Совершенствование методов контроля специфической активности пробиотиков

Арчакова, Елена Геннадьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование методов контроля специфической активности пробиотиков
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов контроля специфической активности пробиотиков"

На правах рукописи

АРЧАКОВА Елена Геннадьевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОБИОТИКОВ

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь-2004

Работа выполнена в лаборатории пробиотиков филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Несчисляев Валерий Александрович Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Пшеничное Роберт Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кузяев Рафаэль Зиафутдинович кандидат медицинских наук Маслов Юрий Николаевич

Ведущая организация:

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Москва

Защита состоится 1

_часов на заседании

диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс (3422) 44-67-11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан

« ¿У» АЛЛ^ 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, чл.-корр. РАН # ^

Ившина И.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Отмечающийся в настоящее время неуклонный рост числа заболеваний, связанных с нарушением биологического равновесия между макроорганизмом и его микробной флорой, а также успешное применение препаратов пробиотического действия при их лечении, вызывает необходимость значительного увеличения выпуска последних (Григорьев, Яковенко, 1997; Бондаренко и др., 1998; Смирнов, Сорокулова, 1999). Повышение эффективности производства пробиотиков связано с совершенствованием способов их получения и контроля. Массовый выпуск и широкая номенклатура препаратов для бактериотерапии предполагает оптимизацию методических подходов при их контроле. Представляется рациональным комплексное решение данной задачи, которое включает унификацию методик контроля, разработку экономичных и эффективных питательных сред и ограничение их номенклатуры, исключение или ограничение применения патогенных и условно-патогенных тест-штаммов, разработку экспрессных способов контроля на основе современных методов биоиндикации. Исследования, связанные с оптимизацией контроля пробиотиков должны способствовать его адаптации к условиям массового производства препаратов, снижению- трудоемкости, продолжительности и материальных затрат на его проведение, и, следовательно, повышению эффективности.

Цель настоящего исследования - совершенствование методов контроля специфической активности препаратов пробиотического действия.

Основные задачи исследования:

1. Разработать унифицированный комплекс питательных сред на основе молочной сыворотки и дрожжевого аутолизата для контроля специфической активности пробиотиков.

2. Провести сравнительное изучение изо-, гомо- и гетероантагонистической активности производственных штаммов Escherichia coli M-17, Lactobacillus spp. с использованием теста отсроченного антагонизма на плотных питательных средах.

3. Разработать способы контроля антагонистической активности препаратов пробиотического действия без использования патогенных и условно-патогенных тест-штаммов.

4. Оценить возможность применения реакции ингибирования микробиолюминесценции для контроля антагонистической активности пробиотиков.

Научная новизна. Показана возможность использования питательной основы, включающей молочную сыворотку и дрожжевой аутолизат, в качестве

универсальной при конструировании

производственных штаммов Bifidobacterium bifidum 1, Е. coli М-17,

Lactobacillus spp. Экспериментально обосновано применение сывороточно-дрожжевых сред для проведения и унификации контроля специфической активности пробиотиков. Проведено комплексное изучение изо-, гомо- и гетероантагонистических свойств производственных штаммов на основе использования теста отсроченного антагонизма с применением различных плотных питательных сред. Установлено, что определение антагонистической активности пробиотиков, предусматривающее оценку изо- и/или гомоантагонизма, способствует увеличению информативности теста отсроченного антагонизма и позволяет ограничить применение патогенных и условно-патогенных тест-культур. Впервые предложено использовать реакцию угнетения микробиолюминесценции для экспресс-оценки антагонистической активности пробиотиков. Определены особенности и условия проведения микробиотестирования для различных препаратов, а также его преимущества в сравнении со способом отсроченного антагонизма.

Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований разработан производственный способ получения сывороточно-дрожжевой питательной основы, которая использована при создании унифицированного комплекса жидких, полужидких и плотных питательных сред, обладающих биологическими параметрами, необходимыми для контроля специфической активности пробиотиков. Предложена схема использования сывороточно-дрожжевых сред при контроле препаратов с учетом специфики определяемых параметров и культуральных свойств бактерий производственных штаммов. В рамках расширения сферы применения регламентированных питательных сред предложено использовать среду МРС для контроля ацилакта. Разработан способ контроля пробиотиков с использованием непатогенных культур в тесте отсроченного антагонизма на плотной питательной среде. Определена специфика проведения теста и количественные параметры оценки для каждого препарата и производственного штамма (Патент РФ №2177152). Предложен оригинальный экспресс-способ определения антагонистической активности препаратов для бактериотерапии на основе реакции угнетения биолюминесценции тест-штамма Е. coli lum+ С-50. Определены методические приемы проведения и количественные критерии оценки результатов теста (Патент РФ №2187801). Результаты исследований использованы при разработке нормативно-технической документации: Фармакопейная статья предприятия «Лактобактерин порошок», Регламент производства «Лактобактерин порошок», Изменение к Фармакопейной статье предприятия «Лактобактерин сухой», Изменение к Фармакопейной статье предприятия «Бифидумбактерин сухой». Подготовлены и утверждены

Фармакопейная статья предприятия 42-0028220301 «Колибактерин сухой» и Фармакопейная статья предприятия 42-0028220201 «Бификол сухой».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Унифицированный комплекс питательных сред на основе молочной сыворотки и дрожжевого аутолизата целесообразно применять для проведения контроля специфической активности пробиотиков.

2. Использование способа определения антагонистических свойств пробиотиков, включающего оценку изо- и гомоантагонистической активности, позволяет ограничить применение патогенных и условно-патогенных тест-культур при их контроле.

3. Для экспрессного определения антагонистической активности пробиотических препаратов целесообразно использование реакции ингибирования микробиолюминесценции.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Уфа, 2000; XIV Коми республиканской Молодежной научной конференции, Сыктывкар, 2000; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», посвященной 105-летию Пермского НПО «Биомед», Пермь, 2003. Диссертация апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед».

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ. Полученные результаты исследований защищены двумя Патентами РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 38 таблиц и 9 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 292 литературных источника, из них 172 отечественных и 120 зарубежных авторов, приложения.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории пробиотиков в соответствии с планом НИР филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» (номер государственной регистрации темы 01.200.1.08828).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В экспериментальных исследованиях использовали производственные штаммы бактерий:

М-17, L. acidophilus К3Ш24, L. acidophilus NK), L. acidophilus 100ЛШ; а также пробиотики на их основе: лактобактерин, колибактерин, бификол, бифидумбактерин, ацилакт производства «Пермского НПО «Биомед».

Для контроля антагонистической активности пробиотиков применяли патогенные и условно-патогенные тест-штаммы, полученные из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича: Shigella flexneri 337, S. flexneri 170, S. some 177b, E. coli 157, Proteus mirabilis 249, P. vulgaris 177, Staphylococcus aureus 209.

Изучение активности кислотообразования проводили титриметрическим методом, количество жизнеспособных клеток в одной дозе препарата определяли путем приготовления ряда десятикратных разведений на регламентированных жидких, полужидких и плотных питательных средах: МРС-1, МРС-2, МРС-4, обезжиренном молоке, модифицированной среде Блаурокка (производства «Пермского НПО «Биомед»); агаре Эндо (производства НПО «Питательные среды», Махачкала) (ФСП 42-0028208301, ФСП 42-0028208401, ФСП 42-0028212701, ФСП 42-0028220201, ФСП 420028220301). Антагонистическую активность пробиотиков определяли регламентированным методом перпендикулярных штрихов в тесте отсроченного антагонизма на плотных питательных средах Гаузе №2 и МРС-5.

Сывороточно-дрожжевую (СД) питательную основу изготавливали из молочной сыворотки (ТУ 9229-110-04610209-02) и дрожжевого аутолизата. При проведении физико-химического контроля в питательной основе определяли: содержание пептидов в реакции с биуретовым реактивом и содержание сухого остатка путем выпаривания согласно «Методическим указаниям по применению физико-химических методов контроля питательных сред» (М., 1977); содержание общего азота в реакции с реактивом Нссслера, содержание аминного азота формольным титрованием и рН потенциометрически согласно ФС 42-3874-99 «Физико-химические, химические, физические, иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов»; содержание хлоридов аргентометрическим методом по Мору согласно «Справочнику по микробиологическим и вирусологическим методам исследования» (М., 1982); содержание глюкозы О-толуидиновым методом согласно ФС 42-3539-98 «Питательная среда 199М (10-кратный концентрат), жидкая»; содержание лактозы рефрактометрическим методом (Горбатова, 1997) на рефрактометре ИРФ - 450Б (Россия).

Биологические параметры сывороточно-дрожжевой среды (показатель чувствительности, эффективности, скорости роста и стабильности основных свойств микроорганизмов) определяли в сравнении с регламентированными плотными, полужидкими и жидкими питательными средами согласно «Методическим рекомендациям к контролю питательных сред по биологическим показателям» (М., 1980).

При разработке способа определения антагонистической активности пробиотиков на основе реакции ингибирования микробиолюминесценции использовали Микробиолюминесцентный Индикатор Токсичности (МИТ), содержащий лиофилизированцую культуру люминесцентных бактерий штамма Е. coli lum+ С-50, разработанный в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН под руководством д.м.н., профессора Р.А. Пшеничнова.

Уровень подавления пробиотиками свечения МИТ определяли с помощью люминометра «Биотокс-6» и оценивали с помощью индекса антагонистической активности препарата (ИАА), численно равного проценту подавления свечения по сравнению с исходным уровнем. Обработку результатов производили согласно «Методическим рекомендациям по определению токсичности воды и водных экстрактов из объектов окружающей среды по интенсивности биолюминесценции бактерий» (М., 1996) путем расчета среднеарифметического значения из трех параллельных измерений (контроль-опыт) по формуле: ИАА=100х(Х1-Х2)/Х1 где X1-интенсивность биолюминесценции контрольной пробы, Х2- интенсивность биолюминесценции опытной пробы.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методами вариационной статистики (Ашмарин, Воробьев, 1962; Поляков, Соколова, 1975) с использованием программы Microsoft Excel for Windows 1998. Достоверность различий между группами оценивали с помощью непарного t-критсрия Стьюдента. Результаты представлены в виде среднего арифметического значения, его ошибки (М±т) и коэффициента корреляции (г).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Унификация набора питательных сред для определения параметров специфической активности препаратов

Современные условия производства пробиотиков диктуют необходимость развития элементов унификации на всех этапах их изготовления и контроля. Это касается и биоматериалов, к которым относятся бактериологические среды.

При конструировании унифицированного комплекса питательных сред для определения параметров специфической активности большой группы пробиотиков была изучена возможность использования молочной сыворотки, содержащей большое количество легкоусвояемых производственными штаммами бактерий источников углеводного питания, и дрожжевого аутолизата (Алексеева и др., 1986; Горбатова, 1997; Степаненко, 2000; Scudra, Blija, 1998). На первом этапе исследований необходимо было отработать способ

получения сывороточно-дрожжевой питательной основы, разработать составы и оценить качество питательных сред.

Приготовление питательной основы включало раздельную подготовку обоих компонентов и их соединение непосредственно перед стерилизацией (рис. 1). Предварительная обработка молочной сыворотки включала осветление (депротеинизацию) путем осаждения белков с последующим их отделением. Дрожжевой аутолизат готовили регламентированным способом (Регламент производства 705-97. Лактобактерин сухой).

Осветленная молочная сыворотка

Сывороточно-дрожжевая питательная основа

Рис. 1. Получение сывороточно-дрожжевой питательной основы.

Необходимый для удовлетворения ростовых потребностей производственных штаммов бактерий уровень аминного азота, составляющий (1,0±0,2) мг/мл, достигался при смешивании дрожжевого аутолизата с содержанием аминного азота (2,0±0,4) мг/мл и осветленной молочной сыворотки в соотношении 1: (2,5-3) соответственно.

При проведении физико-химического анализа сывороточно-дрожжевой питательной основы было установлено, что во всех сериях количество углеводов было достаточным для обеспечения энергетических потребностей микроорганизмов производственных штаммов бактерий: содержание лактозы составляло (3,79±0,18)%, глюкозы - (0,83±0,12)%.

При конструировании унифицированного комплекса сывороточно-дрожжевых (СД) сред полученная питательная основа рассматривалась в качестве постоянной (универсальной) части, переменная (специфичная) составляющая зависела от потребностей конкретного производственного

Аутолизат

штамма и контролируемого параметра специфической активности. Во всех вариантах сывороточно-дрожжевой среды рН с помощью 20% раствора NaOH доводили до (7,4+0,2) - оптимального значения для роста большинства микроорганизмов и активности фермента лактазы (Кислухина, Кюдулас, 1997). Стерилизацию проводили при температуре 112° в течение 30 мин с учетом общепринятого режима стерилизации питательных сред.

Для проведения сравнительных испытаний было приготовлено 27 серий среды СД с различным солевым составом и содержанием агара 0,075%, 0,12% и 2%. Биологические показатели жидких, полужидких и плотных сред СД изучались в сравнении с регламентированными питательными средами на модели определения количества живых бактерий в 1 дозе (КОЕ), активности кислотообразоваиия и антагонистической активности сухих препаратов и лиофилизированных культур штаммов, что позволило получить объективную оценку их пригодности для использования в данных видах контроля.

Было установлено, что сывороточно-дрожжевые среды не уступают по чувствительности и эффективности регламентированным питательным средам, обеспечивают стабильность морфологических, биохимических и культуральных свойств микроорганизмов (табл. 1,4).

Таблица 1

Уровень кислотообразования лакто- и бифидобактерий на жидких питательных средах

Сухой препарат, Активность кислотообразования, Т°

лиофилизированный Среда СД с содержанием Регламентированная

штамм агара 0,075% среда

Лактобактерин 252,15 ±5,29* 259,23 ±5,72'

1. /егтеыит 90Т-С4 260,70 ±6,00* 262,60 ±5,66'

I. рХаМагит 8Р-АЗ 258,70 ±7,00* 260,00 ±6,52'

Бифидумбактерин 111,69 ±2,83* 112,92 ± 2,752

В. Ь\рс1ит 1 118,30 ±4,73* 119,40±4,42г

Примечание. Здесь и в табл. 2, 3, * - р>0,05 по отношению к регламентированной питательной среде; 1 - среда МРС-1; 2 - модифицированная среда Блаурокка.

Морфология колоний и их количество на разработанных средах не отличались (р>0,05), а скорость роста в некоторых случаях превосходила аналогичный показатель на регламентированных питательных средах (табл. 2, 3, 5). Экспериментальным путем определен количественный и качественный состав переменной составляющей каждого варианта среды СД с учетом

Сравнительная характеристика плотных питательных сред по показателям чувствительности и скорости роста

колоний

Сухой препарат, лиофилизирован-ный штамм Среда СД с содержанием агара 2% Регламентированная среда

КОЕ/доза, млрд Время появления колоний, ч Морфология колоний КОЕ/доза, млрд Время появления колоний, ч Морфология колоний

Колибактерин 3,97+0,31» 24 Круглые, белые 4,01+0,251 24 Круглые красные с металлическим блеском

Е. соИ М-17 3,77+0,28* 24 Круглые, белые 3,85+0,23* 24 Круглые красные с металлическим блеском

Лактобактерин 2,11+0,05* 48 Выпуклые, непрозрачные, белые 2,09+0,042 48 Выпуклые, непрозрачные, белые

Ь. /егтепШт 90Т-С4 2,08+0,06* 48 Выпуклые, непрозрачные, белые 2,10+0,072 48 Выпуклые, непрозрачные, белые

Ь. р1ап1агит 8Р-АЗ 2,07+0,05* 48 Выпуклые, непрозрачные, белые 2,08+0, Об2 48 Выпуклые, непрозрачные, белые

Примечание. 1 - среда ЭНДО; 2 - среда МРС - 4.

потребностей конкретного производственного штамма и вида контроля.

Таблица 3

Сравнительная характеристика полужидких питательных сред по показателям чувствительности и скорости роста микроорганизмов

Сухой Среда СД с содержанием агара 0,12% Регламентированная среда

препарат, лиофилизи- КОЕ/ Время появле- Морфо- КОЕ/ Время появле- Морфо-

рованный доза ния логия доза ния логия

штамм колоний, ч колоний колоний, ч колоний

Бифидумбак-терин, х107 13,33± 4,35* 48-72 Гвоздики, крошки 12,08+ 3,87' 72-96 Гвоздики, крошки

В. bijidum 1, xlO7 2,80+ 1.11* 48-72 Гвоздики, крошки 2,16+ 0,74' 72-96 Гвоздики, крошки

Бификол, xlO7 6,56± 1,31* 72-96 Гвоздики, крошки 6,81+ 1,842 72-96 Гвоздики, крошки

Лактобакте-рин, xlO9 4,70+ 0,62* 24-48 Гвоздики, тяжи 4,50+ 0,693 24-48 Гвоздики, тяжи

L.fermentum 90Т-С4, xlO9 4,33± 0,85* 24-48 Гвоздики, тяжи 4,67± 0,763 24-48 Гвоздики, тяжи

L. plantarum 8P-A3, xlO9 4,89+ 0,65* 24-48 Гвоздики, тяжи 4,56+ 0,773 24-48 Гвоздики, тяжи

Примечание. 1 ~ модифицированная среда Блаурокка; 2 - модифицированная среда Блаурокка с азидом натрия; 3 - среда МРС-2.

Всего нами предложено 5 вариантов среды СД для контроля всех показателей специфической активности следующих препаратов: лактобактерина, бифидумбактерина, бификола, колибактерина, ацилакта и лиофилизированных культур штаммов для их изготовления (рис. 2).

Для унификации набора регламентированных питательных сред была изучена возможность использования среды МРС при контроле сухого ацилакта и лиофилизированных культур штаммов для его изготовления. В результате показана возможность использования среды МРС-1 для определения активности кислотообразования и среды МРС-2 для определения количества живых ацидофильных лактобактерий (КОЕ) в 1 дозе препарата и производственных штаммов

L. acidophilus 100АШ. Были выявлены преимущества среды МРС перед регламентированой питательной средой: более точное определение КОЕ за счет возможности подсчета количества колоний, упрощение процесса титрования

из-за отсутствия необходимости предварительного разбивания сгустка, образующегося на обезжиренном молоке (табл. 4,5).

Рис. 2. Область применения комплекса сывороточно-дрожжевых питательных сред.

Таблица 4

Уровень кислотообразования ацидофильных лактобактерий на жидких

питательных средах

Сухой препарат, Активность кислотообразования, T°

лиофилизированный СД с содержанием МРС-1 Обезжиренное

штамм агара 0,075% молоко

Лцилакт 244,69 ± 4,674 243,38 + 6,72* 256,15 ±5,31

L. acidophilus КзЩм 256,90 ± 8,38*# 257,00 ±8,38* 264,40 ±8,00

L. acidophilus NKi 256,60 ± 6,50*# 258,50 ±7,53* 263,70 ±6,80

L. acidophilus 100А1И 246,10 ± 5,86*# 247,20 ±6,13» 253,70 ±6,34

Примечание. Здесь и в табл. 5, * - р>0,05 по отношению к обезжиренному молоку; # - р>0,05 по отношению к среде МРС.

Сравнительная характеристика питательных сред по показателям чувствительности и скорости роста

ацидофильных бактерий

Сухой препарат, лиофилизированный штамм СД с содержанием агара 0,12% МРС-2 Обезжиренное молоко

КОЕ/ доза, х 107 Время появления колоний, ч Морфология колоний КОЕ/ доза, х107 Время появления колоний, ч Морфология колоний КОЕ/ доза, х 107 Время появления сгустка, ч

Ацилакт 17,82+ 6,32*# 48-72 Крошки, клубочки 18,45+ 6,81* 48-72 Крошки, клубочки 17,55+ 5,87 72-96

L. acidophilus К3Ш24 13,00± 4,71 *# 48-72 Крошки, клубочки 14,87+ 5,22* 48-72 Крошки, клубочки 14,07+ 4,53 72-96

L. acidophilus NKi 12,25+ 4,47*# 48-72 Крошки, клубочки 14,00+ 4,96* 48-72 Крошки, клубочки 13,25+ 4,32 72-96

L acidophilus 100АШ 13,79+ 4,99*# 48-72 Крошки, клубочки 15,86+ 5,51* 48-72 Крошки, клубочки 14,93+ 4,78 72-96

Оптимизация теста отсроченного антагонизма на плотной питательной среде

Объектами унификации при производстве препаратов для бактериотерапии, наряду с питательными средами, могут стать методики контроля. Одним из нормируемых показателей специфической активности и важным критерием качества пробиотических препаратов и производственных штаммов бактерий для их изготовления является уровень и спектр антагонизма в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры (Куваева, Кузнецова, 1993). Однако, определение этих показателей в производственных условиях предусматривает использование нерационально большого количества тест-штаммов, работа с которыми трудоемка и требует специальных условий.

Данный раздел нашей работы был связан с изучением возможности ограничения использования патогенных и условно-патогенных тест-культур при определении антагонистической активности пробиотиков. С этой целью проведено сравнительное изучение антагонизма препаратов в отношении непатогенных и патогенных тест-штаммов на регламентированных питательных средах с применением утвержденных методик проведения теста отсроченного антагонизма для каждого препарата. Одновременно, для более полной оценки эффективности среды СД и изучения возможности унификации набора питательных сред, нами была изучена изо-, гомо- и гетероантагонистическая активность пробиотиков на плотном варианте сывороточно-дрожжевой среды (СД-4).

С целью выявления возможных отличий в биологической активности, которые могли быть вызваны различиями в процессе получения, было проведено раздельное исследование изо-, гомо- и гетероантагонизма лиофилизированных культур штаммов и сухих препаратов на их основе. В результате проведенных исследований на образцах 10 коммерческих серий каждого препарата и производственного штамма установлено, что различия в технологии их получения не оказывают выраженного влияния па уровень и спектр антагонизма (табл. 6). Гетероантагонистическая активность пробиотиков в отношении тест-штаммов различной таксономической принадлежности выражена сильнее по сравнению с антагонизмом внутри вида или рода.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности плотного варианта сывороточно-дрожжевой среды СД-4: показатели изо- и гетероантагонизма лактобактерина, колибактерина и бификола на регламентированных средах коррелировали с аналогичными показателями на среде СД-4 (г>0,7) и не имели от них достоверных отличий (р>0,05). В то же время питательная среда СД-4 явилась более адекватным субстратом для постановки теста отсроченного антагонизма ацидофильных лактобактерий по сравнению с регламентированной средой МРС-5 (табл. 7).

Антагонистическая активность штамма М-17 на среде Гаузе №2 и СД-4

Зона задержки роста тест-штаммов, мм

Тест- Гаузе №2 СД-4

штамм Сухой препарат (колибак-терин) Сухой препарат (бификол) Лиофилизиро-ванная культура штамма Сухой препарат (колибах-терин) Сухой препарат (бификол) Лиофилизиро-ванная культура штамма

S. sonnei 1776 18,27 ±0,25 17,73 ±0,41 17,90 ±0,64 18,10 ±0,33# 18,03 ± 0,3 6# 18,10 ±0,51#

S.flexneri ЪУ1 18,33 ±0,23 17,77 ±0,41 18,47 ±0,68 19,00 ±0,ЗОЯ 18,70±0,43# 18,80±0,59#

S.flexneri 170 18,87 ±0,32 17,60 + 0,43 17,57 ±0,48 18,17 ±0,33# 18,50±0,43# 17,90 ± 0,48 #

Е. coli 157 18,20 ±0,32 17,33 + 0,41 17,60 ±0,39 18,53 ±0,3 8# 18,30± 0,41# 18,40±0,69#

Р. vulgaris 177 17,67 ±0,31 17,10 ±0,38 17,40 ±0,44 18,93 ± 0,31# 18,33 ±0,39# 18,80±0,46#

Р. mirabilis 249 17,93 ±0,33 17,40 ±0,32 17,33 ±0,46 19,13 ± 0,34# 18,60 ± 0,44# 18,73 ±0,53#

Е. coli М-17 17,07±0,24## 16,53 ±0,20## 17,13 ±0,34## 15,90±0,34»# 15,47 ±0,39*# 15,90 ±0,39*#

Примечание. Здесь и в табл. 7, * - р<0,05 по отношению к патогенным штаммам; # - р>0,05 по отношению к антагонизму на регламентированной питательной среде; ## - р>0,05 по отношению к патогенным штаммам.

Антагонистическая активность производственных штаммов ацидофильных лактобактерий на среде МРС-5 и

СД-4

Зона задержки роста тест-штаммов, мм

Тест- МРС-5 СД-4

штамм L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus

К3Ш24 НК, 100АШ к3ш24 НК, 100АШ

51 sonnei 1776 16,77 ±0,29 17,00 ±0,42 16,70 ±0,45 21,60 ±0,52** 21,70 ±0,64** 21,30 ±0,43**

S.flexneri 337 16,80 ±0,31 16,70 ±0,35 16,80 ±0,50 21,77 ±0,44** 21,60 ±0,49** 21,60 ±0,42**

S.flexneri 170 16,70 ±0,38 17,00 ±0,53 16,77 ±0,32 21,50 ±0,43** 21,60 ±0,42** 21,20±0,40**

Е. coli 157 16,70 ±0,32 16,90 ±0,41 16,80 ±0,42 21,60 ±0,48** 21,53 ±0,45** 21,60 ±0,44**

P. vulgaris 177 16,60 ±0,47 16,80 ±0,34 16,67 ±0,22 21,50 ±0,48** 21,60 ±0,33** 21,10 ± 0,49**

P. mirabilis 249 16,90 ±0,58 17,00 ±0,64 16,83 ±0,36 21,37 ±0,54** 21,47 ±0,36** 21,50 ±0,60**

S. aureus 209 16,63 ±0,27 16,90 ±0,44 16,60 ±0,40 21,43 ±0,51** 21,43 ±0,50** 21,60±0,63**

L acidophilus К3Ш24 16,13 ±0,25 ## 16,03 ±0,2 6W 16,07 ±0,23## 16,10 ±0,29#* 16,60 ±0,39#* 16,30 ±0,36#*

L. acidophilus HKi 16,10 ±0,32## 15,90±0,24## 16,20±0,33## 16,20 ± 0,31#* 16,50 + 0,40#* 16,27 ±0,33#*

L. acidophilus 100АШ 16,10 ±0,31## 15,90 ± 0,22## 16,10 ±0,32## 16,40 ±0,35#* 16,50±0,32#* 16,30±0,39#*

Примечание. ** - р< 0,05 по отношению к антагонизму на регламентированной питательной среде.

Показана возможность использования среды СД-4 при контроле специфической активности в тесте отсроченного антагонизма, установлены количественные показатели изо- и/или гомоантагонистической активности для каждого производственного штамма и препарата на его основе для регламентированных питательных сред и среды СД-4.

Полученные данные свидетельствуют, что антагонистические свойства препаратов могут быть оценены без применения патогенных тест-культур. Определение антагонистической активности пробиотиков, основанное на эффекте изо- и/или гомоантагонизма, предложено использовать как основной способ для контроля коммерческих серий препаратов и как дополнительный для контроля производственных штаммов, что позволяет ограничить применение патогенных и условно-патогенных культур.

Определение антагонистической активности пробиотиков с помощью теста ингибирования биолюминесценции

Существующие методы контроля биологических показателей препаратов пробиотического действия отличаются значительной продолжительностью. Для разработки экспрессного способа определения антагонистической активности пробиотиков представлялось целесообразным использовать реакцию ингибирования микробиолюминесценции. Подавление свечения тест-штамма Е. coli lum+ C-50 (МИТ) пробиотиком оценивали как проявление антагонизма и выражали в виде индекса антагонистической активности (ИАА), численно равного проценту снижения микробиолюминесценции.

Для выявления зависимости результата от исходной концентрации клеток в исследуемом пробиотике, определение ИАА проводили для цельного препарата и разведенного в 2, 5 и 10 раз. Для выбора оптимальной продолжительности проведения теста измерение ИАА проводилось через различные промежутки времени: 5, 30 минут, 1, 2, 4, 6 и 24 часа. Для определения влияния пробиотических препаратов на выживаемость МИТ параллельно проводили его посев на питательную среду Эндо.

В результате исследований определены закономерности воздействия пробиотиков на МИТ в тесте ингибирования биолюминесценции. Выявлено прямо пропорциональное влияние концентрации препарата в пробе (цельный или разведенный) и продолжительности экспозиции на уровень свечения МИТ для каждого пробиотика. Величина индекса антагонистической активности препаратов и количество КОЕ МИТ находились в сильной обратной зависимости, а ингибирование свечения выявлялось, в целом, раньше и предшествовало последующему отмиранию индикаторных клеток (рис. 3).

Для всех препаратов установлена прямая сильная корреляция между количественными показателями ИАА в период от 30 мин до 2 ч и результатами

Рис. 3. Динамика ингибирования биолюминесценции и отмирания индикаторных клеток при контакте МИТ с: а) ацнлактом; б) лактобактерином на основе штамма L. fermentum 90T-C4; в) тем же на основе штамма L. plantarum 8P-A3.

отсроченного антагонизма в отношении Е. coli lum+ С-50 на плотных питательных средах. Высокий уровень корреляции подтверждает возможность использования теста ингибирования биолюминесценции для экспресс-оценки антагонистических свойств пробиотиков, а также позволяет установить единые для всех препаратов временные параметры его проведения (в течение 2 ч) и количественные критерии оценки (табл. 8).

Таблица 8

Критерии оценки уровня антагонистической активности пробиотиков в тесте ннгибирования микробиолюминесценции

Уровень антагонистической активности препарата Угнетение люминесценции МИТ, (ИАА)

Продолжительность совместной экспозиции, ч

0,5 2

Высокий >70 >80

Средний 50-70 60-80

Низкий <50 <60

Преимуществами разработанного способа являются: отсутствие необходимости применения питательных сред и патогенных тест-штаммов, кратковременная совместная экспозиции препарата и тест-культуры, учет влияния исходной концентрации клеток и метаболитов в исследуемом препарате.

В заключении следует отметить, что результаты наших исследований по унификации набора питательных сред, ограничению использования патогенных тест-штаммов, разработке экспрессных методов контроля способствуют решению актуальной задачи оптимизации контроля пробиотиков в условиях их массового производства.

ВЫВОДЫ

1. Отработан способ получения питательной основы, содержащей молочную сыворотку и дрожжевой аутолизат. Показана возможность ее использования при конструировании бактериологических сред для контроля специфической активности пробиотиков.

2. Разработан унифицированный комплекс сывороточно-дрожжевых питательных сред и схема его применения для определения биологических показателей препаратов: количества живых микроорганизмов в дозе препарата, активности кислотообразования и антагонистической активности.

3. В рамках исследования по унификации набора питательных сред для

контроля лактосодержащих пробиотиков предложено использовать среду МРС для определения специфической активности ацилакта.

4. Разработан способ контроля антагонистической активности препаратов пробиотического действия на основе теста отсроченного антагонизма на плотной питательной среде с применением непатогенных тест-культур, позволяющий ограничить использование патогенных и условно-патогенных штаммов.

5. Разработан экспрессный метод оценки антагонистической активности пробиотиков на основе теста ингибирования микробиолюминесценции. Определены временные параметры его проведения и количественные критерии оценки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Несчисляев В.А., Рагузина СВ., Арчакова Е.Г. К вопросу определения антагонистической активности эубиотиков//В кн.: Современная вакцинология: Тез. докл. II Международной конференции. - Пермь, 1998. - С. 142-143.

2. Несчисляев В.А., Арчакова Е.Г., Чистохина Л.П., Фадеева И.В. Модификация метода оценки in vitro антагонистической активности колибактерина//В кн.: Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Труды Всерос. конф. - Уфа, 2000. - С. 186-188.

3. Несчисляев В.А., Арчакова Е.Г. Новые подходы к методу оценки антагонистической активности пробиотиков in vitro//XIV Рсспуб. молод. научн. конф.: Тез. докл.— Сыктывкар, 2000. - Т. 1. - С. 107.

4. Несчисляев В. А., Арчакова Е.Г. Метод оценки антагонистической активности производственных штаммов ацидофильных лактобактерий в тесте отсроченного антагонизма in vitro//B кн.: Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы: Материалы юбилейной межвузовской научно-практической конференции ПГФА. - Пермь, 2001 г. - С. 165.

5. Несчисляев В.А., Фадеева И.В., Арчакова Е.Г. Исследование штаммосовместимости лактобактерий при разработке технологии комплексного пробиотика//В кн.: Пробиотические микроорганизмы -современное состояние вопроса и перспективы использования: Материалы междунар. научно-практической конф. памяти Г.И. Гончаровой. Сборник материалов конференции. Москва - 2002.- С. 70.

6. Арчакова Е.Г. Разработка критериев оценки антагонистической активности лактобактерина в тесте ингибирования биолюминесценции//В кн.: Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке: Материалы конф. - Пермь, 2003.-С. 283-286.

7. Несчисляев В.А., Лрчакова Е.Г., Павленко И.В., Скудаева Л.К. Новые питательные среды для контроля специфической активности пробиотиков//Там же.-С. 280-283.

8. Арчакова Е.Г., Несчисляев В.А. Оценка эффективности применения новой питательной среды для контроля антагонистической активности пробиотиков//Объединенный медицинский журнал. -№ 2(5). - 2004. - С. 93-94.

9. Несчисляев В.А., Арчакова Е.Г., Чистохина Л.П., Фадеева И.В. и др. Способ контроля антагонистической активности препаратов для лечения и профилактики дисбактериозов. Патент на изобретение РФ №2177152 от 20.12.2001. Заявка № 99125560. Приоритет № 99125560/14 от 02.12.1999г. Бюл. №35.

10. Несчисляев В.А., Пшеничное Р.А., Арчакова Е.Г., Чистохина Л.П., Фадеева И.В. Способ определения антагонистической активности пробиотиков. Патент на изобретение №2187801 от 20.08.2002г. Заявка № 2000118391. Приоритет № 2000118391/14 от 10.07.00г. Бюл. №23.

АРЧАКОВА Елена Геннадьевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОБИОТИКОВ

Автореферат

Лицензия ПД-11-0002 от 15.12.99.

Подписано в печать 17.05.2004. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,5 Формат 60X90/16. Набор компьютерный. Заказ № 380/2004

Отпечатано на ризографе в отделе Электронных издательских систем ОЦНИТ Пермского государственного технического университета 614600, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к. 113, т.(3422) 198-033

P1129Z

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Арчакова, Елена Геннадьевна

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1. Дисбиотические состояния и способы их коррекции, методы определения антагонистической активности пробиотиков.

1.2. Питательные потребности производственных штаммов бактерий для получения пробиотических препаратов.

1.3. Феномен биолюминесценции, люминесцентные микробиотесты и сфера их применения.

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования.

ГЛАВА 3. Унификация набора питательных сред для определения параметров специфической активности препаратов.

3.1. Получение и физико-химические параметры сывороточно-дрожжевой питательной основы

3.2. Изучение ростовых свойств полужидких вариантов среды

3.2.1. Использование полужидких вариантов среды СД при определении количества жизнеспособных бифидобактерий в дозе препарата.

3.2.2. Использование полужидких вариантов среды СД при определении количества жизнеспособных лактобактерий в дозе препарата.

3.3. Изучение ростовых свойств плотных вариантов среды С Д.

3.4. Использование жидкого варианта среды СД в тесте определения активности кислотообразования пробиотиков.

ГЛАВА 4. Оптимизация теста отсроченного антагонизма на плотной питательной среде.

4.1. Изучение изо-, гомо- и гетероантагонизма колибактерина и бификола на различных плотных питательных средах.

4.2. Изучение изо-, гомо- и гетероантагонизма лактобактерина на различных плотных питательных средах.

4.3. Изучение изо-, гомо- и гетероантагонизма ацилакта на различных плотных питательных средах.

ГЛАВА 5. Определение антагонистической активности пробиотиков с помощью теста ингибирования биолюминесценции

5.1. Определение чувствительности штамма Е. coli lum+ С-50 в тесте отсроченного антагонизма на плотной питательной среде.

5.2. Определение влияния пробиотиков на биолюминесценцию рекомбинантного тест-штамма.

5.2.1. Определение ИАА лактобактерина.

5.2.2. Определение ИАА бифидумбактерина.

5.2.3. Определение ИАА ацилакта.

5.2.4. Определение ИАА колибактерина.

5.2.5. Определение ИАА бификола.

5.3. Разработка критериев оценки теста ингибирования биолюминесценции для определения уровня антагонистической активности пробиотиков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование методов контроля специфической активности пробиотиков"

Актуальность проблемы

Организм человека и его нормальная микрофлора являются единой, сложной, строго сбалансированной экологической системой, которая формируется с момента рождения. В настоящее время в связи с неблагоприятной социально-экономической и экологической обстановкой, возрастанием количества стрессовых ситуаций, гипо- и авитаминозов, нерациональной антибиотико-, гормоно- и химиотерапией, неполноценным и нерациональным питанием отмечается неуклонный рост числа заболеваний, связанных с нарушением биологического равновесия между макроорганизмом и разнообразными популяциями микробной флоры его отдельных органов и с систем (12, 132, 176).

С целью профилактики и лечения дисбактериозов в медицинской практике используют биопрепараты, изготавливаемые из живых микроорганизмов, являющихся представителями нормальной микрофлоры кишечника человека: кишечной палочки (колибактерин, бификол), бифидобактерий (бифидумбактерин, бифидумбактерин форте, бифилиз), лактобактерий (лактобактерин, ацилакт, аципол). Живые антагонистически активные бактерии содержатся в препаратах пробиотического действия как в виде монокультур, так и в различных комбинациях, чаще всего в лиофильно высушенном состоянии (38, 129).

Практика применения пробиотиков из различных штаммов показала их положительное влияние на восстановление кишечного и вагинального микробиоценоза и повышение общей резистентности макроорганизма (12, 23, 37, 62, 208, 261).

Широкое распространение дисбактериозов и успешное применение пробиотиков при их лечении стимулирует увеличение объемов выпуска последних. Современное производство препаратов пробиотического действия развивается в направлении интенсификации и предполагает усовершенствование методов их контроля, что может быть осуществлено за счет комплексного подхода, направленного на снижение трудоемкости и материальных затрат при сохранении эффективности. Существующие методы контроля биологических показателей препаратов пробиотического действия базируются на использовании различных питательных сред, большого количества патогенных, и условно-патогенных тест-штаммов, а также отличаются значительной продолжительностью.

Для сферы контроля препаратов актуально создание унифицированного комплекса питательных сред, пригодных для определения всех параметров специфической активности (количество жизнеспособных клеток в 1 дозе, активность кислотообразования, уровень антагонистической активности) препаратов пробиотического действия: лакто-, бифидум-, колибактерина, бификола и ацилакта. Это будет способствовать оптимизации их контроля за счет ограничения номенклатуры используемых питательных сред.

При отборе штаммов микроорганизмов для изготовления пробиотиков особое внимание уделяют спектру и уровню их антагонистической активности (36). Однако, определение этих показателей в производственных условиях предусматривает использование нерационально большого количества патогенных и условно-патогенных тест-штаммов, работа с которыми трудоемка и требует специальных условий. Повышение эффективности контроля при сохранении адекватности и снижение материальных затрат на его проведение в данном случае может быть достигнуто благодаря исключению или ограничению применения указанных тест-штаммов.

Оптимизация контроля препаратов пробиотического действия также может базироваться на применении современных методов биоиндикации, в частности, микробиолюминесценции. Перспективной представляется разработка универсального и экспрессного метода с использованием в качестве тест-штамма культуры светящихся энтеробактерий, позволяющего оценить параметры антагонистической активности пробиотиков по степени ингибирования биолюминесценции.

Таким образом, учитывая важность повышения эффективности производства бактерийных препаратов, представляется актуальным решение вопросов, связанных с оптимизацией и унификацией контроля их биологических показателей.

Цель работы

Совершенствование методов контроля специфической активности препаратов пробиотического действия.

Основные задачи исследования

2. Провести сравнительное изучение изо-, гомо- и гетероантагонистической активности производственных штаммов Escherichia coli М-17, Lactobacillus spp. с использованием теста отсроченного антагонизма на плотных питательных средах.

Научная новизна и практическая значимость работы

Изучены изо-, гомо и гетероантагонизм производственных штаммов бактерий в тесте отсроченного антагонизма на плотных питательных средах. Определена специфика проведения теста и количественные критерии оценки изоантагонистической активности для каждого штамма и препарата на его основе. Предложен способ контроля антагонизма пробиотиков, ограничивающий применение патогенных и условно-патогенных тест-штаммов.

Разработан оригинальный экспресс-способ определения антагонистической активности препаратов для бактериотерапии на основе реакции угнетения биолюминесценции генно-инженерного тест-штамма Escherichia coli lum+ С-50. Определены методические приемы проведения и количественные критерии оценки результатов теста. Показана его более высокая информативность по сравнению с тестом отсроченного антагонизма, а также высокая корреляция результатов обоих методов. Проведенные исследования способствуют расширению сферы использования люминесцентного микробиотестирования.

Разработан состав и способ получения питательной основы для бактериологических сред, включающей молочную сыворотку и дрожжевой аутолизат. Показана возможность использования данной основы в качестве универсальной при конструировании питательных сред для культивирования лакто-, бифидобактерий и кишечных палочек.

Разработан унифицированный комплекс сывороточно-дрожжевых (СД) питательных сред, включающий жидкие, полужидкие и плотные варианты, для определения показателей специфической активности пробиотиков: количества жизнеспособных бактерий в 1 дозе препарата, активности кислотообразования, антагонистической активности.

Предлагаемый набор сред по показателям эффективности не уступает, а в некоторых случаях превосходит регламентированные питательные среды, удовлетворяет ростовые потребности производственных штаммов бактерий, обеспечивает стабильность их морфологических, биохимических и культуральных свойств.

С целью унификации набора регламентированных питательных сред для контроля лактосодержащих препаратов показана возможность использования вариантов среды МРС при определении параметров специфической активности ацилакта.

Результаты научной работы использованы при разработке НД на лактобактерин порошок, лактобактерин сухой и бифидумбактерин сухой. Подготовлены и утверждены ФСП 42-0028220201 на бификол сухой и ФСП 42-0028220301 на колибактерин сухой.

По результатам исследований получены патенты РФ: «Способ определения антагонистической активности пробиотиков» №2187801, приоритет от 10.07.00 г. и «Способ контроля антагонистической активности препаратов для лечения и профилактики дисбактериозов» №2177152 приоритет от 02.12.1999 г.

Основные положения, выдвигаемые на защиту

Связь работы с научными программами

Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории пробиотиков в соответствии с планом НИР филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» и является частью исследований, проводимых по теме «Оптимизация методов контроля специфической активности пробиотиков» (номер государственной регистрации темы 01.200.1.08828).

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Уфа, 2000; XIV Коми республиканской Молодежной научной конференции, Сыктывкар, 2000; Всероссийской научной конференции, «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», посвященной 105-летию Пермского НПО «Биомед», Пермь, 2003.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 38 таблиц и 9 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 292 литературных источника, из них 172 отечественных и 120 зарубежных авторов, приложения.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Арчакова, Елена Геннадьевна

ВЫВОДЫ

3. В рамках исследования по унификации набора питательных сред для контроля лактосодержащих пробиотиков предложено использовать среду МРС для определения специфической активности ацилакта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Отмечающийся в настоящее время неуклонный рост числа заболеваний, связанных с нарушением биологического равновесия между макроорганизмом и его микробной флорой, предполагает значительное увеличение выпуска препаратов пробиотического действия (132, 177). В условиях укрупнения масштабов и необходимости повышения эффективности производства пробиотиков является актуальным решение вопросов, связанных с оптимизацией контроля и направленных на снижение трудоемкости и материальных затрат при его проведении.

При массовом выпуске и широкой номенклатуре препаратов пробиотического действия представляется рациональным развитие элементов унификации на всех этапах их производства. На стадии контроля это может осуществляться в виде комплексного подхода, который включает унификацию методик контроля, разработку экономичных питательных сред и ограничение их номенклатуры, исключение или уменьшение применения патогенных тест-штаммов, разработку экспрессных методов контроля.

Первый раздел наших исследований был посвящен разработке унифицированного комплекса сывороточно-дрожжевых (СД) питательных сред, содержащих молочную сыворотку и дрожжевой аутолизат.

Производственные штаммы бактерий для изготовления пробиотиков характеризуются сложными питательными потребностями, что определяет необходимость применения многокомпонентных сред для их культивирования (35, 61, 282). В состав сред должны входить ингредиенты, богатые аминокислотами и витаминами, например дрожжевой аутолизат, традиционно широко применяемый в производстве пробиотиков (1, 4, 95). Наиболее важным источником энергии для микроорганизмов являются моно- и дисахариды — глюкоза, лактоза, сахароза (35, 189, 239, 250).

Нашей задачей явилось изучение и экспериментальное обоснование возможности использования, наряду с аутолизатом, молочной сыворотки, содержащей легкоусвояемые источники углеводного питания и другие трофические компоненты, при конструировании питательных сред для контроля биологических показателей препаратов пробиотического действия. Выбор данного вида сырья базировался на имеющихся в литературе сообщениях по различным аспектам использования сыворотки в бактериологическом производстве: в процессе микробного синтеза и культивирования микроорганизмов, в составе криопротекторов и защитных сред для лиофильного высушивания, а также в виде добавок в питательную среду для хранения штаммов (101, 102, 159).

В нашей работе молочная сыворотка и дрожжевой аутолизат были использованы при конструировании питательных сред для контроля всех параметров специфической активности большой группы препаратов: •лактобактерина, бифидумбактерина, колибактерина, бификола и ацилакта. Необходимо было отработать технологию получения сывороточно-дрожжевой питательной основы, разработать составы и оценить качество питательных сред. Предварительный анализ показал, что молочная сыворотка отвечает требованиям доступности, стандартности и биологической ценности. Являясь побочным продуктом переработки молока, она содержит большое количество белковых азотистых соединений, углеводов, липидов, минеральных солей, витаминов, органических кислот, ферментов, микроэлементов (34, 49, 136, 157). Наличие в молочной сыворотке большого количества лактозы делает ее ценным источником углеводного питания для различных видов бактерий.

Начальным этапом этого раздела исследований стала отработка температурного режима и рН осаждения белков молочной сыворотки при подготовке данного компонента питательной основы. Предварительная обработка молочной сыворотки включала осветление (депротеинизацию) путем осаждения белков с последующим их отделением от жидкой фазы: рН сыворотки доводили до (7,4+0,2), затем кипятили в течение 15 мин, декантировали и сепарировали.

Были изучены физико-химические характеристики 12 серий нативной и обработанной молочной сыворотки: определяли содержание аминного азота (АА) и хлоридов. В результате исследований было установлено, что исходное содержание АА в молочной сыворотке было непостоянно и связано с различными факторами (время года, предприятие-изготовитель), хлориды являлись более постоянной величиной.

Концентрация АА оказывает существенное влияние на ростовые свойства питательных сред: содержание его менее 0,8 мг/мл снижает эффективность последних, а оптимальное содержание АА, исходя из потребностей производственных штаммов бактерий, составляет (1,0+0,2) мг/мл. Необходимый уровень АА достигался при смешивании дрожжевого аутолизата с содержанием АА (2,0±0,4) мг/мл с осветленной молочной сывороткой в соотношении 1: (2,5-3) соответственно. Приготовление питательной основы включало раздельную подготовку обоих компонентов и их соединение непосредственно перед изготовлением питательной среды.

При проведении физико-химического анализа 8 серий сывороточно-дрожжевой питательной основы определяли следующие показатели: содержание пептидов, сухого остатка, общего азота, аминного азота, хлоридов, глюкозы, лактозы и рН. Установлено, что во всех сериях определялось стабильное содержание лактозы - (3,79±0,18)%, содержание глюкозы колебалось от 0,6 до 1,5% в зависимости от партии молочной сыворотки. Т.о., общее содержание углеводов было достаточным для обеспечения энергетических потребностей микроорганизмов производственных штаммов бактерий.

Конструирование унифицированного комплекса сред базировалось на следующем методическом подходе: полученная питательная основа, включающая аутолизат дрожжевой и молочную сыворотку, рассматривалась в качестве постоянной (универсальной) части вариантов сывороточно-дрожжевых сред. Переменная (специфичная) составляющая зависела от потребностей конкретного производственного штамма и контролируемого параметра специфической активности. Варианты питательных сред были исследованы по биологическим показателям: эффективности, чувствительности и ростовым характеристикам в сравнении с регламентированными средами.

Для проведения сравнительных испытаний было приготовлено 27 серий вариантов среды СД с различным солевым составом и содержанием агара от 0,075% до 2%. Биологические показатели вариантов среды СД изучались на модели определения количества живых бактерий в 1 дозе (КОЕ) сухих препаратов и лиофилизированных культур штаммов согласно регламентированной для каждого методике путем приготовления ряда десятикратных разведений с последующим постинкубационным подсчетом колоний в максимальном разведении, в котором обнаружен рост бактерий -для полужидких вариантов, или с последующим высевом микробной суспензии на чашки Петри и постинкубационным подсчетом числа выросших колоний — для плотных вариантов.

Одновременно эффективность плотных вариантов среды СД изучалась в тесте отсроченного антагонизма пробиотиков, что позволило дать объективную всестороннюю оценку их пригодности для использования в данных видах контроля.

Биологические показатели жидких вариантов среды СД изучались нами на модели определения активности кислотообразования сухих препаратов и лиофилизированных культур производственных штаммов титриметрическим методом по регламентированной для каждого препарата методике.

Результаты апробации показали, что сывороточно-дрожжевые питательные среды не уступают по чувствительности и эффективности регламентированным питательным средам, обеспечивают стабильность морфологических, биохимических и культуральных свойств микроорганизмов. Количество колоний и их морфология на разработанной среде не отличались, а скорость роста в некоторых случаях превосходила аналогичный показатель на регламентированных питательных средах.

В результате проведенных исследований изучено влияние на рост и развитие микроорганизмов отдельных компонентов среды СД. Экспериментальным путем определен количественный и качественный состав переменной составляющей каждого варианта питательной среды с учетом потребностей конкретного производственного штамма и вида контроля. Всего нами предложено 5 вариантов среды СД:

1) жидкая среда СД-1, содержащая 0,075% агара, 0,05 г/л сульфата марганца, 2 г/л цитрата аммония, 2,5 г/л ацетата натрия и 2 г/л гидрофосфата калия - для контроля активности кислотообразования лактобактерина, ацилакта и бифидумбактерина;

2) полужидкая среда СД-2, содержащая 0,12% агара - для определения КОЕ в 1 дозе лактобактерина, ацилакта и бифидумбактерина;

3) полужидкая среда СД-2А, содержащая дополнительно 0,1 г/л азида натрия для подавления роста кишечной палочки - для определения КОЕ бифидобактерий в 1 дозе бификола;

4) плотная среда СД-3, содержащая 2% агара, 0,48 г/л динатрия фосфата, 0,83 г/л натрия сульфита и 0,03 г/л натрия карбоната - для определения КОЕ в 1 дозе колибактерина;

5) плотная среда СД-4, содержащая 2% агара - для определения уровня антагонистической активности лактобактерина, ацилакта, колибактерина и бификола в тесте отсроченного антагонизма методом поперечных штрихов, а также КОЕ в 1 дозе лактобактерина.

Результаты исследований использованы при разработке НД на лактобактерин порошок, лактобактерин сухой и бифидумбактерин сухой. Предусмотрено использование среды СД-1 при определении активности кислотообразования лактобактерина порошка; среды СД-2 - для определения количества живых лактобактерий в дозе препарата; среды СД-4 - для оценки уровня антагонистической активности производственного штамма лактобактерий методом отсроченного антагонизма.

В рамках исследования по унификации набора известных регламентированных питательных сред была изучена возможность использования вариантов среды МРС при контроле сухого ацилакта и лиофилизированных культур штаммов для его изготовления.

В результате проведенного изучения биохимической активности ацидофильных лактобактерий на модели определения кислотообразования ацилакта и производственных штаммов показана возможность использования среды МРС-1 для определения данного параметра: результаты достоверно не отличались (р>0,05) от значений, полученных на регламентированной питательной среде (обезжиренном молоке), и во всех случаях отвечали требованиям НД. Одновременно снижалась трудоемкость контроля за счет упрощения процесса титрования образцов 0,1N раствором натрия гидроксида из-за отсутствия необходимости предварительного разбивания сгустка, образующегося на обезжиренном молоке.

При изучении чувствительности среды МРС-2 на модели определения живых ацидофильных лактобактерий (КОЕ) в 1 дозе препарата были выявлены ее преимущества перед регламентированой питательной средой - более точное определение выживаемости из-за возможности подсчета количества колоний, тогда как на регламентированной среде (обезжиренном молоке) образуется сгусток, а вычисление КОЕ в дозе производится по специальной таблице, усредняющей показатели (155).

Предложенный вариант контроля биологических показателей сухого ацилакта и лиофилизированных культур штаммов для его изготовления, включающий применение вариантов среды МРС, отличается от регламентированного большей точностью и простотой.

Следующим разделом наших исследований явилось изучение возможности оптимизации метода отсроченного антагонизма на плотных питательных средах с целью исключения или уменьшения использования патогенных и условно-патогенных тест-штаммов.

В литературе широко освещена природа антагонизма бактерий, его механизм, виды (изо-, гомо-, гетероантагонизм), ведущее значение для широты распространения и количественного содержания микроорганизмов в различных экологических системах (114, 133). Контроль уровня и спектра антагонистической активности - показателя качества пробиотиков, определяющего в значительной степени их терапевтический эффект - согласно действующей нормативной документации проводится в тесте отсроченного антагонизма методом перпендикулярных штрихов на регламентированных плотных питательных средах и базируется на определении гетероантагонизма в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (151, 152, 153, 154, 155).

Мы предположили, что в искусственно созданных условиях на плотных питательных средах антагонизм производственных штаммов бактерий может быть оценен по любой его составляющей. Для определения гетеро- и гомоантагонизма пробиотиков не обязательно использовать патогенные и условно-патогенные штаммы бактерий. Широкая номенклатура пробиотиков и, соответственно, принадлежность производственных штаммов для их изготовления к различным таксономическим группам позволяют применять их в качестве тест-культур для взаимного определения гетеро- или гомоантагонизма in vitro.

С этой целью было проведено сравнительное изучение специфической активности пробиотиков по отношению к непатогенным и патогенным тест-штаммам на регламентированных питательных средах с использованием утвержденных методик проведения теста отсроченного антагонизма для каждого препарата, включая продолжительность культивирования испытуемой культуры и совместной инкубации с тест-штаммами.

Одновременно, для более полной оценки эффективности среды СД и изучения возможности унификации набора питательных сред при определении уровня антагонистической активности пробиотиков, нами была изучена их изо-, гомо- и гетероантагонистическая активность на плотном варианте сывороточно-дрожжевой среды (СД-4).

Для выявления возможных отличий в биологических свойствах было проведено раздельное исследование антагонистической активности лиофилизированных культур производственных штаммов бактерий и сухих препаратов на их основе. Результаты показали, что различия в технологии получения не оказывают значимого влияния на уровень и спектр антагонизма. Во всех случаях гетероантагонистическая активность пробиотиков в отношении тест-штаммов различной таксономической принадлежности была выражена сильнее по сравнению с антагонизмом внутри вида или рода.

Показатели изо-, гомо- и гетероантагонизма на регламентированных средах коррелировали с аналогичными показателями на среде СД-4 (г>0,7) и не имели от них достоверных отличий (р>0,05), что указывает на возможность использования среды СД-4 при контроле специфической активности лиофилизированных культур штаммов и серий препаратов пробиотического действия в тесте отсроченного антагонизма.

Питательная среда СД-4 явилась более адекватным субстратом для постановки теста отсроченного антагонизма ацидофильных лактобактерий по сравнению с регламентированной средой МРС-5.

Оценка результатов, полученных при исследовании образцов 10 серий лиофилизированной культуры штамма Е. coli М-17, 10 коммерческих серий колибактерина и бификола, позволили нам определить количественные показатели антагонистической активности штамма Е. coli М-17 — зона задержки роста изогенного штамма должна составлять не менее 15 мм на среде Гаузе №2 и среде СД-4, зона задержки роста патогенных и условно-патогенных тест-штаммов на среде СД-4 должна быть также не менее 15 мм и всегда превышать уровень изоантагонистической активности.

Результаты исследований, проведенных на образцах 12 коммерческих серий лактобактерина, 10 серий лиофилизированных культур производственных штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90Т-С4, позволили установить следующие количественные показатели антагонистической активности лактобактерина — зона задержки роста изо- и гомологичного штаммов должна составлять не менее 15 мм на среде МРС-5, зона задержки роста патогенных и условно-патогенных тест-штаммов должна составлять не менее 20 мм на среде МРС-5 и СД-4.

Оценка результатов, полученных при исследовании образцов 10 серий лиофилизированных культур штаммов L. acidophilus КЗШ24, L. acidophilus NK1, L. acidophilus 100АШ, 10 коммерческих серий ацилакта, позволили нам определить количественные показатели их антагонистической активности — зона задержки роста изо- и гомологичного штаммов должна составлять на обеих средах не менее 15 мм; зона задержки роста штамма Е. coli М-17, а также патогенных и условно-патогенных тест-штаммов должна быть во всех случаях больше и составлять не менее 15 мм на среде МРС-5 и не менее 20 мм на СД-4.

Определение антагонистической активности пробиотиков, включающее оценку изо- (или гомоантагонизма), позволяет ограничить применение патогенных и условно-патогенных культур.

По результатам исследований получен патент РФ №2177152 «Способ контроля антагонистической активности препаратов для лечения и профилактики дисбактериозов», приоритет от 02.12.1999. Внесены дополнения в действующую документацию: ФСП 42-0028220301 на колибактерин сухой и ФСП 42-0028220201 на бификол сухой.

Заключительный раздел наших исследований был связан с разработкой экспресс-метода контроля антагонистической активности препаратов пробиотического действия с использованием в качестве тест-культуры люминесцентных бактерий.

В литературных источниках подробно освещена сфера применения биотестов, основанных на анализе люминесцентной реакции бактериальной клетки в ответ на воздействие ингибиторов биологической активности. Благодаря своим несомненным преимуществам - высокой чувствительности, быстроте, минимальному объему исследуемого образца - они нашли широкое применение при оценке уровня загрязненности воды, почвы, промышленных стоков различными ядами, пестицидами, тяжелыми металлами (54, 85, 111, 122, 147, 160, 187, 249).

Список веществ, анализируемых в тест-системах с использованием светящихся бактерий, продолжает пополняться. Расширение сферы применения люминесцентных биотестов является перспективным направлением в биосенсорных исследованиях. Т.к., люминесцентные тест-организмы проявляют обобщенную реакцию на действие всех биологически активных веществ, представлялось вероятным, что с их помощью можно оценить уровень антагонистической активности препаратов пробиотического действия.

Можно было предполагать, что метаболиты пробиотических микроорганизмов, как и другие биологически активные вещества, воздействуют на уровень свечения люминесцентных бактерий, характеризующий общий физиологический статус микроорганизма (54, 147, 246). При этом качественные и количественные изменения данного параметра поддаются объективному контролю и могут быть зафиксированы с помощью биолюминометра при кратковременной совместной экспозиции препаратов и люминесцентного тест-штамма.

Наш подход к оценке антагонистической активности препаратов основывается на определении величины изменения интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и выражается количественно в виде индекса антагонистической активности — ИАА (численно равного проценту подавления свечения по сравнению с исходным уровнем) при расчете среднеарифметического значения из трех параллельных измерений (контроль-опыт)

Первым этапом данного раздела исследований явился выбор физико-химических параметров проведения бактериального люминесцентного теста. Исходя из того, что чувствительность к биологически активным веществам и характер инактивации биосенсора (рекомбинантного тест-штамма) зависит от свойств клеток хозяина, мы остановились на температуре измерительной системы 37° С — оптимальной для Е. coli - штамма-реципиента lux гена (22, 45, 139, 144, 206). Оптимум люминесцентной активности фермента люциферазы наблюдается при значениях рН близких к 7,0, поэтому этот уровень был выбран для регидратированной культуры тест-штамма (76, 112, 226).

В результате наших исследований определены закономерности воздействия пробиотиков на люминесцентный штамм Е. coli lum+ С-50 (разработанный под руководством д.м.н., профессора Р.А. Пшеничнова) в тесте ингибирования биолюминесценции. Выявлено влияние концентрации препарата (цельный или разведенный) в пробе и продолжительности экспозиции на уровень свечения тест-штамма для каждого пробиотика.

Для цельных препаратов (за исключением бифидумбактерина) характерно необратимое гашение свечения. Показатели ИАА, превышавшие 99, можно считать 100%-ным угнетением люминесценции МИТ при учете фонового свечения прибора.

Стимуляцию свечения люминесцентного тест-штамма отдельными разведениями препаратов в начальный период или на протяжении всего срока экспозиции можно объяснить малой концентрацией клеток и их метаболитов, а также воздействием на клетки сенсора компонентов питательной среды и стабилизаторов лиофилизации.

Путем параллельного посева рекомбинантного тест-штамма на среду Эндо определен механизм воздействия на него пробиотиков: цельные препараты не только угнетали биолюминесценцию тест-культуры, но и способствовали отмиранию индикаторных клеток. Индекс антагонистической активности пробиотиков и КОЕ тест-штамма находились в сильной обратной зависимости (г >-0,7), а ингибирование биолюминесценции выявлялось в целом раньше и предшествовало последующему отмиранию индикаторных клеток.

Для обоснования временных параметров проведения (продолжительности экспозиции) и критериев оценки было проведено сравнение результатов и выявлено наличие корреляционной зависимости между результатами, полученными в тесте ингибирования биолюминесценции и регламентированном тесте отсроченного антагонизма на плотной питательной среде. Для всех пробиотиков установлена прямая сильная корреляция между количественными показателями ИАА в период от 30 мин до 2 ч и результатами отсроченного антагонизма в отношении тест-штаммов Е. coli lum+ С-50, Е. coli М-17, Е. coli 157 (г > 0,7).

Высокий уровень корреляции позволяет использовать тест ингибирования биолюминесценции для оценки антагонистических свойств пробиотических препаратов. Преимуществами разработанного способа являются: отсутствие необходимости применения питательных сред и патогенных тест-штаммов, кратковременная совместная экспозиция препарата и тест-культуры, учет влияния исходной концентрации клеток и метаболитов в исследуемом препарате.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Арчакова, Елена Геннадьевна, Пермь

1. Авдеева Н.Г. Разработка технологии производства дрожжевых аутолизатов как основы конструирования питательных сред для чумного микроба и холерного вибриона/ Н.Г. Авдеева, И.А. Дятлов, С.А. Еремин. — Саратов, 2000.-17 с.

2. Акимкин В.Г. Микроэкологические нарушения толстого кишечника у больных гастроэнтерологического профиля/ В.Г. Акимкин, Г.И. Заболотнова// Журнал микробиол. 1997. - №2. - С. 85-86.

3. Ахапкина И.Г. Питательные среды как искусственная среда роста и развития микроорганизмов/ И.Г. Ахапкина, Л.П. Блинкова// Журнал микробиол. -2001. №6. - С. 99-104.

4. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях/ И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.

5. Барановский А.Ю. Дисбактериоз и дисбиоз кишечника/ А.Ю. Барановский, Э.А. Кондрашина. СПб., 2000. - 209 с.

6. Безель B.C. Экологическое нормирование антропогенных нагрузок/ B.C. Безель, Ф.В. Кряжимский, Л.Ф. Семериков, Н.Г. Смирнов// Экология. -1992.-№6.-С. 3-12.

7. Белобородова Н.В. Метаболиты анаэробных бактерий (летучие жирные кислоты) и реактивность макроорганизма/ Н.В. Белобородова, С.М. Белобородов// Антибиотики и химиотерапия. 2000. - Т.45, №2. - С. 28-36.

8. Бельмер С.В. Рациональная терапия дисбактериоза кишечника у детей/ С.В. Бельмер, Т.В. Гасилина// Клин. мед. 1998. — Т.76. — №10. — С.35.

9. Бержанская Л.Ю. Биосенсор для количественного определения в воде синтетических поверхностно-активных веществ/ Л.Ю. Бержанская, О.Н.

10. Постникова, Ю.С. Кривошеин//Авт. св., № 1335569, кл G 12 Q Я.-1987.- 8с.

11. Биотехнологические основы переработки растительного сырья/ О.В. Кислухина, И.И. Кюдулас. Каунас, 1997. - 183 с.

12. Бондаренко А.В. Пути совершенствования этиопатогенетической терапии дисбактериозов/ А.В. Бондаренко, В.М. Бондаренко, Вл.М. Бондаренко// Журн. микробиол. 1998. - №5. - С. 96-101.

13. Бондаренко В.М. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков/ В.М. Бондаренко, Э.И. Рубакова, В.А. Лаврова// Журнал микробиол. 1998. -№5.-С. 107-112.

14. Быков В.А. Суппозиторий с лактобактериями для лечения дисбактериозов влагалища/ В.А. Быков, М.В. Далин: Пат. 2150268 Россия, МПК6 А61К 9/02, А61К 35/74. 2000. - Бюл. №6.

15. Валышев А.В. Влияние бифидобактерий на антилизоцимную активность энтеробактерий/ А.В. Валышев, Н.Н. Елагина// Журнал микробиол. — 2000. № 4. - С. 77-79.

16. Вахитов Т.Я. Сравнительное изучение действия экзометаболитов Escherichia coli М-17 и фруктоолигосахаридов на рост и антагонистическую активность лактобацилл/ Т.Я. Вахитов, О.В. Добролеж // Журнал микробиол. 2001. - №3. - С. 80-83.

17. Вахитов Т.Я. Роль янтарной кислоты в сохранении жизнеспособности и антагонистической активности культуры Е. coli М-17/ Т.Я. Вахитов, О.В. Добролеж// Рус. журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы». 2000. — 4, №1. —С. 31.

18. Вербицкая Н.Б. Сухой биопрепарат и способ его получения/ Н.Б. Вербицкая, О.В. Добролеж, А.И. Кобатов, JI.H. Петров: Пат. 2160992 Россия, МПК А23С 9/12, А23С 9/123. 2000. - Бюл. №36.

19. Верткин A.JI. Дисбактериоз кишечника как побочный эффект антихеликобактерной терапии и новый способ его коррекции/ A.JI.

20. Верткин, B.E. Артамонов, И.Ф. Балагурия// Медицинская картотека МИРа. — 1998. -№10.

21. Виестур У.Э. Культивирование микроорганизмов/ У.Э. Виестур, М.Ж. Кристапсонс, Е.С. Былинкина. — М., 1980. — 230 с.

22. Винаров А.Ю. Использование консорциума бактериальных культур для их выращивания на молочной сыворотке/ А.Ю. Винаров, Т.Е. Сидоренко// Хранение и переработка сельхозсырья. 1999. - №1. - С. 16-17.

23. Витухновская JI.A. Влияние ионов Na+, К+ на люминесцентную активность интактных клеток Vibrio harveyi при различных рН/ JI.A. Витухновская, А.Д. Исмаилов// Микробиология. 2001. - т. 70, №4. - С. 525-530.

24. Воеводин Д.А. Роль дисбактериоза в формировании хронической неинфекционной патологии у детей/ Д.А. Воеводин, Г.Н. Розанова// Журнал микробиол. 2001. - №6. - С. 88-93.

25. Воробьев А.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции/ А.А. Воробьев, Е.А. Лыкова// Журнал микробиол. -1999. -№6.-С. 102-105.

26. Воронкина И.М. Экономичная питательная среда в производстве препарата бифидумбактерина/ И.М. Воронкина, В.Г. Кандюрина// Тезисы докл. конференции 26-27 мая. Махачкала, 1988. - С. 191.

27. Воспяков В.Г. Гликопептиды лактобацилл регуляторы гемопоэза и иммунитета/ В.Г. Воспяков, JI.H. Петров// Рус. журн. «ВИЧ/СПИД и родств. проблемы». - 2000. - 4, №1. - С. 31-32.

28. Гаврилова Н.Н. Электронно-микроскопические исследования характера ингибирования роста сальмонелл лактобактериями/ Н.Н. Гаврилова, И.А. Ратникова// Биотехнология. — 1999. №1. - С. 48-54.

29. Ганшин В.М. Клеточные сенсоры на основе бактериальной биолюминесценции/ В.М. Ганшин, B.C. Данилов// Сенсорные системы. 1997. - Т. 11, № 6. - С. 245-255.

30. Геворкян Н.М. Комплексная оценка загрязнения окружающей среды и уровня генетических повреждений у жителей г. Атбасар (Казахстан)/ Н.М. Геворкян, И.Е. Дробинская, Т.П. Глотова// Гигиена и санитария. 1994. - № 8. - С. 37-40.

31. Гинцбург A.JI. "Quorum sensing" или социальное поведение бактерий/ A.JI. Гинцбург, Т.С. Ильина, Ю.М. Романова// Журн. микробиол. 2003. - №5. — С. 86-93.

32. Гительзон И.И. Светящиеся бактерии/ И.И. Гительзон, Э.К. Родичева, С.Е. Медведева. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-е. - 1984. - 275 с.

33. Гительзон И.И. Штамм бактерий Photobacterium leiognathi, используемый в качестве тест-культуры на токсичность ксенобиотиков/ И.И. Гительзон, Т.И. Воробьева, А.Н. Шендеров, И.Ю. Виделец// Авт. св-во № 1097947, кл. G 01 №33/18.- 1983.-7 с.

34. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов/ К.К. Горбатова. -М.: Колос, 1997.-287 с.

35. Горовиц Э.С. Неспорообразующие анаэробы в норме и патологии/ Э.С. Горовиц, Т.И. Карпунина// Учебно-методическое пособие. Пермь. — 1999. -139 с.

36. Горская Е.М. Биологическая характеристика штаммов лактобацилл, перспективных в качестве эубиотиков/ Е.М. Горская, Н.Н. Лизько, А.А. Ленцнер// Журн. микробиол. 1992. - №3. - С. 17-20.

37. Григорьев П.Я. Диагностика и лечение болезней органов пищеварения/ П.Я. Григорьев, Э.П. Яковенко. СПб., 1997. - С. 298-320.

38. Григорьев А.В. Разработка и клиническая оценка пробиотика «Бифидумбактерин форте»/ А.В. Григорьев, В.М. Бондаренко, Н.А. Абрамов// Журн. микробиол. 1997. - №3. - С. 92-96.

39. Гриценко В.А. Экологические и медицинские аспекты симбиоза Escherichia coli и человека/ В.А. Гриценко, О.В. Бухарин// Журнал микробиол. 2000. - № 3. - С. 92-99.

40. Гукасян Г.Б. Антибиотические свойства Lactobacillus acidophilus «Нарине» и пути их повышения/ Г.Б. Гукасян, Л.Г. Акопян// Журн. микробиол. -2002.-№5.-С. 63-65.

41. Данилаш М.М. Дисбактериоз при заболеваниях органов пищеварительной системы у лиц, пострадавших вследствие Чернобыльской катастрофы/ М.М. Данилаш, О.Г. Лигирда// Лшар. справа. 2000. - №2. - С. 20-22.

42. Данилов B.C. Бактериальная биолюминесценция/ B.C. Данилов, Н.С. Егоров М.: Изд-во МГУ. - 1990. - 152 е., ил.

43. Данилов B.C. Бактериальные биосенсоры с биолюминесцентным выводом сигнала/ B.C. Данилов, В.М. Ганшин// Сенсорные системы. 1998. - Т. 12, № 1.-С. 56-68.

44. Данилов B.C. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий/ B.C. Данилов, А.П. Зарубина, Г.Е. Ерошников// Вест. Моск. Университета. Сер. 16. Биология. -2002.-№3.-С. 20-24.

45. Дементьева Е.И. Изменение АТФ в интактных клетках Escherichia coli, содержащих рекомбинантную люциферазу светляков/ Е.И. Дементьева, Н.Н. Угарова, П.Х. Кобболд//Биохимия. 1996. -Т.61,Вып.7. -С. 1285-1293.

46. Ефимов Б.А. Характеристика микроорганизмов, колонизирующих кишечник человека/ Б.А. Ефимов, Н.Н. Володин// Журн. микробиол. — 2002. №5.- С. 98-104.

47. Жданова Л.П. Питательные среды для изучения анаэробной неспорогенной микрофлоры/ Л.П. Жданова, И.И. Олейник, Б.Д. Быченко// Лаб. дело.1986.-№4.-С. 195-201.

48. Залашко М.В. Микробный синтез на молочной сыворотке/ М.В. Залашко, JI.C. Залашко. -Минск: Наука и техника, 1976. 274 с.

49. Залашко М.В. Биотехнология переработки молочной сыворотки/ М.В. Залашко. М.: Агропромтздат, 1990. — С. 6-34.

50. Залашко М.В. Антимикробные и иммуномодулирующие свойства Lactobacillus acidophilus Ке-10/ М.В. Залашко, Н.И. Анисимова, Л.Г. Борткевич// Прикладная биохимия и микробиология. 1997. - Т.ЗЗ, №3. — С. 305-309.

51. Захарченко М.П. Гигиеническая экспресс-диагностика токсичности дезинфектантов питьевой воды с помощью биотестирования/ М.П. Захарченко, С.М. Ткачук, Л.Е. Яковлева, В.В. Гайдамака// Гигиена и санитария. 1994. - № 9. - С. 3-4.

52. Исмаилов А.Д. Ингибирование бактериальной люминесценции хлорфенолами/ А.Д. Исмаилов, С.И. Погосян, Т.И. Митрофанова// Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - Т.36, №4. - С. 469-473.

53. ИСО 5667/2. Качество воды. Отбор проб. Ч. 2. ГОСТ 2874-82. Вода питьевая.

54. Истомин А.В. Кисломолочный бифидумбактерин: опыт применения, эффективность/ А.В. Истомин// Нар. медицина России. 1999. - №3. - С.8-9.

55. Калмыкова А.И. Пробиотики: Терапия и профилактика заболеваний. Укрепление здоровья/ А.И. Калмыкова. СибНИПТИП СО РАСХН. -Новосибирск, 2001. - 208 с.

56. Карпунина Т.И. Повышение эффективности терапевтического действия пробиотиков/ Т.И. Карпунина, Э.С. Горовиц// Журнал микробиологии,эпидемиол., иммунобиол. 1998. - № 2. — С. 104-107.

57. Каталог светящихся культур/ Под ред. Э.К. Родичевой. Новосибирск: Наука. Сиб. предприятие РАН. - 1997. - 125 с.

58. Кацев A.M. Оценка взаимодействия катионных поверхностно-активных антисептиков с сывороточным альбумином методом бактериальной биолюминесценции/ A.M. Кацев, В.Ю. Семенов// Клиническая лабораторная диагностика. 2002. - № 4. - С. 39-41.

59. Квасников Е.И. Молочнокислые бактерии и пути их использования/ Е.И. Квасников, О.А. Нестеренко. М., 1975. - 389 с.

60. Кигель Н.Ф. Новый бактериальный препарат «АФ» на основе молочнокислых бактерий и его биологические свойства/ Н.Ф. Кигель// Мшробиол. журнал. 2000. - Т. 62, №3. - С. 49-55.

61. Корвякова Е.Р. Применение «ударных» доз бифидумбактерина форте для , лечения больных острыми кишечными инфекциями/ Е.Р. Корвякова// Журн. микробиол. 2000. - №6. - С. 58-61.

62. Корнева Т.К. Дисбактериоз кишечника у проктологических больных: микробиологические аспекты/ Т.К. Корнева// Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1999. - №3.

63. Корпан Я.И. Микробные сенсоры: достижения, проблемы, перспективы/ Я.И. Корпан, А.В. Ельская// Биохимия. 1995. - Т.60, вып.12. - С.1988-1998.

64. Коршунов В.М. Характеристика биологических препаратов и пищевых добавок для функционального питания и коррекции микрофлоры кишечника/ В.М. Коршунов, Б.А. Ефимов, А.П. Пикина// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2000. - №3. — С. 86-91.

65. Коршунов В.М. Изучение бифидофлоры влагалища у женщин репродуктивного возраста/ В.М. Коршунов, З.А. Гудиева// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. - №4. - С. 74-78.

66. Красик JI.JI. Усовершенствование производства колибактерина и разработка нового экспериментального препарата из молочнокислыхбактерий штамма Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ/ JLJL Красик: Автореф. дис. канд. мед. наук. Пермь, 1972. - 20 с.

67. Краскина Н.А. Иммунный статус и микрофлора кишечника у больных полиартритом инфекционно-аллергической природы в процессе лечения бифидумбактерином/ Н.А. Краскина, Т.К. Лопатина// Иммунология. 1996, №4.-С. 52-54.

68. Кратасюк В.А. Люциферазное биотестирование: биофизические основы, методы и применение/ В.А. Кратасюк: Автореф. дис. д.б. н. Красноярск, 1994.-31 с.

69. Кратасюк В.А. Люциферазный биотест для определения степени поражения фузариозом зерна пшеницы/ В.А. Кратасюк, О.И. Егорова// Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т. 34, № 6. - С. 688-691.

70. Критская И.В. Разработка питательных сред и процесса непрерывного культивирования бифидобактерий/ И.В. Критская: Автореф. дис. канд. биол. наук. Москва, 1997. - 27 с.

71. Критская И.В. Оптимизация состава питательной среды для культивирования бифидобактерий B.bifidum 791/ И.В. Критская, Т.Б. Танирбергенов, Л.Н. Саканян//Биотехнология. 1996. - №3. - С. 33-38.

72. Куваева И.Б. Антагонистическая активность микробных популяций защитной флоры и ее связи с характеристикой микробиоценоза и факторами питания/И.Б. Куваева, Г.Г. Кузнецова// Вопр. питания. 1993. -№3. - С. 46-50.

73. Кудряшова Н.С. Действие хинонов на ферментативные биолюминесцентные НАДН-зависимые системы/ Н.С. Кудряшова, Е.Н. Есимбекова//Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - Т. 36, № 4. -С. 474-478.

74. Кузиков А.Н. Применение биолюминесцентного метода определения бактериального аденозинтрифосфата в микробиологии/ А.Н. Кузиков, В.М. Бондаренко, А.Т. Латкин// Журн. микробиол. 2003. - №1. - С.80-89.

75. Кузнецов A.M. Использование светящихся бактерий в биотестировании окружающей среды/ A.M. Кузнецов, Э.К. Родичева, С.Е. Медведева// Материалы Международной конференции, 12-18 сентября. Москва, Пермь, 1998.-С. 395.

76. Кузнецов A.M. Биолюминесцентные методы анализа биологически активных соединений и приборное обеспечение/ A.M. Кузнецов, Н.А. Тюлькова, М.В. Сальников// Материалы V Международной конференции, 18-25 сентября, Волгоград Пермь, 2001. - С.28.

77. Леванова Г.Ф. Метод сравнительного биотестирования питьевой воды с помощью индикаторных штаммов бактерий/ Г.Ф. Леванова, А.С. Юшин, С.Ю. Кашников// Гигиена и санитария. 1999. - № 2. - С. 77-79.

78. Ленцнер А.А. Актуальные проблемы микроэкологии человека/ А.А. Ленцнер, Х.П. Ленцнер// Республиканский сборник научных трудов. -Горький, 1988.-С. 10-15.

79. Ленцнер А.А. Лактофлора и колонизационная резистентность/ А.А. Ленцнер, Х.П. Ленцнер, М.Э. Микельсаар// Антибиотики и мед. биотехнология. 1987. - Т. 32, № 3. - С. 173-179.

80. Лучшев В.И. Дисбактериозы у больных шигеллезами: причины развития и пути коррекции/ В.И. Лучшев, В.М. Бондаренко, М.З. Шахмарданов// Рос. мед. журн. 2000. - №3. - С. 35-39.

81. Лыкова Е.А. Коррекция пробиотиками микроэкологических и иммунных нарушений при гастродуоденальной патологии у детей/ Е.А. Лыкова, В.М. Бондаренко, Ю.А. Изачик// Журн. микробиол. 1996. - №2. -С.88-91.

82. Малатян М.Н. Получение биомассы фототрофных бактерий на молочной сыворотке/ М.Н. Малатян, А.Х. Паронян// Прикладная биохимия и микробиология. 1997. - Т. 33, № 2. - С. 238-240.

83. Мамгин Н.П. Комплексный подход оценки состояния окружающей среды и риска для здоровья в системе обеспечения гигиенической безопасности населения/ Н.П. Мамгин, О.В. Клепиков, П.В. Чернов// Прикл. инф. аспекты мед. 1999. - Т. 2, № 1. - С. 6-11.

84. Манухов И.В. Клонирование и экспрессия /ш:-оперона Photorhabdus luminescensl И.В. Манухов, С.М. Расторгуев// Генетика. 2000. - Т. 36. -№3. - С. 322-330.

85. Масленникова И.Л. Микробиолюминесцентная система оценки мутагенного и общетоксического действия поллютантов/ И.Л. Масленникова, Н.В. Голясная, Р. А. Пшеничнов// Материалы Международной конференции, Волгоград Пермь, 2001. - С. 33.

86. Медведева С.Е. АТФ-азная активность светящихся бактерий и их темновых вариантов/ С.Е. Медведева, А.Н. Медведев, Г.А. Примакова, М.В. Сальников// Изв. СО РАН СССР, биология. 1982. - Вып. 2, № ю.-С. 113117.

87. Меджидов М.М. Состояние и перспективы развития производства микробиологических питательных сред/ М.М. Меджидов// Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии: Тезисы конференции. Махачкала, 1988. - Ч. 1. - С. 3-8.

88. Мельникова В.А. Алгоритм конструирования новых питательных сред/ В.А. Мельникова, И.А. Баснакьян, Б.М. Раскин// Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии: Тезисы конференции. Махачкала, 1988. - Ч. 2. - с. 163.

89. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. Москва, 1980.

90. Методические рекомендации. Определение токсичности воды и водных экстрактов из объектов окружающей среды по интенсивности биолюминесценции бактерий. 26.02.96, № 01-19/16.17.- 9 с.

91. Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред. М., 1977.

92. Милютин В.Н. Некоторые дополнительные требования к кормовым дрожжам, используемым в качестве сырья при производстве питательных сред/ В.Н. Милютин, М.М. Меджидов// Тезисы координационного совещания. Махачкала, 1982. - С. 9-11.

93. Минушкин О.Н. Дисбактериоз кишечника/ О.Н. Минушкин, М.Д. Ардатская, В.Н. Бабин// Рос. мед. журн. 1999. - № 3. - С. 40-44.

94. Михайлова T.JI. Биопрепараты и пищевые факторы в коррекции дисбактериоза/ T.JI. Михайлова, Т.Ю. Калинская, В.Г. Румянцев// Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1999. - Т. 9, №3. - С. 67-70.

95. Никитина З.И. Микробиологический мониторинг наземных экосистем/ З.И. Никитина. -Новосибирск: Наука, 1991. 222 с.

96. Никитина Н.М. Оценка мутагенных свойств техногенного загрязнения водной среды/ Н.М. Никитина// Материалы Международной конференции, 18-25 сентября, Волгоград Пермь, 2001. — С. 36.

97. Николаенко В.Н. Влияние препарата ацилакта на иммунную систему детей, больных атопическим дерматитом/ В.Н. Николаенко, Т.К. Лопатина, В.В. Поспелова// Иммунология. 1996. — Т. 2. — С. 54-57.

98. Новик Г.И. Сохранение жизнеспособности и физиологических свойств бифидобактерий при криоконсервации и лиофилизации/ Г.И. Новик, Н.И. Астапович// Микробиология. 1998. - Т. 67, № 5. - С. 637-642.

99. Новик Г.И. Сохранение жизнеспособности и антагонистической активности бифидобактерий при субкультивировании/ Г.И. Новик, Н.И. Астапович, Н.Е. Рябая// Микробиология. 1998. - Т. 67, № 5. - С. 631-636.

100. Осадчая А.И. Влияние источников питания на синтез экзополисахаридов и аминокислот штаммами Bacillus subtilisl А.И. Осадчая, В.А. Кудрявцев// Мшробюл. журн. 1999. - Т. 61, № 5. - С. 56-63.

101. Осипова ИГ. Некоторые аспекты механизма защитного действия колибактерина и споровых эубиотиков и новые методы их контроля/ И.Г. Осипова: Автореф. дис. канд. биол. наук. Москва, 1997. -25 с.

102. Патрушева Е.В. Микроэкологические изменения при экспериментальном дисбактериозе и роль бактерицидных систем клеток организма хозяина/ Е.В. Патрушева: Автореф. дис. канд. биол. наук. Волгоград, 2000. - 23 с.

103. Пивоварова Н.И. Изучение возможности использования гидролизатов кормовых дрожжей и крови животных при изготовлении питательных сред для диагностики кишечных инфекций/ Н.И. Пивоварова// Журн. микробиол. 1985. - № 7. - С. 32-35.

104. Пикина А.П. Первичный скрининг штаммов бифидобактерий и лактобактерий с целью разработки на их основе эффективных препаратов-пробиотиков/ А.П. Пикина, В.В. Смеянов, Б.А. Ефимов// Журн. микробиол. -1999.-№6.-С. 34-38.

105. Поляков И.В. Практическое пособие по медицинской статистике/ И.В. Поляков, Н.С. Соколова. JL, Медицина. - 1975. — 150 с.

106. Попова Л.Ю. Использование светящихся бактерий для создания тест-системы на гексахлорциклогексан/ Л.Ю. Попова, С.Е. Медведева, О.А. Могильная, А.П. Пузырь// Прикладная биохимия и микробиология. 1991. - Т. 27, Вып. 6. - С. 905-910.

107. Попова Л.Ю. Микробные тест-системы для оценки степени токсичности химических соединений/ Л.Ю. Попова, Н.И. Луцкая, А.Г. Жуков. Красноярск. 1991. - 31с.

108. Постникова О.Н. Влияние поверхностно-активных веществ на люминесцентную систему светящихся бактерий/ О.Н. Постникова, Ю.С. Кривошеин, Л.Ю. Бержанская// Биотехнология. 1992. - № 4. - С. 56-59.

109. Примакова Г.А. Влияние рН на константу скорости затухания люминесценции у различных видов светящихся бактерий/ Г.А. Примакова, Т.П. Сандалова// Прикладная биохимия и микробиология. 1991. - Т. 27, Вып. 1.-С. 142-145.

110. Пучков О.Е. Проблемы оценки жизнеспособности микроорганизмов/ О.Е. Пучков// Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения,экологические проблемы. Междунар. конференция: Тез. докл. Пермь, 1996.-С. 88-89.

111. Пшеничнов Р.А. Микробная популяция — саморегулируемая система/ Р.А. Пшеничнов, В.М. Колотов, С.Я. Барихин// Экология и популяционная генетика микроорганизмов. — Свердловск, 1975. С. 3-13.

112. Пшеничнов Р.А. Микробиолюминесцентный индикатор токсичности -МИТ: конструирование и применение/ Р.А. Пшеничнов, И.Л. Масленникова, Н.М. Никитина// Материалы V Международной конференции, 18-25 сентября, Волгоград — Пермь, 2001. С.42.

113. Пшеничнов Р.А. Оценка эффективности пробиотиков в реакции ингибирования микробиолюминесценции с препаратом МИТ/ Р.А. Пшеничнов, В.А. Несчисляев, А.В. Церегородцев// Материалы V Международной конференции, 18-25 сентября, Волгоград Пермь, 2001. -С. 90.

114. Пшеничнов Р.А. Микробиотест для оценки мониторинга загрязнения почв/ Р.А. Пшеничнов, Ф.Н. Закиров, Н.М. Никитина// Экология. 1995. - № 4. -С. 332-334.

115. Разработка сухой среды для производства колибактерина / Г.В. Султанов, Р.А. Османова// Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии: Тезисы конф. Махачкала, 1988. -Ч. 2. - С. 189-190.

116. Рахманов Р.С. Питательная среда для роста бифидо- и лактобактерий/ Р.С. Рахманов: Пат. 2158302 Россия МПК C12N 1/20, А23С 9/12. 1999.

117. Регламент производства 705-97. Лактобактерин сухой.

118. Реммель Н.Н. Биолюминесцентный контроль интенсивности патологических окислительных процессов в клетках/ Н.Н. Реммель, В.А. Кратасюк// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. -Т. 135, № 1.-С. 52-54.

119. Решетилов А.Н. Биосенсоры и биологические методы анализа объектов окружающей среды/ А.Н. Решетилов// Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - Т. 36, № 5. - С. 605-608.

120. Родичева Э.К. Коллекция культур светящихся бактерий ИБСО/ Э.К. Родичева, Г.А. Выдрякова// Материалы Международной конференции, 8-11 октября, Пермь, 1996. С.93.

121. Рожкова И.Ю. Предпосылки к использованию лактобактерина на основе штамма Lactobacillus fermentum 90-TS-4 в гинекологической практике/ И.Ю. Рожкова, Э.Г. Кравцов// Бюллетень эксп. биологии и медицины. -1999. Т. 127. - № 2. - С. 234-236.

122. Румянцев В.Г. Дисбактериоз кишечника: клиническое значение и принципы лечения/ В.Г. Румянцев// Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1999. - Т. 9, № 3. - С. 61-63.

123. Румянцев Г.И. Проблемы прогнозирования токсичности и риска воздействия химических веществ на здоровье населения/ Г.И. Румянцев, С.М. Новиков//Гигиена и санитария. 1997. - № 6. - С. 13-18.

124. Рысс Е.С. Болезни органов пищеварения/ Е.С. Рысс, Б.И. Шулутко. СПб., 1998.-С. 78-105.

125. Саркисов С.Э. Применение биотерапевтического агента "Жлемик" для коррекции микрофлоры при бактериальных вагинозах/ С.Э. Саркисов, З.С. Крымшокалова// Журн. микробиол. 2000. - № 1. - С. 88-90.

126. Смирнов И.И. Способ коррекции микрофлоры вагины/ И.И. Смирнов, И.Б. Сорокулова: Пат. 2131258 Россия, МПК6 А61К 35/74, C12N 1/20. Институт микробиол. и вирусол. НАН Украины. 1999. - Бюл. №16.

127. Соколова Н.А. Некоторые вопросы экологии антагонизма лактобактерий/ Н.А. Соколова, О.Д. Гольдина// Экология и популяционная генетика микроорганизмов. Свердловск, 1975. - С. 42-46.

128. Спасская Т.А. Экологическая биотехнологическая альтернатива: пробиотики вместо антибиотиков/ Т.А. Спасская// Тез. докл. IV Междунар. научно-практич. конференции, 28-30 сентября, 1998. — Рязань. -С. 201-202.

129. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под редакцией М.О. Биргера. М., «Медицина». - 1982.

130. Состав и свойства молока как сырья для молочной промышленности:" Справочник / Н.Ю. Алексеева, В.П. Аристова, А.П. Патратий. М.: Агропромиздат, 1986. - 232 с.

131. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов/ П.П. Степаненко: Автореф. дис. докт. вет. наук. Москва, 2000. - 30 с.

132. Столов С.В. Заболевания тонкой кишки (клиника, диагностика, лечение)/ С.В. Столов// Новые С.-Петербургские врачебные ведомости. 2000.- № 1.

133. Страховская М.Г. Фотоиндуцированное подавление биолюминесценции генно-инженерного штамма бактерий Е. coli TGI в присутствии фотодитазина/ М.Г. Страховская, И.М. Пархоменко// Микробиология. -2002. Т. 71, № 3. - С. 345-348.

134. Сушко В.И. Основа питательной среды для культивирования микроорганизмов/ В.И. Сушко, И.И. Школьник, В.В. Щеткин: Пат. 2108381 Россия, МПК6 C12N 1/20. 1998.

135. Таболин В.А. Рациональная терапия дисбактериоза кишечника у детей. Методические рекомендации/ В.А. Таболин, С.В. Бельмер, Т.В. Гасилина. -М., 1998.-11 с.

136. Тимошкина Н.Н. Применение биолюминесцентного метода для экспресс-тестирования загрязненных вод/ Н.Н. Тимошкина, С.В. Юшков// Тезисы докл. конф. мол. ученых. Владивосток, 24-26 мая, 1999. — С. 185-187.

137. Титов А.Н. Биолюминесцентный метод определения чувствительности микрофлоры к антибиотикам/ А.Н. Титов, Н.А. Романова, Т.М. Данилова, Л.Ю. Бровко// Лабораторное дело. 1990. - № 10. - С. 61-66.

138. Тюлькова Н.А. Сравнительное исследование влияния температуры на бактериальные люциферазы/ Н.А. Тюлькова, Т.П. Сандалова// Биохимия. -1996. Т. 61, вып. 2. - С. 275-287.

139. Федотова Т.А. Роль дисбактериоза кишечника в формировании иммунной недостаточности у детей/ Т.А. Федотова, А.А. Михайленко// Иммунология. -2001. -№3.- С. 41-45.

140. Фоменко Д.Э. Яновые пептидные антибиотики-микроцины типов В и С: структура и генетические детерминанты синтеза/ Д.Э. Фоменко, А.З. Мелицкая// Молекулярная биология — 1998. — Т. 32, № 2. С. 382.

141. Фомченков В.М. Исследование интегральной токсичности водной среды с использованием бактериальных тестов/ В.М. Фомченков, И.А. Ирхина// Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - Т. 36. - №6. - С. 656-661.

142. Фрунджян В.Г. Биолюминесцентный метод определения общей бактериальной обсемененности сырого молока/ В.Г. Фрунджян, Л.Ю. Бровко// Прикладная биохимия и микробиология. — 1999. — Т. 35. №3. — С. 358-365.

143. ФС 42-3874-99 «Физико-химические, химические, физические, иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов».

144. ФС 42-3539-98 «Питательная среда 199М (10-кратный концентрат), жидкая».

145. ФСП 42-0028212701 бифидумбактерин сухой.

146. ФСП 42-0028220301 колибактерин сухой.

147. ФСП 42-0028220201 бификол сухой.

148. ФСП 42-0028208401 лактобактерин сухой.

149. ФСП 42-0028208301 ацилакт сухой.

150. Хмель И.А. Микроцины — пептидные антибиотики энтеробактерий и генетический контроль их синтеза/ И.А. Хмель, А.З. Метлицкая// Тезисы докладов конф. «Дисбактериозы и эубиотики». М., 26-28 марта, 1996.

151. Храмцов А.Г. Молочная сыворотка/ А.Г. Храмцов. — М.: Пищевая промышленность, 1979. -272 с.

152. Храмцов А.Г. Безотходная технология в молочной промышленности/ А.Г. Храмцов, П.Г. Нестеренко. М., 1989. - 280 с.

153. Храмцов А.Г. Способ получения бифидумбактерина/ А.Г. Храмцов, С.Е. Виноградская: Патент 2160594 Россия, МПК7 А61К 35/74, А23С 9/12.2000. Бюл. № 35.

154. Хрипач JI.B. Оценка суммарной токсичности тяжелых металлов на основе люминесцентного бактериального теста/ JI.B. Хрипач, Ю.А. Ревазова, А.Б. Ходжаян// Гигиена и санитария. 1998. - № 4.- С. 67-72.

155. Шахмарданов М.З. Нарушение микрофлоры кишечника и функциональное состояние лимфоцитов у больных шигеллезом/ М.З. Шахмарданов/7 Эпидемиол. и инфекц. болезни. 1999. - № 1. - С. 35-38.

156. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса/ С.А. Шевелева// Вопр. питания. 1999. -Т. 68. -№ 2. -С. 32-39.

157. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека/ Б.А. Шендеров// Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1998. - Т.7. - № 1. - с. 61-65.

158. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том 3. Пробиотики и функциональное питание/ Б.А. Шендеров. -Москва, 2001. 288 с.

159. Шендеров А.Н. Способ биоиндикации загрязнения водной среды/ А.Н. Шендеров, Т.Ф. Сименская, И.Ю. Виделец: Авт. свид. СССР №1097947; кл. G 01 №33/48.-1985.-7 с.

160. Шмырина И. JI. Люминесцентный микробиотест: возможные пути его оптимизации и расширение сферы использования/ И.Л. Шмырина: Дис. к. б. н. Пермь ИЭГМ УрО РАН, 2000. - 171 с.

161. Штучная Г.В. Проблемы медицинской и экологической биотехнологии/ Г.В. Штучная, В.М. Фомченков, А.И. Ирхина// Тез. докл. Оболенск: ГНЦ ПМ, 1999.-С. 214.

162. Щербаков П.Л. Микроэкология желудочно-кишечного тракта/ П.Л. Щербаков, И.О. Иваников// Рос. мед. журн. 2001. - № 2. - С. 41-43.

163. Энтеробактерии. Руководство для врачей под редакцией В.И. Покровского. М., Медицина. - 1985. - 320 с.

164. Ющук Н.Д. Дисбактериоз кишечника: патогенез и фармакотерапия/ Н.Д. Ющук, А.Л. Верткин// Междунар. медицинский журн. 1998. - № 4.

165. Anand S.K. Antibacterial activity associated with B.bifidumf S.K. Anand, R.A. Srinivasan, L.K. Rao// Cultured Dairy Prod. J. 1985. - Vol. 20, N. 1.

166. Baird-Parker A.C. Organic acids/ A.C. Baird-Parker // Microbial Ecology of Foods/ Ed. Silliker Y.H., Academic Press New York. 1980. - P. 126-135.

167. Baquero F. The microcins/ F. Baquero, F. Moreno// Microbiol. Lett. 1984. -Vol. 23.

168. Barcena J.M. Chemostat production of plantaricin С by Lactobacillus plantarum LL441 / J.M. Barcena, F. Sineriz// Appl. and Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64, N. 9.-P. 3512-3514.

169. Barkin J.S. Difficult decisions in digestive diseases/ J.S. Barkin, A.J. Rogers. -Mosby, 1994.-440 p.

170. Bassi A.S. Recent advances in biosensor research for environmental applications/ A.S. Bassi// Can. Chem. News. 2000. - Vol. 52, N. 4. - P. 22-23.

171. Beloborodov S. The strong vegetarian diet as a risk factor for the digestive tract microflora disbiosis/ S. Beloborodov, A. Ivanov, S. Mitrochin// Microb. Ecology Health and Disease. 1998.-Vol. 10,N.3-4.-P. 198-199.

172. Bengmark S. Colonic food: pre- and probiotics/ S. Bengmark// Am. J. Gastroenterol. 2000. - Vol. 95, N. 1. - P. 5-7.

173. Bertazzoni Minelli E. Different probiotics and intestinal microflora in antibiotic treated children/ E. Bertazzoni Minelli, A. Benni// Microb. Ecology Health and Disease. 1998.-Vol. 10, N. 3-4.-P. 201-202.

174. Bibiloni R. Will a high adhering capacity in a probiotic strain guarantee exclusion of pathogens from intestinal epithelia?/ R. Bibiloni, P. Perez, G. De Antoni// Anaerobe. 1999. - Vol. 5, N. 5. - P. 519-524.

175. Billard P. Bioluminescence-based assay for detection and characterization of bacteria in clinical laboratories/ P. Billard, M.S. DuBow// Clinical Biochemistry. 1998.-Vol. 31, N. 1. - P. 1-14.

176. Bjorck L. The lactoperoxadise system/ L. Bjorck// Natural Antimicrobial Systems. IDF. 41. Square Vergote, 1040. Brussels. - 1985. -P. 8-30.

177. Blum S. Intestinal microflora and the interaction with immunocompetent cells/ S. Blum, S. Alvarez// Ant. Leevewen. 1999. - Vol. 76. - P. 199-205.

178. Bulich A.A. A practical and reliable method for monitoring the toxicity of aquatic samples/ A.A. Bulich// Process Biochem. 1982. - Vol. 17. - P. 45-47.

179. Bulich A.A. The luminescent bacterial toxicity test, its potential as an in-vitro alternative/ A.A. Bulich, K.K. Tung, G. Scheibner// J. Biolumin. Chemilum. -1990.-Vol. 5.-P. 71-78.

180. Burton S.A. The bacterial bioluminescens test/ S.A. Burton, R. Dabbah// Pharmacopeial Forum. 1989. -N. 11. - P. 4812-4814.

181. Callewaert R. Lactobacillus amylovorus DCE 471 is improved and stabilized by fed-batch fermentation/ R. Callewaert, L. De Vuyst// Appl. and Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66, N. 2. - P. 606-613.

182. Calvert R.M. Gaged ATP-an internal calibration method for ATP bioluminescence assays/ R.M. Calvert, H.C. Hopkins// Lett. Appl. Microbiol.-2000. Vol. 30, N. 3 - P. 223-227.

183. Casas I.A. Prebiotics, probiotics, antibiotics and autobiotics/1.A. Casas// Microb. Ecology Health and Disease. 1999. - Vol. 11, N. 2. - P. 108-109.

184. Coconnier M.H. Antagonistic activity against Helicobacter infection in vitro and in vivo by the human L. acidophilus strain LB/ M.H. Coconnier, V. Lievin// Appl. and Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64, N. 11. - P. 4573-4580.

185. Codita I. Rapid test for the detection of staphylococci by ATP-dependent bioluminescence/ I. Codita, C. Popesku// Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 1996. - Vol. 55, N. 4 - P. 323-331.

186. Collins M.D. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut / M.D. Collins// Am. J. Clin. Nutr. 1999. -Vol. 69.-P. 1052-1057.

187. Dunny G.M. Cell-cell signaling in bacteria/ G.M. Dunny, S.C. Winnas Wash. DC., ASM Press. - 1999.

188. Dykers G.A. Selection and fitness in bacteriocin-producting bacteria/ G.A. Dykers, J.W. Hastings// Proc. Roy. Soc. London. 1997. - Vol. 264, N. 1382. -P. 683-687.

189. Dyrset N. Feed supplement recovered from dairy wastewater by biological and chemical pretreatment/ N. Dyrset, E. Selmer-Olsen// J. Chem.Technol. and Biotechnol. 1998. - Vol. 73, N. 3. - P. 175-182.

190. Ehrmann M.A. A gene cluster encoding plantaricin 1.25beta and other bacteriocin-like peptides in Lactobacillus plantarum TMW1.25/ M.A. Ehrmann,

191. A. Remiger, V.G. Eijsink, R.F. Vogel// Biochim Biophys Acta. 2000. - Vol. 1490, N. 3.- P. 355-361.

192. Eijsink V. Comparative studies of class Ha bacteriocins of lactic acid bacteria/ V. Eijsink, M. Skeie// Appl. and Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64, N. 9. - P. 3275-3281.

193. Elli M. Growth requirements of Lactobacillus johnsonii in skim and UHT milk / M. Elli, R. Zink, R. Reniero, L. Morelli// Int. Dairy J. 1999. - Vol. 9, N.8. - P. 507-513.

194. Elmer G.W. Probiotics: 'living drugs' / G.W.Elmer// Am. J. Health. Syst. Pharm. -2001.-Vol. 58,N. 12.-P. 1101-1109.

195. Elmer G.W. Biotherapeutic Agents and Infection Diseases/ G.W. Elmer, L.W. Mc Farland, C.M. Surawicz. Human Press. - 1999. - 316 p.

196. El Soda M. The esterolitic and lipolitic activities of lactobacillis/ M. El Soda, M. Korayem, N. Ezzat// Milchwissenschaft. 1986. - Vol. 41, N.6. - P. 353-355.

197. EPS, Guidance Document on Control of Toxicity Test Precision Using Reference Toxicants/ Report EPS1/RM/12, August 1990, Environmental Protection, Conservation and Protection, Environment Canada. 1990. — 85 p.

198. Ewe K. Effect of lactose, lactulose and bysacodyl on gastrointestinal transit studied by metal detector/ K. Ewe, B. Ueberschaer, A.G. Press// Aliment. Pharmacol. Ther. 1995. - Vol. 9, N. 1. - P. 69-73.

199. Fabricant J.D. Bioluminescent strain of Escherichia coli for the assay of biocides/ J.D. Fabricant, J.H. Chalmers, M.W. Bradbuty// Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1995. - Vol. 45, N. 2. - P. 90-95.

200. Famularo G. Microecology, bacterial vaginosis and probiotics/ G. Famularo, M. Pieluigi// Med. Hypotheses. 2001. - Vol. 56, N. 4. - P. 365-378.

201. Fuller R. Probiotics: the scientific basis/ R. Fuller// London, Chapman & Hall. -1992.

202. Fuller R. Probiotics and prebiotics: microflora management for improved gut health/ R. Fuller, G.R. Gibson// Clin. Microbiol. Infect. 1998. - Vol. 4. - P. 477480

203. Gibson G.R. Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria/ G.R. Gibson, C. McFarlan// J. Appl. Bacteriol. 1994. - Vol. 77, N. 4.

204. Gibson G.R. Dietary modulation of the human gut microflora using the prebiotics oligofructose and inulin/ G.R. Gibson// J. Nutr. 1999. - Vol. 129, N.7.-P. 1438-1441.

205. Gibson G.R. Selective stimulation of bi-fidobacteria in the human colon by oligofructose and inulin/ G.R. Gibson, E.B. Beatty, X. Wang, J.H. Cummings// Gastroenterology. 1995. - Vol. 108. - P. 975-982.

206. Gibson G.R. Aspects of in vitro and in vivo research approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use/ G.R. Gibson, R. Fuller// J. Nutr. -2000. Vol. 130, N.2. - P. 391-395.

207. Gibson G.R. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics/ G.R. Gibson, M.B. Roberfroid// J. Nutr. 1995. - Vol. 125.-P. 1401-1412.

208. Gracia E. In vitro development of S. aureus biofilms using slime-producing variant and ATP-bioluminescence for automatic bacterial quantification/ E. Gracia, A. Fernandez// Luminescence. 1999. - Vol. 14, N. 1 - P. 23-31.

209. Hastings J.W. Bacterial bioluminescence/ J.W. Hastings, K.H. Nealson// Ann. Rev. Microbiol. -1997. Vol. 31. - P. 549-595.

210. Havell E. The role of the flora in cytokine responses/ E. Havell// Microb. Ecology Health and Disease. 1999. - Vol. 11, N.2. - P. 104.

211. Holo H. Plantaricin W from Lactobacillus plantarum belongs to a new family of two-peptide lantibiotics/ H. Holo, Z. Jeknic, M. Daeschel, S. Stevanovic// Microbiology. 2001. - Vol. 147, N. 3. - P. 643-651.

212. Huang Y. Acetate production from whey lactose using co-immobilized cells of homolactic and homoacetic bacteria in a fibrous-bed bioreactor/ Y. Huang, S. YangII Biotechnol and Bioeng. 1998. - Vol. 60, N. 4. - P. 498-507.

213. Jake M. Evidens for the involvement of thiocyanate in the inhibition by Lactobacillus acidophilus/ M. Jake, B.J. Wood, D.R. Berry// Microbes. 1990. -Vol. 62.

214. Jassim S. In vivo bioluminescence/ S. Jassim, A. Ellison, S. Denyer// J. Biolum. Chemilum. 1990.-N. 3.-P. 115-122.

215. Juckett G. Prevention and treatment of traveler's diarrhea/ G. Juckett// Am. Fam. Physician. 1999. - Vol. 60, N. l.-P. 119-124, 135-136.

216. Kaegi E. Unconventional therapies for cancer: 3. Iscador. Task Force on Alternative Therapies of the Canadian Breast Cancer Research Initiative/ E. Kaegi// CMAJ. 1998. - Vol. 158, N. 9. - P. 1157-1159.

217. Kagermeier-Gallaway A.S. International Committee on Systematic Bacteriology / A.S. Kagermeier-Gallaway/ Minutes of the meetings, 4 and 6 July 1994, Praque, Czech Republic// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. - Vol. 50. -N. 3. -P. 1391-1392.

218. Kailasapathy K.A. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp.l K.A. Kailasapathy, J. ChinII Immunol Cell Biol. 2000. - Vol. 78. - P. 80-88.

219. Kaiser R.L.E. Photobacterium phosphoreum. Toxicity Data Index/ R.L.E. Kaiser, V.S. Palabrica// Water Poll. Res. J. Canada. 1991. - Vol. 26, N. 3. - P. 361-431.

220. Kamel B.S. Fermented whole wheat flour and whey in food preparation/ B.S. Kamel// Process Biochem. 1985. - Vol. 20, N. 6. - P. 190-193.

221. Kar T. Therapeutic properties of whey used as fermented drink/ Т. Kar, A.K. Misra// Rev. Microbiol. 1999. - Vol. 30, N. 2. - P. 163-169.

222. Katouli M. Composition and diversity of intestinal coliform flora influence bacterial translocation in rats after hemorrhagic stress/ M. Katouli, T. BarkII Infect. Immun. 1994. - Vol. 62. - N. 11. - P. 4768-4774.

223. Kirjavainen P.V., Gibson G.R. Healthy gut microflora and allergy: Factors influencing development of the microbiota // Ann. Med. 1999. - Vol. 31, No.4. - P. 288-292.

224. Klebanoff SJ. Viricidal effect of Lactobacillus acidophilus! SJ. Klebanoff, RW. Coombs// J. Exp. Med., 1991. Vol. 174, N. 1.

225. Kleesen В. Effects of inulin and lactose on fecal microflora, microbial activity, and bowel habit in elderly constipated persons/ B. Kleesen, B. Sykura, H.-J. Zunft, M. Blaut// Am. J. Clin. Nutr. 1997. - Vol. 65. - P. 1397-402.

226. Korpela M.T. Recombinant Escherichia coli sensor strain for the detection of tetracyclines/M.T. Korpela, J.S. Kurittu, J.T. Karvinen// Anal. Chem. 70. 1998. -N. 6.-P. 4457-4462.

227. Korschunov V.M. Treatment of Experimental Acute Radiation Disease/ V.M. Korschunov, V.V. Smeyanov// Contract Report 98-102, Bethesda, Maryland, USA. 1998.

228. Kwan K.K. Mutatox test: A new test for monitoring environmental genotoxic agents/ K.K. Kwan, В.J. Dutka, S.S. Rao, D. Lui D// Environmental Pollution. -1990. Vol. 65, N. 3. - P. 323-332.

229. Lee P.C. Batch and continuous cultivation of Anaerobiospirullum succiniproducens for the production of succinic acid from whey/ P.C. Lee, W.G. Lee// Appl. Microbiol, and Biotechnol. 2000. - Vol. 54, N. 1. - P. 23-27.

230. Lewis C.B. Detection of bacteriocins produced by lactic acid bacteria/ C.B. Lewis, T.J. Montville// J. Microbiol. Methods. 1991. - Vol. 13.

231. Lidbeck A. Lactobacilli, anticarcinogenic activities and human intestinal microflora/ A. Lidbeck// Eur. J. Cancer. Prev. 1992. - Vol. 1, N.5. - P. 341-353.

232. Linko P. Biotechnology in whey valorization/ P. Linko// Food Industries and Environment. Int. Symp., Budapest, 1982. - P. 221-227.

233. Luchansky J. Probiotic bifidobacterium strain, Wisconsin Alumni Research Foundation/ J. Luchansky, S. Tsai. N. 5902743 USA, МПК6 C12N 1/00, 1/20.- 1999.

234. Maiorella B.L. Ethanol, biomass and enzyme production for whey waste abatement/ B.L. Maiorella, F. Castillo// J. Proc. Biochem. 1984. - Vol. 19, N. 4.-P. 157-161.

235. McFarland L.W. Biotherapeutic Agents and Infection Diseases/ L.W. McFarland. Human Press. - 1999.

236. Mc Farland L.V. Biotherapeutic agents: past, present and future/ L.V. Mc Farland, G.W. Elmer// Microecology Ther. 1995. - Vol. 23. - P.46-73.

237. McGroarty J.A. Detection of lactobacillus substance that inhibits Escherichia colil J.A. McGroarty, G. Reid// Can. J. Microbiol. 1988. - Vol. 34.

238. McNicol P.J. The effect of vaginal microbes on in vivo and in vitro expression of human papillomavirus 16 E6-E7 genes (ENG)/ P.J. McNicol, M. Paraskevas, F.B. Guijon// Cancer Detect. Prev. 1999. - Vol. 23, N. 1. - P. 13-21.

239. Meighen E. Molecular biology of bacterial bioluminescence/ E. Meighen// Microbiol. Rev. 1991. - Vol. 55, N. 1. - P. 123-142.

240. Messi P. Detection and preliminary characterization of a bacteriocin (plantaricin 35d) produced by a Lactobacillus plantarum strain/ P. Messi, M. Bondi, C. Sabia, R. Battini// Int. J. Food Microbiol. 2001. - Vol. 64, N. 1-2. - P. 193-198.

241. Meyrath J. Biomass from whey/ J. Meyrath, K. Bayer// Economic Microbiology. London, 1979. - Vol. 4: Microb. Biomass / Ed. A.H. Rose. - P. 207-269.

242. Minnock A. Photoinactivation of bacteria/ A. Minnock, D.I. Vernon// J. Photochem. Photobiol. В.: Biol. 1996. Vol. 32. - P. 159-164.

243. Mlobeli N.T. Physiology and kinetics of Bifidobacterium bifidum during growth on different sugars/ N.T. Mlobeli, N.A. Gutierrez, I.S. Maddox// Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1998. - Vol. 50, No. 1.

244. Mogensen G. Functional aspects of pro- and prebiotics. A literature review on immune modulation and influence on cancer/ G. Mogensen, J. Rowland// Microb. Ecology Health and Disease. 2000. - Vol. 12, N. 2. - P. 40-44.

245. Morris M. Bacterial vaginosis: a public health review/ M. Morris, A. Nicoll// Brit. J. Obstet. and Gynaecol. 2001. - Vol. 108, N. 5. - P. 439-450.

246. Navarro L. Bacteriocin production by lactic acid bacteria isolated from Rioja red wines/ L. Navarro, M. Zarazaga, J. Sbenz, F. Ruiz-Larrea// J. Appl. Microbiol. -2000.-Vol. 88, N. l.-P. 44-51.

247. Nieves B. Bacterial vaginosis/ B. Nieves// Anaerobe. 1999. - Vol. 4, N. 3-4-P. 343-345.

248. O'Sullivan D.J. Screening of intestinal microflora for effective probiotic bacteria/ D.J. O'Sullivan// J.Agr. and Food Chem. 2001. - Vol. 49, N. 4. - P. 1751-1760.

249. Ouwehand A. Prebiotics and probiotics: safety aspects and risk assessment/ A. Ouwehand, S. Salminen// Microb. Ecology Health and Disease. 1999. - Vol. 11, N. 2.-P. 109.

250. Oxoid Manual of Culture Media, Ingredients and other Laboratoiy // Publ. by OxoidLim. 1981. — P.ll.

251. Podoprigora G.I. Stimulatory effect of Gram-Positive and Gram-Negative probiotics on the host mono-nuclear phagocyte system in gnotobiotic mice/ G.I. Podoprigora, L.B. Comunian// Microb. Ecology Health and Disease. 1999. -Vol. 11, N. 2.-P. 113-114.

252. Ratcliffe B. The potencial for beneficial manipulation of the gut microflora by dietary means/ B. Ratcliffe, J. McMillan// BNF Nutr. Bull. 1999. - Vol. 24, N. 87.-P. 82-90.

253. Reid G. Lactobacillus therapies/ G. Reid, A.W. Bruce, H.J. Busscher, H. Van der Mei. Urex Biotech, Inc. N. 08/867002, A61K 35/74. - 2000.

254. Ribo M.J. Photobacterium phosphoreum Toxicity Bioassay/ M.J. Ribo, R.L. Kaizer// Toxic. Asses. Int. Quart. 1987. - Vol. 2. - P. 305-323.

255. Roberfroid M.B. Prebiotics and probiotics: are they functional foods?/ M.B. Roberfroid // J. Clin. Nutr. 2000. - Vol. 71, N. 6. - P. 1682-1687.

256. Rowland I.R. The effects of transgalactosylated oligosaccharides on gut flora metabolism in rats associated with a human faecal microflora/ I.R. Rowland, R. Tanaka// J. Appl. Bacteriol. 1993. - Vol. 74. - P. 667-74.

257. Rowland J. Gut microflora metabolism what can the microbes do?/ J/ Rowland// Microb. Ecology Health and Disease. - 1999. - Vol. 11, N. 2. - P. 105-106.

258. Ruil L. Interference of Short Chain Fatty Acids Produced by Anaerobe with endocellular Pathogens: an Experimental model/ L. Ruil, A. Arzese// Abstract

259. Воос. XIX Intern. Congress Microb. Ecology and Disease. Rome, September 1821, 1994.

260. Sablon E. Antimicrobial peptides of lactic acid bacteria: mode of action, genetics and biosynthesis/ E. Sablon, B. Contreras, E. Vandamme// Adv Biochem Eng Biotechnol. 2000. - Vol. 68. - P. 21-60.

261. Sarkis GJ. L5 luciferase reporter mycobacteriophages: a sensitive tool for the detection and assay of live mycobacteria/ GJ. Sarkis, W.R. Jakobs, G.F. Hatfull// Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 15, N. 6. - P. 1059-1067.

262. Scudra L.Studies on whey fermentation using lactic acid bacteria L. acidophilus and L. bulgaricus/ L. Scudra, A. Blija// Acta biotechnol. 1998. - Vol. 18, N. 3-P. 277-288.

263. Selan L. Reliability of bioluminescence ATP assay for detection of bacteria/ L. Selan, F. Berlutty, C. Passariello// Ibid. 1992. - Vol. 30, N. 7. - P. 1739-1742.

264. Senthuran A. Lactic acid production by immobilized Lactobacillus casei in recycle batch reactor: A step towards optimization/ A. Senthuran, V. Senthuran // J. Biotechnol. 1999. - Vol. 73, N. 1. - P. 61-70.

265. Shiffrin E.J. Immunomodulation of human blood cells following the ingestion of lactic acid bacteria/ E.J. Shiffrin // J. Dairy Sci. 1995. - V.78, N.3. - P. 491497.

266. Shortt C. Lactobacillus casei Shirota — a biotherapeutic agent/ C. Shortt, T. Saco// Microb. Ecology Health and Disease. 1998. - Vol. 10, N.2. - P. 118119.

267. Stafford D.A. Detecting microbes by bioluminescence/ D.A. Stafford. N. 0006440.2, C12Q G01N 21/76. - 2000.

268. Stanley P.E. Overview of application of bioluminescence/ P.E. Stanley// Bioluminescence and Chemiluminescence. Acad. Press . N.Y. 1981. - P. 275282.

269. Steinberg S.M. A review of environmental application of bioluminescence measurements/ S.M. Steinberg, L.G. Poziomek, W.H. Engelmann// Chemosphere. 1995. - Vol. 30. - P. 2155-2197.

270. Todorov S. Influence of growth medium on bacteriocin production in Lactobacillus plantarum ST31/ S. Todorov, B. Gotcheva// Biotechnol. and Biotechnol. Equip. 2000. - Vol. 14, N. 1. - P. 50-55.

271. Tomas M. Hotton. The vaginal flora and urinary tract infections/ T. Hotton, W. Stamm/ Ed. Mobley, HLT Warron J.W. Washington ASM press, 1996. - XIV. -P. 67-86.

272. Toshio M. Antimicrobial Activities of Organic Acids Determined by Minimum inhibitory concentrations at different ph ranged/ M. Toshio, Y. Toshihiro, M. Akihiro// J. Jap. Soc. Food Sci. Technol. 1994. - Vol. 41, N. 10.

273. Tsunataro K. Method of increasing interferon production in humans. Institut Pasteur De Kyoto, Nitto Pharmaceutical Ind., Ltd./ K. Tsunataro. N. 5662900 USA, МПК6 AO IN 63/00, C12N 1/20. - 1997.

274. Turner D.L. Solution structure of plantaricin C, a novel lantibiotic/ D.L. Turner, L. Brennan, H.E. Meyer, C. Lohaus// Eur. J. Biochem. -1999. Vol. 264, N. 3. -P. 833-839.

275. Ulitzur S. Established technologies and new approaches in applying luminous bacteria for analytical purposes/ S. Ulitzur// J. of Bioluminescence and Chemiluminescence. -1997. Vol. 12, N. 4. - P. 179-192.

276. Vallino J.J. Modeling bacterial utilization of dissolved organic matter: Optimization replaces Monod growth Kinetics/ J.J. Vallino, C.S. Hopkinson, J.E. Hoblie// Limnol. Oceanogr. 1996. - Vol. 41, N. 8. - P. 1591-1609.

277. Van Kraaji C. Lantibiotics: Biosyntesis, mode of action and application/ C. Van Kraaji, M. de Vos Willem// Natur. Prod. Repts. 1999. - Vol. 62, N. 3. - P. 267277.

278. Van Loo. Functional food properties of non-digestible oligosaccharides: a consensus report from the ENDO project (DGXII AIRII-CT94-1095)/ Van Loo, J.A. Cummings, J.A. Delzenne, N.A. Englyst// Br. J. Nutr. 1999. - Vol. 81, N. 2.-P. 121-132.

279. Vassu Т. Lactic acid bacteria used as probiotics-isolation, preservation and biomass obtaining/ T. Vassu, E. Sararman// An. Univ., Bucuresti. Biol. — 1997. — Vol. 46.-P. 87-91.

280. Waters R. Lactobacillus reuterim and intestinal integrity/ R. Waters, N. Carbajai, I. Casas// Microb. Ecology Health and Disease. 1999. - Vol. 11, N. 2. - P. 126.

281. Wetzel K. Stress response in Lactococcus lactis and Streptococcus thermophilics induced by carbon starvation/ K. Wetzel, M. Menzel, K.J. Heller// Kiel, milchwirt. Forschungsber. 1999. - Vol. 51, N. 4. - P. 319-332.

282. Wiedermann U. Increased translocation of Escherichia coli and development of artrithis in vitamin A-deficient rats/ U. Wiedermann, L. A. Hanson// Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, N. 8. - P. 3062-3068.

283. Wilson M. Bacterial perturbation of cytokine networks/ M. Wilson, R. Seymour, B. Henderson// Ibid. 1998. - Vol. 66, N. 6. - P. 2401-2409.

284. Woodward C. Drug treatment of common STDs: Part II. Vaginal infections, pelvic inflammatory disease and genital warts/ C. Woodward, M.A. Fisher// Am. Fam. Physician. 1999. - Vol. 60, N. 6. - P. 1716-1722.

285. Yamamoto Y. Structural study on an exocellular polysaccharide produced by Lactobacillus! Y. Yamamoto, S. Murosaki, R. Yamauchi// Carbohydr. Res. -1994.-Vol. 261, N. 1.

286. Zlotta A.R. Biological response modifiers for the treatment of superficial bladder tumors. (ENG; includes abstract)/ A.R. Zlotta, C.C. Schulman// Eur. Urol. 2000. - Vol. 37, N. 3. - P. 10-15.

Информация о работе

Арчакова, Елена Геннадьевна
кандидата медицинских наук
Пермь, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Совершенствование методов контроля специфической активности пробиотиков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно