Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Одиночные поры, индуцированные электрическим полем в липидном бислое

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Меликов, Камран Чингиз оглы, Москва

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова.

Биологический факультет

На правах рукописи

Меликов Камран Чингиз оглы

Одиночные поры, индуцированные

электрическим полем в липидном бислое.

03.00.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Научный руководитель доктор химических наук, чл.-корр РАН, профессор Ю.А. Чизмаджев.

/

Москва - 1999

Оглавление.

Сгр.

Введение. 4

Часть I. Литературный обзор 7

Глава 1.1. Электрический пробой клеток 7

1.1.1. История вопроса. 7

1.1.2. Значение исследований электрического пробоя. 8 Глава 1.2. Феноменология электрического пробоя БЛМ. 12

1.2.1. Необратимый электрический пробой. 12

1.2.2. "Стрессованное" состояние. 14

1.2.3. Обратимый пробой. 15 Глава 1.3. Механизм электропорации. 17

1.3.1. Ранние теории электрического пробоя. 17

1.3.2. Формирование пор при электропорации. 18

1.3.3. Теория электропорации. 20

1.3.4. Гидрофильные и гидрофобные поры. 24

1.3.5. Метастабильные поры. 26

1.3.6. Заключение. 32 Часть П. Материалы и методы. 34

II. 1. Эксперименты на плоских бислойных липидных мембранах. 34

11.2. Эксперименты на мембранах на конце микропипетки. 35

11.3. Электрическая схема измерений. 36 П.4. Реактивы. 36 II.5. Липидный состав мембран. 37

Часть Ш. Результаты. 38 Глава III. 1. Общая картина изменений проводимости БЛМ, вплоть до

разрушения. 38

III. 1.1. Картина электрического пробоя плоских БЛМ из ДФФХ. 38

III. 1.2. Картина электрического пробоя участка мембраны ю

ДФФХ на конце стеклянной микропипетки. 42 Глава IIL2. Ступенчатые изменения проводимости мембраны,

индуцированные электрическим полем. 46

111.2.1. Эксперименты на плоских БЛМ. 46

111.2.2. Эксперименты на мембранах на конце микропипегки. 50 Глава III.3. Рост проводимости мембраны связан с накоплением мегасгабильных пор. 57

111.3.1. Обратимость изменений проводимости. 57

111.3.2. Рост проводимости мембраны связан с формированием более чем одного дефекта. 59

Глава III.4. Свойства проводящих дефектов- мегасгабильных пор. 61

111.4.1. Анализ проводимости пор. ■ 62

111.4.2. Анализ времен жизни пор. 62

111.4.3. Анализ константы скорости "рождения" пор. 66

111.4.4. Среднее количество пор перед необратимым разрушением мембраны. 69

Глава III.5. Непроводящее дефектное подсосгояние- "предпоры". 76

111.5.1. Флуктуации проводимости БЛМ из ДФФХ вблизи 76 уровня фоновой проводимости: пачечная активность.'

111.5.2. Влияние предобработки на рост проводимости 77 мембраны.

Часть IV. Обсуждение. 81

Выводы 94

Литература 96

Введение.

Известно, что под действием достаточно высоких потенциалов происходит сильное увеличение проводимости клеточных и искусственных мембран. После выключения внешнего поля проводимость мембраны может вернуться к исходному значению. Этот феномен носит название обратимой электропорации или обратимого электрического пробоя. В случае, если амплитуда или длительность импульса внешнего напряжения достаточно велики, происходит необратимое разрушение мембраны.

Интерес к электрическому пробою связан с тем, что уже много лет электропорация используется в различных биотехнологических приложениях и в медицине [1, 2]. Среди биотехнологических приложений, в которых электропорация нашла широкое применение, необходимо отметить трансфекцию различных типов клеток - от прокариот до дрожжей, растительных и животных клеток [1, 3-7]. Другой областью применения электрического пробоя плазматической мембраны является введение в клетку различных веществ в разных экспериментальных целях. Так введение в клетки рестриктаз дает возможность исследовать влияние специфических делений на клеточную жизнедеятельность [5]. Введение в клетку с помощью электропорации антител к определенным белкам позволяет ингибировать их работу в клетке [1,5, 8]. Электропорация также может использоваться для прижизненной окраски клеточных органел различными флуоресцентными красителями [5, 9]. Электропорация находит применение и в медицине для лечения раковых заболеваний [1, 10, 11]. Кроме того интерес к исследованиям электрического пробоя проявляют исследователи, занимающиеся экзоцитозом и вирусным слиянием. Ряд авторов предполагает, что одной из промежуточных стадий в этих биологически важных процессах является липидная пора - структура, формирование которой предполагается и при электропорации [12-14].

На сегодняшний день накоплено большое количество данных, касающихся электрического пробоя как клеточных, так и искусственных мембран. Показано, что электропорация мембран клеток бактерий, водорослей, растительных клеток, эритроцитов, лимфоцитов, нервных клеток и ряда других типов мембран имеет общие закономерности. Это позволяет предположить, что основную роль в электрическом пробое клеточных мембран играет липидный матрикс. В то же время биологические мембраны пробиваются обратимо, тогда как для плоских БЛМ, сформированных из большинства липидов, характерен необратимый пробой и лишь искусственные мембраны таких довольно экзотических составов как окисленный холестерин, азолектиновые мембраны, модифицированные 1Ю2+, и холестеринсодержащие мембраны в присутствии голотурина А, пробиваются обратимо.

В предыдущих работах была развита теория электрического пробоя, предполагающая, что в основе механизма электропорации лежит формирование локальных дефектов структуры бислоя - гидрофильных пор. Эта теория достаточно хорошо описывает имеющиеся данные. Кроме того имеется ряд экспериментальных данных подтверждающих локальный характер пробоя, в то же время имеется необходимость в дополнительных экспериментальных доказательствах формирования локальных дефектов под действием электрического поля.

В работах по исследованию обратимого пробоя азолектиновых мембран, модифицированных 1Ю2"\ были найдены характеристики локальных проводящих дефектов - пор. В то же время большое число дефектов, формирующихся в мембранах в описанных экспериментальных условиях (105 согласно оценкам авторов), и приближенный характер формул, использованных для расчета параметров пор, позволяет рассматривать полученные характеристики лишь в качестве оценок.

В данной работе был исследован пробой мембран из 1,2-дифитаноил-вп-глицеро-З-фосфатидилхолина, сформированных из раствора липида в сквалене. Особое внимание уделено исследованию начальных стадий пробоя. Путем сравнения пробоя на мембранах разного размера получены новые доказательства локального характера пробоя. С помощью методики "пэтч-клампа", примененной к плоским БЛМ, зарегистрированы изменения проводимости мембраны, которые можно связать с одиночными проводящими дефектами. На основе анализа таких изменений проводимости исследованы свойства одиночных дефектов.

Часть I Литературный обзор.

Глава 1.1. Электрический пробой клеток.

§1.1.1. История вопроса. Барьерная функция - одна из основных функций клеточных мембран, нарушение которой может привести к гибели организма. Одним из факторов, способных повредить клеточную мембрану является электрическое поле. Нарушение барьерной функции мембран под действием поля называют электрическим пробоем [15-17].

Еще в середине прошлого века было установлено, что при действии сильного электрического поля возбудимые ткани необратимо повреждаются [18], а в 1936 году такое повреждение тканей было связано с разрушением клеточных мембран [19]. Однако систематическое изучение влияния сильных электрических полей было начато лишь в конце 50-х годов. В экспериментах на перехватах Ранвье было показано, что при сильной гиперполяризации (до U«150-200 мВ) наблюдается уменьшение сопротивления мембраны [20-23]. При этом последующее возвращение мембранного потенциала к значению потенциала покоя сопровождалось восстановлением свойств мембраны. Если же мембраны поляризовали до значений порядка 350-400 мВ происходило их необратимое разрушение.

Рядом исследователей было показано, что электрические поля напряженностью более 10кВ/см способны необратимо повреждать плазматические мембраны, вызывая гибель микроорганизмов многих видов [24-28]. Большая серия работ по исследованию влияния электрического поля на клеточную мембрану была проведена на клетках водорослей с использованием внутриклеточных микроэлектродов. В экспериментах на клетках водорослей Chara, Nitella iranslucens и Valonia ultricularis было обнаружено, что при напряжениях на мембране, превышающих «300400 мВ, происходит резкое увеличение проводимости клеточной мембраны [29-32]. Снятие электрического поля приводило к восстановлению

изолирующих свойств мембраны. В экспериментах на эритроцитах было показано, что при увеличении напряженности электрического поля, в котором находится суспензия клеток, выше некоторого критического значения происходит резкое уменьшение сопротивления плазматической мембраны [33-38]. Кроме того, используя набор различающихся по размеру зондирующих молекул, Кинозита и др. показали, что после обработки мембраны электрическим полем возрастает ее проницаемость для больших молекул [37]. На основе этих данных было предположено, что под действием поля в мембране образуются поры. В другой работе тех же авторов было показано, что эти поры способны "залечиваться" [38]. Сходство картины пробоя для мембран разной природы позволяет предположить существование общего механизма пробоя биомембран. Это позволяет исключить возможную роль в электрическом пробое специфических мембранных белков и предположить, что электрический пробой связан с изменениями в липидном матриксе биологических мембран. Кроме того, о том, что пробой связан с перестройками бислоя, говорит увеличение скорости "флип-флопа" через мембрану эритроцитов при электрическом пробое [39, 40]. Было также показано, что электропорация бислойных липидных мембран (БЛМ), сформированных из различных натуральных и синтетических липидов, протекает аналогично электропорации биологических мембран [41-43]. Таким образом бислойные липидные мембраны представляют собой удобную модельную систему для исследования электропорации, использованную и в данной работе. Подробно электрический пробой искусственных мембран будет рассмотрен в главах 1.2 и 1.3.

£ 1.1.2. Значение исследований электрического пробоя. Исследования электропорации представляют интерес в связи с широким практическим применением пробоя в качестве инструмента для

направленного и контролируемого нарушения структуры клеточных мембран. Кроме того исследования электрического пробоя могут быть полезны для понимания механизмов ряда важных биологических процессов (таких как вирусное слияние и экзоцитоз). Ниже мы рассмотрим основные области применения электрического пробоя.

В 1982 году Нойман с соавторами показали, что обработка клеток импульсами высокого напряжения в присутствии ДНК приводит к введению в клетки чужеродного генетического материала [44]. С тех пор метод электротрансформации получил широкое распространение. Электропорация успешно используется для трансфекции разнообразных эукариот: растительных протопластов [45], интактных растительных клеток [46], животных клеток [4] и дрожжей [7]. Кроме того электротрансформация стала одним из наиболее популярных методов введения плазмидной ДНК в бактерии. Метод электротрансформации имеет по сравнению с другими способами трансформации множество преимуществ, такие как быстрота и воспроизводимость метода, возможность работы с неочищенной плазмидной ДНК, отсутствие необходимости в специальной предобработке клеток перед трансформацией [47]. Электропорация с успехом применяется для трансформирования широкого круга грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, многие из которых нельзя трнсформировать другими методами. Необходимо также отметить высокую эффективность электротрансформации - для E.coli выход трансформантов может достигать 80% от общего числа клеток [47]. Это позволяет использовать электротрансформацию E.coli для создания больших плазмидных библиотек [48].

В ряде работ электропорация была использована для введения в клетку различных белков. Введение в клетки рестриктаз в отличие от

ультрафиолетового и рентгеновского облучения дает возможность вызывать специфические нарушения генетического материала. Это дает в руки исследователей мощный инструмент для исследования повреждений ДНК [5]. Введение в клетки антител к различным белкам может быть использовано для прижизненной окраски этих белков или ингибирования их работы [5, 8, 49]. Так с помощью электропорации в присутствии флуоресцентно меченного фалотоксина были окрашены актиновые филаменты в клетках [50].

Электропорация находит применение и в медицине, в частности при лечении раковых заболеваний [10]. Было показано, что применение электропорации в сочетании с химиотерапией (это метод получил название электрохимиотерапии) значительно увеличивает эффективность лечения некоторых видов рака [11].

Еще в конце 70-х годов были изучены условия загрузки эритроцитов различными препаратами и получены данные о распределении этих веществ в организме после введения клеток в кровоток [51]. Было показано, что препараты, инкапсулированные в клетки, обладают более продолжительным действием и не вызывают иммунологический шок даже при больших дозах [52].

Исследования пробоя мембран эритроцитов и липосом диффузионными потенциалами подтверждает возможность электрического пробоя в условиях, сходных с физиологическими [53, 54]. Кроме того необходи мо отмстить, что как для клеточных, так и для искусствснных мембран пробой наблюдается в диапазоне напряжений от 100 до 200 мВ, а различные факторы (такие как ультрафиолетовое облучение) могут еще более снижать потенциал пробоя. Кроме того, было обнаружено, что достаточно повысить потенциал энергизованных митохондрий еще на 3050 мВ, как наступает электрический пробой мембран [55]. Таким образом

не исключена возможная роль пробоя при развитии патологических процессов в клетке.

Предполагается, что в основе механизма пробоя лежит формирование липидных пор. В то же время, ряд исследователей экзоцитоза и вирусного слияния считают, что одной из промежуточных стадий в этих биологически важных процессах также может быть липидная пора [12-14]. В пользу этого говорит характер влияния на эти процессы липидного состава сливающихся мембран [13] и эксперименты по слиянию липосом с бислоем [56]. Поэтому исследования механизма пробоя могут представлять интерес для понимания процессов, протекающих при экзоцитозе и вирусном слиянии.

Глава 1.2. Феноменология электрического пробоя БЛМ.

ф 1.2.1. Необратимый электрический пробой. Необратимый электрический пробой наблюдается на искусственных мембранах самого разнообразного липидного состава: азолектин, общие липиды мозга быка, яичный лецитин, фосфатидилэтаноламин и т.д. [57, 58]. Поведение проводимости мембран в электрическом поле сугубо индивидуально. В то же время на осциллограммах тока можно выделить ряд характерных черт. На рисунке 1 представлена обобщенная схема изменений проводимости БЛМ перед необратимым разрушением [58-60]. Характерная картина необратимого пробоя БЛМ выглядит следующим образом: после заряжения мембраны на некоторое время устанавливается стационарный ток, соответствующий фоновой проводимости мембраны, затем появляются флуктуации тока и мембрана разрушается. На схеме обозначены следующие характерные времена процесса: время заряжения мембраны (V), время появления флуктуаций время жизни мембраны (1;,) и время собственно разрыва мембраны (Ч ). Среди этих характеристик наиболее исследовано время жизни мембраны. Как уже упоминалось выше, поведение мембран в поле сугубо индивидуально и время жизни мембраны величина случайная. Причем время жизни мембран распределено в широком диапазоне и с уменьшением напряжения происходит увеличение дисперсии времен жизни, нормированных на среднее время жизни. Дифференциальные кривые распределения одномодальны и асимметричны, причем максимум распределения смещен в область малых времен.

Достаточно хорошо исследовано влияние различных факторов на среднее время жизни мембран в электрическом поле. Было показано, что для мембран различных составов (общие липиды мозга быка, яичный лецитин, азолектин, ксилан-О, яичный лецитин - азолектин) среднее время жизни мембраны сильно зависит от напряжения [58-60]. В то же время среднее время жизни мембраны при заданном напряжении зависит от

Рис. 1. Обобщенная схема необратимого электрического пробоя БЛМ при скачкообразном увеличении напряжения.

липидного состава мембраны. Так среднее время жизни при напряжении в 300 мВ для мембран из ксилана-0 и общих липидов мозга быка составляет 19 и 2211 мс соответственно [58]. Замена используемого при формировании мембран растворителя также влияет на время жизни БЛМ в электрическом поле [58]. На стабильность БЛМ влияет температура, пр�