Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование электронно-возбужденных состояний эмиттера бактериальной биолюминесценции с помощью молекулярных акцепторов энергии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Немцева, Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Миграция энергии электронного возбуждения в бактериальных биолюминесцентных системах (обзор литературы).

1.1. Механизм бактериальной биолюминесценции.

1.1.1. Общая характеристика явления.

1.1.2. Биолюминесцентная реакция бактерий.

1.1.2.1. Интермедиа™ реакции, катализируемой бактериальной люциферазой.14 1.1.2.1. Проблема эмиттера бактериальной биолюминесценции.

1.1.2.1.1. Проблема формирования первичного эмиттера биолюминесценции.

1.1.2.2.2. Проблема переноса энергии на вторичные эмиттеры бактериальной биолюминесценции.

1.1.3. Пути воздействия химических соединений на биолюминесценцию in vitro.

1.2.Современные методы исследования межмолекулярных переносов энергии.

1.2.1. Дезактивация электронно-возбужденных состояний молекул.

1.2.2. Тушение флуоресценции.

1.2.3. Переносы энергии электронного возбуждения.

1.2.3.1. Излучательный тип переноса энергии.

1.2.3.2. Теория безызлучательного переноса энергии.

1.2.4. Флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением.

1.3. Спектрально-люминесцентные свойства компонентов биолюминесцентных бактериальных систем.

1.3.1. Спектральные свойства ферментов бактериальной биолюминесценции.

1.3.2. Свойства флавинмононуклеотида и его производных.

1.3.3. Спектральные свойства НАД+ и НАДН.

1.3.4. Оптические свойства альдегидов.

1.3.5.Спектральные свойства люмазинового и желтого флуоресцентного белков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование электронно-возбужденных состояний эмиттера бактериальной биолюминесценции с помощью молекулярных акцепторов энергии"

актуальность проблемы. Явление биолюминесценции (свечения живых организмов) в настоящее время нашло широкое применение в виде аналитических методов и биотестов. При этом используются как светящиеся организмы, так и выделенные из них системы ферментов, катализирующих биолюминесцентные реакции (Кратасюк и др., 1982; Гительзон и др., 1984). С одной стороны, специфичность ферментативных биолюминесцентных систем и тест-параметр в виде света позволяют регистрировать очень малые количества субстратов в исследуемых растворах (например, до 10"15 М НАДН, до 10~13 М АТФ). С другой стороны, чувствительность биолюминесцентных систем к разным классам ксенобиотиков делает их удобными для оценки общей токсичности проб при мониторинге окружающей среды. Такое применение биолюминесцентных систем делает актуальным вопрос о механизме действия на них разных классов химических соединений. Одним из методов исследования этих механизмов является воздействие на биолюминесцентную систему рядом веществ с последовательно изменяющимися характеристиками (Kratasyuk et al., 1998).

Биолюминесценция считается частным случаем хемилюминесценции, т.е. процессом трансформации энергии химической связи в энергию электронно-возбужденных состояний молекул. Характерными отличиями биолюминесцентных реакций от хемилюминесцентных являются их чрезвычайно высокие квантовые выходы (0.1-1.0), которые обеспечиваются участием в процессе специфических ферментов - люцифераз. При этом механизм образования в ходе реакции электронно-возбужденных состояний все еще не выяснен до конца даже для самых изученных биолюминесцентных систем - бактериальной и светляковой. Многие механизмы, предложенные в настоящее время для биолюминесцентной реакции бактерий, включают в себя стадию образования высоковозбужденного предшественника эмиттера, играющего роль донора энергии.

Таким образом, одним из путей воздействия веществ на биолюминесценцию является перенос (акцептирование) энергии электронного возбуждения с эмиттера и/или его высокоэнергетического предшественника.

Теория переносов энергии электронного возбуждения и тушения люминесценции в молекулярных растворах интенсивно развивалась последние полвека. В данной работе методы и подходы, разработанные ранее для растворов, применены к более сложной люминесцентной системе, в которой электронно-возбужденные состояния образуются в результате химической реакции с участием биологического катализатора - фермента люциферазы.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение влияния процессов переноса энергии на спектральные характеристики бактериальной биолюминесценции in vitro методом тестирования свойств системы с помощью ряда модельных флуоресцентных соединений с различной энергией низших возбужденных синглетных состояний.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние на спектры бактериальной биолюми-несценции ряда ксантеновых красителей.

2. Исследовать спектры биолюминесценции в присутствии ароматических соединений с энергией флуоресцентного состояния, превышающей энергию соответствующего состояния эмиттера, для тестирования заселенности высших электронно-возбужденных состояний интермедиатов биолюминесцентной реакции.

3. Установить характер взаимодействия экзогенных соединений с ферментом -бактериальной люциферазой, используя методы флуоресцентной спектроскопии.

Научная новизна. Исследовано изменение спектральных характеристик биолюминесценции в присутствии ряда соединений (потенциальных акцепторов энергии возбуждения) с различной энергией флуоресцентных состояний. Зарегистрирована сенсибилизированная люминесценция соединений, энергия флуоресцентного состояния которых превышает энергию соответствующего состояния эмиттера и спектры поглощения не перекрываются со спектром биолюминесценции. Энергия высоковозбужденного состояния, образующегося в биолюминесцентной реакции, оценена как > 26000 см"1. Получены времена вращательной корреляции спада анизотропии флуоресценции молекул-акцепторов в присутствии люциферазы, подтверждающие слабое (гидрофобное) взаимодействие этих молекул с ферментом.

Практическое значение работы. Данное исследование вносит вклад в разработку физико-химических основ биолюминесцентного анализа. В работе исследован один из механизмов воздействия экзогенных соединений на тестовую биолюминесцентную систему - акцептирование энергии электронного возбуждения. Полученные результаты указывают на необходимость учета спектральных характеристик излучения в биолюминесцентном анализе образцов, содержащих флуоресцентные соединения. Это позволяет увеличить чувствительность и точность биолюминесцентных биотестов в отношении V некоторых классов поллютантов, таких как красители и другие ароматические соединения.

Положения, выносимые на защиту

1. Спектральные характеристики биолюминесценции (интенсивность, положение максимума, форма спектра) в присутствии флуоресцентных соединений определяются спектрально-люминесцентными свойствами этих соединений (квантовый выход, молярная экстинкция, энергия флуоресцентного состояния).

2. В реакции бактериальной люциферазы происходит образование высоковозбужденного предшественника эмиттера биолюминесценции с энергией электронно-возбужденного состояния не менее 26000 см"1.

3. Гидрофобные взаимодействия обеспечивают возможность переноса энергии между активным центром люциферазы и малополярными экзогенными молекулами в условиях отсутствия перекрытия спектров.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 8-м Всероссийском (с международным участием) симпозиуме «Гомеостаз и окружающая среда» (Красноярск, 1997), 8-м Международном конгрессе по биотехнологии (Будапешт, 1997), 10-м и 12-м Международных симпозиумах по биолюминесценции и хемилюминесценции (Болония, Италия, 1998, Кембридж, Великобритания, 2002), 2-м Съезде биофизиков России (Москва, 1999), 13-м Международном биофизическом конгрессе (Нью Дели, Индия, 1999), 4-м Съезде 8

Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск. 2000), 4-й Международной конференции по биологической физике (Киото, Япония, 2001), 20-й Международной конференции по фотохимии (Москва, 2001).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в виде 6-ти статей и 7-ми тезисов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав и заключения. Объем диссертационной работы составляет 118 страниц машинописного текста, включая 12 таблиц и 34 рисунка.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Немцева, Елена Владимировна

ВЫВОДЫ ПО ДИССЕРТАЦИИ:

1. Показано, что спектральные характеристики биолюминесценции (интенсивность, положение максимума, форма спектра) в присутствии флуоресцентных соединений определяются спектрально-люминесцентными свойствами этих соединений (квантовый выход, молярная экстинкция, энергия флуоресцентного состояния).

2. Установлено наличие сенсибилизированной люминесценции соединений, для которых отсутствует перекрытие спектра поглощения со спектром биолюминесценции, в реакции, катализируемой бактериальной люциферазой.

3. Получено экспериментальное подтверждение заселения в биолюминесцентной реакции высших электронно-возбужденных состояний с энергией не менее 26 ООО см"1.

4. На основе результатов спектральных исследований, включая изучение спада анизотропии флуоресценции с временным разрешением, показано, что между люциферазой и неполярными экзогенными молекулами в растворе осуществляются слабые взаимодействия гидрофобного характера, что создает условия для переноса энергии с возбужденных интермедиатов биолюминесцентной реакции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные в данной работе исследования свидетельствуют о высокой активности электронно-возбужденных состояний эмиттера бактериальной биолюминесценции в процессах переноса энергии возбуждения. Активный центр люциферазы не создает препятствий для акцептирования энергии электронного возбуждения, локализованной на эмиттере, экзогенными молекулами. Добавляя в реакцию бактериальной люциферазы вещества с разными энергиями флуоресцентных состояний, удалось зарегистрировать даже перенос энергии с высоковозбужденных уровней эмиттера - явление, достаточно редкое для спектроскопии молекулярных растворов. Особенности изучаемого объекта -ферментативной реакции (например, способность люциферазы взаимодействовать с неполярными молекулами) создали условия для осуществления таких переносов, что и было показано в данной работе.

Полученные результаты являются подтверждением гипотезы о первоначальном заселении высокоэнергетичных состояний эмиттера бактериальной биолюминесценции в результате ферментативной реакции. Поскольку биолюминесцентные реакции других организмов также проходят с участием гетероциклических соединений с высоким квантовым выходом флуоресценции, существует вероятность образования высоковозбужденных интермедиатов и в биолюминесцентных процессах других организмов, не только бактерий. Продолжением исследований, проведенных в данной работе, может стать изучение структуры высших электронно-возбужденных состояний эмиттеров других биолюминесцентных организмов, таких как светляки и кишечнополостные.

Ill

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Немцева, Елена Владимировна, Красноярск

1. Васильев Р.Ф. Пути возбуждения хемилюминесценции в органических соединениях // Биохемилюминесценция. М: Наука, 1983. - С.З 1-55.

2. Векшин H.JI. Экранировочный гипохромизм хромофоров в макромолекулярных биоструктурах // Биофизика. 1999. - Т.44. - 1. - С.45 - 55.

3. Владимиров Ю.А. Фотохимия и люминесценция белков. М.: Наука, 1965. - 232 с. Владимиров Ю.А., Добрецов Т.Е. Флуоресцентные зонды в исследованиях биологических мембран. М.: Наука, 1980. - 320 с.

4. Герасимова М.А. Влияние ксантеновых красителей на характеристики биолюминесцентной биферментной системы: Магистерская диссертация, КрасГУ. Красноярск, 2001. 55 с.

5. Гительзон И.И., Родичева Э.К., Медведева С.Е. и др. Светящиеся бактерии.-Новосибирск: Наука, 1984.- 298 с.

6. Демченко А.П. Люминесценция и динамика структуры белков. Киев: Наукова думка, 1988. -280 с.

7. Ермолаев В.Л. Сверхбыстрые безызлучательные переходы между высоковозбужденными состояниями в молекулах органических соединений // Успехи химии.-2001. -Т.70.-2. -С.539 561.

8. Ермолаев В.Л., Бодунов Е.Н., Свешникова Е.Б., Шахвердов Т.А. Безызлучательный перенос энергии электронного излучения. Л.: Наука, 1977. - 311 с.

9. Кудряшева Н.С., Белобров П.И., Кратасюк В.А., Шигорин Д.Н. Электронно-возбужденные состояния при биолюминесценции // ДАН СССР. 1991. - Т.321. - 4. -С.837 - 841.

10. Кудряшева Н.С., Зюзикова Е.В., Гутник Т.В., Кузнецов A.M. Действие солей металлов на бактериальные биолюминесцентные системы различной сложности // Биофизика. 1996.-Т. 41.-6.-С. 1264 - 1269.

11. Мак-Глинн С., Адзуми Т., Киносита М. Молекулярная спектроскопия триплетного состояния. М.: Мир, 1972. - 448 с.

12. Мешалкин Ю.П., Немцева Е.В., Алфимов Е.А.,Кудряшева Н.С. О тушении бактериальной биолюминесценции красителями. // Биофизика. 1999. - Т.44. - 6. -С.1083 - 1086.

13. Потапова Е.Н. Двухфотонные флуоресцентные зонды и их применение: выпускная работа бакалавра. Новосибирск: НГТУ, 2000. 50 с.

14. Теренин А.Н. Перенос и миграция энергии в биохимических процессах // УФН. -1951.-T.33.-3.-C.347 379.

15. Угарова Н.Н., Бровко Л.Ю. Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ: Метод, указания. Москва: МГУ, 1981. - 138с.

16. Шигорин Д.Н., Валькова Г.А., Гастилович Е.А. и др. Электронно-возбужденные состояния многоатомных молекул, -М.: Наука, 1993. 496с.

17. Baldwin Т.О., Nicoli M.Z., Becvar J. Е., Hastings J.W. Bacterial luciferase. Binding of oxidized flavin mononucleotide // J. of Biol. Chem. 1975. - V. 250. - 8. - P.2763 - 2768.

18. Eberhard, A., Hastings, J.W. A postulated mechanism for the bioluminescence oxidation of reduced flavin mononucleotide // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1972. - V.47. - 2. -P.348 - 353.

19. El-Sayed. Spin-orbital coupling and radiationless process in nitrogen heterocycles // J. Chem. Phys. 1963. - V.12. - P. 2834 - 2838.

20. Eweg J. K„ Muller F„ Visser A. J. W. G., Yeeger C„ Bebelaar D. And Van Voorst J. D. W. Molecular luminescence of some isoalloxazines in apolar solvents at various temperatures // Photochem. Photobiol. 1979. - V.30. - P.463 - 471.

21. Fischer A.J., Thompson Т. В., Thoden J. В., Baldwin T. 0., Rayment I. The 1.5-A resolution crystal structure of bacterial luciferase in low salt conditions/ / J. Biol. Chem. -1996. V.271. - 36. - P.21956 - 21968.

22. Gordon-Walker A., Penzer G. R., Radda G. K. Excited states of flavins characterised by absorption, prompt and delayed emission spectra//Eur. J. Biochem. 1970. - V.13. - P.313 -321.

23. Gratz H., Penzkofer A. Triplet-triplet absorption of some organic molecules determined by picosecond laser excitation and time-delayed picosecond light continuum probing // J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 1999. - Y.127. - P.21 - 30.

24. Hastings J.W., Gibson Q.H. Intermediates in the bioluminescent oxidation of reduced flavinmononucleotide // J. Biol. Chem. 1963. - Y.238. - 7. - P.2537 - 2554.

25. Hastings J.W. Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review // Gene. 1996.- V.173. P.5 - 11.

26. Haugland R.P. (editor). Handbook of fluorescent probes and research chemicals, 7th edition. Molecular probes Inc., 1999. 679 p.

27. Heelis P.F. The photophysical and photochemical properties of flavins (isoalloxazines) // Chem. Soc. Rev. 1982. - 11. - P.15 - 39.

28. Jameson D.M., Seifried S.E. Quantification of protein-protein interaction using fluorescence polarization // Methods: A Companion to Methods in Enzymology. 1999. - V.19. - 2. - P. 222-233.

29. Johansson L. B.-A., Davidsson A., Lindblom G., Razi Naqvi K. Electronic transitions in the isoalloxazine ring and orientation of flavins in model membranes studied by polarized light spectroscopy // Biochemistry. 1979. - V.18. - P.4249 - 4253.

30. Kosover E.M. A proposed mechanism for light emission by bacterial luciferase involving dissociative electron transfer // Biochim. Biophis. Res. Comm. 1980. - V. 92. -2. - P.356 -364.

31. Kurfurst M., Hastings J.W. Identification of the luciferase-bound flavin-4A-hydroxide as the primary emitter in the bacterial bioluminescence reaction // Flavins and Flavoproteins, Walter de Gruyter&Co., Berlin-New York, 1984 P.657 - 667.

32. Kulinski Т., Visser A. J. W. G. Spectroscopic investigation of the single triptophan residue and of riboflavin and 7-oxolumazine bound to lumazine apoprotein from Photobacterium leiognathi // Biochemistry. 1987. - V.26. - P. 540 - 549.

33. Kudryasheva N.S., Meshalkin Y.P., Shigorin D.N. Upper electron-excited states in bacterial bioluminescence // Bioluminescence and Chemiluminescence: molecular reporting with

34. Photons. Proc. of the 9th Int. Symp. on Biolum. and Chemilum., Woods Hole, Massachusetts, October 1996. P.70 - 73.

35. Kudryasheva N.S., E.V. Nemtseva, Yu.P. Meshalkin, A.G. Sizykh. Upper electron-excited states in bioluminescence: experimental indication // Luminescence. 2001. - V.16. - P.243 -246.

36. Kudryasheva N.S., E.V. Nemtseva, A.G. Sizykh, V.A. Kratasyuk, A.J.W.G Visser. Estimation of energy of upper electron-excited states in bacterial bioluminescent emitter// J. Photochem. Photobiol.: В.- 2002,- V.68. 2. - P. 109 - 112.

37. Matheson I.B.C., Lee J. Kinetics of bacterial bioluminescence and the fluorescent transient // Photochem. Photobiol. 1983. - V.38. - 2. - P.231 - 240.

38. Meighen E.A. Bacterial bioluminescence: organization, regulation and application of the 1га genes//FASEB J. 1993. - V.7. - P. 1016 - 1022.

39. O'Kane D., Lee J. Chemical characterization of lumazine protein from Photobacterium leiognathi: comparison with lumazine protein from Photobacterium phosphoreum // Biochemistry. 1985. - V.24. - P. 1467 - 1475.

40. Reed E. and Franginea G. Design and performance of a high power mode-locked Nd:YLF laser // SPIE Proc. V.1223: Solid State Lasers, 1990.

41. Tanner J. J., M. D. Miller, K. S. Wilson, S.-C. Tu, K. L. Krause. Structure of bacterial luciferase p2 homodimer: implication for flavin binding // Biochemistry. 1997. - V.36. - 4. -P.665 - 672.

42. Visser A.J.W.G., Lee J. Lumazine protein from the bioluminescent bacterium Photobacterium phosphoreum. A fluorescence study of the protein-ligand equilibrium // Biochemistry. 1980. - V.l9. - P.4366 - 4372.

43. Weber G. // Flavins and flavoproteins, ed. E. C. Salter, Elsevier, Amsterdam, 1966. P.15.