. конф. - Пермь, 1996, - С. 72-73.

12. Несчисляев В.А. Пробиотики: ретроспектива, проблемы и достижения научно-производственной практики НПО «Биомед»//Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 1998. - № 2. - С. 100-102.

13. Несчисляев В.А., Вдовина Т.П., Пучнин B.C., Чугунова H.H., Молохова Е.И., Рагузина C.B. Разработка способов стабилизации биомассы при изготовлении лекарственных форм лактобактерина//Там же. - С. 102-104.

14. Несчисляев В.А., Арчакова Е.Г., Рагузина C.B. К вопросу определения антагонистической активности эубиотиков//В кн.: Современная вакцинология: Тез. докл. П Междунар. конф. - Пермь, 1998. - С. 142-143.

15. Молохова Е.И., Несчисляев В.А., Панкратова Г.А., Пучнин B.C., Чугунова H.H., Чугунов П.В. Перспективные разработки по созданию новых лекарственных форм препаратов бактериотерапии/ЛГам же. - С. 146 - 147.

16. Молохова Е.И., Несчисляев В.А. Выбор состава и оценка качества мазевой композиции с лактобациллами//В кн.: Фармация в XXI веке: инновации и традиции: Тез. докл. Междунар. научн. конф. - Санкт-Петербург. - 1999. - С. 64.

17. Молохова Е.И., Несчисляев В.А., Фадеева И.В., Чистохина Л.П. Мази на основе жидких бактериальных культур и культур альных жидкостей лактобацилл//В кн.: Человек и лекарство: Тез. докл. VII Рос. национального конгресса. - Москва, 2000. - С. 616.

18. Фадеева И.В., Несчисляев В.А., Молохова Е.И. Получение стабильной биомассы при изготовлении мягких лекарственных форм пробиотиков//В кн.: Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы: Матер, юбилейной межвузовской научно-практ. конф. Пермской государственной фармацевтической академии. - Пермь, 2000. - С. 167.

19. Чистохина Л.П., Несчисляев В.А., Сафонова Г.М. Разработка биологически активных препаратов на основе культуральных жидкостей лакто- и бифвдобактерий//Там же. - С. 168.

20. Несчисляев В.А., Фадеева И.В., Чистохина Л.П., Молохова Е.И. Стабилизация бактериальной биомассы при изготовлении мягких лекарственных форм лактобактерина//В кн.: Актуальные вопросы разработки, производства и

применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Матер. Всерос. конф. - Уфа, 2000. - Ч. 1. - С. 188-190.

21. Несчисляев В.А., Арчакова Е.Г., Чистохина Л.П., Фадеева И.В. Модификация метода оценки in vitro антагонистической активности колибактерина//Там же. - С. 186-188.

22. Несчисляев В.А., Фадеева И.В., Чистохина Л.П. К вопросу разработки лекарственных форм пробиотиков//В кн.: Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Матер, конф. - Томск, 2001. - С. 54-55.

23. Несчисляев В.А., Сафонова Г.М., Чистохина Л.П. К вопросу о влиянии препарата, полученного из культуральной жидкости лактобахтерий, на систему иммунитета//Там же. - С. 56-57.

24. Пшеничнов P.A., Несчисляев В.А., Царегородцев A.B. Оценка эффективности пробиотиков в реакции ингибирования микробиолюминесценции с препаратом МИТ//В кн.: Проблемы загрязнения окружающей среды: Тез. докл. V Междунар. конф. - Пермь - Волгоград, 2001. - С. 90.

25. Поспелова В.В., Несчисляев В.А., Воропгалина H.H., Фадеева И.В., Чистохина Л.П., Канаева E.H. Лекарственные формы пробиотиков для местного применения, их разработка и перспективы исследований/УВ кн.: Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования: Матер. Междунар. научно-практ. конф. - Москва, 2002. - С. 11.

26. Несчисляев В .А., Сафонова Г.М., Чистохина Л.П. Новый пробиотический препарат «Микростим»//Там же. - С. 49.

27. Несчисляев В.А., Фадеева И.В., Молохова Е.И., Тодер В.П. Влияние ксеропротекторов на технологические свойства сухой биомассы лактобактерий// В кн.: Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке: Матер. Всерос. научн. конф. - Пермь, 2003. - С. 268-270.

28. Несчисляев В.А., Фадеева И.В. Биологические свойства препарата лакгобактерин-БИЛС//Там же. - С. 277-279.

29. Несчисляев В.А., Пшеничнов P.A., Чистохина Л.П. Влияние метаболитов лактобактерий на рост и интенсивность биолюминесценции Escherichia coli Z-905 lumV/Там же. - С. 270-273.

30. Чистохина Л.П., Сафонова Г.М., Несчисляев В.А. Изменение фагоцитарной активности нейтрофилов крови при длительном введении препарата «Микростим»//Там же. - С. 317-319.

31. Несчисляев В.А., Арчакова Е.Г., Павленко И.В., Скудаева Л.К. Новые питательные среды для контроля специфической активности пробиотиков//Там же. -С. 280-282.

32. Лемешева М.И., Несчисляев В.А. Подбор и конструирование питательных сред для выращивания бифидобактерий//Там же. - С. 290-293.

33. Пшеничное P.A., Несчисляев В.А. Генно-инженерный гибрид Escherichia coli lum+ С-50: селекция, конструирование на его основе сенсора МОТ, перспективы применения//Там же. - С. 274-277.

34. Молохова Е.И., Чистохина Л.П., Несчисляев В.А. Новые мазевые основы на базе культуральных жидкостей лактобацилл//В кн.: Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Матер, конф. - Пятигорск, 2003. -С. 139-141.

35. Несчисляев В.А., Чистохина Л.П., Моховикова В.Б. Пути повышения биологической активности пробиотиков//В кн.: Человек и лекарство: Тез. докл. XI Рос. национального конгресса. - Москва, 2004. - С. 464.

36. Несчисляев В.А., Фадеева И.В. Сравнительное изучение биологических свойств нового комплексного пробиотика и препаратов-аналогов//Пермский мед. журнал. - 2004. - Т. 21, № 1. - С. 87-90.

37. Несчисляев В.А., Чистохина Л.П. О способности препарата «Микростим» влиять на чувствительность ряда патогенных микроорганизмов к антибиотикам//Там же. - № 2. - С. 96-99.

38. Несчисляев В.А., Арчакова Е.Г., Пшеничное P.A. Экспресс-тест для контроля антагонистической активности колибактерина//Сибирский мед. журнал. - 2004. - Т. 19, № 2.- С. 37-38.

39. Сафонова Г.М., Несчисляев В.А., Чистохина Л.П. Оценка безопасности нового пробиотика, содержащего метаболиты лактобактерий//Там же. - С. 38-40.

40. Молохова Е.И., Демешева М.И., Несчисляев В.А. Разработка состава капсулированной лекарственной формы с бифидобакгериями/Лам же. -С.58-59.

41. Арчакова Е.Г., Несчисляев В.А. Оценка эффективности применения новой питательной среды для контроля антагонистической активности пробиотиков// Объединенный мед. журнал. - 2004. - № 2 (5). - С. 93-94.

42. Несчисляев В.А., Фадеева И.В., Моховикова В.Б. Изучение устойчивости лакто- и бифидобактерий к биологическим жвдкостям//В кн.: Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Матер. Всерос. научн. конф. -Томск, 2004. -С. 130-132.

43. Демешева М.И., Несчисляев В.А., Молохова Е.И. Биотехнологические аспекты производства бифидосодержащих пробиотиков//В кн.: Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания: Матер. Междунар. конф. -Москва, 2004. -С. 183-184.

44. Несчисляев В.А. Модуляция бактериальных культур в производстве пробиотиков//Там же. - С. 192-193.

45. Несчисляев В.А., Арчакова Е.Г., Моховикова В.Б. Применение казеиново-дрожжевой питательной среды для контроля активности

кислотообразования бифидобактерий//В кн.: Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал: Тез. докл. II Междунар. конф. -Пермь-Казань-Пермь, 2005. - С. 72-73.

46. Пучнин B.C., Чугунова H.H., Несчисляев В.А. Способ получения сухой биомассы лакто-, коли- или бифидобактерий. Патент на изобретение РФ № 2076722. Приоритет от 29.06.94. Бюл. № 10,1997.

47. Несчисляев В.А. Способ получения суппозиториев бактерийных препаратов для коррекции дисбактериозов. Патент на изобретение РФ № 213690. Приоритет от 30.01.97. Бюл. № 19,1999.

48. Несчисляев В.А., Арчакова Е.Г., Чистохина Л.П., Фадеева И.В., Чупринина Р.П., Осипова И.Г., Евлашкина В.Ф. Способ контроля антагонистической активности препаратов для лечения и профилактики дисбактериозов. Патент на изобретение РФ № 2177152. Приоритет от 02.12.1999. Бюл. № 35,2001.

49. Несчисляев В.А., Петров В.Ф., Молохова Е.И., Фадеева И.В., Чистохина Л.П. Мазь «Эмулакт» для лечения и профилактики инфекционно-воспалительных гинекологических заболеваний и дисбактериозов. Патент на изобретение РФ № 2183963. Приоритет от 10.08.1999. Бюл. № 18, 2002.

50. Несчисляев В.А., Пшеничнов P.A., Арчакова Е.Г., Чистохина Л.П., Фадеева И.В. Способ определения антагонистической активности пробиотиков. Патент на изобретение РФ № 2187801. Приоритет от 10.07.2000. Бюл. № 23, 2002.

51. Чистохина Л.П., Мерзлякова H.A., Фадеева И.В., Несчисляев В.А., Молохова Е.И. Способ приготовления основы для лекарственных и косметических средств. Патент на изобретение РФ № 2187994. Приоритет от 26.10.2000. Бюл. № 24,2002.

52. Несчисляев В.А., Фадеева И.В. Способ получения лактобактерина. Патент на изобретение РФ № 2200566. Приоритет от 26.07.2001. Бюл. № 8,2003.

53. Несчисляев В.А., Чистохина Л.П. Способ получения биологического стимулятора. Патент на изобретение РФ № 2224018. Приоритет от 21.11.2001. Бюл. № 5,2004.

НЕСЧИСЛЯЕВ Валерий Александрович

ПРОБИОТИКИ: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОЛУЧЕНИЯ, КОНТРОЛЯ И КОНСТРУИРОВАНИЯ ПРЕПАРАТОВ

Автореферат

Лицензия ПД-11 -0002 от 15.12.99.

Подписано в печать - 26.10.2005. Тираж 120 экз. Усл. печ. л.3,0 Формат 60x84/16. Набор компьютерный. Заказ № 1425/2005.

Отпечатано на ризографе в отделе Электронных издательских систем ОЦНИТ Пермского государственного технического университета 614600, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к. 113, т. (342) 219-80-33

№21721

РНБ Русский фонд

2006-4 19416

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Несчисляев, Валерий Александрович

Список основных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ПРОБИОТИКИ: МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ,

ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРОИЗВОДСТВА.

1.1. Значение и функции нормальной микрофлоры организма человека, роль лактобактерий.

1.2. Актуальные вопросы изготовления и контроля пробиотических препаратов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ

ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ.

3.1. Унификация глубинного культивирования производственных бактериальных штаммов.

3.2. Повышение эффективности процесса лиофилизации в технологии пробиотиков.

3.3. Разработка альтернативных способов стабилизации бактериальных культур и изготовление лекарственных форм пробиотиков.

ГЛАВА 4. ОПТИМИЗАЦИЯ КОНТРОЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ ПРОБИОТИКОВ.

4.1. Разработка унифицированного комплекса питательных сред для определения специфической активности пробиотиков.

4.2. Оптимизация теста отсроченного антагонизма на плотной питательной среде.

4.3. Использование реакции ингибирования микробиолюминесценции для определения антагонистической активности пробиотиков.

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО

ПРЕПАРАТА «ЛАКТОБАКТЕРИН-БИЛС».

5.1. Конструирование бактериальной композиции: сравнительная характеристика и оценка совместимости производственных штаммов лактобактерий.

5.2. Особенности технологии и методы контроля комплексного препарата.

5.3. Сравнительная характеристика биологических свойств лактобактерина-БИЛС и препаратов-аналогов.

ГЛАВА 6. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА «МИКРОСТИМ» ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ЛАКТОБАКТЕРИЙ.

6.1. Разработка технологии и физико-химические параметры препарата.

6.2. Исследование влияния микростима на микроорганизмы

6.3. Основные направления использования культуральной жидкости лактобактерий в технологии пробиотиков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пробиотики: микробиологические и технологические аспекты получения, контроля и конструирования препаратов"

Актуальность проблемы. Современные условия жизнедеятельности человека характеризуются постоянным влиянием неблагоприятных био-, техно- и социогенных факторов, интенсивность воздействия которых часто превышает компенсаторные возможности микроэкологической системы макроорганизма [11, 31, 68, 229, 362]. Нарушения микробиоценоза играют существенную роль в патогенезе большого количества заболевания различной этиологии, что позволяет рассматривать проблему коррекции дисбиозов как общемедицинскую [21, 89, 107, 157, 202, 220, 239]. Этим обусловлена необходимость обеспечения практического здравоохранения широким арсеналом эффективных и доступных пробиотических препаратов, предназначенных для поддержания и восстановления симбиотических микробиоценозов человека [94, 102, 133, 158, 226, 287, 375]. Актуальной задачей для отечественного производства пробиотиков является выпуск конкурентоспособных препаратов, которые по своим потребительским характеристикам не должны уступать импортным аналогам. Основными направлениями прикладных исследований в области пробиотиков являются: разработка новых препаратов с повышенной биологической активностью, новых лекарственных форм и оптимизация технологического процесса [75, 134, 153, 156, 195]. Массовый выпуск препаратов для бактериотерапии вызывает также необходимость оптимизации способов их контроля [147].

Клинические исследования последних лет открывают новые стороны позитивного воздействия пробиотиков на физическое состояние человека [33, 119, 313, 339]. Это позволяет расширять сферу их применения (акушерство и гинекология, стоматология, дерматология и др.) и определяет необходимость создания лекарственных форм, адекватных новым способам аппликации и требованиям к потребительским свойствам препаратов (суппозитории, мази, кремы, порошки, капсулы, таблетки) [165, 177, 290, 353]. В связи с этим разработка и усовершенствование технологий указанных фармакопейных форм, являются актуальными для производства пробиотиков, которые выпускаются в основном в виде сухой биомассы во флаконах (ампулах).

Проблема повышения эффективности производства пробиотических препаратов предполагает решение задач, связанных с усовершенствованием всех стадий технологического процесса, включая накопление биомассы, стабилизацию бактериальных культур и изготовление лекарственных форм. В условиях массового производства пробиотиков актуальна проблема оптимизации способов и методических подходов, используемых при контроле их специфической активности [147]. Решению данной проблемы будет способствовать разработка адекватных, малозатратных и экспрессных тестов биоиндикации [170].

Эффективность бактерийных препаратов определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в их состав [12, 37, 63, 123, 164, 225]. Повышение и расширение спектра биологической активности пробиотиков может быть достигнуто за счет разработки комплексных препаратов на основе специально подобранных бактериальных композиций, включающих совместимые и взаимодополняющие штаммы. Создание препаратов многовидового микробного состава является перспективным направлением в бактериотерапии [И, 185].

При разработке пробиотиков нового поколения в качестве перспективных рассматривают препараты на основе биологически активных метаболитов бактерий - представителей нормальной микрофлоры организма человека [43, 45]. Экзометаболиты индигенных бактерий стимулируют рост резидентной микрофлоры, подавляют патогенные микроорганизмы, способствуют регенерации эпителия слизистой оболочки и оказывают иммуномодулирующее действие [27, 39, 227, 327, 343, 370, 380]. В связи с известной биологической активностью метаболитов лактобактерий [32, 48j 119, 255, 278, 292, 329] и потребностью практической медицины в препаратах, обладающих комплексным пробиотическим и иммуномодулирующим действием, разработка нового лекарственного средства на основе продуктов жизнедеятельности лактобактерий является весьма актуальной.

Основные задачи исследования:

2. Разработать унифицированный комплекс сывороточно-дрожжевых питательных сред для контроля специфической активности пробиотиков и новые способы определения их антагонистических свойств, позволяющие ограничить использование патогенных тест-штаммов.

Для улучшения биологических показателей сухой биомассы разработаны приемы подготовки бактериальных суспензий к лиофилизации, основанные на комплексном применении трофических и протективных свойств обезжиренного молока. Сконструированы составы защитных сред для использования единого режима сублимационного высушивания. Установлено, что применение ксеропротектора, содержащего аэросил, способствует улучшению технологических характеристик лиофилизированной биомассы. Разработан способ получения сухой биомассы лактобактерий, пригодной для изготовления препарата «Лактобактерин порошок».

В качестве альтернативы сублимационному высушиванию предложен способ стабилизации жидкой бактериальной культуры, обеспечивающий длительное сохранение жизнеспособности клеток и предназначенный для изготовления мягких лекарственных форм пробиотиков. На основе разработанного способа получен препарат «Лактобактерин, суппозитории вагинальные» (патент на изобретение РФ № 2132690, приоритет от 30.01.1997), а также мазь на основе лактобактерий «Эмулакт» (патент на изобретение РФ № 2183963, приоритет от 10.08.1999). Показана возможность получения стабильной микрогранулированной биомассы иммобилизированных лакто-, коли- и бифидобактерий (патент на изобретение РФ № 2076722, приоритет от 29.06.1994).

Для контроля специфической активности пробиотиков сконструирован унифицированный комплекс жидких, полужидких и плотных питательных сред на основе молочной сыворотки и дрожжевого аутолизата. Разработан способ контроля пробиотических препаратов с применением непатогенных культур в тесте отсроченного антагонизма на плотной питательной среде (патент на изобретение РФ № 2177152, приоритет от 02.12.1999) и предложен новый методический подход для оценки его результатов. Показана возможность использования данного теста для исследования совместимости штаммов в бактериальных композициях. Разработан оригинальный способ определения антагонистической активности пробиотиков на основе реакции угнетения микробиолюминесценции (патент на изобретение РФ № 2187801, приоритет от 10.07.2000) и предложен экспресс-тест для его практического применения.

Сконструирована бактериальная композиция из известных производственных штаммов лактобактерий и разработан способ получения на ее основе нового комплексного пробиотика «Лактобактерин-БИЛС сухой», обладающего высокой биологической активностью (патент на изобретение РФ № 2200566, приоритет от 26.06.2001). Предложен способ выделения и стабилизации метаболитов лактобактерий (патент на изобретение РФ № 2224018, приоритет от 21.11.2001), с помощью которого получен новый препарат «Микростим», обладающий широким спектром бактериотропного действия. Показана возможность использования метаболитов лактобактерий в технологии пробиотиков при накоплении биомассы и изготовлении лекарственных форм (патент на изобретение РФ № 2187994, приоритет от 26.10.2000).

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют существующее представление о биотехнологическом потенциале производственных штаммов бактерий, а также о возможных способах стабилизации бактериальных культур и методах исследования их антагонистических свойств, методологии конструирования комплексных пробиотических препаратов, диапазоне бактериотропного действия метаболитов лактобактерий и перспективах их применения. Определены закономерности процесса накопления биомассы и стабилизации бактериальных культур в условиях унификации однотипных технологических операций. Результаты исследований свидетельствуют о возможности получения адекватной информации об антагонистической активности пробиотиков без использования патогенных тест-культур.

Практическая значимость работы определяется разработанными эффективными и экономичными технологическими приемами, позволяющими адаптировать процессы изготовления и контроля пробиотиков к условиям массового производства препаратов, а также созданием новых пробиотических препаратов, позволяющих расширить спектр лекарственных средств для нормализации микроэкологического статуса человека.

Разработанные способы накопления биомассы и стабилизации бактериальных культур используются в производстве пробиотиков и включены в нормативную документацию на препараты: «Лактобактерин сухой», «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», «Бифидумбактерин сухой», выпускаемые в Пермском НПО «Биомед». Предложенные методические подходы при контроле антагонистической активности пробиотиков отражены в проектах новых редакций фармакопейных статей предприятия на препараты, включая «Колибактерин сухой» и «Бификол сухой».

Положения, выносимые на защиту

1. Использование разработанных технологических приемов, включающих применение унифицированных питательных и защитных сред, а также различных вариантов стабилизации бактериальных культур при изготовлении лекарственных форм пробиотиков, отвечает потребностям массового производства пробиотических препаратов и способствует повышению его экономической эффективности.

3. Биологическая активность комплексного пробиотика «Лактобактерин-БИЛС», разработанного на основе лактобактерий L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus К3Ш24, превосходит таковую препаратов-аналогов (лактобактерин, ацилакт).

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Научной конференции «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии», Томск, 1991; Научной конференции «Экспериментальная и прикладная иммунология», Пермь, 1991; Научно-практической конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994; Конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 1995; Международной научно-практической конференции «Дисбактериозы и эубиотики», Москва, 1996; I и II Международных конференциях «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы», Пермь, 1996, 2005; Международной научной конференции «Современная вакцинология», Пермь, 1998; Международной научной конференции «Фармация в XXI веке: инновации и традиции», Санкт-Петербург, 1999; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Уфа, 2000; VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2000; Всероссийской конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2001; V Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды», Волгоград-Пермь, 2001; V Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», Санкт-Петербург, 2001; Международной научно-практической конференции «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», Пермь, 2003; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2004; XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2004; Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания», Москва, 2004.

По теме диссертации опубликованы 53 печатные работы, из них 8 патентов РФ на изобретение.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена на базе отделения препаратов бактериотерапии и лаборатории биорегуляторов в соответствии с планом НИР филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и CP РФ «Пермское НПО «Биомед» (номер госрегистрации: 01.9.80.0.07822, 01.200.1.08828, 01.200.1.08829).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Несчисляев, Валерий Александрович

233 ВЫВОДЫ

4. Сконструирован унифицированный комплекс жидких, полужидких и плотных питательных сред на основе молочной сыворотки и дрожжевого аутолизата, предназначенных для контроля специфической активности пробиотиков (лактобактерина, ацилакта, бифидумбактерина, бификола и колибактерина). Сфера его применения включает определение показателей кислотообразования, отсроченного антагонизма и количества жизнеспособных клеток в дозе пробиотического препарата.

6. Сконструирована бактериальная композиция и разработан способ получения комплексного препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой», содержащего штаммы лактобактерий L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus К3Ш24. Предложен способ контроля специфической активности нового пробиотика, предусматривающий количественный учет каждого бактериального компонента его композиции. Выявлены преимущества разработанного препарата по сравнению с биологической активностью препаратов-аналогов - ацилакта и лактобактерина.

7. Разработан новый пробиотический препарат «Микростим», полученный оригинальным способом из культуральной жидкости лактобактерий, стимулирующий рост, кислотообразование, антагонизм лакто-и бифидобактерий, оказывающий антибактериальное действие на ряд патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и повышающий их антибиотикочувствительность. Препарат сохраняет бактериотропную активность при воздействии секретов желудочно-кишечного тракта и стабилен в процессе хранения. I I

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интенсивное развитие теории и прикладных направлений медицинской микробной экологии значительно углубляет научные представления о значении нормальной микрофлоры для жизнедеятельности человека. Нарушения микробиоценоза макроорганизма под воздействием био-, техно- и социогенных факторов играют существенную роль в патогенезе большого количества заболеваний различной этиологии, что позволяет рассматривать проблему коррекции дисбиозов как общемедицинскую. Комплексная терапия дисбиотических состояний включает в качестве основного и обязательного этапа использование пробиотических препаратов, расширяющаяся сфера применения которых требует адекватного обеспечения их потребительских свойств [31, 68, 89, 225]. Необходимость сохранения и повышения конкурентоспособности отечественных пробиотиков на фармацевтическом рынке стимулирует проведение исследований, связанных с разработками новых препаратов и модернизацией существующих технологий.

Первый раздел настоящей работы, связанный с усовершенствованием способа получения пробиотических препаратов, включал разработку технологических приемов, направленных на повышение эффективности и экономичности процесса изготовления пробиотиков (лактобактерин, ацилакт, бифидумбактерин, бификол, колибактерин). Методический подход при этом базировался на сочетании принципа унификации однотипных технологических операций и учета специфики свойств производственных штаммов различной таксономической принадлежности.

Оптимизация способа производственного культивирования бактерий предполагает усовершенствование состава питательных сред и параметров (режимов) накопления биомассы. Принцип унификации в данном случае был реализован в виде использования универсальной питательной основы производственных сред, а также путем ограничения номенклатуры рабочих растворов, применяемых при периодическом реакторном культивировании.

Из ранее разработанных нами [138] унифицированных комплексов производственных питательных сред были отобраны для практического использования казеиново-дрожжевые среды. Последующая их модификация включала в основном балансировку состава питательной основы, состоящей из дрожжевого аутолизата и казеинового гидролизата, с учетом трофических потребностей производственных штаммов и необходимости снижения расхода указанных компонентов.

Для изготовления лактосодержащих пробиотиков (лактобактерин, ацилакт) предложена единая КД среда с относительно низким содержанием дрожжевого аутолизата (25-30%) и казеинового гидролизата (10-15%), которая обеспечивает достаточно высокий (Ю9-Ю10 КОЕ/мл) уровень накопления биомассы производственных штаммов в процессе глубинного культивирования.

Единая КД среда применялась при разработке реакторного способа культивирования ацидофильных лактобактерий в ходе освоения выпуска ацилакта в НПО «Биомед». Был изучен характер роста штаммов L. acidophilus К3Ш24, L. acidophilus NKb L. acidophilus ЮОаш как в монокультурах, так и в ассоциации. Установлено, что КД среда обеспечивает практически одинаковый уровень накопления биомассы этих штаммов. Переход от стационарного к управляемому процессу глубинного культивирования позволил повысить содержание жизнеспособных клеток в бактериальной о Q взвеси с 10 до 10 КОЕ/мл, а также значительно сократить продолжительность операции.

Была модифицирована среда КД №5 [166] для получения бифидосодержащих пробиотиков (бифидумбактерин, бификол). Предложенный вариант отличается уменьшенным в 2 раза содержанием компонентов питательной основы и возможностью использования наряду с лактозой и других углеводов при реакторном культивировании бифидобактерий. Данная среда не уступает прототипу по эффективности и о q обеспечивает высокий уровень (10 -10 КОЕ/мл) накопления клеток. При этом оба варианта среды КД №5 позволяют получать монокультуру В, bifidum 1 (бифидумбактерин), содержащую 109 КОЕ/мл, а в смешанной культуре о бификол) этот показатель составляет 10 КОЕ/мл, что подтверждает более высокую эффективность раздельного накопления биомассы штаммов в производстве комплексного препарата.

Предложенная для изготовления колибактерина КД среда является модификацией казеинового бульона для культивирования Е. coli М-17 [103]. Этот вариант среды, содержащий 30-40% казеинового гидролизата и 10-20% дрожжевого аутолизата в качестве частичной замены более дорогого компонента питательной основы, не уступает указанному бульону по эффективности.

Для предотвращения ухудшения ростовых свойств КД сред при термической обработке было исключено внесение углевода на этапе их приготовления, а необходимая концентрация этого компонента обеспечивается в ходе реакторного культивирования с помощью подачи стерильного раствора. Такой подход, не оказывая существенного влияния на уровень накопления клеток, способствовал улучшению физических свойств готовых препаратов (цвет и структура сухой биомассы).

При сравнительном применении нескольких углеводов в процессах реакторного культивирования производственных штаммов было установлено, что по совокупности показателей эффективности и экономичности эти рабочие растворы можно ранжировать следующим образом: глюкоза>сахароза>лактоза.

Для применения в производственных условиях был разработан способ получения комплексного корригирующего раствора, содержащего углеводный компонент и рН-корректор (аммиак). Приготовление такого раствора исключает необходимость термической обработки углевода, а его стерильность обеспечивает 2-6-часовая экспозиция раствора перед использованием.

Получаемые с помощью унифицированных приемов культивирования бактериальные взвеси были использованы в исследованиях, связанных с процессом лиофилизации, которая является основным способом стабилизации клеточной биомассы в производстве пробиотических препаратов. Эти исследования включали разработку унифицированного комплекса защитных сред и новых способов подготовки бактериальных культур к сублимационному высушиванию, а также получение сухой биомассы с улучшенными технологическими свойствами для изготовления различных лекарственных форм пробиотиков.

Повышение эффективности процесса лиофилизации предполагает сокращение длительности высушивания препаратов за счет более «жестких» условий сублимации, связанных с интенсивным подогревом биомассы. Это обстоятельство диктует более высокие требования к защитным средам, которые должны обеспечить необходимый биопротективный и структурообразующий эффект. Варианты ксеропротекторов, содержащих желатин, Na-КМЦ, крахмал, ПВП, а также сахарозу и обезжиренное молоко, для получения флаконных (ампульных) форм пробиотиков апробировали на модели бактериальной суспензии штамма L. plantarum 8Р-АЗ, которая отличается низкой эвтектикой и высоким содержанием клеток. Лучший результат был отмечен при использовании СЖМ среды, которая, не уступая аналогам по биопротективному действию, обеспечивала получение лактобактерина с необходимой структурой (внешний вид) сухой массы, отвечающей требованиям НД. Это послужило основой разработки для каждого выпускаемого в НПО «Биомед» пробиотика своего варианта СЖМ среды. Использование унифицированного комплекса защитных сред и единого «жесткого» режима сублимации позволило получить выраженный технологический эффект, связанный с сокращением на 20-30% длительности цикла высушивания каждого препарата.

Высокой влагосорбционной активностью обусловлена низкая сыпучесть измельченной сухой биомассы производственных штаммов, особенно лактобактерий, что делает ее малопригодной для изготовления порошков и других лекарственных форм пробиотиков. Для улучшения технологических свойств лиофилизированных субстанций был разработан вариант защитной среды, из состава которой был исключен структурообразующий высокомолекулярный компонент. Было установлено, что желатин и другие апробированные высокомолекулярные вещества негативно влияют на показатель сыпучести сухой биомассы лактобактерий, а его повышению способствует введение в состав ксеропротектора аэросила. Защитная сахарозо-молочная среда с добавлением аэросила была использована при разработке технологии препарата «Лактобактерин порошок», а также порошковой и капсульной форм бифидумбактерина.

Подготовка бактериальных культур к высушиванию, помимо внесения ксеропротекторов, может включать ряд дополнительных операций, направленных на повышение концентрации или устойчивости клеток в материале для лиофилизации. Наш подход при разработке новых способов такой подготовки базировался на комплексном использовании протективных и трофических свойств обезжиренного молока как основного компонента защитной СЖМ среды. На модели штамма В. bifidum 1, не обладающего способностью сквашивать данный субстрат, была показана целесообразность предварительного накопления биомассы бифидобактерий на молоке, что не приводит к ухудшению его защитных свойств. Применение обогащенного клетками протектора способствует повышению содержания жизнеспособных бифидобактерий в получаемой суспензии и, соответственно, в дозе сухого препарата. Другой вариант комплексного использования молока был апробирован на модели штамма L. plantarum 8Р-АЗ и включал предварительный перевод («трансфазинг») бактериальной культуры из стационарной в лаг-фазу роста. Двукратное разбавление бактериальной взвеси молоком с последующей короткой (2-3 ч) инкубацией суспензии при 37 °С способствовало сохранению жизнеспособности клеток при лиофилизации.

Разведение бактериальной культуры при ее модуляции полностью компенсировалось повышением устойчивости лактобактерий.

Способ получения микрогранул, содержащих иммобилизованные бактерии, основан на способности полимерного носителя коагулировать при изменении рН раствора [184]. Бактериальную взвесь смешивали с раствором АФЦ в растворе натрия гидрокарбоната и вызывали коагуляцию добавлением уксусной кислоты. Образовавшиеся микрогранулы отделяли от жидкой фазы и подвергали 6 - 8-часовому вакуумному досушиванию. Полученные образцы микрогранул, содержащие Е. coli М-17, L. plantarum 8Р-АЗ и В. bifidum 1, отличаются повышенной устойчивостью клеток к секретам ЖКТ и стабильностью при длительном хранении. Они могут быть использованы в качестве самостоятельной дозированной лекарственной формы или для изготовления таблеток и капсул.

Изготовление мягких лекарственных форм пробиотиков можно рассматривать как процесс иммобилизации бактериальных культур в массе носителя (суппозиторная или мазевая основа). Добавление ПАВ в жидкую бактериальную взвесь и смешивание полученной суспензии с носителем создает диффузионные препятствия массообменным процессам клетки, пролонгируя сохранение ее жизнеспособности. Отработка такого подхода на модели штамма L. plantarum 8Р-АЗ позволила получить суппозитории и мазь с необходимым (12 мес) сроком годности и исключить лиофилизацию.

Представленные результаты исследований в сфере технологии пробиотиков способствовали усовершенствованию производственного процесса и 4-кратному увеличению объема выпуска указанных препаратов в НПО «Биомед» при значительном сокращении расхода сырья и материалов.

Следующий раздел данной работы, направленный на оптимизацию контроля специфической активности пробиотиков, включал исследования, связанные с разработкой набора питательных сред для определения биологических параметров препаратов, новыми методическими подходами при проведении и оценке теста отсроченного антагонизма, а также с изучением и практическим использованием реакции ингибирования биолюминесценции.

Наряду с питательными средами для производственного культивирования бактерий, проблема ограничения номенклатуры актуальна и для сред, используемых для контроля пробиотиков. С этой целью был разработан унифицированный комплекс питательных сред на основе молочной сыворотки и дрожжевого аутолизата, сочетание которых позволяет удовлетворить основные трофические потребности производственных штаммов, входящих в состав лакто-, коли-, бифидумбактерина, бификола и ацилакта.

Использование молочной сыворотки было обусловлено высоким содержанием в ней азотистых соединений, углеводов, минеральных солей, витаминов, микроэлементов [59, 83, 186, 218]. Технологическая обработка молочной сыворотки при получении питательной основы была направлена на сохранение ее трофической ценности и включала термообработку и осветление. Способ изготовления СД сред предусматривает раздельную подготовку компонентов питательной основы и их соединение с учетом необходимой концентрации аминного азота.

Контроль специфической активности пробиотиков предполагает использование жидких, полужидких и плотных питательных сред, которые, помимо универсальной СД основы, при необходимости должны включать дополнительные компоненты (переменная составляющая), способствующие проявлению и выявлению биологических свойств производственных штаммов. Поэтому состав базовых вариантов сред, содержащих питательную основу и уплотняющее вещество, дополнялся и подвергался коррекции по результатам апробации. Варианты СД сред испытывали при определении всех параметров специфической активности пробиотиков (препараты и штаммы для их изготовления), а в качестве объектов сравнения использовали регламентированные среды.

2) полужидкая среда СД-2 - для определения КОЕ в 1 дозе лактобактерина, ацилакта и бифидумбактерина;

4) плотная среда СД-3 - для определения КОЕ в 1 дозе колибактерина;

Применение данного комплекса позволит ограничить номенклатуру контрольных сред и питательных субстратов для их изготовления, будет способствовать унификации и снижению затратности методов определения биологических параметров пробиотиков.

Тест отсроченного антагонизма с использованием регламентированного набора патогенных и условно-патогенных контрольных штаммов является наиболее распространенным при контроле антагонистических свойств пробиотиков. Представлялось целесообразным при его проведении ограничить применение патогенных культур и использовать универсальный вариант плотной питательной среды (СД-4).

В искусственно созданных in vitro условиях межпопуляционного взаимодействия подавляющая активность испытуемой бактериальной культуры проявляется в виде гетеро-, гомо- и изоантагонизма в зависимости от таксономической принадлежности тест-штаммов [172]. Из этого следует, что оценить антагонистическую активность пробиотиков можно по любой ее составляющей или их совокупности, а для определения гетеро- и гомоантагонизма не исключено использование наряду с патогенными микробами и сопоставимых с ними по чувствительности непатогенных бактерий, в т.ч. производственных штаммов.

При сравнительном изучении изо-, гомо- и гетероантагонизма пробиотиков на общепринятых средах и среде СД-4 применялись регламентированные условия проведения теста отсроченного антагонизма и соответствующий расширенный набор контрольных культур. Результаты исследований позволили отметить более выраженную ингибирующую активность используемых культур в отношении гетерологичных патогенных и непатогенных штаммов по сравнению с антагонизмом внутри вида и рода, а также пронормировать количественные параметры и их соотношение для всех составляющих антагонистической активности пробиотиков с учетом применяемой питательной среды. Показатели изо-, гомо- и гетероантагонизма на регламентированных средах Гаузе №2 и МРС-5 коррелировали с аналогичными показателями на испытуемой среде (г>0,05) и не имели от них достоверных отличий (р>0,05), что подтверждает возможность использования и универсальность среды СД-4 для данного теста.

Анализ результатов и методических основ постановки теста отсроченного антагонизма позволил сделать . вывод, что проявление антагонистических свойств у испытуемой бактериальной культуры не вызывает сомнений,, если величина зон подавления роста гетеро и (или) гомологичных штаммов превышает аналогичный показатель в отношении изологичного штамма, ингибирование роста которого связано, очевидно, с функционированием системы «чувство кворума» [56, 81, 295, 322].

Развитие in vitro бактериальной культуры, обладающей антагонистической активностью, сопровождается продукцией комплекса метаболитов, ингибирующих функциональную активность и развитие других популяций. Следовательно, оценить антагонистические свойства пробиотиков можно не только по подавлению роста, но и по степени угнетения отдельных функций тест-культур. Наш подход базировался на использовании феномена ингибирования микробиолюминесценции, фиксируемого с помощью люминометра. В качестве объекта воздействия пробиотиков применяли культуру Е. coli lum+ С-50, которая является биоиндикатором люминесцентной тест-системы «Эколюм», разработанной Р.А. Пшеничновым с соавт.

После определения оптимальных условий совместной экспозиции было изучено влияние препаратов и их разведений на люминесценцию сенсора. Полученные результаты позволили выявить зависимость уровня свечения тест-культуры от концентрации каждого пробиотика и продолжительности совместной экспозиции. Было установлено, что цельные препараты, за исключением бифидумбактерина, быстро и необратимо с первых минут экспозиции ингибируют микробиолюминесценцию. Уменьшение концентрации препарата сопровождалось снижением данного эффекта. При разведении в 10 раз все пробиотики, за исключением колибактерина, на протяжении длительного периода или до конца экспозиции (24 ч) вызывали стимуляцию свечения биосенсора.

Цельные препараты существенно влияли на жизнеспособность клеток сенсора, отмиранию которых предшествовало угнетение свечения. Показатели ингибирования биолюминесценции (% снижения свечения по сравнению с контролем) и количество КОЕ биосенсора находились в сильной обратной зависимости, что подтверждает высокую индикативность культуры Е. coli lum+ С-50 для исследования антагонистических свойств пробиотиков.

При сопоставлении результатов ингибирования биолюминесценции (на 30 мин и 2 ч экспозиции) и показателей отсроченного антагонизма в отношении штамма Е. coli lum+ С-50 была выявлена сильная прямая корреляция между величиной угнетения свечения и размером зон подавления роста сенсора у всех цельных пробиотиков (г>0,7).

Для практического применения реакции ингибирования микробиолюминесценции нами предложен вариант теста, включающий 2-часовую экспозицию пробиотика и сенсора для определения параметров и динамики гашения его свечения. Проведенные исследования позволили установить количественные показатели угнетения люминесценции, характеризующие уровень антагонистической активности препарата.

Наряду с усовершенствованием способов получения и контроля известных препаратов, настоящая работа включала исследования по созданию новых пробиотиков на основе лактобактерий и их метаболитных комплексов.

Известно, что моновидовые пробиотики, в т.ч. лактосодержащие, обладают ограниченными биологическими свойствами, обусловленными потенциалом одного вида бактерий, и уступают по терапевтической эффективности комплексным препаратам [11]. Конструирование новых пробиотиков предполагает использование потенциала известных производственных штаммов, оптимальное сочетание которых существенно влияет на качественные характеристики комплексных препаратов.

С целью создания нового комплексного препарата из известных производственных культур лактобактерий было проведено сравнительное изучение биологических и технологических свойств штаммов L. plantarum 8Р-АЗ, L. fermentum 90Т-С4, L. acidophilus К3Ш24, L. acidophilus ЮОаш, L. acidophilus NKb Исследование биологических свойств включало оценку активности кислотообразования, адгезивности, устойчивости к антибактериальному действию биологических жидкостей (желудочный сок, желчь), антагонистической активности и антибиотикочувствительности.

Результаты изучения адгезии на модели человеческих эритроцитов по методике В.И. Брилис с соавт. показали низкую степень активности производственных штаммов лактобактерий. При сравнительной оценке не выявлено достоверных различий между адгезивными свойствами L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90 Т-С4, а также у штаммов внутри вида L. acidophilus. Последние даже в низком диапазоне адгезивности значительно уступали L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90 Т-С4 (р<0,05).

При изучении устойчивости штаммов к секретам ЖКТ установлена высокая резистентность L.plantarum 8Р-АЗ к желудочному соку и желчи. Штаммы вида L. acidophilus проявили меньшую устойчивость по сравнению с L. plantarum 8Р-А и L. fermentum 90 Т-С4. Отмечена более высокая устойчивость к воздействию биологических жидкостей штамма L. acidophilus К3Ш24 среди вида L. acidophilus.

Антагонистическую активность производственных штаммов лактобактерий определяли in vitro методом отсроченного антагонизма на плотной питательной среде МРС-5 в отношении стандартного набора тест-штаммов, используемых при контроле пробиотиков. Установлено, что наибольшей ингибирующей активностью обладали штаммы L. fermentum 90Т-С4 и L. plantarum 8Р-АЗ. Лактобактерии вида L. acidophilus слабее подавляли рост тест-культур (р<0,01), внутри вида достоверных различий по антагонистической активности не выявлено.

Было проведено изучение антибиотикочувствительности лактобактерий к ряду препаратов, наиболее часто применяемых в лечебной практике, с помощью диско-диффузионного метода. Штаммы вида L. acidophilus проявили чувствительность почти ко всем использованным антибиотикам, кроме канамицина и линкомицина. Штаммы L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90Т-С4 показали значительную устойчивость к выбранным антибиотикам, за исключением левомицетина, рифампицина и олеандомицина. По резистентности бактериальных культур к антибиотикам производственные штаммы лактобактерий условно были разделены на две группы: устойчивых (L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90Т-С4) и чувствительных (L. acidophilus). Внутри групп достоверных различий по чувствительности не было обнаружено.

Изучение технологических свойств производственных штаммов включало определение уровня накопления биомассы при глубинном культивировании, устойчивости к лиофильному высушиванию и стабильности в процессе хранения. По уровню накопления биомассы при глубинном культивировании с использованием казеиново-дрожжевой среды выявлено преимущество L. plantarum 8Р-АЗ по сравнению с другими штаммами. Накопление биомассы у трех штаммов L. acidophilus не имело существенных различий, но значительно уступало L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90Т-С4.

Результаты определения количества живых клеток в сухой культуре после лиофилизации свидетельствуют, что по чувствительности к неблагоприятному воздействию данного фактора исследуемые штаммы вполне сопоставимы, потеря жизнеспособных клеток составляла около 50%. В процессе хранения сухих культур в течение 12 мес при температуре (6±2) °С количество живых клеток уменьшалось не более чем на 24 %.

С помощью теста отсроченного гомоантагонизма на плотной питательной среде был изучен уровень совместимости штаммов в указанных композициях. По результатам анализа была выбрана композиция, включающая L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus К3Ш24. Эти культуры оказывают наименьшее ингибирующее влияние друг на друга по сравнению с другими вариантами композиций.

Выбор бактериальной композиции позволил перейти к технологическому этапу создания нового препарата, получившего название «Лактобактерин-БИЛС». При отработке способа его получения были использованы технологические приемы, применяемые при культивировании и стабилизации бактериальных культур в производстве лактобактерина и ацилакта.

В ходе разработки технологии нового препарата был унифицирован процесс приготовления маточных культур лактобактерий на основе использования питательной среды МРС-1 для трех последовательных пассажей каждого штамма. При сравнительном изучении качественных показателей маточных культур, изготовленных по общепринятому и предлагаемому способам, были получены сопоставимые результаты, достоверных отличий не наблюдалось. Данный способ получения маточных культур позволяет упростить приемы работы, связанные с использованием различных питательных сред, а также исключить применение сред МРС-4, МРС-2 {L. plantarum 8Р-АЗ) и обезжиренного молока {L. acidophilus К3Ш24).

Была изучена возможность совместного реакторного культивирования выбранных штаммов лактобактерий с использованием казеиново-дрожжевой среды. Установлено, что, развиваясь в ассоциации, штамм L. plantarum 8Р-АЗ достигает уровня накопления биомассы, достоверно сопоставимого с монокультурой, при этом показатель выживаемости ацидофильных лактобактерий уступает монокультуре в среднем на один порядок. Поэтому в технологию препарата был включен метод раздельного культивирования штаммов.

Исходя из содержания жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) в производственной культуре каждого штамма, было определено количественное соотношение бактериальных взвесей при получении суспензии комплексного препарата, оно составило: 2-3 части взвеси L. acidophilus К3Ш24 и одну часть L. plantarum 8Р-АЗ.

Для лиофилизации комплексного препарата был успешно апробирован универсальный режим замораживания и высушивания, используемый в производстве лактобактерина и ацилакта. При получении препарата в виде сухой биомассы во флаконах в качестве защитной среды для высушивания бактериальной суспензии применялась сахарозо-желатино-молочная среда, обеспечивающая необходимые физические свойства нового пробиотика.

Стандартизация препарата включала скрининг регламентированных методов контроля лактосодержащих пробиотиков и выбор наиболее адекватных. Методы контроля, используемые при стандартизации лактобактерина сухого (исключая определение количества жизнеспособных клеток в дозе препарата), позволяют достоверно оценить свойства лактобактерина-БИЛС, поэтому они были включены в НД на новый препарат. Раздельный количественный учет бактериальных составляющих препарата был предусмотрен на этапе конструирования композиции, в его основу были положены существенные видовые отличия штаммов по характеру роста на питательных средах и по ферментативной активности. Штамм L. plantarum 8Р-АЗ достоверно обнаруживается в композиции с помощью стандартных методов контроля на средах МРС-2 и МРС-4, предусмотренными НД на препараты «Лактобактерин сухой» и «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», присутствие штамма L. acidophilus К3Ш24 в данных условиях не обнаруживается и не влияет на результат анализа. Количество бактерий штамма L. acidophilus К3Ш24 в препарате можно определить методом, представленным в НД на «Ацилакт сухой», по эффекту сквашивания обезжиренного молока. Присутствие штамма L. plantarum 8Р-АЗ на данной среде на результат анализа не влияет.

Так как лактобактерин-БИЛС включает штаммы, применяемые при изготовлении лактобактерина и ацилакта, при исследовании биологической активности нового препарата данные пробиотики были использованы в качестве препаратов сравнения. В рамках доклинического изучения лактобактерина-БИЛС были определены следующие характеристики: активность кислотообразования, антагонистические свойства, адгезивность, чувствительность к антибактериальному воздействию.

При исследовании кислотообразования было установлено, что по динамике и достигаемому уровню кислотности (> 200°Т) культуральной среды лактобактерин-БИЛС не уступает аналогам и превосходит лактобактерии при инкубации в молоке (р<0,05). В комплексном препарате не отмечено негативного взаимовлияния штаммов на активность кислотообразования.

По антагонистической активности новый препарат, как показали результаты тестов отсроченного антагонизма и ингибирования микробиолюминесценции, значительно превосходит препараты сравнения. На среде МРС-5 величина зон подавления роста патогенных и условно-патогенных тест-штаммов, в т.ч. выделенных из клинического материала, у лактобактерина-БИЛС всегда превышала 30 мм и была в 2 раза выше показателей ацилакта. Лактобактерии также существенно уступал новому препарату по параметрам воздействия на все группы контрольных культур 0X0,01).

Изучение адгезивных свойств препаратов позволило установить, что показатели лактобактерина и ацилакта, как и ожидалось, соответствуют диапазону низкой адгезивности. Лактобактерин-БИЛС превосходит препараты-аналоги по СПА, величина которого позволяет оценить степень его адгезивности как среднюю, обусловленную эффектом суммации и характеризующую взаимовлияние штаммов в новом пробиотике.

При исследовании устойчивости препаратов к действию секретов ЖКТ (желудочный сок, желчь) было отмечено снижение чувствительности в составе комплексного препарата штамма L. acidophilus К3Ш24 по сравнению с монокультурой. Этот эффект, вероятно, связан с протективным действием в смешанной популяции метаболитов штамма L. plantarum 8Р-АЗ, который отличается высоким уровнем устойчивости.

Анализ показателей чувствительности препаратов к антибиотикам подтвердил зависимость этого параметра от исходных свойств производственных штаммов, входящих в их состав. Ацилакт проявлял устойчивость только к канамицину и линкомицину. Лактобактерин-БИЛС и лактобактерии обладали аналогично широким спектром устойчивости, соответствующей штамму L. plantarum 8Р-АЗ.

Изученная совокупность биологических свойств препаратов свидетельствует, что лактобактерин-БИЛС по большинству параметров превосходит пробиотики-аналоги. Это позволяет предполагать более высокую терапевтическую эффективность нового комплексного препарата.

Наряду с конструированием комплексного бактерийного препарата были проведены исследования по разработке препарата на основе низкомолекулярного метаболитного комплекса лактобактерий. Культуральная жидкость (КЖ) лакто- и бифидобактерий, которая в ряде случаев является отходом производства пробиотиков, содержит комплекс биологически активных метаболитов, обладающих пробиотическим и иммуномодулирующим действием [27, 48, 215, 227, 346, 380], поэтому целесообразно использовать ее в качестве сырья для изготовления лекарственных препаратов.

Для получения препарата «Микростим» была использована КЖ производственного штамма лактобактерий L. plantarum 8Р-АЗ, выбор которого был обусловлен высокой иммунобиологической активностью его метаболитов и их значительным содержанием в исходном сырье. Т ехнология препарата включает отделение низкомолекулярной фракции КЖ по окончании фазы логарифмического роста культуры путем концентрирования бактериальной взвеси методом ультрафильтрации и последующую термическую обработку ультрафильтрата. Получаемый при этом концентрат биомассы предназначен для изготовления различных лекарственных форм лактобактерина (суппозитории, порошки), что позволяет рассматривать запатентованный способ получения микростима как составную часть комплексных технологий в производстве пробиотиков.

В ходе разработки технологии микростима установлено, . что термическая обработка ультрафильтрата КЖ не только обеспечивает стабильность его биологических свойств на протяжении длительного срока хранения (4 года), но и повышает специфическую активность препарата. Термическое воздействие, вероятно, вызывает инактивацию супрессорных метаболитов, не влияя на стимуляторы роста бактериальной культуры, которые по данным ряда исследователей устойчивы к нагреванию [247, 277, 382,386].

Наши исследования показали, что микростим обладает широким спектром бактериотропного действия, в т. ч. проявляет выраженную пробиотическую активность. Препарат стимулирует рост и кислотообразование лакто- и бифидобактерий. Важным является эффект значительного повышения под действием микростима антагонизма лактобактерий к патогенным и условно-патогенным микробам, так как именно ингибирующая активность нормофлоры обеспечивает колонизационную резистентность [48, 119, 198, 222]. Препарат оказывает стимулирующее влияние на показатели антагонистической активности как культуры-продуцента, так и других штаммов лактобактерий. При этом микростим стимулирует только гетероантагонизм лактобактерий и не изменяет их ингибирующую активность по отношению друг к другу.

Пробиотическое действие микростима сохраняется в секретах желудочно-кишечного тракта. В комплексе с желудочным соком препарат оказывает даже более выраженное стимулирующее влияние на функциональную активность лактобактерий, что, вероятно, связано с благоприятным действием низких концентраций желудочного сока на общий метаболизм молочнокислых бактерий. Таким образом, при пероральном приеме возможно повышение пробиотической активности препарата.

Культуральная жидкость лактобактерий содержит целый комплекс антимикробных метаболитов (летучие жирные кислоты, перекись водорода, этанол, лизоцим, бактериоцины, бактериоциноподобные вещества и другие соединения) [29, 38, 247, 269, 278], поэтому представляло интерес оценить влияние микростима на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы.

Проведенные исследования показали, что микростим оказывает антибактериальное действие на возбудителей инфекций, таких как шигеллы, кишечная палочка, протей, клебсиеллы, синегнойная палочка, золотистый стафилококк и другие. К действию препарата чувствительна как грамотрицательная, так и грамположительная микрофлора. Минимальная подавляющая концентрация микростима при внесении в МПБ составляет -30-50%, а при внесении препарата в МПА - 10-30%.

Бактерицидный эффект микростима развивается быстро, в течение первых 5 мин контакта бактерий с препаратом. Полученные данные позволяют предположить, что мишенью действия низкомолекулярных метаболитов лактобактерий, содержащихся в препарате, служит цитоплазматичес'кая мембрана бактериальной клетки. Это согласуется с данными других исследователей, согласно которым большинство лантибиотиков оказывает антимикробное действие путем нарушения структуры цитоплазматической мембраны с образованием в ней мультимерных пор [78, 342].

Помимо того, что микростим обладает прямым антибактериальным действием, он также повышает чувствительность ряда патогенных микробов к антибиотикам. Влияние препарата на антибиотикочувствительность зависит от механизма действия антибактериального средства, вида патогенного микроорганизма и его резистентности к антибиотику. В наибольшей степени микростим усиливает антибактериальный эффект /7-лактамных антибиотиков на грамположительные бактерии, что свидетельствует о действии препарата на клеточную стенку микробов. Известно, что антибактериальные пептиды лактобактерий способны освобождать гидролазы клеточной стенки, результатом чего является индукция аутолитических процессов и деградация пептидогликана [294, 303, 409]. Микростим повышает чувствительность и к антибиотикам, являющимися ингибиторами синтеза белка, таким как гентамицин, тетрациклин и доксициклин. В этом случае положительный эффект препарата реализуется, по-видимому, за счет повышения проницаемости клеточной стенки микроорганизма для антибиотика, а также, возможно, путем сочетанного ингибирующего действия на биосинтез микробных макромолекул.

Было изучено действия препарата на антибиотикочувствительность дрожжеподобных грибов, отличающихся повышенной устойчивостью к антибиотикам и метаболитам лактобактерий. Установлено, что микростим статистически значимо повысил чувствительность Candida albicans АТСС 885-653 к нистатину и клотримазолу - антибиотикам, нарушающим целостность цитоплазматической мембраны грибов.

Наряду с изучением бактериотропного действия, в ходе доклинических испытаний препарата была исследована его безопасность и иммунобиологическая активность.

В настоящее время препарат «Микростим», так же как препарат «Лакто бактерин-БИЛС», прошел предварительную экспертизу в Государственном институте стандартизации и контроля медицинских иммунобиологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. По обоим препаратам проводится подготовительная работа к проведению клинических испытаний.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Несчисляев, Валерий Александрович, Пермь

1. А.с. 1097947 СССР, G 01 N 33/18. Штамм бактерий Photobacterium leiognathi, используемый в качестве тест-культуры на токсичность ксенобиотиков / И.И. Гительзон, Т.И. Воробьева, А.Н. Шендеров, И.Ю. Виделец. 1983. - 7 с.

2. А.с. 1097947 СССР, G 01 N 33/48. Способ биоиндикации загрязнения водной среды / А.Н. Шендеров, Т.Ф. Сименская, И.Ю. Виделец. 1985. - 7 с.

3. А.с. 1335569 СССР G 12 Q 1Л. Биосенсор для количественного определения в воде синтетических поверхностно-активных веществ / Л.Ю. Бержанская, О.Н. Постникова, Ю.С. Кривошеин. 1997.- 8 с.

4. А.с. 1638156 СССР, С 12 N 1/00, 1/38, С 12 R 1:19. Способ получения аутоактиватора роста для культивирования Escherichia coli / Т.Я. Вахитов, О.Ю. Яшина. 1988.-8 с.

5. А.с. 2076722 СССР, А 61 К 35/74. Способ получения сухой биомассы лакто-; коли или бифидобактерий / B.C. Пучнин, Н.Н. Чугунова,

6. B.А. Несчисляев. 1994. - 6 с.

7. А.с. 491691 СССР, С 12 b 3/14, С 12 К 1/06. Стимулирующая добавка к синтетической питательной среде для культивирования микроорганизмов /

8. C.Я. Барихин, А.Г. Ткаченко, Р.А. Пшеничнов, В.М. Колотов. 1974. - 6 с.

9. А.с. 957909 СССР, А 61 К 35/74, С 12 N '/4. Способ получения биомассы бифидобактерий / Н.Г. Рахимова, В.В. Поспелова, Н.Н. Ворошилина и др. 1983.-8 с.

10. А.с. 97108832 Украина, С 12 N 1/20, А 23 С 9/12. Способ получения пробиотика «Симблер-2» и способ производства с его использованием кисломолочного продукта / Д.С. Янковский, Г.С. Дымент, Е.П. Потребчук, Л.Д. Товкачевская. 1997. - 7 с.

11. Агамалян С.С. Эффективность лиофилизированного препарата «Нарине» при коррекции дисбактериозов / С.С. Агамалян, К.А Саркисян // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1997. - N. 6. - С. 68-70.

12. Алюшин М.Т. Аэросил и его применение в фармацевтической практике/М.Т. Алюшин, М.М. Астраханова//Фармация. 1968. - N. 6. -С. 73-77.

13. Андрейчин М.А. Антимикробные свойства желчи и желчных кислот / М.А. Андрейчин // Антибиотики. 1980.- N. 25 (12). - С. 936-939.

14. Антонов С.Ф. Особенности сублимационной сушки лекарственных и диагностических препаратов в ампулах / С.Ф. Антонов, Г.И. Сигаев, Б.А. Никонова и др. // Биотехнология. 1998. - N. 5. - С. 48-69.

15. Аркадьева З.А. Методы хранения культур микроорганизмов // Метаболизм микроорганизмов / З.А. Аркадьева; Под ред. Н.С. Егорова -Москва: Изд-во МГУ, 1986. С. 57-64.

16. Балтрашевич А.К. Способ определения чувствительности анаэробных микроорганизмов к антибиотикам с использованием стандартных дисков / А.К. Балтрашевич, Т.П. Комаровская // Антибиотики. 1982. -N. 8. - С. 32-36.

17. Барановский А.Ю. Дисбактериоз и дисбиоз кишечника / А.Ю. Барановский, Э.А. Кондрашина. Санкт-Петербург: Питер, 2000. - 224 с.

18. Бартенева Н.С. Взаимосвязь химической структуры и биологической активности эндотоксина грамотрицательных бактерий. Молекулярная и клеточная теория инфекционного иммунитета / Н.С. Бартенева. Москва, 1985. -С. 62-71.

19. Баснакьян И.А. Голодание бактерий. Стресс, обусловленный лимитом субстрата / И.А. Баснакьян, В.А. Мельникова // Журн. микробиол. 2001. -N. 1.-С. 99-103.

20. Баснакьян И.А. Холодовой шок у бактерий / И.А. Баснакьян // Вестн. РАМН.-2001.-N.3.-C. 18-21.

21. Безель B.C. Экологическое нормирование антропогенных нагрузок / B.C. Безель, Ф.В. Кряжимский, Л.Ф. Семериков, Н.Г. Смирнов // Экология. -1992.-N. 6.-С. 3-12.

22. Беккер М.Е. Анабиоз микроорганизмов. / М.Е. Беккер, Б.Э. Дамберг,

23. A.И. Раппопорт. Рига, 1981.-253 с.

24. Белобородова Н.В. Метаболиты анаэробных бактерий (летучие жирные кислоты) и реактивность макроорганизма / Н.В. Белобородова, С.М. Белобородов // Антибиотики и химиотерапия. 2000. - N. 2. - С. 28-36.

25. Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве // Сб. науч. тр. Москва, 1986. - 207 с.

26. Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления / Л.П. Блинкова // Журн. микробиол. 2003. - N. 3. — С. 109-113.

27. Бондаренко В.М. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией / В.М. Бондаренко, А.А. Воробьев // Журн. микробиол. 2004. - N. 1. -С. 84-92.

28. Бондаренко В.М. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков /В.М. Бондаренко, Э.И. Рубакова, В.А. Лаврова//Журн. микробиол. 1998. -N. 5. - С. 107-112.

29. Бондаренко В.М. Механизм действия пробиотических препаратов /

30. B.М. Бондаренко, Р.П. Чупринина, М.А. Воробьева // Биопрепараты. 2003. -N.3.-C. 2-5.

31. Бочков И.А. Бактериальная колонизация и сукцессия у новорожденных детей в аспекте проблемы госпитальных инфекций / И.А. Бочков, Н.М. Овчарова // Журн. микробиол. 1991. - N. 8. - С. 71-74.

32. Бри лис В.И. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов / В.И. Брилис, Т.А. Брилене, Х.П. Ленцнер // Лабораторное дело. 1986. -N. 4. - С. 210-212.

33. Бухарин О.В. Межбактериальные взаимодействия / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов, Л.М. Хуснутдинова // Журн. микробиол. 2003. - N. 4. - С. 3-8.

34. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий: теория и практика / О.В. Бухарин // Журн. микробиол. 2000. - Прилож. к N. 4. - С. 4-7.

35. Валышев А.В. Влияние бифидобактерий на антилизоцимную активность энтеробактерий / А.В. Валышев, Н.Н. Елагина // Журн. микробиол. -2000.-N. 4.-С. 77-79.

36. Вальтер М.Б. Постадийный контроль в производстве таблеток / М.Б. Вальтер, О.Л. Тюненков, Н.А. Филипин. Москва: Медицина, 1982. - 208 с.

37. Вахитов Т.Я. Действие препарата аутостимуляторов роста Escherichia coli М-17 (Актофлор) на рост чистых и смешанных культур бактерий / Т.Я. Вахитов, О.Ю. Яшина, JI.H. Петров, A.M. Королюк // Журн. микробиол. -2000.-N. З.-С. 20-24.

38. Виестур У.Э. Культивирование микроорганизмов / У.Э. Виестур, М.Ж. Кристапсонс, Е.С. Былинкина. Москва, 1980. - 230 с.

39. Винаров А.Ю. Использование консорциума бактериальных культур для их выращивания на молочной сыворотке / А.Ю. Винаров, Т.Е. Сидоренко // Хранение и переработка сельхозсырья. 1999. -N. 1. - С. 16-17.

40. Воробьев А.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции / А.А. Воробьев, Е.А. Лыкова // Журн. микробиол. 1999. -N. 6. - С. 102-105.

41. Воробьева Л.И. Антимутагенные свойства бактерий (обзор) / Л.И. Воробьева, С.К. Абилев // Прикл. биохимия и микробиол. 2002. - Т. 38, N. 2.-С. 115-127.

42. Воронина М.Н. Лактобацилы микрофлоры желудка человека: Автореф. дис. . канд. мед. наук / М.Н. Воронина. Тарту, 1968. - 23 с.

43. Высоцкий В.В. Биологическое значение и структурные основы адгезивных свойств микроорганизмов (обзор) /В.В. Высоцкий // Медицинские аспекты микробной экологии. Москва - Вып. 7/8 - 1993/1994. - Ч. I. - С. 42-52.

44. Габриэлян Р.И. Функции микрофлоры желудочно-кишечного тракта и последствия ее нарушения после хирургических вмешательств /Р.И. Габриэлян, Е.М. Горская, Н.Д. Снегова // Антибиотики и химиотерапия. 2000. - Т. 45, N. 9. - С. 24-29.

45. Ганшин В.М. Клеточные сенсоры на основе бактериальной биолюминесценции / В.М. Ганшин, B.C. Данилов // Сенсорные системы. 1997. -Т. 11, N. 6.-С. 245-255.

46. Геворкян Н.М. Комплексная оценка загрязнения окружающей среды и уровня генетических повреждений у жителей г. Атбасар (Казахстан) / Н.М. Геворкян, И.Е. Дробинская, Т.П. Глотова // Гигиена и санитария. 1994. - N. 8. - С. 37-40.

47. Гинцбург A.JI. «Quorum sensing» или социальное поведение бактерий / A.JI. Гинцбург, Т.С. Ильина, Ю.М. Романова // Журн. микробиол. 2003. -N. 5.-С. 86-93.

48. Гительзон И.И. Светящиеся бактерии / И.И. Гительзон, Э.К. Родичева, С.Е. Медведева. Новосибирск: Наука, 1984. - 275 с.

49. Гланц С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. / С. Гланц. -Москва: Практика, 1999. 459 с.

50. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов / К.К. Горбатова. М.: Колос, 1997. - 287 с.

51. Горин С.Е. Получение иммунологически активных фрагментов пептидогликана бактериальной клеточной стенки / С.Е. Горин, В.В. Есипова, С.М. Навашин // Иммуномодуляторы: Сб. тр. ЦНИИВС им. Мечникова. -Москва, 1987.-С. 77-88.

52. Горовиц Э.С. Неспорообразующие анаэробы в норме и патологии / Э.С. Горовиц, Т.И. Карпунина//Учебно-метод. пособие. Пермь, 1999. - 139 с.

53. Горская Е.М. Адгезивные свойства бактерий кишечного происхождения / Е.М. Горская, Х.П. Ленцнер, А.А. Ленцнер и др. // Журн. микробиол. 1991.-N. 10.-С. 5-8.

54. Горская Е.М. Биологическая характеристика штаммов лактобацилл, перспективных в качестве эубиотиков / Е.М. Горская, Н.Н. Лизько, А.А. Ленцнер // Журн. микробиол. 1992. - N. 3. - С. 17-20.

55. Горская Е.М. Механизмы развития микроэкологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции: Автореф. дис. д-ра мед. наук / Е.М. Горская. Москва, 1994. - 53 с.

56. Государственная Фармакопея СССР. Вып. 1. 11-е изд., доп. -Москва: Медицина, 1989. - 336 с.

57. Государственная Фармакопея СССР. Вып. 2. 11-е изд., доп. -Москва: Медицина, 1990. - 400 с.

58. Государственный реестр лекарственных средств (по состоянию на 1 января 2000 г.): Официальное издание. Минздрав РФ, 2000. - 1202 с.

59. Грищенко В.А. Сравнительный анализ чувствительности к желчи энтеробактерий / В.А. Грищенко, Ю.А. Брудастов, Е.В. Кудря, Л.И. Васильева // Журн. микробиол. 2002. -N. 3. - С. 65-67.

60. Данилов B.C. Бактериальная биолюминесценция / B.C. Данилов, Н.С. Егоров Москва: Изд-во МГУ. - 1990. - 152 с.

61. Данилов B.C. Бактериальные биосенсоры с биолюминесцентным выводом сигнала / B.C. Данилов, В.М. Ганшин // Сенсорные системы. 1998. -Т. 12, N. 1.-С. 56-68.

62. Данилов B.C. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе 1га-оперонов разных видов люминесцентных бактерий / B.C. Данилов, А.П. Зарубина, Г.Е. Ерошников // Вест. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. - 2002. - N. З.-С. 20-24.

63. Дементьева Е.И. Изменение АТФ в интактных клетках Escherichia coli, содержащих рекомбинантную люциферазу светляков / Е.И. Дементьева, Н.Н. Угарова, П.Х. Кобболд // Биохимия. 1996. -Т. 61, Вып. 7. - С. 1285-1293.

64. Демешева М.И. Совершенствование технологии лекарственных форм бифидумбактерина: Дис. канд. фарм. наук/М.И. Демешева. Томск, 2005.-153с.

65. Демина JI.C. Влияние высушивания на содержание нуклеиновых кислот и мутационные изменения у микроорганизмов / JI.C. Демина, С.В. Лысенко // Биол. науки, 1989. N. 5. - С. 87-95.

66. Долинов К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов / К.Е. Долинов. Москва: Медицина, 1969. - 230 с.

67. Егоров Н.С. Бактериоцины. Образование, свойства, применение / Н.С. Егоров, И.П. Баранова // Антибиотики и химиотерапия. 1999. - Т. 44, N. 6.-С. 33-41.

68. Блинов Н.П. Химическая микробиология / Н.П. Елинов. Москва: Высш. шк., 1989.-448 с.

69. Жданова Л.П. Питательные среды для изучения анаэробной неспорогенной микрофлоры / Л.П. Жданова, И.И. Олейник, Б.Д. Быченко // Лабор. дело. 1986. - N. 4. - С. 195-201.

70. Завильгельский Г.Б. «Quorum sensing», или как бактерии «разговаривают» друг с другом / Г.Б. Завильгельский, И.В. Манухов // Молекул, биол. 2001. - Т. 35, N. 2. - С. 268-277.

71. Залашко М.В. Биотехнология переработки молочной сыворотки / М.В. Залашко. Москва: Агропромиздат, 1990. - С. 6-34.

72. Залашко М.В. Микробный синтез на молочной сыворотке / М.В. Залашко, Л.С. Залашко. Минск: Наука и техника, 1976. - 274 с.

73. Звягин И.В. Методические рекомендации по разработке режимов замораживания высушивания биологических препаратов / И.В. Звягин, И.А. Хорьков, Э.Ф. Токарик и др. - Москва, 1981. - 34 с.

74. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы / Под ред. Д. Вудворда. Москва, 1988. - 215 с.

75. Исакова Д.М. Управление процессом культивирования молочнокислых бактерий в мембранном ферментаторе / Д.М. Исакова, А.Ю. Попов // Контроль и управление биотехнологическими процессами: Тез. докл. Всесоюзн. конф. Горький, 1985. - С. 177-178.

76. Исмаилов А.Д. Ингибирование бактериальной люминесценции хлорфенолами/ А.Д. Исмаилов, С.И. Погосян, Т.И. Митрофанова// Прикл. биохимия и микробиол. 2000. - Т.36, N. 4. - С. 469-473.

77. Кайдалов А.А. Специфическое связывание мурамилпептидов с мембранами мозга крысы / А.А. Кайдалов, Ю.Н. Уткин, Т.М. Андронова и др. //Биоорган, химия.- 1987.-Т. 13,N. 11.-С. 1523-1529.

78. Калмыкова А.И. Пробиотики: терапия и профилактика заболеваний. Укрепление здоровья / А.И. Калмыкова. Новосибирск: НПФ «Био-Веста»,2001.-208 с.

79. Калюжин О.В. Производные мурамилдипептида в эксперименте и клинике / О.В. Калюжин // Журн. микробиол. 1998. - N. 1. - С. 104-108.

80. Карпунина Т.И. Повышение эффективности терапевтического действия пробиотиков / Т.И. Карпунина, Э.С. Горовиц, А.Н. Чиненкова, А.Я. Перевалов//Журн. микробиол. -1998. -N. 2.-С. 104-107.

81. Кафарская Л.И. Микробная экология влагалища / Л.И. Кафарская, О.В. Коршунова, Б.А. Ефимов и др.//Журн. микробиол. 2002 - N. 6. - С. 91-99.

82. Кацев A.M. Оценка взаимодействия катионных поверхностно-активных антисептиков с сывороточным альбумином методом бактериальной биолюминесценции / A.M. Кацев, В.Ю. Семенов // Клинич. лаб. диагностика.2002.-N. 4.-С. 39-41.

83. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры / Н.Ю. Каширская // Рус. мед. журн. 2000. - Т. 8, N. 13-14.-С. 572-756.

84. Квасников Е.И. Молочнокислые бактерии и их использование / Е.И. Квасников, О.А. Нестеренко. Москва: Наука, 1975. - 384 с.

85. Кигель Н.Ф. Новый бактерийный препарат «АФ» на основе молочнокислых бактерий и его биологические свойства / Н.Ф. Кигель // Микробиол. ж. (Укр.) 2000. - Т. 62, N. 3. - С. 49-55.

86. Корпан Я.И. Микробные сенсоры: достижения, проблемы, перспективы / Я.И. Корпан, А.В. Ельская // Биохимия. 1995. - Т. 60, Вып.12. -С. 1988-1998.

87. Коршунов В.М. Характеристика биологических препаратов и пищевых добавок для функционального питания и коррекции микрофлоры кишечника / В.М. Коршунов, Б.А. Ефимов, А.Р. Пикина // Журн. микробиол. — 2000. -N. 3 С.86-91.

88. Красик J1.J1. Усовершенствование производства колибактерина и разработка нового экспериментального препарата из молочнокислых бактерий штамма Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ: Автореф. дис. . канд. мед. наук / JI.J1. Красик. Пермь, 1972. - 20 с.

89. Кратасюк В.А. Бактериальная биолюминесценция и биолюминесцентный анализ / В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон // Биофизика. -1982. Т. 27, Вып. 6. - С. 737-753.

90. Кратасюк В.А. Люциферазное биотестирование: биофизические основы, методы и применение: Автореф. дис. . д-ра биол. наук / В.А. Кратасюк. Красноярск, 1994. - 31 с.

91. Критская И.В. Разработка питательных сред и процесса непрерывного культивирования бифидобактерий: Автореф. дис. . канд. биол. наук / И.В. Критская. Москва, 1997. - 27 с.

92. Куваева И.Б. Микроэкологические и иммунологические нарушения у детей / И.Б. Куваева, К.С. Ладодо. Москва: Медицина, 1991. - 240 с.

93. Кудлай Д.Г. Бактериоциногения / Д.Г. Кудлай, В.Г. Лиходед. -Ленинград: Медицина, 1966. -201 с.

94. Кудряшова Н.С. Действие хинонов на ферментативные биолюминесцентные НАДН-зависимые системы / Н.С. Кудряшова, Е.Н. Есимбекова // Прикл. биохимия и микробиол. 2000. - Т. 36, N. 4. - С. 474-478.

95. Кузиков А.Н. Применение биолюминесцентного метода определения бактериального аденозинтрифосфата в микробиологии / А.Н. Кузиков, В.М. Бондаренко, А.Т. Латкин // Журн. микробиол. 2003. -N.1.-C. 80-89.

96. Кузнецов A.M. Биолюминесцентные методы анализа биологически активных соединений и приборное обеспечение / A.M. Кузнецов, Н.А. Тюлькова, М.В. Сальников // Матер. V Междунар. конф. Волгоград -Пермь, 2001. - С. 28.

97. Куплетская М.Б. Методы длительного хранения коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии Московского государственного университета / М.Б. Куплетская, З.А. Аркадьева // Микробиология. 1997. -Т. 66,N. 2.-С. 283-288.

98. Курепина Н.Е. Микроцины: природа и генетическое детерминирование / Н.Е. Курепина, И.А. Хмель // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1986. - N. 4. - С. 3-10.

99. Куяров А.В. Колонизационная резистентность как показатель функциональных возможностей организма и коррекция ее нарушений: Автореф. дис. . д-ра мед. наук / А.В. Куяров. Москва, 2000. - 46 с.

100. Лактобактерии сухой. Регламент производства № 1567-04. Пермь, 2004. 128 с.

101. Леванова Г.Ф. Метод сравнительного биотестирования питьевой воды с помощью индикаторных штаммов бактерий / Г.Ф. Леванова, А.С. Юшин, С.Ю. Кашников // Гигиена и санитария. 1999. - N. 2. - С. 77-79.

102. Ленцер А.А. К вопросу о холестеринолитической активности лактобацилл / А.А. Ленцер, А.А. Трошин // Успехи мед. науки: Тез. докл. — Тарту, 1986.-С. 125-126.

103. Ленцнер А.А. Лактобациллы микрофлоры человека: Автореф. дис. . д-ра мед. наук / А.А. Ленцнер. Тарту: 1973 . - 69 с.

104. Ленцнер А.А. Лактофлора и колонизационная резистентность / А.А. Ленцнер, Х.П. Ленцнер, М.Э. Микельсаар и др. // Антибиотики и химиотерапия. 1987. -N. 3. - С. 173-179.

105. Ленцнер А.А. Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология / А.А. Ленцер, В.И. Брилис, Т.А. Брилене. Москва, 1982. - 245 с.

106. Лобанок А.Г. Биотехнология микробных ферментов / А.Г. Лобанок, Н.И. Астапович, Р.В. Михайлова. Минск: Наука и техника, 1989. - 205 с.

107. Лопатина Т.К. Иммуномодулирующее действие препаратов-эубиотиков / Т.К. Лопатина, М.С. Бляхер, В.Н. Николаенко, М.Н. Ниловский // Вестн. РАМН, 1997. N. 3. - С. 30-33.

108. Лыкова Е.А. Антибактериальная резистентность штаммов, входящих в состав препаратов пробиотиков / Е.А. Лыкова // Журн. микробиол. -2000.-N. 2.-С. 63-66.

109. Максимова Е.Е. Регулиремая экспрессия генов бактериальной люминесценции, клонированных в многокопийной рекомбинантной плазмиде Е.Е. Максимова, Л.Ю. Попова, Каргатова Т.В. и др. // Микробиология. 1997. -Т. 66, N. 2. - С. 223-227.

110. Малатян М.Н. Получение биомассы фототрофных бактерий на молочной сыворотке / М.Н. Малатян, А.Х. Паронян // Прикл. биохимия и микробиол. 1997. - Т. 33, N. 2. - С. 238-240.

111. Мамгин Н.П. Комплексный подход оценки состояния окружающей среды и риска для здоровья в системе обеспечения гигиенической безопасности населения / Н.П. Мамгин, О.В. Клепиков, П.В. Чернов // Прикл. аспекты инфекц. мед. 1999. - Т. 2, N. 1. - С. 6-11.

112. Масленникова И.Л. Микробиолюминесцентная система оценки мутагенного и общетоксического действия поллютантов / И.Л. Масленникова, Н.В. Голясная, Р.А. Пшеничнов // Матер. Междунар. конф. Волгоград -Пермь, 2001.-С. 33.

113. Меджидов М.М. Состояние и перспективы развития производства микробиологических питательных сред / М.М. Меджидов // Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии: Тез. конф. — Махачкала, 1988.-Ч. 1.-С. 3-8.

114. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. Москва, 1980.

115. Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению лекарственных препаратов для местного лечения гнойных ран. Москва: Фармакологический комитет МЗ СССР, 1989. - 21 с.

116. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков. Москва: МЗ СССР, 1983. - 16 с.

117. Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред. Москва: МЗ СССР, 1977. - 17 с

118. Михайлова Т.Л. Биопрепараты и пищевые факторы в коррекции дисбиоза / T.JI. Михайлова, Т.Ю. Калинская, В.Г. Румянцева // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатологии и колопроктол. 1999. - Т. 8, N. 3. - С. 67-70.

119. Молохова Е.И. Биофармацевтические аспекты пробиотиков / Е.И. Молохова // Пробиотические микроорганизмы современное состояние вопроса и перспективы использования: Тез. докл. Междунар. научно-практ. конф. - Москва, 2002. - С. 64.

120. Мулюкин А.А. Сравнительное изучение элементарного состава вегетативных и покоящихся клеток микроорганизмов / А.А. Мулюкин, В.В. Сорокин//Микробиология. 2002. - Т. 71, N. 1. - С. 37-38.

121. Мурашова А.О. Бифидогенные факторы как лекарственные препараты / А.О. Мурашова, О.Б. Лисицин, Н.А. Абрамов // Журн. микробиол. -1999.-N. 5.-С. 56-61.

122. Назарова Е.К. Микробиоценоз влагалища и его нарушения. Этиология, патогенез, клиника, лабораторная диагностика / Е.К. Назарова, Е.И. Гиммельфарб, Л.Г. Созаева // Антибиотики и химиотерипия. 2002. -Т. 47, N. 4.-С. 34-42.

123. Несчисляев В.А. Унификация технологии получения и контроля препаратов для бактериотерапии с использованием питательных сред из непищевого сырья: Дис. . .канд. мед. наук / В.А. Несчисляев. 1989. -147 с.

124. Никитин Е.Е. Замораживание высушивание биологических препаратов / Е.Е. Никитин, И.В. Звягин // Москва: Колос, 1971. - 343 с.

125. Никитина З.И. Микробиологический мониторинг наземных экосистем / З.И. Никитина. Новосибирск: Наука, 1991. - 222 с.

126. Новик Г.И. Сохранение жизнеспособности и антагонистической активности бифидобактерий при субкультивировании / Г.И. Новик, Н.И. Астапович, Н.Е. Рябая // Микробиология. 1998. - Т. 67, N. 5. - С. 631-636.

127. Новик Г.И. Сохранение жизнеспособности и физиологических свойств бифидобактерий при криоконсервации и лиофилизации / Г.И. Новик, Н.И. Астапович // Микробиология. 1998. - Т. 67, N. 5. - С. 637-642.

128. Озерецковский Н.А. Бактерийные, сывороточные и вирусные лечебно-профилактические препараты. Справочник практического врача / Н.А. Озерецковский, Г.И. Останина. Санкт-Петербург, 1998. - С. 135-154.

129. Олейникова Е.А. Методика определения и природа бактерицидного действия желудочного сока / Е.А. Олейникова, Р.К. Маковоз // Лабор. дело. -1975.-N. 4.-С. 239-248.

130. Опарин Ю.Г. Повреждение и защита биоматериалов при замораживании и лиофилизации / Ю.Г. Опарин // Биотехнология. 1996. - N. 7.-С. 3-13.

131. Определение токсичности воды и водных экстрактов из объектов окружающей среды по интенсивности биолюминесценции бактерий: Методические рекомендации. Москва: Государственный комитет санэпиднадзора России, 1996. - 9 с.

132. Осипова И.Г. Некоторые аспекты механизма защитного действия колибактерина и споровых эубиотиков и новые методы их контроля: Автореф. дис. . канд. биол. наук / И.Г. Осипова. Москва, 1997. - 25 с.

133. Панин А.Н. Иммунология и кишечная микрофлора / А.Н. Панин, Н.И. Малик, Е.В. Малик. Москва, 1998. - 47 с.

134. Парфенов А.И. Лечение дисбактериоза кишечника препаратом Хилак-форте / А.И. Парфенов, Ю.К. Калоев, Н.Г. Федотова // Провизор. 1998. -N.9.-C. 12-15.

135. Патент 2065875 Россия, А 61 К 35/74// (С 12 N 1/20, С 12 R 1:19). Штамм бактерий Esherichia coli, используемый для получения колибактерина / Р.А. Пшеничнов, В.Н. Вотяков, В.М. Колотов. 1993. - 6 с.

136. Патент 2090612 Россия, С 12 N 1/38. Стимулятор роста бактериальной культуры/Т.Я. Вахитов, JI.H. Петров, О.Ю. Яшина. 1993. - 8 с.

137. Патент 2108381 Россия, С 12 N 1/20. Основа питательной среды для культивирования микроорганизмов / В.И. Сушко, И.И. Школьник, В.В. Щеткин.- 1998.-5 с.

138. Патент 2151796 Россия, С 12 N 1/20, С 12 Р 1/04. Штамм Lactococcus lactis продуцент бактериоцина низина / М.Б. Биттеева, В.В. Бирюков, И.Н. Щеблыкин и др. - 1999. - 5 с.

139. Патент 2158302 Россия, С 12 N 1/20, А 23 С 9/12. Питательная среда для роста бифидо- и лактобактерий / Р.С. Рахманов. 1999. - 4 с.

140. Патент 2160594 Россия, А 61 К 35/74, А 23 С 9/12. Способ получения бифидумбактерина / А.Г. Храмцов, С.Е. Виноградская. 2000. - 6 с.

141. Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека / Л.Г. Перетц. Москва, 1955. - 435 с.

142. Петухов В.А. Нарушение функций печени и дисбиоз при липидном дистресс-синдроме Савельева и их коррекция пребиотиком Хилак-форте / В.А. Петухов // Рус. мед. журн. 2002. - Т. 10, N. 4. - С. 158-164.

143. Пинегин Б.В. Мурамилдипептиды иммунотропные средства нового поколения /Б.В. Пинегин, Т.М. Андронова // Мед. картотека. - 1999. -N. З.-С. 26-29.

144. Полищук Е.И. Выбор стабилизирующей среды для получения лиофилизированных живых культур возбудителей микозов / Е.И. Полищук, Н.В. Колтукова // Лабор. диагностика. 1999. - N. 4. - С. 29-33.

145. Попова Л.Ю. Микробные тест-системы для оценки степени токсичности химических соединений / Л.Ю. Попова, Н.И. Луцкая, А.Г. Жуков. Красноярск, 1991. - 31 с.

146. Поспелова В.В. Биологическая характеристика некоторых производственных и свежевыделенных штаммов лактобацилл /В.В. Поспелова, М.А. Шабанская, Н.В. Морозова // Мед. аспекты микр. экологии. 1992. -Вып. 6. - С. 54-57.

147. Поспелова В.В. Микробные биопрепараты для коррекции бактериоценоза кишечника, их консруирование и применение: Дис. . д-ра мед. наук. Москва, 1979. - 459 с.

148. Поспелова В.В. Новые сферы применения микробных биопрепаратов для коррекции бактериоценоза организма человека / В.В. Поспелова, Н.Г. Рахимова, М.П. Халенева и др. // Иммунобиол. препараты. М., 1989. - С. 142-152.

149. Постникова О.Н. Влияние поверхностно-активных веществ на люминесцентную систему светящихся бактерий/ О.Н. Постникова, Ю.С. Кривошеин, Л.Ю. Бержанская // Биотехнология. 1992. - N. 4. - С. 56-59.

150. Пшеничнов Р.А. Микробиолюминесцентный индикатор токсичности- МИТ: конструирование и применение / Р.А. Пшеничнов, И.Л. Масленникова, Н.М. Никитина // Матер. V Междунар. конф. Волгоград - Пермь, 2001. - С.42.

151. Пшеничнов Р.А. Микробиолюминесценция / Р.А. Пшеничнов, И.Л. Масленникова, Н.М. Никитина. Пермь, 2005.

152. Пшеничнов Р.А. Микробиотест для оценки мониторинга загрязнения почв / Р.А. Пшеничнов, Ф.Н. Закиров, Н.М. Никитина // Экология.- 1995.-N. 4.-С. 332-334.

153. Пшеничнов Р.А. Микробная популяция саморегулируемая система / Р.А. Пшеничнов, В.М. Колотов, С .Я. Барихин и др. // Экология и популяционная генетика микроорганизмов: Сб. статей УНЦ АН СССР. -Свердловск, 1975.-С. 3-13.

154. Раппопорт А.И. Влияние сахарозы и лактозы на устойчивость дрожжей Saccharomyces cerevisiae к обезвоживанию / А.И. Раппопорт, М.Е. Беккер // Микробиология. -1983. -Т. 52, Вып. 5. С. 719-722.

155. Реммель Н.Н. Биолюминесцентный контроль интенсивности патологических окислительных процессов в клетках / Н.Н. Реммель, В.А. Кратасюк // Бюлл. экспер. биол. и мед. 2003. - Т. 135, N. 1. - С. 52-54.

156. Решетилов А.Н. Биосенсоры и биологические методы анализа объектов окружающей среды / А.Н. Решетилов // Прикл. биохимия и микробиол. 2000. - Т. 36, N. 5. - С. 605-608.

157. Рожкова И.Ю. Предпосылки к использованию лактобактерина на основе штамма Lactobacillus fermentum 90-TS-4 в гинекологической практике / И.Ю. Рожкова, Э.Г. Кравцов // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1990. - Т. 27, N. 2. -С. 234-236.

158. Руководство по вакцинному и сывороточному делу / Под ред. П.Н. Бургасова Москва: Медицина, 1978. - С. 45-153.

159. Румянцев Г.И. Проблемы прогнозирования токсичности и риска воздействия химических веществ на здоровье населения / Г.И. Румянцев, С.М. Новиков // Гигиена и санитария. 1997. -N. 6. - С. 13-18.

160. Семикоз Н.Г. Применение лекарственного препарата Хилак при лечении поражений кишечника, вызванных лучевой терапией / Н.Г. Семикоз, Л.И. Мокан, В.П. Фефелова и др. // Еженедельник Аптека. 2000. - N. 39 (260).-С. 4-5.

161. Серебрякова Е.В. Оценка гидрофобных свойств бактериальных клеток по адсорбции на поверхности капель хлороформа / Е.В. Серебрякова, И.В. Дармов, Н.П. Медведев // Микробиология. 2002. Т. 71, N. 2. - С. 237-239.

162. Сидякина Т.М. Консервация микроорганизмов в коллекциях культур. Консервация генетических ресурсов. Методы. Проблемы. Перспективы / Т.М. Сидякина. Пущино, 1991. - С. 81-159.

163. Синицын А.П. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, В.И. Лозинский, С.Д. Спасов. Москва: Изд-во Моск. у-та, 1994. - 288 с.

164. Состав и свойства молока как сырья для молочной промышленности: Справочник / Н.Ю. Алексеева, В.П. Аристова, А.П. Патратий. Москва: Агропромиздат, 1986. - 232 с.

165. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М.О. Биргера. Москва: Медицина, 1982. - 464 с.

166. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов: Автореф. дис. . д-ра вет. наук / П.П. Степаненко. Москва, 2000. - 30 с.

167. Степанчук Ю.Б. Микрофлора пищеварительного тракта и метаболизм щавелевой кислоты / Ю.Б. Степанчук // Пробиотические микроорганизмы современное состояние вопроса и перспективы использования: Матер. Междунар. научно-практ. конф. - Москва, 2002. - С. 26.

168. Стоянова Л.Г. Сравнение способов хранения молочнокислых бактерий / Л.Г. Стоянова, З.А. Аркадьева // Микробиология. 2000. - Т. 69, N. 1.-С. 98-104.

169. Страховская М.Г. Фотоиндуцированное подавление биолюминесценции генно-инженерного штамма бактерий Е. coli TGI в присутствии фотодитазина / М.Г. Страховская, И.М. Пархоменко // Микробиология. 2002. - Т. 71, N. 3. - С. 345-348.

170. Суворова К.Н. Атопический дерматит: иммунопатогенез и стратегия иммунотерапии /К.Н. Суворова//Рус. мед. журн. 1998. - Т. 6, N. 6. - С. 344-347.

171. Телешева Л.Ф. Механизмы противоинфекционной защиты репродуктивного тракта женщин / Л.Ф. Телешева, В.Ф. Долгушина, И.И. Долгушин // Журн. микробиол. 1998. - N. 4. - С. 85-90.

172. Тимошкина Н.Н. Применение биолюминесцентного метода для экспресс-тестирования загрязненных вод / Н.Н. Тимошкина, С.В. Юшков // Тез. докл. конф. мол. ученых. Владивосток, 1999. - С. 185-187.

173. Титов А.Н. Биолюминесцентный метод определения чувствительности микрофлоры к антибиотикам / А.Н. Титов, Н.А. Романова, Т.М. Данилова, Л.Ю. Бровко // Лабор. дело. 1990. - N. 10. - С. 61-66.

174. Тюрин М.В. К механизму антагонистической активности лактобацилл / М.В. Тюрин, Б.А. Шендеров, Н.Г. Рахимова и др. // Журн. микробиол. 1989. - N. 2. - С. 3-8.

175. Тюрин М.В. Устойчивость к антибиотикам лактобацилл, выделенных из кишечника здоровых людей / М.В. Тюрин // Антибиотики и химиотерапия. 1989. - Т. 34, N. 9. - С. 716-718.

176. Файбич М.М. Стабилизация вакцинных препаратов в процессе высушивания и хранения / М.М. Файбич // Журн. микробиол. 1968. - N. 2. - С. 59-66.

177. Федоров А.Ю. Хранение штаммов промышленных микроорганизмов, включенных в полимерные матрицы / А.Ю. Федоров, Е.В. Волченко, И.Н. Сингирцев и др. // Прикл. биохимия и микробиол. 2000. -Т. 36, N. 1.-С. 59-67.

178. Федотова Т.А. Роль дисбактериоза кишечника в формировании иммунной недостаточности у детей / Т.А. Федотова, А.А. Михайленко, С.Ф. Сергеева и др. // Иммунология. 2001. - N. 3. - С. 41-45.

179. Филиппов В.А. Бактериоциногения лактобацилл полости рта: Автореф. дис. . д-ра мед. наук / В.А. Филиппов. Москва, 1982. - 27 с .

180. Фоменко Д.Э. Новые пептидные антибиотики микроцины типов В и С: структура и генетические детерминанты синтеза / Д.Э. Фоменко, А.З. Мелицкая, Г.С. Катруха и др. // Молекул, биол. - 1998. - N. 2. - С.382-386.

181. Фомченков В.М. Исследование интегральной токсичности водной среды с использованием бактериальных тестов / В.М. Фомченков, И.А. Ирхина //Прикл. биохимия и микробиол. 2000. - Т. 36, N. 6. - С. 656-661.

182. Фрунджян В.Г. Биолюминесцентный метод определения общей бактериальной обсемененности сырого молока / В.Г. Фрунджян, Л.Ю. Бровко // Прикл. биохимия и микробиол. 1999. - Т. 35, N. 3. - С. 358-365.

183. ФС 42-0054-00 Лактобактерин сухой.

184. ФС 42-3365-00 Колибактерин сухой.

185. ФС 42-3539-98 Питательная среда 199 М (10-кратный концентрат), жидкая.

186. ФС 42-3874-99 Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов.

187. ФС 42-3946-00 Ацилакт сухой.

188. ФС 42-3947-00 Бифидумбактерин сухой.

189. ФС 42-3950-00 Лактобактерин, суппозитории вагинальные.

190. ФСП 42-0028220201 Бификол сухой.

191. Хавкин А.И. Микробиоценоз кишечника и иммунитет / А.И. Хавкин //Рус. мед. журн.-2003.-Т. 11, N. 3. С. 122-126.

192. Хмель И.А. Микроцины пептидные антибиотики энтеробактерий: генетический контроль синтеза, структура, механизм действия / И.А. Хмель // Генетика. - 1999.-Т. 35, N. 1.-С.5-16.

193. Храмцов А.Г. Безотходная технология в молочной промышленности / А.Г. Храмцов, П.Г. Нестеренко. Москва, 1989. - 280 с.

194. Храмцов А.Г. Молочная сыворотка / А.Г. Храмцов. Москва: Пищевая промышленность, 1979. - 272 с.

195. Хрипач JI.B. Оценка суммарной токсичности тяжелых металлов на основе люминесцентного бактериального теста / JI.B. Хрипач, Ю.А. Ревазова, А.Б. Ходжаян // Гигиена и санитария. 1998. -N. 4. - С. 67-72.

196. Циммерман Я.С. Дисбиоз («дисбактериоз») кишечника и его клинически манифестные формы: антибиотико-ассоциированная диарея и псевдомембранозный колит / Я.С. Циммерман. Пермь, 2005. - 66 с.

197. Чахава О.В. Микробиологические и иммунологические основы гнотобиологии / О.В. Чахава, Е.М. Горская, С.З. Рубан. Москва: Медицина, 1982.- 152 с.

198. Черкасов С.В. Изменение биологических свойств Staphylococcus epidermidis и Escherichia coli под влиянием метаболитов вагинальных лактобацилл в эксперименте / С.В. Черкасов, Т.М. Забирова, А.В. Сгибнев и др. //Журн. микробиол.-2001.-N. 4.-С. 114-116.

199. Черкасов С.В. Роль биологических свойств вагинальных лактобацилл в процессах колонизации / С.В. Черкасов, Т.М. Забирова, А.В. Сгибнев, И.В. Черкасов // Журн. микробиол. 2003. - N. 4. - С. 61-64.

200. Чернякова В.И. Влияние желчи на интестинальные аэробные бактерии/В.И. Чернякова, Т.В. Смирнова //Врач. дело. 1978. -N. 10. - С. 87-91.

201. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса / С.А. Шевелева // Вопр. питания. -1999.-N. 2.-С. 32-40.

202. Шендеров Б.А. Медицинская и микробная экология и функциональное питание: В 3 т. Т. I: Микрофлора человека и животных и ее функции / Б.А. Шендеров. Москва: «ГРАНТЪ», 1998. - 288 с.

203. Шендеров Б.А. Медицинская и микробная экология и функциональное питание: В 3 т. Т. II: Социально-экологические и клинические последствия дисбаланса микробной экологии человека и животных / Б.А. Шендеров. Москва: «ГРАНТЪ», 1998. - 416 с.j

204. Шендеров Б.А. Медицинская и микробная экология и функциональное питание: В 3 т. Т. III: Пробиотики и функциональное питание / Б.А. Шендеров. Москва: «ГРАНТЪ», 2001. - 288 с.

205. Шмырина И. JI. Люминесцентный микробиотест: возможные пути его оптимизации и расширение сферы использования: Дис. . канд. биол. наук / И.Л. Шмырина. Пермь, 2000. - 171 с.

206. Шульпекова Ю.О. Применение пробиотиков в клинической практике / Ю.О. Шульпекова // Болезни органов пищеварения. 2003. - Т. 5, N. 1.-С. 28-32.

207. Щербаков И.Т. Применение пребиотика хилак-форте в комплексном лечении больных ОКИ и хроническими заболеваниями ЖКТ у взрослых / И.Т. Щербаков, Н.А. Малышев, Н.М. Грачева и др. // Новые лекарственные препараты. 2003. - N. 7. - С. 51-59.

208. Эйсфельд Д.А. Биологическая характеристика производственных штаммов лактобактерий: Дис. канд. биол. наук /Д.А. Эйсфельд. 2002. - 129 с.

209. Юринова Г.В. Роль адгезии бактерий в колонизации слизистых оболочек организма (обзор) / Г.В. Юринова, В.И. Злобин, С.М. Попкова, Е.Л. Кичиргина // Бюл. СО РАМН. 2001. - N. 3. - С. 90-93.

210. Яковлева В.И. Иммобилизованные клетки в биотехнологии / В.И. Яковлева. -Пущино, 1987.-С. 15-26.

211. Adebawo О.О. Utilization of high lysine-producing strains of Lactobacillus plantarum as starter culture for nutritional improvement of ogi /

212. Adebawo, J.O. Akingbala, J.L. Ruiz-Barba, O. Osilesi // World J. of Microbiol, and Biotechnol. 2000.- N. 5.- P. 451-455.

213. Adorns M.R. Growth ingibition of food-borne pathogens by lactic and acetic acids and their mixtures / M.R. Adorns, C.I. Hill // Intern. J. Food Sci. Technol. 1988. - Vol. 23. - P. 287-292.

214. Alvarez-Olmos M.I. Probiotic agents and infectious diseases: A modern perspective on a traditional therapy / M.I. Alvarez-Olmos, R.A. Oberhelman // Clin. Infec. Diseas. Vol. 32, N. 11.-P. 1567-1576.

215. Amant D.C.St. Inhibition of Neisseria gonorrhoeae by Lactobacillus species that are commonly associated with the female genital tract / D.C.St. Amant,

216. E. Valentin-Bon, A.E. Jerse // Infection and Immunity. 2002. - Vol. 70. - P. 7169-7171.

217. Anderson R. The significance and potential molecular mechanisms of gastrointestinal barrier homeostasis / R. Anderson // Scand. J. Gastroenterol. 1997. -Vol. 32, N. l.-P. 1073-1083.

218. Annuk H. Antagonistic activity of Lactobacilli against urinary Escherichia coli / H. Annuk, I. Vainumae, K. Aimla et al. // Microb. Ecol. Health and Disease. 1999.-Vol. 11,N. 2.-P. 117.

219. Ashar M.N. Intestinal microflora, fermented milks and their role in human health / M.N. Ashar, J.B. Prajapati // Everyman's Sci. 1999. - N. 1. - P. 4-7.

220. Atrin A. Mode of action, purification and amino acid sequence of plantaricin С19, an anti-Listeria bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum C19 / A. Atrin, N. Rekhif, A.J. Moir et al. // Intern. J. Food Microbiol. 2001. -Vol. 68.-P. 93-104.

221. Audibert F. Adjuvants for vaccines, a quest / F. Audibert // Intern. Immunopharmacol. -2003. Vol. 3,N. 8.-P. 1187-1193.

222. Aumerich M.T. Bacteriocin-producing in Spanish-style fermented sausages: Characterization of bacteriocins / M.T. Aumerich, M. Garriga, J.M. Monfort et al. // Food Microbiol. 2000. - Vol. 17, N. 11. - P. 33-35.

223. Baquero F. The microcins / F. Baquero, F. Moreno // Microbiol. Lett. -1984.-Vol. 23.-P. 117-124.

224. Barcena J.M. Chemostat production of plantaricin С by Lactobacillus plantarum LL441 / J.M. Barcena, F. Sineriz// Appl. and Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64, N. 9. -P. 3512-3514.

225. Barker K.F. Antibiotic resistanse: A current perspective / K.F. Barker // Brit. J. Clin. Pharmacol. 1999. - Vol. 48, N. 2. - P. 109-124.

226. Bassi A.S. Recent advances in biosensor research for environmental applications / A.S. Bassi // Can. Chem. News. 2000. - Vol. 52, N. 4. - P. 22-23.

227. Bengmark S. Econutrition and health maintenance a new concept to prevent GI inflammation, ulceration and sepsis / S. Bengmark // Clin. Nutrition.-1996.- Vol. 15.-P. 1-10.

228. Bibiloni R. Will a high adhering capacity in a probiotic strain guarantee exclusion of pathogens from intestinal epithelia? / R. Bibiloni, P. Perez, G. De Antoni // Anaerobe. 1999. - Vol. 5, N. 5. - P. 519-524.

229. Billard P. Bioluminescence-based assay for detection and characterization of bacteria in clinical laboratories / P. Billard, M.S. DuBow // Clinical Biochemistry. 1998.-Vol. 31, N. l.-P. 1-14.

230. Blum S. Intestinal microflora and the interaction with immunocompetent cells / S. Blum, S. Alvarez // Ant. Leevewen. 1999. - Vol. 76. - P. 199-205.

231. Bogovic M.B. Bacteriocinogenic activity of lactobacilli isolated from cheese and baby faeces / M.B. Bogovic, I. Rogelj // Food Technol. and Biotechnol. -1999.-N. 2.-P. 93-100.

232. Borriello S.P. Microbial flora of the gastrointestinal tract / S.P. Borriello // Microbial metabolism in the digestive tract / Ed. M.J. Hill. New York: Academic Press, 1986.-P. 3-15.

233. Brashears M.M. Bile salt deconjugation and cholesterol removal from media by Lactobacillus casei / M.M. Brashears, S.E. Gilliland, L.M. Buck // J. Dairy Science. 1998. - Vol. 36, N. 3. - P. 281-301.

234. Brock T.D. Biology of Microorganisms / Ed. M.T. Madigan, J.N. Martinko, J. Parker. London: Prentice Hall Internacional, 1997. - 997 p.

235. Bulich A.A. A practical and reliable method for monitoring the toxicity of aquatic samples / A.A. Bulich // Process Biochem. 1982. - Vol. 17. - P. 45-47.

236. Bulich A.A. The luminescent bacterial toxicity test, its potential as an in-vitro alternative / A.A. Bulich, K.K. Tung, G. Scheibner // J. Biolumin. Chemilum. -1990.-Vol. 5.-P. 71-78. .

237. Burton S.A. The bacterial bioluminescens test / S.A. Burton, R. Dabbah // Pharmacopeial Forum. 1989.-N. 11.-P. 4812-4814.

238. C. De Simone. Effect of Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus acidophilus on gut mucosa and peripheral blood В limphocytes / C. De Simone, A. Ciardi, A. Grassi et al. // Immunopharmacol. Immunotoxicol. - 1982. - Vol. 14, N. l.-P. 1-2.

239. Calewaert R. Bacteriocinproduction with Lactobacillus amylovorus DCE 741 is improved and stabilized by fed-batch fermentation / R. Calewaert, L. De Vuyst // Appl. and Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66, N. 2. - P. 606-613.

240. Calvert R.M. Gaged ATP-an internal calibration method for ATP bioluminescence assays/ R.M. Calvert, H.C. Hopkins// Lett. Appl. Microbiol.- 2000. -Vol. 30, N. 3.-P. 223-227.

241. Casas I.A. Prebiotics, probiotics, antibiotics and autobiotics / I.A. Casas // Microb. Ecol. Health and Disease. 1999. -N. 2. - P. 108-109.

242. Castellano P. Mode of action of lactocin 705, a two-component bacteriocin from Lactobacillus casei CRL705 / P. Castellano, R. Raya, G. Vignolo // Inter. J. Food Microbiol. 2003. - Vol. 85, N. 1-2. - P. 35-43.

243. Chhabra R.S. Intestinal absorption and metabolism of xenobiotics in laboratory animals / R.S. Chhabra, W.C. Eastin // Intestinal Toxicology / Ed. C.M. Schiller. New York: Raven Press, 1984. - P. 28-34.

244. Chowdhury A.R. A highly convergent approach for the synthesis of disaccharide repeating units of peptidoglycan / A.R. Chowdhury, A. Siriwardena, G.J. Boons // Tetrahedron Lett. 2002. - Vol. 43, N. 43. - P. 7805-7807.

245. Christl S.U. Production, metabolism and extretion of hidrogen in the large intestin / S.U. Christl, P.R. Murgstroyd, G.R. Gibson, J.H. Cummings // Gastroenterol. 1992. - Vol. 102, N. 2. - P. 498-503.

246. Chung T.C. In vitro studies on reuterin synthesis by Lactobacillus reuteri / T.C. Chung, L. Axelsson, S.E. Lindgren et al. // Microb. Ecol. Health and Disease. -1989.-Vol. 2.-P. 137-144.

247. Cohen L.Y. Modulation of expression of class II MHC and CD40 molecules in murine В cells by various muramyl dipeptides / L.Y. Cohen, G.M. Bahr, E.C.A. Darcissac, M.A. Parant // Cell. Immunol. 1996. - N. 1. - P. 75-84.

248. Cross M.L. Anti-allergy properties of fermented foods: an important immunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria? / M.L. Cross, L.M. Stevenson, H.S. Gill // Intern. J. Immunopharmacol. 2001. - Vol. 1, N. 5. -P. 891-901.

249. Cummings J.H. Role of intestinal bacteria in nutrient metabolism / J.H. Cummings, G.T. Macfarlane // Am. J. Clin. Nutr. 1997. - N. 16. - P. 3-11.

250. Darcissac E.C.A. Selective potentiation of cytokine expression in human whole blood by myrabytide, a myramyl dipeptide analogue / E.C.A. Darcissac, G.M. Bahr, P.R. Pouillart et al. // Cytokine. 1996. - Vol. 8, N. 8. - P. 658-666.

251. Diep D.B. A bacteriocin-like peptide induces bacteriocin synthesis in Lactobacillus plantarum Cll / D.B. Diep, L.S. Havarstein, I.F. Nes // Mol. Microbiol. 1995.-Vol. 18.-P. 631-639.

252. Doeschel M.A. Antimicrobial substances from lactic acid bacteria for use as food preservatives / M.A. Doeschel // Food Thechnol. 1989. - Vol. 43. - P. 164167.

253. Dunny G.M. Cell-cell signaling in bacteria / G.M. Dunny, S.C. Winnas. -Wash. DC.: ASM Press. 1999.

254. Dutta R.C. Peptide immunomodulators versus infection, an analysis / R.C. Dutta // Immunol. Lett. 2002. - Vol. 83, N. 3. - P. 153-161.

255. Dyrset N. Feed supplement recovered from dairy wastewater by biological and chemical pretreatment / N. Dyrset, E. Selmer-Olsen // J. Chem.Technol. and Biotechnol. 1998. - Vol. 73, N. 3. - P. 175-182.

256. Efiuwewere B.J.O. Mannitol enhanced survival of Lactococcus lactis subjected to drying / B.J.O. Efiuwewere, L.G.M. Gorris, E.J. Smid et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1999.-Vol. 51, N. l.-P. 100-104.

257. Ehrmann M.A. A gene cluster encoding plantaricin 1.25beta and other bacteriocin-like peptides in Lactobacillus plantarum TMW1.25. / M.A. Ehrmann, A. Remiger, V.G. Eijsink, R.F. Vogel // Biochim. Biophys. Acta. 2000. -Vol. 1490, N.3.- P. 355-361.

258. El Soda M. The esterolitic and lipolitic activities of lactobacillis / M. El Soda, M. Korayem, N. Ezzat // Milchwissenschaft. 1986. - Vol. 41, N. 6. -P. 353-355.

259. Elli M. Growth requirements of Lactobacillus johnsonii in skim and UHT milk / M. Elli, R. Zink, R. Reniero, L. Morelli // Int. Dairy J. 1999. - Vol. 9, N.8. -P. 507-513.

260. Elliott S.N. Bacteria rapidly colonize and modulate haeling of gastric ulcers in rats / S.N. Elliott, A. Buret, W. McKnight et al. // Am. J. Physiol. 1998. -N. 3, Pt. l.-P. 425-432.

261. Elmer G.W. Probiotics: «living drugs» / G.W. Elmer // Am. J. Health Syst. Pharm. 2001. - Vol. 58, N. 12. - P.l 101-1109.

262. Enan G. Inhibition of Bacillus cereus ATCC 14579 by plantaricin UG1 in vitro and in food / G. Enan 11 Nahrung. 2000. - Vol. 44. - P. 364-367.

263. Famularo G. Microecology, bacterial vaginosis and probiotics / G. Famularo, M. Pieluigi // Med. Hypotheses. 2001. - Vol. 56, N. 4. - P. 365-378.

264. Fuller R. Modification of the intestinal microflora using probiotics and prebiotics /R. Fuller, G.R. Gibson// Scand. J. Gastroenterol. 1997. - Vol. 32, suppl. 222. - P. 28-32.

265. Ganzle M.G. Caracterization of reutericyclin produced by Lactobacillus reuteri LTH2584 / M.G. Ganzle, L. Holtzel, W. Jens et al. // Appl. and Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66, N. 10. - P. 4352-4333.

266. Garneau S. Two-peptide bacteriocins produced by lactic acid bacteria / S. Garneau, N.I. Martin, J.C. Vederas // Biochim. 2002. - Vol. 84, N. 5-6. -P. 577-592.

267. Gary D.M. Cell-cell communicition in gram-positive bacteria / D.M. Gary, L.A.B. Bettina // Annu. Rev. Microbiol. 1997. - Vol. 51. - P. 527-564.

268. Gibson G.R. Aspects of in vitro and in vivo research approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use / G.R. Gibson, R. Fuller // J. Nutr. 2000. - Vol. 130, N. 2. - P. 391-395.

269. Goldin B.R. The effect of milk and lactobacillus feeding on human intestinal bacterial enzyme activity / B.R. Goldin, S.L. Gorbach // Amer. J. Nutr. -1984. Vol. 39. -N. 5. - P. 756-761.

270. Gorbach S.L. Lastic acid bacteria and Human Health / S.L. Gorbach // Ann. Med. 1990. - Vol. 22. - P. 37-41.

271. Gracia E. In vitro development of S. aureus biofilms using slime-producing variant and ATP-bioluminescence for automatic bacterial quantification / E. Gracia, A. Fernandez // Luminescence. 1999. - Vol. 14, N. 1 - P. 23-31.

272. Grunewald K.K. Serum cholesterol levels in rats fed fermented by Lactotbacillus acidophillus / K.K. Grunewald // J. Food Sci. 1982. - Vol. 47. - P. 153-157.

273. Guerin-Danan C. Microb. Storage of intestinal bacteria in samples frozen with glycerol / C. Guerin-Danan, C. Andrieux, O. Szylit // Microb. Ecol. Health and Disease. 1999.-Vol. 11,N. 3.-P. 180-182.

274. Gupta P.K. Antagonic activity of Lactobacillus acidophilus fermented milk against different pathogenic bacteria / P.K. Gupta, B.K. Mital, S.K. Garg // Indian J.Exp. Biol. 1996. - Vol. 34, N. 12. - P. 1245-1247.

275. Hancock R.E.W. Cationic peptides: A new source of antibiotics / R.E.W. Hancock, R. Lehrer // Trends Biotechnol. 1998. - N. 2. - P. 83-88.

276. Hastings J.W. Bacterial bioluminescence / J.W. Hastings, K.H. Nealson // Ann. Rev. Microbiol. -1997. Vol. 31. - P. 549-595.

277. Hauge H.H. Membrane-mimicking entities induce structuring of the two-peptide bacteriocins plantaricin E/F and plantaricin J/K / H.H. Hauge, D. Mantzilas, V.G. Eijsink, J. Nissen-Meyer // J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181, N. 3. - P. 740-747.

278. Havell E.A. The role of the flora in cytokine responses / E.A. Havell // Microb. Ecol. Health and Disease. 1999. - N. 2. - P. 104.

279. Holdeman L.V. Recent changes in identification and classificacion of some anaerobes / L.V. Holdeman, E.P. Cato, W.E.C. Moore // Anaerobic bacteria selected topics / Ed. D.W. Lambe. New York, 1980. - P. 25-38.

280. Holo H. Plantaricin W from Lactobacillus plantarum belongs to a new family of two-peptide lantibiotics / H. Holo, Z. Jeknic, M. Daeschel et al. // Microbiol. 2001. - Vol. 147. - P. 643-651.

281. Holton W.C. Fresh ideas for food safety / W.C. Holton // Environ Health Perspect. 2000. - Vol. 108, N. 11. - P. 516-519.

282. Huang Y. Acetate production from whey lactose using co-immobilized cells of homolactic and homoacetic bacteria in a fibrous-bed bioreactor / Y. Huang, S. Yang // Biotechnol and Bioeng. 1998. - Vol. 60, N. 4. - P. 498-507.

283. Ishibashi N. Probiotics and safety / N. Ishibashi, S. Ymazaki // Am. J. Clin. Nutr. 2001. - N. 73. - P. 465-470.

284. Isolauri E. Probiotics in the management of atopic eczema / E. Isolauri, T. Arvola, Y. Sutas et al. // Clin. Exp. Allergy. 2000. -V. 30, N. 11. - P. 1604-1610.

285. Jama Y.H. Antibacterial effect of plantaricin LP84 on food borne pathogenic bacteria occurring as contaminants during idle batter fermentation / Y.H. Jama, M.C. Varadaraj // World J. of Microbiol, and Biotechnol. 1999. -N. 27.-P. 215.

286. Jassim S. In vivo bioluminescence / S. Jassim, A. Ellison, S. Denyer // J. Biolum. Chemilum. 1990.-N. 3.-P. 115-122.

287. Kailasapathy K.A. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. / K.A. Kailasapathy, J. Chin // Immunol. Cell. Biol. 2000. - Vol. 78. - P. 80-88.

288. Kalliomaki M. Probiotics during pregnancy and breast-feeding might confer immunomodulatory protection against atopic disease in the infant / M. Kalliomaki, E.J. Isolauri // Allergy Clin. Immunol. 2002. - Vol. 109, N. 1. -P. 119-121.

289. Kalliomaki M. Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo-controlled trial / M. Kalliomaki, S. Salminen, H. Arvilommi et al. // Lancet. 2001. - Vol. 357, N. 9262. - P. 1076-1079.

290. Kamel B.S. Fermented whole wheat flour and whey in food preparation / B.S. Kamel // Process Biochem. 1985. - Vol. 20, N. 6. - P. 190-193.

291. Kar T. Therapeutic properties of whey used as fermented drink / T. Kar, A.K. Misra // Rev. Microbiol. 1999. - Vol. 30, N. 2. - P. 163-169.

292. Kets E.P.W. Effect of carnitines on Lactobacillus plantarum subjected to osmotic stress / E.P.W. Kets, J.A.M. De Bont // FEMS Microbiol. Lett. 1997. -Vol. 146. - P. 205-209.

293. Kleerebezem M. Quorum sensing by peptide pheromones and two-component signal-transdution systems in Gram-positive bacteria / M. Kleerebezem, L.E.N. Quadri, O.P. Kuipers, W.M. de Vos // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 24. - P. 895-904.

294. Korpela M.T. Recombinant Escherichia coli sensor strain for the detection of tetracyclines / M.T. Korpela, J.S. Kurittu, J.T. Karvinen // Anal. Chem. -1998.-N. 6.-P. 4457-4462.

295. Kubota Т. Intrapreoptic microinjection of TNF-a enhances non-REM sleep in rats / T. Kubota, N. Li, Z. Guan et al. // Brain Research. 2002. - Vol. 32, N. l.-P. 37-44.

296. Kwan K.K. Mutatox test: A new test for monitoring environmental genotoxic agents / K.K. Kwan, B.J. Dutka, S.S. Rao, D. Lui D // Environmental Pollution. 1990. - Vol. 65, N. 3. - P. 323-332.

297. Lee P.C. Batch and continuous cultivation of Anaerobiospirullum succiniproducens for the production of succinic acid from whey / P.C. Lee, W.G. Lee // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 2000. - Vol. 54, N. 1. - P. 23-27.

298. Lidbeck A. Lactobacilli, anticarcinogenic activites and human intestinal microflora / A. Lidbeck // Eur. J. Cancer. Prev. 1992. - Vol. 1, N. 5. - P. 341-353.

299. Lilly D.M. Probiotics: Growth promoting factors producend by microorganisms / D.M. Lilly, R.H. Stillwell // Science. 1965. - Vol. 147. -P. 747-748.

300. Lindgren S.E. Antagonistic activities of lactic acid bacteria in food and vegetables / S.E. Lindgren, W.J. Dobrogosz // FEMS Microbiol. Rev. 1990. -Vol. 87.-P. 149-164.

301. Linko P. Biotechnology in whey valorization / P. Linko // Food Industries and Environment: Int. Symp. Budapest, 1982. - P. 221-227.

302. Luckey T.D. Overview of gastrointestinal microecology / T.D. Luckey // Die Nahrung. 1987. - Vol. 31, N. 5-6. - P. 142-148.

303. MacFarlane G.T. Human colonic microbiota: ecology, physiology and metabolic protential of intestinal bacteria / G.T. MacFarlane, S. MacFarlane // Scand. J. Gastroenterol. 1997. - Vol. 32, Suppl. 222. - P. 3-10.

304. Mack D.R. Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro by inducing intestinal mucin gene expression / D.R. Mack, M. Sonia, W. Shu et al. // Am. J. Physiol. 1999. - Vol. 276, N. 4, Pt. 1. - P. 941-950.

305. Mack D.R. Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro by inducing intestinal mucin gene expression / D.R. Mack, M. Sonia, W. Shu et al. // Am. J. Physiol. 1999. - Vol. 276, N. 4, Pt. l.-P. 941-950.

306. Maiorella B.L. Ethanol, biomass and enzyme production for whey waste abatement / B.L. Maiorella, F. Castillo // J. Proc. Biochem. 1984. - Vol. 19, N. 4. -P. 157-161.

307. Majamaa H. Probiotics: a novel approach in the management of food allergy / H. Majamaa, E. Isolauri // J. Allerg. and Clin. Immunol. 1997. - Vol. 99, N. 2.-P. 179-185.

308. Mangell P. Lactobacillus plantarum 299v Inhibits Escherichia coli-Induced Intestinal Permeability / P. Mangell, P. Nejdfors, M. Wang et al. // Digestive Diseases and Sciences. 2002. -N. 47. - P. 511-516.

309. Masek K. Neuroendocrine immune interactions in health and disease / K. Masek, P. Slansky, P. Petrovicky, J.W. Hadden // Intern. J. Immunopharmacol. -2003. Vol. 3, N. 8. - P. 1235-1246.

310. Matsuzaki T. Modulating immune responses with probiotic bacteria / T. Matsuzaki, J. Chin // Immunol, and Cell. Biol. 2000. - Vol. 78, N. 1. -P. 67-73.

311. Mc Kay L.L. Applications for biotechnology: present and future improvements in lactic acid bacteria / L.L. Mc Kay, K.A. Baldwin // FEMS Microbiol. Rev. 1990. - Vol. 87. - P. 3-14.

312. McAuliffe O. Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action / O. McAuliffe, C. Hill, R.P. Ross // FEMS Microbiol. Rev. 2001. - Vol. 25, N. 3. -P. 285-308.

313. McAuliffe O. Regulation of immunity to the two-component lantibiotic, lacticin 3147, by the transcriptional repressor LtnR / O. McAuliffe, T. O'Keeffe, C. Hill, R.P. Ross // Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 39, N. 4. - P. 982-993.

314. Meighen E. Molecular biology of bacterial bioluminescence / E. Meighen //Microbiol. Rev. 1991. - Vol. 55, N. 1. - P. 123-142.

315. Meniok T.A. Effect of immunomodulator from Lactobacillus Delbrueckii on therapeutic efficacy of cyclophosphamide in mice with Levis carcinoma / T.A. Meniok, I.M. Voyejkova, O.Y. Yudina et al. // Exper. Oncol. 2000. - N. 22. - P. 211-214.

316. Messens W. Inhibitory substances produced by Lactobacilli isolated from sourdoughs a review / W. Messens, L.D. Vuyst // Intern. J. Food Microbiol. — 2002.-Vol. 72, N. 1-2.-P. 31-43.

317. Metchnikoff E. The Prolongation of Life: Optimostic Dtudies / E. Metchnikoff. New York: GP Putmen's Sons, 1908. - P. 161-183.

318. Meyrath J. Biomass from whey / J. Meyrath, K. Bayer // Economic Microbiology. London, 1979. - Vol. 4: Microb. Biomass / Ed. A.H. Rose. -P. 207-269.

319. Minnock A. Photoinactivation of bacteria / A. Minnock, D.I. Vernon // J. Photochem. Photobiol. 1996. - Vol. 32. - P. 159-164.

320. Mlobeli N.T. Physiology and kinetics of Bifidobacterium bifidum during growth on different sugars / N.T. Mlobeli, N.A. Gutierrez, I.S. Maddox // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1998. - Vol. 50, N. 1. - P. 16-17.

321. Mogensen G. Functional aspects of pro- and prebiotics. A literature review on immune modulation and influence on cancer / G. Mogensen, I. Rowland, T. Midtvedt, R. Fonden // Microb. Ecol. Health and Disease. 2000. - Vol. 12, N. 2. - P. 40-44.

322. Moll G.N. Complementary and overlapping selectivity of the two-peptide bacteriocins plantaricin EF and Ж / G.N. Moll, E. Akker, H.H. Hauge et al. // J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. - P. 4848-4852.

323. Morris M. Bacterial vaginosis: a public health review / M. Morris, A. Nicoll // Brit. J. Obstet. and Gynaecol. 2001. - Vol. 108, N. 5. - P. 439-450.

324. Muller-Adolf H. Comparative cytokine inducing pattern of lactic acid bacteria for mucosal vaccine development / H. Muller-Adolf, C. Grangette, D. Goudercourt et al. // Immunol. Lett. 1999. - N. 1. - P.33.

325. Nacajima K. Antihypertensive efect of extract of Lactobacillus casei in patients with hypertension / K. Nacajima, Y. Hata, Y. Osono et al. // J. Clin. Biochem. Nutr.- 1995.-Vol. 18.-P. 181-187.

326. Narushima S. Human intestinal bacteria and bile acid transformacion in gnotobiotic mice / S. Narushima, K. Iton, K. Kuruma, K. Uchida // Microb. Ecol. Health and Disease. 1999. - Vol. 11, N. 2. - P. 122.

327. Nattress F.M. Effects of treatment with lysozyme and nisin on the microflora and sensory properties of commercial pork / F.M. Nattress, L.P. Baker // Intern. J. Food Microbiol. 2003. - Vol. 85, N. 3. - P. 259-267.

328. Navarro L. Bacteriocin production by lactic acid bacteria isolated from Rioja red wines / L. Navarro, M. Zarazaga, J. Sbenz et al. // J. Appl. Microbiol. -2000. Vol. 88, N. 1. - P. 44-51.

329. O'Sullivan D.J. Screening of intestinal microflora for effective probiotic bacteria / D.J. O'Sullivan // J.Agr. and Food Chem. 2001. - Vol. 49, N. 4. -P. 1751-1760.

330. Okada M. The influence of intestinal flora on the healing of intestinal anastomosis in rats / M. Okada, C. Bothin, K. Kanazawa, T. Midtvedt // Microb. Ecol. Health and Disease. 1999. - N. 2. - P. 114.

331. Orrhage K. Bifidobacteria and lactobacilli in human health / K. Orrhage, C.E. Nord // Drugs Exp. and Clin. Res. 2000. - N. 3. - P. 95-111.

332. Ouwehand A. Prebiotics and probiotics: safety aspects and risk assessment / A. Ouwehand, S. Salminen // Microb. Ecol. Health and Disease. 1999. -N. 2.-P. 109.

333. Ouwehand A.C. Adhesion properties to characterize probiotics / A.C. Ouwehand, S. Salminen // Microb. Ecol. Health and Disease. 2000. - Vol. 12, N. 2. -P.113.

334. Oxoid Manual of Culture Media, Ingredients and other Laboratory I I Publ. by Oxoid Lim. 1981. -P. 11.

335. Papagianni M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications / M. Papagianni // Biotechnol. Ad. -2003. Vol. 21, N. 6. - P. 465-499.

336. Patent 0006440.2 USA, С 12 Q lA, G 01 N 21/76. Detecting microbes by bioluminescence / D.A. Stafford. 2000.

337. Patent 5662900 USA, A 01 N 63/00, С 12 N 1/20. Method of increasing interferon production in humans / K. Tsunataro. Filed Dates: 19.06.96. Issued Dates: 02.09.97.

338. Patent 5929109 USA, A 61 К 39/02, A 61 К 45/00. Enhancing and stabilizing agent of the activity of Bifidus factor / M. Hiroharu, I. Kakuhei, K. Tsutomu. Filed Dates: 03.10.97. Issued Dates: 27.07.99.

339. Perdigon G. Lactic acid bacteria and their effect on the immune system / G. Perdigon, R. Fuller, R. Raya // Curr. Issues Intest. Microbiol. 2001. - Vol. 2, N. l.-P. 27^42.

340. Pessi T. Interleukin-10 generation in atopic children following oral Lactobacillus rhamnosus GG / T. Pessi, Y. Sutas, M. Hurme, E. Isolauri // Clin. Exp. Allergy.-2000.-Vol. 30, N. 12.-P. 1804-1808.

341. Rafter J.J. The role of probiotic bacteria in colon prevention / J.J. Rafter // Microb. Ecol. Health and Disease. 1999. - Vol. 11, N. 2. - P. 111.

342. Ribo M.J. Photobacterium phosphoreum Toxicity Bioassay / M.J. Ribo, R.L. Kaizer // Toxic. Asses. Int. Quart. 1987. - Vol. 2. - P. 305-323.

343. Roberfroid M.B. Prebiotics and probiotics: are they functional foods? / M.B. Roberfroid//J. Clin. Nutr. 2000. - Vol. 71, N. 6. - P. 1682-1687.

344. Roediger W.E.W. Interrelationship bitween bacteria and mucosa of the gastrointestinal tract / W.E.W. Roediger // Microbial metabolism in the digestive tract / Ed. M.J. Hill. New York: Academic Press, 1986. - P. 29-32.

345. Rolfe R.D. The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health / R.D. Rolfe // J. Nutrition. 2000. - Vol. 130, Suppl. 2. - P. 396-402.

346. Rowland J. Gut microflora metabolism what can the microbes do? / J. Rowland // Microb. Ecol. Health and Disease. - 1999. - Vol. 11, N. 2. -P. 105-106.

347. Russel A.D. Do biocedes select for antibiotic resistence? / A.D. Russel // J. Pharm. and Pharmacol. 1999. - Vol. 51, Suppl. - P. 29-31.

348. Sablon E. Antimicrobial peptides of lactic acid bacteria: mode of action, genetics and biosynthesis / E. Sablon, B. Contreras, E. Vandamme // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2000. - Vol. 68. - P. 21-60.

349. Salminen S. Gut flora in normal and disorderd states / S. Salminen, E. Isolauri, T. Onnela// Chemother. 1995. - Vol. 41. - P. 5-15.

350. Sanders J.W. Environmental stress responses in Lactococcus lactis / J.W. Sanders, G. Venema, J. Kok // FEMS Microbiol. Rev. 1999. - Vol. 23, N. 4. -P. 483-501.

351. Sarkis G.J. L5 luciferase reporter mycobacteriophages: a sensitive tool for the detection and assay of live mycobacteria / G.J. Sarkis, W.R. Jakobs, G.F. Hatfull // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 15, N. 6. - P. 1059-1067.

352. Savada H. Purification and characterizacion of an antihypertensive compound from Lactobacillus casei / H. Savada, M. Furushiro, K. Hirai et al. // Agric. Biol. Chem. 1990. - Vol. 54. - P. 3211-3216.

353. Savage D.C. Microorganisms associated with epithelial surfaces and stability of the indigenous gastrointestinal microflora / D.C. Savage // Nahrung. -1987. Vol. 31, N. 5-6. - P. 383-394.

354. Scheunemann C. F. HtrA is a key factor in the response to specific stress conditions in Lactococcus lactis / C.F. Scheunemann, I. Poquet // FEMS Microbiol. Lett. 2003. - Vol. 224, N. 1. - P. 53-59.

355. Schrezenmair J. Probiotics, prebiotics, synbiotics approaching a definition / J. Schrezenmair, M. De Verse // Am. J. Clin. Nutr. 2001. - N. 73. -P. 361-364.

356. Scudra L. Studies on whey fermentation using lactic acid bacteria L. acidophilus and L. bulgaricus / L. Scudra, A. Blija // Acta Biotechnol. 1998. -Vol. 18, N. 3.-P. 277-288.

357. Senthuran A. Lactic acid production by immobilized Lactobacillus casei in recycle batch reactor: A step towards optimization / A. Senthuran, V. Senthuran // J. Biotechnol. 1999. - Vol. 73, N. 1. - P. 61-70.

358. Shalev E. Ingestion of probiotics: optimal treatment of bacterial vaginosis in pregnancy / E. Shalev // IMAJ. 2002. - N. 4. - P. 357-360.

359. Signe K. A study on growth characteristics and nutrient consumption of Lactobacillus plantarum in A-stat culture / K. Signe, L. Tiiu-Maie, P. Tarvo, P. Toomas // Antonie van Leeuwenhoek. 1999. - N. 75 - P. 309-320.

360. Simon G.L. Intestinal flora in health and disease / G.L. Simon, S.L. Golbach // Gastroenterol. 1984. - Vol. 86. - P. 358-364.

361. Smith D.L. Animal antibiotic use has an early but important impact on the emergence of antibiotic resistance in human commensal bacteria / D.L. Smith, A.D. Harris, J.A. Jonson et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99, N. 9. -P. 6434-6439.

362. Steinberg S.M. A review of environmental application of bioluminescence measurements / S.M. Steinberg, L.G. Poziomek, W.H. Engelmann // Chemosphere. 1995. - Vol. 30. - P. 2155-2197.

363. Sutter V.L. Anaerobes as normal oral flora / V.L. Sutter // Rev. Infect. Dis.-1984.-Vol. 6, Suppl. l.-P. 16-24.

364. Tagg J.R. Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria / J.R. Tagg, A.S. Dajani, L.W. Wannamaker // Bacteriol. Rev. 1976. - Vol. 40, N. 3. - P. 722-756.

365. Tannock G.W. The normal microflora: new concepts in health promotion / G.W. Tannock//Microbiol. Sci. 1988. -N. l.-P. 663-673.

366. Taranto M.P. Evidence for hypocholesterolemic effect of Lactobacillus reuteri in hypercholesterolemic mice / M.P. Taranto, M. Medici, G. Perdigon et al. // J. Dairy Science. 1998. - Vol. 81, N. 9. - P. 2336-2340.

367. Thompson M.H. Metabolism of neutral steroides / M.H. Thompson // Microbial metabolism in the digestive tract / Ed. M.J. Hill. New York: Academic Press, 1996.-P. 33-35.

368. Todorov S. Influence of growth medium on bacteriocin production in Lactobacillus plantarum ST31 / S. Todorov, B. Gotcheva, X. Dousset et al. // Biotechnol. and Biotechnol. Equip. 2000. - Vol. 14, N 1. - P. 50-55. .

369. Turner D.L. Solution structure of plantaricin C, a novel lantibiotic / D.L. Turner, L. Brennan, H.E. Meyer et al. // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol. 3. -P. 833-839.

370. Twomey D.P. Protection against Staphylococcus aureus mastitis in dairy cows using a bismuth-based teat seal containing the bacteriocin, lacticin 3147 / D.P. Twomey, A.I. Wheelock, J. Flynn et al. // Dairy Sci. 2000. - Vol. 83, N. 9. - P. 1981-1988.

371. Uguen P. Lantibiotic biosynthesis: interactions between prelacticin 481 and its putative modification enzyme / P. Uguen, J.P. Le Pennec, A. Dufour // J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182, N. 18. - P. 5262-5266.

372. Ulitzur S. Established technologies and new approaches in applying luminous bacteria for analytical purposes / S. Ulitzur// J. of Bioluminescence and Chemiluminescence. -1997. Vol. 12, N. 4. - P. 179-192.

373. Vallino J.J. Modeling bacterial utilization of dissolved organic matter: Optimization replaces Monod growth Kinetics / J.J. Vallino, C.S. Hopkinson, J.E. Hoblie // Limnol. Oceanogr. 1996. - Vol. 41, N. 8. - P. 1591-1609.

374. Van der Voorde L. In vitro appraisal of the probiotic value of intestinal lactobacilli / L. Van der Voorde, H. Christiaens, W. Verstraete // World. J. Microbiol. Biotechnol. 1991. - Vol. 7, N. 6. - P. 587-592.

375. Van der Waaij D. Colonisation resistanse of the digestive tract: mechanism and clinical consequences / D. Van der Waaij // Nahrung. 1987. -Vol. 31, N. 5-6.-P. 507-517.

376. Van der Waaij D. The immunoregulation of the intestinal flora: experimentl investigations on the developement and composicion of the microflora in normal and thymusless mice / D. Van der Waaij // Microbiol. Therapy. 1984. -Vol. 14.-P. 63-74.

377. Van Kraaij C. Lantibiotics: biosintesis, mode of action and applicacions / C. Van Kraaij, M. De Vos Willem, R.J. Siezen, O.P. Kuipers // Naur. Prod. Repts. -1999. Vol. 16, N. 5. - P. 575-587.

378. Veld J.H. Health aspects of probiotics / J.H. Veld, M.A.R. Bosschaert, C. Shortt // Food Sci. Technol. Today. 1998 - Vol.12, N. 1 - P. 46-50.

379. Vidaver A.K. Bacteriocins: the lure and reality / A.K. Vidaver // Plant Dis. 1983. - Vol. 67, N. 5. - P. 471-475.

380. Waters R. Lactobacillus reuteri and intestinal integrity / R. Waters, N. Carbajal, I. Casas // Microb. Ecol. Health and Disease. 1999. - Vol. 11, N. 2. -P. 126-127.

381. Wouters J.A. The role of cold-shock proteins in low- temperature adaptation of food-related bacteria / J. A. Wouters, F.M. Rombouts, O.P. Kuipers et al. // Syst. And Appl. Microbiol. 2000. - Vol. 23, N. 2. - P. 165-173.

382. Zlotta A.R. Biological response modifiers for the treatment of superficial bladder tumors / A.R. Zlotta, C.C. Schulman // Eur. Urol. 2000. - Vol. 37, N. 3. - P. 10-15.

Информация о работе

Несчисляев, Валерий Александрович
доктора медицинских наук
Пермь, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Пробиотики: микробиологические и технологические аспекты получения, контроля и конструирования препаратов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы