Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотоника биополимеров, мембран и модельных систем пути трансформации энергии фотовозбуждения

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотоника биополимеров, мембран и модельных систем пути трансформации энергии фотовозбуждения"

о

На правах рукописи

х В е к ш и н Николай Лазаревич

ФОТОНИКА БИОПОЛИМЕРОВ, МЕМБРАН И МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ: ПУТИ ТРАНСФОРМАЦИИ ЭНЕРГИИ ФОТОВОЗБУЖДЕНИЯ

03.00.02-биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-1998

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Официальные оппоненты: '

доктор химических наук И.И.Сапежинский доктор физико-математических наук, профессор В.С.Горелик доктор биологических наук, профессор А.Я.Потапенко Ведущая организация:

Институт фундаментальных проблем биологии РАН (г.Пущино)

Защита состоится 2 октября 1998 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 200.53.01 в Институте биохимической физики РАН, г. Москва, ул.Косыгина-4.

С диссертацией можно ознакомиться в объединенной библиотеке Института химической физики РАН.

Автореферат разослан «??.£..»................гГ1998г.

Ученый секретарь совета, кандидат химических наук

М.А.Смотряева

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

В биологических структурах поглощение света приводит к тем же процессам трансформации энергии, что и в молекулярных растворах: колебательной релаксации, внутренней конверсии, интерконбинационной конверсии в триплет, флуоресценции и фосфоресценции, переносу энергии электронного возбуждения, образованию эксимеров и эксиплексов, переносу электронов, конформационным изменениям я химическим превращениям. Эти процессы и составляют предмет фотоники.

Во многих биологических системах указанные процессы трансформации энергии выполняют определенную биологическую функцию. Например, это биолюминесценция светлячков, рыб, медуз, бактерий [Угарова H.H., 1981; Данилов В.С.,1979], образование витамина D и пигментов в коже [Потапенко А.Я., 1988; Рощупкин Д.И., 1975], преобразование световых квантов в электрический сигнал в зрительных палочках и колбочках [Фесенко Е.Е., 1986], световая регуляция клеток микроорганизмов [Крицкий М.С., 1988; Фрайкин Г.Я., 1988; Синещеков O.A., 1988]. Особо важную роль играют указанные процессы трансформации энергии в бактериальном и растительной фотосинтезе [Красновский A.A., 1974; Литвин Ф.Ф., 1981; Борисов А.Ю., 1987; Шувалов В.А., 1990; Чибисов А.К., 1969; Шахов A.A., 1994].

Различные спектральные методы, основанные на регистрации взаимодействия света с природными или искусственными хромофорами, используются для исследования пространственной организации и функционирования мембран, ферментов и нуклеиновых кислот [Полетаев А.И., 1976; Франк-Каменецкий М.Д., 1967; Завильгельский Г.Б., 1988; Гурский Г.В., 1983]. Стимулирующее действие света широко используется в биологии и медицине для активации структур клеток животных и лечения многих заболеваний [Барский Е.Л., 1986; Холмогоров В.Е., 1988; Гуринович Г.П., 1988; Кару Т., 1989; Гамалея Н.Ф., 1988].

Среди наиболее развитых областей молекулярной фотоники можно выделить флуоресцентный анализ [Борисевич H.A., 1967; Нурнухаметов Р.Н., 1971; Левшин Л.В., 1989; Фок «.В., 1964; Ермолаев В.Л., 1977; Чукова Ю.П., 1980; Казуренко Ю.Г., 1982; Жевандров Н.Д., 1987], фотохимические методы [Летохов B.C., 1987; Никогосян Д.Н., 1987; Маслов В.Г., 1982; Львов K.M., 1988; Кузьмин В.А., 1985], абсорбционную спектроскопию [Бахшиев Н.Г., 1972; Персонов Р.И., 1988], хемилюминесценцию [Ва-

- i-

сильев Р.Ф., 1970; Шляпинтох В.Я., 1976; Сапежинский И.И., 1988]. Эти методы дают ценную информацию о пространственной организации и функционировании биологических структур [Баренбойм Г.М., 1966; Конев C.B., 1965; Рубин А.Б. 1988; Давыдов P.M., 1987; Владимиров Ю.А., 1980; Бурштейн Э.А., 1977; Гуроверов К.К., 1983; Котельников А.И., 1981; Черницкий Е.А., 1972; Посудин Ю.И., 1985; Золин В.Ф., 1980; Боровиков Ю.С., 1985; и др.].

Итак, важность развития фотоники биоструктур обусловлена следующими моментами: 1) В живых клетках многие из указанных каналов трансформации энергии фотовозбуждения выполняют определенную биологическую функцию. 2) Ряд указанных процессов может быть использован в качестве основы методов исследования структуры и функции мембран, ферментов и нуклеиновых кислот. 3) Фотоактивация (особенно лазерная) находит широкое применение в клеточной биологии и в медицине. 4) Изучение процессов, происходящих при поглощении и трансформации световой энергии в биоструктурах, важно само по себе как выяснение специфики физических каналов преобразования энергии в гетерогенных, анизотропных, упорядоченных, жестких системах.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

Гетерогенность, анизотропия, упорядоченность, относительно высокая жесткость и некоторые другие свойства биомакромолекул и мембран ногут приводить к необычным соотношенияи между различными каналами трансформации энергии фотовозбуждения, к неожиданным спектральным эффектам.

Цель работы заключалась в изучении специфики трансформации энергии при фотовозбуждении естественных хромофоров и зондов, находящихся в биоструктурах, т.е. в предсказании, обнаружении и объяснении новых спектральных эффектов, установлении главных каналов реализации энергии фотовозбуждения в конкретных структурах животного происхождения и их коделях. Для этого нужно было решить следующие задачи: изучить процессы экранирования и реабсорбции света в гетерогенных системах; объяснить спектральные особенности триптофановой флуоресценции белков на основе представлений об эксиплексах и релаксационных процессах; выяснить природу тушения триптофановой и зондовой флуоресценции различными природными и искусственными соединениями в конкретных парах хромофор -

■г-

тушитель, представляющих интерес для биофизики; исследовать процессы переноса энергии в биополинерах, мембранах и их моделях; изучить возможность использования света нефотосинтезирующими ферментными комплексами для переноса электронов, химических превращений и запасания энергии; предварительно выяснить возможные стадии этих процессов на модельных системах.

НАУЧНОЕ ЗНАЧЕНИЕ И НОВИЗНА.

Было проведено систематическое исследование особенностей трансформации энергии фотовозбуждения в конкретных биоструктурах животного происхождения и их моделях. Обнаружен ряд новых спектральных эффектов и дана их интерпретация. Впервые были получены следующие принципиальные результаты, выносимые на защиту: 1) Стопкообразное расположение хромофоров в макромолекулах и их комплексах может приводить к возникновению эффекта экранировочного гипохромизма, обусловленного взаимным ^экранированием хромофоров от света при конкуренции за фотон. Полученные теоретические выражения позволяют предсказывать гипохромные спектры олигонуклеотидов, ДНК, белков, м(иекМЯРНЫ.х кластеров биологически важных хромофоров. 2) Скопление хромофоров в малом объеме может приводить также к таким явлениям, как микро-экранировка и микро-реабсорбция света за счет наличия высоких локальных оптических плотностей отдельных частиц. Это важно учитывать при измерениях люминесценции мембран и клеток.*3) ЭксиллексныЙ характер белковой флуоресценции создает спектральную неоднородность, характеризующуюся зависимостью времени жизни и степени поляризации от длины волны излучения. В белках с внутренними триптофанилами снижение поляризации в длинноволновой области обусловлено возрастанием вращательного движения при увеличении времени жизни. Наносекундная подвижность триптофанила и ряда других хромофоров носит в значительной степени вынужденный характер. 4) Предложена модель дробного переноса энергии в эксимерах и эксиплексах, объясняющая величину "красного сдвига" и бесструктурность эксиплексной полосы излучения. 5) Перекрывание спектров люминесценции и поглощения хромофоров не обязательно ведет к переносу энергии электронного возбуждения; часто преобладают конкурирующие процессы: динамическое тушение, образование эксиплексов, фотоперенос электрона и др. В мембранах и макромолекулах перенос энергии происходит эффективно лишь на малых расстоя-

-3-

ниях, соизмеримых с размерами хромофоров, и не описывается ферстеровс-кой моделью. 6) Показана фотоактивация потребления кислорода и синтеза АТФ в митохондриях и изучен их механизм; предложена модель "теплового сопряжения". 7) Продемонстрирована регуляция дегидрогеназ УФ светом за счет десорбции продукта из активного центра.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Исследование трансформации энергии фотовозбуждения в биоструктурах и их моделях имеет большое значение для понимания функционирования живых систем, для правильного применения спектральных методов, для развития и использования физических теорий возбужденных состояний в регулярных системах.

Совокупность полученных результатов представляет собой развитие нового направления исследований - фотоники биоструктур. При этом был» осуществлены теоретические обобщения и решены крупные задачи, имеющие важное научное и народнохозяйственное значение.

В практическом отношении было сделано следущее: - разработаны многоходовые кюветы, позволяющие многократно увеличить чувствительность флуоресцентного анализа (кюветы запатентованы, внедрены и выпускаются НПО "Биоприбор"); - предложен метод комбинированного спектрофо-тометрического измерения количества белка в биологических суспензиях; - фотохимическая реакция между НАДН, флавином и кислородом предложена в качестве способа обескислороживания растворов (имеется внедрение); -синтез АТФ в освещаемых митохондриях может быть применен для стимуляции проростков (используется в растениеводстве); - экранировочная модель предлагается в качестве инструмента для расчетов гипохромных спектров или оценки регулярности и количества хромофоров в скоплениях и макромолекулах; - предложено использовать мономерную люминесценцию пирена для измерения концентрации кислорода, а ее вибронные полосы -для оценки микрополярности мембран.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ.

Материалы работы докладывались на Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1981, 1984, 1988, 1991), 1-м Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Всесоюзной конференции по люминесцентному анализу в биологии и медицине (Рига, 1988), школе-кон-

-V-

£еревдии по биоорганической химии (Алушта, 1989), 3-м международном симпозиуме по люминесцентной спектрометрии в биомедицинских науках (Гент, Бельгия, 1989), 6-м международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Кембридж, Англия, 1991), 5-м конгрессе Европейского общества по фотобиологии (Амстердам, Нидерланды, 1991), международном симпозиуме по спектроскопии биологических молекул (Англия, L991) и др., а также на лабораторных, отдельских и общеинститутских :ёминарах ИБК, ИХФ, МГУ, ФИАН, ИОФАН, НИФХИ, МФТИ и др. [ Основные результаты диссертационной работы изложены в 65 публикациях, из которых 38 - статьи в центральных отечественных и зарубежных курналах, 2 патента, 3 монографии.

Диссертация состоит из введения, раздела "материалы и методы", 5 "лав раздела "результаты и обсуждение", заключения, выводов и списка хитературы; общий объем - 321 стр.

(АТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе использовались импортные белки и отечественные химически истые реактивы. Олигоаденины были получены из полиадениловой кислоты

группе С.М.Женодаровой (ИТЭБ РАН). Однослойные липосомы готовились з лецитин-стандарта способом "впрыскивания" [Batzri S., 1973]. Мемб-аны саркоплазматического ретикулума были получены в группе В.Б.Ритова МГУ, биол.ф-т). Митохондрии выделялись из печени крысы по методу [Мо-олова И.М., 1975]. делипидированные митохондрии получены с помощью цетоновой экстракции [Lester R., 1967]. Комплекс апомиоглобина с про-опорфирином IX получен по методу [Постникова Г.Б., 1986].

Спектры возбуждения, излучения и степени поляризации регистриро-ались на "SLM-4800", "Perkin-Elmer MPF 44В" и "Hitachi MPF-4" в стан-1ртиых или многоходовых кюветах; где необходимо проводилась коррекция i спектральную чувствительность. Времена жизни измерялись на 3LM-4800" и на синхротроне в Орсе (Франция) по известным методам [La-swicz J., 1983; O'Connor D., 1984].

Для повышения чувствительности флуоресцентного анализа слабопог-нцающих растворов были разработаны многоходовые кюветы [16-18]. В LCTности, "зеркальная" кювета использует принцип многократного отра-)ния возбуждающего света от зеркального слоя, нанесенного на грани 1арцевой ячейки, а кювета "ПВО" работает за счет эффекта полного

• sr.

внутреннего отражения на границе кварц-воздух двух призменных элементов ячейки [16,20,38]. Теоретический коэффициент усиления (в) для многоходовых кювет определяется выражением:

в = < 1 + Н ) (1+НТ+ + ... КПТП )

где и - коэффициент отражения зеркального слоя или призиы, Т - коэффициент светопропускания раствора в полосе возбуждения, п - число отражений. Многоходовые кюветы повышают интенсивность флуоресценции (рис.1). Они особенно полезны при измерении времени жизни (г), когда мала интенсивность возбуждения. Они позволяют повысить точность измерения -с в наносекундном диапазоне или снизить концентрацию флуоресцентного зонда, а также устраняют паразитное попадание возбуждающего света в канал регистрации при около-резонансных измерениях [56].

Рис.1. Спектр возбуждения флуоресценции 0,01 мкМ родамина-Б в этаноле, измеренный со стандартной о.ю

кюветой (1) и с зеркальной (2) . "5ЬМ", регистрация «•»•

при 600 нм, щели = 2 нм.

о

140 ИО Ш1 ¡П Л,А/П

Спектрофотоивтрические измерения в видимой и УФ области поводились на "Еегк1п-Е1тег-Со1етап" и "Эресогс! ЦУ-чЛз" в кварцевых кюветах Спектры ИК поглощения записывались на спектрометре "5ресогс1 75 111" в КВг-кюветах.

Для стандартно выделяемых препаратов биомембран к клеток был раз работай комбинированный метод УФ-спектрофотометрического измерения концентрации белка [28], основанный на сравнении оптической плотности при 280 или 290 нм с однократным колориметрическим определением. Мето значительно упрощает процедуру измерения количества белка в пробе и имеет высокую чувствительность.

Для проведения фотохимических опытов была собрана установка, поз

воляющая проводить одновременные кинетические измерения интенсивности флуоресценции, концентрации кислорода и рН в освещаемом объеме [4].

Концентрация АТФ измерялась по убыванию неорганического фосфата [Bonting, 1970] и по люциферин-люциферазной реакции в растворе или с иммобилизованой люциферазой [Н.Н.Угарова, 1981]. 1. АБСОРБЦИЯ СВЕТА В УПОРЯДОЧЕННЫХ СТРУКТУРАХ. ГИПОХРОМИЗМ: ЭКРАНИРОВОЧНАЯ МОДЕЛЬ.

Одним из наиболее интересных спектральных явлений, наблюдаемых при объединении хромофоров, является феномен гипохронизма - снижения коэффициента экстинкции [Weissbluth М., 1971]. Величина гипохромизма (h) определяется выражением:

h / 100% = (Е - Ел) / Е где Е - коэффициент экстинкции раствора одиночных хромофоров, Е" -средний коэффициент экстинкции в хромофорном скоплении или макроноле-куле в расчете на один хромофор.

Среди интерпретаций этого явления наиболее популярными были две: "светоиндуцированные межхромофорные взаимодействия" [Tinoco I., 1960] и "эффект сита" [Duysens L., 1956]. Анализ этих моделей показал [33,35], что они не позволяют дать количественное описание гипохромных спектров. Однако вторая модель правильно указывает на то, что (в условиях, когда нежмолекулярными взаимодействими можно пренебречь) гипох-ромизм может вызываться неоднородный характером поглощения света в неоднородной среде.

Чтобы объяснить гипохромизм ДНК, олигонуклеотидов, белков и других полимерных молекул (в условиях, когда межхромофорные взаимодействия слабы) была использована экранировочная модель [19,33,35]. В стопке хромофоров (рис.2), находящихся на расстояниях значительно меньших длины волны, вероятность поглощения фотона k-тым хромофором составляет:

k-l

р* - ( 1 - р )к 1 р

где р - вероятность поглощения одиночным хромофором (при данной длине

90ЛНЫ).

пиши nJ б ~

в < Г

\ с

I ♦ ^ N

Рис.2. Различные варианты расположения хромофорных диполей: стопка (а), стопка со сдвигом (б), линейная цепочка (в), хаотическое скопление (г).

Согласно теории мишени [А.Н.Теренин, 1967], р может быть выражена через отношение сечения поглощения (s) к площади хромофора (S). Сечение поглощения может быть выражено через коэффициент экстинкции и имеет размер площади ("площадь не проницаемая для фотона" [Теренин, 1967]).

В итоге было получено [19,33], что гипохромный коэффициент экс-тинкции в расчете на один хромофор регулярной стопки составляет:

ЕА = [ 1 - ( 1 - 2,3 Е q / S )k] S / 2,3 q k где q - ориентационный фактор.

Это выражение позволяет предсказывать гипохромные коэффициенты экстинкции в макромолекулах или стопкообразных скоплениях идентичных хромофоров исходя из известных значений Е, s, q и к.

На рис.3 для примера приведена расчетная зависимость ЕЛ олигоа-денинов от длины цепочки (от к) и экспериментальные точки из работы [Leng М., 1966]. Отклонение точек вверх при к 6 можно объяснить известной способностью длинных олигонуклеотидов к изломам и скадыванию. Рис.3. Зависимость коэффициента экстинкции аденинового хромофора при 260 нм от длины олигоадениновой цепочки при q = 1 (1), стопки при q = 2 (2) и данные из работы [Leng М., 1966] (3) .

15СЮ0

- J-

Поскольку Е меняется с длиной волны, то формула дает возможность описать форму гипохромной полосы. На рис.4 показаны спектры поглощении пента-аденозинфосфата, аденозина и вычисленный из последнего гипохром-ный спектр при к = 5 и д = 2.

Рис.4. Спектры коэффициента экстинкции аденозина (1) и пента-аденозинфосфата (2) в 10 мМ какодилатном буфере с 100 нН Ь1С1, рН =» 7, при 6"С, а также теоретический гипохромный спектр при к = 5 и ч = 2 (3) .

Аналогичные данные были получены для ДНК, агрегатов тирозина, триптофановых й тирозиновых остатков фосфолипазы а2 и РНКазы Т1, гемоглобина в эритроцитах, кластеров антрацена и др.

2. МИКРОЭКРАНИРОВКА И МИКРОРЕАБСОРБЦИЯ СВЕТА В ГЕТЕРОГЕННЫХ СИСТЕМАХ.

Правильный количественный учет экранировки и реабсорбции света чрезвычайно важен при люминесцентных измерениях [Паркер С., 1972]. дш слабо поглощающих растворов (О « 0,1) этими факторами обычно можно пренебречь. Однако для оптически гетерогенных растворов, какими являются полимеры, биомакромолекулы, мембраны и клетки, это не всегда возможно. В гетерогенных системах из-за сильно неравномерного распределения хромофоров по объему могут возникать ситуации, когда локальная оптическая плотность (О') отдельной частицы будет наемного превышать оптическую плотность (Э) всей системы. Поэтому возникнут эффекты локальной экранировки и реабсорбции света - "микроэкранировка" и "микрореаб-сорбция" [27]. В этом случае:

Т' - г 10-Е'с,£1'

где Е' - интенсивность люминесценции гетерогенного раствора (суспензии) , к - интенсивность люминесценции идеального раствора, Е' - коэффициент экстинкции хромофоров в отдельной частице с' - локальная концентрация хромофоров, с1' - эффективная длина частицы. Для зондов,

-3-

встраивающихся в макромолекулы, мембраны или клетки:

1д (Г' / ?) - - Ь Е'с где N - число Авогадро, с - конечная концентрация зонда, Ь - коэффициент перераспределения зонда между частицами и внешним раствором, V -объем одной частицы. Микроэкранировка и микрореабсорбция приводят к снижению интенсивности люминесценции и искажению формы спектра возбуждения или излучения (рис.5). 2

1.0

Рис.5. Спектральные изменения при Уюкроэкранировке или микрореабсорбция света в гетерогенных системах. 1 - спектр возбуждения или излучения исходно; 2 - то же о,5 в результате микроэкранировки или микрореабсорбции; 3 - спектр поглощения отдельной частицы. При вычислении 2 из 1 и 3 принято, что максимуме И' - 1,0.

А , ЛЛ1

Например, наблюдается небольшая микрореабсорбция белковой люминесценции эритроцита его гемоглобином (рис.6). Для эритроцита расчет дает, что Т' - 0,87 при 412 нм, т.е. Е' < Г на 13%; в опыте получено 15%.

Рис.6. Микрореабсорбция белковой люминесценции эритроцитов в области полосы Соре. 1 - спектр поглощения гемоглобина в эритроцитах; 2 -белковая люминесценция эритроцитов; пунктир - з; то же без микрореабсорбции.

3.0 2 ,1.0

2

2,0 \ 2 I

0,5\ 0,04

1,0

0,02

4ео д,л гп.

- Ш-

3. ТРАНСФОРМАЦИЯ ЭНЕРГИИ ПРИ ФОТОВОЗБУЖДЕНИИ БЕЛКОВ. СПЕКТРАЛЬНАЯ НЕОДНОРОДНОСТЬ И ВЫНУЖДЕННАЯ ПОДВИЖНОСТЬ.

Уже давно было обнаружено, что степень поляризации (Р) белковой флуоресценции снижается в длинноволновой части спектра [Конев C.B., 1965] . Для объяснения этого одни авторы выдвинули представления о "дуальности" триптофановой эмиссии из-за наличия двух осцилляторов полосы поглощения [Valeur В., 1977]; другие считали, что причиной снижения Р является изменение эффективности миграции энергии между триптофанилами с разными спектрами [Бурштейн Э.А., 1983; и др.]; третьи полагали, что дело заключается в гетерогенности центров излучения по вращательной подвижности [Черницкий Е.А., 1972; и др.]; четвертые предположили наличие возрастания угла между осцилляторами поглощения и излучения с увеличением длины волны эмиссии [Туроверов К.К., 1985] и т.п. Было отмечено также [Саржевский A.M., 1971], что некоторые авторы вообще считают непостоянство Р артефактом, обусловленным попаданием возбуждающего света в канал регистрации.

Конечно, каждый из перечисленных факторов мог бы, в принципе, приводить к указанному эффекту. Но важно было установить главную причину. В работах [21,23] было проведено изучение причин изменения Р по спектру излучения белков. На рис.7 показан один из характерных опытов. В отличие от предшественников, нами были проведены также измерения "с. Из рис.7 видно, что с увеличением длины волны наблюдается возрастание "С и снижение Р. Рис.7, флуоресценция гиалуронидазы. 1 и 2 -спектры излучения, 3 и

4 - степень поляризации,

5 - время жизни. Возбуждение = 280 нм (для 1,3,5) или 300 нм (для 2,4).

В табл. 1 приведены данные о -с и Р для ряда белков и модельных систем. Для всех белков, включая однотриптофановые, имеет место возрастание х и снижение Р в длинноволновой области. То же самое наблюдается для глицеринового раствора триптофана. Возрастание X. в "красной"

- И-

области было получено позднее на однотриптофановых мутантных белках [Harris D., 1990].

Для d, 1-триптофана в глицерине можно воспользоваться'известных уравнением Левшина-Перрена:

1/Р - 1/3 - (1/Ро - 1/3) (1 + RTt//jV) где Ро - предельная поляризация, - вязкость, 1 - абсолютная температура, R - универсальная постоянная, V - объем частицы. Подстановка значений Ро - 0,5, ^ - 10 пуаз, V - 30 А3, Т - 294 К, R - 8,3 Дж/моль К v -с - 4,2 не дает Р - 0,33. Это значение совпадает с величиной Р, полученной при возбуждении 300 нм и регистрации при 320 ни (табл.1). Подстановка т - 5,4 не дает Р - 0,3, что близко к величине Р при 380 нм (табл.1). Таким образом, изменение Р по спектру излучения триптофана в глицерине вызвано исключительно увеличением вращательного дви -жения тех молекул, которые имеют большее -с.

Таблица 1. Положение максимума излучения, квантовый выход флуоресценции (f), степень поляризации (Р) и время жизни возбужденного состояния (-с, не) d, 1-триптофана и белков.

нм f Р (320) Р (380) -с (320) т(380)

d, 1-триптофан в глицер. 343 0,34 0,33 0,29 4,2 5,4

d,1-триптофан в воде 347 0,20 0,01 0,00 3,1 3,2

глюкагон 345 0,07 - 0,04 3,0 3,1

субтилизин 345 0,04 - 0,04 3,4 4,2

пероксидаза - 0,03 0,36 0,23 2,6 4,1

альбумин 342 0,32 0,32 0,28 5,5 6,3

фосфоглицераткиназа 340 0,05 0,32 0,13 1,9 3,4

трипсин 328 0,09 0,30 0,22 3,5 4,4

алкогольдегидрогеназа 328 0,32 0,34 0,30 4,0 5,1

пепсин 342 0,38 0,22 0,21 6,4 7,2

лизоцим 332 0,07 0,30 0,20 1,6 2,4

химотрипсиноген 327 0,09 0,23 0,20 2,0 2,7

лактатдегидрогеназа 339 0,46 0,33 0,31 6,5 8,4

гиалуронидаза 340 - 0,30 0,16 3,9 4,7

-12-

гексокиназа - - 0,32 0,24 3, 1 4,2

амилаза 336 0, 28 0,33 0,27 4, 3 5,7

мембранная Са-АТФаза 328 0, ,30 0,34 0,25 4, 2 5,9

Примечание: Р измерена при возбуждении 300 нм, z. - при 295 нн. Белки растворены в водных буферах. Температура « 20*С.

Возрастание -с в длинноволновой области наблюдается практически для всех белков и для d,1-триптофана в глицерине. Ни в одном случае нет уменьшения. Для раствора триптофана в глицерине существует только одна причина возрастания t: релаксационная спектральная неоднородность. Этот эффект хорошо известен для вязких растворов красителей и проявляется когда -с соизмеримо с временем ориентационной и колебательной релаксации среды [Мазуренко, 1982; Meech S., 1982; Lakowicz J., 1984]: -С ~ -С (reí) .

В белке триптофан может находиться в "вязком" окружении; он является спектрально неоднородным из-за того, что за время порядка т: происходит релаксация его микроокружения. Это ведет к "красному" смещению наносекундных спектров излучения, что и проявляется как возрастание фазово-модуляционного "С. В случае водного окружения релаксация протекает за пикосекунды и поэтому в наносекундном диапазоне наблюдается постоянство -с (для d, 1триптофана в воде и для глюкагона, триптофанил которого обращен в воду). Подтверждением правильности такой точки зрения служат также опыты по релаксационной спектральной неоднородности флуоресцентных зондов, введенных в белок [33]. На рис.8 приведена флуоресценция антрацена, связанного альбумином. Видно возрастание -с и снижение Р в длинноволновой области.

Рис.8. Спектр излучения (1) , поляризация (2) и время жизни (3) антрацена на бычьем сывороточном альбумине. Концентрация антрацена - 4 мкМ, альбумина - 14 мкМ. Возбуждение -360 нм.'

А, лш

С помощью разрешенной во времени спектроскопии было показано [53], что указанная неоднородность триптофановой эмиссии не является непрерывной, а носит дискретны* характер: при переходе от "синей" области к "красной" изменяются только амплитуды коротко- и долгоживущих •С-компонент, но сами -с-компоненты остаются постоянными. На рис.9 приведено распределение по -с и его амплитудам для триптофана в глицерине при 330 нм, а на рис. 10 - при 385 км. Негативная компонента, наблюдаемая в "красной" области, обусловлена временем, необходимым для образования эксиплекса триптофан-глицерин.

Рис.9. Распределение времен жизни флуоресценции триптофана в глицерине при 330 нм. -с1 = 0,54 не, -е2 = 2,3 не, тЗ <= 5,4 не. Возбуждение - 280 нм.

L, „Лиши

0.01 0.1 1 10 exclted State litstfme (ns)

Рис.10. Распределение времен жизни флуоресценции триптофана в глицерине при 385 нм. х = 5,3 не, •c(neg.) - 0,3 не. Возбуждение - 280 нм.

0.01 0.1 1 к

excited State liíetime (ns)

Негативная компонента триптофановых эксиплексов найдена теперь и в белках [Sopkova J., 1994].

Большинство исследователей, использовавших триптофановую флуоресценцию в качестве метода индикации конформационной динамики белка, подразумевали наличие спонтанной, тепловой динамики. Это справедливо лишь тогда, когда триптофанилы погружены в водную фазу, т.е. когда-с (reí) « -с. В противном случае, для белков со спрятанными трипгофани-

-14-

лами, флуоресцентный анализ несет информацию также и о вынужденной динамике, вызванной фотовозбуждением. Вот почему теоретические оценки спонтанной вращательной подвижности триптофанилов дают очень низкие значения [Э. А .Бурштейн, ШЗ), а экспериментальные данные по деполяризации флуоресценции [Ichiye Т., 1983; Lakowicz J., 1986] - высокие.

В глицерине, этаноле и др. растворителях фотовозбуждение триптофана приводит к возникновению вынужденной ориентационной и колебательной подвижности сольватных молекул. Сходная ситуация имеет место в белках: триптофанил окружен несколькими группами, которые обретают подвижность после его фотовозбуждения. Энергия, индуцирующая такую подвижность, может быть найдена как: Q = Ы/ (ex) - hV (ега)

Для возбуждения при 290 нм и эмиссии при 340 нм Q = 60, 6 кДж/коль, что достаточно для разрыва 4-х водородных связей. В отсутствие флуоресценции Q - 410 кДж/моль, т.е. при низком квантовом выходе флуоресценции следует ожидать возникновения фотоконформационной релаксации, переводящей глобулу в новую устойчивую конформацию, что для темновых ферментов равнозначно инактивации. Это согласуется с тем фактом, что при УФ облучении белков происходит их денатурация, сопровождающаяся уширением и длинноволновым сдвигом спектра излучения [Оста-шевский И.Я., 1979], а также с тем, что фотоинактивация ферментов идет гораздо быстрее, чем фотолиз их триптофанилов [Рубенчик А.Я., 1976].

4. ЭКСИПЛЕКСНАЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ БИОПОЛИМЕРОВ. ЭКСИПЛЕКСЫ И ЭКХИНЕРЫ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ: ДРОБНЫЙ ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ.

Флуоресценция белков и нуклеиновых кислот носит преимущественно эксиплексиый характер [Longworth J., 1970; Hershberger M., 1976, 1981; Vigny P., 1976; Helene С., 1976]: фотовозбужденный хромофор образует с соседними группами или хромофорами неустойчивый электронно-возбужденный комплекс (эксиплекс), эмиссия которого уширена и смещена в "красную" область. Механизм трансформации энергии в эксиплексах индольного хромофора с полярными группами был не совсем ясен: "В эксиплексах индолов с полярными молекулами экситонное взаимодействие не может играть заметной роли; донорно-акцепторное взаимодействие индола с растворителем также не может быть существенным" [Капинус Е.И., 1988]. существуют проблемы в описании и других эксиплексов - ароматических углеводоро-

- if-

дов, бихромофоров и полимеров [37]. В [36,37] был сделан анализ имеющихся представлений и была предложена новая модель - "дробного переноса энергии".

Суть модели заключается в том, что тушхгелъ служит в качестве акцептора колебательных квантов, отдаваемых электронно-возбужденным донором, а эксиплексное излучение осуществляется из промежуточных (иНДУ" ЦИрОВАННЫХ) возбужденных состояний донора (рис.11) [44,45].

Рис.11. Схема дробного переноса энергии в эксиплексах и эксимерах. Д - донор, А - акцептор, - частота возбуждения, Ут - частота мономерного излучения, Уе - частота эксиплексного излучения.

и

А

а-

5

Величина красного сдвига выражается как разность частот мономерной и эксиплексной эмиссии:

¿V = У (т) - У (е) При образовании эксиплексов ряда ароматических углеводородов с диэтиланилином в гексане сдвиг составил в среднем около 3000 см-1: 2940 для пирена, 2760 для метилантрацена, 3290 для хризена и т.п. (рис.12) [36,44]. Сдвиг на ~ 3000 см-1 можно трактовать как результат акцептирования колебательных квантов диэтиланилином, имеющим при 3000

см-1 очень интенсивную ИК полосу (Е = 200 М-1 см-1) [36].

1.0

Рис.12. Спектры излучения антрацена (1) и его эксиплекса с диэтиланилином (2) в гексане при 20 С; эксиплексная полоса увеличена в 33 раза (3) . Возбуждение - 355 нм.

-16-

V.

Уширэние и бесструктурность эксиплексной (эксимерной) полосы обуславливается вознккновениен в доноре множества излучательных переходов из промежуточных-ИВДуцярОШННЫХ-состояний (рис.11). Предложенная модель согласуется с известным внутримолекулярным акцептированием колебательных квантов высокочастотными группами (С-Н и др.) в многоатомных молекулах [Tiang Ch., 1969; Медведев Э.С., 19вЗ]. Наша модель обсуждается в обзоре [Барашков H.H., 19ЭЗ].

Мономерная и эксиплексная компоненты излучения триптофана и его аналогов в полярных растворителях были разделены с помощью разрешенной во времени спзктроскопяи [53,55]. Роль колебательных мод акцептора была показана через частотный сдвиг индольной полосы излучения в дейте-

ь

рированном этаноле [44,45].

5. ИСКУССТВЕННЫЕ ЭКСИПЛЕКСЫ В БЕЛКАХ И МЕМБРАНАХ.

Тушение флуоресценции биополимеров субстратами, красителями или ароматическими углаводородами, имеющими перекрывающиеся полосы поглощения, обычно связывают с наличием резонансного переноса энергии. Однако оказывается [33,37], что зачастую конкурирующие с ?тин процессом другие каналы трансформации энергии могут быть преобладающими.

Для примера можно рассмотреть пару триптофанил-пирзн. Спектр поглощения пирена сильно перекрывается с триптофановой эмиссией; радиус Ферстера (Ro) = 2В Ä. При встраивании пирена в мембраны саркоплазмати-ческого рэтикулума была обнаружена его способность сильно тушить трип-тофановую флуоресценцию [1], что первоначально было интерпретировано с позиции ферстеровской теории. В пользу переноса энергии служило возгорание люминесценции пирена и появление э его спектре возбуждения полосы при 280 нм. Однако последующие исследования показали [8,9,33], что возгорание вызвано увеличением кэантового выхода люминесценции пирена при его сорбции на белнах и липидах, а полоса при 280 нм принадлежит димерам пирена, а такие реабсорбции и собственной флуоресценции белка. На ряс.13 и 14 показаны спектры возбуждения, а на рис.15 - кривые титрования пиренсм альбумина. Из двух триптофанилов альбумина только один, доступный для пирена, подвергается тушению. Второй остаток вообще не тушится.

Аналогичные данные били получены на саркоплазматическом ретикулу-ме и. митохондриях. В бломембранах тушение белковой флуоресценции иире-

- И-

кок возникает лишь при таких концентрациях,

белках [13,24,26,32].

Рис.13. Спектры возбуждения

бычьего сывороточного альбумина

(1), пирена на альбумине (2) и

пирена в липосомах (3) . '

Концентрация белка - 0,5 нг/нл,

пирена - 7,2 мкМ, лецитина - 0,2 1.1

мг/мл. Регистрация при 393 нм.

когда зонд связывается на

Рис.14. Спектры возбуждения мономеров и димеров пирена: 1 - в присутствии 0,1 мг/мл альбумина, регистрация при 393 нм, 2 - то же при 470 нм, 3-18 мкМ пирена без белка, при 470 нм.

Рис.15. Зависимость интенсивности флуоресценции альбумина (0,2 мг/мл) и пирена от концентрации последнего.

1 - белковая флуоресценция при 340 нм; возбуждение - 286 нм;

2 - мономеры пирена при 393 нм; возбуждение - 286 ни;

3 - димеры пирена при 470 ни; возбуждение - 286 нм;

4 - мономеры пирена при 393 нм; возбуждение - 334 ни.

Причиной отсутствия переноса энергии является вероятно то, что пирен имеет Колебательные МОДЫ И способен вступать в существенное дезаКТИШВДОННОе взаимодействие с возбужденным триптофанилом.

Поскольку при тушении (выход на плато, рис.15) триптофановое т уменьшалось (с 5,4 до 3,8 не для альбумина), а эффективность резонансного переноса энергии была нулевая, то было сделано заключение о дина-

-11-

мическом характере тушения [9]. Г, последующем удалось показать, что между индольным хромофором и пиреном может возникать эксиплекс [39,40] .

Образование эксиплвкса между возбужденным пиреном и метилиндоль-ным хромофором было продемонстрировано на бихромофорсодержащем олиго-пептиде [КлЪЪепз Р., 1985]. Аналогичные данные были получены нами при тушении пиреновой мономерной люминесценции добавляемым индолом в фос-фолипидных мембранах и саркоплазматическом ретикулуме [39,40] (табл.2; для сравнения приведены данные о паре пирен-диэтиланилин). Излучение мономеров пирена имеет максимум при 393 ни и никак не перекрывается с полосой поглощения индола при 280 нм или диэтиланилина при 300 ни, т.е. резонансный перенос энергии невозкожен.

Таблица 2. Эксиплексы пирен-индол и пирен-диэтиланилин в мембранах липосом и саркоплазматического ретикулума.

Мембраны Тушитель F/Fo F<е)/Fo F(e)/F -с, не Мах(е),нм

Липосомы

Липосомы

Липосомы

Сарк.рет.

Сарк.рет.

Сарк.рет.

ДЭА Индол

ДЭА Индол

100 45

25 100

26 49

0 13 24 О 31 10

152 79 40 155 40 81

450 460

456

Примечание: Fo - исходная интенсивность мономерной люминесценции пирена, F - то же после тушения; F(e) - интенсивность эксиплексной люминесценции; -с - время жизни мономеров пирена; Мах (е) - максимум эксиплексной полосы. Концентрации: 0,6 мг лецитина/мл, 0,27 мг белка/мл, ДЭА - 300 мкМ, индол - 500 мкМ, пирен - 0,4 мкМ.

Отсутствие заметного резонансного переноса энергии было найдено также [8,33] для другой пары, ранее использовавшейся в мембранологии как ферстеровская: антрацен - диметяламинохалкон (явлется сложным производным диметиланилина, который образует с антраценом флуоресцирующие эксиплексы [Капинус Е.И., 1988]). На основании измерения -с, спектров возбуждения , излучения и концентрационных зависимостей было

сделано заключение о том, что тушение антраценовой флуоресценции диме-тиламинохалконом вызвано образованием зкскппаксов.

-19-

6. ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ ЭЛЕКТРОННОГО ВОЗБУЖДЕНИЯ В БИОПОЛИМЕРАХ, МЕМБРАНАХ И МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ.

Рассмотрена эффективность горячей миграции энергии по ДНК со стоком возбуждения на флуоресцирующий краситель. С помощью интеркалирующего в фаговую ДНК этидиум бромида показапо, что при комнатных теипературах горячая перенос энергии на него происходит только с одного-двух соседних нуклеотидов. Расхождение полученных экспериментальных данных с литературными предсказаниями о возможности эффективной миграции энергии по нуклеотидам ПИК вызвано следующими причинами: 1) спадом миграции уже после одного-двух актов переноса из-за низкой вероятности каждого акта; 2) ухудшением миграции из-за нарушения красителем спиральнссти ДНК; 3) гипохромизмом красителя.

РИС .16. Спектры возбуждения этидиум бромида в этаноле (1) и на нативной (2) и денатурированной нагреванием (3) ДНК из фага"лямбда". Концентрация оснований ДНК ~ 18 мкМ, ЭЕ - 1,5 мкМ.

3(

Т7'

л1

/ ;

1) В биополимере донор (триптофанил, нуклестид, ковалентная нетш и др.) и акцептор (кофермент, субстрат, метка и др.! находятся в закрепленном положении на определенном расстоянии друг от друга. 2) в биополимере часто реализуется случай "один донор - один акцептор", т.о. можно работать без осложняющих множественных взаимодействий. 3) В биополимере близость донора и акцептора достигается за счет их концэнтри рования в определенных участках макромолекулы, поэтому нет необходимости в высоких концентрациях, приводящих к экранировке, реабсорбции др. 4) В жесткой макромолекуле можно исключить диффузионное столкчове ние удаленных донора и акцептора. 5) В макромолекулах с определенным количеством близлежащих одинаковых хромофоров можно наблюдать эффективную миграцию энергии. 6) Для многих водорастворимых белков и нукле иновьп: кислот имеются данные рентгеноструктурного анализа, поэтому можно работать "с открытыми глазами".

Рассмотрим для примера тушение триптофановой флуоресценции алко-гольдегидрогеназы из печени лошади при связывании НАДН.

Ранние исследования показали [ТЬеогеИ Н., 1971], что тушение флуоресцещии алкогольдегидрогенази при связывании НАДН сопровождаете

-го-

переносом энергии на НАДН. Одг»ко было не ясно, какова эффективность переноса с Тгр314 и с Тгр15, первый из которых находится близко к пиридиновому кольцу НАДН, а второй удален на 27 X. Кроме того, было обнаружено, что флуоресценция тушится и при добавлении НАД+ [Shore J., 1975; Suhadolnik R., 1977], который не имеет полосы поглощения при 340 нм и на который перенос электронного возбуждения невозможен. Ряд авторов высказал предположение о том, что НАД+ индуцирует в ферменте значительно конформационныв изменения, ведуыие к тушению. Такое предположение поставило вопрос о poj.i конформационных изменений в тушении при связывании НА.ГН. В сзязи с этим в [2,10,12] было проведено подробное исследование;.

Было установлено [10], что связывание НАДН приводит к тушению только одного из двух триптофановых остатков: Тгр314, который имеет максимум эмиссии при 371 нм (Ттр15, имеющий полосу при 335 нм, не тушится) . При сгяз^'ьании НАДН наб-пюдось снижение интенсивности флуоресценции и сдвиг спектра в длинноволновую сторону. После достижении предельного тушения форма спектра становилась сходной со спектром Тгр15, полученным при раглох.ончи исходного спектра на две компоненты методом "фагового подавления". Главлой причиной тугпения является перенос энергии на НАДН. Не рин.17 показан спектр возбуждения НАДН, связанного с ферментом в услтвл ¡х, когда достигается предельное тушение - 50% (при возбуждении 28 6 нм и регистрации 32<J нм) .

Рис.17. Спектр возбуждения НАДН в растворе и на легипрогеназе.

1- вклад самого белка;

2- НАДН на белке;

3- НАД-*- в растворе;

4- ПАДН в растворе. Белок - 0,14 мг/мл, НАДН -3 мкМ, НАД-* - 20 мкМ. Регистрация - 435 нм.

Почти сг;ноЕрбмеш:о с намл [10,12] аналогичные данные по раздгле-нкю триптосновой флусресменции алкоголь дегидроге-назы на два составляющие меюдом "фаг)озого подавления" и по тушению были получены в работе [\irand Ь., 1985].

-г;-

Сравнение со спектрами поглощения показало, что полоса при 286 нм обусловлена (за вычетом вкладов самого белка и НАДН) переносом энергии только с одного триптофанила. Теоретические Ио для пары Тгр314 - НАДН и пары Тгр15 - НАДН достаточно велики: 36 и 32 А. [12]. Отсутствие заметного переноса энергии с Тгр15 на НАДН, пиридиновое кольцо которого удалено лишь на 27 А, вступает в противоречие с ферстеровскай моделью, согласно которой следовало ожидать 74%-ной эффективности переноса для этой пары.

Вывод о том, что лишь Тгр314 подвергается тушению, был подтвержден и фазово-модуляционными измерениями с: при 320 нн -с снижалось с 4 не до 2,8 не, а при 360 нм - с 4,8 не всего до 4,5 не, что с учетом вкладов обоих триптофанилов говорит об отсутствии тушения Тгр15.

На основании сравнительного анализа изменений флуоресценции при связывании НАДН, НАД+, АДС, ФМН, ФЛД, рибофлавина, аденозина, этанола, уксусного альдегида, пирена и батофенантролина [2,10,12] нами был сделан вывод об отсутствии существенных конформационных изменений фермента при их сорбции. Этот вывод был подтвержден в работах [Ре^егзэ б., 1987; ЭЫатЫп! в., 1990] и состыковался с результатами рентгенострук-турного анализа [Се<1егдгеп-геррегаиег Е., 1985].

С чем же связано тушение при добавлении НАД+ ?

На рис.18 приведены спектральные изменения, наблюдающиеся при добавлении к раствору нвдиализованой алкогольдегидрогеназы избытка НАД+ и затеи - уксусного альдегида.

Рис.18. Флуоресценция фермента при добавлениии НАД+ и уксусного альдегида. 1- фермент исходно; 2 -добавлено 20 мкМ НАВ+; 3 - после НАД+ добавлено 500 мкМ альдегида. Белок

- 0,14 мг/мл. Возбуждение

- 286 нм.

Полоса в районе 435 нм, возникающая после добавления НАД+, ничем не отличается от аналогичной полосы, принадлежащей связанному НАДН, а ее спектр возбуждения идентичен спектру 2 на рис.17. Если фермент

-22

1 предварительно диализоват:., то НАД+ тушит флуоресценцию не более чем на 15%. Значит, при связывании НАД+ с ферментом происходит восстановление НАД+ до НАДН, который и тушит триптофановую флуоресценцию. Уксусный альдегид, окисляющий НАДН на ферменте до НАД+, устраняет тушение.

Полученные данные позволили установить причину тушения при связывании НАД+ и объяснить, почему у разных авторов [Shore J., 1975; Abdallah М., 1978; Suhadolnik R., 1977; Anderson D., 1982] получалась разная величина предельного тушения.

Рассмотрим вопрос об эффективности тирозин-триптофанового переноса энергии. Величина Ro для пары тирозин-триптофан составляет по разным оценкам [Lakowicz J., 1983] от 10 до 18 X. На заре изучения белковой флуоресценции тирозин-триптофановый перенос не был найден [Teale F., 1960]. Затем путем сравнения квантовых выходов излучения при возбуждении 280 и 295 нм было вычислено, что эффективность тирозин-триптофанового переноса в трипсине равна 100%, в пепсине - 80% и т.д. [Krorman М., 1971]. Спустя еще 10 лет было получено, что эффективность невелика, например в трипсине - 29% [Saito Y., 1981] и т.д. Мы попытались выяснить данный вопрос.

Были измерены спектры поглощения, возбуждения, излучения, времена жизни, поляризация и квантовые выходы флуоресценции ряда водорастворимых белков: трипсина, пепсина, альбумина, лизоцима и др. (см. табл.1) [33], фосфолипазы А2 и РНКазы Т1 [54]. Не было обнаружено заметного переноса ни в одном белке за исключением бычьего сывороточного альбумина, в котором эффективность была менее 30%. Например, бычья фосфоли-паза А2 содержит 7 тирозиновых остатков, удаленных от единственного триптофанила на 5-23 I. Спектр возбуждения фосфолипазы А2, записанный в области триптофановой эмиссии, не содержал тирозиновой компоненты и полностью совпадал со спектром возбуждения раствора N-ацетилтриптофа-намида [54].

Среди причин, которые могли привести некоторых авторов к ошибочным заключениям об эффективном переносе, следует выделить гипохронизн белков с большим количеством триптофанов и тирозинов [54] . Кроме того, дезактивация возбужденных тирозинов соседними нехромофорными группами доминирует в белках по сравнению с переносом энергии на триптофанилы. Отмечалось [Бурштейн Э.И., 1976, 1977], что во многих белках, не содержащих триптофанилов вообще, тирозины сильно затушены соседними

-23

группами.

Аналогичная конкуренция дезактивации по сравнению с переносом энергии электронного возбуждения наблюдалась лаки при тушении трипто-фановой флуоресценции апомиоглобина протопорфиринои IX [11,14].

При тушении триптофанавой флуоресценции Са-АТФазы мембран саркоп-лазматического ретикулума красителями: аурамином, пиронином, корифос-фином, трипановым красным, цианиноБЫми зондами, антраценом, пиреном [33,34] не было обнаружено переноса энергии; только при тушении зондом АНС наблюдался перенос. На рис.19 приведены спектры излучения Са-АТФа-зы саркоплазматического ретикулума до и после добавления АНС.

Рис.19. Спектры флуоресценции Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума до (1) и после (2) добавления />.НС. Концентрация мембран - 0,13 мг белка/мл, АНС - 10 мкМ. Возбуждение -286 нм. Спектры корректированы.

НО 330 360 330 >>¡3 «50 Ш

Сравнение площадей потушенной и сенсибилизированной флуоресценции (с учетов квантовых выходов Са-АТФазы = 0,3 и АНС = 0,5) показывает, что эффективность переноса энергии составляет около 20% в сравнении с эффективностью тушения. Преобладающая роль дезактивации вызвана вероятно двумя причинами: а) наличием в АНС групп и , имеющих интенсивные колебательные моды; б) изменением конформации Са-АТФазы прк связывании зонда.

В монографиях [33,37] был проведен критический анализ данных пс переносу энергии в биополимерах, мембранах и модельных система;:. Оказалось, что: 1) эффективный перенос энергии осуществляется обычно на коротких расстояниях, соизмеримых с размерами хромофсров, и не описывается ферстеровской моделью; 2) эффективность тушения обычно больше, чем эффективность переноса, что вызвано наличием конкурирующих каналов дэзактивации, переноса электронов, образования эксяплексов и др. 3) во многих работах не проводился (или проводился неточно] учет таких осложняющих факторов как гипохромизк, экранировка, микроэкракировка, ре-абсорбция, микрореабсорбция, спектральная неоднородность, которые уже

- гч-

были выше рассмотрены, а также - обьемная реабсорбция и фотопревраше-ния.

В [15] было показано, что в тонких слоях, на которых принято работать для устранения экранировки и реабсорбции, может возникать эффект объемной реабсорбции: в тонких слоях имеет место перепоглощение донорной люминесценции акцептором в направлении ширины и высоты светового возбуждающего пятна, а в тонких кюветах оно усиливается за счет полного внутреннего отражения на границах раздела. Это ведет к тривиальному возгоранию люминесценции акцептора, создающему иллюзию сенсибилизации. Было получено приближенное выражение:

F (а) / F(d) = R f (а) [2 - Т(Ь) - Т(с)]

где F(а) - интенсивность люминесценции акцептора, F (d) - интенсивность люминесценции донора, R - коэффициент учета эффекта полного внутреннего отражения, f(a) - квантовый выход люминесценции акцептора, Т(Ь) и Т(с) - среднее светопропускание акцептора в области перекрывания его полосы поглощения с донорным излучением в направлении ширины и высоты светового пятна, соответственно. Наличие объемной реабсорбции было показано [15,33] на примере ферстеровской пары трипафлавин - родамин Б.

7. ЭКСИМЕРЫ ПИРЕНА В МЕМБРАНАХ. МОНОМЕРЫ ПИРЕНА - ИНДИКАТОРЫ ПОЛЯРНОСТИ МЕМБРАНЫ И КОНЦЕНТРАЦИИ КИСЛОРОДА.

Поскольку в органических растворителях эксимеризация пирена сильно зависит от вязкости [Паркер С., 1972], то многие исследователи попытались использовать это для изучения вязкости и фазовых переходов липидного бислоя мембран [Galla Н., 1974, 1975, 1979, 1980; VanderKoo'i J., 1974; Добрецов Т.Е., 1980; Дергунов А.Д., 1981; Прокопьева В.Д., 1983; Литвинов И.С., 1982; и др.]. В растворителях эксимеризация происходит следующим образом:

1о

Руг---> Руг*---» F (т) + Руг

Ю Руг

Руг---> Руг*---*■ (Руг Руг)*---F(е) + Руг + Руг

где 1о - возбуждающий свет, F(то) - мономерная люминесценция, F(e) -эксимерная люминесценция. Большинство исследователей, измеряя F(ш) и

F(в), подразумевали, что именно вязкость обуславливает ту или иную степень эксимеризации F(e)/F(m). Однако оказалось [13,24,26], что схему необходимо дополнить мономерной, димерной и эксимерной люминесценцией пиреновых дилеров или кластеров:

Хо

(Руг Руг)---» (Руг Руг) *

Руг + Руг + F(m) + F(e) + F(d)

Наши данные по дилерам и кластерам пирена использованы в обзоре [Барашков H.H., 1993].

В работах [13,24,26] было проведено изучение процессов, влияющих на эксимеризацию пирена в мембранах. Было показано, что 1) пирон сильно флуоресцирует не только в мембранах, но и в водном растворе, причем его мономерная и дхмерная эмиссия похожи на мономерную и эксимерную эмиссию в мембранах; 2) пирен способен существовать в воде и мембранах в виде димеров и кластеров; 3) когда пирен не агрегирован, то эксиме-ров мало; 4) пирен способен сорбироваться на мембранных белках; 5) кислород, присутствующий в растворе, способен тушить пиреновую люминесценцию в мембранах очень сильно; 6) пирен совершает в мембранах не только латеральное, но и трансмембранное движение.

Для примера на рис.20 приведена люминесценция пирена в мембранах митохондрий при добавлении фенола, тушащего только мономёрную полосу.

Рис.20. Мономерная и эксимерная люминесценция пирена в митохондриях до (1) и после (2) добавления 100 мМ фенола. I, IX, III,IY,Y - вибронные пики. Митохондрии - 0,17 мг белка/мл. Возбуждение - 335 нм.

При сорбции на белках пирен тушит триптофановую флуоресценцию, в нативных и делипидированных митохондриях величина такого тушения различается незначительно (табл.3), хотя Р (в)/Я (т) отличаются почти в пять раз [26,33]. в мембранах саркоплазматического ретикулума пирен

-2 6-

при малых концентрациях расположен преимущественно в липидной фазе, а при увеличении концентрации, когда возникает тушение белковой флуорес ценции, пирен сорбируется на Са-АТФазе [32].

Таблица 3. Величина предельного тушения митохондриальной белковой флуоресценции пиреном и степень эксимеризации пирена.

Тушение (%) F(e)/F (m)

Нативные митохондрии 27 0,47

Делипидированные митохондрии 23 0,10

Примечание: для тушения: возбуждение - 286 нм, регистрация - 335 нм; для эксимеризации: возбуждение - 336 нм, регистрация - 470 и 393 нм. Митохондрии - 0,6 мг белка/мл, пирен - 2,4 мкМ.

Таким образом, были выяснены существенные ограничения использования пирена при изучении вязкости мембран. Независимо это было показано также в работе [Blackwell М., 1986].

При малых концентрациях, когда пирен в мембранах находится в мо-нонерной форме и при этом не дает эксимеров, можно использовать его люминесценцию для детектирования содержания кислорода [24,26]. Например, при окислении сукцината в дыхательной цепи митохондрий возникает потребление кислорода, сопровождающееся возрастанием х. (т) и F (га) (рис.21) .

Рис.21. Потребление кислорода (1) и возрастание мономерной люминесценции пирена (2) в митохондриях, в герметичной кювете. Пунктир - без сукцината. Сукцинат - 10 мМ, митохондрии -0,8 мг белка/мл-. Возбуждение -336 нм, регистрация - 393 нм.

Вибронныэ полосы мономерной эмиссии пирена чувствительны к полярности растворителя [Kalyanasundarairt К., 1977; Dong D., 1982] (см. виб-

-24- -

ронные пики на рис.20). В табл.4 приведены данные об интенсивности вибронных полос в различных системах [24,33, !Щ ]. Из них следует, что мономерная эмиссия пирена в мембранах осуществляется преимущественно из полярной фазы, а не из области углеводородных хвостов фосфолипидов, как считалось ранее. За время -с (т) мономер успевает подняться в полярные области, а оставшиеся мономеры эксимеризуются в глубине мембраны.

Таблица 4. интенсивность вибронных пиков мономерной эмиссии пирена в различных системах.

I II III IX I

Липосомы (Руг/Ьхр = 1/600) 1, 0 0,71 1, 04 1, 15 1, 23

Липосомы (Руг/ГДр = 1/100) 1, 0 0, 67 0, 92 0, 85 0, 98

Митохондрии (нативные) 1, 0 0, 68 0, 92 0, 83 0, 95

Митохондрии (делипидированные) 1, 0 0,69 0, 92 0, 83 0, 94

Бычий сывороточный альбумин 1, 0 0,73 0, 87 - 0, 98

Вода 1, 0 0,55 0, 56 - 0, 88

Этанол 1, 0 0,68 0, 87 - 1, 01

Гексан 1, 0 1,01 1, 49 1, 15 1, 18

Наши данные по вибронным полосам пирена были использованы в работах [Ь'Неиреих, 1989; Мегг1уак, 1991; КавЬиНп, 1990] для изучения биомембран.

8. ФОТОАКТИВАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ И КОМПОНЕНТОВ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИЙ: ФОТОДЫХАНИЕ И СВЕТОЗАВИСИМЫЙ СИНТЕЗ АТФ.

Интенсивное облучение светом биополимеров и мембран животного происхождения обычно приводит к повреждению структуры и утрате функций [33]. Однако в ряде случаэв наблюдается активация. Так, под действием света наблюдалось восстановление цитохромов митохондриальных мульти-ферментных комплексов, инкубируемых с флавинани и ЭДТА [Шппетапп Н., 1977], и т.д. (см. [33]).

На рис.22 показано потребление кислорода, возникающее при освещении суспензии печеночных митохондрий [5,33] . Такое фотопотребление кислорода прекращается сразу же после выключения света и угнетается

- И-

азидом. Добавление флавинмононуклеотида (ФМН) резко ускоряет процесс. Введение таких субстратов как сукцинат, глутамат, оксибутират не влияет на фотодыхание. Добавление НАДН или кетоглутарата приводит к резкой активации, фотопотребление кислорода возникало также в лецитиновых липосомах, инкубированных с ФМН, но оно не ингибировалось азидом. Фотодыхание печеночных митохондрий было подтверждено в работе [Конев С.В., 1992] в условиях цианидного блока.

Рис.22. Фотопотребление кислорода в митохондриях под лучом света СВД-120А

(а), то же в присутствии ФМН при облучении 436 нм

(б) и при освещении раствора ФМН линией 436 нм при (¿^ добавке субстратов (по 5 мМ). I - сукцинат, II -глутамат, III - оксибутират, IY - кетоглутарат, Y - азид.

При освещении митохондрий происходят два процесса:

hr

02

Lip

Fla---*■ Fla*---»- Fla*---»- Fla + 02*---«- Lip02

he Sub 02 Fla---•» Fla*---» Fla*---» Fla-H2 ---»■ Fla + H202

где Fla - флавопротеин или ФМН, Fla* - возбужденный синглет флавина, Fla14 - триплет. Lip - липиды или другие окисляемые субстраты, Lip02 -продукты окисления. Sub - субстрат типа НАДН или кетоглутарата, Г1а-Н2 - восстановленный флавин, Og* - синглетный кислород.

На рис.23 приведена кинетика окисления НАДН в растворе при освещении ФМН [4]. НАДН контролировался спектрофотометрически при 340 нм.

-¡9-

I I

Рис.23. Кинетика окисления НАДН при освещении ФМН в растворе. 1 - изненение рН;

2 - флуоресценция ФМН;

3 - потребление кислорода. Освещение линией 436 нм. Флуоресценция ФМН при 520 нн. ФМН - 27 мкМ, НАДН -230 мкМ, рН = 5,6 (2 км фосфатный буфер) .

I .

НАДН1™ I

Эти данные, а также изучение концентрационных зависимостей инги-бирования реакции фотоокисления различными тушителями (азид, никель) в аэробных и анаэробных условиях позволили найти константы скорости всех процессов в освещаемом растворе:

kl

Fla + hY---* Fla*

k6

02*---02

k2

Fla* ---♦ Fla

k7

02* + NADH + H+---H202 + NAD+

k3

Fla*---*■ Fla*

k8

02* + Fla---»• Fla02

k4

Fla"4---» Fla

k9

02* + NaN3---»-02 + NaN3

k5 klO Fla* + 02---»- Fla + 02* Fla" + NADH + H+---Fla-H2 + NAD+

Константа скорости окисления НАДН синглетным кислородом составила 1,910 М 1 с 1 [4,33], а триплетнык флавином - 1,5-10 М 1 с т.е. к7 » кЮ .

Квантовый выход (W) фотоокисления НАДН синглетным кислородом был определен аналогично тому, как это было сделано при изучении фотоокисления им порфиринов [Бытева И.М., 1975]:

w

k7[NADH] k5[02] j / (k4 + k5[02])(k6 + k7[NADH] + k8[Fla])

где j - эффективность интеркомбинационной конверсии Fla* в Fla*. W составил около 0,7 [4].

Вывод о наличии окисления НАДН синглетным кислородом, генерируемым триплетным флавином, был подтвержден в работах [Fritz B.J., 1985; Красновский A.A.(мл.), 1987], хотя и с меньшим выходом.

При поглощении света флавопротеинами митохондрий происходит еще один .процесс: внутренняя конверсия флавина. Это должно приводить к локальному "разогреву" мембраны и изменению скорости темнового синтеза АТФ [42,47]. Эта идея была высказана нами как развитие оригинальной модели механизма сопряжения, предложенной в работе [Straub К., 1974]. Действительно, в печеночных митохондриях нами было обнаружено светоза-висимое фосфорилирование [6,7], которое впоследствии было изучено более подробно [42,43,51]. одновременно с работой [7] появилось сообщение о синтезе АТФ при освещении митохондриальной АТФазы [Неделина О.С., 1983].

На рис.24 приведены данные об изменении концентрации АТФ в суспензии митохондрий под лучом синего света и в темноте. Спектр действия был сходен с полосой поглощения флавинов при 440 нм [43,51]. Возможность синтеза АТФ в митохондриях на красном свету была показана в работе [Passarella S. et al., 1984].

Рис.24. Изменения концентрации АТФ в митохондриях в темноте и на синем свету. 1 - добавлено 1000 мкМ АДФ; 2 - добавлено 700 мкМ АДФ; 3 - добавлено 200 мкМ АФД; 4 - в присутствии 3 мМ кетоглутарата, добавлено 200 мкМ АДФ; 5 - добавлено 1000 мкН АДФ, без освещения.

При небольших количествах добавленного АДФ эффект мал, но сильно активируется кетоглутаратом. Ротенон, антимицин, азид, олигомицин, ди-циклокарбоксидиимид - устраняли как темновое фосфорилирование, так и светозависимое. Свет частично обращал действие разобщителя (динитрофе-нола) аналогично тому, как это наблюдали Рэкер и Стокениус на "химе-

-31-

pax" из бактериородопсина, митохондриальной АТФазы и фосфолипидов [Racker Е., 1974].

Светозависимое фосфорилирование найдено и в митохондриях растений [Шахов A.A., 1994]. Оно играет особенно большую роль в развитии проростков, не имеющих хлорофилла.

9. ФОТОФИЗИКА НАДН-ДЕГИЛРОГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА (НА ПРИМЕРЕ АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ).

Фотоактивация темновых ферментов была рассмотрена в обзоре [Hug D., 1991], в монографии [33] и др. Механизмы фотоактивации различны. Например, колебательные кванты, образующиеся в ходе релаксации фотовозбужденных хромофоров фермента или кофермента могут вызывать десорбцию кофермента или субстрата [52].

С помощью измерения кинетики интенсивности флуоресценции НАДН на алкогольдегидрогеназе из печени лошади под Уф лучом обнаруживается "фотоответ" [52] . Он возникает при наличии комплекса НАДН-белок, но не в растворе НАДН или белка (табл.5).

Таблица 5. Флуоресцентный фотоответ НАДН под уф лучом.

мин. Свет NÄDH NADH-E NAD+-E-C2H50H NADH-Alb NADH-Li]

1 нет 0,71 0,93 0,80 0, 85 0,65

2 нет 0,71 0,93 0,80 0, 85 0,65

3 hY 0,69 0,82 0,63 0,79 0,62

4 hY 0,69 0,72 0,55 0,79 0,62

Примечание: Е - фермент (3 мкМ), А1Ъ - альбумин (3 мкМ), Lip -фосфолипидные липосомы (0,1 мг/мл), NAD+ (75 мкМ), NADH (26 мкМ), этанол (30 мМ), 12 мМ трис-HCl (рН » 7,5). Облучение через УФС-1.

Были измерены спектры поглощения, тушение флуоресценции при повышении температуры, рн-зависимости флуоресценции и флуоресцентного фотоответа и др. Полученные данные показывают, что активность "темновых" дегидрогеназ может регулироваться светом за счет десорбции продукта из активного центра фермента.

-за-

выводы.

1. Разработаны многоходовые кюветы, позволяющие многократно усилить интенсивность флуоресценции слабопоглощающих растворов. Кюветы могут быть использованы при детектировании спектров возбуждения, излучения и времени жизни возбужденного состояния.

2. а) Установлено, что важнейшей причиной длинноволновой деполяризации трилтофановой и зондовой флуоресценции в белках является возрастание вращения хромофора из-за увеличения его времени жизни, б) Длинноволновое увеличение времени жизни вызвано возрастанием амплитуд долгоживущих компонент затухания; при этом каждая из компонент, соответствующая определенному типу взаимодействия, является константой, в) Обнаружена субнаносекундная компонента негативной амплитуды, характеризующая время образования эксиплекса между триптофаном и ОН-группой. г) Одной из важнейших причин спектральной неоднородности триптофановой флуоресценции в полярных средах, олигопептидах и белках является вариация амплитуд затухания мономерных и фотоконформерных эксиплексных центров, д) На основании опытов с триптофаном, индолом и ароматическими углеводородами в полярных и неполярных растворителях предложена модель дробного переноса энергии в эксиплексах и эксимерах, заключающаяся в том, что тушитель выступает в качестве акцептора колебательных квантов, отдаваемых возбужденным донором, а возникающая бесструктурная полоса излучения принадлежит переходам из промежуточных, индуцированных акцептором, состояний донора.

-33-

3. а) Показаны ограничения использования эксимеризации пирена для измерения мембранной вязкости. Излучение мономеров пирена происходит преимущественно из полярной фазы мембраны; пирен совершает не только латеральное, но и трансмембранное движение, б) Мономерная люминесценция пирена может быть использована для оценки полярности мембраны и измерения содержания в ней кислорода.

4. а) Эффективный перенос энергии в макромолекулах и мембранах происходит обычно на малых расстояниях, соизмеримых с размерами хромофоров, и не описывается количественно ферстеровской моделью. Перекрывание спектров флуоресценции и поглощения не обязательно ведет к резонансному переносу. Величина такого переноса ниже величины тушения из-за конкурирующих процессов - дезактивации, образования эксиплексоэ, фотопереноса электрона. Это показано на потенциальных ферстеровских парах.тирозин-триптофан, триптофан-пирен, триптофан-АНС, антрацен-диметиламинохалкон, триптофан-НАДН, НАДН - флавин и других. Например, в алкогольдегидрогеназе имеет место перенос энергии на НАДН с ближнего триптофанила Тгр314, но нет переноса с Тгр15 удаленного на 27 А, что не укладывается в ферстеровскую модель, б) С помощью этцдиум бромцда, интеркалирующего в ДНК, продемонстрировано отсутствие миграции энергии вдоль цепи; перенос энергии на краситель происходит только с двух соседних нуклеотидов. в) В тонких оптических слоях имеет место эффект объемной реабсорбции, заключающийся в дополнительном возгорании люминесценции акцептора при перепоглощении донорного излучения в объеме светового пятна; это показано на классической ферстеровской паре трипафлавин - родамин.

5. а) Стопкообразное расположение хромофоров в макромолекулах и . молекулярных скоплениях на расстояниях меньших длины световой волны

- гч-

может приводить к возникновению гипохромизма, обусловленного взаимным электро-олтическим экранированием хромофоров. С помощью экранировочной модели удается описать гипохромизм в молекулярных агрегатах, олигонуклеотидах, ДНК, белках и других структурах, б) Скопление хромофоров в малом объеме мембранных и клеточных структур может приводить (за счет высокой оптической плотности в кажой отдельной частице) к микроэкранировке и микрореабсорбции света, вызывающим снижение интенсивности и искажение формы спектров возбуждения и излучения, б. а) Интенсивное УФ освещение стимулирует дегидрогеназу за счет активации колебательных мод белка или НАДН, что приводит к десорбции НАДН (продукта) из активного центра, б) Обнаружено митохондриальное фотодыхание. Изучено окисление НАДН, кетоглутарата и липидов синглетным кислородом, генерируемым при освещении флавинов. Обнаружено митохондриальное светозависимое фосфорилирование, чувствительное к ингибиторам. Предполагается, что свет вызывает наработку АТФ за счет облегчения его десорбции из активного центра фермента, разогреваемого в ходе внутренней конверсии в флаволротеинах и гем-белках.

Ъ5-

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ:

1. Добрецов Г.Е., Векшин Н.Л., Владимиров Ю.А. Различия пространственной организации белково-липидных комплексов мембран эндоплазмати-ческого ретикулуиа печени и саркоплазматического ретикулума // Доклады АН СССР.-1978,- Т.239, N 5.- С.1241-1244.

2. Векшин Н.Л. Флуоресцентное изучение конформационного поведения ал-когольдегидрогеназы // Тезисы докл. 4-й Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. Харьков.-1981.- С.26-27.

3. Векшин Н.Л., Литвинов И.С. Люминесцентное изучение пространственной организации белок-липидных комплексов китохондриальных мембран в различных функциональных состояниях// Молекулярная биология.-1981.- Т.15, N 5.- С.1188-1193.

4. Векшин Н.Л., Миронов Г.П. Окисление НАДН синглетным кислородом, генерируемым с участием триплетных состояний флавина // Биофизика. -1981.- Т.26, N 6.- С.953-959.

5. Векшин Н.Л., Миронов Г.П. Флавин-зависимое потребление кислорода в митохондриях при освещении // Биофизика.- 1982.- Т.27, N 3.-

С.537-539.

6. Векшин Н.Л., Миронов Г.П. Действие света на содержание АТФ в митохондриях печени крысы // Тезисы докл. Всес. биофизического съезда. Том 1. М.-1982,- с.263.

7. Векшин Н.Л. Фотоактивация переноса электронов и энергии в биохимических "темновых" системах // физико-химические основы функционирования клеток. Пущино: АН СССР.-1983.- С.82-86.

8. Векшин Н.Л. Применение безызлучательного переноса энергии электронного возбуждения для изучения пространственной организации белок-липидных комплексов биомембран. Препринт. Пущино: АН

СССР.-1983,- С.1-16.

9. Векшин Н.Л. Проверка ферстеровской концепции индуктивнэрезонансного переноса энергии для пары триптофанил-пирен // Молекулярная биология.- 1983,- Т.17, N 4.- С.827-832.

10.Vekshin N.L. Luminescence studies on the conformational behavior of horse-liver alcohol dehydrogenase // Eur. J. Biochem. - 1984,-V.143, N 1,- P.69-72.

И.Юмакова E.M., Постникова Г.Б., Векшин Н.Л. Изучение рНяндуцирован-ных конформационных изменений в миоглобине кашалота, апомиоглобине и его комплексе с протопорфирином IX методом люминесценции // Тезисы докл. 5-й Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. Харьков. -1984.- С.277-278.

12.Векшин Н.Л. Люминесцентное изучение конформационного поведения ал-когольдегидрогеназы из печени лошади при связывании субстратов // Молекулярная биология.-1985.- Т.19, N 3.- С.767-773.

13.Vekshin N.L. On the membrane viscosity measurements using pyrene excimer luminescence // Stud. Biophys.- 1985- V.106, N 2.- P.69-78.

14.Постникова Г.Б., Юмакова Е.М., Векшин Н.Л. рН-зависимые изменения трилтофановой и порфириновой флуоресценции в комплексе апомиоглоби-на с протопорфирином IX и в метмиоглобине // Биохимия. - 1986.-

Т.51, N 2. С.313-321.

15.Векшин Н.Л. О возрастании люминесценции акцептора при реабсорбции донорной люминесценции // Журнал прикладной спектроскопии.- 1986.-T.44, N 6, С.961-965.

16.Векшин Н.Л. Многоходовые люминесцентные кюветы // Приборы и лабораторное оборудование для научных исследований. Пущино: АН СССР.-1986.- С.34-37.

17.Векшин Н.Л. Многоходовое устройство для люминесцентного анализа. Авт.свид. N 1254357 // Бюллетень изобретений.- 1986,- N 32 (патент

-36-

РФ, 1993).

18.Векшин H.JI. Кювета для люминесцентных измерений. Авт.свид. N 1312452 // Бюллетень изобретений. -1987,- N 19 (патент РФ, 1993).

19.Векшин Н.Л. Экранировочный гипохромизм в стопках хромофоров // оптика и спектроскопия.- 1987.- Т.63, N 3,- С.517-519.

20.Векшин Н.Л. Кюветы многократного отражения для люминесцентного анализа // Приборы и техника эксперимента.- 1987.- N 1.- С.208-211.

21.Векшин Н.Л. Фотоконформационная релаксация белковой структуры по данным триптофановой флуоресценции // Биофизика.- 1987.- Т.32, N 4,- С.588г591.

22.Векшин Н.Л. Перенос энергии электронного возбуждения в растворах органических соединений, препринт. Пущино: АН СССР.- 1987.- с.1-38.

23.Vekshin N.L. On the changing of polarization degree across tryp-tophan fluorescence spectrum // Stud.Biophys.- 1987.- V.118, N 3.-P.173-182.

24.Векшин Н.Л. К вопросу об измерении вязкости модельных и биологических мембран по люминесценции пирена // Биологические науки.-

1987.- N 11.- С.59-66.

25.Векшин Н.Л. Межбелковые расстояния в биомембранах: геометрические модели // Биофизика.- 1988,- Т.33, N 2.- С.360-362.

26.Vekshin N.L. On the measuring biomembrane microviscosity using py-rene luminescence in aerobic conditions // J.Blochem. Biophys.Met-hods.- 1987,- V. 15.- P.97-104.

27.Векшин Н.Л. Микроэкранировка и кикрореабсорбция люминесценции в гетерогенных системах // Журнал прикладной спектроскопии.- 1988.-Т.49, N 1,- С.31-35.

28.Векшин Н.Л. Спектрофотометрическое определение количества белка в стандартных биологических суспензиях // Биологические науки.-

1988.- N 4,- С.107-111.

29.вэкшин Н.Л. Сопряжение АТФ-синтетазы с мембранными переносчиками электронов и энергии: тепловая модель. Препринт. Пущино: АН CCCP.-1988.- С.2-28.

30.векшин Н.Л. Модель вибронного сопряжения окисления и фосфорилиро-вания // Тезисы докл. 6-й Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. Харьков.- 1988.- С.67-69.

31.Векшин Н.Л. Поляризационный перенос возбуждения в макромолекулах II Тезисы докл. б-й Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. Харьков.- 1988.- С.66-67.

32.Векшин Н.Л. Локализация флуоресцентных зондов в биомембранах // Тезисы докл. Всесоюзной конференции по люминесцентному анализу в медицине и биологии и его аппаратурному обеспечению. Рига: РМИ,

1988.- С.67-68.

33.Векшин Н.Л. Фотоника биологических структур. Пущино: АН СССР, 1988.

34.Векшина О.М., Векшин Н.Л. Сравнение каталитических и структурных свойств Са-АТФаз продолговатых трубочек и терминальных цистерн саркоплазматического ретикулума // Молекулярная биология.- 1989.-Т.23, N 4,- С.1041-1050.

35.Vekshin N.L. Screening hypochromism of biological macromolecules and suspensions // J.Photochem.Photobiol., B: Biol.- 1989,- V.3, N 4,- P.625-630.

36.Векшин Н.Л. Дробный перенос энергии в эксимерах и эксиплексах. Препринт. Пущино: АН СССР.- 1989.- С.2-25.

37.векшин Н.Л. Перенос возбуждения в макромолекулах. Итоги науки и техники, сер. Радиационная химия и фотохимия.- Т.7, М.: ВИНИТИ. -

1989.

38.Vekshin N.L. Multipasa cuvettes for spectrofluorimetry // Analyt.

■if-

Chim. Acta.- 1989,- V.227.- P.291-295.

39.Vekshin N.L. Exciplexes of pyrene with indole and diethylaniline in liposomes and biomembranes // Analyt. Chim. Acta.- 1989.-V.227P.267-272.

40.Векшин H.JI. Эксиплексы пирена с индолом и диэтиланилином в липосо-мах и биомебранах. // Журнал прикладной спектроскопии.- 1990,-

Т.52/ N 3.- С.471-476.

41.Векшин Н.Л. Фотофизические процессы комплекса НАДН-алкогольдегид-рогеназа. Препринт. Пущино: АН СССР,- 1990.- С.1-13.

42.Vekshin N.L. Thermal hypothesis of coupling ATP synthesis to electron transfer in biological membranes // Comm. Mol. Cell. Bi-ophys.- 1990.- V.7, N 1.- P.17-25.

43.Векшин Н.Л. Светозависимое фосфорилирование в митохондриях // Молекулярная биология." 1991.- Т.25, N 1,- С.54-59.

44.векшин Н.Л. Трансформация возбуждения в эксимерах и эксиплексах ароматических углеводородов // Журнал прикладной спектроскопии.-1991.- Т.54, N 1.- С.26-31.

45.Vekshin N.L. Excitation conversion in excimers and exciplexes of aromatic hydrocarbons // Spectrochim. Acta.- 1991.- V.47 A, N 1.-P.155-158.

46.Векшин H.JI. Трансформация энергии фотовозбуждения в биополимерах и их комплексах // Тезисы докл. 7-й конференции по спектроскопии биополимеров. Харьков.- 1991.- С.38-39.

47.Векшин Н.Л. Тепловая модель сопряжения синтеза АТФ с переносом электронов // Биофизика.- 1991.- Т.36, N 6.- С.994-999.

48.Vekshin N.L. Micro-screening and micro-reabsorption of light in heterogeneous biological systems // 6-th Intern. Symposium on bioluminescence and chemiluminescence. Proc., Cambridge.-1991.

49.Vekshin N.L. Photophysical processes in NADH-alcohol dehydrogenase complex // 5-th Congress of the European Soc. for photobiology. Proc., Amsterdam.- 1991,- P.89.

50.Vekshin N.L. Photophysical processes in NADH-alcohol dehydrogenase // Spectroscopy of biological molecules (ed. by R.E.Hester). Royal Soc. of Chem., Cambridge.- 1991.- P.259-260.

51.Vekshin N.L. Light-dependent ATP synthesis in mitochondria // Bioc-hem. Intern. - 1991,- V.25, N 4.- P.603-611.

52.Vekshin N.L. Photophysical processes in NADH-alcohol dehydrogenase complex // J. Photochem. Photobiol., В.: Biol.- 1992,- V.12.-

P.295-303.

53.Vekshin N.L., Vincent M., Gallay J. Excited state lifetime distributions of tryptophan fluorescence in polar solutions: evidences for solvent exciplex formation // Chem. Phys. Lett.- 1992.- V.199.-P.459-464.

54.Vekshin N.L., Vincent M., Gallay J. Tyrosine hypochromism and absence of tyrosine-tryptophan energy transfer in phospholipase A2 and ribonuclease Tl.' // Chem. Phys.- 1993.- V.171.- P.231-236.

55.Gallay J., Vekshin N., Sopkova J., Vincent M. Evidences for picosecond excited state reactions of indole derivatives in alcoholic solvents, reverse micelles and proteins // Time-resolved laser spectroscopy in Biochemistry-4, SPIE OE/lase meeting, Los Angeles.-1994.

56.Векшин H.JI. Многоходовые кюветы для флуоресцентной спектроскопии // Оптическая техника.- 1994,- N 3.- С.18-20 (Vekshin N.L. Multiple-pass cells for fluorescence spectroscopy // Optical Engineering Bull.- 1994,- N 3.- P.18-20.)

-it-

57. Векшин Н.Л. Разделение тирозиновой и триптофановой компонент флуоресценции методом синхронного сканирования. // Биофизика, 1996, Т.41, N6,0.1176-1179.

58. Vekshin N.L. Energy Transfer in Macromolecules. Bellingham, USA, SPIE, 1997.

59. Vekshin N.L. Screening hypochromism in biopolymers and chromophore clasters./ Spectroscopy of Biological Molecules, Modern Trends (ed. by P.Carmona), Kluwer Acad. Publ., 1997, p.97-98.

60. Векшина O.M., Векшин Н.Л., Особенности взаимодействия Ca2*- АТФазы с липидной фазой в мембранах терминальных цитерн и продолговатых трубочек./ Второй съезд биохимического общества РАН, тезисы, ч.2, 1997, С.307-308.

61. Векшин Н.Л. Об эффективности резонансного переноса энергии при тушении белковой флуоресценции красителями. // Журнал прикладной спектроскопии, 1998, Т.65, N 2, С.290-293.

62. Векшин Н.Л. Размеры белков и стехиометрия в шапероновом комплексе SecB-RBPTI, оцениваемые по флуоресценции ANS. II Биохимия, 1998, Т.63, N 4, С.141-144.

63. Векшин Н.Л. Взаимное экранирование хромофоров в биоструктурах. / Второй съезд фотобиологов, Пущино, 1998, С.19-21.

64. Векшин Н.Л. Фотодыхание и светозависимый синтез АТФ в митохондриях. / Второй съезд фотобиологов, Пущино, 1998, С.22-24.

65. Векшин Н.Л. Резонансный перенос энергии с нуклеотиды в митохондриях. // Биохимия,

белков на пиридиновые 1998, т. 63, * 9,с.И7-120

- Ъ9-

Научное издание Автореферат Векшина Н.Л.

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции ОК-005-93; том 2; 953000 - книги и брошюры.

07.07.98 г. Зак. 8064Р. Тир. 100 экз. Усд.печ.л. 2,5. Отпечатано с оригинала-макета в Отделе научно-технической информации Путинского научного центра РАН. 142292 г. Пущино Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ ПНЦ РАН.