Небислойные структуры в мембранах при электропорации, трансфекции и слиянии клеток

Черномордик, Леонид Витальевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Небислойные структуры в мембранах при электропорации, трансфекции и слиянии клеток
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Небислойные структуры в мембранах при электропорации, трансфекции и слиянии клеток"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ & ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.Ломоносова

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

. ЧЕРНОМОРДИК Леонид Витальевич ""

НЕБИСЛОЙНЫЕ СТРУКТУРЫ В МЕМБРАНАХ ПРИ ЭЛЕКТРОПОРАВДИ, ТРАНСФЕКЦМИ И СЛИЯНИИ КЛЕТОК.

- 03.00.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва - 1991

Работа выполнена в отделе биоэлектрохимии Института электрохимии им. А.Н.Фрумкина, АН СССР.

Официальные оппоненты:

- академик АМН СССР, доктор биологических наук Ю.А.Владимиров

- доктор химических: наук, профессор И.А.Василенко

- доктор физико-математических наук, профессор В.А.Твердислов

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта, АН СССР.

/(Эыая 1991 г. в ¿Г.

Защита состоится / имая 1991 г. в /О • на заседании Специализированного Ученого Совета Д.053.05.53 при Московском государственном университете км. М.В.Ломоносова.

Адрес: 119899, Москва, Ленгоры, МГУ, Биологический факультет, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ".

Автореферат разослан апреля 1991 г

Ученый секретарь Специализированного Совета, ^Г4 доктор биологических наук, 1 -

Актуальность___проблемы. Универсальной основой всех биологически

мембран является бимолекулярный слой, сформированный молекулам лишдов. Непрерывность такого лишдного Оислоя имеет решающе значение для выполнения мембранами их основной функции эффективного отделения объема клеток от окружающей среды. В то к время существуют физиологически важные процессы, связанные временным и локальным нарушением непрерывной бислойной структур липидкого матрикса мембран. Такие локальные небислойные дефект реализуются, например, при слиянии мембран, при образовании мембранах пор при лизисе клеток и электрическом пробое, а так» при транслокации через мембраны макромолекул. Выяснен» функциональной роли небислойных структур предсгавляе значительный интерес как подход к изучению механизма эта процессов, каждый из которых весьма важен в биологии клетга Отметим, лишь, что, слияние мембран лежит в основе эндо-зкзоцитоза, реализуется при оплодотворении и во многих друп биологически значимых явлениях. Кроме того процессы связанные образованием небислойных структур, активно используются биотехнологии. Так, слияние клеточных мембран является важш стадией соматической гибридизации клеток, а транслокация чер< биомембраны таких макромолекул как ДНК лежит в основе вс< методов генетической трансформации клеток, т.е. введения клеточный геном новых генов. Именно эти подходы: гибридизация трансформация, составляют основные универсальные инструмен современной генноинженерной биотехнологии. В то же время сейч. процедуры, используемые для слияния и транслокации ДИК, нос чисто эмпирический характер, часто недостаточно универсальны эффективны. Во многом это связано с отсутствием разработаны представлений- о механизме этих процессов, реализующих посредством образования определенных небислойных структу

Целью__настоящего исследования было выяснить механи

возникновения,свойства и функциональную роль локальных и, к правило, корогкокивущкх небислойных структур, связанных деформацией изгиба монослоев мембраны в таких мембранв процессах как порообразование и слияние. При выполнении рабе были поставлены следующие задачи: изучение феноменологии механизма электропорашш и слияния модельных и клеточных мембра а также исследование связи между электропорацией

электротрансфекцией.

Научная_новизна. Создано новое научное направление - исследование функциональной роли небислойных структур в мембранах при слиянии, порообразовании и трансмембранном переносе макромолекул, основанное на рассмотрении локальных и' короткокивущих нарушений непрерывности лиидного мзтрикса биомембран как дефектов, обладающих избыточной: энергией упругого сопротивления липидных монослоев изгибу.

- Впервые с помощью экспериментального и теоретического исследования закономерностей электропорадш развиты и обоснованы общие представления о возникновении, эволюции и свойствах пор в липидных и клеточных мембранах.

- Впервые исследованы все стадии взаимодействия бислойных липидных мембран, не содержащих растворителя, и поэтому лучше моделирующих клеточные мембраны чем липидные мембраны с растворителем. Показано, что присутствие растворителя существенно искажает некоторые стадии взаимодействия и, в первую очередь, стадии плоско-параллельного контакта и монослойного слияния мембран. Только для мембран, не содержащих растворителя удается наблюдать Са2+ -стимулируемое слияние.

- Впервые установлено, что при слиянии липидных мембран последовательно реализуются два типа промежуточных небислойных » структур: на стадии монослойного слияния это перемычки - сталки,

а на стадии полного слияния - гидрофильные поры.

- Впервые обнаружено, что электрическая обработка липосом вызывает высокоэффективный захват 'липосомами ДНК и выяснен механизм этого явления.

Наутао-практическая__ценность полученных результатов состоит в разработке теоретического фундамента для биотехнологических и биомедицинских приложений слияния и электропорации клеточных мембран и транслокации через них ДНК. Сформулированные и обоснованные з работе представления о механизме этих явлений ■ использованы для отработки условий электротрансформации целого ряда линий клеток важных для биотехнологии с частотой, существенно- превышающей . достигаемую при использовании традиционных методов трансформации.

Развитая методология была успешно использована в Институте бгоорганической химии и Институте молекулярной биологии АН СССР, Всесоюзном Кардиологическом Научном Центре.

Работа выполнялась в .рамках. Постановления ГКНТ, Госплана .и АН СССР от 13.02. 81 по решению в IS8I - 1985 гг важнейшей научно-технической проблемы 0.74.05 "Разработать новые направления исследований' генетического аппарата, биополимеров и структур клетки, осуществляющих важнейшие проявления жизнедеятельности, и внедрить достижения молекулярной биологии и молекулярной генетики в народное хозяйство" и Постановления ЦК КПСС и Совета Министров СССР N 807 от 26 августа 1985 г. о дальнейшем развитии новых направлений биологии и биотехнологии. Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены в частности на следующих научных собраниях: I Советско-Швейцарском Симпозиуме "Биологические Мембраны. Структура и функции" (Тбилиси, 1979), I Советско-Американском Симпозиуме "Биологические Мембраны" (Киев,1978), Международный Симпозиум по сиоэлектрохимш и биоэнергетике (Ваймар, ГДР, 1979), Всесоюзная Школа Биологические Мембраны (Рига-1980, Пупщно-1991 ), Международный .Симпозиум "Дискуссии по биоэлектрохимии им. Гейровского ' (Либице, ЧССР, 1980), 3, 4 и 5 Международные Симпозиумы "Биофизика клеточной поверхности" (ГДР, Арендзе-1984, Херингсдорф-1986, Хюлингсдорф Росток-1988), 8 Международной Симпозиум "Поверхностные Силы" (Москва, 1986), Международное Совещание "Электрические поля в биотехнологии" ( Гюлечице, НРБ, 1987), Международный Симпозиум по биоэлектрохимии и биоэнергетике (Сегед, ВНР, 1987), Международное Совещание по роли мембранные кривизн ( Бетезда, США, 1989), Фрумкинский Международны! Симпозиум по био электрохимии (Суздаль, 1988), Международная Конференция "Трансмембранные электрические поля в биофизике' (Балтимор, США, 1990), Международная Конференция тк электропоршда и электрослияншо (Будсхол, США, 1990).

ПОРЫ В ЛИПЩЩОМ БИСЛОЕ Известно, что при кратковременном наложении на клеточну] мембрану достаточно сильного внешнего электрического поля мембране развиваются процессы, приводящие к очень значительном, увеличению проводимости и проницаемости. При выключении пол • мембрана из такого высокопроводящего состояния может вернуться исходное. Явление это получило название обратимого электрическог пробоя ( stampfii, 1958). Если же амплитуда или длительност импульса достаточно велики, то наступает необратимое поврекдени

мембраны. Электрический пробой клеточных мембран лежит в основе таких перспективных биотехнологических методов как электрослияние (Zimmermann, 1982 и Сухарев и др.,1990) и электротрансфекция (см ниже). Высказывалось также предположение, что электрический пробой мембран диффузионными потенциалами может играть существенную роль при некоторых патологических процессах, связанных с неспецифическим нарушением барьерной функции мембран (Пучкова и др.,1984).

"* Происходящее при электрическом пробое временное или необратимое нарушение одной из наиболее важных функций клеточных мембран - барьерной, исследовалось разными методами и на разных объектах. Установлено, что это явление имеет универсальный характер. Электрический пробой мембран микроорганизмов, водорослей, протопластов растений, эритроцитов, лимфоцитов, нервных и мышечных клеток, а также мембранных органелл характеризуется целым рядом общих закономерностей (Zimmermann, 1982). Поэтому естественно предположить, что в основе электрического пробоя лежат процессы, развивающиеся в липидном матриксе клеточных мембран - универсальной основе мембранных структур, определяющей изолирующие - "барьерные" свойства биомембран. Удобной экспериментальной моделью для изучения влияния сильного электрического поля на свойства бимолекулярного« слоя лйпидных молекул оказались плоские липидные мембраны, " формирующиеся на отверстии в тефлоновой перегородке ячейки при нанесении капли раствора липида в жидком углеводороде (например, декане) (Mueller et al., 1962). В этой системе были обнаружены и исследованы необратимое разрушение и обратимый электрический пробой бислоев. Можно считать установленным, что в основе этих явлений легат возникновение и развитие пор. Однако', до сих пор нет единой точки зрения на их структуру и механизм зарождения. Экспериментальные методы. Для изучения электропорации липидных мембран используются методы релаксации заряда (Benz et al., 1979) и фиксации напряжения (JI.В.Черноморда® и др. 1978). В первом случае исследуется кинетика понижения напряжения на мембране после наложения на нее кратковременного импульса (20 не - 10 мкс). Важно подчеркнуть, что собственно пробой происходит еще до начала регистрации разряда 'мембраны. Этот метод позволяет выяснить, как быстро можно вызвать состояние пробоя, но не дает возможности следить за эволюцией пор во времени.

Быстродействие метода фиксации потенциала не более 5-10 мкс. Однако он позволяет непрерывно контролировать ■ изменение проводимости мембран от 1СГ8 до 1СГ* Ом^см-2 и благодаря этому следить за накоплением пор и изменением их размера. Такт образом, методы релаксации заряда и фиксации напряжения прекраснс дополняют друг друга.

Разрушение ыеыбран в электрическом поле. При наложении не мембраны ступеньки напряжения, стадии быстрого нарастания тока, связанной с механическим разрушением мбмбраны предшествует латентная стадия, когда процессы, протекающие на мембране, сравнительно слабо сказываются на ее проводимости (или приводят t обратимым изменениям). Длительность латентной фазы, т.е. врем? жизни мембраны в поле является ' случайной величиной. Поэтому токовые осциллограммы разрушения в поле каздой мембраны носят индивидуальный характер (Абидор и др., 1979) и явление разрушенш приходится характеризовать стохастическими величинами, важнейша? из которых - среднее время жизни мембран, резко убывает npi увеличении напряжения (рисЛ).

Механизм разрушения был детально изучен в наших работа} 1978-1985 гг. Установлено, что в основе -этого явления лежи1; возникновение и развитие в мембране гидрофильных пор, т.е. пор, внутренняя поверхность которых выстлана полярными головкаш липидов. Влияние напряжения на времена жизни бислоев обусловле! тем, что вода, обладающая большей диэлектрической проницаемость! чем мембрана, втягивается в область сильного электрического поля; т.е. в пору (Абидор и др., 1979).

Для работы образования в бислое сквозной цилиндрической nopi радиусом г можно записать

£ 2

№ = 2тсг7 - шг2о - тсг2Ст ( g- -1 ) С )

Здесь ДР - свободная энергия, у,- линейное натяжение в поре, a i Cm - натяжение и удельная емкость мембран, ew и еш диэлектрические проницаемости воды и мембраны, и - напряжение н; мембране. Величина -у для малых пор зависит от г как через ynpyryi энергию изгиба, так и в результате действия гвдратационных си. ■ отталкивания. Отвлекаясь пока от этого обстоятельства и принима. 7 = const, зависимость энергии системы от радиуса поры моя® представить в виде кривой с максимумом (рис.2а). Критически

0,2

0,4 0,6 U.B

Рис. I. Влияние напряжения на средние времена жизни оислойных лмлидных мембран разных составов.Экспериментальные точки получены для мембран из'фосфатидилхо-лина (о ), фосфатидил-холина в присутствии лизофосфатидилхолина (0,4 мг/л) ( в ), фосфа-тидилэтаноламина ( л ). 10 М KCl. Теоретические кривые 1,2 и 3 получены с помощью выражения (2) при значениях ] и D: (I)

3,3 х га-%, D =

7 -5

2,5 х 10 ; (2) 7 = 8,6

х Ю~12Н, Б = 8 х Ю~8;

(3) 7 = 1,66 х 10~ПН, Б

3,1 х Ю~7. Вставка на рисунке: Типичная осциллограмма тока I при необратимом электрическом пробое ли-пидаого бислоя, вызван-* наложением ступеньки напряжения и.

F* —

VI m

тп шу

Г)Г% &VTIГ

Рис. 2. . Изменения энергии мембраны, Р, при возникновении в ней поры радиусом г. Кривая I: изменение энергии для гидрофильной поры, Б^,

описывается выражением ! I). Пунктирная линия показывает увеличение

для пор малых радиусов. Кривая. 2:изменение энергии ?0 для гидрофобной

поры. Показаны также структуры гидрофобной(б) и гидрофильной (в) пор.

радиус поры, соответствующий точке максимума, и зысота энергетического барьера убывают с ростом наложенного напряжения. Если в результате тепловых флуктуаций радиус какой-либо поры превысит критическое значение, такая пора стремится к самопроизвольному расширению, поскольку этот процесс сопровождается понижением свободной энергии системы. Таким образом, разрыв мембраны в электрическом поле связан с преодолением одной из пор энергетического барьера. Для среднего

времени жизни jt, можно записать

1 2 %f

= В ехр ---2 (2)

кТ {о + [0 ( --2 - 1 )] -Щ

где к - константа Больцмана, Г - температура в шкале Кельвина, е D -предэкспоненциальный множитель, зависящий от числа пор нг мембране и скорости их диффузии в пространстве радиусов.

На рис.1 приведены теоретические кривые lg t, (U), полученные с помощью выражения (2) для мембран некоторых составов. Для измеренных значений о и Ст мы определяли значения ч и D, обеспечивающие наименьшие отклонения теоретической кривой от экспериментальных точек ( L.Chernomordik et al., 1985). Видно, что при определенных значениях у и D теоретические кривые в целог, хорошо описывают зависимости от напряжения времен жизни бислое! разных составов. Следует отметить, что получаемые таким образог, значения 7 (0,3 : 1,7 Ю-** Н весьма близки к значению, приведенному в (Harbich and Helfrich, 1979) и оцененному п< радиусу пор, образующихся в гигантских лецитиновых липосомах npi наложении на них сильного электрического поля. Поскольку в -вносит вклад энергия изгиба кромки поры, естественно ожидать, чтс стабильность бислоев должна зависеть от спонтанной кривизн монослоев, составляющих мембрану (см ниже). Прямые эксперимент! показали, что присутствие в мембранах лизолецитина, которы! увеличивает спонтанную кривизну и способствует формировали гидрофильных пор действительно существенно уменьшает (L.Chernomordik et al.,1985).

Завершая этот раздел подчеркнем, что поскольку npi . необратимом пробое появление в мембране пор обнаруживается лиш: после достижения первой из них критического радиуса, начиная которого рост поры неизбежно приводит к разрушению мембраны

невыясненными оставались самая , ранаяя стадия формирования гидрофильных пор и их основные свойства. Для анализа этих важных вопросов удобной экспериментальной системой оказался обратимый электрический пробой 'липидных бислоев.

Обратимый электрический пробой: феноменология. Мы исследовали обратимый" пробой т.е. значительное (до 7 порядков) увеличение проводимости липидных мембран в сильном электрическом поле, не сопровождающееся их механическим разрушением на бислоях из окисленного холестерина, бислоях из азолектина, модифицированных

9 J.

ионами U0, ( Sukharev et al., 1982; Chernomordik et al., 1982) и на мембранах из смеси лецитина и холестерина в присутствии -злкалоида-голотурина А ( Sukharev et al.,1983). Несмотря на заметные количественные различия между этими экспериментальными системами во всех случаях выявлялись одни и те же качественные закономерности.

Представленная на рис.За серия осциллограмм тока, полученных при последовательном наложении на мембрану из окисленного холестерина импульсов напряжения разной амплитуды иллюстрирует некоторые из этих закономерностей. В начале 20 мкс импульса доминирующим является ток заряжения, который, однако, быстро спадает. Одновременно развивается ток проводимости и уже через 5 мкс этот ток становится основным. По этой причине на осциллограмме не регистрируется уровень фонового тока. В конце » импульса и = 0,7 В (кривая I) ток проводимости составляет ~ 5

с * т

10 А, что соответствует проводимости 10 - 10 Ом . Таким образом, проводимость, возрастает по сравнению с фоновой (Ю-9 -ID"10 Ом ) в Ю4 - 10^ раз. Если длительность импульса не слишком велика, такое повышение проводимости является обратимым и, в отличие от осциллограмм необратимого пробоя, имеющих случайный характер полностью воспроизводится при повторном наложении такого же импульса (кривая 2). При большой длительности импульсов или малой паузе между ними обратимое нарастание проводимости переходит в необратимое разрушение мембраны. Увеличение амплитуды импульса приводит к быстрому повышению скорости развития тока при обратимом пробое (кривые 3-5). Сильная зависимость времени развития обратимого пробоя от напряжения выявляется, и при использовании метода релаксации заряда (Benz and Zimmermann, 1980). Поскольку величина напряжения, вызывающего определенное увеличение проводимости, зависит от времени

ТОК, ^А

Рис. 3 а,б. Осциллограммы тока при обратимом росте проводимости мембраны из окисленного холестерина (а) и мембраны ¿-клетки (б) в ответ на прямоугольные шпульсы напряжения разных амплитуд, накладываемые последовательно через I мин.

(а) Длительность импульсов 20 цс; амплитуда: 0,68 (кривая 3); 0,72 (кривая 4) и 0,73 В (кривая 5). Импульс О,? В накладывали дважды (кривые I и 2).

(б) Длительность импульсов 10 мс, амплитуды: 0,2; 0,3; 0,4 и 0,5 В -кривые 1, 2, 3 и 4, соответственно.

оздействия поля на мембрану, понягяе потенциала обратимого робоя, также как понятие потенциала необратимого разрушения жадного бислоя оказывается не имеющим физического смысла. <5ратишй пробой - накопление пор. При исследовании механизма ■братимого электрического пробоя липидного бислоя прежде всего ¡озникает Еопрос о том, глобальные или локальные процессы лежат в юнове этого явления. Крупномасштабные деформации мембраны, сражающиеся в изменении толщины, площади или диэлектрической гроницаемости должны, очевидно, привести к изменению емкости в [роцессе нарастания тока. Однако, проведенные нами в работе ;chernomordik et al., 1982) прямые эксперименты показали, что ¡начительное ( более 3 порядков ) увеличение проводимости шпидного бислоя при электропорации не сопровождается заметным 1зменением емкости мембраны (точность измерения емкости - 2 %). Саким образом, рост проводимости мембран в электрическом поле определяется локальными, а не крупномасштабными изменениями структуры мембраны. Оценка по току даже при достижении сопротивления ~ Ю4 Ом дает для суммарной площади пор лишь величину ~ Ю-8 см2, что намного меньше площади всей мембраны

-Я ?

(10 см ). Воспроизводимость осциллограмм обратимого пробоя при последовательном наложении одинаковых импульсов (рис.За, кривые I и 2) и отсутствие видимых флуктуавдй при относительно больших • токах говорит о том, что в этой системе выполняется закон больших чисел - в мембране возникает множество пор.

Характерные времена развития и залечивания пор. Важная информация о свойствах пор, развивающихся при 'пробое была получена при изучении кинетики восстановления изолирующих свойств мембран в экспериментах с наложением на бкслой. многоступенчатых импульсов напряжения. На рис.4 приведены токовые ответы, полученные при наложении на ио|+- модифицированную мембрану двух одинаковых импульсов напряжения с определенной паузой между ними, в течение которой на бислое поддерживалось относительно низкое напряжение. Мы видим, что в момент понижения напряжения после первого импульса происходит очень быстрое (менее чем за 5 мкс ) уменьшение проводимости мембраны. В литературе высказывалось предположение., что этот эффект отражает быстрое исчезновение пор (Benz and Zimmermann, 1981; Zimmermann, 1982). Однако, наши эксперименты показали, что это не так (Chernomordik et al.,' 1987). В ответ на повторный импульс, совпадающий по' амплитуде с

0./1А

и.

0.5

1.-е

Рис. 4. Токовая осциллограмма , полученная при последовательном наложении на ио|+-модифицированную мембрану двух одинаковых импульсов (и = 0,75 В, г = 10 мс) при 4 мс паузе между ними, в течении которой на мембране поддерживается напряжение и = 0,5 В.

Рис. 5. Влияние напряжения и на проводимость

о ио|*-модифицированной

мембраны в состоянии обратимого пробоя.

(а) Профиль энергии узкой поры в мембране. * Внешнее электрическое поле понижает барьер и облегчает прохождение ионов через пору.

(б) Зависимости ^ в (и) полученные сразу после наложения на мембрану импульсов напряжения разной длительности:' 1,6 В, 0,1. мс (I); 1,6 В, 0,2 мс (2); 1,6 В, 0,5 мс (3).

(с) Схема экспериментов, использованных для

получения зависимостей с (и). Исследовалось изменение тока при изменение напряжения на мембране с одного и того же уровня при первой

ступени импульса до разных уровней и на второй ступени импульса.

1 1

первым, но наложенный через 4 мс наблюдается нарастание тока проводимости, причем в начале второго импульса ток такой же как в конце первого (рис.4). Таким образом, в этом эксперименте длительность паузы с относительно низким напряжением оказалась недостаточно велика, чтобы обеспечить существенное уменьшение числа и радиуса пор, развившихся в мембране за время первого импульса. При постепенном увеличении продолжительности паузы между импульсами мы определяли через какое время ток в начале второго импульса оказывался таким же, как в начале первого. Определенные таким образом времена залечивания мембран после обратимого пробоя варьировали в диапазоне 1-100 с в зависимости от характера электрической обработки.

Поскольку резкое понижение проводимости, G, после окончания импульса происходит при сохранении числа и среднего радиуса пор, естественно предположить, что в основе этого эффекта лежит нелинейная зависимость G от напряжения. В ее основе, вероятно, лежит электростатическое выталкивание иона из узкой поры. Ионы, проходящие через узкую пору должны преодолевать определенный энергетический барьер, который подрезается- напряжением, наложенным на мембрану (Chernomordik et al., 1987).

Для простоты ' предположим, что проводимость мембраны обусловлена порами, имеющими одинаковые размеры и форму,, а» энергетический профиль иона в поре w(x) имеет форму трапеции (рис.5а). Тогда при напряжении и>>25 мВ и среднем радиусе пор г, много меньшем толщины мембраны h, имеем

InG = ln ^ - 1п{[1 + ]exp(W - при)'- пРи } (3)

4 W0-n(3U 0 W0-n(3î7

Здесь N - число пор, к - удельная электропроводность электролита, Р= e/kT , е - заряд протона, к - постоянная Больцмана, Т -абсолютная температура, n = a/h - безразмерная протяженность входного участка поры (см.рис.5), которая определяется в основном геометрией кромки и слабо зависит от г, WQ - энергия иона в центре поры, однозначно связанная с г. Сопоставляя экспериментальные зависимости lg G (U) с формулой (3) можно оценить значения г и п, т.е. получить информацию о динамике изменения размера и количества пор в мембране во время обратимого

пробоя и после него. Из рис.5 в видно, что теоретические кривые хорошо ложатся на экспериментальные точки, полученные с помощью экспериментов, в которых исследовали зависимость проводимости бислоя в состоянии обратимого пробоя от напряжения (рис.5 с).

Рассмотренная модель была использована нами для изучения некоторых закономерностей изменения среднего радиуса и числа пор в ходе обратимого пробоя и после него (Chernomordik et al., 1987; Glaser et al., 1989). Прежде всего количественная обработка экспериментальных зависимостей igG (U), полученных сразу после наложения на бислой импульсов напряжения одинаковой амплитуда, но разкоай длительности позволила установить что увеличение длительности воздействия импульса напряжения приводит к линейному по времени возрастанию количества пор. Одновременно с этим растет их средний радиус, причем скорости обоих процессов зависят от напряжения на мембране. Аналогичные эксперименты показали также, что одинаковый по величине уровень проводимости бислоя, достигнутый при разных электрических обработках, соответствует разным по численности и размерам популяциям пор. Этот важный вывод подтверждается и результатами, полученными'в экспериментах по влиянию молекул-блокаторов (сахарозы и гемоглобина) на проводимость липидного бислоя на разных стадиях обратимого пробоя (Chemomordik et al., 1983). »

Анализ экспериментальных зависимостей igG (U), полученных через разное время после наложения на " мембрану одинаковых импульсов напряжения, порождающих в бислое определенную популяцию пор показал, что уменьшение проводимости с характерным временем от миллисекунд до десятков миллисекунд обусловлено изменением размера пор. Лишь на временах более 10 с начинает уменьшаться количество пор. Таким образом, характерное время изменения размера пор (I - 10 мс) оказывается существенно меньше характерного времени уменьшения числа пор, которое и определяет времена залечивания мембран.

Структура пор и механизм их формирования. Поры в липидном бислое в принципе могут быть гидрофобными или гидрофильными (Abidor et al., 1979). В первом случае стенки пор образованы углеводородными хвостами лидидов (рис.2 в), во-втором внутренняя поверхность пор выстлана полярными головками (рис.2 с). Оценки показывают, что гидрофобные пары, заполненные водой, энергетически невыгодны -(Chernomordik et al., 1983) и поэтому

должны быть короткоживушими. Поскольку дефекты, образующиеся в мембране при обратимом пробое оказались весьма долгоживущими (времена их жизни составляют 10 -.100 с), можно предположить, что это гидрофильные поры. В пользу такого . предположения свидетельствует и обнаруженное • нами увеличение скорости накопления пор при обратимом пробое после модификации мембраны лизолецитином. Этот эффект естественно связать с понижением линейного натяжения гидрофильных пор в присутствии лизолецитина . (Chernomordik et al., 1985) и следовательно, с облегчением образования таких пор. Таким образом, наблюдаемые в широком диапазоне длительностей " и амплитуд электрической обработки явления обратимого и необратимого электрического пробоя липидных мембран имеют в своей основе эволюцию гидрофильных пор.

В наших работах мы экспериментально и теоретически обосновали следующие представления о процессе рождения гидрофильных пор при электрическом пробое (Chernomordik and Chizmadzhev, 1989). В результате латеральных тепловых колебаний липидных молекул в бислое могут возникать гидрофобные поры. Энергия такой поры'Р0 зависит от ее радиуса как показано на рис.2 ' а. Гидрофобное взаимодействие, приводящее к понижению поверхностного натяжения на границе гидрофобной поверхности с водой

о ,

существенно уменьшает энергию в случае малых г (г < 10 А) и тем самым повышает вероятность рождения подобных пор. Напротив, для гидрофильных пор з том же интервале радиусов нарастание упругой энергии кромки и ее гидратационного расталкивания должно привести к увеличению энергии- пор Pi с уменьшением радиуса (рис.2 а).

Из сопоставления зависимостей от радиуса энергий гидрофильной и гидрофобнойпор видно, что при малых радиусах в бислое более выгодно существование гидрофобных пор (рис.2 а). Если же радиус возникшей поры превысит критическое значение г*, при котором F0(r*) = F^r*), становится выгодной трансформация гидрофобной поры в гидрофильную. Дальнейшая эволюция гидрофильной поры зависит от энергетического профиля

Рассмотрим случай, когда, во-первых, энергетический барьер образования разрушающей бислой надкритической гидрофильной поры достаточно' велик. Во-вторых, значение г = г , соответствующее локальному минимуму Р^(г), превышает г*. В этом случае в мембране возможно образование метастабильных гидрофильных пор в области г

~ г . Предположим, что накопление таких пор под действием электрического поля и■ является причиной 'обратимого пробоя лшшдных бислоев. Рассмотрим кинетику этого процесса, предполагая, что уменьшение энергии в электрическом поле обусловлено втягиванием воды в область сильного поля, т.е. в пору.

В работе Glaser et а-1., 1988 ;для скорости спонтанного образования ыетастабильных пор Кр мы получили следующее выражение:

vS AW (U = 0) xrl (е -s )е U2 in к (U) = In -----2--------+---ш- —— (4)

v d о kT 2hkT

где v - характерная частота, по порядку величины равная частоте

латеральных тепловых колебаний лишдных молекул в бислое; а0 -

площадь, приходящаяся на одну молекулу, s - площадь бислоя. Это

выражение было ■ использовано для экспериментальной проверки

развитых представлений.

На мембрану накладывали трехступенчатые импульсы напряжения,

состоящие из двух измерительных участков с и = ит и одного

тестирующего с и = ut (рис.6 а). По изменению тока Al(Ut) между

- концами первого и началом второго измерительного участков изучали

зависимость Кр от амплитуды ut при постоянном ит. Импульсы

напряжения подбирали таким образом, чтобы на тестирующем участке

наблюдался линейный, рост тока через мембрану. В .этом случае

скорость рождения пор много больше скорости их гибели, -и

последним процессом можно пренебречь. Мы предполагали, что ДКи^.)

= AM(ut) г umg(um). где AM(ut) - число гидрофильных пор,

образованных в бислое в течение тестирующего участка, а g(U ) -

средняя проводимость этих пор при и = ит.' Поскольку Кр(и^) =

AN(Ut)/At, для сопоставления экспериментальных данных с

теоретическими предсказаниями формулу (4) приводили к виду AI о

In [м) = А + BU^ (5)

где

и gm )vs aw (и = о)

А = In ( ---ш---) - ---Е------------------(6)

ао Ш

В =-----(7)

2hM) 2 На рис. 6в показана зависимость in (Al/At) от ut. Из рисунка

А -2

и.у и -

0.9-

1 а! Д. -4

-8

•12

-16

тп-1-1-г

I г-

■ 3,

■з.

----А

----ит

г а1

г.о щ,в

Рис. 6. Кинетика возникновения пор при обратимом пробое ио^"1"-модифицированной - мембраны.

(а) Схема использованных экспериментов. Осциллограмма токового ответа (верхняя часть рисунка) и форма импульсов напряжения (внизу) при

и = 0,9 В и и, = I,-} В. т с

(б) Зависимость 1п (дг/дю от при ит = 0,9 в.

Рис. 7. Элекгростимули-руемый захват нативной ДНК фага Т7 (кривая I) и фруктозы (кривая 2) большими однослойными липосомами. Прямоугольный импульс электрического поля длительностью -0,3 мс накладывали на* суспензию липосом в я?

присутствии [ СР] ДНК или [14С] фруктозы.

ЗАХВАТ ДНК. % ЗАХВАТ ФРУКТОЗЫ. %

- 10

10 кВ / см

<Г

6 видно, что при 0,65 < И*. < 1,5 В значение- 1п (Д1/ДЮ линейно

возрастает с увеличением И^. в соответствии с формулами (4) и

(5). Отметим, что по значению коэффициента В можно оценить г*.

такая оценка дает ~ 3 А, а значение коэффициента А определяет высоту энергетического барьера ровдения гидрофильных пор, по которой, пользуясь *известной зависимостью Р (г), также можно

оценить ту же величину. Такие оценки дает для г^ очень близкое

значение " 4 А. Подчеркнем, что коэффициенты А и В независимы и отражают совершенно различные стороны процесса образования пор. Поэтому совпадение результатов проведенных оценок свидетельствует в пользу предлагаемой модели рождения пор. Предложенный механизм в" равной мере применим и к необратимому пробою. Мембраны, неспособные к обратимому повышению проводимости характеризуются, видимо, таким соотношением энергетических ветвей Р0 и , что промежуточный минимум г = гт л®50 расположен высоко, либо вообще отсутствует. Вероятно способность мембран к обратимому или необратимому типу пробоя определяется, в первую очередь, спонтанной кривизной монослоев, составляющих мембрану (см ниже). ЭЛЕКТР0П0РАЦШ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ' Клеточную мембрану можно упрощенно рассматривать . как лшшдный бислой, в котором ■ "плавают" молекулы белков, тем илиа иным способом взаимодействующих, друг с другом и с липидами. Именно низкая проницаемость лшидного бислоя мембраны для гидрофильных частиц лежит в основе барьерной функции мембран. Качественное совпадение основных закономерностей, .характерных для резкого повышения в электрическом поле проводимости и проницаемости мембран самых разнообразных клеток и "органелл свидетельствует, что решающую роль в явлении электрического пробоя мембран играет липидный бислой - универсальная основа мембранных структур. Сравнение рассмотренных выше результатов, полученных при изучении электрического пробоя бислойных липидных мембран, с результатами, полученными при использовании тех же методов (фиксации напряжения и релаксации заряда) на клеточных мембранах, подтверждают это предположение.

Основные закономерности, описывающие поведение клеточных и модельных мембран в сильном электрическом поле поразительно похожи. Отметим, прежде всего, обнаруженное нами сходство осциллограмм тока пробоя при фиксации напряжения на клеточных

мембранах и на плоских бислоях (Chernomordik et ab,-1987). В обоих случаях необратимому повреждению мембраны предшествует -стадия обратимого -падения сопротивления. Время жизни в электрическом поле- tx липидных бислоев - и клеточных мембран является случайной величиной, и зависимости среднего времени жизни от приложенного .напряжения в обоих случаях убывают ■с близким наклоном: при увеличении напряжения на 0,1 В; t^ уменьшается приблизительно на порядок. На обратимой стадии пробоя также, наблюдаются общие закономерности. Клеточные мембраны и липидные, бислои" обладают качественно одинаковыми зависимостями тока обратимого • пробоя от времени и от амплитуды приложенного напряжения/ Осциллограммы тока 'обратимого пробоя, полученные на -мембранах Ь - клеток и эритроцитов 'чрезвычайно похожи _ на осциллограммы обратимого пробоя бислойных липидных мембран (рис. 36). Близкие -зависимости напряжения обратимого пробоя от длительности" заряжающего импульса, измеренные '■ на - мембранах водоросли Valonia и на плоских липидных мембранах приведены в работе (Zimmermann and Benz, 1980). Установлено, что'при данной длительности импульса потенциал -пробоя клеточных и липидных мембран сходным' образом зависит от концентрации - и ■ состава электролита, а-также от температуры. Как и в случае бислойных липидных мембран, повышение интенсивности и длительности» электрической обработки приводит к одновременному увеличению и числа, и среднего радиуса пор-, развивающихся в клеточных мембранах при, обратимом пробое '("Chernomordik et'al.,- 1987). Понижение напряжения на _клеточных и модельных мембранах, находящихся в состоянии обратимого пробоя, приводит к очень 'быстрому (за микросекунды) падению проводимости. Время залечивания пор в липидных бислоях также оказалось весьма близко к характерному для биомембран (секунды-минуты).

Близость феноменологии электрического пробоя клеточных и лгашдных 'мембран подтверждает предположение о том, что поры, развивающиеся, при электрическом пробое клеточных мембран, возникают в их липидном матриксе. Таким образом, рассмотренные выше представления о механизме пробоя-бислойных. липидных мембран могут быть применимы и для описания электропорации биомембран.

Очевидно', однако, что структура любой биологической мембраны гораздо сложнее структуры "чистого" липидного бислоя. Поэтому эволюция и даже образование электропор в липидном матриксе

клеточной мембраны могут существенно отличаться от таковых в модельном липидном бислое. Так, в определенных 'условиях увеличение проницаемости клеточных мембран при пробое приводит к вторичным процессам типа коллоидно-осмотического лизиса (Zimmermann, 1982). Отсутствие у замкнутых везикулярных мембран клеток и органелл мениска также может • привести к определенному изменению характера пробоя, особенно на поздних стадиях (Пастушенко и Чизмаджев', 1983). Наконец, только на клеточных мембранах в некоторых случаях нам удалось наблюдать интересный эффект "привыкания" мембран (или клеток в целом) к действию сильного электрического поля: при наложении серии одинаковых импульсов напряжения с достаточно большими паузами между ниш .достигаемое к концу импульса значение проводимости уменьшается с каждым последующим импульсом. .

Наиболее яркой особенностью электропррзции биомембран можно, вероятно, считать крайне медленное (часы) залечивание части пор, образующихся при электрической обработке очень - большой длительности и /или интенсивности. Такие поры' напоминают кезалечиваквдеся поры в мембранах гемолизированных эритроцитов (ЫеЪег and Steck, 1982). Можно предположить, что такие долгоживущие дефекты возникают, если в кромке поры (нескольких из множества малых'пор, развивающихся при коротком .импульсе очень высокой амплитуды,' или в - немногих очень больших порах, характерных для импульсов поля большой длительности), оказываются молекулы белков, понижающие линейное натяжение пор, 7. Понижение электромеханической стабильности плоских липидных мембран, отражающее уменьшение 7' было отмечено нами ранее (Чизмаджев и др., 1982).

При рассмотрении влияния электрической обработки на свойства клеточных мембран необходимо принимать во внимание и.относительно крупно-масштабные изменения структуры мембран, связанные со свойствами белкового цитоскелета и , в"первую очередь мембранного -кортекса животных клеток. В работе Gass and Chernomordik, 1990 было показано, что электропорация клеточных мембран сопровождается появлением на мембранах различных видов животных клеток блебов - своеобразных крупно-масштабных (0.2 -I рл) деформаций. Блебы развивались на поверхности живых клеток преимущественно в участках мембран, подвергаемых самым большим ■ напряжениям. Формирование блебов происходило в ходе

.осмотически-контролируемого процесса, подавляемого увеличением тоничности или' вязкости внешнего раствора. Поскольку блебы на клеточных мембранах рассматриваются в литературе как зоны мембран, обедненные по белку, их появление после электрической обработки клеток мы интерпретируем как проявление локальных нарушений структуры мембранного кортекса при электропорации.

Возможно разрыв белковой сети мембранного скелета связан с локальным изменением ионной силы, рН и концентрации баг+ в цитоплазме около поры. Процесс локального разрыва и ■ перераспределения мембранного скелета эритроцитов . был теоретически проанализирован нами в работе Kozlov et al.-, 1990. Согласно проведённому анализу разрыв лишь одной связи в спектрин-актиновой сети,прилегающей к цитоплазматической стороне мембраны, может привезти к перераспределению структуры скелета на значительной площади. Благодаря взаимодействию белковой Сети с интегральными белками мембраны это приведет к появлению зон мембраны, обедненных-по-белку. Возможные размеры и последующая эволюция таких зон определяются формой - клетки, электрическими взаимодействиям мембранных белков и упругостью мембранного скелета.

ГОРЫ И ЭЛЕКТРОТРАНСФЖЦМЯ.

В 1982 г. Neumann et al впервые показали, что 'обработка ' клеток короткими импульсами сильного электрического, поля может приводить не только к электропорации, но и к электротрансфекции т.е. к введению в клетки чужеродного генетического материала. Это явление широко используется в настоящее время в качестве мощного и универсального подхода в биотехнологии. Мы исследовали феноменологию и механизм электротрансфекции" животных, клеток разных" линий (регистрировалась ' кратковременная экспрессия маркерных генов или генетическая трансформация клеток) и клеток Е. coli в совместных работах с Н.Е.Броуде (ИБХ АН СССР), A.M.Ибрагимовым (ВКНЦ АМН СССР) и С.М.Серовым и В.П.Прасоловым (ИМБ АН СССР).

На первый взгляд представляется очевидной роль•электропор в электротрансфекции как путей диффузионного проникновения молекул ДНК в . клетки- Против такого предположения, однако, свидетельствует целый ряд экспериментальных данных. Начнем с того, что электротрансфекция была успешно _ использована для введения в клетки огромных молекул ДНК [150 Кб в работе Knutson

and Yee, 1987], оценка размеров которых в 'традиционной модели энтропийного клубка дает более I |im. В то -же время типичные размеры электропор,' определенные с помощью ' различных экспериментальных подходов, не превышают -10 нм.

Какие жевторичные процессы могут принимать участие в '"транслокации ДНК-через клеточную мембрану при электротрансфекции?

В принципе ДНК может вноситься в клетки с потоком воды при - коллоидно-осмотическом набухании клеток после электропорации. Кроме того набухание клеток может создавать натяжение мембран, вызывающее рост пор и, в результате, облегчение транслокации ДНК. Для проверки возможной роли осмотических эффектов в нашей работе • Кленчин и '"др., 1991 исследовалась- эффективность электротрансфекции ,( здесь - кратковременной экспрессии в Cos 1 клетках гена галактозидазы плазмиды рСН НО) при электрообработке клеток в гиперосмотической среде, содержащей 20 мМ инулина. Благодаря своему относительно большому размеру это осмотически активное вещество не проникает через мембрану с электропорами и, в результате, предотвращает коллоидно - осмотическое набухание клеток (Zimmermann et all,1976). Обнаруженное нами отсутствие-каких-либо изменений в эффективности электротрансфекции при введении в среду инулина позволяет исключить непосредственное участие осмотических процессов.в рассматриваемом явлении. *

В специальных экспериментах мы исследовали кинетику транслокации ДНК при электротрансфекции. Было установлено, что уже через 2-3 секунды после наложения импульса электрического поля ДНК оказывается внутри клетки. Обработка суспензии клеток и ДНК ДНКазой уже через 3 с после импульса не понижало ■ эффективности электротрансфекции. - Отметим также двадцатикратное падение эффективности электротрансфекции при введении ДЩ через 5 с после импульса, а не за 5 с до него как в контроле. Эти результаты позволяют предположить, что транслокация .ДНК происходит непосредственно- во "время " импульса. При изучений электротрансфекции клеток, распластанных на целлофане-проводящем адгезивном субстрате (эта экспериментальная система была развита в работах С.И.Сухарева), была доказана существенная роль электрофореза в явлении электротрансфекции. При создании пространственной асимметрии во взаимодействии ДНК 'с клетками в отношении полярности накладываемого импульса поля был обнаружено, что эффективность трансфекции. 'на порядок возрастала при

полярности импульса, обеспечивающей электрофоретическое движение ДНК з сторону клеток.

Этот результат • указывает, что электрофорез играет в электротрансфекции существенную роль , которая вероятно не может быть сведена лишь к направлению молекул ДНК к электропорам с соответствующим увеличением локальной концентрации ДНК около пор. Индуцируемое электрофорезом непосредственное взаимодействие молекулы ДНК и кромки поры может привести к тому, что радиус поры увеличится до необходимого для обеспечения прохода макромолекулы. Такое взаимодействие может также вызвать локальную инвагинацию мембраны и, в результате, экдоцитозоподобный захват ДНК клеткой. В пользу последней возможности свидетельствуют, в - частности, результаты, полученные наш совместно с А.В.Соколовым и В.Г.Будкером (ШБХ СО АН СССР) при изучении электроиндуцируемого захвата ДНК липосомами.

В этих -исследованиях для изучения механизма электротрансфекции в качестве простой модельной системы были использованы большие (средний дяаметер ~ 0.5 цгп) однослойные везикулы из яичного фосфагидилхолина или из смеси дипальмитоилфосфапшшхолина и холестерина. Мы обнаружили, что наложение на суспензию таких везикул в присутствии нативной или обработанной ультразвуком ДНК фага Т7 или, в некоторых » экспериментах плазмиды, рви _ 322 одиночных импульсов электрического поля напряженностью 12.5 кВ/см и длительностью 0.1 - I мс приводит к необратимому связыванию существенной части ДНК с везикулами (рис. 7). Отметим, что. оценка напряжения на мембранах липосом при таких напряженностях внешнего поля дает значения близкие к -характерным для электротрансфекции клеток. . Локализация связанной ДНК с помощью флуоресцентной краски -этидиум бромида, специфически связывающейся с ДНК и практически не проникающей через липосомальную мембрану, показала, что захваченная ДНК хотя и находится внутри липосом, но пространственно отделена от внутреннего их объема дополнительной мембраной. Эти результаты указывают, что как и в случае захвата ДНК липосомами индуцируемого двухвалентными ионами (это явление было обнаружено и исследовано в лаборатории В.Г.Будкера) электросттужруемый захват ДНК осуществляется не как непосредственная транслокация макромолекул через электропоры,- а при образовании эндосомоподобных везикул.

СЛИЯНИЕ МЕМБРАН

Слияние клеток или мембранных везикул т.е. объединение клеточных мембран и ограниченных ими объемов, является универсальным мембранным явлением играющим важную роль в целом ряде физиологических процессов. Слияние мембран это важная стадия в биогенезе мышечных волокон, и оплодотворении . На субклеточном уровне слияние'является ключевым событием в процессах зндо- и экзоцитоза . Следует упомянуть также слияние клеток in vitro при соматической гибридизации . клеток с использованием полиэтиленгликоля, вируса Сендай .и других фьюзогенов, а - также роль слияния'в проникновении в клетку оболочечных вирусов .

Очевидно, ' что для слияния клеточных мембран необходимо объединение их лшидных матриксов. Более того, слиянию, согласно некоторым литературным данным, предшествует вытеснение белковых молекул из области контакта мембран и образование в этой области чисто лшидных доменов. Это обстоятельство свидетельствует в пользу существенной роли лшидных матриксов в структурных перестройках биологических"мембран, приводящих к слиянию. Поэтому для изучения механизма слияния мы. использовали как- модельную систему взаимодействие и слияние двух контактирующих - бислойных липидных мембран. Эта простая и наглядная" экспериментальная система'- (Либерман ,и Ненашев, 1968; Баджинян и_др., .1972; Berestovsky and Gyulkhandanyan,'1976; Chernomordik et al., 1987) позволяет' исследовать" одиночные акты взаимодействия мембран и механизмы структурных перестроек - в ходе промежуточных стадий их слияния. Важно, что легко интерпретируемые электрические измерения, используемые здесь для контроля за' системой меньше ''возмущают" мембраны,чем .разнобразные " зонды и маркеры. Остановимся вкратце на методических особенностях экспериментальной системы двух липидных бислоев и проиллюстрируем основные стадии слияния на примере этой модели.

На рис. 8а показано устройство нашей измерительной ячейки (Melikyan et al, 1983).. Отделения ячейки заполняются растворами электролитов. Мембраны формируются на отверстиях I и 2. Тефлоновые стержни (3,4) позволяют, контролируя уровни растворов в 1 и Iii отделениях, выдавливать мембраны друг навстречу другу. Визуальный контроль за взаимодействующими бислоями в двух направлениях: перпендикулярном и параллельном плоскости контакта мембран осуществляется с помощью микроскопов через три стеклянных

Г А/

Рис. 8. Конструкция измерительной ячейки и установки (а), а также принцип емкостного контроля при исследовании взаимодействия липидных бислоев (б,в,г). а) I,II,III - отделения ячейки; 1,2 -отверстия в тефлоновых стенках; 3,4 - • тефлоновые стержни, используемые для создания градиентов гидростатического давления при приведении мембран в контакт, с - генератор линейной развертки напряжения, СА^ и Са2 - усилители тока, соединенные с

хлор-серебряными электродами в отделениях ячейки. б,в,д - цикл взаимодействия бислоев (в верхней части этих рисунков приведены характерные осциллограммы токов на выходе СА2). б - мембраны в

контакте, в-- образование в зоне контакта одиночного бислоя, г -мембранная трубка.

окошка (рис. 8а). Достаточно простая установка, состоящая из двух усилителей тока, генератора и осциллографа (рис. 8а), позволяет легко контролировать проводимость, емкость, . заряд, электромеханическую стабильность -каждой из мембран и области их контакта (ОаегпотогсШЕ е-Ь а1., 1987).

Бислойныё липидные мембраны полученные по - общепринятой методике . Мюллера-Рудина, как правило, содержат растворитель (декан, гептан и т.д.), присутствие которого существенно сказывается на свойствах мембран. Для того, чтобы выяснить как растворитель влияет на взаимодействие мембран,- мы использовали бислои лишенные растворителя. В литературе такие" мембраны получали обычно сведением липидных- монослоев.• Однако для рассматриваемой системы этот метод оказался крайне неудобным. Относительно малая площадь мембран очень затрудняла визуальный контроль, а также измерение' площади бислоев и области их контакта. Кроме того, эти мембраны практически лишены мениска, выполняющего роль резервуара липидов при увеличении площади бислоев выдавливанием их навстречу друг другу. Мы разработали ■ методику получения мембран лишенных растворителя из. скваленовых , растворов фосфолипидов (СЬетотог<Цк: et а1., 1984), основанную на вытеснение сквалена, практически нерастворимого в' бислое (№А-Ье, 1,978), в мениск -при растекании мембраны. ^Методика позволяет формировать,стабильные мембраны-относительно большой площади Г 1,5 мм2), увеличиваемой'при выдавливании еще в 1,5 - 2 раза . Это обстоятельство делает скваленовые бислои очень удобными для изучения взаимодействия липидных мембран без растворителя.

На рис. 8 б-г показаны последовательные стадии слияния двух липидных бислоев. В результате монослойного слияния контактирующих мембран в области контакта образуется бислой, .-который мы будем называть контактным бислоем (рис. 8в). Полному слиянию мембран, предполагающему объединение как бислоев, так и ограниченных ими водных объемов в данной модельной . системе соответствует образование мембранной трубки (рис. 8г). Е определенных условиях, например, при повышении гидростатического давления снаружи мембранной трубки, она скачкообразно делится не два бислоя. Таким образом, система возвращается в исходное состояние (рис. 86). . ■

Метод емкостного контроля ШеЬег, 1974) -позволяет четко различать основные стадии взаимодействия двух мембран. В верхнег

части рис. 8 б,в,г показаны характерные для последовательных стадий слияния осциллограммы токов, регистрируемых на выходе операционного токового усилителя CAg. .Так, монослойному слиянию бислоев соответствует качественное изменение осциллограммы -возникает знакопеременный прямоугольный емкостный сигнал, а полному слиянию соответствует появление большого тока проводимости через раствор электролита в мембранной трубке. Монослойное слияние липвдных бислоев. После сближения бислоев созданием соответствующих градиентов гидростатического Давления спонтанно начинается следующая стадия взаимодействия мембран - их мокослойное слияние, т.е. образование одиночного контактного бислоя в области контакта двух мембран (рис. 8 в). Возникновение такой триламинарной структуры в ходе взаимодействия бислоев, содержащих или несодержащих растворитель,было доказано с помощью ряда независимых экспериментальных, подходов (Chernomordik et al.,1987). Наиболее прямым доказательством образования в зоне контакта мембран одиночного бислоя является, на 'наш взгляд, совпадение значений удельной емкости области контакта с удельной емкостью обычной мембраны того же состава, обнаруженное наш для бислоев, лишенных растворителя (Melikyan et al, 1983).

Структура, образованная в результате монослойного слияния двух мембран (рис. 8в), в обычных условиях достаточно устойчива,» причем наличие растворителя в мембранах не является обязательным условием для ее стабилизации (Schindler and Feher, 1976, Chernomordik et al, 1985).'

Отметим, что с помощью менее прямых и, следовательно, менее надежных подходов монослойное слияние в ряде случаев выявляли и в процессе слияния биологических- мембран (Pinto da Silva and Nogueira, 1977, 1979, Belitser et al., 1982, Luci and Ahkong, 1986). Реализация монослойного слияния в области контакта бислоев отмечалась также при взаимодействии липосом с плоским бислоем (Babunashvili et al, 1991). а также при взаимодействия однослойных и многослойных липосом (Bondeson and Sundler, 1985, Bentz et al, 1985, Duzgunes et al, 1985, Markin et al, 1984).

Таким образом, стадия монослойного слияния, выявленная и детально изученная при взаимодействии плоских липидных бислоев, не является особенностью этой экспериментальной системы. Можно предположить, что во всех случаях, как и при взаимодействии плоских , бислоев, локальное образование контактного бислоя

является обязательным промежуточным этапом слияния мембран (Gingell and Ginsberg, 1978, Luci and-'Ahkong, 1986). Механизц монослойного слияния бислоев. При - изучении

взаимодействия не содержащих растворителя плоских бислоев можно достаточно точно зафиксировать время ожидания . монослойного слияния "t т.е.- промежуток времени с момента образования плотного ■ плоскопараллельного контакта до инициации контактного бислоя (Chernomordik et al., 1985). При одной и 'той же площади контакта время ожидания монослойного слияния существенно зависит от липидного состава мембран. Чтобы понять причину подобного различия, рассмотрим монослой, составленный из липидных модекул одного вида. В ненапряженном состоянии он будет обладать .кривизной, которую называют спонтанной кривизной молекул этого вида £ . Этот параметр отражает соотношение средних эффективных размеров полярной- головки и гидрофобной части липидных молекул в плане. Очевидно, что спонтанная кривизна определяется не только "формой" липидных молекул, но и взаимодействием между ними в монослое. Характерным примером липида -с положительной спонтанной' кривизной (рис.Э A ill) 'является лизолецитин. Отрицательная кривизна (рис.Э А I) характерна для кардиолипина в- присутствии ионов Са2+ или для ненасыщенного фосфатидилэтаноламина - липидов, формирующих инвертированную гексагональную фазу. Спонтанная» кривизна монослоя, построенного из; смеси липидных молекул различных видов, определяется' спонтанной кривизной и долей соответствующих липидов. Спонтанная , кривизна монослоев, составляющих мембрану, определяет характерные структурные перестройки. При положительной спонтанной кривизне монослоев (например, присутствует лизолецитин) энергетически выгодно образование гидрофильной поры (рис.Э в ill). Напротив, при " отрицательной спонтанной кривизне липидов (например, для монослоев, составленных из ненасыщенного фосфатидилэтаноламина) характерно возникновение в мембране локальных вспучиваний (рис.Э В I).

В работе (Chernomordik et al, 1985) мы развили и экспериментально подтвердили сталкерный механизм монослойного ■слияния, предложенный Козловым и Маркиным в 1983 г.. Согласно гипотезе этих авторов на ■контактирующих монослоях возникают дефекты-вспучивания, представляющие собой локальные разрывы монослоев. Замыкаясь друг на друга, эти вспучивания образуют

—

AI В 1

(LPC) (xlO иг/ил)

IM =

А II В II

О?

А III

В ш

[IPC] (ilO иг/мл)

Рис. 9. Спонтанная кривизна монослоев и структурные перестройки в мембранах. Липидные монослои, имеющие отрицательную (А I), нейтральную (А II) и положительную (A III) спонтанные кривизны, и соответствующие им вероятные структурные дефекты в липидном бислое: локальное вспучивание - зародыш сталка (В I) и гидрофильная -пора (В III). В правой части рисунка показано влияние концентрации лизофэсфатидалхолина (лизолецитина) в омывающем мембраны растворе на время ожидания монослойного слияния, tmI (С) и линейное натяжение кроглки гидрофильной поры 7

(D). Экспериментальные точки получены для бислоев из фосфатидилэтаноламина в сквалене; I0-iM KCl. Теоретические прямые получены-с помощью выражений (8) и (9).

1.0

сталк, а увеличение диаметра- последнего приводит к возникновению контактного бислоя. Именно образование стажа рассматривается при этом как лимитирующая стадия слияния. Монослои, образующие стаж, сильно изогнуты и обладают, следовательно, заметной энергией - изгиба. Эта энергия тем меньше, чем более асимметрична липидная молекула (чем меньше ее полярная головка по сравнению с шириной 'углеводородного хвоста), т.е. чем- ниже спонтанная кривизна ■ монослоев (рис.9 А I). Поэтому энергия стажа и, соответственно, время ожидания монослойного " слияния определяется спонтанной • кривизной монослоев, составляющих мембрану.

Экспериментальное результаты, полученные' нами при' исследовании.монослойного-слияния липидных бислоев, .качественно согласуются с рассмотренной моделью. Если расположить липидные составы в порядке возрастания среднего времени ожидания монослойного слияния, то получим ■ следующий ряд:' кардиолипин. + , са2+, фосфатидилэтаноламин, азолектин + холестерин, азолектин, азолектин + .. лизолецитин. Поскольку лизолецитин имеет положительную, кардиолипин. + ' Са2+, фосфатидилэтаноламин и холестерин - отрицательную спонтанные кривизны, а азолектин - как сложная смесь липидов, должен характеризоваться промежуточным значением рассматриваемого "параметра, -рост спонтанной кривизны монослоев, составляющих мембраны, в качественном согласии с * -предсказаниями сталкерной гипотезы, , отражается в увеличении времени ожидания монослойного слияния.

Для количественной .проверки гипотезы о стажах удобно иметь двухкомпонентную мембрану, составляющие которой обладают разной 'спонтанной кривизной, а их относительная концентрация поддается . непрерывному изменению. В работе Chernomordik et al (1985) в качестве такой системы мы выбрали" не содержащие растворителя мембраны из фосфатидилэтаноламина, в которые включался лизолецитин из. омывающего раствора.

Для логарифма времени ожидания стажа в такой мембране в этой работе получено выражение:

lg(tmi) = const + 6.15 ш ( es1 - £s2 )6АС0 (8)

где cQ - концентрация липидных молекул со спонтанной кривизной £ . в омывающем мембрану растворе; А - коэффициент распределения

этого липида между мембраной и раствором (ACQ - доля молекул данного тша в монослое); - спонтанная кривизна молекул, составляющих исходный монослой; 5 толщина монослоя; В -коэффициент упругости изгиба монослоя. Таким образом, зависимость log t f(CQ) должна иметь линейный характер, причем среднее время ожидания должно возрастать при увеличении cQ. В работе (Chernomordik et al., 1985) был найден способ экспериментального определения значения комбинации параметров, присутствующей в выражении (I) как множитель при cQ. Дело в том, что спонтанная кривизна мембранного монослоя должна влиять не только на образование сталка, но также и на другую перестройку липидного бислоя: образование гидрофильной поры (рис. 9 в III). Монослой на кромке поры изогнут и обладает упругой энергией, причем знак кривизны гидрофильной поры противоположен знаку кривизны поверхности сталка. Для мембраны, состоящей из лшшдов двух видов, зависимость энергии кромки поры, отнесенной к единице ее длины, т.е. линейного натяжения поры от объемной концентрации первого компонента представляется в виде:

1СВ 2тсв

■ 7 = 5-- 2*Bgs2 - -д- ( 5s1 - Ss2 ) 5АС0 .(9)

Из выражения (9) видно, что энергия кроши поры, подобно энергии * монослойного сталка линейно уменьшается с ростом CQ. На рис. 9 d приведены значения 7, определенные с помощью экспериментального изучения электромеханической стабильности мембран (см выше) при разных концентрациях лизолецитина в растворе электролита (Chernomordik et al, 1985). Зависимость 7 от CQ имеет в соответствии с выражением (9) линейный зарактер. На рис. 9 с приведены экспериментальные точки, отражающие зависимость lg t f от CQ. Линейный характер такой зависимости соответствует выражению (8). На этом же рисунке сплошной кривой показана теоретическая зависимость lg t f (со'> получающаяся, если в выражение (8) вместо комбинации параметров В( £g1 - ?s2)Sa подставить ее значение, определенное из наклона зависимости 7(С0). Видно, что экспериментальные точки хорошо ложатся на полученную таким, образом теоретическую зависимость lg t f(CQ). Важно подчеркнуть, что при проведенном сопоставлении теории и эксперимента не было использовано ни одного свободного параметра.

Следовательно, тот факт; что все экспериментальные точки ложатся на одну прямую, причем наклон этой прямой совпадает с полученным теоретически, можно считать серьезным подтверждением сталкерного механизма монослойного слияния.

Необходимо отметить, что подобные сталкам образования обнаружены на мулъшламеллярных лжгосомах определенного состава (Borovjagin et ai, 1982). Возникновение сталков между соседними бислоями таких липосом приводит к формированию локальных участков контактного бислоя. Интересно, что подобные структуры наблюдаются на лжгосомах, содержащих лшшды, которые, согласно развиваемым представлениям, способствуют образованию сталков.

Полное слияние липидных бислоев

Структура, образованная в результате монослойного слияния мембран (рис.8 в), достаточно стабильна, и спонтанный переход монослойного слияния в полное - событие'довольно редкое. Поэтому для образования мембранной трубки в системе двух плоских бислоев необходимы специальные условия (Melikyan et al, 1983 а,Ъ). Важно подчеркнуть, что при любом способе реализации полного слияния плоских бислоев, возникновение контактного бислоя обязательно предшествует образованию мембранной трубки.

Практически в 10055 случаев наблюдается образование мембранной трубки, т.е. слияние мембран при наложении на * триламинарную структуру, возникшую после монослойного слияния, достаточно сильного электрического поля (Melikyan et al, 1983а; Fisher and Parker, 1984). В отличие от прочих способов реализации полного слияния, электрослияние плоских бислоев наблюдается для всех исследованных липидных составов, независимо от присутствия растворителя в плоских мембранах.

Система двух контактирующих липидных бислоев оказалась весьма удобной для изучения механизма электрослияния мембран. Во-первых, в отличие от электрослияния липосом и клеток, точно известны значения напряжений на мембранах. Во-вторых, слияние можно реализовать не только наложением внешнего поля, но и за счет диффузионного потенциала, или внутримембранного поля в случае монослойного слияния бислоев с разным поверхностным зарядом (Melikyan et al, 1983 а). В-третьих, начало полного слияния фиксируется с большой точностью благодаря токовым измерениям. В-четвертых, можно четко контролировать стадию взаимодействия мембран в момент наложения импульса (до

монослойного слияния или после него).

Важно, что для электрослияния, как и для других способов получения мембранной трубки, необходимо предварительное образование контактного бислоя: наложение электрического поля на мембраны в стадии плоскопараллельного контакта даже при весьма малых расстояниях между мембранами вызывает разрушение обеих мембран, но не индуцирует слияния (МеНкуап et а1., 1983; Й1егпотог<31к et а1, 1987 а).

Для изучения механизма электрослияния бислоев в 'работе' (МеНкуап еь а1, 19ЭЗ) мы сравнили зависимости I) длительности прямоугольного импульса, необходимого для индукции слияния мембран, от амплитуды этого импульса и 2) логарифма среднего времени жизни обычного бислоя того же липидного состава и площади, что и контактный бислой (рис. 10). Совпадение обеих кривых во зсем исследованном диапазоне напряжений доказывает, что в основе электрослияния и разрушения мембран в электрическом поле лежит один и тот же механизм: развитие в контактном бислое гидрофильных пор надкритического радиуса, стремящихся к самопроизвольному расширению.

Экспоненциальный характер зависимости времени электрослияния (1^) бислоев и времени жизни обычной мембраны (1^) от напряжения в исследованном диапазоне объясняет почти 100% образование * мембранной трубки в экспериментах по электростимулируемому слиянию. Действительно, если напряжение на контактном бислое равно и, то на неконгактирующих участках мембран падает по и/2. Соотношение времен можно приблизительно оценить, как ехр

(аи/2), где а - наклон кривых £(И). Чем выше и, тем больше вероятность, что контактный бислой разрушится раньше неконтактирующих участков.

Как уже отмечалось электростимулируемое слияние бислоев можно наблюдать на бислоях любого из исследованных составов. Существенно более специфическим оказалось Са индуцируемое слияние бислоев обнаруженное наш лишь для кардиолипин содержащих мембран лишенных растворителя (Меликян и др., 1983).

Особым случаем слияния бислоев следует считать деление мембранной трубки (рис.8 г-б), происходящее спонтанно при возникновении определенной конфигурации бислоя (МеНкуап et а1, 1984). Подчеркнем, что этот процесс не требует никаких дополнительных условий и, по-видимому, определяется особой

Рис. 10. Зависимость от напряжения средней длительности импульса,необходимого для индукции слияния ( О ) и среднего времени жизни обычной мембраны ( о ). Бислои из смеси

диолеоилфосфатидилхолина и холестерина,- I0_IM KCl.

л-

—i—

02.

ОА

0,6

Рис. II. Последовательные стадии слияния мембран согласно сталкерному механизму: а) мембраны на равновесном расстоянии; б) локальное сближение и разрыв контактирующих монослоев; в) образование сталка; г) рост площади контактного бислоя; д) разрыв контактного бислоя при образовании гидрофильной поры е) завершение процесса слияния. Тонкими линиями показаны границы гидрофобных поверхностей монослоев.

геометрией системы: образованием узкого цилиндрического канала на начальных стадиях деления трубки.

Результаты, полученные нами при изучении взаимодействия и слияния липидных бислоев позволили нам сформулировать общее описание явления слияния как последовательной реализации определенных небислойных структур (Черномордик и др., 1986).

После достижения расстояний между бислоями порядка- 25 А, сближение мембран резко затрудняется вследствие наличия мощных гидратационных сил. Для дальнейшего сближения бислоев в липидных мультислоях или бислоев, нанесенных на поверхность слюдяных цилиндров, необходимы колоссальные давления в сотни и тысячи атмосфер (йапс1, 1981). В отличии от таких систем, плоские мембраны (или липосомы) способны преодолевать гидратационный барьер практически без внешнего давления, по-видимому, благодаря тепловым флуктуациям (ЬеИст еЪ а1., 1986; СЬегпотогсИк е1; а1., 1987). При этом происходит локальное сближение мембран на малое расстояние ~ 0,5 нм. В результате конкуренции гидратационного и гидрофобного взаимодействий нарушается структура контактирующих монослоев и образуется сталк (рис. II б и в). Для возникновения сталка и роста его диаметра с образованием контактного бислоя с одной стороны и для разрыва контактного бислоя, т.е. полного слияния, с другой стороны, необходимо, чтобы наружные монослои * мембран имели отрицательную, а внутренние монослои положительную спонтанную кривизну. Таким образом, согласно развитым нами представлениям, на, разных стадиях слияния: при образовании сталка и гидрофильной поры, последовательно реализуются небислойные структуры, предъявляющие противоположные требования к спонтанным кривизнам разных монослоев мембран. Такие противоположные знаки спонтанных кривизн наружных и внутренних монослоев взаимодействующих мембран, вероятно, действительно реализуются в некоторых экспериментальных системах в присутствии фьюзогенов, например, ионов Са2+ (Du2gunes, 1985) и фосфолипаз С и Е) (Шрагин и др., 1985), модифицирующих наружные монослои липосомальных мембран.

В согласии с предсказаниями рассмотренной гипотезы, полное слияние 'удалось зарегистрировать при модификации внутренних монослоев плоских мембран лизофосфатидилхолином (СйегпотогсШс е1; а!., 1987). Формально, действие фьюзогенов должно, в рамках

предложенного механизма, сводиться к увеличению вероятности монослойного слияния и разрыву образованного при этом контактного бислоя путем рождения в нем гидрофильной поры (рис. Пд). Отметим, что механические напряжения в контактном бислое, возникающие, в частности, при наличии градиента осмотического давления на липосомальной мембране или благодаря натяжению плоских липидных мембран, способствует дополнительной дестабилизации контактного ^бислоя и росту диаметра образованной в нем гидрофильной поры.

Анализ литературы позволяет заключить, что основные стадии и закономерности взаимодействия мембран, реализующиеся в системе плоский бислой- плоский бислой, в большей или меньшей степени соответствует установленным для клеточных мембран и для других модельных систем. В то же время изучение взаимодействия двух бислоев удачно дополняет информацию, полученную в других экспериментальных системах, и позволяет выяснить механизм важных стадий происходящих процессов.

Влияние мембранного скелета эритроцитов на развитие слияния

Рассмотренная выше модель слияния описывает процесс лишь до образования в зоне контакта мембран гидрофильной поры надкритического радиуса. Для системы липидный бислой - липидный» бислой такая пора спонтанно и быстро растет завершая объединение внутренних объемов ограниченных сливающимися мембранами. Однако, оказалось, что для клеточных мембран на этой стадии процесса нельзя не учитывать влияние мембранного кортекса - составной части белкового цитоскелета. Влияние мембранного скелета эритроцитов на расширение пор при электрослиянии теней эритроцитов мы исследовали с . помощью фазово-контрастной и флуоресцентной световой микроскопии и электронной микроскопии (Chernomordik and Sowers, 1991). Наложение короткого импульса электрического поля 10 кВ/ см, 1,2 мс) на сформированные с помощью диэлектрофореза агрегаты теней эритроцитов человека или кролика приводило к слиянию мембран, регистрируемому по переносу флуоресцентного мембранного маркера от меченых к немеченным мембранам. Слияние может происходить между двумя и более соседними тенями. Электронная микроскопия тонких срезов показала, что контактные зоны в необратимых агрегатах ' клеток, полученных • при электростимулируемом слиянии мембран перфорированы множеством

Рис. 12. Электронная микрофотография зон слияния между тенями эритроцитов кролика. Слияние было индуцировано одиночным экспоненциальным импульсом поля (напряженность 4 кВ/см, постоянная времени 1,2 мс).

пор, возникающих на ранних этапах слияния при локальном соединении внутриклеточных объемов клеток (рис. 12). Такие стабильные (время жизни > 48 часов) поры имеют диаметр 0.07-0.I * мкм. Установлено, что эволюция этих пор контролируется интактным спектрин-актиновыи скелетом мембран. Модификация мембранного скелета при прогревании мембран (температура > 46° С, 10 минут); или при длительной (более I часа) инкубации клеток при низкой ионной силе вызывала резкое изменение характера слияния. В этом случае локальное слияние сразу приводит к полному исчезновению какой-либо перегородки между клетками т.е. к образованию гигантских клеток.

Используя Dil как мембранный маркер мы исследовали также электрослияние между мембранами подвергнутыми и не подвергнутыми тепловой обработке. Выло установлено, что даже если лишь одна из приведенных в контакт мембран имела интактный мембранный скелет, расширения пор, возникающих в контактной зоне при электрослиянии, до полного объединения объемов клеток не наблюдалось. Стабилизация белковым скелетом мембраны промежуточных структур, возникающих при слиянии по-видимому является универсальным явлением. Действительно, при изучении . экзоцитоза и вирус-индуцируемого слияния недавно было установлено, что

образование локальной цитоплазматической перемычки (fusion роге) не завершает процесс слияния. Как было показано в работах Sarcar et al., 1989 и Zimmerberg et al., 1987 такие поры могут закрываться и вновь возникать или стабилизироваться при радиусах ~ 40 нм. Это слишком узкие водные каналы, чтобы обеспечить возможность для ядер сливающихся клеток встретиться при соматической гибридизации или для нуклеокапсида вируса проникнуть в цитоплазму клетки-мишени. Таким образом, обнаруженная нами стабилизация пор белковым скелетом' мембран может в некоторых случаях делать лимитирующей стадией слияния мембран не образование цитоплазматической перемычки, а увеличение ее радиуса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В этом цикле работ с помощью различных экспериментальных моделей систематически исследованы электропорация, трансфекция и слияние клеток. Установлено, что в основе всех этих явлений лежат родственные структурные перестройки клеточных мембран, связанные с нарушением непрерывности их липидного матрикса с образованием короткоживувдх небислойных структур. Такие структуры: поры, развивающиеся в мембранах при всех трех рассмотренных явлениях, и сталки, возникающие при монослойном слиянии мембран, формируются в результате локальных деформаций изгиба монослоев мембран в противоположных направлениях.

В наших работах было впервые доказано, что обратимый или необратимый рост проводимости липидных бислоев разных составов при наложении на них достаточно сильного электрического поля отражает развитие в мембранах гидрофильных пор, т.е. сквозных пор, внутренняя поверхность которых выстлана полярными головками липидов. Положительная спонтанная кривизна монослоев, составляющих мембрану, отражающая, например присутствие лизолецитина, способствует формированию таких пор из гидрофобных пор малых радиусов 0.5 нм). При достижении радиусом одной иг пор критического значения, составляющего в зависимости от напряжения и состава мембран ~ 1-5 нм начинается необратимое механическое разрушение мембраны. Используемое в этом цикле работ наложение на липидные Сислои сильных электрических поле! . благодаря экспоненциальным зависимостям числа пор и ю проводимости от напряжения оказалось исключительно информативный подходом к изучению структуры и механизма образованш гидрофильных пор как локальных небислойных структур.

Слияние мембран, процесс в котором нарушение целостности мембран, должно сочетаться с их соединением уже новым образом оказалось связанным со структурными перестройками, родственными происходящим при порообразовании. При изучении слияния липидных бислоев было выявлены следующие стадии процесса. При приведении мембран в контакт между ними возникает локальная перемычка -стаж, увеличение диаметра которого приводит к формированию контактного бислоя, состоящего из монослоев разных мембран. Для перехода от такого монослойного слияния к полному в контактном бислое должна появиться и расти гидрофильная пора. Таким образом на разных стадиях процесса слияния последовательно реализуются родственные небислойные структуры ( стаж и пора), предъявляющие противоположные требования к спонтанным кривизнам монослоев, составляющих контактирующие мембраны. Благодаря этому явления порообразования (в частности, электропорации) и слияния липидных бислоев описываются наш в рамках единого формализма как деформации изгиба монослоев мембраны в разных направлениях.

Не вызывает сомнений, что клеточные мембраны являются гораздо более сложными структурами чем липидные бислои. Специальные эксперименты показали, в частности, что поздние стадии электропорации и слияния клеточных мембран контролируются структурами бежового цитоскелета. Однако, наши экспериментальные * данные и анализ результатов других авторов свидетельствуют о том, что ранние стадам всех этих явлений определяются, в существенной степени, свойствами липидного матрикса биологических мембран и могут быть объяснены на основе развитых представлений.

Мы исследовали также феноменологию и механизм электротрансфекции. Результаты, полученные при изучении этого явления на животных клетках разных линий, на клетках Е. coli и на липосомах, позволили предложить и обосновать экспериментально новый механизм электротрансфекции, согласно которому электростимулируемый захват ДНК основан на электрофоретическом движении молекул ДНК и осуществляется не как транслокация макромолекул через электропоры, как это обычно предполагалось в литературе, а при образовании эндосомоподобных везикул, содержащих ДНК. "Таким образом и этот процесс, требующий сначала образования электропор, а затем отрыва эндосомоподобной везикулы, т.е. перестройки родственной слиянию, связан с образованием в мембранах локальных и короткоживущих небислойных структур.-

выводы

1. Нарушение барьерной функции клеточных и липидных мембран при кратковременном наложении на них сильного электрического поля связано с появлением в липидном бислое короткоживувдх гидрофобных пор, которые затем, при соответствующей переориентации липидных молекул, трансформируются в гидрофильные поры. Число и радиус гидрофильных пор растет со временем.

2. Скорость накопления гидрофильных пор и для малых пор их ""проводимость экспоненциально растут с напряжением. Поры могут

возникать менее чем за 20 не. Характерные времена изменения размера пор (I - 10 мс)* существенно меньше времен исчезновения пор при снятии напряжения (1-100 с).

3. Для изучения■механизма электротрансфекции впервые использованы большие однослойные лшгасомы. Показано, что молекулы ДНК эффективно захватываются липосомами при кратковременном наложении электрического поля (12,5 кв/см, I мс). В основе обнаруженного явления лежит не транслокация макромолекул через электропоры, а образование эндосомоподобных везикул.

4. При исследовании механизма электротрансфекции "животных клеток разных линий и клеток Е. coli установлено, что процесс проникновения ДНК в клетки занимает не более 2 с и доказана существенная роль в электротрансфекции электрофоретического * движения макромолекул.

5. При изучении взаимодействия липидных бислоев установлено, что полному слиянию всегда предшествует монослойное слияние, т.е. возникновение в области контакта мембран одиночного бислоя, состоящего из внутренних монослоев обеих мембран. Доказано, что сначала на мембранах возникают дефекты, представляющие собой разрывы моноелоев. Замыкание таких дефектов друг на друга образует сталк - локальную перемычку между мембранами, радиус которой растет с формированием контактного бислоя. Разрыв такого бислоя при образовании в нем гидрофильной поры приводит к полному слиянию мембран.

6. Обнаружены и исследованы разные способы индукции полного слияния бислойных липидных мембран: Са2+-индуцируемое слияние кардиолипин содержащих мембран без растворителя, электрослияние мембран любых составов и спонтанное деление мембранной трубки определенной формы на две мембраны. Предложено общее описание явления слияния как последовательной реализации двух типов

локальных небислойных структур: сталков и пор.

7. Кратковременное наложение сильного электрического поля на клетки наряду с электропорацией приводит к образованию на живых клетках долгоживущх, обратимых, осмотически зависимых деформаций клеточных мембран - блебов, преимущественно локализованных на тех участках клеточной мембраны, на которых во время электрического импульса возникает максимальное напряжение.

8. При изучении электрослияния теней эритроцитов установлено, что зоны контакта мембран после импульса перфорированы множеством стабильных пор (время жизни > 48 часов), имеющих диаметр 0.07-0.1 мкм. Размеры таких цитоплазматических перемычек между клетками контролируются спектрин-актиновым мембранным скелетом эритроцитов. Увеличение ' диаметра пор до полного завершения слияния происходит только после повреждения мембранного скелета.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Л.В.Черномордая, И.Г.Абидор, В.Б.Аракелян "Влияние стрессовых воздействий на электрические свойства БЛМ" (1978) Биофизика т.5, 806-812.

2. И.Г.Абидор, В.Б.Аракелян, Л.В.Черномордик, В.Ф.Пастушенко, М.Р.Тарасевич, Ю.А.Чизмаджев "Электрический пробой БЛМ" (1978), Докл. АН СССР т. 240, 733-736

3. И.Г.Абидор, С.Х.Айтьян Л.В.Черномордик, В.В.Черный Ю.А.Чизмаджев "Определение граничных потенциалов мембран потенциодинамическим методом" (1979) Докл. АН СССР т.245, 977-981.

4. И.Г.Абидор, В.Б.Аракелян, Л.В.Черномордик, В.Ф.Пастушенко, Ю.А.Чизмаджев "Механизм электрического пробоя БЛМ" (1979) Докл. АН СССР Т."245, 1239-1242.

5. I.G.Abidor, Y.B.Arakelyan, L.V.Chernomordik, Yu.A.Chizmadshev, Y. P. Pastushenko, M. R. Tarasevich "Electrical breakdown of BLM: Main experimental facts and their qualitative discussion" (1979) Bioelectrochemistry & Bioenergetics, v. 6, 37-52.

6. L. V. Chernomordik & I. G. Abidor "The voltage induced local defects in unmodified BLM" (1980) Bioelectrochemistry & Bioenergetics, r. 7, 617-623.

7. Ю.А.Чизмаджев, Л.В.Черномордик, В.Ф.Пастушенко, И.Г.Абидор "Электрический пробой бислойных лшшдных мембран" (1981) в книге "Итоги Науки и Техники" ВИНИТИ, т.2, 161-266.

8. S. I. Sukharev, L. V.. Chernomordik, >1. G. Abidor, Yu. A. Chizmadzhev "Effects of uranyl ions on the properties of bilayer lipid membranes" (1982) Bioelectrochemistry & Bioenergetios, 7.

9, 133-HO.

9. I. G. Abidor, L. V. Chernomordik, S. I. Sukharev, Yu.A.Chizmadzhev "The reversible electric breakdown of bilayer lipid membranes" (1982) Bioelectrochemistry & Bioenergetios, v.

9. 141-148.

10. I. V. Chernomordik, S. I. Sukharev, I. G. Abidor, Yu. A. Chizmadzhev "The study of BIM reversible electrical breakdown mechanism in presence of uranyl ions" (1982) Bioelectrochemistry & Bioenergetios, v. 9, 149-155.

11. Yu. A. Chizmadzhev, E. M. Egorova, L. V. Chernomordik, I. G. Abidor "Studies on the liposome interaction with planar bilayers" (1982) StucLia Biophysica, v. 90, 159-167.

12. Г.Б.Меликян, JI.В.Черномордое, И.Г.Абидор, Л.М.Чайлахян "Са2+- индуцируемое слияние липидных бислоев лишенных растворителя" (1983) Докл. АН СССР т. 269, 1221-1225.

13. С.И.Сухарев, В.Б.Аракелян, И.Г.Абидор, Л.В.Черномордик, В.Ф.Пастушенко "Разрушение БЛМ при электрическом пробое" (1983) Биофизика т. 28, 756-761.

14. _ L. Y. Chernomordik, S. 1. Sukharev, I. G. Abidor, Yu. A. Chizmadzhev "Breakdown of lipid bilayer membranes in an electric field" (1983) Biochimica et Biophysica Acta, v. 736, 203-213.

15. G. B. Melikyan, I. G. Abidor, L. Y. Chernomordik, L. Ы. Chailakhyan "Electrostimulated fusion and fission of bilayer lipid membranes" (1983) Biochimica et Biophysica Acta, v. 730, 395-398.

16. Л.В.Черномордик, С.И.Сухарев, И.Г.Абидор "Долгоживущие дефекты в липидных бислоях после обратимого электрического пробоя" (1984) Биологические Мембраны т. 1, 1230-1237.

17. G. В. Melikyan, M. M. Kozlov, I. V. Chernomordik, Y. S. Markin "Fission of the bilayer lipid tube" (1984) Biochimica et Biophysica Acta, v. 776, 169-175.

18. Л.В.Черномордик "Электростимулируемое слияние клеток" ■(1984) Успехи Соврем. Биологии г. 98, 395-408.

19. L. Y. Chernomordik, 0. В. Melikyan, N. I. Dubrovina, I. G. Abidor, Yu. A. Chizmadzhev "Solvent free bilayers from squalene solutions of phospholipids" (1984) Bioelectrochemistry &

Bioenergetics, v. 12, 155-166.

20. Л.В.Черномордик "Биомедицинские приложения электропорации клеточных мембран" (1985) Успехи Соврем. Биологии т. 99, 67-80.

21. L. V. Chernomordik, М. Ы. Kozlov, G. В. Melikyan, I. G. Abidor, V.S. Markin, Yu. A. Chizmadzhev "The shape of lipid molecules and monolayer membrane iusion" (1985) Biochimica et Biophysica Acta, v. 812, 643-655.

22. В.Ф.Пастушенко, Л.В.Черномордик, Ю.А.Чизмаджев "Определение линейного натяжения бислойных липидных мембран по временам их жизни в электрическом поле" (1985) Биологические Мембраны т. 2, 813-81923. Г.Б.Меликян, Л.В.Черномордик, И.Г.Абидор -"Рост площади триламинарной структуры при монослойном слиянии липидных мембран" (1985) Биологические Мембраны т. 2, 1047-1055.

24. Л.В.Черномордик, М.М.Козлов, С.Л.Лейкин, В.С.Маркин, Ю.А.Чизмаджев "Слияние мембран: локальные взаимодействия и структурные перестройки" (1986) Докл. АН СССР т. 288, 1009-1011.

25. С.Л.Лейкин, Р.Глазер, Л.В.Черномордик- "Механизм образования .пор при электрическом пробое мембран" (1986) Биологические Мембраны т. 3, 944-951.

26. Л.В.Черномордик, Г.Б.Меликян, Ю.А.Чизмаджев "Плоские липидные бислои как модель для изучения слияния биомембран"» (1987) Biologicheskye Membrany, v. 4, 117-164.

27. L. V. Chernomordik, G. B. Melikyan, Yu. A. Chizmadzhev "Biomembrane fusion: a new concept derived from model studies using two interacting planar lipid bilayers" (1987) Biochimica et Biophysica Acta, v. 906,309-352.

28. L. V. Chernomordik, S. I. Sukharev, S. Y. Popov, V. P. Pastushenko, A. Y. Sokirko, I. G.Abidor, Yu. A. Chizmadzhev "The electrical breakdown of cell and lipid membranes: the similarity of phenomenology" (1987) Biochimica et Biophysica Acta, v. 902, 360-373.

29. S. L. Leikin, M. M. Kozlov, L. Y. Chernomordik, Y. S. Markin, Yu. A. Chizmadzhev "Membrane fusion: overcoming of the hydration barrier and local restructuring" (1987) Journal of Theor. Biol., v. 129, 411-425.

30. Г.В.Гасс, П.М.Кузьмин, Л.В.Черномордик, В.Ф.Пастушенко, Ю.А.Чизмаджев "Взаимодействие и деформируемость мембран в клеточных цепочках, сформированных с помощью диэлектрофореза"

(1987) Биологические Мембраны т. 4, 1059-1072.

31. И.Т.Агаркова, С.М.Серов, В.С.Прасолов, Л.В.Черномордик "Использование электростимулируемого введения ДНК для генетической трансформации эукариотических клеток" (1987) Биологические Мембраны, т. 4, 1059-1072.

32. Е.С.Цымбалюк, Л.В.Черномордик, Н.Е.Броуде, Ю. А. Чизмаджев "Электростимулируемзя трансформация клеток Escherichia coli"

(1988) Биологические Мембраны т. 5, 240-245. ^

33. R. Glaser, S. L. Leikin, L. V. Ch.emomord.ik, А. V. Sokirko, V. F. Pastushenko "Pore arising and development in course of reversible electrical breakdown" (1988) Biochimica et Biophysica Acta, v. 940, 275-287.

34. E. S. Cymbalyuk, L. V. Chernomordik, N. E. Broude, Yu. A. Chizmadzhev "Electrostimulated transformation of Escherichia coli cells pretreated by EDTA solution" (1988) PEBS letters, .v. 234, 203-207.

35. L. Y. Chernomordik, Yu. A. Chizmadzhev "Electroporation oi bilayer lipid membranes: phenomenology and mechanism" (1989) ir "Electroporation and Electroiusion in Cell Biology" (Eds. E. Neumann, A. Sowers and C. Jordan) Plenum Press, N.-Y., 181-192

36. G. B. Melikyan, L. Y. Chernomordik "Electrostimulated fusior of lipid bilayers" (1989) in "Electroporation and Electrofusior in Cell Biology" (Eds. E. Neumann, A. Sowers and C. Jordan] Plenum Press, N.Y. , 83-96

37. M-. M. Kozlov, S. L. Leikin, L. V. Chernomordik, Y. S. Markin, Yu. A. Chizmadzhev "Stalk mechanism of membrane fusion" (1989' European Biophys. J., v. 17, 121-129

38. R.W. Glaser, S.L. Leikin, L.Y. Chernomordik, V.P Pastushenko, A.I. Sokirko (1989) "Electrical breakdown o: membranes" Studia biophysica v.130, 157-160

39. G. V. Gass, I. V. Chernomordik (1990) "Reversible large-scali deformations in the membranes of electrically treated cells electroinduced bleb formation" Biochim. Biophys. Acta, v. 1023 1-11

40. M. Kozlov, L. Chernomordik, V. Markin "A mechanism о ' formation of protein-free regions in the red blood cell membrane . the rupture of the membrane skeleton" (1990) Journal о

Theoretical Biol., v. 144, 347-365

41. В. Кленчин, C.M. Серов, С.М.Сухарев, Л.В.Черномордик

Ю.А.Чизмаджев (1990) "Роль электрофореза в

электростимулируемом захвате ДНК животными клетками" Биологические Мембраны т. 7, 446-447

42. Ь. Chernomordik, A. Sokolov, У. Budker "Electrostimulated uptake DNA by liposomes" (1990) Biochim. Biophys. Acta, v. 1024, 179-183.

43. L. Chernomordik and A. Sowers (1991) "Evidence that spectrin restrains the expansion of a fusion zone if it is created between t#o erythrocyte ghosts in contact and even if the spectrin is intact in only one of the two ghost membranes" Biophys. J. v. 59, 209a

Информация о работе

Черномордик, Леонид Витальевич
доктора биологических наук
Москва, 1991
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы