Диссертации » Биологические науки » Биотехнология

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Технология производства пробиотика КД-5 и его использование в свиноводстве
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Технология производства пробиотика КД-5 и его использование в свиноводстве"

На правах рукописи

СМИРНОВА Екатерина Александровна

Технология производства пробиотика КД-5 и его использование в свиноводстве

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003462169

Москва-2009

003462169

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Грязнева Татьяна Николаевна.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Субботин Владимир Викторович; доктор биологических наук, профессор Павлова Инна Борисовна.

Ведущая организация - ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии».

Защита диссертации состоится « Л иидЖ/пс&ШУт. в «/6» часов на заседании диссертационного совета Д.¿20.042.01 в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23. тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Автореферат разослан «-^ » 7бс-^&ил 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Желудочно-кишечные болезни поросят различной этиологии по частоте, массовости и величине наносимого экономического ущерба занимают одно из первых мест в нозологическом профиле болезней свиней. Широко применяемые для лечения поросят антибиотики, наряду с антимикробным действием, вызывают побочные эффекты: возникновение антибиотикорезистентости у патогенных бактерий, дисбактериозы, аллергии-ческие реакции и др. (Панин Н.А., Малик Н.И., 2003).

В последние годы все большее значение в качестве альтернативы антибиотиков приобретают пробиотические препараты, применение которых в свиноводстве является принципиальным решением проблемы получения экологически чистых продуктов питания (Сидоров М.А., Субботин В.В., 2000).

При производстве пробиотиков в их состав включается биомасса живых, антагонистически активных микроорганизмов, а продукты микробного синтеза (ферменты и бактериоцины) не используются, т.к. процесс их выделения и концентрирования является технологически сложным.

Однако утилизация биологически активных продуктов метаболизма пробиотических культур бактерий является, на наш взгляд, нерациональным расходованием биологических ресурсов.

Поэтому, разработка пробиотиков на основе полезных бактерий и продуктов их микробного синтеза, а также оценка эффективности подобных средств при желудочно-кишечных болезнях поросят является актуальной задачей.

Цель исследований - разработка технологии производства пробиотика КД-5 и его применение при откорме поросят-отъемышей.

Для решения были поставлены следующие задачи:

1. Изыскать компоненты, перспективные для включения в состав пробиотика для поросят - отъемышей.

2. Определить биологическую активность культур штаммов В.БиЫШэ ТПИ 13 и В.НсЬешАэгпт ТПИ 11 и их метаболитов в различных соотношениях т

vitro и in vivo.

3. Разработать технологию производства гтробиотика КД-5 на основе бацилл и продуктов их микробного синтеза.

4. Оценить воздействие пробиотика КД-5 на показатели гомеостаза организма поросят-отъемышей.

5. Определить эффективность применения пробиотика КД-5 при желудочно-кишечных болезнях поросят-отъемышей.

6. Разработать нормативную документацию на пробиотик КД-5 для регистрации его на территории РФ.

Научная новизна. Впервые, на основе культур штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11, а также их продуктов микробного синтеза, сконструирован пробиотик КД-5 для применения в свиноводстве.

Культуры штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 обладают высокой ферментативной активностью и продуцируют бактериоцины, обуславливающие антагонистическое действие в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, вызывающих желудочно-кишечные болезни у поросят-отъемышей.

Установлено, что в процессе культивирования B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 в смеси с энтеротоксигенными микроорганизмами образуется нано-липосомальный комплекс бактериоцинов, ферментов и энтеротокси-нов (КФБЭ), представляющий собой смесь пептидогликанов и липополисаха-ридов. Комплекс КФБЭ адсорбируется на клеточной стенке патогенных микроорганизмов, препятствуя пассивной диффузии и активному транспорту питательных веществ, а также способствует проникновению бактериоцинов и ферментов бацилл внутрь энтеротоксигенных бактерий, что приводит к их гибели.

Показано, что пробиотик КД-5, содержащий в своем составе биомассу B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11, а также их метаболиты в соотно-ении 1:1, обладает уникальными биологическими свойствами, отличающими его от других пробиотиков: подавление размножения сальмонелл, кандид, стафилококков и стимуляция роста лактобацилл и бифидобактерий in vitro и в

4

желудочно-кишечном тракте поросят-отьемышей.

Разработана технология производства пробиотика КД-5 с использованием контактно-сорбционного метода высушивания биомасссы бащиш и продуктов их микробного синтеза на пшеничных отрубях. Срок хранения препарата составляет не менее 18 месяцев.

Показана высокая (90 - 100%) лечебно-профилактическая эффективность пробиотика КД-5 при гастроэнтеритах поросят-отьемышей.

Выявлено положительное влияние пробиотика на переваримость и эффективность использования организмом поросят-отьемышей питательных веществ комбикорма на гематологические, биохимические и иммунологические показатели крови животных. Приросты живой массы поросят-отьемышей возрастают на 40%.

Практическая значимость. На базе ООО «НПК ЦМВЭИ» (г. Пущино) создана технологическая линия и организовано серийное производство пробиотика КД-5. Получено 3 серии препарата, отвечающие требованиям СТО.

Разработан проект нормативной документации на КД-5 (регламент производства, инструкция по применению, методы контроля качества).

Утверждены в установленном порядке два отчета по испытанию безопасности и антимикробной активности КД-5 и производственных испытаний препарата в условиях свиноводческих хозяйств.

В соответствии с порядком регистрации ветеринарных препаратов в РФ, нормативная документация, отчеты об испытаниях КД-5 и 3 серии препарата направлены на экспертизу в лабораторию пробиотиков ФГУ ВГНКИ.

В опытах на поросятах-отьемышах, принадлежащих С ПК «Новое Литви-ново» и ЗАО «Медвежьи озера» Щелковского района Московской области, изучен механизм действия пробиотика КД-5; дана оценка влияния биологически активных веществ, синтезируемых В.зиЫШв ТПИ 13 и В.НсЬешйэгт1з ТПИ 11, на микробиоценоз кишечника, обменные и иммунные процессы организма животных; показана высокая лечебно-профилактическая и экономическая эффективность препарата, при использовании в свиноводстве. Полученные данные подтверждены актами, утвержденными руководителями хо-

5

зяйств.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО МГАВМиБ при изучении студентами и слушателями ФПК дисциплин «Ветеринарная микробиология», «Микробиология и иммунология», «Биотехнология».

Личный вклад соискателя. Автору принадлежит непосредственное осуществление исследований по разработке параметров и режимов получения биомассы культур штаммов B.subtílis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11, кон-тактно-сорбционного высушивания пробиотика КД-5, определение безвредности препарата на лабораторных животных, испытание лечебно-профилактической эффективности КД-5 в свиноводческих хозяйствах, анализ и теоретическое обобщение полученных данных, разработка нормативной документации на препарат.

В работе использованы материалы, полученные лично автором. Штаммы B.subtílis ТПИ 13-07.06.21-ДЕП/ВГНКИ и B.licheniformis ТПИ 11-07.06.22-ДЕП/ ВГНКИ были предоставлены автором штаммов Грязневой Т.Н.

Апробирование результатов. Основные результаты диссертационной работы изложены в 2 отчетах НИР, 3 печатных работах и были доложены: на международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 2007); на 9-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2007»; на Международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (Щелково, 2008), на V съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2008).

Материалы диссертации представлены на соискание премии Президента РФ в области науки и инноваций для молодых ученых (2008).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 3 статьи, в т.ч. 1 в научном журнале, рекомендованном ВАК, 2 - в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертационной работы. Материалы диссертации изложены на 192 страницах машинописного текста и включают введение, об-

6

зор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (201 источник, из которых 140 отечественных и 61 иностранных авторов). Работа содержит 23 таблицы, 58 рисунков, 28 страниц приложений.

Основные положения п результаты, выносимые на защиту;

1. Применение в составе пробиотика КД-5 В. subtilis ТЛИ 13 и B.licheniforis ТПИ 11 и продуктов их микробного синтеза.

2. Технология приготовления пробиотика КД-5.

3. Результаты изучения лечебно-профилактической эффективности КД-5 при желудочно-кишечных болезнях поросят-отъемышей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2005 по 2008 год на кафедрах микробиологии и биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ, на базе НПК «Центр медико-ветеринарных экологических исследований» (г. Пущино) и в НИИ биоцидов и нанобиотехнологии (г. Москва). Эксперименты на поросятах-отъемышах проводили на свинокомплексах СПК «Новое Литвиново» и ЗАО «Медвежьи озера» Щелковского района Московской области.

Для приготовления КД-5 использовали штаммы В. subtilis ТПИ 13-07.06.21-ДЕП/ВГНКИ и B.licheniformis ТПИ 11-07.06.22-ДЕП/ВГНКИ.

Для определения антагонистической активности бактерий-компонентов КД-5 были использованы тест-штаммы E.coli 1257, S.sonnei 5063, S.typhimu-ium 55, S.aureus 209, C.albicans 690, L.fermentum Ф-36 и B.globosum БФ-4, a также культуры патогенных бактерий E.coli К88 и S.aureus Н.

В опытах по изучению безвредности и лечебно-профилактической эффективности КД-5 были использованы 60 белых мышей массой 18-20 г и 80 поро-сят-огьемышей крупной белой породы в возрасте 35-40 дней.

В процессе работы было отобрано и исследовано 150 проб фекалий и 40 проб крови поросят-отъемышей, 70 проб фекалий белых мышей.

Электронно-микроскопическое исследование антагонистического действия

бацилл-компонентов КД-5 на патогенные и непатогенные бактерии проводили с помощью электронного микроскопа «J 100В».

Культивировали бациллы в производственных условиях в биореакторах БИОР-0,1. Культуры разбавляли стерильной бидистиллированной водой, смешивали в соотношении 1:1 в гомогенизаторе Braun. Высушивали КД-5 контактно-сорбционным методом в сушильной установке с кипящим слоем ЭВЗ, используя в качестве сорбента пшеничные отруби по ГОСТ 7169-66.

Лечебно-профилактическую эффективность КД-5 оценивали в контролируемых опытах на поросятах-отьемышах. Учитывали данные клинического обследования животных, изучения в динамике микробного пейзажа кишечника, биохимических, гематологических и иммунологических показателей крови, а также определяли экономические показатели.

Экспериментальные данные обрабатывали статистически с использованием компьютерной программы «Statistica 6,0» и анализом результатов по Ашмарину И.П. и Воробьеву A.A. (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изыскание компонентов, перспективных для включения в состав пробнотнка для поросят-отъемышей

Сравнительная характеристика биологической активности культур штаммов B.subtilis ТПИ 13 н B.Iicheniformis ТПИ 11. Дня изучения биологической активности культур изучаемых бацилл в сравнительном аспекте определяли их ферментативную и антагонистическую активность в отношении тест-штаммов бактерий и проводили электронно-микроскопический анализ бактерицидного действия бацилл (табл. 1).

Таблица 1. Антагонистическая активность изучаемых бацилл в отношении тест-штаммов бактерий

Количество бацилл, млрд. м.к./мл Зона торможения роста тест-штаммов, мм

B.subtilis ТПИ 13 B.Iicheniformis ТПИ 11 S. sonnei 5063 S. typhimu-rium 55 S. aureus 209 С. albicans 690

10±2 10±2 18±2 16±1 20±2 28±2

Культуры изучаемых бацилл обладали высокой антагонистической активностью в отношении патогенных тест-штаммов грамположительных и гра-

8

мотрицательных бактерий.

При культивировании смешанной культуры бацилл с энтеротоксигенными эшерихиями, было установлено, что бактериоцины и ферменты бацилл, а также токсины эшерихий образуют нано-липосомальный комплекс (КФБЭ), который адсорбируется на поверхности патогенных эшерихий, в результате чего продукты метаболизма В.эиЫШэ ТПИ 13 и В.НсЬетАэггшэ ТПИ 11 проникают внутрь эшерихий и лизируют их (рис.1).

Рис. 1. Адсорбция комплекса КФБЭ на поверхности энтеропатогенной Е.соН, ><26000

В контрольной пробе, в отсутствие бацилл комплекс КФБЭ не образовывался и патогенные Е.соН размножались и вырабатывали токсины. При культивировании непатогенной Е.соН в смешанной культуре с бациллами, комплекс КФБЭ также не образовывался, лизиса бактерий не наблюдалось.

При культивировании изучаемых бацилл в смешанной культуре с Ьлегтепшгп Ф-36 и В^оЬозит БФ-4 на плотных питательных средах, вокруг зоны роста бацилл наблюдался вторичный рост лакто- и бифидобактерий в виде валика, что характеризует синергидное действие бактерий-компонентов КД-5 в отношении полезной микрофлоры.

Полученные данные свидетельствуют о том, что В^иЫШэ ТПИ 13 и В.Н-сЬетйнттпз ТПИ 11 являются перспективными для включения в состав нового пробиотика, т.к. обладают широким спектром антимикробной активности и проявляют синергидное действие в отношении лакто- и бифидобактерий.

Изыскание адсорбентов для контактно-сорбциоииого высушивания пробиотика. Пробиотик для поросят должен обладать не только антимикробной активностью, но и способствовать перевариванию корма, а также размножению полезных бактерий в пищеварительном тракте. Поэтому, в качестве еще одного компонента КД-5 были выбраны пшеничные отруби. Кроме того, пшеничные отруби обладают важными технологическими свойствами: длительно хранятся, имеют сыпучую консистенцию, обладают адсорбирующими свойствами, стандартны по составу.

Таким образом, в состав нового пробиотика КД-5 были включены 2 штамма бацилл - В. зиЫШэ ТПИ 13 и В. НсЬешй>гпш ТПИ И и их метаболиты, а также отруби пшеничные как наполнитель и адсорбент биомассы и продуктов микробного синтеза бацилл.

Технология приготовления пробиотика КД-5

Приготовление опытных серий КД-5. При конструировании пробиотика на основе культур В. эиЫШэ ТПИ 13 и В. НсЬешйэпшз ТПИ 11 и продуктов микробного синтеза, подбирали их оптимальное соотношение, в качестве критерия используя антагонистическую активность (табл. 2).

Таблица 2. Антагонистическая активность различных вариантов комбинирования изучаемых бацилл и их метаболитов

Концентрация бацилл, Концентрац. белка в Зона торможения роста тест-штаммов,

млрд. м.к./мл КЖ бацилл мкг/мл мм

В^иМ-Нв В.НсЬетГог- В.БиЫШз В.НсЬет£Ьг- Е.соН 8ДурЫ Б.аиге- С.а!Ысапб

ТТШ 13 пш ТПИ 11 ТПИ 13 пизТПИИ К88 тлит 55 1^209 690

1 2 з 4 5 6 7 8

0,6 9,4 2б2±117 1817±119 0 0 6±2 10±2

1,3 8,2 467±116 174Ш21 21 0 6±2 12±2

1,5 6,9 680±119 1693±119 5±2 2±1 9±1 11±4

2,1 6,0 915±118 1585±120 9±1 5±2 15±2 13±2

1 2 3 4 5 6 7 8

3,2 3,9 1394±127 134Ш21 11±1 11=4=1 19±4 15±1

5,0 5,0 147&Ш8 12541120 14±2 13±2 26*2 18±2

6,2 1,8 1500±119 915±119 12±2 12±1 24±2 16±2

6,7 2,0 1719±П8 662±120 13±1 11±2 22±2 15±4

8,4 0,5 1859±117 316±21 10±1 12±1 21±2 11±4

Примечание: КЖ - культуралькая жидкость, содержащая продукты микробного синтеза бацилл

Наиболее высокой антагонистической активностью обладал вариант комбинирования бацилл и их метаболитов в соотношении 1:1. Концентрация бацилл коррелировала с количеством вырабатываемых ими продуктов метаболизма, что является важным показателем, характеризующим стандартность препарата.

Перед высушиванием биомассы бацилл и их метаболитов при производстве опытных партий КД-5, концентрацию бацилл в 1 мл суспензии доводили до 500 млн. м.к. В одной емкости смешивали суспензию бацилл с метаболитами и пшеничные отруби из расчета на 1 л суспензии 1 кг отрубей. Полученную массу высушивали в термостате при 37°С в течение 7сут., ежедневно перемешивая, затем определяли концентрацию жизнеспособных бацилл.

Было установлено, что после высушивания концентрация изучаемых бацилл увеличилась в 3 раза и составила 1,5 млрд. м.к. в 1 г КД-5. При этом из препарата не было выделено посторонней микрофлоры. Спорообразование бацилл составляло 84,3 %.

Таким образом, были изготовлены 4 опытные серии КД-5 для определения антимикробной активности и безвредности препарата in vivo и in vitro.

Определение антимикробной активности а безвредности опытных серий КД-S. При культивировании тест-штаммов бактерий в смеси с КД-5 в МПБ через 12 ч наблюдалось снижение концентрации S.typhimurium и E.coli с 108 м.к. до 104 м.к, C.albicans - до 103 м.к, a S.aureus - до 102 м.к. Через 18 ч культивирования ни один тест-штамм из среды с КД-5 не был выделен.

Для определения безвредности пробиотика мышам опытной группы в течение 30 дней скармливали КД-5. Никакого другого корма мыши опытной группы не получали. Мышей контрольной группы кормили кормом для грызунов.

После постановки опыта у мышей, получавших КД-5, количество условно-

11

патогенных бактерий уменьшилось в 3 раза, а количество лакто- и бифидо-бактерий возросло в 2 раза. Патологических изменений состояния животных опытной группы не наблюдалось.

Из кишечника мышей контрольной группы после постановки опыта выделяли повышенное в 2 раза количество условно-патогенных бактерий и пониженное количество лакто- и бифидобактерий.

Таким образом, пробиотик КД-5 обладает антимикробной активностью в отношении энтеропатогенных грамположительных и грамотрицательных бактерий и синергидным действием в отношении полезной микрофлоры как in vivo, так и in vitro. Приготовленные экспериментальные серии КД-5 были аналогичны по технологическим показателям и биологической активности, а разработанная технология приготовления опытных серий КД-5 была воспроизводимой.

Технология промышленного производства пробиотика КД-5

На базе ООО Научно-производственная компания «Центр медико-ветеринарных экологических исследований» была создана автоматизированная линия по производству пробиотика КД-5.

Исходя из опыта производства пробиотика Биод-5, а также имеющегося на предприятии оборудования, в автоматизированную линию были включены:

- бутыли объемом 20 дм3, для приготовления посевного материал на плотной среде Гисса;

- биореактор КМ-0,1, для приготовления посевного материала в жидких средах;

- биореакторы марки «БИОР-0,1» (РФ, г. Кириши);

- гомогенизатор для приготовления смеси бацилл (Braun, Германия);

- сушильная установка ЭВЗ- 01 ПН 0,003-0,03НК-0,1 с кипящим слоем для контактно-сорбционного высушивания КД-5 (НПО НИИХИММАШ).

Технология промышленного производства биомассы бацилл и продуктов их метаболизма представлена на рисунке 2.

Рис. 2. Технологическая схема получения биомассы бацилл и продуктов микробного синтеза при производстве пробиотика КД-5

Посевной материал выращивали на среде Гисса в бутылях объемом 20 дм3 при температуре (37±1)°С в течение 5-7 суток. Ежедневно определяли гетерогенность роста и уровень спорообразования. Посевная доза живых бацилл составила не менее 1,0 млн. м.к/см3.

Затем суспензии бацилл переносили в биореактор КМ-0,1, используя для культивирования среды ПС-№4 для В. виЫШя ТПИ 13 и ПС-№7 для В. НсИеш-йэптш ТПИ 11, разработанные профессором Грязневой Т.Н.

Принятые для КМ-0,1 параметры культивирования (коэффициент аэрации - 0,7 дм3/мин, продолжительность культивирования 24 ч для В. виЫШз ТПИ 13; 0,4 дм3/мин и 28 ч для В. НсЬетйэттз ТПИ 11, соответственно, а также число оборотов мешалки - 500 об/мин) были достаточными для обеспечения полноценного роста и спорообразования бацилл.

Приготовленные посевные культуры имели следующие показатели: общая концентрация бацилл не менее 15 млрд/см3; биологическая - не менее 10 млрд/см3; содержание зрелых спор - не менее 80 %.

Посевной материал вносили в биореактор из расчета 1 млн. м. к. на 1,0 см3 питательной среды.

Культивирование бацилл проводили в биореакторах БИОР - 0,1 (рис. 3).

13

Рис. 3. Цех культивирования бактерий-компонентов яробиотвка КД-5 в НПК «Центр медико-ветеринарных экологических исследований»

Параметры и режимы глубинного культивирования бацилл представлены в табл. 3.

Таблица 3. Параметры н режимы глубинного культивирования

бацилл

Параметры и режимы В.зиЬйНз В.НсЬегшйзгпш

ТПИ 13 ТПИ 11

Тип биореактора БИОР-0,1 БИОР-0,1

ПС №4 №7

Коэффициент заполнения биореактора 0,6 0,6

Температура, °С 37±1 37±1

Давление, МПа 0,10±0,05 0,10+0,05

Коэффициент аэрации, дм /мин 0,7±0,1 0,4+0,1

Частота вращения мешалки, об/мин 530 320

Продолжительность культивирования, ч Пеногаситель Э-1, дм3 24 28

0,8 0,5

Характеристика культур бацилл, полученных при выращивании в биореакторах «БИОР-0,1», представлена в табл. 4.

Таблица 4. Характеристика культур бацилл, полученных при культивировании в биореакторах

Микроорганизм Кол-во серий культур Продолжительность культивирования, ч Характеристика культур

рН БК, млрд. м.к/см3 Спорообразование, % Концентрация белка, мкг/мл

В.БиЫШв ТПИ13 3 24 6,2±0,2 5,2±1,3 7Ш0 1426±143

В.НсИешй) пшзТПИ 11 3 28 6,4±0,4 5,3±2,1 66±5 1395±127

Примечание: БК - биологическая концентрация бацилл.

Из материалов таблицы следует, что процесс культивирования бацилл в биореакторах завершился высокими уровнями накопления биомассы, в составе которой зрелые споры составляют около 70 %. Полученные 3 серки культур бацилл были стандартны по концентрации бацилл, белковым компонентам и антагонистической активности.

Технологическая схема получения конечной стадии пробиотика КД-5 представлена на рисунке 4,

Рис. 4. Конечные стадзн производства пробиотика КД-5

Конечный этап приготовления препарата состоял из следующих стадий: разбавления КЖ стерильной бндистиллированной водой, до концентрации не менее 1,5 млрд. м.к./см3; приготовление смеси КЖ в соотношении 1:1 в гомо-

15

генизаторе при частоте вращения мешалки 1000 об/мин; взвешивание пшеничных отрубей; смешивание пшеничных отрубей со смесью КЖ в гомогенизаторе; высушивание полученной смеси контактно-сорбционным методом в сушильной установке с кипящим слоем в течении 6 часов (3 часа при 40°С и 3 часа - при 60°С) до влажности 5%; фасовка КД-5 в пакеты из полимерных материалов по 50 г.; этикетирование готовой лекарственной формы.

Разработанная технология промышленного производства КД-5 была воспроизводимой на всех стадиях технологического процесса. Рассчитанный срок хранения КД-5 составил не менее 18 месяцев.

Технологические параметры культивирования В. БиЫШэ ТПИ 13 и В. НсЬе-шГоггтБ ТПИ 11 и требования к получаемым культурам бацилл были включены в регламент производства КД-5.

Контроль качества пробаотнка КД-5

Пробиотик КД-5 представляет собой микробную массу В.виЫШв ТПИ 13 и В.НсЬешйэптиз ТПИ 11 и их метаболитов в соотношении 1:1, адсорбированных на пшеничных отрубях, (табл. 5).

Таблица 5. Физико-химические и биологические показатели КД-5

Показатель Характеристика

Внешний вид Сухая аморфная масса в виде хлопьев и гранул бежевого или серого цвета, размером 3,0±1,5мм

Количество жизнеспособных бацилл в 1 см3, клеток (1,5 ± 0,2) х 10®

Спорообразование,% 85±2

Массовая доля влаги, % 5±1

Контаминация ПМФ, количество микробных клеток в поле зрения микроскопа Допускается не более 3 бактерий-сапрофитов. Не допускается наличие патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов

РН 7,0 ±0,1

Безвредность В тесте на белых мышах безвреден

Антагонистическая активность к тест-культурам Препарат должен давать зоны угнетения тест-штаммов не менее чем (мм): S.aureus 209 - 22±2, S.typhimurium 55 -12±2, C.albicans 690 - 26±2, E.coli К88 -15±2.

Методы контроля качества КД-5 были включены в СТО на препарат.

Оценка лечебно-профплактпческой эффективности пробиотика КД-5 при желудочно-кишечных болезнях поросят-отъемышей

Лечебно-профилактическую эффективность КД-5 оценивали на поросятах-отьемышах, которых разделили на 4 группы: 2 опытные и 2 контрольные по 20 голов в каждой.

-1 опытная группа (здоровые) - пробиотик давали с кормом 1 раз в день в течение 7 дней в дозе 5 г (7,5 млрд. м.к. на 1 поросенка);

- I контрольная группа - с профилактической целью скармливали кормовой антибиотик биовит-80 по общепринятой в хозяйстве схеме.

- II опытная группа (больные гастроэнтеритом) - КД-5 давали с кормом в дозе 7,5 г. в течение 10 дней (11,25 млрд. м.к. на 1 поросенка).

- II контрольная группа - внутримышечно вводили дизпаркол (1 мл на 10 кг веса), биовит-80 с кормом в дозе 4 гр. на 1 поросенка в течение 10 дней.

ВI опытной группе на 2 сутки с начала постановки опыта заболело 2 поросенка. Болезнь проявлялась расстройством пищеварения, сопровождалась диареей и длилась 5 дней. Все поросята выздоровели. В I контрольной группе на 2 сутки признаки гастроэнтерита наблюдали у 6 животных, на 3 сутки - у 7 поросят, 2 поросенка пали.

Профилактическая эффективность КД-5 при гастроэнтеритах поросят составила 90%.

Поросята II опытной группы выздоравливали на 4 день с начала постановки опыта. Во II контрольной группе 25% поросят пали.

Терапевтическая эффективность КД-5 составила 100%.

Влияние изучаемых бацилл в составе пробиотика КД-5 на микрофлору кишечника поросят-отъемышей

У поросят I опытной группы к 3 дню исследований наблюдалось исчезновение из желудочно-кишечного тракта Р.vulgaris, K.pneumonia, Staphylococcus, Enterococcus и увеличение концентрации бифвдо- и лактобактерий.

У поросят-отъемышей II опытной группы на 6 день с момента постановки опыта отмечалось снижение концентрации патогенных бактерий до 103 м.к./г. и увеличение содержания бифндо- и лактобактерий до Ю10 м.к. в 1 г фекалий.

17

От поросят контрольных групп во все дни исследований выделяли условно-патогенные бактерии в концентрациях 10х - 109 м.к./г., на фоне дефицита лакто- и бифидобактерий.

При заражении мышей выделенными культурами бактерий, животные пали на 2-3 сутки. При вскрытии мышей выделяли исходные микроорганизмы.

Таким образом, причиной гастроэнтерита у поросят-отьемышей явилась ассоциация условно-патогенных микроорганизмов, обладающих выраженной патогенностью для белых мышей. При использовании КД-5 с профилактической и лечебной целью микробный пейзаж кишечника поросят нормализовался на 3 сутки с начала постановки опыта, из кишечного содержимого исчезали патогенные бактерии, повышалась концентрация лакто- и бифидобактерий.

Оценка влияния пробпотика КД-5 на показатели периферической крови поросят-отьемышей

После постановки опыта у поросят опытных групп, количественный и качественный состав форменных элементов крови был стабильным и соответствовал физиологической норме.

У животных контрольных групп имела место эозинопения, число нейтро-филов увеличивалось в 2 раза и было выше, чем у поросят опытных групп, что свидетельствует о развитии воспалительного процесса в организме животных.

Препарат КД-5 стимулировал гуморальный иммунитет у поросят опытных групп. Уровень в сыворотке крови животных на 7 и 14 дни исследований был выше на 5%, в сравнении с контролем. Уровень иммуноглобулина класса М у больных животных всех групп был достоверно выше, чем у здоровых. К 14 дню эксперимента уровень иммуноглобулина класса М у поросят II опытной группы снижался до нормы.

После постановки опыта у поросят опытных групп наблюдалось повышение общего белка, а концентрация альбуминов и фосфора снижалась до физиологической нормы. У поросят контрольных групп эти показатели практически не изменялись.

При использовании пробиотика КД-5 без дополнительной дачи поросятам кальциевой подкормки, уровень кальция у поросят опытных групп повысился

18

и составил нижнюю границу нормы. В тоже время, у поросят контрольных групп уровень содержания кальция в сыворотке крови был ниже нормы.

Таким образом, КД-5 безвреден для поросят, не вызывает аллергических реакций и способствует нормализации гематологических, иммунологических и биохимических показателей периферической крови животных.

Экономические показатели применения КД-5 при откорме иоросят-отьемышей

При использовании пробиотика КД-5 для откармливаемых свиней опытных групп был получен дополнительный прирост живой массы 9,2 кг в среднем на 1 голову, реализационная стоимость которого составила 1104 рубля. Превышение реализационной стоимости дополнительного прироста живой массы над разницей в стоимости кормов составило 4124,76 и 3475,8 рублей на 1 голову по I и II опытным группам поросят, соответственно.

Использование пробиотика КД-5 в составе полнорационных комбикормов обеспечило экономический эффект в расчете на 1 голову, в среднем 1000,0 руб., за счет дополнительно полученного прироста

Себестоимость 1 кг прироста живой массы у поросят опытных групп была ниже на 18,8%, в сравнении с контрольными животными. Прибыль от реализации свинины в I опытной группе была выше на 40 %, во II - на 70% выше, чем в контроле. Экономическая эффективность применения КД-5 на рубль затрат составила 45,4 руб.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый пробиотик КД-5, представляющий собой высушенную контактно-сорбционным способом на пшеничных отрубях биомассу B.subtilis ТПИ 13 и B.iicheniformis ТПИ 11 и их метаболитов в соотношении 1:1, при содержании в 1 г препарата 1,5 млрд. микробных клеток бацилл со сроком хранения не менее 18 месяцев.

2. Параметры культивирования культур B.subtilis ТПИ 13 и B.iicheniformis ТПИ 11 с использованием биореакторов БИОР - 0,1, коэффициенте аэрации -0,7 дм3/мнн, продолжительность культивирования 24 ч для В. subtilis ТПИ 13

19

и 0,4 дм3/мин и 28 ч - для В. НсЬешйэтнз ТПИ 11, соответственно, были достаточными для обеспечения полноценного роста и спорообразования бацилл, а также микробного синтеза бактериоцинов и ферментов.

3. При контактно-сорбционном методе высушивания КД-5 с использованием сушильной установки с кипящим слоем ЭВЗ и пшеничных отрубей в качестве сорбента, биомасса бацилл и продукты их метаболизма обезвоживаются при температуре 40-60°С в течение 6 часов без повреждения биокомпонентов, при влажности конечного продукта 5 %. Полученные 3 серии препарата были стандартны по составу и биологической активности и соответствовали требованиям СТО.

4. При культивировании В.зцЫШб ТПИ 13 и В.НсЬеш&пшз ТПИ 11 в смеси с энтеротоксигенными эшерихиями, образуется нано-липосомальный комплекс бактериоцинов, ферментов и энтеротоксинов (КФБЭ), представляющий собой смесь пептидогликанов и липополисахаридов. Комплекс КФБЭ адсорбируется на поверхности патогенных эшерихий, препятствуя пассивной диффузии и активному транспорту питательных веществ, а также способствует проникно-вению продуктов микробного синтеза бацилл внутрь патогенных эшерихий, что приводит к их гибели.

5. Пробиотик КД-5 безвреден для животных и способствует нормализации гематологических, иммунологических и биохимических показателей периферической крови поросят-отьемышей, больных гастроэнтеритом на 10-14 дни с начала постановки опыта.

6. Профилактическая эффективность КД-5 при желудочно-кишечных болезнях поросят-отъемышей составила 90,0%, при даче препарата в дозе 5 г на голову 1 раз в день 7 дней подряд, терапевтическая - 100%, при даче препарата в дозе 7,5 г на голову 1 раз в день в течение 10 дней. При использовании КД-5 с терапевтической целью все поросята опытной группы выздоравливали на 4 сутки после постановки опыта. В контрольной группе летальность составила 25%, а выздоровление животных при лечении их антибиотиками наступало на 6-7 дни с начала постановки опыта.

7. У поросят опытных групп наблюдалось увеличение убойной массы на 9,7%, на 1 голову бьшо получено на 3,2 кг мяса больше, чем от контрольных животных. Среднесуточный прирост живой массы у животных опытной группы в сравнении с контрольной был выше на 11,4%, а затраты комбикорма на 1 кг были ниже на 10,1 %. Прибыль от реализации свинины в опытных группах была на 31,24% больше, в сравнении с контролем. Экономическая эффективность применения КД-5 на рубль затрат составила 45,4 руб.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Разработан проект Инструкции по применению пробиотика КД-5 в ветеринарии.

2. Разработан и утвержден 12.03.2008 г. «Технологический регламент производства пробиотика КД-5».

3. Составлены и утверждены отчеты об испытании КД-5:

- отчет «Экспериментальные испытания безопасности и антимикробной активности пробиотика КД-5» (промежуточный), утвержден 17.01.2008 г.;

- отчет «Изучение профилактической эффективности пробиотика КД-5 при желудочно-кишечных болезнях поросят-отьемышей» (заключительный), утвержден 21.02.2008 г.

4. В соответствии с порядком регистрации ветеринарных препаратов в Российской Федерации, нормативная документация на препарат КД-5 представлена на экспертизу в лабораторию пробиотнков ФГУ ВГНКИ.

5. На базе ООО «НПК ЦМВЭИ» (г. Пущино) создана аппаратурно-техно-логическая линия промышленного производства пробиотика КД-5. Организовано серийное производство препарата.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Рекомендовать пробиотик КД-5 зооветспециалистам н владельцам животных в качестве лечебно-профилактического средства при гастроэнтеритах поросят-отьемышей, вызванных энтеропатогенными бактериями, а также как

средство заместительной терапии для восстановления полезной микрофлоры кишечника животных после использования антибиотиков и других химиоте-рапевтических препаратов.

2. Отработанные технологические параметры и режимы производства про-биотика КД-5 рекомендуются для приготовления пробиотиков на основе других микроорганизмов и продуктов их метаболизма.

3. С целью повышения энергии роста свиней на откорме и увеличения экономической эффективности производства свинины рекомендуется в состав полнорационных комбикормов вводить пробиотик КД-5 из расчета 10 г на 1 поросенка-отъемыша или 5 кг на 1 тонну корма.

4. Результаты исследований по созданию технологии производства про-биотика КД-5 и оценке его эффективности при гастроэнтеритах поросят-отъ-емышей, рекомендуется использовать в учебном процессе по дисциплинам «Микробиология» и «Биотехнология» в высших учебных заведениях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Смирнова Е.А. Кормовая добавка КД-5 в рационах свиней /Е.А. Смирнова //Зоотехния.- 2007.- № 5.- С. 16.

2. Грязнева Т.Н. Профилактическая эффективность пробиотика КД-5 при желудочно-кишечных болезнях поросят-отьемышей /Т.Н. Грязнева, Е.А. Смирнова, И.В. Тихонов //Клиническое питание: Научно-практический журнал.- Спб.- Мат. межд. конгр. «Пробиотики, пребиотики, сннбиотики и функциональные продукты питания»,- 2007.- № 1-2.- С. 35-36.

3. Смирнова Е.А. Технология приготовления пробиотика КД-5 /Е.А. Смирнова, Т.Н. Грязнева // Клиническое питание: Научно-практический журнал.-Спб.- Мат. межд. конгр. «Пробиотики, пребиотики, синбиотнки и функциональные продукты питания».- 2007.- № 1-2.- С.66-67.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД№ 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 29.01.09. Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,44 Печать авторефератов: 730-47-74, 778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смирнова, Екатерина Александровна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Физиологические особенности пищеварения у свиней.

1.2. Нормальная микрофлора желудочно-кишечного тракта свиней.

1.3. Бактерии рода Bacillus как компоненты нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта свиней.

1.4. Рационы кормления свиней, направленные на профилактику желудочно-кишечных болезней.

1.5. Про биотические препараты, применяемые для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней свиней.

1.6. Кормовые добавки, используемые в свиноводстве, и методы их приготовления.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Изыскание компонентов, перспективных для включения в состав пробиотика для поросят-отъемышей.

3.1.1. Сравнительная характеристика биологической активности культур штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ И.

3.1.2. Изыскание адсорбентов для контактно-сорбционного высушивания пробиотиков.

3.2. Технология приготовления пробиотика КД-5.

3.2.1. Приготовление опытных серий КД-5.

3.2.2. Определение антимикробной активности и безвредности опытных серий КД-5.

3.2.3. Технология промышленного производства пробиотика КД-5.

3.3. Контроль качества пробиотика КД-5.

3.4. Оценка лечебно-профилактической эффективности пробиотика КД-5 при желудочно-кишечных болезнях поросят-отъемышей.

3.4.1. Влияние изучаемых бацилл в составе пробиотика КД-5 на микрофлору кишечника поросят-отъемышей.

3.4.2. Оценка влияния пробиотика КД-5 на показатели периферической крови поросят-отъемышей.

3.4.3. Экономические показатели применения КД-5 при откорме поросят-отъемышей.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Технология производства пробиотика КД-5 и его использование в свиноводстве"

Желудочно-кишечные болезни поросят различной этиологии по частоте, массовости и величине наносимого экономического ущерба занимают одно из первых мест в нозологическом профиле болезней свиней (1).

Ежегодно желудочно-кишечными болезнями переболевает 55-57 % поросят-отъемышей. Падеж от этих болезней составляет около 30 % от всего павшего поголовья молодняка. При этом среди причин отхода животных основное место занимают болезни, связанные с нарушением деятельности желудочно-кишечного тракта, возбудителями которых является условно-патогенная микрофлора. У переболевших поросят снижается прирост живой массы, что сказывается на их дальнейшем развитии и формировании продуктивных качеств (13, 67, 71).

Широко применяемые для лечения поросят антибиотики, наряду с положительным воздействием на течение и форму болезни, вызывают побочные эффекты: возникновение антибиотикорезистентности у патогенных бактерий, дисбактериозы, аллергические реакции и др. (6).

Использование кормовых антибиотиков породило проблему, когда в результате мутаций патогенная микрофлора, являющаяся типичной и для человека, становится резистентной к антибиотикам и передается от животных к человеку (67).

В последние годы в мире наметилась тенденция на снижение масштабов использования кормовых антибиотиков в рационах животных. В 1999 году в странах Евросоюза и восточной Европы было запрещено использование антибиотиков дойным коровам, так как существовал риск потребления человеком остаточных количеств антибиотиков с сырым молоком. С января 2006 г. в странах Евросоюза было принято решение о запрете использования кормовых антибиотиков для разных видов животных, в том числе и свиней (145).

В настоящее время проблему желудочно-кишечных болезней поросят в ряде стран пытаются решить за счет применения экстрактов растительных масел и пробиотических препаратов. Но применение пробиотиков, на наш взгляд, является принципиальным решением вопроса получения экологически чистых продуктов питания и сохранения природного равновесия в зонах промышленного производства сельхозпродукции (8).

В последние годы все большее значение в качестве альтернативы антибиотиков приобретают пробиотические препараты, применение которых в свиноводстве, является принцип решения проблемы получения экологически чистых продуктов питания (7, 20, 27, 28, 30, 33, 38, 55, 91, 116).

При производстве пробиотиков в состав препарата включается как правило только биомасса живых, антагонистически активных микроорганизмов, а ценные продукты микробного синтеза (ферменты и бактериоцины, не используются, т. к, процесс их выделения и концентрирования является технологически сложным и трудоемким.

Однако отечественными и зарубежными авторами установлено, что лак-тобактерии синтезируют молочную кислоту, лизоцим, ацидофилин и др., би-фидобактерии синтезируют витамины группы В, в частности, никотиновую, фолиевую кислоты, тиамин, биотин, цианокобаламин, а также аминокислоты и белки, обеспечивая их всасывание, а В.эиЫШз и В-НсЬетГоптаэ вырабатывают более 70 видов ферментов, до 200 видов бактериоцинов, продуцируют факторы роста для нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных, витамины группы В, другие биологически активные вещества.

Поэтому утилизация подобных ценных продуктов микробного синтеза при производстве пробиотиков является, на наш взгляд, нерациональным расходованием биологических ресурсов.

В ветеринарной практике свиноводства наиболее востребованы те лекарственные и профилактические средства, которые задаются с кормом, так как этот способ технологичен и не требует больших трудовых затрат.

С учетом отмеченного, разработка пробиотиков на основе живых, антагонистически активных микроорганизмов и продуктов их микробного синтеза, а также оценка эффективности подобных средств при желудочно-кишечных болезнях поросят является актуальной задачей.

- Цель настоящих исследований - разработка технологии производства пробиотика КД-5 и его применение при откорме поросят-отъемышей.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изыскать компоненты, перспективные для включения в состав пробиотика для поросят - отъемышей.

2. Определить биологическую активность культур штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 и их метаболитов в различных соотношениях in vitro и in vivo.

3. Разработать технологию производства пробиотика КД-5 на основе бацилл и продуктов их микробного синтеза.

4. Оценить воздействие пробиотика КД-5 на показатели гомеостаза организма поросят-отъемышей.

5. Определить эффективность применения пробиотика КД-5 при желудочно-кишечных болезнях поросят-отъемышей.

6. Разработать нормативную документацию на препарат КД-5 для регистрации его на территории РФ.

Научная новизна.

1. Впервые, на основе культур штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11, а также их продуктов микробного синтеза, сконструирован пробиотик КД-5 для применения в свиноводстве.

2. Культуры штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 обладают высокой ферментативной активностью и продуцируют бактериоцины, обуславливающие антагонистическое действие в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, вызывающих желудочно-кишечные болезни у поросят-отъемышей.

3. Установлено, что в процессе культивирования B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 в смеси с энтеротоксигенными микроорганизми образуется нано-липосомальный комплекс бактериоцинов, ферментов и энтеро-токсинов (КФБЭ), представляющий собой смесь пептидогликанов и липо-полисахаридов. Комплекс КФБЭ адсорбируется на клеточной стенке патогенных микроорганизмов, препятствуя пассивной диффузии и активному транспорту питательных веществ, а также способствует проникновению бактериоцинов и ферментов бацилл внутрь энтеротоксигенных бактерий, что приводит к их гибели.

4. Показано, что пробиотик КД-5, содержащий в своем составе биомассу B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11, а также их метаболиты в соотношении 1:1, обладает уникальными биологическими свойствами, отличающими его от других пробиотиков: подавление размножения сальмонелл, кандид, стафилококков и стимуляция роста лактобацилл и бифидобактерий in vitro и в желудочно-кишечном тракте поросят-отъемышей.

5. Разработана технология промышленного производства пробиотика КД-5 с использованием контактно-сорбционного метода высушивания биомассы бацилл и продуктов их микробного синтеза на пшеничных отрубях. Срок хранения препарата составляет не менее 18 месяцев.

6. Показана высокая (90 - 100%) лечебно-профилактическая эффективность пробиотика КД-5 при гастроэнтеритах поросят-отъемышей.

7. Выявлено положительное влияние пробиотика на переваримость и эффективность использования организмом поросят-отъемышей питательных веществ препарата, на гематологические, биохимические и иммунологические показатели крови животных. Приросты живой массы поросят-отъемы-шей возрастают на 40%.

Практическая значимость.

1. Для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней поросят-отъемышей разработан новый пробиотик КД-5, и промышленная технология его производства.

2. На базе ООО «НПК ЦМВЭИ» (г. Пущино) создана технологическая линия и организовано серийное производство пробиотика КД-5. Получено 3 серии препарата, отвечающие требованиям СТО.

3. Разработан проект нормативной документации на КД-5 (регламент производства, инструкция по применению, методы контроля качества).

4. Утверждены в установленном порядке два отчета по испытанию безопасности и антимикробной активности КД-5 и производственных испытаний препарата в условиях свиноводческих хозяйств.

5. В соответствии с порядком регистрации ветеринарных препаратов в Российской Федерации, нормативная документация, отчеты об испытаниях КД-5 и 3 серии препарата направлены на экспертизу в лабораторию про биотиков ФГУ ВГНКИ.

6. В опытах на поросятах-отъемышах, принадлежащих СПК «Новое Лит-виново» и ЗАО «Медвежьи озера» Щелковского района Московской области, изучен механизм действия пробиотика КД-5; дана оценка влияния биологически активных веществ, синтезируемых В.зиЫШэ ТПИ 13 и ВЛкИешЯэпшз ТПИ 11, на микробиоценоз кишечника, обменные и иммунные процессы организма животных; показана высокая лечебно-профилактическая и экономическая эффективность препарата, при использовании в свиноводстве. Полученные данные подтверждены актами, утвержденными руководителями хозяйств.

7. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО МГАВМиБ при изучении студентами и слушателями ФПК дисциплин «Ветеринарная микробиология», «Микробиология и иммунология», «Биотехнология».

Личный вклад соискателя. Автору принадлежит непосредственное осуществление исследований по разработке параметров и режимов получения биомассы культур штаммов В.зиЫШБ ТПИ 13 и В.ИсЬетйэпгиз ТПИ И, контактно-сорбционного высушивания пробиотика КД-5, определение безвредности препарата на лабораторных животных, испытание лечебно-профилактической эффективности КД-5 в свиноводческих хозяйствах, анализ и теоретическое обобщение полученных данных, разработка нормативной документации на препарат.

В работе использованы материалы, полученные лично автором. Производственные штаммы В.зиЫШв ТПИ 13-07.06.21-ДЕП/ВГНКИ и В.НсИеш-1опгш ТПИ 11-07.06.22-ДЕШВГНКИ были предоставлены автором штаммов, профессором Грязневой Т.Н.

Апробирование результатов. Основные результаты диссертационной работы изложены в 2 отчетах НИР, 3 печатных работах и были доложены:

- на международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 2007);

- на 9-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2007»;

- на Международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (Щелково, 2008).

- на V съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2008).

Материалы диссертации отправлены на соискание премии Президента

Российской Федерации в области науки и инноваций для молодых ученых

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 3 статьи, в том числе 1 - в научном журнале рекомендованном ВАК, 2 - в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертационной работы. Материалы диссертации изложены на 192 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (201 источник, из которых 61 иностранных авторов). Работа содержит 23 таблицы, 58 рисунков, 28 страниц приложений.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Смирнова, Екатерина Александровна

5. ВЫВОДЫ

1. Разработан новый пробиотик КД-5, представляющий собой высушенную контактно-сорбционным способом на пшеничных отрубях биомассу В.БиЫШз ТПИ 13 и В.Нс11ешГопш8 ТПИ 11 и их метаболитов в соотношении 1:1, при содержании в 1 г препарата 1,5 млрд. микробных клеток бацилл, со сроком хранения не менее 18 месяцев.

2. Параметры культивирования культур В.БиЫШз ТПИ 13 и ВЛюЬешГогпиз ТПИ 11с использованием биореакторов БИОР - 0,1, коэффициенте аэрации - 0,7 дм3/мин, продолжительность культивирования 24 ч для В. яиЫШз ТПИ 13 и 0,4 дм3/мин и 28 ч - для В. НсЬешГопшз ТПИ 11, соответственно, были достаточными для обеспечения полноценного роста и спорообразования бацилл, а также микробного синтеза бактериоцинов и ферментов.

3. При контактно-сорбционном методе высушивания КД-5 с использованием сушильной установки с кипящим слоем ЭВЗ и пшеничных отрубей в качестве сорбента, биомасса бацилл и продукты их метаболизма обезвоживаются при температуре 40-60°С в течение 6 часов без повреждения биокомпонентов, при влажности конечного продукта 5 %. Полученные 3 серии препарата были стандартны по составу и биологической активности и соответствовали требованиям СТО.

4. При культивировании В.эиЫШз ТПИ 13 и В.Нс11еш£опш8 ТПИ Ив смеси с энтеротоксигенными эшерихиями, образуется нано-липосомальный комплекс бактериоцинов, ферментов и энтеротоксинов (КФБЭ), представляя-ющий собой смесь пептидогликанов и липополисахаридов. Комплекс КФБЭ адсорбируется на поверхности патогенных эшерихий, препятствуя пассивной диффузии и активному транспорту питательных веществ, а также способствует проникновению продуктов микробного синтеза бацилл внутрь патогенных эшерихий, что приводит к их гибели.

5. Пробиотик КД-5 безвреден для животных и способствует нормализации гематологических, иммунологических и биохимических показателей периферической крови поросят-отъемышей, больных гастроэнтеритом на 10-14 дни с начала постановки опыта.

6. Профилактическая эффективность КД-5 при желудочно-кишечных болезнях поросят-отъемышей составила 90,0 %, при даче препарата в дозе 5 г на голову 1 раз в день 7 дней подряд, терапевтическая - 100 %, при даче препарата в дозе 7,5 г на голову 1 раз в день в течение 10 дней. При использовании КД-5 с терапевтической целью все поросята опытной группы выздоравливали на 4 сутки после постановки опыта. В контрольной группе летальность составила 25%, а выздоровление животных при лечении их антибиотиками наступало на 6-7 дни с начала постановки опыта.

7. У поросят опытных групп наблюдалось увеличение убойной массы на 9,7 %, на 1 голову было получено на 3,2 кг мяса больше, чем от контрольных животных. Среднесуточный прирост живой массы у животных опытной группы в сравнении с контрольной был выше на 11,4 % , а затраты комбикорма на 1 кг были ниже на 10,1 %. Прибыль от реализации свинины в опытных группах была на 31,24 % больше, в сравнении с контролем. Экономическая эффективность применения КД-5 на рубль затрат составила 45,4 руб.

6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Разработан проект Инструкции по применению пробиотика КД-5 в ветеринарии.

2. Разработан и утвержден 12.03.2008 г. в установленном порядке «Технологический регламент производства пробиотика КД-5».

3. Составлены и утверждены отчеты об испытании пробиотика КД-5:

- отчет «Экспериментальные испытания безопасности и антимикробной активности пробиотика КД-5» (промежуточный), утвержден 17.01.2008г.;

- отчет «Изучение профилактической эффективности пробиотика КД-5 при желудочно-кишечных болезнях поросят-отъемышей» (заключительный), утвержден 21.02.2008г.

4. В соответствии с порядком регистрации ветеринарных препаратов в Российской Федерации, нормативная документация представлена на экспертизу в лабораторию про биотиков ФГУ ВГНКИ.

5. На базе ООО «НПК ЦМВЭИ» (г. Пущино) создана аппаратурно-тех-нологическая линия промышленного производства пробиотика КД-5. Организовано серийное производство препарата.

7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Рекомендовать пробиотик КД-5 -зооветспециалистам и владельцам животных в качестве лечебно-профилактического средства при гастроэнтеритах поросят-отъемышей, вызванных энтеропатогенными бактериями, а также как средство заместительной терапии для восстановления полезной микрофлоры кишечника животных, после использования антибиотиков и других химиоте-рапевтических препаратов.

2. Отработанные технологические параметры и режимы производства пробиотика КД-5, рекомендуются для приготовления пробиотиков на основе других микроорганизмов и продуктов их метаболизма.

3. С целью повышения энергии роста свиней на откорме и увеличения экономической эффективности производства свинины рекомендуется в состав полнорационных комбикормов вводить пробиотик КД-5 из расчета 10 г на 1 поросенка-отъемыша или 5 кг на 1 тонну корма.

4. Результаты исследований по созданию технологии производства пробиотика КД-5 и оценке его эффективности при гастроэнтеритах поросят-отъемышей, рекомендуется использовать в учебном процессе по дисциплине «Микробиология» и «Биотехнология» в высших учебных заведениях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смирнова, Екатерина Александровна, Москва

1. Анохин Б.М. Болезни молодняка сельскохозяйственных живот-ных./Б.М. Анохин Воронеж: Изд. НИИСЖ- 1996. - 213 с.

2. Антипов В.А. Биологические препараты симбионтных микроорганизмов и их применение в ветеринарии /В.А. Антипов //Сельское хозяйство за рубежом. -1981.- № 2.-С. 43-47.

3. Антипов В.А. Использование пробиотиков в животноводстве /В.А. Антипов // Ветеринария. 1991. - № 4. - С. 55-58.

4. Аркадьева З.А. Факторы, влияющие на жизнеспособность и свойства микроорганизмов при различных методах хранения /З.А. Аркадьева //Биологические науки.- 1993. № 4.- С. 93 - 104.

5. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях /Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Л.: Гос. из-во мед. литературы. -1962. - 290 с.

6. Байбеков И.М. Взаимодействие индигенных пристеночных микроорганизмов с клетками слизистой оболочки пищеварительного тракта /И.М. Байбеков, Р.Ш. Мавлян-Ходжаев, Х.И. Ирсалиев //Арх.патол. 1992. - № 5.-С. 18-22

7. Бакулина Л.Ф. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии /Л.Ф. Бакулина, И.В. Тимофеев, Н.Г. Перминова //Биотехнология. 2001. - № 2. - С. 48 - 56.

8. Белов А.Д. Новое в лечении, диагностике и профилактике болезней молодняка/А.Д. Белов. -М.: МВА. 1991. - 94с.

9. Белявская В.А. Пробиотики из рекомбинантных бацилл новый класс лечебно-профилактических препаратов и способ доставки лекарственных белков в организм /В.А. Белявская //Сб.науч.тр. Новосибирск: НИКТИ БАВ.-- 1996.-С. 90-197.

10. Биотехнология: учебник /И.В. Тихонов, Е.А. Рубан, Т.Н. Грязнева и др.; под ред. Воронина Е.С. Санкт-Петербург: Гиорд.- 2005. - 750 с.

11. Бирюков B.B. Оптимизация периодических процессов культивирования микроорганизмов /В.В. Бирюков, М.В. Кантере М.: Наука. - 1985. - 282 с.

12. Бойко Н.В. Антагонистическое действие культур Bacillus subtilis на бактерии рода Klebsiella /Н.В. Бойко, А.И. Туряница, Е.П. Попович //Микробиол. журн. 1989. - № 1. - С. 87-91.

13. Бондаренко В.М. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры /В.М. Бондаренко, В.Г. Петровская //Вестник РАМН. 1997. - № 3. - С. 7 -10.

14. Бондаренко В.М. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков /В.М. Бондаренко, Э.И. Рубакова, В.А. Лаврова //Микробиол. журн. 1998. - № 4. - С. 107 - 111.

15. Быков В.А. Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов /В.А. Быков, И.А. Крылов, М.Н. Манаков М.: Высшая школа. - 1987. - 143 с.

16. Варфоломеев С.Д. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов /С.Д. Варфоломеев, C.B. Калюжный М.: Высшая школа. - 1990. - 260 с.

17. Волкопялов Б.П. Учебник по свиноводству / Б.П. Волкопялов // Ленинград: Колос. 1968. - 350 с.

18. Воробьев A.A. Дисбактериозы актуальная проблема медицины /A.A. Воробьев, H.A. Абрамов, В.М. Бондаренко //Вестник РАМН - 1997. - № 3. - С. 4-7.

19. Воробьев A.B. Опыт применения пробиотика биоспорин для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней молодняка /A.B. Воробьев,

20. A.А. Фадеев //Актуал. пробл. произв. продуктов жив-ва: Сб.науч.тр. Самара: Наука - 2001. - С. 86 - 88.

21. Выделение и идентификация бактерий желудочно-кишечного тракта животных /Е.С. Воронин, Т.Н. Грязнева, И.В. Тихонов и др. //Методические рекомендации. -М.: МГАВМиБ. 2004. - 108 с.

22. Горская Е.М. Механизмы развития микроэкологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции: Автореф. дис. докт. мед. наук /Е.М. Горская. М: Наука. - 1994. - 53 с.

23. Готтшлак Г. Метаболизм бактерий /Г. Готтшлак М.: Мир. - 1982.310 с.

24. Грязнева Т.Н. Антагонистическая активность бифидо- и лактобакте-рий в отношении энтеробактерий /Т.Н. Грязнева, Л.Я. Ставцева //Ветеринария. 1991. - № 6. - С. 21 - 22.

25. Грязнева Т.Н. Теоретическое обоснование разработки технологии глубинного способа культивирования микроорганизмов B.subtilis и

26. B.licheniformis для производства пробиотиков /Т.Н. Грязнева, П.Г. Васильев, А.П. Лиморенко //Ветеринарная медицина. Изд. «Агровет». - 2002. - № 2.1. C. 32 34.

27. Грязнева Т.Н. Технология производства пробиотика «Биод-5» и его применение в ветеринарии /Т.Н. Грязнева //Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Сб. науч. жр. Покров: ВНИИВВиМ. - 2003. - С. 609 - 614.

28. Грязнева Т.Н. Разработка глубинного способа культивирования бацилл-компонентов пробиотика Биод-5 /Т.Н. Грязнева //Биотехнология. -2004. -№ 5. С. 67 - 68.

29. Дрыгина Е.С. Оборудование биотехнологических производств за рубежом /Е.С. Дрыгина, И.Л. Ципенюк //Процессы и аппараты микробиологических производств: Сб.науч.тр. М.: Мир. - 1987. - С. 23.

30. Евдокимова H.B. Некоторые аспекты распространения в почвах представителей рода Bacillus в связи с кинетикой их роста /Н.В. Евдокимова //Науч. конф. мол. ученых фак. почвоведения МГУ: Сб.науч.тр. М.: МГУ. -1989. - С. 25 -26.

31. Егоров Н.С. Бактериоцины. Образование, свойства, применение /Н.С. Егоров, И.П. Баранова //Антибиотики и химиотерапия. 1999. - № 6. - С. 15 -16.

32. Жданов П.И. Применение споробактерина жидкого поросятам /П.И. Жданов //Ветеринария. 1994. - № 7. - С. 41 - 44.

33. Жданов П.И. Биологические и эпизоотологические аспекты производства и применение нового пробиотика из бактерий рода Bacillus в свиноводстве: Автореф. дис. канд. вет. наук /П.И.Жданов. СПб.: ПГАВМ. - 1997. - 21 с.

34. Жданов П.И. Опыт и перспективы применения нового пробиотика «Споробактерин» в животноводстве и ветеринарной практике /П.И. Жданов, В.М. Мешков, А.И. Лепский //Юбилейн. сб.тр.ученых Оренбург.гос.аграр.ун-та. Оренбург: ОГАУ. - 2000. - С. 4 - 7.

35. Жуков Е. Г. Защита животных при возникновении чрезвычайных ситуаций /Е.Г. Жуков, Г.Я. Курочкин Ветеринария. № 4. - 1993. - С. 21 - 22.

36. Ивановский A.A. Новый пробиотик бактоцеллолакт при различных патологиях у животных/A.A. Ивановский //Ветеринария. 1996. - № 11. - С. 34-35.

37. Изучение свойств бифидобактерий, выделенных от разных видов животных /Т.Н. Грязнева, A.B. Лештаева, Д.Н. Любимов и др. //Ветеринарная медицина. Изд. Агровет. - 2002. - № 1. - С. 13 - 14.

38. Исмаилов М.А. Профилактическое и терапевтическое действие био-спорина-В при диареях телят и поросят /М.А. Исмаилов, Д.А. Девришов, З.М. Бедоева //Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии: Сб.науч. тр. М.: МВА. - 1997. - С. 12 - 13.

39. Интизаров М.М. Микрофлора тела животных /М.М. Интизаров. -M.: MB А. 1994.-350 с.

40. Интизаров М.М. Возможности гнотобиологического эксперимента при изучении механизмов бактериального антагонизма и симбиоза /М.М. Интизаров //Теоретические и практические основы гното биологии: С б. науч. тр. М.: Агропромиздат. - 1986. - С. 22 - 29.

41. Кабанов В.Д. Интенсивное производство свинины: Учебник /В.Д Кабанов М.: тип. Россельхозакадемии. - 2003. - 400 с.

42. Каврук Л.С. Ускоренная индикация патогенных энтеробактерий /Л.С. Каврук, А.Б. Кононенко, C.B. Бритова //Ветеринария,- 1992.- № 5,- С. 31 -33.

43. Карпов A.M. Сушка продуктов микробиологического синтеза /A.M. Карпов, А.А.Улумиев.- М.: Легкая и пищевая промышленность,- 1982.- 216 с.

44. Клименко В.В. Применение пробиотиков в ветеринарии /В.В. Юль менко //Биотехнология, экология, медицина. Киров: Экспресс. - 2002. - С. 32-34.

45. Ковалев В.Ф. Некоторые проблемы применения антибиотиков в животноводстве и ветеринарии /В.Ф. Ковалев //Антибиотики и медбиотехноло-гия. 1989. - № 10. - С. 725 - 729.

46. Ковалев C.B. Проектирование и оборудование биотехнологическихпредприятий /C.B. Ковалев, И.В. Тихонов, Н.И. Симонова //Практикум по процессам и аппаратам биотехнологии. Ч. I. - М.: ВУ РХБЗ МО РФ. - 2000. -123 с.

47. Комплексная кормовая добавка «Пробиоцел»/А.Я. Яхин, О.В. Соковых, А.Р. Абдрафиков и др. //Мясная индустрия. 2003. - №1. - С.44 - 45.

48. Коршунов В.М. Характеристика биологических препаратов и пищевых добавок для функционального питания и коррекции микрофлоры кишечника /В.М. Коршунов, Б.А. Ефимов, А.К. Пикина //Журн. микробиол. -1995.-№ 3.-С. 48 55.

49. Королюк A.M. Конструирование новых препаратов и лечебных продуктов для направленной коррекции микроэкологического статуса организма /A.M. Королюк //Инфектология, достижения и перспективы: Сб.науч.тр.-Санкт-Петербург. 1996. - С. 125.

50. Костенко Т.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии /Т.С. Костенко, В.Б. Родионова, Д.И. Скородумов. М.: Колос. -2001.-63 с.

51. Котов В. Б. Состояние и тенденции развития биотехнологии за рубежом /В.Б. Котов, Т.А. Беляева //Итоги науки и техники. Биотехнология: Сб.науч.тр. -М.: Мир. 1991. - С. 156.

52. Кошелева Г.Н. Принцип действия ферментов /Т.Н. Кошелева //Комбикорма. 1999. - № 8. - С. 38 - 39.

53. БЗНИИММО РФ. 1999. - С. 111 - 112.

54. Кругликов В.Д. Возможность приживления Lactobacillus acidophilus в кишечнике белых мышей на фоне бактериальной терапии /В.Д. Кругликов, Р.И. Цураева, И.В. Рыжков //Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1997.-№ 1.-С. 67-69.

55. Кудрявцев В.А. Влияние живых культур Bacillus subtilis на неспецифическую резистентность организма /В .А. Кудрявцев, JI.A. Сафронова, А.И. Осадчая //Микробиол. журн. 1996. - № 2. - С. 46 - 55.

56. Куриленко А.Н. Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных /А.Н. Куриленко, В.Л. Крупальник М.: Колос. - 2000. -387 с.

57. Ленцнер А.А. Лактофлора и колонизационная резистентность /А.А. Ленцнер, Х.П. Ленцнер, М.Э. Микельсаар //Антибиотики и мед. биотехнол,-1987. -№ 3. С. 173 - 179.

58. Литвина Л.А. Перспективы использования пробиотиков в животноводстве /Л.А. Литвина, К.Я. Мотовилов //Проблемы стабилизации и развития с.-х. пр-ва Сибири, Монголии и Казахстана в XXI в: Сб.науч.тр. Новосибирск: Наука. - 1999. - ч. 2. - С. 220 - 222.

59. Логунов В. Ферментные препараты фирмы ХЕХСТ //Комбикормовая промышленность. 1996. - № 7. - С. 16-18.

60. Лукин A.A. Защитная функция пептидных антибиотиков бацилл /A.A. Лукин //Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987. - № 7. - С. 538-541.

61. Макарцев Н.Г. Кормление сельскохозяйственных животных: учебник /Н.Г Макарцев Калуга: Облитизат. - 1999. - 358 с.

62. Малик Н.И., Иммунобиология и кишечная лактофлора /Н.И. Малик, А.Н. Панин, Е.В. Малик //М.: Аграрная наука. 1998. - 48 с.

63. Малик Н.И. Антилизоцимные свойства молочно-кислых бактерий, выделенных из кишечника поросят и птицы /Н.И. Малик //Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов: Сб.науч.тр. М.: ВГНКИ. - 2001. - С. 98 - 99.

64. Малик Н.И. Ветеринарные пробиотические препараты /Н.И. Малик, А.Н. Панин //Ветеринария. 2001. - № 1. - С. 46 - 51.

65. Малик Н.И. Применение пробиотиков в качестве ростостимулирую-щей кормовой добавки и средства профилактики неинфекционных желудочно-кишечных болезней поросят /Н.И. Малик, Ч.К. Авылов //Сб. научн. тр. ВГНКИ. М.: ВГНКИ. - 2001. - Т.2. - С.221 - 222.

66. Малик Н.И. Новые пробиотические препараты ветеринарного назначения: Автореф. дисдокт. биол.наук: 16.00.03 /Н.И Малик М.:ВГНКИ.2002. 53 с.

67. Матвеев В.Е. Научные основы микробиологической технологии. Кинетика развития и инактивация микробных популяций, септика, масштабирование /В.Е. Матвеев М.: Агропромиздат. - 1985. - 224 с.

68. Мечников И.И. Этюды оптимизма /И.И. Мечников М.: Наука. -1988.-327 с.

69. Микроэкология желудочно-кишечного тракта. Коррекция микрофлоры при дис бактериозах кишечника /В.М. Коршунов, H.H. Володин, Б.А. Ефимов и др. М.: Наука. - 1999. - С. 125 - 135.

70. Мишурнова Н.В. Современное представление о роли нормальноймикрофлоры пищеварительного тракта /Н.В. Мишурнова, Ф.С. Киржаев //Ветеринария. 1993. - № 7 (6). - С. 30 - 33.

71. Молохова Е.И. Пробиотики на Российском рынке /Е.И. Молохова //Фармация. - 2000. - № 3. - С. 55 - 58.

72. Мосичев М.С. Общая технология микробиологических производств /М.С. Мосичев, A.A. Складнев, В.Б.Котов.- М.: Агропромиздат.- 1982.- 185 с.

73. Никитенко В.И. Вместо лекарств — бактерии /В.И. Никитенко //Наука в СССР. 1991.-№4.-С. 116-121.

74. Никитенко В.И. Споробактерин новый препарат для лечения дис-бактериозов и гнойно-воспалительных процессов /В.И. Никитенко, H.H. Горбунова, A.B. Жигайлов //Дисбактериозы и эубиотики: Сб.науч.тр. - М.: Мир.- 1996. С. 26-28.

75. Никитенко В.И. Некоторые новые данные о механизме действия спо-рообразующих пробиотиков /В.И. Никитенко, М.В. Бородин //Актуальные вопросы военной и практической медицины Оренбург: Наука - 2000,- С. 79- 80.

76. Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных /Н.И. Калашников, Б.Н. Клейменов и др. М.: Агропрмиздат. - 1985. - 250 с.

77. Осадчая А.И. Стимуляция роста и спорообразование B.subtillis с оптимизацией углеводного питания при глубинном культивировании /А.И. Осадчая, В.А. Кудрявцев //Прикл. биохимия и микробиол. 1997. - Т.ЗЗ. - № 3.-С.321 -324.

78. Осипова ИГ. Изучение безопасности бактерий рода Bacillus, составляющих основу некоторых пробиотиков /И.Г. Осипова, И.Б. Сорокулова

79. Журн. микробиол., эпидемиологии. 1998. - № 6. - С. 68-71.

80. Панин А.Н. Про биотические препараты в ветеринарии /А.Н. Панин, Н.И. Малик, Е.В. Малик //Ветинформ. 1993. - № 2. - С. 9 - 10.

81. Панин А.Н. Биотехнологические аспекты изготовления сухих пробиотических препаратов /А.Н. Панин //Научные основы пр-ва вет. биол.препаратов: Сб.науч.тр. Щелково: ВНИТИБП. - 2000. - С. 343 - 345. </

82. Петров В.Ф. Получение природных биологических активных препаратов — новое направление исследований в НПО «Биомед» /В.Ф. Петров, Г.М. Сафонова //Журн.микробиол. 1998. - № 2. - С. 95 - 98.

83. Пикина А.П. Первичный скрининг штаммов бифидобактерий и лак-тобактерий с целью разработки на их основе эффективных препаратов-пробиотиков /А.П. Пикина, В.В. Смеянов, Б.А. Ефимов //Журн. Микробиол. -1999.-№6. С. 34-36.

84. Платонов A.B. Производство препаратов для животноводства на основе микроорганизмов-симбионтов желудочно-кишечного тракта /A.B. Платонов М.: ВНИИСЭНТИ. - 1985. - 44 с.

85. Повышение эффективности пробиотикотерапии у поросят /А.Н. Панин, Н.И. Малик, Е.В. Малик и др. //Ветеринария. 1996. - т. 56. - С.22 - 23.

86. Попова Ж.П. Новый пробиотик для животноводства /Ж.П. Попова, А.К. Никонорова //Зоотехния. 1995. - № 11. - С. 21 - 22.

87. Регистр лекарственных средств России //Энциклопедия лекарств.

88. M.: РЛС. 2000/1999. - 1006 с.

89. Руденко И .Я. Оценка клинической эффективности оригинального жидкого лактобактерина /И.Я. Руденко, Б.И. Херодинов //Инфектология, достижения и перспективы: Сб.науч.тр. Санкт-Петербург: Георд. - 1996. - С. 184- 185.

90. Самуйленко А.Я. Основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов /А.Я. Самуйленко, Е.А. Рубан М.: Россельхоза-кадемия. - Т 1. - Т 2. - M.: РАСХН. - 2000. - 781 с.

91. Сафонов Т.А. Пробиотики как фактор, стабилизирующий здоровье животных /Т.А. Сафонов, Т.А. Калинина, В.П. Романова //Ветеринария. -1992.-№7-8(3).-С. 33-34.

92. Сельскохозяйственная биотехнология /B.C. Шевелуха, Е.А. Калашникова, Е.С. Воронин и др. М.: Высшая школа. - 2003. - С.469.

93. Сидоров М.А. Основы профилактики желудочно-кишечных заболеваний новорожденных животных /М.А. Сидоров, В.В. Субботин //Ветеринария. 1998. -№ 1. - С. 3 - 6.

94. Сидоров М.А. Нормальная микрофлора животных и ее коррекция пробиотиками /М.А. Сидоров, В!В. Субботин //Ветеринария. 2000. - № 11. -С. 17 - 22.

95. Скальский Н.Г. Биотехнологический потенциал консорциумов микроорганизмов в народном хозяйстве /Н.Г. Скальский, С.П. Лях М.: ВНИИПИ. - 1990. -С.198.

96. Слабоспицкая А.Т. Ферментативная активность бацилл, перспективных для включения в состав биопрепаратов /А.Т. Слабоспицкая, С.С. Крымовская, С.Р. Резник //Микробиол. журн. 1990. - Т. 52, № 1. - С. 9 - 1.

97. Смирнов В.В. Влияние комплексного пробиотика споролакта на микробиоценоз кишечника теплокровных /Смирнов В.В., Резник С.Р., Вью-ницкая В.А. //Микробиол. журн. 1995. - № 4. - С. 42-49.

98. Смирнов В.В. Пробиотики на основе живых культур микроорганизмов /В.В. Смирнов, Н.К. Коваленко //Микробиол. журн. 2002. - № 4. -С.62 - 80.

99. Сорокулова И.Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых биопрепаратов /И.Б. Сорокулова //Антибиотики и химиотерапия. 1996. - № 10. - С. 13 - 15.

100. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов /И.Б. Сорокулова //Антибиотики и химиотерапия. 1998. -№ 2. - С. 20 -23.

101. Субботин В.В. Биотехнология пробиотиков ветеринарного назначения /В.В. Субботин, М.А. Сидоров //Аграрная наука,- 1998.- №3,- С.20 21.

102. Субботин В.В. Новые пробиотики /В.В. Субботин, Н.В. Данилевская //Животновод. 1998. - №4. - С.20.

103. Субботин В.В. Биотехнология пробиотика лактобифадола (бифаци-добактерина) и его лечебно-профилактическая эффективность: Автореф. дис. докт. вет. наук: 16.00.03 /В.В. Субботин М.: МГУПБ. - 1999. - 41 с.

104. Субботин В.В. Профилактика желудочно-кишечных болезней новорожденных животных с симптомокомплексом диареи /В.В. Субботин, М.А. Сидоров //Ветеринария. 2001. - № 4. - С. 3 - 7.

105. Тарабукина Н.П. Морфологические, культуральные и биологические свойства Bacillus subtilis «ТНП-3» /Н.П. Тарабукина //Научное обеспечение ветеринарных проблем в животноводстве: Сб.науч.тр. Новосибирск: НИИВПЖ. - 2000. - С. 264 - 266.

106. Тараканов Б.В. Использование микробных препаратов и продуктов микробиологического синтеза в животноводстве /Б.В. Тараканов.-М.: ВНИИ-ТЭИ агропром. 1987. - С.48.

107. Тараканов Б.В. Новые биопрепараты для ветеринарии /Б.В. Тараканов, Т.А. Николичева //Ветеринария. 2000. - № 7. - С. 45 - 50.

108. Тараканов М.А. Механизм действия пробиотиков на микрофлору пищеварительного тракта и организм животных /М.А. Тараканов //Ветеринария. 2000. - № 5. - С. 32 - 33.

109. Тихонов И.В. Способ повышения устойчивости к желудочно-кишечным инфекциям /И.В. Тихонов, Т.Н. Грязнева, Д.А. Девришов //Сб. науч. ст. IX междунар. ветеринар, конгресса. М.: Ассоциация практикующих ветеринарных врачей. - 2001. - С. 318 - 319.

110. Тихонов И.В. Концентрирование и высушивание биопрепаратов /И.В. Тихонов, Е.С. Воронин, Т.Н. Грязнева //Учебно-методическое пособие. М.: МГАВМиБ. - 2002. - С.50.

111. Тихонов И.В. Совершенствование технологии производства про-биотика Биод-5 и методов его контроля /И.В. Тихонов, Т.Н. Грязнева, А.П. Лиморенко //Ветеринарная медицина. 2004. - № 4. - С. 40-41.

112. Тихонов И.В. Основы биотехнологических процессов. Способы культивирования микроорганизмов: Учеб.-метод. пособ.,Ч. II /И.В. Тихонов, Е.С. Воронин, C.B. Ковалев /М.: МГАВМиБ. 2002. - С.57.

113. Тихонов И.В. Основы биотехнологических процессов. Выделение, концентрирование и очистка биопрепаратов: Учеб.-метод, пособ., Ч. III /И.В. Тихонов, Е.С. Воронин, C.B. Ковалев /М.: МГАВМиБ. 2000. - С. 48.

114. Тихонов И.В. Проблемы и перспективы биотехнологии /И.В. Тихонов, В.А. Гаврилов //Ветеринарная медицина. М.: Агровет. - № 3. - 2003. -С. 26 - 27.

115. Тремасов М.Я. Изучение защитной роли пробиотиков при эшери-хиозе /М.Я. Тремасов, А.Г. Абдуллин //Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Сб.науч.тр -Екатеринбург: ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. 1999. - С. 247.

116. Тутов И.К. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов: Учеб.пособ. /И.К. Тутов И.К., В.И. Ситьков Ставрополь: СГСХА. - 1997. -С.251.

117. Фукс П.П. Разработка новой технологии получения сухого пробио-тика /П.П. Фукс, Э.П. Петренчук //Вет.медицина,- 1997.- Вып. 73. С. 24 -28.

118. Чернущенко Е.В. Процессы пищеварения и усвоения питательных веществ при скармливании сухой живой бактериальной культуры /Е.В. Чернущенко //Бюл. ВНИИФБИП с.-х. животных. 1988. - № 3. - С. 36 - 38.

119. Чудновская И.В. Антивирусная активность пробиотиков из бацилл /И.В. Чудновская, C.JI. Рыбалко, И.Б. Сорокулова //Доповщ1 Н.ацюнально1 академп наук Украши. 1995. - № 2. - С. 124 -126.

120. Шевелева С. А. Пробиотики, пребиотики и про биотические продукты. Современное состояние вопроса /С.А. Шевелева //Вопр. питания. 1999. - № 2. - С. 32 - 40.

121. Шендеров Б.А. Пробиотики и функциональное питание /Б.А. Шен-деров, М.А. Манвелова, Ю.Б. Степанчук //Антибиотики и химиотерапия. -1997.- №7. -С. 30-34.

122. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание /Б.А. Шендеров М.: Грантъ. - 1998. - Т. 1-2. - 288 с.

123. Щербаков П.Н. Профилактика и лечение при желудочно-кишечных и респираторных болезнях /П.Н. Щербаков, А.Г. Гусев //Ветеринария. 2002. - № 3. - С. 15 - 16.

124. Щербакова Э.Г. Новый препарат Бифилиз (ВИГЭЛ) и опыт его применения /Э.Г. Щербакова, Н.М. Грачева, Г.А. Растунова //Дисбактериозы и эубиотики: Сб.науч.тр. М.: ВИЭВ. - 1996. - С. 41 - 43.

125. Электронная микроскопия биологических объектов /Т.Н. Грязнева, З.Н. Меньшикова, И.В. Тихонов и др. //Учебно-методическое пособие. М.: МГАВМиБ. - 2003. - 109 с.

126. Эпштейн-Литвак Р.В. Дисбактериоз кишечника: Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследований /Р.В. Эпштейн-Литвак М.: Мир. - 1973. - С. 229 - 234.

127. Bansal S. Probiotics in healyh and diseasts / S. Bansal //J. Assoc physicians. 2001.-№ 7,-P. 735-741.

128. Benedettini G. Et al Iimimnomodulation by Bacillus subtilis spores / G. Benedettini, G. Delibero, R. Pierotti // Boll. 1st. Sieroter. Milan. 1983. -62, N 6. -P. 509-516.

129. Benedettini J. Et al. Imniunomodulation by Bacillus subtilis spores/ J. Benedettini //Boll. 1st. Sierote Milan. -1983. -62 № 6. -P.509-516.

130. Berg R.D. Probiotics, prebiotics, or conbiotics / R.D. Berg // Treds Microbiol. 1998. - Vol. 6. - P. 89-92.

131. Bengmark S. Colonic food: pre- and probiotics / S. Bengmark //Am J

132. Gastroenterol. 2000; 95 (1) SuppI: S 5-7.

133. Bonomi A. Probiotics in swine feeding: The use of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis (experimental contribution) / A. Bonomi // Riv. della Soc. Italianadi Scienza Dell'Alimentazione. — 1992. 21.- N 4. - P. 481-499.

134. Chattopadhyay S.P. Production of valine by a Bacillus sp / S.P. Chatto-padhyay, A.K. Baneijee // Z. Allg. Mikrobiol. 1978. - 18. - N 4. - P. 243-254.

135. Cipradi G. Effect of an adjunative treatment with Bacillus subtilis forfoodallergy / G. Cipradi // Chemioterapia.-1986.- 5. N6.- P. 408-410.

136. Coppi F. Results of treatment with Bacillus subtilis spores (Entero-germina) after antibiotic therapy in 95 patients with infection calculosis / F. Coppi //Chemotherapia. 1985. - 4. - № 6. - P. 467 - 470.

137. Collins M.D. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut / M.D. Collins Am J Clin Nutr, 1999; 69 (suppi): 1052S-7S.

138. Christopher F. Environmental biotechnology / F. Christopher New York. - 1990. - P. 265-270.

139. DaviesM. Bacterial cells as anti-tumor agents in man/ M. Davies // Rev.Environ Health.- 1982.- 4.- № 1.- P.31—36.

140. Delneste Y. Functional foods: Mechanisms of action on immunocompetent cells / Y. Delneste , A. Donnet-Hughes, E.J. Schiffrin // Nutr. Rev. 1998. -№56.-P. 93-98.

141. De Vos W.M. Gene expression systems for lactic acid bacteria / W.M. De Vos //Curr Opin. Microbiol. -1999.-N2.-Pp.-289-295.

142. Dubos RJ. Staphyiococci and infection immunity / R.J. Dubos //Amer J. Diuseases Children. 1963 Y. 105. H. 643-645.

143. Ducluzeau R. Production of an antibiotic substance by Bacillus licheni-formis within the digestive tract of gnotobiotic mice / R. Ducluzeau, F. Dubos, P. Rainbaud // Antimicrob. Agents Chemother.-1978.-13.- N 2.- P.97-103.

144. Dunny G.M. Cell-cell communication in gram-positive bacteria / G.M. Duiniy, B.A. Leonard //Ann. Rev Microbiol. -1997. -N51. -Pp.-527-564.

145. Eijsink V.G. Induction of bacteriocin production in Lactobacillus sake by a secreted peptide / V.G. Eijsink, M.B. Brurberg, P.H. Middelhoven, I.F. Nes //J.

146. Bacterid. -1996. -N 178(8). Pp.- 2232-2237.

147. Elkins C.A. Identification of genes encoding conjugated bile salt hydrolase and transport In Lactobacillus johnsonii 100-100 / C.A. Elkins, D.C. Savage //J. Bacterid. -1998. -N 180. -Pp.-4344-4349.

148. Evaldson I. The normal Human anaerobic microflora / I. Evaldson, A. Heimdaki, L. ICagar, C.E. Nord // Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 1982. - v. 35. -P.9-15.

149. Foran C. Bacillus secreted IgA / C. Foran //Chimioterapia.-1989.-6.-P. 218-231.

150. Freter R. Experimental enteric shigella and vibrio infectijn in mice and-guinea pig //j. Exp. Med. 1956. V.104. P.411-418.

151. Fuller R. Bacteria associated with the gastric epithelium of neonatal pigs / R. Fuller, P.A. Barrow, B.E. Brooker // Appl. Environ. Microbiol., 1978, vol. 35, N3.-P. 582-591.

152. Fuller R. Development and dynamics of the aerobic gut flora in gnotobi-otic and conventional animals // Advances in Veterinary Medicine. 1982. V 33.P.7-15.

153. Fuller R., Newman H.N. and Snoeyenbos G.H. Microbial competition in the mouth and gastrointestinal tract // nature. Antimicrobial System. Bath University Press. Bath. 1989.P.11-28.

154. Fuller R. Probiotics in man and animals / R. Fuller // J. Appl. Bacter. -1989.-66 №5.-P. 365 -378.

155. Fuller R. History and development of probiotics /Fuller R. // Probiotics.

156. The scientific basis. London: Chapman a. Hall. - 1992. - P. 29-53.

157. FullerR. Probiotics: the scientific basis / R. Fuller// London: Chapman S Hall.- 1992.-P. 216-226.

158. Fuller R. Probiotics 2. Application and practical aspects. Introduction: Development of commercial preparations. Factors affecting the response / R. Fuller// London -1997.-153 p.

159. Fuller R. Probiotics andprebiotics: microtlora management for improved gut health / R. Fuller, G.R. Gibson //Clin Microbiol Infect 1998: 4: 477-480.

160. Garlson H. Deference mechanisms of the avian gastrointestinal tract / H. Garlson //Poltry Sci. -1982. -V.61, № 7. P. 1268-1272.

161. Gibson G.R. Dietary modulation of the human colonic microbiota: Introducing the concept of prebiotics / G.R. Gibson, M.B. Robefroid //J. Nutr. 1995. -125, N6. - P. 1401-1412.

162. Gibson G.R. Selective stimulation of bifidobacteria in the human colon by oligofructose and inulin. / G.R. Gibson, E.B. Beatty, X. Wang, J.H. Cummings //Gastroenterology 1995; 108: 975-82.

163. Gibson G.R. Oligosaccharides and prebiotics / G.R. Gibson // Petfood Forum'96, Chicago, USA.- Chicago, 1996. P. 15-18.

164. Gibson G.R. Dietary modulation of the human gut microflora using the prebiotics oligofwtose and inulin / G.R. Gibson //J Nutr 1999; 129 (7) SuppI: 1438S-41S.

165. Gibson G.R. Aspects of in vitro and In vivo research approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use / G.R.Gibson, R. Fuller //J. Nutr. 2000: 130 (2) Suppl: 391S-395S.

166. Gilliland S.E. Influence of consuming milks containing cells of Lactobacilli acidophilus on lasctose malabsorption in humans / S.E. Gilliland, H.S. Kim //Abstr. Ann. Meet. Am.Soc. Microbiol. -1981. -N 27. P.-200.

167. Gilliland S.E. Use of the Minitek system for characterizing lactobacilli / S.E. Gilliland, M.L. Speck//Appl. Environ.Microbiol. 1985. -N 33. - P.-1289.

168. Gilliland S. E. Antagonistic action of Lactobacillus acidophilus towards intestinal and food-bome pathogens in associative culture / S.E. Gilliland //FEMS Microbiol. Rev,1990, V. 87.

169. Gissen A.S. Off probiotics, prebiotics and synbiotics / A.S. Gissen // ISS VRP'S Inc. Vit Res. Prod. Newsletters. USA. - 1995. - P. 111-117.

170. Huis H.J. Selection criteria for probiotic microorganisms / H.J. Huis, C. Shortt //Gut flora and health — past, present and future. — London; New York: Roval Soc. Med. Press Limited. 1996. - P. 27-36.

171. Killen M. Genetic modification of intestinol lactobacilli and bifidobacteria / M. Killen, M. Klatnhamm //J. Mol. Biol.- 2000.- № 2.-P. 41-50.

172. Landsudvalget for svin. Bioplus 2B till smagrise // Den rullende Afprofn-ing af staid- og produktionssystemer.- Copenhagen, Meddelse, 1989.-P.162.

173. Lilley D.M. Probiotics: growth promoting factors produced by microorganisms / D.M. Lilley, R.J. Stillwell // Science. 1965. - 147. - P. 747-748.

174. Lion A.B. Probiotics / A.B. Lion, R.B. Gumming, R.D. Kent //Austral. Vet.- 1977.- 53.

175. Lucey T.D. Introduction of intestinal microecology // J. Amer. Clinical Nutrition. 1972.V.25 P.1292-1294.

176. Manachini P.L. Thermostable alkaline protease produced by Bacillus thermoruber a new species of Bacillus / P.L. Manachini, M.G. Fortina, C. Parini // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1988. - 28, 4/5. - P. 409-413.

177. Maruta ICiyoshi. Probiotics or antibiotics /Maruta Kiyoshi. //World Poul-try.-1999,N 3.-P.112-127

178. Mazza P. The use of Bacillus subtilis as an Antidiarrhoeal microorganism /P. Mazza //Boll. Chem. Farm. -1994.-133, N.l -P.3-18.

179. Mendonca A.L. Bacillus spp. produtores de proteases: isolamento, carac-terizacao e melhoramento de B. cereus / A.L. Mendonca, R.L. Mariano, J.M. Araujo //Arg. biol. e tecnol. 1996. - 39, N 2. - P. 359-372.

180. Nosaki-Renard J. Induction d'interferon par Bacillus subtilis / J. Nosaki-Renard Ann Microbiol. - 1978, 129 a, № 4, P. 525-542.

181. Ozawa K. Effect of administration of Bacillus toyoi on intestinal flora / K. Ozawa, H. Yokota, M. Kimura //Japan. J. Vet. Sci.-1981/-43. N 5,- P. 771775.

182. Pollman D.S. Probiotics in pig diets / D.S. Pollman //Recent Advances in Animal Nutrition- Butterwortli. London. - 1986.- P. 193-205.

183. Tanaka R. Probiotics: prospects of use in opportunistic infections / R. Tanaka Microbiol. Biochem. - 1995.- № 7.- P. 123-127.

184. Thach P.N. Le Bacillus subtilis en thérapeutique et dans la propliilaxie / P.N. Thach, T.C. Vu, T.H. Nguen //Rev. Immunol. 1968. - 72, N 1/2. - P. 53-58.

185. Wei H. Bacillus cereus "Cereobiogen" as a growth promoter of Bifîdo-bactcriiim in infantile diarrhoea therapy / H. Wei, E. Kan //Recent advances in germfreeresearch. -Tokyo: Tokai Univ. press. 1981. - P. 475-480.

186. Wood T.N. Probiotics shown to change bacterial community structure in the avian gactrointestinal tract / T.N. Wood //J.Appl. and Environ. Microbiol. -1999.-Nov.-P. 134-138.

Информация о работе
  • Смирнова, Екатерина Александровна
  • кандидата биологических наук
  • Москва, 2009
  • ВАК 03.00.23
Диссертация
Технология производства пробиотика КД-5 и его использование в свиноводстве - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Технология производства пробиотика КД-5 и его использование в свиноводстве - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы