Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотоника биополимеров, мембран и модельных систем

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Векшин, Николай Лазаревич, Б. м.

ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

- г ■" М.......«№ 1^/м Щ УДК 577.336 + 577.34

' " ~ ?

~ о , \ ! .......................

1счал" .....

В е к ш и н Николай Лазаревич

ФОТОНИКА БИОПОЛИМЕРОВ, МЕМБРАН И МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ: ПУТИ ТРАНСФОРМАЦИИ ЭНЕРГИИ ФОТОВОЗБУЖДЕНИЯ

03•оо.02-биофизика

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических . наук

ОГЛАВЛЕНИЕ. стр.

ВВЕДЕНИЕ. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ..........................................................&

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ................................................................................6

НАУЧНОЕ ЗНАЧЕНИЕ И НОВИЗНА.......................................................%

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ............................................................5

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ..............................................................Ю

ГЛАВА 1 . ВВЕДЕНИЕ В ФОТОНИКУ................................£

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................

#1 . ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И РЕАКТИВЫ.........................йв

#2. АППАРАТУРА..............................................

#3. МНОГОХОДОВЫЕ КЮВЕТЫ ДЛЯ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА......... ^

#4. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ КОМБИНИРОВАННЫЙ СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ

КОНЦЕНТРАЦИИ МЕМБРАННОГО БЕЛКА.............................. 3%

#5. РАЗДЕЛЕНИЕ ТИР03ИН0В0Й И ТРИПТОФАНОВОЙ КОМПОНЕНТ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ МЕТОДОМ СИНХРОННОГО СКАНИРОВАНИЯ..............

ГЛАВА 3. ТРАНСФОРМАЦИЯ ЭНЕРГИИ ПРИ Ф0Т0В03БУВДЕНИИ БЕЖОВ

И СПЕКТРАЛЬНАЯ НЕОДНОРОДНОСТЬ ИХ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ.............. ^

#1 . ОБ ИЗМЕНЕНИИ СТЕПЕНИ ПОЛЯРИЗАЦИИ ПО СПЕКТРУ ИЗЛУЧЕНИЯ

БЕЛКОВ......................!.............................. &

#2. ОБ ИЗМЕНЕНИИ ВРЕМЕНИ ЖИЗНИ ПО СПЕКТРУ ИЗЛУЧЕНИЯ.

ДИСКРЕТНЫЕ СОСТОЯНИЯ........................................ £3

#3. ФОТОИНДУЦИРОВАННАЯ НАНОСЕКУНДНАЯ ПОДВИЖНОСТЬ В БЕЛКАХ И ОЛИГОПЕПТИДАХ............................................... 81

ГЛАВА 4. ЭКСИПЛЕКСЫ И ЭКСИМЕРЫ.............................. Н

#1 . МОДЕЛЬ ДРОБНОГО ПЕРЕНОСА ЭНЕРГИИ........................

#2. ЭКСИПЛЕКСЫ И ЭКСИМЕРЫ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ.......

#3. ЭКСИПЛЕКС ПИРЕН-ИНДОЛ...................................

#4. ЭКСИМЕРЫ И ДИМЕРЫ ПИРЕНА В МЕМБРАНАХ....................

#5. МОНОМЕР ПИРЕНА - ИНДИКАТОР КОНЦЕНТРАЦИИ КИСЛОРОДА И ПОЛЯРНОСТИ МЕМБРАНЫ.........................................

ГЛАВА 5. ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ ЭЛЕКТРОННОГО ВОЗБУЖДЕНИЯ............ {2%

#1. МОДЕЛЬ ФЕРСТЕРА И ЕЕ ОГРАНИЧЕНИЯ........................

#2. ЭФФЕКТ ОБЪЕМНОЙ РЕАБСОРБЦИИ............................. 1Ъ€

#3. ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ В БЕЛКАХ. ОБ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПЕРЕНОСА С

ТИРОЗИНОВЫХ ОСТАТКОВ НА ТРИПТОФАНОВЫЕ.......................

#4. ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ В ГЕМ-БЕЛКАХ..................:.........

#5. ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ В АЖОГОЛЬДЕЩДРОГЕНАЗЕ.................

#6. О ТУШЕНИИ БЕЛКОВОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ КРАСИТЕЛЯМИ И

АРОМАТИЧЕСКИМИ УГЛЕВОДОРОДАМИ...............................

#7. ОБ ЭФФЕКТИВНОСТИ МИГРАЦИИ ЭНЕРГИИ ПО БИОПОЛИМЕРАМ. ИНТЕРКАЛИРУЮЩИЙ КРАСИТЕЛЬ И ДНК.............................

ГЛАВА 6. АБСОРБЦИЯ СВЕТА В СТРУКТУРАХ....................... 190

#1. ГИПОХРОМИЗМ............................................. 43 4

#2. ВЕРОЯТНОСТЬ ПОГЛОЩЕНИЯ. ЭКРАНИРОВОЧНАЯ МОДЕЛЬ

ГИПОХРОМИЗМА................................................

#3. НУКЛЕОТИДЫ, ОЛИГОНУКЛЕОТВДЫ И ДНК....................... »<>2

#4. ТИРОЗИН, ТРИПТОФАН И БЕЛКИ..............................

#5. ЭРИТРОЦИТЫ, ХЛОРОПЛАСТЫ, КЛАСТЕРЫ И ДРУГИЕ

МИКРОСТРУКТУРЫ.............................................. 23 й

#6. МИКРОЭКРАНИРОВКА И МИКРОРЕАБСОРБЦИЯ СВЕТА В ГЕТЕРОГЕННЫХ

СИСТЕМАХ....................................................

ГЛАВА 7. ФОТОАКТИВАЦИЯ ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ....................

#1. ФОТОФИЗИКА НАДН-ДЕГИДР0ГЕНАЗН0Г0 КОМПЛЕКСА.

ФОТОДЕСОРБЦИЯ...............................................

#2. ФОТОПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ 1ЩЦУ НАДН И ФЛАВИНАМИ. РОЛЬ

СИНГЛЕТНОГО КИСЛОРОДА....................................... Я^С

#3. ФОТОДЫХАНИЕ МИТОХОНДРИЙ................................. Z66

#4. СВЕТОЗАВИСИМЫЙ СИНТЕЗ АТФ В МИТОХОНДРИЯХ. МОДЕЛЬ

ТЕПЛОВОГО СОПРЯЖЕНИЯ........................................ Я-6*

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................

ВЫВОДЫ...................................................... zs с

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................... ZSO

ВВЕДЕНИЕ. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

В биологических структурах поглощение света приводит к тем же процессам трансформации энергии, что и в молекулярных растворах: колебательной релаксации, внутренней конверсии, интеркомбинационной конверсии в триплет, флуоресценции и фосфоресценции, переносу энергии электронного возбуждения, образованию эксимеров и эксип-лексов, переносу электронов, конформационным изменениям и химическим превращениям. Изучение этих процессов и составляет предмет фотоники.

Важность развития фотоники биологических структур определяется следующими факторами:

а) Обычно представления молекулярной фотоники растворов автоматически переносятся на биоструктуры. Часто это оправдано. Однако гетерогенность, анизотропия, упорядоченность, относительно высокая жесткость и некоторые другие свойства биомакромолекул и мембран могут приводить к необычным соотношениям между различными каналами трансформации энергии электронного возбуждения, к неожиданным спектральным эффектам. Изучение процессов, происходящих при поглощении фотона в молекулярных биоструктурах, является существенным для понимания физических механизмов этих процессов и их специфики в гетерогенных, анизотропных, жестких структурах. Диссертационная работа и посвящена в основном этому вопросу.

б) Некоторые процессы трансформации энергии электронного возбуждения могут быть использованы в качестве физических спектральных характеристик для изучения структуры и функции мембран и биополиме-

ров. Они основываются на детектировании взаимодействия света с природными или синтетическими хромофорами, находящимися в этих объектах. Одним из наиболее развитых областей молекулярной фотоники является флуоресцентный анализ, который дает ценную информацию о пространственной организации и функционировании биоструктур.

в) Во многих биологических системах указанные процессы трансформации энергии выполняют определенную биологическую функцию. Например, это биолюминесценция светлячков и глубоководных рыб, образование пигментов и витамина Д в коже, преобразование световой энергии в электрическую в зрительных палочках и колбочках, и т.д. Особенно важную роль играют указанные процессы в растительном и бактериальном фотосинтезе.

N

г) В последние годы световая стимуляция с помощью мощных ламп и лазеров широко используется в клеточной биологии и медицине.

д) Спектроскопические характеристики различных биомолекул используются для создания детекторов и сенсоров (например, сенсоры на кислород, глюкозу и др.). В свою очередь, многие биологические соединения могут детектироваться оптическими физико-химическими датчиками.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

Цель работы заключалась в изучении специфики трансформации энергии при фотовозбуждении естественных хромофоров и зондов, находящихся в биоструктурах, т.е. в предсказании, обнаружении и объяснении спектральных эффектов, установлении главных каналов реали-

зации энергии фотовозбуждения в конкретных макромолекулярных структурах животного происхождения и их моделях.

Для этого нужно было решить следующие задачи: повысить чувствительность люминесцентного анализа; разработать простой и надежный способ измерения концентрации мембранного бежа, позволяющий сохранить его нативность; найти эффективный способ разделения сильно перекрывающихся спектров излучения; объяснить спектральные особенности триптофановой флуоресценции белков на основе представлений об эксиплексах и релаксационных процессах; выяснить природу тушения триптофановой и зондовой флуоресценции различными природными и искусственными соединениями в конкретных парах хромофор -тушитель, представляющих интерес для биофизики; исследовать процессы переноса энергии в биополимерах, мембранах и их моделях; изучить процессы экранирования и реабсорбции света в гетерогенных системах; изучить возможность использования света нефотосинтезирующими ферментными комплексами для переноса электронов, химических превращений и запасания энергии; предварительно выяснить возможные стадии этих процессов на модельных системах.

НАУЧНОЕ ЗНАЧЕНИЕ И НОВИЗНА.

Было проведено систематическое исследование особенностей трансформации энергии фотовозбуждения в конкретных биоструктурах животного происхождения и их моделях. Обнаружен ряд новых спектральных эффектов и дана их интерпретация. Основные данные изложены в публикациях [1-59]. Впервые были получены следующие принципиальные результаты, выносимые на защиту:

1) Разработаны многоходовые кюветы, позволяющие существенно повысить чувствительность флуоресцентного анализа. 2) Предложен простой и надежный способ измерения концентрации бежа в стандартных биологических суспензиях. 3) Показана применимость синхронной спектроскопии для разделения сильно перекрывающихся центров излучения бежа. 4) Доказано, что в бежах с внутренними триптофанила-ми снижение поляризации в "красной" области спектра излучения обусловлено возрастанием вращательной подвижности из-за увеличения времени жизни возбужденного состояния. Увеличение времени жизни вызвано ростом вклада долгоживущей эксиплексной компоненты; сами компоненты являются константами. 5) При фотовозбуждении хромофоров в жидком и вязком микроокружении возникает вынужденная подвижность, обнаруживаемая для бежов и олиго-пептидов в наносекундной области. 6) Предложена модель дробного переноса энергии в эксиме-рах и эксиплексах, объясняющая величину "красного сдвига" и бесструктурность эксиплексной полосы излучения. 7) Перекрывание спектров люминесценции и поглощения хромофоров не обязательно ведет к переносу энергии электронного возбуждения. В мембранах и макромолекулах перенос энергии происходит эффективно лишь на малых расстояниях, соизмеримых с размерами хромофоров, и не описывается ферстеровской моделью. 8) Стопкообразное расположение хромофоров в макромолекулах может приводить к возникновению экранировочного ги-похромизма, обусловленного конкуренцией хромофоров за фотон. Скопление хромофоров в малом объеме может приводить к микро-экранировке и микро-реабсорбции света из-за высоких оптических плотностей отдельных частиц. 9) Продемонстрирована регуляция дегидрогеназ УФ светом за счет десорбции продукта из активного центра. Ю) Показана фотоактивация потребления кислорода и синтеза АТФ в митохондриях; предложена модель "теплового сопряжения".

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Исследование трансформации энергии фотовозбуждения в биоструктурах и их моделях имеет большое значение для понимания функционирования живых систем, для правильного применения спектральных методов, для развития и использования физических теорий возбужденных состояний в регулярных системах.

Совокупность полученных результатов представляет собой существенное развитие нового направления исследований - фотоники биоструктур. При этом были осуществлены теоретические обобщения и решены крупные задачи, имеющие важное научное и прикладное значение. В практическом отношении было сделано следущее:

- разработаны многоходовые кюветы, позволяющие многократно увеличить чувствительность флуоресцентного метода (кюветы запатентованы, внедрены и выпускаются НПО "Биоприбор"; материалы о них вошли в учебник по молекулярной оптике [60]);

- предложен метод комбинированного спектрофотометрического измерения количества бежа в биологических суспензиях;

- предложено использовать мономерную люминесценцию пирена для измерения концентрации кислорода, а ее вибронные полосы - для оценки микро-полярности мембран (материалы использованы в [61,62]).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ.

Материалы работы докладывались на Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1981, 1984, 1988, 1991), 1-м Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Всесоюзной конференции по люминесцентному анализу в биологии и медицине (Рига, 1988), школе-конференции по биоорганической химии (Алушта, 1989), 3-м международном симпозиуме по люминесцентной спектрометрии в биомедицинских науках (Гент, Бельгия, 1989), 6-м международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Кембридж, Англия, 1991), 5-м конгрессе Европейского общества по фотобиологии (Амстердам, Нидерланды, 1991), международном симпозиуме по спектроскопии биологических молекул (Англия, 1991) и др., а также на лабораторных, отдельских и общеинститутских семинарах ИБК, ФИАН, ИХФ, МГУ, ИОФАН, НИФХИ, МФТИ и др.

Основные результаты диссертационной работы изложены в 59 публикациях, из которых 37 - статьи в центральных отечественных и зарубежных журналах, 2 патента, 2 монографии.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ФОТОНИКУ.

Схема основных процессов трансформации энергии электронного возбуждения в хромофорных системах дана на рис.1 (из [631, с небольшими модификациями).

Некоторые пути трансформации энергии в фотовозбужденном хромофорной молекуле показаны на рис.2 (схема из [64], с незначительными изменениями). Электронно-колебательный переход с нижнего виб-ронного уровня (V = о) основного состояния (БО) на вибронные уровни (V = О, 1, 2, 3) возбужденных синглетных состояний (Б1 и Б2) возникает с некоторой вероятностью, когда хромофорная молекула взаимодействует с фотоном. Затем внутримолекулярные электрон-вибронные взаимодействия приводят к быстрой колебательной релаксации (уи) или внутренней конверсии (1С). Если имеет место УИ, то молекула попадает на нижний колебательный уровень состояния Б1. За дезактивацию возбужденного состояния Б1 конкурируют 1С, БТ и флуоресценция. 1С или флуоресценция переводят молекулу вновь в Бо-состояние. БТ-переход называется интеркомбинационной конверсией в триплет. Фосфоресценция и триплет-синглетная (ТБ) интерконверсия возвращают молекулу в состояние БО.

ПОГЛОЩЕНИЕ СВЕТА. Вероятность поглощения кванта молекулой зависит, в частности, от энергии это]?о кванта (длины волны или частоты) и от энергетических уровней хромофора данной молекулы. При не слишком высоких интенсивностях света эта вероятность является молекулярной константой. Время перехода при поглощении кванта составляет не более нескольких фемтосекунд.

В растворе поглощающих молекул интенсивность светового потока экспоненциально спадает вдоль направления его распространения. Ко-

личественно это выражается законом Бугера-Ламберта-Беера [60]:

D = Е [с] Ъ

где D = log (I'/I") - оптическая плотность, I' и I" интенсивности падающего и выходящего световых потоков, Е коэффициент молярной экстинкции, [с] - концентрация в молях, ъ - длина оптического пути в образце.

КОЛЕБАТЕЛЬНАЯ РЕЛАКСАЦИЯ И ВНУТРЕННЯЯ КОНВЕРСИЯ. Для молекул с сопряженными связями время vr и 1С процессов составляет около 0,11,0 пикосекунды. vr и 1с переходы происходят благодаря собственным вибрациям и вращениям молекулы. Потери энергии на vr лежат между юо и 5000 см-1 и соответствуют инфракрасным (Ж) переходам.

ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ. Излучательные переходы из S1 в so происходят за времена порядка 0,01-100 наносекунд. Такая люминесценция, не сопровождающаяся изменением спина электрона, называется флуоресценцией. Поскольку скорость испускания света значительно меньше скорости vr, то спектры флуоресценции сдвинуты в более "красную" область по сравнению со спектрами поглощения. Кроме того, в растворах (особенно - полярных) спектры излучения сдвинуты также благо-

5

даря межмолекулярным взаимодействиям с растворителем.

Вероятность флуоресценции (квантовый выход) может быть выражен через константы скоростей конкурирующих процессов:

Q(f) = K(f) / [K(f) + K(ic) + K(st)3

где КШ - константа флуоресценции, к(1о) и к(st) - константы скорости процессов 1С и эт. Когда данная возбужденная молекула взаимодействует с не возбужденной, другие дополнительные константы (переноса энергии электронного возбуждения, переноса электрона, эксимеризации, дезактивации и др.) должны быть введены в знаменатель приведенной формулы. Чем больше число и скорости процессов, конкурирующих с излучательным переходом из Б1, тем меньше <2(:0. Константа скорости обратно-пропорциональна времени жизни, поэтому:

01(1) = ^А"

где -Г - измеряемое время жизни (т.е. время, за которое интенсивность кинетики затухания свечения уменьшается в 2,3 раза), а V* -естественное время жизни.

С другой стороны, <э(1) может быть выражен через интенсивности падающего и выходящего световых потоков (I' и I", соответственно) и интенсивность флуоресценции (р):

(Ж) = Р / Ц'-Г')

Используя эту формулу и известный закон Бугера-Ламберта-Беера [65] при малых оптических плотностях (Б <.0.02), можно получить приближенное выражение [66]:

<3(Г) = Р/ 2.3 Г Е [с] Ъ

где Е - коэффициент экстинкции, [о] - концентрация, ъ - длина оптического пути.

ИНТЕРКОНВЕРСИЯ И ФОСФОРЕСЦЕНЦИЯ. Интеркомбинационная конверсия означает изменение спина электрона. Излучательные переходы из Т1 в БО явл/яются запрещенными по спину процессами; они имеют очень большое время затухания - 0,1 мс - 10 с. Такая люминесценция называется фосфоресценцией. В растворах фосфоресценция сильно затушена растворителем и кислородом.

ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ. Когда электронно-возбужденная молекула взаимодействует с невозбужденной, может произойти безызлучательный перенос энергии. Если акцептор энергии �