Механизм формирования электронно-возбужденных состояний в бактериальной биолюминесценции

Кудряшева, Надежда Степановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизм формирования электронно-возбужденных состояний в бактериальной биолюминесценции
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизм формирования электронно-возбужденных состояний в бактериальной биолюминесценции"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК-СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Институт биофизики

На правахрукописи

КУДРЯШЕВАНадежда Степановна

МЕХАНИЗМ ФОРМИРОВАНИЯ электронно-возбужденных СОСТОЯНИЙ В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

03.00.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Красноярск, 2004

Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН г. Красноярска

Официальные оппоненты: - чл.-корр. РАН, доктор химических

наук, профессор Казаков В.П.

- доктор физико-математических наук, профессор Хлебопрос Р.Г.

- доктор химических наук, старший научный сотрудник Тарабанько В.Е.

Ведущая организация: Московский государственный

университет.

Защита диссертации состоится « 2004 года

в_час. на заседании диссертационного Совета Д 003.007.01 в

Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, Красноярск, Академгородок

(факс 8-3912-433400, тел.8-3912-431579)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан

2004

года

Ученый секретарь ^

диссертационного Совета

кандидат физико-математических наук Косолапова Л.Г.

Актуальность проблемы. Процессы жизнедеятельности организмов всегда сопровождаются слабой' и сверхслабой хемилюминесценцией. Это связано с тем, что в результате реакций окисления в биологических системах формируются электронно -возбужденные состояния молекул продуктов. Малый квантовый выход хемилюминесценции в живых объектах связан с эффективной безызлучательной конверсией возбуждения. Биолюминесценция является частным случаем хемилюминесценции, отличается присутствием биологических катализаторов и характеризуется высокими квантовыми выходами (от 1 до 100%). Формирование возбужденных состояний эмиттеров биолюминесценции является наименее изученной стадией биолюминесцентных процессов.

В настоящее время изучение механизма формирования возбуждения в хемилюминесцентных реакциях осуществляется на основе квантово-химических подходов с учетом анализа скоростей элементарных физико-химических процессов [Л1,Л2].. Наиболее вероятным полагается формирование -состояний с локализацией возбуждения на карбонильных группах. Кроме того, в 70-80-х годах разработана систематика молекул по спектрально-люминесцентным, свойствам [ЛЗ], в соответствии с которой эмиттеры всех биолюминесцентных организмов принадлежат к V спектрально -люминесцентной группе, молекулы которой характеризуются высокими квантовыми выходами л л * - ф л у о рее це н ц и и и высшими состояния пл*-типа. Именно принадлежность эмиттеров биолюминесценции к данной группе соединений и определяет высокие квантовые выходы излучательной дезактивации возбужденных эмиттеров биолюминесценции. Т.о., интенсивность биолюминесценции определяется, во-первых, высокими скоростями ферментативных биолюминесцентных реакций, и, во-вторых, электронной структурой молекул эмиттеров.

биолюминесценции) является интегральной характеристикой скоростей элементарных физико-химических процессов на всех стадиях этого процесса: от начальных стадий химических перестроек до формирования и дезактивации электронно-возбужденных состояний.

Для анализа скоростей элементарных физико-химических процессов в биолюминесцентной системе использован метод воздействия на систему рядами гомологичных соединений, различающихся их физико-химическими характеристиками: энергией электронно-возбужденных состояний, квантовым выходом флуоресценции, редокс-потенциалом, количеством гидрофобных заместителей, включением в состав молекулы тяжелого атома и др. Физико-химические характеристики экзогенных соединений определяют их влияние на элементарные физико-химические процессы. Так, скорость межмолекулярной миграции энергии возбуждения связана с относительным положением уровней энергии электронных состояний донора и акцептора; скорость внутримолекулярной миграции энергии зависит от присутствия тяжелого атома; эффективность миграции электрона или водорода в полярной среде (Н = е- + H+) определяются электронно-акцепторными характеристиками экзогенных молекул; гидрофобные взаимодействия зависят от количества и размера гидрофобных фрагментов в этих соединениях.

Таким образом, развитие теорий хемилюминесценции, строения молекул и межмолекулярной миграции энергии возбуждения определяют основу для изучения физико-химического механизма формирования возбуждения в биолюминесцентном процессе. Исследование механизма формирования электронно-возбужденных состояний биолюминесцентного эмиттера актуально с научной точки зрения.

Анализ закономерностей воздействия экзогенных соединений на биолюминесцентные системы актуален и с практической точки зрения, т.к. результатом его является создание физико-химических основ люминесцентного биотестирования.

соединений с различными физико-химическими характеристиками на биолюминесцентную систему сопряженных ферментативных реакций.

В работе поставлены следующие задачи.

1. Исследовать элементарные стадии, предшествующие образованию флуоресцентных состояний эмиттера бактериальной биолюминесценции. Экспериментально доказать возможность заселения высших электронно-возбужденных состояний эмиттера на основе анализа спектров биолюминесценции в присутствии ароматических соединений с различной' энергией флуоресцентных состояний.

2. Установить зависимость эффективности излучательной дезактивации флуоресцентных состояний биолюминесцентного эмиттера от следующих факторов:

♦ эффективности межмолекулярной миграции; энергии возбуждения, варьируемой добавлением экзогенных соединений с различными энергиями флуоресцентных 1) состояний;

♦ эффективности внутримолекулярной миграции энергии возбуждения, варьируемой добавлением экзогенных соединений, включающих атомы галоидов разной массы;

♦ влияния катионов металлов с различными электронно -акцепторными свойствами на распределение электронной плотности в биолюминесцентной систехМе сопряженных реакций;

♦ влияния экзогенных окислителей на процессы миграции водорода (Н = е-+ Н+) в окислительно-восстановительной реакции с участием НАДН, сопряженной с биолюминесцентной реакцией.

3. Установить зависимости эффективности взаимодействия экзогенных соединений с ферментами биолюминесцентной системы реакций от физико-химических характеристик данных соединений.

4. Разработать физико-химические основы люминесцентного биотестирования для прогнозирования результатов анализа и направленного изменения чувствительности биотестов к определенным группам поллютантов.

использованием флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением показана возможность межмолекулярной резонансной миграции энергии с высших электронно-возбужденных состояний биолюминесцентного эмиттера на экзогенные гидрофобные молекулы.

Впервые эффективность излучательной дезактивации флуоресцентных состояний биолюминесцентного эмиттера связана со скоростями элементарных физико-химических процессов (переноса энергии, электрона, водорода), которые варьировались добавлением экзогенных соединений с заданными физико-химическими характеристиками (энергией электронно-возбужденных состояний, квантовым выходом флуоресценции, редокс-потенциалом, количеством гидрофобных заместителей и т.д.). Установлены зависимости- между данными характеристиками экзогенных соединений и изменением скорости и спектральных характеристик биолюминесцентной реакции. Продемонстрирован внешний эффект тяжелого атома в биолюминесцентной системе. Показано, что изменение кинетических параметров биолюминесценции (индукционного периода, времени выхода, на максимум биолюминесценции) системы сопряженных ферментативных реакций, катализируемых бактериальной люциферазой и НАД(Ф):ФМН-оксидоредуктазой, в присутствии окислителей связаны с влиянием этих молекул на процессы переноса водорода (Н = е- + Н+) в реакции окисления НАДН, сопряженной с биолюминесцентной реакцией. Показано, что основным механизмом влияния катионов металлов на скорость биолюминесцентной реакции является изменение распределения электронной плотности в биолюминесцентной системе сопряженных реакций. Установлена связь физико-химических характеристик экзогенных соединений (массы галогена в составе молекулы, количества гидрофобных заместителей) с эффективностью взаимодействия этих соединений с ферментами биолюминесцентной системы.

Предложен метод количественного исследования свойств биологических тестовых систем на основе воздействия рядами гомологичных соединений с различными физико-химическими характеристиками.

Положения, выносимые на защиту.

1. Обоснование и экспериментальное доказательство возможности заселения высших электронно-возбужденных состояний 6

эмиттера бактериальной биолюминесценции в качестве стадии, предшествующей образованию флуоресцентных состояний эмиттера в биолюминесцентной реакции.

2. Механизмы воздействия экзогенных соединений на бактериальную биолюминесценцию: изменение заселенности электронно-возбужденных состояний эмиттера, распределения электронной плотности, скорости сопряженных реакций, активности ферментов. Определяющая роль физико-химических характеристик экзогенных соединений (энергии электронно-возбужденных состояний, электронно-акцепторных характеристик, массы галоида в составе молекулы, количества гидрофобных заместителей) в перечисленных эффектах.

3. Физико-химический подход для изучения механизма функционирования биологических тестовых систем путем воздействия рядами гомологичных соединений с различными физико-химическими характеристиками: энергией электронно-возбужденных состояний, редокс-потенциалом, гидрофобностыо и т.д.

Практическая значимость.. Полученные в работе закономерности воздействия рядов экзогенных соединений на биолюминесцентные системы представляют собой физико-химическую основу люминесцентного биотестирования и используются при разработке методов целенаправленного изменения чувствительности биолюминесцентных тестовых систем к различным группам поллютантов, а также прогнозирования результатов люминесцентных биотестов.

Апробация работы. Основные положения работы представлены на 5-ой Всесоюзной конференции по органическим люминофорам (Харьков, 1987); 3-ем Всесоюзном совещании «Люминесценция и развитие ее применений в народном хозяйстве» (Рига, 1989); 4-ой Всесоюзной конференции по фотохимии (Новосибирск, 1989); Совещании по проблемам гидрометеорологического обеспечения народного хозяйства Сибири (Красноярск, 1989); 5-м Всесоюзнм совещании по люминесценции (Караганда, 1989); 3-ем Всесоюзном совещании по хемилюминесценции (Рига, 1990); 3-ей Международной конференции по химической инженерии (Прага, 1990); 4-м

Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и экологии и его аппаратурное обеспечение" (Клин, 1992), Всероссийской конференции по биотехнологии (Пущино, 1992); Международной конференции по наноструктурным технологиям (Москва, 1993); Международных конференциях по биолюминесценции и хемилюминесценции (Гаваи, США, 1993; Вудс Хол, США, 1996; Болонья, Италия, 1998; Кембридж, Великобритания, 2002); Международных конференциях по экологии (Санкт-Петербург, 1994, Пермь, 2001); Международной конференции по антиоксидантной терапии (Берлин, Германия, 1996); Международным совещаниям по биосенсорам (Лунд, Швеция, 1996; Берлин, Германия, 1998); 9-ой Международной конференции по коллоидным системам (София, Болгария, 1997); Международной конференции по биотехнологии (Будапешт, Венгрия, 1997); 3-м Международном симпозиуме по новым ароматическим соединениям (Гонг-Конг, 1998); Международном биофизическом конгрессе (Дели, Индия, 1999); 2-м Съезде биофизиков России (Москва, 1999); Международных симпозиумах по полициклическим ароматическим соединениям (Лион, Франция, 1999; Париж, Франция 2001); 4-м Съезде белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Белоруссия, 2000); Международной конференции по биологической физике (Токио, Япония, 2001); Международной конференции по химии высокоорганизованных соединений (С.-Петербург, 2001), Международной конференции по фотохимии (Москва, 2001), Международной конференции по Спектроскопии биологических молекул (Сегед, Венгрия, 2003), Международной школе по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Саратов, 2003).

Публикации. Основные материалы диссертации" изложены в более чем 100 публикациях, 40 из них - статьи в реферируемых российских (советских) и зарубежных изданиях.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №98-02-18054 и №01-0332843); Российско-голландского гранта NWO-Russia 047-007-005; NATO Collaborative Linkage Grant (CLG-974984); грант REC-002 Министерства образования Российской Федерации и Американского фонда гражданских исследований и развития для независимых

государств бывшего Советского Союза (программа «Фундаментальные исследования и высшее образование»); Федеральной целевой программы «Интеграция высшего образования и фундаментальной науки» (проекты А0021 и В008); гранта ИНТАС №562, грантов Красноярского краевого фонда науки 5F0086-C и 7F0202-D; гранта РАН для молодых ученых №223.

Список сокращений: ФМН - флавинмононуклеотид, НАДН -никотинамиддинуклеотид восстановленный, РОРОР - 1,4-бис(5-фенилоксазол-2-ил)бензол, МСБ - п-бис(о-метилстерил)бензол, I — интенсивность биолюминесценции, !о - контрольное значение интенсивности биолюминесценции в отсутствии экзогенных соединений, С - концентрация экзогенных соединений.

Личный вклад соискателя состоял в проведении основных экспериментальных и теоретических работ по теме диссертации. Автору принадлежит гипотеза активности высших электронно-возбужденных состояний в биолюминесцентном процессе и метод использования рядов гомологичных соединений с различными физико-химическими характеристиками для изучения механизма функционирования ферментативных систем. Экспериментальная проверка гипотезы и использование предложенного метода осуществлялись совместно с сотрудниками и аспирантами лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, кафедры квантовой электроники Красноярского госуниверситета, лаборатории лазерной спектроскопии Новосибирского государственного технического университета, Микроспектроскопического центра Агроуниверситета г. Вагенинген (Голландия).

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на 326 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, пяти глав с изложением результатов работы, заключения, выводов и списка литературы (319 источников). В диссертации представлено 74 рисунка и 24 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава «Электронно-возбужденные состояния в бактериальной биолюминесценции» представляет собой обзор литературы, в котором изложены современные представления о механизмах функционирования биолюминесцентной системы светящихся бактерий, а также имеющиеся подходы к анализу действия экзогенных соединений на биолюминесцентные системы. Описаны физико-химические основы теории хемилюминесценции и систематика молекул по спектрально-люминесцентным свойствам, на основе которых предлагается гипотеза активности высших электронно-возбужденных состояний в биолюминесцентном процессе. Приведена схема предлагаемого механизма формирования высших триплетных состояний П71*-типа (Рис.1) в результате внутримолекулярного переноса электрона от депротонированной кетоимидной группы в процессе формирования эмиттера биолюминесценции. Изложены современные представления о миграции энергии возбуждения, разработанные для растворов флуоресцентных соединений. Показано, что возможными путями направленного воздействия экзогенных соединений на биолюминесцентную систему являются следующие (Рис.2): (1) образование дополнительных межмолекулярных каналов резонансной миграции энергии с электронно-возбужденных состояний эмиттера, (2) изменение эффективности внутримолекулярных процессов переноса энергии в результате увеличения скорости интеркомбинационной конверсии в эмиттере биолюминесценции в присутствии внешнего тяжелого атома, (3) изменение скорости реакций, сопряженных с биолюминесцентной, (4) взаимодействие с ферментами биолюминесцентной системы, (5) влияние на распределение электронной плотности в биолюминесцентной системе. В конце главы приведен обзор методов использования биолюминесцентных систем для экологического мониторинга.

Во второй главе «Методика, эксперимента» описаны оборудование, материалы и методы исследования. Приведены методики, использованные для изучения кинетики биолюминесценции, спектров поглощения и люминесценции при стационарном

возбуждении. Описаны установки для изучения кинетики спада люминесценции с пикосекундным разрешением, приведены методики расчета времен жизни флуоресценции и времен вращательной корреляции анизотропии флуоресценции. Изложена методика определения скорости НАДН-зависимых процессов методом абсорбционной спектроскопии. Приведены спектрально -люминесцентные характеристики молекул, используемых в качестве экзогенных соединений в биолюминесцентных системах.

Рис.1. Формирование электронно-возбужденного эмиттера бактериальной биолюминесценции. 1 - 4А-пероксифлавин, 2 - пл* состояние пероксифлавина, 3 - молекула гидроксифлавина в основном

состоянии.

В третьей главе «Изучение заселенности электронно-возбужденных состояний эмиттера» изложены экспериментальные результаты исследования заселенности электронно-возбужденных состояний эмиттера биолюминесценции. Изучены корреляции между скоростью излучатсльной дезактивации флуоресцентных состояний биолюминесцентного эмиттера и эффективностью внутри- и

межмолекулярных процессов переноса энергии. Эффективность внутри- и межмолекулярных процессов миграции энергии варьировали путем введения в систему экзогенных соединений с различной энергией электронно-возбужденных состояний и/или включением в структуру молекулы атомов галоидов разной массы.

Химическая реакция

____*

I—

Воздействие экзогенных соединений: 1. Заселенность возбужденных состояний

► Т

Г * П'

2. Б-Т конверсия--------------

^__3. сопряженные реакции

4. ферменты

5. распределение электронной плотности (все стадии процесса)

Эмиттер биолюминесценции

Рис.2. Влияние экзогенных соединений на различных стадиях биолюминесцентного процесса.

Межмолекулярную миграцию энергии наблюдали в присутствии химически инертных флуоресцентных молекул в качестве акцепторов энергии возбуждения (Рис. 3). Предполагалось, что данные соединения изменяли интенсивность биолюминесценции в результате образования межмолекулярных каналов миграции, энергии с возбужденных состояний, эмиттера путем резонансного переноса (Рис.2, тип воздействия №1) или абсорбции биолюминесценции, а также взаимодействия с ферментами (Рис.2, тип воздействия №4).

Рассмотрены две группы флуоресцентных соединений, различающихся относительным положением, уровней энергии флуоресцентных состояний относительно биолюминесцентного эмиттера. Флуоресцентные молекулы с энергией Б^-состояний

меньшей, чем энергия аналогичного состояния биолюминесцентного эмиттера (Рис.3б), и значительным интегралом перекрытия спектров их поглощения со спектром биолюминесценции способны акцептировать энергию с 8яя*-состояний биолюминесцентного эмиттера; молекулы с энергией -состояний большей, чем энергия аналогичного состояния биолюминесцентного эмиттера (Рис.3 в), и отсутствием перекрытия спектров их поглощения с биолюминесценцией могут быть акцепторами энергии только с высших электронно-возбужденных состояний эмиттера при условии их заселенности.

Рис.3. Относительное положение и орбитальная природа уровней энергии электронных состояний (а) биолюминесцентного эмиттера, (б, в) экзогенных молекул-акцепторов энергии.

Экспериментальное доказательство возможности заселения высших электронно-возбужденных состояний с использованием экзогенных молекулярных акцепторов энергии, С использованием

ряда флуоресцентных молекул, энергия возбужденных состояний которых характеризуется рисунком Зв, в условиях исключения межмолекулярного синглет-синглетного переноса и абсорбции биолюминесценции экспериментально проверено предположение о заселении высших электронно-возбужденных состояний эмиттера в биолюминесцентном процессе. Для этого изучены спектры биолюминесценции в присутствии химически инертных флуоресцентных соединений. На Рис.4 приведены энергии

флуоресцентных состояний биолюминесцентного эмиттера (Рис.4,

структура 1) и используемых молекул акцепторов (Рис.4, структуры 27>-

Е, см"

30000

20000

32600

30100

26000 26100 26200 26100 -

27100

•21700

ЬУ|

Ьу2

Ьуч

Ьу4

Ьу7

0 1 ^ 1 \1/_Ф \1/ \1/

2 3 4 5 6 7 Рис.4. Энергии электронно-возбужденных состояний эмиттера бактериальной биолюминесценции (1) и флуоресцентных состояний ароматических молекул (2-7): 2 — РОРОР, 3 - антрацен, 4 - МСБ, 5 — пирен, 6 - 2-метокси-нафталин, 7 - п-терфенил. Высшее электронно-возбужденное состояние эмиттера бактериальной биолюминесценции показано пунктиром.

На Рис.5 приведен спектр биолюминесценции в присутствии-РОРОР (спектр 3). Максимум сенсибилизированной люминесценции РОРОР, которая была зарегистрирована в этих условиях (спектры 3, 4), совпадает с максимумом флуоресценции РОРОР при фотовозбуждении (^тпах =418 нм, спектр 5). Аналогичные изменения в спектре биолюминесценции наблюдали в присутствии антрацена и МСБ. Таким образом, зарегистрированная сенсибилизированная флуоресценция РОРОР, антрацена и МСБ свидетельствует о заселенности высших

электронно-возбужденных состояний эмиттера в биолюминесцентном процессе.

D, I

1.0 -

0.5 -

0.0

300

400

500

600

длина волны, нм

Рис. 5. 1 - спектр поглощения РОРОР (С=10-6М, этанол). Спектры люминесценции: 2 - биолюминесценция, 3 - биолюминесценция в присутствии РОРОР (С = 1.4-1 О-7 М), 4 - сенсибилизированная люминесценция РОРОР, т.е. разностный спектр РОРОР в биолюминесцентной' системе, увеличенный' в 7 раз, 5 - спектр фотолюминесценции РОРОР (С=10-6М; этанол).

В аналогичных условиях в биолюминесцентной реакции не найдено сенсибилизированной флуоресценции пирена, 2-метокси-нафталина; н-терфенила. (структуры .5-7, Рис.4). Этот факт позволяет локализовать энергию высших электронно-возбужденных, состояний эмиттера бактериальной биолюминесценции около 26000 см-1.

Аналогично тому, как высшие электронно-возбужденные состояния ответственны. за появление в голубой области спектра сенсибилизированной флуоресценции химически инертных экзогенных соединений, эти состояния могут быть ответственны и за голубой сдвиг биолюминесценции в присутствии антенных протеинов, например, люмазина [Л4]. Переносу энергии в этом случае способствуют межбелковые взаимодействия. Эти процессы важны для понимания механизма биолюминесценции in vivo.

Следует отметить, что результаты приведенных экспериментов не дают возможности однозначно сделать вывод о мультиплетности высших электронно-возбужденных состояний эмиттера.

Изучение возможности миграции энергии в системе: эмиттер биолюминесценции - гидрофобная молекула. Методами флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением при импульсном возбуждении изучены взаимодействия с ферментами ряда гидрофобных органических флуоресцентных соединений, которые были использованы для мониторинга заселенности высших электронно-возбужденных состояний эмиттера, - РОРОР, МСБ, антрацена, 1,4-нафталиндиола.

Кривые спада флуоресценции 1(1) и анизотропии флуоресценции г(0 были описаны суммой экспоненциальных членов:

где р, и т, — амплитуда и время жизни /-той компоненты флуоресценции, соответственно; и <{>, — начальная анизотропия и время вращательной корреляции /-той компоненты анизотропии флуоресценции, соответственно; N и М — число компонент в кинетике спада флуоресценции и анизотропии флуоресценции.

В Табл. 1 приведены характеристики спада анизотропии флуоресценции молекул РОРОР, МСБ, антрацена, 1,4-нафталиндиола в этаноле, водно-этанольном растворе в отсутствии и присутствии бактериальной люциферазы, а также аналогичные характеристики для раствора бактериальной люциферазы.

Анализ времен вращательной корреляции ф растворов данных флуоресцентных соединений показывает, что добавление фермента меняет параметры спада анизотропии веществ. Как видно из Табл. 1, величины ф молекул в присутствии люциферазы не совпадают ни с ф в спиртовой, ни в водно-спиртовой средах (различия - за пределами погрешности эксперимента) и значительно отличаются от ф макромолекулы люциферазы, рассчитанной из данных по спаду фотолюминесценции ароматических аминокислотных остатков. Такое

изменение спектральных свойств растворов молекул в присутствии люциферазы объясняется гидрофобными взаимодействиями между ферментом и молекулами, основа которых - универсальные межмолекуляные (ван-дер-ваальсовые) взаимодействия.

Таблица 1.

Параметры спада анизотропии флуоресценции гидрофобных молекул и бактериальной люциферазы.

образец Pi <t»i,ns (32 ф2, ns

Растворы в этаноле*

1.4-нафталиндиол 0.02 0.20 (0.12-0.30) - -

РОРОР 0.30 0.29 (0.26-0.32) - -

МСБ 0.34 0.15(0.13-0.16) - -

Антрацен 0.20 0.21 (0.16-0.27) 0.02 7.4 (2.3-13.5)

Водно-этанольные (100:1) растворы*

1.4-нафталиндиол 0.10 0.06 (0.03-0.11) 0.03 1.2 (0.8-2.0)

РОРОР 0.11 0.93 (0.50-1.43) 0.19 33 (16-49)

МСБ 0.34 23 (18-33) - -

Антрацен Анизотропия не определяется

Водно-этанольные ( М)* 00:1) растворы в присутствии люциферазы (2-10"6

1.4- нафталиндиол 0.06 0.40 (0.19-0,61) 0.14 11.4(7.1-15.7)

РОРОР 0.20 9.7 (7.7-12.6) - -

МСБ 0.16 1113 (9.1-14.5) - -

Антрацен 0.13 4.8 (3.7-7.7) - -

Водный раствор бактериальной люциферазы (2-10"6М)**

Люцифераза 0.04 0.44(0.23-0.65) | 0.22 34(30-39)

Условия: (*)20°С, С=Ю"7М, А.аозбужлСнИ,=343 нм, ^„,^„„=426 нм. (**) 20°С, С=10"6М, Я. возбужден,,, =300 нм, X регистрации =340 нм. В скобках

приведены стандартные отклонения величин ф.

Наличие межмолекулярных взаимодействий подтверждает и изменение спектров фотолюминесценции растворов исследованных флуоресцентных молекул при добавлении люциферазы. На Рис. 6 в качестве примера приведены спектры РОРОР в различных

микроокружениях. Из этого рисунка видно, что при переходе от спиртового раствора к водно-спиртовому происходит перераспределение интенсивности в колебательных подуровнях спектра люминесценции РОРОР, сопровождающееся общим падением интенсивности люминесценции. Добавление фермента частично

Рис.6. Спектры флуоресценции РОРОР, С=10-7 М, возбуждение 343 нм, t=20°C: 1 -раствор в этаноле, 2 -водно-этанольный раствор (100:1), 3-водно-э ганол ьный раствор (100:1) в присутствии люциферазы РМео%пслЫ (2-10"6 М).

Наличие универсальных межмолекулярных взаимодействий, радиус действия которых порядка 1 нм, предполагает возможность резонансного межмолекулярного переноса энергии (включая обменно-резонансный перенос с характеристическим радиусом 1-1,5 нм) в качестве механизма возбуждения этих соединений в биолюминесцентной реакции в отсутствии перекрытия спектра биолюминесценции и спектров поглощения данных гидрофобных молекул.

Дезактивацию флуоресцентных состояний

биолюминесцентного эмиттера в присутствии

молекулярных акцепторов энергии изучали на примере ряда флуоресцентных красителей (родамин 6Ж, незамещенный родамин, уранин, эозин и эритрозин), характеризующихся энергией флуоресцентных состояний меньшей энергии аналогичного состояния эмиттера биолюминесценции (Рис. 36) и значительным перекрытием спектров их поглощения со спектром биолюминесценции. В спектре биолюминесценции зарегистрировано увеличение интенсивности в

снимает указанные эффекты.

О L--—^ ■' --,--

350 400 450 500

Длина волны нм

области длин волн, характерной для флуоресценции этих соединений. Показано, что данное увеличение интенсивности определяется спектральными характеристиками молекул, а именно, площадью перекрытия спектров их поглощения со спектром биолюминесценции и квантовым выходом их флуоресценции. Установлено, что данные изменения спектров связаны, с процессами резонансной межмолекулярной миграции энергии возбуждения от эмиттера к молекулам акцепторов и абсорбцией биолюминесценции в присутствии экзогенных флуоресцентных соединений. Рассчитаны соотношения вкладов резонансной миграции возбуждения и абсорбции в биолюминесцентной системе.

Рассмотренные в данном разделе процессы аналогичны процессам, имеющим место и в биологических системах in vivo. Наиболее подробно исследован перенос энергии в бактериальной биолюминесцентной системе в присутствии желтого флуоресцентного протеина [Л4], спектр поглощения которого перекрывается со спектром биолюминесценции. Процессу миграции, энергии способствуют межбелковые связывания.

Внешний эффект тяжелого атома в биолюминесцентной системе наблюдали на примере галогенсодержащих неорганических и органических соединений. Присутствие тяжелого атома в системе увеличивает спин-орбитальные взаимодействия в возбужденном эмиттере биолюминесценции, что приводит к увеличению эффективности внутримолекулярной безызлучательной деградации энергии через низшие триплетные состояния-(Рис.2, тип воздействия №2). На Рис. З.а этот канал (S^*—>■ Т^* -—У So) указан сплошными волнистыми стрелками.

Исследовано воздействие галогенидов калия KCI, КВг, KI на биолюминесцентную биферментную систему сопряженных реакций. На основе зависимостей максимальных величин I от концентрации солей калия-рассчитаны коэффициенты активации и ингибирования

биолюминесцентной системы реакций: К^, K¡, (Табл. 2). Данные коэффициенты интегрально отражают вклады всех процессов, ведущих к изменению интенсивности биолюминесценции с ростом концентрации галогенидов. Расчеты велись с использованием

следующих зависимостей в различных интервалах концентраций этих солей:

Показано, что с ростом атомной массы-галогена происходит уменьшение коэффициентов активации и увеличение

коэффициентов ингибирования К/ биолюминесцентной системы. Соответственно растет ингибирующая способность галогенида.

Таблица 2.

Влияние галогенидов калия на биолюминесцентную систему сопряженных реакций. Ка - коэффициентактивации, К« - коэффициент ингибирования. Индексы I и 0 указывают, что расчеты проводились соответственно по изменению интенсивности и квантового выхода биолюминесценции.

Соединение КС1 КВг К1

Мол. масса, а.е.м. 77,5 119 166

Диапазон концентраций, М Ю'^Ю'1 Ю^тЮ"1 10^10"4

(1/1о)шач 3.8 2.9 1.0

7±1 (4.5+0.7)-101 (2.410.3)-105

к!, М"1 (2.3+0.1)-102 (1.2±0.1)-102 0

а 0.7±0.1 0.910.1 -

к?, м-' 9±1 (2.2+0.3)-10' (2.210.2)-105

(1.4±0.2)102 (9.2±1.1)-10' 0

р 0.9±0.1 1.3±0.2 -

Аналогичные результаты получены и при анализе коэффициентов ингибирования и активации К ^ и К.^ , рассчитанных

по зависимости относительного квантового выхода Q от концентрации солей калия:

Проведено сравнение величин К'и с аналогичными величинами,

полученными для фотолюминесценции ФМН (К^)фмн- Показаны

сходные зависимости величин для ряда галогенидов

калия. Изменения интенсивности биолюминесценции в присутствии галогенидов объяснены с точки зрения внешнего эффекта тяжелого атома в электронно-возбужденных системах.

Внешний эффект тяжелого атома проиллюстрирован также на примере ряда ксантеновых красителей (флуоресцеин, эозин, эритрозин). Из Табл.3 видно, что с ростом массы галоидных заместителей в этих молекулах увеличиваются коэффициенты ингибирования биолюминесцентной системы, что свидетельствует о росте ингибирующей способности красителя.

Таблица 3.

Влияние ксантеновых красителей на биолюминесцентную бифермент!гую систему сопряженных реакций. - коэффициент ингибирования. Индексы I и Q указывают, что расчеты проводились соответственно по изменению интенсивности и квантового выхода биолюминесценции.

Краситель Флуоресцеин Эозин Эритрозин

Формула С2оН,о05Ыа2 С2оН6Вг405На2 С2оН61405Ка2

Молекулярная масса 376 692 880

Диапазон концентраций,М 10"8-И0"5 10"7-5-10'5 11

к?, м-1 (1.4±0.1)104 (1.2±0.1)-105 (4.2+0.4)-105

к:, м-1 (5.7±0.5>104 (2.3 ±0.2)-105 (1.3+0.1)-10б

Роль фермента люциферазы в биолюминесцентной реакции является одним из наиболее обсуждаемых вопросов в теории

биолюминесценции, поэтому следует остановиться на нем подробнее. Люцифераза в данной системе исполняет роль биологического катализатора и функционирует вплоть до стадии образования эмиттера в электронно-возбужденном состоянии. Высокая эффективность дальнейших стадий внутримолекулярной безызлучательной деградации возбуждения Б (Т)м*——~> Б*** и излучательной дезактивации флуоресцентных состояний Б*** —» Бо задается относительным положением уровней энергии электронно-возбужденных состояний эмиттера с учетом их орбитальной природы и мультиплетности (Рис.За). Константы скорости вышеупомянутых внутримолекулярных переходов следующие [Л5-Л6]:

В главе 4 «Скорость дезактивации флуоресцентных состояний эмиттера биолюминесценции и влияние • экзогенных соединений на электронную плотность» исследовано влияние солей металлов на скорость дезактивации флуоресцентных состояний эмиттера в биолюминесцентной системе сопряженных реакций, катализируемых ферментами люциферазой и 11АД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазой. Определены коэффициенты ингибирования биолюминесценции (К) солями металлов с использованием соотношения: Величины К интегрально отражают

влияние солей металлов на всех стадиях процесса.

Электронно-акцепторные свойства катионов металлов характеризовали энергией сродства к электрону в водной среде . Эти величины рассчитывали по уравнению

N3" (е) = - АС"+, где

Здесь ДС"

НуЛг

стандартные свободные энергии

образования катионов с зарядом п и п+1 из свободных атомов в вакууме. - стандартные энергии гидратации этих

катионов, которые рассчитывали с использованием изменения энтальпии и энтропии гидратации катионов в стандартных условиях.

Показано, что тип эффекта (ингибирование или активация биолюминесценции) зависит от природы внешних орбиталей катионов. Проведено сопоставление величин К и ЫЭ"(е) (Рис.7).

Рис. 7. Стандартная энергия сродства к электрону катионов в водной среде (а) и коэффициенты ингибирования биолюминесценции

(К) солями металлов (б).

Из этого рисунка видно, что ингибируют биолюминесценцию (К>0) катионы металлов, для которых ДС(е) > 100 кДж/моль, в остальных случаях наблюдается активация биолюминесценции (К<0). Из этой закономерности выпадает действие солей трехвалентных металлов (А13+> Сг3+, Ре3+), что вероятно связано с высокой способностью к гидролизу в водных растворах. Алюминий представлен на Рис.7 в качестве примера такого исключения.

Аналогичные результаты получены и при сопоставлении величин К со стандартными редокс-потенциалами (Е°) катионов. Рассчитаны коэффициенты корреляции (Согт) между величинами К и АС (е) (СогГ(Д(5«)= -0,75), между К и Е° (СогТ(Е°) = 0,69). Эти коэффициенты оказались выше, чем между К и массой катиона m (Соггт= 0,58). Т.о., установленные корреляции показывают, что электронно-акцепторные свойства катионов являются определяющим при изменении интенсивности биолюминесценции.

В главе 5 «Скорость дезактивации флуоресцентных состояний эмиттера биолюминесценции и влияние соединений с различным редокс-потенциалом на перенос водорода (Н = е" + Н+)» приведены корреляции между скоростью излучательной дезактивации флуоресцентных состояний биолюминесцентного эмиттера и влиянием экзогенных молекул окислителей на процесс миграции водорода, который в полярной среде можно рассматривать в виде суммы элементарных переносов электрона и протона (Н = е" + Н+). В биолюминесцентной системе двух сопряженных реакций перенос водорода осуществляется в реакции окисления НАДН (1), сопряженной с биолюминесцентной реакцией (2) (Рис.2, тип воздействия №3):

ФМНН" + ЯСНО + 02 ФМН + ЯСОО + Н20 + Ьу (2)

Молекулы окислителей могут конкурировать с ФМН в реакции (1) в соответствии с уравнением (3):

хинон + 11АДН -> гидрохинон" + НАД* (3)

Эффективность конкуренции определяется превышением потенциала Ез реакции (3):

(Ез—Ехинон/гидрохинон" ~~ ЕнаД+/НАДн) над потенциалом Е| реакции (1):

(Е^Ефмн/фмцн- - Енад+/надн)> где Ехинон/гидрохинон-, ЕцаД+/НАДН, Е фмн/фмнн" - окислительно-восстановительные потенциалы соответствующих полуреакций.

Влияние экзогенных окислителей на биолюминесцентную систему двух сопряженных ферментативных реакций (1) и (2) изучено на примере ряда органических и неорганических соединений. В кинетике биолюминесценции присутствие этих соединений проявляется специфическим образом: не только уменьшается интенсивность биолюминесценции, но и растет время выхода на максимум (1) и появляется индукционный период биолюминесценции [Л7]. Логично предположить, что эти дополнительные кинетические параметры связаны с конкуренцией хинонов (реакция 3) с ФМН в реакции окисления НАДН.

Для того, чтобы подтвердить это предположение, изучены зависимости от стандартного редокс-потенциала Е° хинонов скоростей реакции (3) в случае неферментативного процесса и катализа препаратом НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы. Скорости

неферментативной и ферментативной реакций (3) в условиях эксперимента характеризовали константами скоростей соответственно первого и нулевого порядков к] и ко- На Рис. 8а и Рис. 8Ь приведены зависимости этих констант от Е°. На Рис.8с представлена зависимость нормированного времени выхода на максимум биолюминесценции биферментной системы 1'= Ах/АС от стандартного редокс-потенциала хинонов Е°

Константы скоростей окислительно-восстановительных реакций связаны с Е° уравнением Аррениуса к -аехр(-ДС^ /ЯТ) и соотношением с учетом линейной корреляции свободных

энергий активации АС® и реакции- Ж?0 (соотношения Бренстеда). В

соответствии с этим, зависимости могут быть описаны

уравнением (1):

/ = аехр(6£°)

(1)

где f = к| или ко- Величины коэффициентов а и Ь для ферментативной и неферментативной реакции (3), приведены в Табл. 4. Зависимость ^ от Е0 описана также уравнением (1) (Табл.4).

Г 10

10 -

0 I

(с)

ч6 ?1

Рис.8. Зависимости

(a) константы скорости к1 неферментативной реакции (3),

(b) константы скорости ко ферментативной реакции (3), (^ времени выхода на максимум t биолюминесценции биферментной системы от стандартного редокс-потенциала Е° хинонов: (I) 9,10-антрахинон;

(2) тетраметил-1,4-бензохинон;

(3) 1,4-нафтохинон; (4) 2-метил-1,4-нафтохинон; (5) метил-1,4-бензохинон; (6) 1,4-бензохинон

Т.о, зависимости от стандартного редокс-потенциала

хинонов имеют сходный экспоненциальный характер. Это показывает,

4 «

0,5 Е, В

что время выхода на максимум биолюминесценции 1 в биолюминесцентной системе сопряженных ферментативных реакций (1) и (2) связано с конкуренцией окислителей (хинонов) при окислении НАДН (реакции (1) и (3)). Величины Ь в случае биферментной системы примерно в два раза выше, чем в случаях неферментативной и моноферментной реакции (3), что может быть результатом дополнительного расходования НАДН в биферментной системе реакций.

Таблица 4.

Описание зависимости кинетических характеристик расходования хинонов к], ко и I' от их редокс-потенциалов Е° в соответствии с уравнением

k, 3300 5,6

ко 0,009 4,5

t' 42000 8,0

На основе кинетики ферментативного и неферментативного окисления НАДН в реакции (3) рассчитаны понижения энергии активации ферментативного процесса по сравнению с неферментативным. (AG*) для рядов метил-производных 1,4-бензохинона и 1,4-нафтохинона. Из Рис.9 видно, что количество гидрофобных заместителей в молекуле 1,4-бензохинона определяет величину AG". Аналогичная закономерность отмечена и для ряда 1,4-нафтохинона.

Анализ закономерностей воздействия редокс-активных соединений вносит новый вклад в теорию биотестирования. Изменения дополнительных (помимо максимальной интенсивности биолюминесценции) кинетических параметров, зависящих только от окислителей, делает биотесты in vitro специфичными к этой группе соединений. Это дает возможность классифицировать биотесты in vitro в качестве промежуточных между классическими неспецифичными биотестами и узко-специфичным химическим анализом.

Рис.9. Зависимость понижения энергии активации при ферментативном процессе (АО#) для ряда метил-производных 1,4-бензохинона.

Существует возможность увеличения цепи сопряжения НАДН-зависимых ферментативных реакций путем конструирования цепей ферментативных сопряженных реакций. В этом случае увеличивается количество возможных путей влияния экзогенных соединений на процессы переноса водорода в системе и, тем самым, увеличивается чувствительность биолюминесцентной системы сопряженных ферментативных реакций к экзогенным окислителям. В работе продемонстрирована возможность увеличения чувствительности системы сопряженных реакций, катализируемых бактериальными ферментами НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазой и люциферазой, при сопряжении с НАДН-зависимой реакцией, катализируемой алкогольдегидрогеназой. Таким образом, детализация механизма воздействия органических окислителей на сопряженные ферментативные НАДН-зависимые системы дает возможность варьирования чувствительности этих систем при использовании их в качестве тестовых при экологическом мониторинге.

Существует возможность варьирования чувствительности биолюминесцентных тестовых систем и путем добавления низкомолекулярных редокс-активных соединений. В частности, предложено включение в биферментную биолюминесцентную систему низкомолекулярного окислителя (1,4-бензохинона) для повышения чувствительности биолюминесцентной тестовой системы к восстановителям.

В главе 6 «Исследование взаимодействий экзогенных соединений с ферментами методами спектроскопии с временным; разрешением» изучены взаимодействия экзогенных соединений с ферментами (см. Рис.2, тип воздействия №4), определяющие вклад макромолекулярных процессов в изменение эффективности образования возбужденных состояний в биолюминесценции.

Исследован спад флуоресценции и анизотропии флуоресценции красителей ксантенового ряда, включающих атомы галоидов разной массы, (флуоресцеина, эозина и эритрозина) в водных растворах в присутствии и отсутствии бактериальных ферментов люциферазы и НАД(Ф)Н-ФМН-оксидоредуктазы. Показано, что как в отсутствии, так и в присутствии ферментов наблюдается уменьшение времен жизни флуоресценции с ростом массы галоидного заместителя в ряду галоидсодержащих красителей, что является примером эффекта тяжелого атома, как в водных молекулярных растворах, так и в присутствии ферментов.

О взаимодействии ксантеновых красителей с ферментами судили по изменению времен вращательной корреляции ф красителей при добавлении ферментов (Табл.5). Появление дополнительных компонент в спаде анизотропии флуоресценции эозина и эритрозина (характеризуемых параметрами ) свидетельствует о

связывании этих красителей с макромолекулами люциферазы и НАДН:ФМН — оксидоредуктазы в отличие от флуоресцеина, у которого такого связывания не проявляется. Подтверждение этого - слабое изменение в присутствии ферментов формы и положения спектров флуоресценции эритрозина и эозина в отличие от флуоресцеина, у которого спектральные свойства в этом случае не меняются. Вместе с тем, отличие величин ф2 красителей в присутствии ферментов от собственных ф редуктазы и люциферазы (соответственно 10,3± 0,9 не и 34± 4 не, Табл.1) свидетельствует об отсутствии жесткого связывания этих соединений с ферментами.

Таким образом, на примере ряда ксантеновых красителей показано, что увеличение массы галоидного заместителя приводит к росту связывания экзогенных молекул с ферментами. При этом обеспечиваются условия для снижения каталитической активности ферментов.

Таблица 5.

Параметры спада анизотропии флуоресценции ксантеновых красителей в присутствии люциферазы и НАД(Ф)Н:ФМН - оксидоредуктазы

Образец р, ф1,НС Л, % Р2 ф2, НС Ь, %

Водные растворы

Флуоресцеин 0.37 0.12+0.01 100 - - -

Эозин 0.38 0.1810.01 100 - - -

Эритрозин 0.38 0.14±0.01 100 - - -

Водные растворы в присутствии НАД (5-10"5 М (Ф)Н:ФМ ) Н - оксидоредуктазы

Флуоресцеин 0.36 0.1310.01 100 - - -

Эозин 0.33 0.1710.01 17 0 04 7±2 83

Эритрозин 0.24 0.1710.01 13 0.16 1.710.4 87

Водные растворы в присутствии бактериальной люцис ^еразы (5 10"5 М)

Флуоресцеин 0.37 0.1210.01 100 - - -

Эозин 0.30 0.2210.01 8 0.09 811 92

Эритрозин 0.17 0.2610.03 5 0.24 3.710.8 95

Условия: 20°С; А.мзбуЖдения= 450 нм, А-регистрац,,, = 500 нм. Концентрация флуоресцеина — 5-10-7 М, эозина — 10^ М, эритрозина — 5-1О^ М. Стацдартное отклонение рассчитано с 95 % доверительным интервалом, ф - время вращательной корреляции, р - амплитуда, £ —

весовые коэффициенты: ^ = Ф'.. — ] 00% -

Взаимодействие нефлуоресцентных экзогенных окислителей с ферментами биолюминесцентной системы изучали косвенным методом: на основе анализа спектральных характеристик эндогенного флавина, присутствующего в препаратах люциферазы и 11АД(Ф)Н:ФМН-оксвдоредуктазы. Анализировали спад флуоресценции и анизотропии флуоресценции при импульсном возбуждении, спектры испускания и анизотропию флуоресценции эндогенного флавина при

постоянном возбуждении. В Табл. 6 сопоставлены характеристики спада анизотропии растворов ФМН и эндогенного флавина в присутствии и отсутствии хинонов.

Таблица. 6.

Характеристики спада анизотропии флуоресценции флавина в образцах: раствора ФМН (10-6 М) в фосфатном буфере (рН 6,85), эндогенного флавина в препаратах люциферазы (Ь), НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы (И) в присутствии 1,4-бензохинона (8-10-3 М) или 2,3-

Тип образца Р. Ф, и Рз f2

ФМН 0,34 0,19 ±0,01 100% 0

Я* 0,27 0,26 ±0,01 12,6% 0,05 10,3± 0,9 87%

Я и 1,4-бензохинон 0,36 0,15 ±0,01 28% 0,04 3,3 ± 0,3 72%

Я и 2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохинон 0,32 0,16 ±0,01 100% 0

Ъ* 0,22 0,24 ±0,01 2,2% 0,063 34 ±4 98%

Ь и 1,4-бензохинон 0,37 0,145 ±0,01 100% - - 0

Ь и 2,3-диметокси-5-метил-1.4-бензохинон 0,33 0,16±0,01 100% 0

Условия: 20 С; ^-возбужден»« 450 НМ, Арс-истраци,, 540 НМ. (*) X возбуждения =300 нм, Я, регистрации =340 нм. ф - время. вращательной корреляции, Р -

амплитуда, £ - весовые коэффициенты ( / - <*>> Ю0%)-

Уменьшение и исчезновение долговременных компонент спада анизотропии флуоресценции эндогенного флавина в присутствии 1,4-бензохинона и 2.3-лимек)кси -5- ме 1ш- 1,4-бензохинона, оцениваемых величинами р2> Фг и (Табл.6), свидетельствует о том, что хиноны взаимодействуют с ферментами биолюминесцентной системы, в результате чего происходит уменьшение связывания эндогенного флавина с ферментами. При этом увеличение Э1 и ^ указывает на рост количества свободного ФМН в растворе в присутствии хинонов. При этом указанные эффекты проявляются в большей степени для молекул 2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохинона, включающих гидрофобные

заместители. Таким образом, уменьшение связывания эндогенного флавина может свидетельствовать об изменении структуры ферментов и, следовательно, уменьшении их ферментативной активности.

Итак, на основе анализа флуоресцентных характеристик экзогенных соединений в присутствии и отсутствии ферментов, а также характеристик эндогенного флавина в присутствии и отсутствии нефлуоресцентных экзогенных соединений установлен факт взаимодействия экзогенных соединений с ферментами биолюминесцентной системы, приводящего к возможному уменьшению активности биологических катализаторов. Эффективность взаимодействия увеличивается с ростом атомной массы галогена и количества гидрофобных заместителей в структуре экзогенных молекул.

Методами флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением исследованы взаимодействия ферментов из набора люминесцентных биотестов (алкогольдегидрогеназа и трипсин) с экзогенными флуоресцентными соединениями. В качестве экзогенных соединений выбраны гидрофобные молекулы РОРОР и 1,4-антрацендиола. Зарегистрированы изменения характеристик спада анизотропии флуоресценции этих молекул при добавлении ферментов и сделан вывод о неспецифическом связывании данных соединений ферментами.

В главе 7 «Применение закономерностей воздействия экзогенных соединений на биолюминесценцию для люминесцентного тестирования» проведено сравнение воздействия рядов экзогенных соединений на биолюминесцентные системы, используемые в настоящее время в экологическом биотестировании: 1) водо-растворимую биферментную систему люцифераза -НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза, 2) иммобилизованную в крахмальный гель систему люцифераза - НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза и 3) люминесцентные бактерии.

Проведено сравнение воздействия солей металлов на указанные биолюминесцентные системы. Рассчитаны коэффициенты ингибирования этими соединениями. Показано, что эффективность ингибирования солями металлов биолюминесцентных систем связана с электронной структурой катиона - природой его внешних орбиталей и зарядом. 32

Проведено сравнение действия рядов фенолов и хинонов на указанные три бактериальные биолюминесцентные системы, рассчитаны, коэффициенты ингибирования (К). Для всех трех систем показано, что величины К фенолов меньше, чем хинонов. Установлено, что в присутствии хинонов кинетика биолюминесценции иммобилизованной системы (как и водорастоворимой системы [Л7]) характеризуется, индукционным периодом и задержкой выхода на максимум биолюминесценции/ Величины этих параметров иммобилизованной системы также пропорциональны концентрации хинона и зависят от его редокс потенциала. Показано, что величины К для системы бактерий больше, чем для систем ферментативных реакций. Различия в действии данных органических соединений на три указанные биолюминесцентные системы объяснены различной скоростью диффузии, ролью клеточной мембраны и влиянием на дыхательную цепь бактерий.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА | С. Петербург * 09 «в «вт 1

выводы

1. На основе анализа спектров биолюминесценции в присутствии химически инертных ароматических соединений с различной энергией флуоресцентных состояний, характеризующихся отсутствием перекрывания спектров их поглощения со спектром биолюминесценции, экспериментально доказана возможность заселения высших электронно-возбужденных состояний эмиттера биолюминесценции в биолюминесцентной реакции. Энергия этих состояний локализована около 26000 см".

2. Показано, что неспецифические взаимодействия гидрофобных флуоресцентных соединений с люциферазой определяют условия для межмолекулярной резонансной миграции энергии с высших электронно-возбужденных состояний эмиттера биолюминесценции на флуоресцентные состояния этих соединений при отсутствии перекрывания спектров их поглощения со спектром биолюминесценции.

3. Показано, что скорость излучателыюй дезактивации флуоресцентных состояний биолюминесцентного эмиттера в присутствии экзогенных органических и неорганических соединений, включающих атомы галоидов, зависит от атомной массы галоида и связано с изменением скорости интеркомбинационной конверсии (внешний эффект тяжелого атома).

4. Показано, что скорость излучательной дезактивации флуоресцентных состояний биолюминесцегггного эмиттера в присутствии солей металлов зависит от электронно-акцепторных характеристик катионов и связана с их интегральным влиянием на электронную плотность в биолюминесцентной системе.

5. Установлено, что скорость излучательной дезактивации флуоресцентных состояний биолюминесцентного эмиттера в присутствии экзогенных окислителей зависит от редокс-потенциала окислителей и связана с их влиянием на процессы миграции водорода (Н = е" + Н*) в реакции окисления НАДН, сопряженной с биолюминесцентной реакцией.

6. Методами флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением показано, что эффективность взаимодействия экзогенных соединений с ферментами биолюминесцентной системы реакций 34

(люциферазой и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазой) определяется массой атомов галоидов и количеством гидрофобных заместителей в составе экзогенных молекул.

7. Разработаны физико-химические основы люминесцентного биотестирования для прогнозирования результатов анализа и направленного изменения чувствительности биотестов к определенным группам поллютантов.

По теме диссертации опубликованы следующие работы.

1.Кудряшева Н.С., Белобров П.И., Кратасюк В А Физические закономерности тушения биолюминесценции бактериальной люциферазы.- Красноярск, И.Ф., 1987. - 42с. (ПрепрУАН СССР, Сиб.отделение, Ин-т физики им. Л.В.Киренского, N70B).

2.Кудряшева Н.С., Шигорин Д.Н. Исследование эффективности фотовосстановления карбонилсодержащих соединений в присутствии молекул-акцепторов энергии возбуждения // Журн. физ. химии. -1988. -Т.62, N9. - С.2526-2528.

3.Кудряшева Н.С., Белобров П.И., Кратасюк ВА, Щербинская М.К.. Закономерности концентрационного тушения биолюминесценции биферментной системы,- Красноярск: И.Ф., 1988. -39с. (Препр./ АН СССР, Сиб.отделение, Ин-т физики имЛ.В.Киренского, N81 Б).

4.Kudryasheva N.S., Belobrov P.I., Kratasyuk BA, Sherbinskaya M.K.. Physical-chemical regularities of external quenching of bacterial bioluminecsence/ In book Biological Luminescence, Singapore: World Scientific, 1990.- P.416-425.

5.Кудряшева H.C., Белобров П.И., Кратасюк ВА, Шигорин Д.Н.. Изучение механизма биолюминесценции с помощью молекул тушителей.- Красноярск/И.Ф., 1991. - 22 с. (Препр./АН СССР, Сиб. отделение, Ин-т. физики им. Л.В.Киренского, N156B).

6.Кудряшева Н.С., Белобров П.И., Кратасюк ВА, Шигорин Д.Н.. Электронно-возбужденные состояния при биолюминесценции // Доклады АН СССР. - 1991. - Т.321, N4. - С.837-841.

7.Кратасюк ВА, Макурина В.И., Кузнецов AM., Кудряшева Н.С., Плотникова Н.Б., Медведева С.Е., Гриценко И.С., Черных В.П..

Изучение действия сульфопроизводных янтарной кислоты на бактериальную биолюминесценцию// Прикладная биохимия и микробиология.- 1991.-T.21,N1.-C. 127-133.

8.Кудряшсва Н.С., Шалаева Е.В., ЗадорожнаяЕ.Н., Кратасюк

B.А., Стом Д.И., Балаян А.Э.. Закономерности ингибирования биолюминесцентной реакции хинонами и фенолами - компонентами сточных вод.- Красноярск/ ИБФ., 1992.- 25 с.(Препр./АН СССР, Сиб.отд., Ин-т.биофизики, Ш14Б).

9.Kudryasheva N.S., Abakumova V.V., Belobrov P.I., Egorova O.I., Kratasyuk V.A. Nanodiamond action on bacterial bioluminescence in vitro // Herald of Russian Acad.Tech.Sci. -1994. - Vol.1, N7. - P.201-207.

10. Кудряшева Н.С., Шалаева Е.В., Задорожная Е.Н., Кратасюк В.А., Стом Д.И., Балаян А.Э. Закономерности ингибирования бактериальной биолюминесценции in vitro хинонами и фенолами -компонентами сточных вод// Биофизика. -1994. - Т.39, N3. - С.455-464.

11. Kudryasheva N.S., Kratasyuk V.A., Belobrov.P.I. Bioluminescent analysis. The action of toxicants: Physical-chemical regularities of the toxicants effects// Anal.Lett. - 1994. - Vol.27, N15. P.2931-2938.

12. Кратасюк В.А., Кудряшева Н.С. Отчет о биолюминесцентном международном семинаре, проходившем 4-10 августа 1994г, Красноярск// Биофизика. - 1995.- Т.40, №.3.-С.701-703.

13. Кудряшева Н.С, Зюзикова Л.В., Гутник Т.В., Кузнецов А.В. Действие солей металлов на бактериальные биолюминесцентные системы различной сложности//Биофизика. - 1996.-Т.41 N.6. - С. 12641269.

14. Кудинова И.Ю., Есимбекова Е.Н., Кудряшева Н.С. изучение действия хинонов на алкогольдегидрогеназу // Сборник материалов 7 Всероссийской конф. по гомеостазу, 1996. - С.78-79.

15. Kudryasheva N.S., Shigorin D.N., Meshalkin Y.P. Upper electron excited states in bioluminescence/ In: Bioluminescence and Chemiluminescence, Ed.by John Wiley & Sons LTD, 1997. - P.70-73.

16. Кудряшева Н.С, Шилова Е.В., Хендогина Е.В. Кратасюк В.А. Использование биолюминесцентных биотестов для мониторинга вод озера Шира. Сб."Медико-биологические и экологические проблемы комплекса "Озеро Шира", Томск, 1997.-

C.100-105. 36

17. Kratasyuk V.A., Khendogina E.V., Kudryasheva N.S., Vetrova E.V., Kudinova I.Yu.. Development of the Bioluminescent Bioindicators for Analyses of Pollutions. In the Proceedings of First International Conference and Industrial Exhibition 'Field Screening Europe, ed. By J.Gottlieb, H. Hotzl, K.Huck and R.Niessner, Kluwer Academic Publishers, Karlsruhe, 1997 - P.73-76.

18. Кудинова И.Ю., Есимбекова Е.Н., Кудряшева H.C, Кратасюк В.А. Исследование влияния хинонов на биолюминесцентную систему сопряженных оксидоредуктаз. //Сборник материалов 8 Всероссийской конф. По гомеостазу, 1997. - Т.2. - С.235-238.

19. Ветрова Е.В., Кудряшева Н.С. Растворимая и иммобилизованная биолюминесцентные системы для анализа хинонов и фенолов//Сборник материалов 8 Всероссийской конф. По гомеостазу, 1997.-Т.2.-С.216-221.

20. Немцева Е.Н., Кудряшева Н.С. Механизм тушения сигнальной реакции люминесцентных биотестов//Сборник материалов 8 Всероссийской конф. По гомеостазу, 1997.-Т.2. - С.246-249.

21. Kudryasheva N.S., Kratasyuk VA., Esimbekova E.N.,Vetrova, Kudinova I.Y. Development of the bioluminescent bioindicators for analyses of pollutions// Field Analytical Chemical Technologies. - 1998. - Vol.2, N. 5. - P.277-280.

22. Кратасюк В.А., Егорова О.И., Кудряшева Н.С, Львова Л.С., Орлова Н.Ю., Бытев В.О. Влияние фузариотоксинов на бактериальную биолюминесцентную систему in vitro.// Прикладная биохимия и микробиология. - 1998. - Т.34, №2. - С.207-209.

23. Кратасюк В.А., Егорова О.И., Есимбекова Е.Н., Кудряшева Н.С, Орлова Н.Ю, Львова Л.С. Люциферазный биотест для определения степени поражения фузариозом зерна// Прикладная биохимия и микробиология.-1998. - Т.34, №6. - С.688-691.

24. Kudryasheva N.S., Kudinova I.Y., Esimbekova E.N., Kratasyuk V.A., Stom D.I. Effects of quinoncs and phenols on the NAD(H)-dependent triple systems// Chemosphere. - 1999. - Vol.38, N4. - P.751-758.

25. Кудряшева Н.С, Зюзикова Е.В., Гутник Т.В. Механизм действия солей металлов на бактериальную биолюминесцентную систему in vitro// Биофизика.-1999.- Т.44,№2. - С.244-250.

26. Kudryasheva N.S., Nemtseva E.V., Sizykh A.G., Shishkin A.G., Provorov A.S. Bacterial bioluminescence spectra in the presence of

aromatic fluorescent compounds. In: Roda A, Pazzagly M, Kricka LJ, Stanley PE, editors. Bioluminescence and Chemiluminescence: Perspectives for 21-st Century. Chichester, John Wiley & Sons, 1999. - P.585-588.

27. Kudryasheva N.S. Mechanisms of xenobiotics' effects on bacterial bioluminescence//Luminescence. - 1999. - Vol.14. - P. 199-200.

28. Kratasyuk V.A., Vetrova E.V., Kudryasheva N.S. Bioluminescent Water Quality Monitoring of Salt Lake Shira // Luminescence. -1999. - Vol.14. - P. 193-195.

29. Мешалкин Ю.П., Немцева Е.В., Алфимов Е.Е., Кудряшева Н.С. О тушении бактериальной биолюминесценции красителями. // Биофизика -1999,- Т.44, №4. - С.1083-1089.

30. Kudryasheva N.S. Shilova E.V., Khendogina E.V., Kratasyuk VA Lake Shira, a Siberian lake: ecosystem structure and function. 3: The use ofbioluminescent biotests to monitor ecological status// International Journal of Salt Lake Research. -1999. - Vol.8. - P.245-25I.

31. Кудряшева Н.С, Есимбекова Е.Н., Кудинова И.Ю., Кратасюк В А, Стом, Д..И. Действие хинонов на ферментативные биолюминесцентные НАДН-зависимые системы// Прикладная биохимия и микробиология, - 2000.- Т.36, №4.- С.474-478.

32. Kudryasheva N.S., Nemtseva E.V., Meshalkin Yu.P, Sizykh AG. Upper electron-excited states in bioluminescence: experimental indication// Luminescence. 2001. - Vol.3. - P.243-246.

33. Vetrova E.V., Kudryasheva N.S., Visser A.J.W.G, van Hoek A Inhibition mechanisms of a bioluminescent enzyme system NAD(P)H:FMN-oxidoreductase-luciferase by quinones. In: Bioluminescence & Chemiluminescence: Progress & Current Applications. Editors: Stanley, P.E. & Kricka, LJ. World Scientific Publishing, Singapore. 2002.-P. 101-104.

34. Кудряшева Н.С, Кратасюк ВА, Есимбекова Е.Н. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа. 2002, Издательство Красноярского госуниверситета, Красноярск, -146 с.

35. Vetrova E.V, Kratasyuk V.A, Kudryasheva N.S. Bioluminescent characteristics map of Shira lake water// Aquatic Ecology. -2002.-Vol.36, N2-4. - P.309-315.

36. Gerasimova MA, Kudryasheva N.S. Effects of potassium halides on bacterial bioluminescence// J.Photochem.Photobiol. - 2002. -Vol.66,N3.-P.218-222.

37. Kudryasheva N.S., Vetrova E.V., Kuznetsov A.M., Kratasyuk V.A., Stom D.I.. Bioluminescent assays: effects of quinones and phenols// Ecotoxicology and Environmental Safety. - 2002. - Vol.53, N2. -P.221-225.

38. Kudryasheva N.S., Nemtseva E.V., Sizykh A.G., Kratasyuk V.A., Visser A.J.W.G. Estimation of energy of the upper electron-excited states of the bacterial bioluminescent emitter// J.Photochem.Photobiol. B. -2002. - Vol.68, N2-3 - P. 88 - 92.

39. Kudryasheva N.S., Nemtseva E.V., Visser A.J.W.G., van Hoek A. Interaction of aromatic compounds with Photobacterium leiognathi luciferase: fluorescence anisotropy study// Luminescence.- 2003.- V.I8, N3, -p. 156-161.

40. Kudryasheva N.S., Esimbekova E.N., Remmel N.N., Kratasyuk V.A., Visser A.J.W.G., van Hoek A. Effect of quinones and phenols on the triple enzymic bioluminescent system with protease// Luminescence. -2003. - V.18. - P. 224-228.

ЛИТЕРАТУРА

[Л1] Васильев Р.Ф. Механизм возбуждения хемилюминесценции // Изв.

АН. СССР, Сер.физ. - 1982. - Т.46, №2. - С. 323 - 329.

[Л2] МсСарга F. Mechanism in chemiluminescence and bioluminescence -

unfinished business. In: Bioluminescence and Chemiluminescence, edited by

J.W.Hastings, L.J.Kricka, P.E.Stanley, John Wiley & Sons, Chichester,

1997.-P.7-15.

[ЛЗ] Шигорин Д.Н. Систематика молекул по спектрально-люминесцентным свойствам и Периодический закон Менделеева//Журн.физ.химии. - 1977.- Т.51.- N8 - С. 1894-1919; Шигорин Д.Н. К систематике молекул. Закон гомологических рядов в изменении свойств молекул // Журн.физ.химии. - 1980. — Т. 54, N8. - С. 1935-1951.

[Л4] Lee J. Mechanism of bacterial bioluminescence. Chemi- and Bioluminescence / Ed. Burr I.C. - Morcel Bekker, 1985. [Л5] Плотников В.Г. - Теоретическине основы спектрально-люминесцентной систематики молекул/УУспехи химии. 1980.-Т.49, № 2.-С.327-361.

[Л6] Шигорин Д.Н., Валькова ГА, Гастилович Е.А. и др. Электронно-возбужденные состояния многоатомных молекул. Москва: Наука, 1993.-495с.

[Л7] Кратасюк В.А. Люциферазное биотестирование: биофизические основы, методы и применение; Автореф. дисс. доктора биол. наук. -Красноярск, 1994. - 20 с.

Подписано в печать 2.04.04. Формат 60 х 84 1/16. Бумага типографская. Печать офсетная. Объем 1,8 пл.'Тираж 100 экз. Заказ № 18

Типография Института физики СО РАН 6600366 г.Красноярск, Академгородок 50, строение 38.

»-7o > ;

Содержание диссертации, доктора физико-математических наук, Кудряшева, Надежда Степановна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ЭЛЕКТРОННО-ВОЗБУЖДЕННЫЕ СОСТОЯНИЯ В БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ.

1.1. Ферментативные хемилюминесцентные реакции светящихся организмов.

1.2. Механизмы формирования электронно-возбужденных состояний хемилюминесцентной ферментативной реакции

1.2.1. Химические процессы, предшествующие стадии электронного возбуждения.

1.2.2. Взаимодействие субстратов с ферментами в надмолекулярных структурах.

1.2.3. Стадия формирования электронно-возбужденных состояний

1.3. Возможность заселения высших электронно-колебательных состояний эмиттера

1.3.1. Закономерности внутримолекулярной миграции энергии возбуждения в эмиттере.

1.3.2. Формирование электронно-возбужденных состояний в хемилюминесцентных процессах.

1.3.3. Заселение высших электронно-возбужденных состояний эмиттера в биолюминесцентном процессе.

1.4. Эффективность элементарных физико-химических процессов в биолюминесцентной реакции.

1.4.1. Механизмы переноса энергии электронного возбуждения в люминесцентных системах. Природа донора и акцептора.

1.4.2. Миграция электрона в биолюминесцентных системах.

1.4.3. Миграция водорода (Н=е" + Н1") в биолюминесцентной системе . 96 1.5. Применение спектроскопии с временным разрешением для изучения межмолекулярных взаимодействий.

1.6. Использование системы сопряженных ферментативных реакций качестве люминесцентного биотеста.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизм формирования электронно-возбужденных состояний в бактериальной биолюминесценции"

Процессы жизнедеятельности организмов всегда сопровождаются слабой и сверхслабой хемилюминесценцией. Это связано с тем, что в результате реакций окисления в биологических системах формируются электронно-возбужденные состояния молекул продуктов. Малый квантовый выход хемилюминесценции в живых объектах связан с эффективной безызлучательной конверсией возбуждения. Биолюминесценция является частным случаем хемилюминесценции, отличается присутствием биологических катализаторов и характеризуется высокими квантовыми выходами (от 1 до 100%). Формирование возбужденных состояний эмиттера биолюминесценции является наименее изученной стадией биолюминесцентного процесса.

В настоящее время изучение механизма формирования возбуждения в хемилюминесцентных реакциях осуществляется на основе квантово-химических подходов с учетом анализа скоростей элементарных физико-химических процессов. Наиболее вероятным полагается формирование пп*-состояний с локализацией возбуждения на карбонильных группах. С другой стороны, В 70-х 80-х годах разработана систематика молекул по спектрально-люминесцентным свойствам, в соответствии с которой эмиттеры всех биолюминесцентных организмов принадлежат к V спектрально-люминесцентной группе, молекулы которой характеризуются высокими квантовыми выходами 7Т7Г*-флуоресценции и высшими состояния пя*-типа. Именно принадлежность эмиттеров биолюминесценции к данной группе соединений и определяет высокие квантовые выходы излучательной дезактвации возбужденных эмиттеров биолюминесценции. Т.о., интенсивность биолюминесценции определяется, во-первых, высокими скоростями ферментативных биолюминесцентных реакций, и, во-вторых, электронной структурой молекул эмиттеров.

Изучение механизма биолюминесценции предполагает анализ скоростей элементарных физико-химических процессов (миграции энергии, электрона), ведущих к формированию и дезактивации электронно-возбужденных состояний эмиттера биолюминесценции. При этом эффективность излучательной дезактивации флуоресцентных состояний в биолюминесцентном процессе (интенсивность биолюминесценции) является интегральной характеристикой скоростей элементарных физико-химических процессов на всех стадиях биолюминесцентного процесса: от начальных стадий химических перестроек до формирования и дезактивации электронно-возбужденных состояний.

Для анализа скоростей элементарных физико-химических процессов в биолюминесцентной системе использован метод воздействия на систему рядами гомологичных соединений, различающихся их физико-химическими характеристиками: энергией электронно-возбужденных состояний, квантовым выходом флуоресценции, редокс-потенциалом, количеством гидрофобных заместителей, включением в состав молекулы тяжелого атома и др. Физико-химические характеристики экзогенных соединений определяют их влияние на элементарные физико-химические процессы. Так, скорость межмолекулярной миграции энергии возбуждения определяется относительным положением уровней энергии электронных состояний донора и акцептора; скорость внутримолекулярной миграции энергии зависит от присутствия тяжелого атома; эффективность миграции электрона или водорода в полярной среде (Н = е" + Н+) определяются электронно-акцепторными характеристиками экзогенных молекул; гидрофобные взаимодействия зависят от количества и размера гидрофобных фрагментов в этих соединениях.

Таким образом, развитие теорий хемилюминесценции, строения молекул и межмолекулярной миграции энергии возбуждения определяют основу- для изучения физико-химического механизма формирования возбуждения в биолюминесцентном процессе. Исследование механизма формирования электронно-возбужденных состояний биолюминесцентного эмиттера актуально с научной точки зрения.

Цель исследования. Целью работы является изучение механизма формирования электронно-возбужденных состояний в биолюминесценции на основе закономерностей воздействия рядов соединений с различными физико-химическими характеристиками на биолюминесцентную систему сопряженных ферментативных реакций.

В работе поставлены следующие задачи.

1. Исследовать элементарные стадии, предшествующие образованию флуоресцентных состояний эмиттера бактериальной биолюминесценции. Экспериментально доказать возможность заселения высших электронно-возбужденных состояний эмиттера на основе анализа спектров биолюминесценции в присутствии ароматических соединений с различной энергией флуоресцентных состояний.

• эффективности межмолекулярной миграции энергии возбуждения, варьируемой добавлением экзогенных соединений с различными энергиями флуоресцентных (8*0 состояний;

• эффективности внутримолекулярной миграции энергии возбуждения, варьируемой добавлением экзогенных соединений, включающих атомы галоидов разной массы;

• влияния катионов металлов с различными электронно-акцепторными свойствами на распределение электронной плотности в биолюминесцентной системе сопряженных реакций;

• влияния экзогенных окислителей на процессы миграции водорода (Н = е" + Н*) в окислительно-восстановительной реакции с участием НАДН, сопряженной с биолюминесцентной реакцией.

Научная новизна. Впервые экспериментально доказана возможность участия высших электронно-возбужденных состояний эмиттера в биолюминесцентном процессе. Установлена энергия высших электронно-возбужденных состояний - порядка 26000 см"1. С использованием метода флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением показана возможность межмолекулярной резонансной миграции энергии с высших электронно-возбужденных состояний биолюминесцентного эмиттера на экзогенные гидрофобные молекулы.

Впервые эффективность излучательной дезактивации флуоресцентных состояний биолюминесцентного эмиттера связана со скоростями элементарных физико-химических процессов (переноса энергии, электрона, водорода), которые варьировались добавлением экзогенных соединений с заданными физико-химическими характеристиками (энергией электронно-возбужденных состояний, квантовым выходом флуоресценции, редокс-потенциалом, количеством гидрофобных заместителей и т.д.). Установлены зависимости между данными характеристиками экзогенных соединений и изменением скорости и спектральных характеристик биолюминесцентной реакции. Продемонстрирован внешний эффект тяжелого атома в биолюминесцентной системе. Показано, что изменение кинетических параметров биолюминесценции (индукционного периода, времени выхода на максимум биолюминесценции) системы сопряженных ферментативных реакций, катализируемых бактериальной люциферазой и НАД(Ф):ФМН-оксидоредуктазой, в присутствии окислителей связаны с влиянием этих молекул на процессы переноса водорода (Н = е" + Н+) в реакции восстановления НАДН, сопряженной с биолюминесцентной реакцией. Показано, что основным механизмом влияния катионов металлов на скорость биолюминесцентной реакции является изменение распределения электронной плотности в биолюминесцентной системе сопряженных реакций. Установлена связь физико-химических характеристик экзогенных соединений (массы галогена в составе молекулы, количества гидрофобных заместителей) с эффективностью взаимодействия этих соединений с ферментами биолюминесцентной системы.

Положения, выносимые на защиту.

1. Обоснование и экспериментальное доказательство возможности заселения высших электронно-возбужденных состояний эмиттера бактериальной биолюминесценции в качестве стадии, предшествующей образованию флуоресцентных состояний эмиттера в биолюминесцентной реакции.

2. Механизмы воздействия экзогенных соединений на бактериальную биолюминесценцию. Связь физико-химических свойств экзогенных соединений (энергии электронно-возбужденных состояний, электронно-акцепторных характеристикам, количества гидрофобных заместителей, массы галоида в составе молекулы) со скоростями элементарных физико-химических процессов на различных стадиях биолюминесцентного процесса, эффективностью взаимодействия этих соединений с ферментами и скоростью дезактивации флуоресцентных состояний эмиттера.

Практическая значимость. Полученные в работе закономерности воздействия рядов экзогенных соединений на биолюминесцентные системы представляют собой физико-химическую основу люминесцентного биотестирования и используются при разработке методов целенаправленного изменения чувствительности биолюминесцентных тестовых систем к различным группам поллютантов и прогнозирования результатов люминесцентных биотестов.

Апробация работы. Основные положения работы представлены на 5-ой Всесоюзной конференции по органическим люминофорам (Харьков, 1987); 3-ем Всесоюзном совещания «Люминесценция и развитие ее применений в народном хозяйстве» (Рига, 1989); 4-ой Всесоюзной конференции по фотохимии (Новосибирск, 1989); Совещании по проблемам гидрометеорологического обеспечения народного хозяйства Сибири (Красноярск, 1989); 5-м Всесоюзного совещания по люминесценции (Караганда, 1989); 3-ем Всесоюзном совещании по хемилюминесценции (Рига, 1990); 3-ей Международной конференции по химической инженерии (Прага, 1990); Международного конгресса по аналитической химии (Лондон, 1992); 4-м Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и экологии и его аппаратурное обеспечение" (Клин, 1992), Всероссийской конференции по биотехнологии (Пущино, 1992); Международной конференции по наноструктурам технологиям (Москва, 1993); Международных конференциях по биолюминесценции и хемилюминесценции (Гаваи, США, 1993, Вудс Хол, США, 1996, Болонья, Италия, 1998, Кембридж, Великобритания, 2002); Международных конференциях по экологии (Санкт-Петербург, 1994, Пермь, 2001);

Международной конференции по антиоксидантной терапии (Берлин, 1996); Международным совещаниям по биосенсорам (Лунд, Швеция, 1996, Берлин, Германия, 1998); 9-ой Международной конференции по коллоидным системам (София, Болгария, 1997); Международной конференции по биотехнологии (Будапешт, Венгрия, 1997); 3-м Международном симпозиуме по новым ароматическим соединениям (Гонг-Конг, 1998); Международном биофизическом конгрессе (Дели, Индия, 1999); 2-м Съезде биофизиков России (Москва, 1999); Международных симпозиумах по полициклическим ароматическим соединениям (Лион, Франция, 1999, Париж, Франция 2001); 4-м Съезде белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Белоруссия, 2000); Международной конференции по биологической физике (Токио, Япония, 2001); Международной конференции по химии высокоорганизованных соединений (С.-Петербург, 2001), Международной конференции по фотохимии (Москва, 2001), Международной конференции по Спектроскопии биологических молекул (Сегед, Венгрия, 2003), Международной школе по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Саратов, 2003).

Личный вклад соискателя состоял в проведении основных экспериментальных и теоретических работ по теме диссертации. Автору принадлежит гипотеза активности высших электронно-возбужденных состояний в биолюминесцентном процессе и метод использования рядов гомологичных соединений с различными физико-химическими характеристиками для изучения механизма функционирования ферментативных систем. Экспериментальная проверка гипотезы и использование предложенного метода осуществлялись совместно с сотрудниками и аспирантами лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН., кафедры квантовой электроники Красноярского госуниверситета, лаборатории лазерной спектроскопии Новосибирского государственного технического университета, Микроспектроскопического центра Агроуниверситета г.Вагенинген (Голландия).

Основная часть результатов была получена в соавторстве с Шигориным Д.Н., Кратасюк В.А., Белобровым П.И., Е.В., Немцевой Е.В., Есимбековой E.H., Сизых А.Г., Герасимовой М.А., Кузнецовым A.M.-, Мешалкиным Ю.П. Вклад соавторов отражен в публикациях. Автор приносит благодарность всем коллегам за участие в совместных работах и обсуждении результатов.

Публикации. Основные материалы диссертации изложены в более чем 100 публикациях, 40 из них — статьи в реферируемых российских (советских) и зарубежных изданиях.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №98-02-18054 и №01-03-32843); Российско-голландского гранта NWO-Russia 047-007-005; NATO Collaborate Linkage Grant (CLG-974984); грант REC-002 Министерства образования Российской Федерации и Американского фонда гражданских исследований и развития для независимых государств бывшего Советского Союза, программа «Фундаментальные исследования и высшее образование»; Федеральной целевой программы «Интеграция высшего образования и фундаментальной науки» (проекты А0021 и В008); гранта ИНТАС №562, грантов Красноярского краевого фонда науки и 5F0086-C и 7F0202-D; гранта РАН для молодых ученых №223.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Кудряшева, Надежда Степановна

ВЫВОДЫ

3. Показано, что скорость излучательной дезактивации флуоресцентных состояний биолюминесцентного эмиттера в присутствии экзогенных органических и неорганических соединений, включающих атомы галоидов, зависит от атомной массы галоида и связано с изменением скорости интеркомбинационной конверсии (внешний эффект тяжелого атома).

4. Показано, что скорость излучательной дезактивации флуоресцентных состояний биолюминесцентного эмиттера в присутствии солей металлов зависит от электронно-акцепторных характеристик катионов и связана с их интегральным влиянием на электронную плотность в биолюминесцентной системе.

5. Установлено, что скорость излучательной дезактивации флуоресцентных состояний биолюминесцентного эмиттера в присутствии экзогенных окислителей зависит от редокс-потенциала окислителей и связана с их влиянием на процессы миграции водорода (Н = е" + Н+) в реакции окисления НАДН, сопряженной с биолюминесцентной реакцией.

6. Методами флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением показано, что эффективность взаимодействия экзогенных соединений с ферментами биолюминесцентной :системы реакций (люциферазой и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазой) определяется количеством гидрофобных заместителей и массой атомов галоидов в составе экзогенных молекул.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использзованные в работе подходы к изучению механизма функционирования биологических систем на основе анализа эффективности элементарных физико-химических процессов, варьируемых в результате воздействия на систему рядами гомологичных соединений с различными их физико-химическими характеристиками, перспективны и для изучения других биологических систем. Прежде всего, наиболее явно прослеживается необходимость экспериментального обоснования применимости гипотезы активности высших электронно-возбужденных состояний к другим биолюминесцентным системам, отличным от бактериальной, таким как светляковая биолюминесцентная реакция или кальций-регулируемая реакция морских люминесцентных кишечнополостных. Возможность применимости данной гипотезы ко всем биолюминесцентным организмам (универсальность гипотезы) следует из следующих 2-х положений:

1) Молекулы эмиттеров всех биолюминесцентных организмов представляют собой ароматические соединения, характеризующиеся высокими выходами флуоресценции. Это дает возможность классифицировать эти молекулы как принадлежащие к V спектрально-люминесцентной группе в соответствии с Систематикой молекул по спектрально-люминесцентным свойствам Шигорина Д.Н. Для этих молекул характерна последовательность уровней энергии электронно-возбужденных состояний Бо, Тдат*, ТП5Г*, 8ПЯ* и высокие квантовые выходы 7гл*-флуоресценции. Кроме того, все молекулы эмиттеров являются гетероциклическими соединениями, т.е. включают в свои структуры гетороатомы (азот, карбонильные группы) и связанные с ними п-электроны. Следовательно, диаграммы Яблонского этих соединений включают гиг*-состояния, которые не являются низшими.

2) В работах Васильева Р.Ф. доказано, что в хемилюминесцентных реакциях окисления образуются птс*- состояния продуктов реакции, что доказывается наличием слабой пл*-фосфоресценции для соединений с низшими триплетными П7Г*- состояниями.

Совокупность этих двух позиций для биолюминесцентных эмиттеров дает возможность предложить образование высших пти*- состояний эмиттера биолюминесценции в качестве первично-возбужденного состояния эмиттера, предшествующего излучающему синглетному состоянию юг*-типа. Применимость этих двух положений для эмиттеров всех биолюминесцентных организмов дает возможность считать гипотезу активности высших электронно-возбужденных состояний универсальной для всех биолюминесцентных организмов:

Поэтому следующим этапом работы должно стать исследование биолюминесцентных эмиттеров других биолюминесцентных организмов с помощью молекул акцепторов энергии возбуждения.

Кроме того, чрезвычайно важными являются результаты данной работы с точки зрения создания физико-химических основ биолюминесцентного анализа. Именно в результате изучения эффективности элементарных физико-химических процессов в системе могут быть проанализированы характерные свойства биотестов, отличающие их от химического анализа, такие как (1) неаддитивность (отклик системы на воздействие суммы веществ не равен сумме откликов на каждое отдельное вещество) и (2) неспецифичность (изменение только одного параметра жизнедеятельности организма, например, выживаемости, подвижности, температуры тела и т. д. при воздействии на него различающихся факторов среды, например, растворов токсичных экзогенных соединений различного химического состава).

Библиография Диссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Кудряшева, Надежда Степановна, Красноярск

1. Агранович В.М., Галанин М.Д. Перенос электронного возбуждения в конденсированных средах. М: Мир, 1978.

2. Баскаков И.В., Воейков B.J1. Роль электронно-возбужденных состояний в биохимических процессах.//Биохимия.- 1996 .- Т.61, N 7. -С.837 — 844

3. Барлтроп Дж., Койл Дж. Возбужденные состояния в органической химии, М: Мир, 1978.

4. Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Иванова Н.М., Минаев Б.Ф., Осяева О.В., Федорова Г.В. Электронная модель возбуждения хемилюминесценции в реакциях окисления органических соединений// Изв.АН СССР, Сер.Физ.- 1987.- Т.51, №3.- С.540-547.

5. Берберан-Сантос М.Н., Бодунов E.H., Мартиню Ж.М.Г. Концентрационная зависимость квантового выхода сенсибилизированной люминесценции при переносе энергии с высоких возбужденных состояний// Оптика и спектроскопия.- 1997.- Т.83, №3.- С.378-383.

6. Бурштейн А.И. Концентрационное тушение некогерентных возбуждений в раствовах// Успехи физических наук.- 1984.- Т. 143.- С. 553600.

7. Вавилов С.И. Собр.соч. Т.П. М., 1954 С. 116-153.

8. Васильев Р.Ф, Механизм возбуждения хемилюминесценции // Изв. АН. СССР, Сер.физ. 1982. - Т.46, №2. - С. 323 - 329.

9. Васильев Р.Ф. Пути возбуждения хемилюминесценции в органических соединениях. В кн. Биохемилюминесценция. М: Наука, 1983. С.31-55.

10. Векшин Н.Л. Экранировочный гипохромизм хромофоров в макромолекулярных биоструктурах //Биофизика. 1999. - Т.44. - 1. - САЗ -55.

11. Ветрова Е.В., Кудряшева Н.С. Растворимая и иммобилизованная биолюминесцентные системы для анализа хинонов и фенолов//Сборник материалов 8 Всероссийской конф. По гомеостазу, март, 1997.- Т.2.- С.216-221.

12. Введение в фотохимию органических соединений. Под ред. Беккера и Ельцова. Л: Химия, 1976. - 384 с.

13. Владимиров Ю.А. Фотохимия и люминесценция белков. М.: Наука, 1965. -232 с.

14. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследованиях биологических мембран. М.: Наука, 1980. 320 с.

15. Галанин М.Д. К вопросу о влиянии концентрации на люминесценцию растворов// ЖЭТФ.- 1955.- Т.28, №4.- С.485-495.

16. Гиль Т.А., Балаян А.Э., Стом Д.И. Гашение люминесценции светящихся бактерий как тест для оценки токсичности фенольных компонентов стоков // Микробиология. 1983. -Т.52, N6. - С.1014-1016.

17. Гительзон И.И., Родичева Э.К., Медведева С.Е. и др. Светящиеся бактерии,- Новосибирск: Наука, 1984.- 298 с.

18. Горелик М.В. Химия антрахинонов и их производных.- М: Наука, 1983,- 248с.

19. Горшков В. И., Кузнецов И. А. Основы физической химии. М.: Изд-воМГУ, 1993.-334 с.

20. Демченко А.П. Люминесценция и динамика структуры белков. -Киев: Наукова думка, 1988. 280 с.

21. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982.

22. Ермолаев В.Л., Бодунов Е.В., Свешниклва Е.В., Шахвердов Т.А. Безызлучательный перенос энергии в конденсированных средах. JI: Наука, 1977.

23. Ермолаев B.JI. Сверхбыстрые безызлучательные переходы между высоковозбужденными состояниями в молекулах органических соединений // Успехи химии. 2001. - Т.70,№ 2. - С.539 - 561.

24. Есимбекова E.H., Кратасюк В.А., Гладышев М.И., Хромичек Е.В. Использование биолюминесцентных методов для изучения природных лабораторных экосистем. Материалы 7-ой конференции по Гомеостазу, под ред.А.Нефедова, Красноярск, 1996.- С.29-30.

25. Жмур Н.С. Государственный и производственный контроль токсичности вод методами биотестирования в России. — М: Междун. дом сотрудничества, 1997.- 148 с.

26. Заворуев В.В., Межевикин В.В. Непрерывное культивирование светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum с управлением по люминесценции. //Прикл. биохимия и микробиол.-1983.-Т.19.-№.4.- С.564.

27. Илларионов Б.А., Протопопова М.В., Каргинов В.А., Мертвецов Н.П., Гительзон И.И. Нуклеотидная последовательность генов а- и ß-субъединиц люциферазы Photobacterium leiognathi // Биоорганическая химия. 1988. - Т. 14. - 3. - С.412 - 415.

28. Каталог культур светящихся бактерий / Под ред. Э.К.Родичева.-Новосибирск: Наука, Сиб.предприятие РАН, 1997. -125 с.

29. Кириллова И.П., Зайцева Л.А., Дмитриева JI.B. Биолюминесцентный анализ и его возможности. //Общие вопросы микробиологической промышленности.- 1983.- С.44.

30. Козинец Г.И. Интерпретация анализов крови и мочи и их клиническое значение. М: "Триада-Х", 1998.

31. Краснов К.С, Воробьв Н.К., Годнев И.Н. Физическая химия. М.: «Высшая школа» 1995. в 2-х т.

32. Кратасюк В.А., Фиш A.M. Изучение механизма действия 2,4-динитрофторбензола на бактериальную люминесценцию in vitro// Биохимия. -1980. Т.45, №7. -С. 1175-1182.

33. Кратасюк В.А., Гительзон И.И. Бактериальная биолюминесценция и биолюминесцентный анализ // Биофизика.- 1982.- Т. 27, N 6. С. 937-953.

34. Кратасюк В.А., Гительзон И.И. Использование бактериальной биолюминесцеюнции и биолюминесцентного анализа //Успехи микробиологии,- 1987.-T.2L- С.3-30.

35. Кратасюк В.А. Люциферазное биотестирование: биофизические основы, методы и применение; Автореф. дисс. доктора биол. наук. -Красноярск, 1994.-20 с.

36. Кратасюк В.А., Абакумова В.В., Ким Н.И. (1994) Гелевая модель функцонирования люциферазы в клетке// Биохимия.- 1994.- Т.59, No 7,-С.761-765.

37. Кратасюк В.А., Кузнецов A.M., Родичева Э.К., Грибовская И.В., Егорова О.И., Абакумова В.В. //Сибирский экологический журнал.- 1996.-Т.5.- С.397-403.

38. Кратасюк В.А., Егорова О.И., Кудряшева Н.С., Львова Л.С., Орлова Н.Ю., Бытев В.О. Влияние фузариотоксинов на бактериальную биолюминесцентную систему in vitro.// Прикладная биохимия и микробиология.- 1998.- Т.34, №2.- С.207-209.

39. Кратасюк В.А., Егорова О.И., Есимбекова E.H., Кудряшева Н.С., Орлова Н.Ю, Львова Л.С. Люциферазный биотест для определения степенипоражения фузариозом зерна// Прикладная биохимия и микробиология.-1998а.- Т.34, №6. -С.688-691.

40. Крашенинников A.A., Любимцев В.А, Шабля А.О. перенос энергии с высших синглетных возбужденных состояний в жидком растворе. В кн. «Возбужденные молекулы. Кинетика превращений». Л.:Наука, 1982. -С.32-50.

41. Крестов Г.А. Термодинамика ионных процессов в растворах. Л:Химия, 1986.

42. Кудинова И.Ю., Есимбекова E.H., Кудряшева Н.С., Кратасюк В.А. Исследование влияния хинонов на биолюминесцентную систему сопряженных оксидореуктаз. //Сборник материалов 8 Всероссийской конф. По гомеостазу, март, 1997.,Т.2, С.235-238.

43. Кудряшева Н.С., Белобров П.И., Кратасюк В.А. Физические закономерности тушения биолюминесценции бактериальной люциферазы.-Красноярск, И.Ф., 1987.- 42с. (Препр./АН СССР, Сиб.отделение, Ин-т физики им. Л.В.Киренского, N70B).

44. Кудряшева Н.С., Шигорин Д.Н. Исследование эффективности фотовосстановления карбонилсодержащих соединений в присутствии молекул-акцепторов энергии возбуждения//Журн.физ.химии.- 1988.-T.62,N9.- С.2526-2528.

45. Кудряшева Н.С., Белобров П.И., Кратасюк В.А., Щербинская М.К. Закономерности концентрационного тушения биолюминесценции биферментной системы.- Красноярск: И.Ф., 1988.- 39с. (Препр./ АН СССР, Сиб.отделение, Ин-т физики им.Л.В.Киренского, N81E).

46. Кудряшева Н.С., Валькова Г.А., Шигорин Д.Н., Горелик М.В. Фотохимические свойства карбонилсодержащих соединений, принадлежащих различным спектрально-люминесцентным группам// Журн.физ.химии.- 1989.- T.63,N1.- С.177-183.

47. Кудряшева Н.С. Ненизшие триплетные состояния в фотовосстановлении карбонильных соединений и бактериальной биолюминесценции / Автореф.канд.дисс., Красноярск, 1991, 20с.

48. Кудряшева Н.С., Белобров П.И., Кратасюк В.А., Шигорин Д.Н. Изучение механизма биолюминесценции с помощью молекул тушителей.-Красноярск/ И.Ф., 1991.- 22 с.(Препр./АН СССР, Сиб.отделение, Ин-т.физики им. Л.В.Киренского, N156B).

49. Кудряшева Н.С., Белобров П.И., Кратасюк В.А., Шигорин Д.Н. Электронновозбужденные состояния при биолюминесценции // Докл.АН СССР-1991.- Т.321, N4,- С.837-841.

50. Кудряшева Н.С., Шалаева Е.В., Задорожная E.H., Кратасюк В.А., Стом Д.И., Балаян А.Э. Закономерности ингибирования бактериальной биолюминесценции in vitro хинонами и фенолами -компонентами сточных вод// Биофизика -1994.- Т.39, N3.- С.455-464.

51. Кудряшева Н.С., Зюзикова Л.В., Гутник Т.В., Кузнецов A.B. Действие солей металлов на бактериальные биолюминесцентные системы различной сложности//Биофизика.- 1996.-Т.41 N.6.- с.1264-1269.

52. Кудряшева Н.С., Шилова Е.В., Хендогина Е.В. Кратасюк В.А. Использование биолюминесцентных биотестов для мониторинга вод озера Шира. Сб."Медико-биологические и экологические проблемы комплекса "Озеро Шира", Томск, 1997. -С. 100-105.

53. Кудряшева Н.С., Зюзикова Е.В., Гутник Т.В. Механизм действия солей металлов на бактериальную биолюминесцентную систему in vitro// Биофизика.- 1999.-Т.44, №2.-С.244-250.

54. Кудряшева Н.С., Есимбекова E.H., Кудинова И.Ю., Кратасюк В.А., Стом, Д.И. Действие Хиионов на ферментативные биолюминесцентные НАДН-зависимые системы// Прикладная биохимия и микробиология,-2000.- Т.36, №4.- С.474-478.

55. Кудряшева Н.С., Кратасюк В.А., Есимбекова E.H. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа. 2002, Красноярск: «Графити», 154 с.

56. Кузнецов A.M., Родичева Э.К., Шилова Е.В. Биотест, основанный на лиофилизованных бактериях// Биотехнология,- 1996.-Т.9.- С.57-61.

57. Кузнецов A.M., Тюлькова H.A., Кратасюк В.А., Абакумова В.В., Родичева.Э.К. Изучение характеристик реагентов для биолюминесцентных биотестов//Сибирский экологический журнал// 1997. -№5.- С.459-465.

58. Кукушкин Ю.Н., Маслов Е.И. Строение атома и химическая связь / Под ред. Е.А.Максимюка.- Д.: ЛГУ, 1973.- 80 с.

59. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир, 1974. Т.З. - 1056 с.

60. Мажуль М.М., Данилов B.C. Исследование свойств НАД(Р)Н:ФМН-оксидоредуктазы из морских люминесцентных бактерий Vibro fischeri. // Биохимия. 1994.-Т. 59,N.10. - С. 1608-1614.

61. Мажуль М.М., Данилов B.C. Влияние ассоциации компонентов бактериальной люминесцентной системы V. fischeri на реакцию бактериальной люциферазы. // Биохимия. 1995. - Т. 60, N7. - С. 10731080.

62. Мажуль М.М., Завильгельский Г.Б., Зарубина А.П., Юдина Т.П., Данилов B.C. FMN-редуктаза из Escherichia coli и ее влияние на активность люциферазы из морских бактерий Vibro fischeri.il Микробиология. 1999. — Т. 68? N2.-С. 149-154.

63. Мак-Глинн С., Адзуми Т., Киносита М. Молекулярная спектроскопия триплетного состояния. М.: Мир. 1972.

64. Мецлер Д. Биохимия, Т.2, М: Мир, 1980

65. Мешалкин Ю.П., Немцева Е.В., Алфимов Е.Е., Кудряшева Н.С. О тушении бактериальной биолюминесценции красителями. // Биофизика.-1999,- Т.44, №4.- С.1083-1089.

66. Немцева E.H., Кудряшева Н.С. Механизм тушения сигнальной реакции люминесцентных биотестов// Сборник материалов 8 Всероссийской конф. По гомеостазу, март, 1997, Т.2. С.246-249.

67. Рабинович В.А., Кашин З.Я. Справочник химика, Л:Химия, 1977.

68. Реннеберг Р. Эликсиры жизни. М.: Мир, 1987.

69. Паркер С. Фотолюминесценция растворов. М: Мир, 1972. 512 с.

70. Петушков В.Н., Кратасюк Г.А., Фиш A.M., Гительзон И.И. Способ определения активности протеаз. //Авт.свид. N 1027615, опубл.07.07.83, Бюлл-N 25.-с. 159.

71. Петушков В. Н. Биферментная система оксидоредуктаза -люцифераза светящихся бактерий: Автореф. кан. биол. наук. Красноярск, 1985,- 17 с.

72. Петушков В.Н., Кратасюк Г.А., Родионова Н.С., Фиш A.M., Белобров П.И. Биферментная система ИАОН^ММ-оксидоредуктаза-люцифераза из светящихся бактерий // Биохимия.- 1984.- Т.49, №.4.-С.692-702.

73. Петушков В.Н., Родионова Н.С., Белобров П.И. Изучение эффективности работы биферментной системы NADH:FMN-оксидоредуктаза-люцифераза светящихся бактерий // Биохимия 1985, - Т. 50.N3.-C. 401-405.

74. Петушков В.Н. Биолюминесцентный анализ ферментных систем. В кн. Молекулярные механизмы клеточного гомеостаза. Новосибирск: Наука, 1987 С.204-216.

75. Петушков В.Н., Гусейнов O.A. Биолюминесцентный метод определения активности НАДН-зависимой гидрогеназы // Прикладная биохимия и микробиология.-1992.- Т.28. -С.907-911.

76. Плотников В.Г. Теоретические основы спектрально-люминесцентной систематики молекул//Успехи химии. 1980.-Т.49, № 2,-С.327-361.

77. Потапов В.М., Татаринчик С.Н. Органическая химия. М. «Наука», 1989. - 370 с.

78. Рикенглаз М.М., Розман И.М. О кинетике люминесценции жестких растворов при наличии переноса энергии. I. Перенос за счет дипольного взаимодействия. II. Перенос за счет обменного взаимодействия // Оптика и спектроскопия. 1974. - Т. 36,N1. - С. 100-114.

79. Рубин А.Б., Шинкарев В.П. Транспорт электронов в биологических системах. М.: Наука, 1984. - 320 с.

80. Сандалова Т.П., Тюлькова H.A. Влияние модификации SH-групп на свойства четырех бактериальных люцифераз.- Красноярск, 1991. 19с. (АН СССР, Сиб. отделение, Ин-т. биофизики, Препринт №1566)

81. Строкач Н.С., Шигорин Д.Н., Щеглова H.A. Электронно-колебательные спектры многоатомных молекул. М.: Наука, 1982.- 143 с.

82. Сущик H.H., Гладышев М.И., Калачева Г.С., Плаксина И.В. Динамика биомассы микроводорослей и состава внеклеточных свободных жирных кислот в экспериментальных микроэкосистемах. //Известия АН Серия биологическая. -1998.- N 6.- С.738-744.

83. Теренин А.Н. Фотоника молекул красителей. JI: Наука, 1967.

84. Теренин А.Н. Перенос и миграция энергии в биохимических процессах//УФН.- 1951.- Т.ЗЗ, №.3.-С.347- 379.

85. Угарова H.H., Бровко Л.Ю. Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ. Москва: МГУ, Метод, указания/ МГУ им.Ломоносова, хим. факультет, каф. химической энзимологии. 1981. -138с.

86. Ферст Е. Структура и механизм функционирования ферментов. М: Мир, 1980.

87. Химическая энциклопедия, M: Научное издательство «Большая Российская Энциклопедия», 1995.

88. Шарипов Г.Л., Казаков В.П., Толстиков Г.А. Химия и хемилюминесценция 1,2-диоксетанов. М.: Наука, 1990.- 288 с.

89. Шигорин Д.Н. Систематика молекул по спектрально-люминесцентным свойствам и Периодический закон МенделееваУ/Журн.физ.химии. 1977.- Т.51.- N8 - С. 1894-1919.

90. Шигорин Д.Н. К систематике молекул. Закон гомологических рядов в изменении свойств молекул II Журн.физ.химии. 1980. - Т. 54, N8. - С. 1935.

91. Шигорин Д.Н., Валькова Г.А., Гастилович Е.А. и др. Электронно-возбужденные состояния многоатомных молекул. Москва: Наука, 1993.-495-с.

92. Шумихин В.Н., Данилов В. С., Малков Ю. А., Егоров Н.С. Выделение и очистка бактериальной люциферазы из Photobacterium fïscheri для аналитических целей // Биохимия. 1980. - Т. 45, N9. - С. 15761581.

93. Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма. М.: Мир, 1966. —863 с.

94. Abu-Soud H., Mullins L.S., Baldwin Т.О., Raushel F. Stopped-flow kinetic analysis of the bacterial luciferase reaction // Biochemistry. 1992. — V.31.-P. 3807-3813.

95. Baldwin T.O., Nicoli M.Z., Becvar J.E., Hastings J.W. Bacterial luciferase. Biding of oxidized flavin mononucleotide// J. Biol. Chem. 1975.-V.250.- P.2763-2768.

96. Baldwin T.O., Chen L.H., Chlumsky L.J., Devine J.H., Ziegler M.M., Site-directed mutagenesis of bacterial luciferase: analysis of the essential thiol // J. Biolum. Chemolum. 1989. - Vol. 4. - P. 40-48.

97. Balny C., Hastings J.W. Fluorescence and bioluminescence of bacterial luciferase intermediates // Biochemistry. 1975. - V. 14. - C. 4719-4723.

98. Becvar J.E., Baldwin T.O., Nicoli M.Z., Hastings J.W. The flavin stoihiometry of the bacterial bioluminescence reaction // Flavins and flavoproteins. 1976. - P. 94-100.

99. Beechem J.M., Gratton E., Ameloot M., Knutson J.R. and Brand L. The global analysis of fluorescence intensity and anisotropy decay data: Second-generation theory and programs // Topics in fluorescence spectroscopy. 1991. — V. 2,- P.40.

100. Belkin S. Stress-response luminous bacteria for toxicity and genotoxicity monitoring // Microscale Aquatic Toxicology-Advances, Techniques and Practice. 1998. - P. 171-183.

101. Belkin S., Smulski D.R., Dadon S., Van Dyk T.K., LaRossa R.A. A panel of stress-responsive luminous bacteria for toxicity detection // Wat. Res., -1997.-V. 31.- P. 3009-3016.

102. Bhagchandam C.L., Verma S.P. // Ind. J. Pure and Apple Phys.- 1973.-V.7, N5.- P.378-380.

103. Bironaite D., Anusevic Z., Jacquot J.-P., Cenas N. Interaction of quinones with Arabidopsis thaliana thioredoxin reductase // Biochemica et Biophysica Acta. 1998. - V. 1383. - P. 82-92.

104. Bruggeman Y.E., Boogert A., van Hoek A., Jones P.T., Winter G., Shots A., Hilhorst R. Phage antibodies against an unstable hapten: oxygen sensitive reduced flavin // FEBS Letters. 1996. - V. 388. - P. 242-244.

105. Bruggeman Y.E., Honegger A., Kreuwel H., Visser A.W.G., Laane C., Schots A., Hilhorst R. Regulation of the flavin redox potential by flavin-binding antibodies // Eur.J. Biochem., 1997. - V. 249. - P. 393-400.

106. Bruice T.C. Mechanism of flavin catalysis // Acc Chem Res. 1976. -V. 13.-P. 256-262.

107. Bulich A. A., Marking L.L., Kimerle R.A. Use of luminescent bacteria for determining toxicity in aquatic environments. //In Aquatic Toxicology, Kimerle, R.A. and Marking LL (Eds) ASTM, Philadelphia 1979.- P.98-106.

108. Bulish A.A.,.Isenberg D.L. Use of the Luminescent Bacterial System for Rapid Assessment of Aquatic Toxicity// ISA Trans Actions.- 1981 V.20.- P.29-33.

109. Chen L.H., Baldwin T.O. Random and site directed mutagenesis of bacterial luciferase: investigation of aldehyde binding site // Biochemistry. -1989. V. 28, N. 6.- P. 2684-2689.

110. Cheung, Y.H., Neller, A., Chu, K.H., Tam, F.Y., Wong, C.K., Wong, Y.S., and Wong, M.H. Assessment of Sediment Toxicity Using Different Tropic Organisms//Arch. Environ. Contam. Toxicol.- 1996.- V.32.- P. 260-267.

111. Chikuba K., Yubisui T., Shirabe K., Takeshita M. Cloning and nucleotide sequence of a c DNA of the human erythrocyte NADPH-flavin reductase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - V. 198. - P. 1170-1176.

112. Choi S.H., Gu M.B. Phenolic toxicity — detection and classification through the use of recombinant bioluminescent Escherichia coli cells // Environ. Toxicol. Chem. 2001. - V. 20. - P. 248-255.

113. Choi H., Tang C-K., Tu S-C. Catalytically active forms of the individual subunits of Vibrio harveyi luciferase and their kinetic and binding properties // J. Biol.Chem. 1995.-V. 270, N. 28. - P. 16813-16829.

114. Cilento G.J. Generation of triplet carbonyl during peroxidase catalyesed reactions // Biolum.Chemilum. 1988.- V.2, N4.- P. 192.

115. Clare C., Raso S. W., Sinclair J. F., Ziegler M. M., Chaffotte A. F., Baldwin. T.O. Kinetic mechanism of luciferase subunit folding and assembly // Biochemistry.- 1997.- V.36.- P.1891-1899.

116. Dodson, G. and Wodawer, A. Catalytic triads and their relatives// TIBS.-1998.-N3.- P.347-352.

117. Drzyzga, O., Jannsen, S., and. Blotevogel, K.H. (1995). Toxicity of diphenylamine and some of its nitrated and aminated derivatives to the luminescent bacterium Vibrio fisheri. // Ecotoxicol. Environ. Saf. 1995.-V. 31.-P. 149-152.

118. Duane W., Hastings J.W. Flavin mononucleotide reductase of luminous bacteria. // Mol. Cell.Biochem. 1975. - V. 6, N. 1. - P. 53-64.

119. Dutton P.L. Redox potentiometry: determination of midpoint potentials of oxidation-reduction components of biological electron-transfer systems // Methods Enzymol. 1978. - V. 54. - P. 411-435.

120. Van Dyk T.K., Majarian W.R., Konstantinov K.B., Young R.M., Dhurjati P.S., LaRossa R.A. Rapid sensitive pollutantdetection of heat shock gene-bioluminescence gene fusion. // Appl. Environ. Microbiol. -1994. V. 60. -P. 1414-1420.

121. Eberhard, A. and Hastings, J.W. A postulated mechanism for the bioluminescence oxidation of reduced flavin mononucleotide.//Biochem. Biophys. Res. Comm. 1972.- V.47, N2. - P.348-353.

122. Eberlein G., Bruice T.C. The chemistry of a 1.5-diblocked flavin. 2. Proton and electron transfer steps in the reaction of dihydroflavins with oxygen // J. Am. Chem. Soc. 1983. -VI. 105. - P. 6685-6697.

123. El-Sayed. Spin-orbital coupling and radiationless process in nitrogen heterocycles // J. Chem. Phys.- 1963. V.12.- P. 2834-2838.

124. Esimbekova E.N., Kratasyuk V.A., Gladyshev M.I., Khromichek E.V. Use of Bioluminescent Methods for Studying of the Natural Laboratory Ecosystems. In: Materials of the 7-th Int. Conference on Gomeostase, ed. by A.Nefedov, Krasnoyarsk, 1996. P.29-30.

125. Eweg J. K., Muller F., Visser A. J. W. G., Veeger C., Bebelaar D. And Van Voorst J. D. W. Molecular luminescence of some isoalloxazines in apolar solvents at various temperatures // Photochem. Photobiol. 1979. - V.30. -P.463-471.

126. Fisher A.J., Raushel F.M., Baldwin T.O., Rayment I. Three-dimensional structure of bacterial luciferase from Vibrio harvei at 2.4A resolution// Biochemistry.- 1995.- V.34.- P.6581-6586.

127. Fischer A.J., Thompson T. B., Thoden J. B., Baldwin T. O., Rayment I. The 1.5-A resolution crystal structure of bacterial luciferase in low salt conditions//J. Biol. Chem.- 1996. V.271,N36. - P.21956 - 21968.

128. Fleming G.R., Knight A.W.E., Morris J.M., Morrison R.J.S., Robinson G.W. Picosecond fluorescence studies of xanthene dyes // J. Am.Chem.Soc.-1977.- P.4306-4311.

129. Francisco W.A., Abu-Soud N.M., DelMonter A.J., Singelton D.A., Baldwin T.O., Raushel F.M. Deuterium kinetic isotope effect and mechanism of reaction of bacterial luciferase// Biochemistry.- 1998.-V.37.- P.256-266.

130. Fontecave M., Eliasson R., Reichard P. NAD(P)H:flavin oxidoreductase of Escherichia coli. A ferric iron reductase participating in the generation of the free radical of ribonucleotide reductase. // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262. - P. 12325-12331.

131. Forster Th. Intermolecular energy migration and fluorescence// An.Phys.-1948.- V.2.- V.55-15.

132. Francisco W.A., Abu-Sound H.M., Baldwin T.O., Raushel F.M. Interaction of bacterial luciferase with aldehyde substrates and inhibitors // J. Biological Chemistry. 1993. - V. 268, 3. - P. 24734-24741.

133. Francisko W.A., Abu-Sound H.M., Topgi R., Baldwin T.O., Raushel F.M. Interaction of bacterial luciferase with 8-substituted flavin mononucleotide derivatives // J. Biological Chemistry. 1996. - Vol. 271. N. 1. - P. 104-110.

134. Francisco W.A., Abu-Soud H.M., DelMonte A.J., Singletion D.A., Baldwin T.O., Raushel F.M. Deuterium kinetic isotope effects and the mechanism of the bacterial luciferase reaction // Biochemistry. 1998. - V. 37.-P. 2596-2606.

135. Ghisla S. Dehydrogenation mechanism in flavoprotein catalysis // Flavins and flavoproteins. 1982.-P. 133-142.

136. Ghisla S. & Massey V. Mechanisms of flavoprotein-catalyzed reactions //Eur. J. Biochem. 1989.-V. 181.-P. 1-17.

137. Ghisla S., Massey V., Lhoste J-M., Mayhew S.G. Fluorescence and optical characteristics of reduced flavins and flavoproteins // Biochemistry. -1974. V. 13, N.3. - P. 586-597.

138. Gibson Q.H., Hastings J.W. The oxidation of reduced flavin mononucleotide by molecular oxygen // Biochemistry. 1962. - Vol. 83. - P. 368-377.

139. Gladyshev M.I., Sushchik N.N., Kalachova G.S., Shchur L.A. The effect of algal blooms on the disappearance of phenol in a small forest pond. // Water Research. 1998. - V.32, N9. - P.2769-2775.

140. Grabert E., Kossler F. About the Effects of Nutrients on the Luminescent Bacteria Test. In: Bioluminescence and Chemiluminescence, ed. by J.W.Hastings, L.J.Kricka, and P.E.Stanley, 1996.- P.291-294.

141. Grabert, E. and Kossler, F. (1997). About the effects of nutrients on the luminescent bacteria test, In Bioluminescence and Chemiluminescence (J.W.Hastings, L.J.Kricka, and P.E.Stanley Eds.), John Wiley & Sons, Chichester

142. Gratz H., Penzkofer A. // J. Photochem. Photobiolo. A: Chem.-1999.-V.127.- P.21-30.

143. Gordon-Walker A., Penzer G. R., Radda G. K. Excited states of flavins characterised by absorption, prompt and delayed emission spectra // Eur. J. Biochem. 1970. - V.13. - P.313-321.

144. Gu M.B., Gil G.C. A multi-channel continuous toxity monitoring system using recombinant bioluminescent bacteria for classification of toxicity // Biosensors & Bioelectronics. 2001.-V. 16.-P. 661-666.

145. Gu M.B., Gil G.C., Kim J.H. Enhancing the sensitivity of a two-stage continuous toxicity monitoring system through the manipulation of the dilution rate // J. Biotechnology. 2002. - V. 93. - P. 283-288.

146. Gu M.B., Mitchell R.J., Kim J.H. Continuous monitoring of protein damaging toxicity using a recombinant bioluminescent Escherichia coli // Chemical and Biological Sensors for Environmental Monitoring. 2000. - P. 185-196.

147. Guzzella, L., Bartone, C., Ross, P., Tartari,G., and Mutau, H. Toxicity Identification Evalution of Lake Orta (Northen Italy) Sediments Using the Microtox System// Ecotoxicology and Environmental Safety.- 1995.- V.35.- P. 231-235.

148. Hall L.H., Bowers M.L., Durfor C.N. Further consideration of flavin coenzyme biochmistry afforded by geometry optimized molecular orbital calculations // Biochemistry. - 1987(b). - V. 26. - P. 7401-7409.

149. Halle F., Meyer J.M. Iron release from ferrisiderophores. A multi-step mechanism involving a NADH/FMN oxidoreductase and a chemical reduction by FMNH2 // Eur. J. Biochem. 1992. - V. 209. - P. 621-627.

150. Hart R.S., Cormier M. Recent advanse in the mechanisms of bio and chemiluminescent reaction // Photochem. Photobiol. - 1979. - V. 29. - P. 209215.

151. Hastings J.W., Gibson Q.H. Intermediates in the bioluminescent oxidation of reduced flavin mononucleotide// J. Biol. Chem.- 1963. V.238, N7.- P.2537-2554.

152. Hastings J.W., Rilley W.H., Massa I. The purification, properties and chemiluminescent quantum yield of bacterial luciferase // J. Biol.Chem. 1965.- V. 240. P.1473-1481.

153. Hastings J.W., Balny C., LePeuch C., Douzou P. Spectral properties of an oxygenated luciferase-flavin intermediate isolated by low-temperature chromatography // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. - V. 70. - P. 3468-3472.

154. Hastings J.W., Balny C. The oxygenated bacterial luciferase-flavin intermediate. Reaction products via the light and dark pathways // J. Biol. Chem.- 1975. V. 250. - P. 7288-7293.

155. Hastings J.W., Nealson K.H. Bacterial bioluminescence // Ann. Rev. Microbiol. 1977. -V. 31. - P. 549-595.

156. Hastings J.W., Potrikus C.I., Gupta S.C., Kurfurst M., Makemson I.C. // Biochemistry and Physiology of Bioluminescent Bacteria. In: Advances in Microbial Physiology. Academic Press, London, 1985, V.26.- P.235-291.

157. Hastings J.W. Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review // Gene.- 1996.- V. 173P. 5-11.

158. Haugland R.P. (editor). Handbook of fluorescent probes and research chemicals, 7th edition. Molecular probes Inc., 1999. 679 p.

159. Heelis P.F. The photophysical and photochemical properties of flavins (isoalloxazines) // Chem. Soc.Rev.- 1982.- V.l 1.- P. 15-49.

160. Hemmerich P., Michel H., Schug C., Massey V. Scope and limitation of single electron transfer in biology // Struct. Bonding. 1982. V. 48. - P. 93-130.

161. Van Hoek A., Visser A.J.W.G. Pulse selection system with electro-optic modulators applied to mode-locked cw lasers and time-resolved single photon counting. // Rev. Sci. Instruments.- 1981.- V. 52.- P. 1199-1205.

162. Van Hoek A.,. Visser A.J.W.G. Artefact and distortion sources in time correlated single photon counting// Analytical Instrumentation.- 1985.-V. 14.-P.359-378.

163. Van Hoek A., Visser A.J.W.G. Efficient method for the extraction of second harmonic light after extracavity frequency doubling// Appl. Optics .1990.- V.29.-P.2661-2663.

164. Holzman T.F., Baldwin T.O. Reversible inhibition of the bacterial luciferase catalyzed bioluminescence reaction by aldehyde substrate: Kinetic mechanism and ligand effects // Biochemistry. 1983. - V. 22. - P. 2838-2846.

165. Hu H.-Y., Fujie K., Nakagome H., Urano K., Katayama A. Quantitive analyses of the change in microbial diversity in a bioreactor for wastewater treatment based on respiratory quinines // Wat. Res. 2002. - V. 33. - N. 15. -P. 3263-3270.

166. Jablonski E., DeLuca M. Purification and properties of the NADH and NADPH specific FMN oxidoreductases from Beneckea harveyi // Biochemistry. 1977. - V. 16. - P. 2932-2936.

167. Jablonski E., DeLuca M. Studies of the Control of Luminescence in Beneckea harveyi: properties of the NADH and NADPH:FMN oxidoreductases // Biochemistry. 1978. -V. 17. - P. 672-678.

168. Jeffers C.E., Tu S-C. Differential transfers of reduced flavin cofactor and product by bacterial flavin reductase to luciferase // Biochemistry. 2001. — V. 40.-P. 1749-1754.

169. Johansson L. B.-A., Davidsson A., Lindblom G., Razi Naqvi K. Electronic transitions in the isoalloxazine ring and orientation of flavins in model membranes studied by polarized light spectroscopy // Biochemistry. 1979. -V. 18. - P.4249-4253.

170. Johnston T.C., Thompson R.B., Baldwin T.O. Nucleotide sequence of the luxB gene of V. Harveyi and the complete amono acid sequence of the b subunit of bacterial luciferase //J. Biol. Chem. 1986. - V. 261, N11. - P. 48054811.

171. Jorns M.S. The catalytic mechanism of DNA photolyase // Flavins and Flavoproteins 1987. - P. 233-246.

172. Kalacheva G. S., Gubanov V. G., Gribovskaya I. V., Gladchenko I. A., Zinenko G. K., Savitsky S. V. Chemical analysis of Shira lake water (19972000) // Aquati Ecology. 2002. -V. 2. - P.123-141.

173. Kamal C., Bruice T.C. Chemiluminescence accompanying the decomposition of 4A-flavine-alhyl-peroxide model studies of bacterial luciferase// J.Am.Chem.Soc.- 1977.- V.99, N2.- P.7064-7069.

174. Kasha M., Collisional perturbation of spin-orbital coupling and the mechanism of fluorescence quenching. A visual demonstration of the perturbation// J. Chem. Phys.- 1952.- V.20.- P.71-74.

175. Karatani H., Konaka T. In vitro bacterial bioluminescence coupled with a mediated electrochemical process of flavine on a viologen polymer electrode // Biochemistry and Bioenergetics. 1998. - Vol. 46. - P. 227-235.

176. Klinman J.P. Redox-Active Amino acids in biology // Methods in Enzymology 1995. - P. -28-56.

177. Koo J.-Y., Schuster G.B. Chemically initiated electron exchange luminescence. A new chemiluminescent reaction pathway for organic peroxides. // J. Am. Chem. Soc. 1977. - V. 99. - P. 6107.

178. Kosover E.M. A proposed mechanism for light emission by bacterial luciferase involving dissociative electron transfer // Biochem. Biophis. Res. Comm.-1982.- V.92, N2.- P.356-364.

179. Kratasyuk V.A. Principle of Luciferase Biotesting. In: Biological luminescence, ed. by B. Jezowska-Trzebiatowska, B.Kochel, J.Stawinski and I.Strek, World Scient., Singapore, 1990,- P.550-558.

180. Kratasyuk V.A., Vetrova E.V., Kudryasheva N.S. Bioluminescent Water Quality Monitoring of Salt Lake Shira // Luminescence.- 1999.- V.14.- P. 193195.

181. Kratasyuk, V.A., Esimbekova, E.N., Gladyshev, M.I., Khromichek, E.B., Kuznetsov, A.M. and Ivanova, E.A. The use of bioluminescent biotests for study of natural and laboratory aquatic ecosystems// Chemosphere, 2001.- V.42, N8.-P.907-915.

182. Kudryasheva N.S., Belobrov P.I., Kratasyuk B.A., Sherbinskaya M.K. Physical-chemical regularities of external quenching of bacterial bioluminecsence/ In book Biological Luminescence, Singapure: World Scientific, 1990.- P.416-425.

183. Kudryasheva N.S., Abakumova V.V., Belobrov P.I., Egorova O.I., Kratasyuk V.A. Nanodiamond action on bacterial bioluminescence in vitro // Herald of Russian Acad.Tech.Sci.- 1994.- V.l, N7.- P.201-207.

184. Kudryasheva N.S., Kratasyuk V.A., Belobrov.P.I. Bioluminescent analysis. The action of toxicants: Physical-chemical regularities of the toxicants effects// Anal.Lett.- 1994.- Vol.27, N15. P.2931-2938.

185. Kudryasheva N.S., Shigorin D.N., Meshalkin Y.P. Upper electron excited states in bioluminescence/ In: Bioluminescence and Chemiluminescence, Ed.by John Wiley & Sons LTD, Spring 1997.- P.70-73.

186. Kudryasheva N.S., Kratasyuk V.A., Esimbekova E.N.,Vetrova, Kudinova I.Y. Development of the bioluminescent bioindicators for analysese of pollutions// Field Analytical Chemical Technologies. 1998.- V.2, N. 5.- P.277-280.

187. Kudryasheva N.S., Kudinova I.Y., Esimbekova E.N., Kratasyuk V.A., Stom D.I. (1998). Effects of quinones and phenols on the NAD(H)-dependent triple systems// . Chemosphere.- 1999.-V.38,N4.- P.751-758.

188. Kudryasheva N.S. Mechanisms of xenobiotics' effects on bacterial bioluminescence//Luminescence.- 1999.- V.14.- P. 199-200.

189. Kudryasheva N.S., Nemtseva E.V.,.Meshalkin Yu.P, Sizykh A.G. Upper elecrton-excited states in bioluminescence: experimental indication// Luminescence.- 2001.- V.3.- P.243-246.

190. Kudryasheva N.S., Gerasimova M.A. Effects of potassium halides on bacterial bioluminescence// J.Photochem.Photobiol.- 2002.- V.66, N3.- P.218-222.

191. Kudryasheva N.S., Nemtseva E.V., Sizykh A.G. , Visser, A.J.W. Estimation of energy of upper electron-excited states in bacterial bioluminescent emitter. Materials of 12th Int.symp.on B1 CI, Robinson college, Univ.of Cambridge, UK, 2002, P.31-32.

192. Kurfurst M., Hastings J.W. Identification of the luciferase-bound flavin-4A-hydroxide as the primary emitter in the bacterial bioluminescence reaction. In Flavins and Flavoproteins, 1984, Walter de Gruyter&Co., Berlin-New York.-P.657-667.

193. Kurfurst M, Macheroux P, Ghisla S and Hastings JW. Isolation and characterisaton of the transient, luciferase-bound flavin-4a-hydroxide in the bacterial luciferase reaction. Biochim.Biophys.Acta.- 1987.- V.924.- P. 104-110.

194. Kulinski T., Visser A. J. W. G. Spectroscopic investigation of the single triptophan residue and of riboflavin and 7-oxolumazine bound to lumazine apoprotein from Photobacterium leiognathi // Biochemistry. 1987. - V.26. - P. 540-549.

195. Z., Meighen E.A. Fatty acid-enhanced binding of flavin mononucleotide to bacterial luciferase measured by steady-state fluorescence // Biochim. Biophis. Res. Comm. 1992. - V.188, N2. - P.497-502.

196. Z., Meighen E.A. The turnover of bacterial luciferase is limited by a slow decomposition of the ternary enzyme-product complex of luciferase, FMN, and fatty acid // J. Biol.Chem. 1994. - V. 269, N9. - P. 6640-6644.

197. Macheroux P., Ghisla S., Kurfurst M., Hastings J.W. // Flavins and Flavoproteins. (Bray R.C., Engel P., Mayhew S.G., Eds.) Walter deGruyter, Berlin, New York, 1984. pp. 669-672.

198. Macheroux P., Chisla S., Hastings J.W. Spectral detection of an intermediate preceding the excited state in the bacterial luciferase reaction // Biochemistry. 1993.-V. 32. - P. 14183-14186.

199. Magde D., Wong R., Seybold P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields // Photochem. Photobiol. -2002. V.75, N4. - P.327 - 334.

200. Mager H.I.X., Addink R. On the role of some flavins adducts as one-electron donors // Flavins and flavoproteins. Bray R.S., Engel P. C., Mayhew S. G. (Eds), Berlin: Walter de Gruyter, 1984. P.37-40.

201. Matheson B.C., Lee J., Miiller F. Bacterial bioluminescence: spectral study of the emitters in the in vitro reaction // Biophysics. 1981. - V. 78, N2. -P. 948-952.

202. Matheson I.B.C., Lee J. Kinetics of bacterial bioluminescence and the fluorescent transient // Photochem. Photobiol. 1983. - V.38, N2. - P.231-240.

203. Matsushita K, Toyama H., Yamada M., Adachi O. Quinoproteins: structure, function, and biotechnological applications // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V.58. - P. 13-22.

204. McCapra F., Lesson P. D., Donovan V., Reeey G. Reaction of flavin analogs and other geterocycles as model of bioluminescence // Tetrahedron. -1986. V.42, N12. - P.3223 -3243.

205. McCapra F. Mechanism in chemiluminescence and bioluminescence -unfinished business. In: Bioluminescence and Chemiluminescence, edited by J.W.Hastings, L.J.Kricka, P.E.Stanley, John Wiley & Sons, Chichester, 1997.-P.7-15.

206. Meighen E.A. Bacterial bioluminescence: organization, regulation and application of the lux genes // FASEB J.- 1993.- V.7.- P. 1016-1022.

207. Michaliszyn G.A., Wing S.S., Meighen A. Purification and properties NAD(P)H:flavin oxidoreductase from the luminous bacteria, Beneckea harveyi // J. Biol. Chem. 1977. - V. 252, N21. - P. 7495-7499.

208. Middleton A.J., Smith E.B. General anaesthetics and bacter ial luminescence. 1. The effect of diethyl ether on the in vivo light emission of Vibrio fischeri. //Proc. Roy. Soc. Long. B. 1976a.- V.193, N4.- P. 159-171.

209. Middleton A.J., Smith E.B. General anaesthetics and bacterial luminescence. 2. The effect of diethyl ether on in vitro light emission of Vibrio fischeri. //Proc. Roy. Soc. Long. B., 19766.- V.193, N4.- P. 173-190.

210. Monaco H.L. Crystal structure of chicken riboflavin binding protein // EMBO J. - 1997.-V. 16.-P. 1475-1483.

211. Moonen C.T.W., Vervoort J., Mueller F. Same new ideas about the possible regulation of redox potentials in flavoproteins with special reference to flavodoxins // Flavins and flavoproteins. 1984. - P. 493-496.

212. Moore J.W. and Moore E.A. Environmental Chemistry, Academic Press, NY, 1983.-P. 423-438.

213. Müller F. The flavin redox system and its biological function. // Topics in Current Chemistry. 1983. - P. 71-107.

214. Natecz-Jawecki G., Rudz В., and Sawicki J. Evalution of toxicity of medical devices using Spirotox and Microtox tests: I. Toxicity of selected toxicants in various diluents// Biomedical Materials Reserch .- 1997.- V. 35.- P. 101-105.

215. Nefsky В., DeLuca M. Studies on the NADH and NADPH: riboflavin 5'-phoaphate (FMN) oxidoreductases from Beneckea harveyi: characterization of the FMN binding sites // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1982. -V.216, N1. - P. 10-16.

216. Nicoli M.Z., Hastings J.W. Bacterial luciferase. The hydrophobic environment of the reactive sulfhydryl // J. Biol. Chem. 1974. - V. 249, N.8. -P. 2393-2396.

217. Niviere V., Fieschi F., Decout J-L., Fontecave M. In the NAD(P)H:Flavin Oxidoreductase from Escherichia coli д member of the ferredoxin-NADP+ reductase family? // J. Biological Chemistry. 1996. - V. 271, N28.-P. 16656-16661.

218. Niviere V., Vanoni M.A., Zanetti G., Fontecave M. The NAD(P)H:flavin oxidoreductase from Escherichia coli with NADPH and riboflavin: identification of intermediates // Biochemistry. 1998. - V. 37. - P. 11879-11887.

219. Novikov E.G., van Hoek A., Visser A.J.W.G., Hofstraat J.W. Linear algorithms for stretched exponential decay analysis// Opt. Commun.- 1999.-V.166.-P.189-198.

220. O'Connor D.V., Phillips D. Time-correlated single photon counting. London: Academic Press, 1984.

221. O'Kane D., Lee J. Chemical characterization of lumazine protein from Photobacterium leiognathi: comparison with lumazine protein from Photobacteriumphosphoreum И Biochemistry. 1985. - V.24. - P. 1467 - 1475.

222. O'Kane D.J., Vervoort J., Muller F., Lee J. Purification and characterization of an unusual non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi II Flavins and Flavoproteins. 1987. - P. 641.

223. Petrov R.R., Utkin I.B., Munilla R., Fernandez V.M., Popov V.O. Effect of redox potential on the properties of the NAD-dependent hydrogenase from Alcaligenes eutrophus Z1 // Arch. Biochem. Biophys. 1989. - V. 268, 1. - P. 306-313.

224. Petushkov V.N., Ketelaars M., Gibson B.G., Lee J. The interaction of Photobacterium leiognathi and luciferases the with fluorescent (antenna) proteins: bioluminescence effects of the aliphatic additive // Biochemistry. -1996b. V.35. - P.12086 - 12093.

225. Platenkamp R.J., Palmer M.N., Visser A.J.W.G. Ab initio molecular orbital studies of closed shell flavins // Eur. Biophys. J. 1987. - V. 14. - P. 393402.

226. Plotnikiv V.G., Regularities of processes of radiationless conversion in polyatomic molecules// Int.J.Quantum Chemistry. 1979.- V.16.-P.527-541.

227. Raushel F.M., Baldwin T.O. Proposed mechanism for the bacterial bioluminescence reaction involving a dioxirane intermediat // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989, Vol.164, N3.- P. 1137-1142

228. Reed E., Frangineas G. Design and performance of a high-power mode-locked Nd:YLF laser. In: SPIE Proc.- 1990.- V. 1223: Solid State Lasers.- P.338-349.

229. Schuster G.B. Chemiluminescence of organic peroxides. Conversion of grounf-state reaction to excited-states products by the Chrmically Initiated Electron-Exchange Luminescence mechanism// J Am Chem Soc.- 1979.-V.12.-P.366-373.

230. Serat W.F., Budenger F.E. Evaluation of biological effects of air pollutants by use of luminescent bacteria. //J. Bacteriol. 1965. - V.90, N3.-P.832-833.

231. Serat W.F., Budinger F.E., Mueller F.K. Toxicity evaluation of air pollutants by use of luminescent bacteria. //Atmospher. Environ. 1967.- V.I.-P.21-32.

232. Sharp R.E., Chapman S.K. Mechanisms for regulating electron transfer in multi-centre redox proteins // Biochemica and Biophysica Acta. 1999. — V. 1432.-P. 143-158.

233. Sirokman G., Wilson T., Hastings J.W. A bacterial luciferase reaction with a negative temperature coefficient attributable to protein-protein interaction. // Biochemistry.- 1995.- V.34.- P.13074-13081.

234. Soep B., Kellmann A., Martin M., Lindqvist L. Study of triplet quantum yields usind a tunable dye laser // Chem. Phys. Lett.- 1972.- V. 13, №3.- P.241-244.

235. Stankovich M.T. Redox properties of flavins and flavoproteins // Chemistry and biochemistry of flavoenzymes (Miiller F., ed.) CRC Press, Boca Raton. 1990. - V. 1. - P. 401-4025.

236. Stom D.I. Influence of polyphenols and quinones on aquatic plants and their blocking of SH-groups// J Acta hydrochim. hydrobiol. 1977. V.5.-P. 291298.

237. Stom D.I., Geel T.A., Balayan A.E., Kuznetsov A.M. Bioluminescent Method in Studing the Complex Effect of Sewage Components// Arch.Environ.Contam.Toxicol.- 1992.- V.22.- P. 203-208.

238. Sun M., Moore T.A., Song P.-S. Molecular Luminescence studies of flavins. I. The Excited states of flavins // J. American Chemical Society. 1972. -V. 94.-P. 1730-1740.

239. Takagi K., Kano K., Ikeda T. Mediated bioelectrocatalysis based on NAD-related enzymes with reversible characteristics // J. Electroanalytical Chemistry. 1998. - V. 445. - P. 211 -219.

240. Tanner J, Lei B, Liu M, Tu SC, Krause KL Crystallization and preliminary crystallographic analysis of NADPH:FMN-oxidoreductase from Vibrio harveyi // J Mol Biol. 1994. - V. 241. -N. 2. - P. 283-287.

241. Tanner J.J. Lei B., Tu S-C., Krause K.L. Flavin reductase P: Structure of the dimeric enzyme that reduced flavin // Biochemistry. 1996. - V. 35. - P. 13531-13539.

242. Tanner J. J., Miller M. D., Wilson K. S., Tu S.-C., Krause K. L. Structure of bacterial luciferase (32 homodimer: implication for flavin binding // Biochemistry.- 1997.- V.36, N4.- P.665-672.

243. Tatsumi H., Nakase H., Kano K., Ikeda T. Mechanistic study of the autoxidation of reduced flavin and quinone compounds. // J. Electroanalytical Chemistry. 1998. - Vol. 443. - P. 236-242.

244. Tu S-C. Isolation and properties of bacterial luciferase-oxygenated flavin intermediate complexed with long-chain alcohols// Biochemistry.- 1979.-V. 18,N26.-P. 5940-5945.

245. Tu S.-C. Bacterial luciferase 4a-hydroperoxyflavin intermediates: stabilization, isolation, and properties// Methods Enzymol.- 1986. — V.133.-P.128-135.

246. Tu S.-C., Mager H. Biochemistry of bacterial bioluminescence. // Photochem. Photobiol. 1995. -V. 62. - P. 615-624.

247. Tu S.-C., Lei B., Yu. Y., Liu M. Characterization of Vibrio harveyi NADPH:FMN oxidoreductase and mechanism of reduced flavin transfer to luciferase // Flavins and Flavoproteins.- 1997. P. 357-366.

248. Tyulkova NA. Purification of bacterial luciferase from Photobacterium Leiognathi with the use of FPLC-system. In: Jezowska-Trzebiatowska B, Kochel B, Stawinski J, Strek W, editors. Bacterial Luminescence. Singapore: World Scient, 1990.- P.369-374.

249. Turro N.J. Modern molecular photochemistry. University Science Book: California, 1991.-620 p.

250. Ulitzur, S. and Hastings, J.W. Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979.-V.76, N1.- P.265-267.

251. Ulitzur S., Weiser I., Yannai S. A new sensitive and simple bioluminescence test for mutagenic compounds. //Mutant Res. 1980.- V.74, N2.- P.l 13-124.

252. Ulitzur S., Reinhertz A., Hastings J.W. Factors affecting the cellular expression of bacterial luciferase. //Arch. Microbiol.- 1981,- V.129.- P.67-71.

253. Ulitzur S., Weiser I. Acridine dyes and other DNA- intercalating agents induce the luminescence system of luminous bacteria and their dark variants. //Proc.Natl. Acad.Sci.USA.- 1981.- V.78, N6.- P.3338-3342.

254. Vervoort J., Muller F., O'Kane D.J., Lee J., Bacher A. Bacterial luciferase: a carbon-13, nitrogen-15, and phosphorus-31 nuclear magnetic resonance investigation // Biochemistry. 1986. - V. 25. - P. 9067-8075.

255. Vetrova E.V, Kratasyuk V.A, Kudryasheva N.S. Bioluminescent characteristics map of Shira lake water// Aquatic Ecology.- 2002.- N2-4.- P.309-315.

256. Visser A.J.W.G., Lee J. Lumazine protein from the bioluminescent bacterium Photobacterium phosphoreum. A fluorescence study of the protein-ligand equilibrium // Biochemistry. 1980. - V.19. - P.4366-4372.

257. Visser A.J.W.G., Vervoort J., O'Kane D., Lee J., Carreira L.A. Raman Spectra of flavin bound in flavodoxins and other flavoproteins. Evidence for structural variations in the flavin-binding region // Eur. J. Biochem. 1983. - V. 131.-P. 639-645.

258. Visser A.J.W.G., van Hoek A., Visser N.V., Lee Y., Ghisla S. Timeresolved fluorescence study of the dissociation of FMN from the Yellow fluorescence protein from Vibrio fischeri // Photochem. Photobiol. 1997. - V. 65.-P. 570-575.

259. Vos K., A. van Hoek, A.J.W.G. Visser. Application of a reference deconvolution method to trytophan fluorescence in proteins. A refined description of rotation dynamics. // Eur. J. Biochem. 1987. - V.165. - P.55-63.

260. Vrielink A., Lloyd L., Blow D.M. Cristal structure of cholesterol oxidase from Brevibacterium sterolicum refined at 1.8 A resolution. // J.Mol. Biol. -1991.- V.219.- P.533-554.

261. Waddle J., Baldwin T.O. Individual a and p subunits of bacterial luciferase exhibit bioluminescence activity // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1991.- V. 178.-P. 1188-1193.

262. Ward W.W. Energy transfer processes in bioluminescence// Photochem.Photobiol.rev.- 1979.- V.4.- P. 1-57.

263. Watanabe T., Nakamura T. Studies on luciferase from Photobacterium Phosphoreum. VIII. FMN-H202 initiated bioluminescence and thermodynamics of elementary steps of the luciferase reaction // J. Biochemistry. 1976. — V. 79.- P. 489-495.

264. Weber G. // Flavins and flavoproteins, ed. E. C. Salter, Elsevier, Amsterdam, 1966. P. 15.

265. Wei C.J., Lei B, Tu S.C. Characterization of the Binding of Photobacterium phosphoreum P-flavin by Vibrio harveyi Luciferase // Arch Biochem Biophys, 2001. - V. 396, N2. - P. 199-206.

266. Williams C.H., Lipoamide dehydrogenase, glutathione reductase,thioredoxin reductase, and mercuric ion reductase a family of flavoenzyme transhydrogenases // Chemistry and Biochemistry of flavoenzymes. - 1992. - P. 3121-213.

267. Wood K.V., Gruber M.G. Transduction in microbial biosensors using multiplexed bioluminescence// Biosensors & Bioelectronics.- 1996.- V.ll.- P. 207-214.

268. Zigler MM, Baldwin TO. Biochemistry of bacterial bioluminescence. In Current Topics in Bioenergetics. Academic Press: N.Y., 1981. P.66-133.

269. Zenno S and Saigo K. Identification of the encoding the major NAD(P)H-flavin oxidoreductase of the bacterium vibrio fischeri ATCC 7744 // J. Bacteriology. 1994. - V. 176. - P. 3544-3551.

270. Zhou Z., Swenson R.P. Electrostatic effects of surface acidic amino acid residues on the oxidation reduction potentials of the flavodoxin from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough) // Biochemistry. - 1995. - V. 34. - P. 3183-3194.

Информация о работе

Кудряшева, Надежда Степановна
доктора физико-математических наук
Красноярск, 2004
ВАК 03.00.02

Диссертация

Механизм формирования электронно-возбужденных состояний в бактериальной биолюминесценции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы