Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Одиночные поры бислойных липидных мембран в температурной области фазового перехода гель-жидкий кристалл

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Богатырева, Наталья Эдуардовна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1. Липидная пора.

2. Время жизни мембраны с порой.

3. Поры при осмотическом пробое.

4. Поры при электрическом пробое.

5. Поры при фазовом переходе.

Jmtfmvi--- *

6. Затекание липидных пор.

7.Разрыв куполообразных мембран.

Глава II. Материалы и методы

1. Используемые материалы.

2. Методика формирования бислойных липидных мембран.

3. Выгибание мембран и измерение поверхностного натяжения.

4. Методика приготовления липосом.

5. Установка для проведения электрических измерений.

6. Калориметрические измерения.

Глава III. Флуктуации тока в бислойных липидных мембранах из дипальмитоилфосфатидилхолина при температуре фазового перехода жидкокристаллическое состояние - гель

1. Общая картина изменений проводимости БЛМ при фазовом переходе.

2. Флуктуации тока в БЛМ.

3. Распределение межимпульсных интервалов.

4. Радиусы липидных пор.

5. Кинетика затекания липидных пор.

ГЛАВА 4. ПРОВОДИМОСТЬ КУПОЛООБРАЗНЫХ МЕМБРАН.

1. Создание куполообразной мембраны большой площади из исходно плоской БЛМ.

2. Модель выгибания мембраны.

3. Экспериментальная зависимость площади мембраны от объема жидкости, добавленной с одной ее стороны.

4. Измерение проводимости БЛМ при температуре фазового перехода в условиях роста площади.

5. Амплитудные и временные характеристики флуктуаций тока.

ГЛАВА 5. ВРЕМЕНА ЖИЗНИ БИСЛОЙНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН В ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКОМ И ГЕЛЬ-СОСТОЯНЖЯХ

1. Эксперименты по определению времени жизни БЛМ при различных температурах.

2. Расчет времени жизни БЛМ с порой по формуле Дерягина.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Одиночные поры бислойных липидных мембран в температурной области фазового перехода гель-жидкий кристалл"

Актуальность проблемы. Для выполнения клеточной мембраной ее барьерной функции необходима непрерывность и целостность липидного бислоя, составляющего основу мембраны. Перестройка бислоя, приводящая к появлению в нем структурных дефектов, меняет его свойства. Изучение физических механизмов сохранения стабильности и целостности биологических мембран важно для понимания таких фундаментальных биологических процессов, как клеточное взаимодействие, слияние клеток, гемолиз эритроцитов и т.д.

Данная работа посвящена изучению стабильности мембран, содержащей липидные поры. Причинами появления пор в мембранах могут быть тепловые флуктуации липидных молекул, а также действие внешних факторов. В числе причин, приводящих к образованию пор, можно отметить осмотическое давление, электрический пробой, действие детергентов, а также фазовый переход из жидкокристаллического в гель-состояние и в гексагональную фазу II.

Липидные поры в отличие от белковых каналов не обладают выраженной избирательностью, что коррелирует с их сравнительно большими размерами. Однако в процессе затекания липидные поры могут достигать малых размеров, сравнимых с размерами белковых ионных каналов, что может приводить к перераспределению ионных токов в мембране, например, при возбуждении. После выключения стрессового воздействия бислойная липидная мембрана может вернуться к состоянию с низкой проводимостью (размеры липидных пор недостаточны для прохождения гидратированного иона).

В липидном бислое образуются два вида пор: гидрофобные и гидрофильные поры, отличающиеся краевой энергией. Гидрофобные поры могут при определенных условиях эволюционировать в гидрофильные, а затем либо затекать, либо расти, приводя к разрыву 5 мембраны. Развитие поры зависит от критических параметров: энергетического барьера и критического радиуса.

В настоящее время наиболее исследованы механизмы образования липидных пор в условиях осмотического давления[ 10,60,87], электрического пробоя[23,28,34], а также действия детергентов[46,59,22]. Проблемой стабильности пленок с порами занимались Дер яги н и др[43,44].

В лаборатории Антонова в начале 80-х были обнаружены липидные поры при фазовом переходе жидкокристаллическое состояние-гель. Поры были зарегистрированы по флуктуациям трансмембранного тока в режиме фиксации потенциала.

Знание кинетики затекания липидных пор, распределения пор в мембране, условий стабильности мембран в различных фазовых состояниях находят применение в таких областях, как липосомальный транспорт, криобиология, трансфекция, электропорация, слияние различных типов клеток, введение антител к определенным белкам.

Цель и задачи исследования. В отличие от белковых каналов липидные поры при температурном фазовом переходе быстро затекают в результате диффузии липидных молекул и для получения популяции пор, достаточной ддя статистической обработки, БЛМ обычно замораживают [4]. Распределение пор в этом случае зависит от соотношения скоростей движения фронта фазового перехода и затекания отдельных пор. Как правило, удается зарегистрировать популяцию пор, обогащенную медленно затекающими порами. В данной работе впервые предпринята попытка регистрации популяции липидных пор при фиксированной температуре, соответствующей области фазового перехода из жидкокристаллического состояния в гель. В качестве объектов исследования были выбраны БЛМ из синтетического дипальмигоилфосфатидилхолина с узкой температурной зоной фазового перехода и природный фосфолипид - яичный лецитин, подвергнутый предварительной гидрогенизации. В последнем случае температурная 6 зона перехода была широкой, и температура фиксировалась в точке, соответствующей максимуму на кривой теплопоглощения.

В опытах с электрическим пробоем БЛМ [16] установлено, что устойчивость лшшдных мембран, определяемая временем жизни БЛМ, может быть количественно рассмотрена в рамках теории Дерягина-Гу топа-Прохоро ва[43,44]. Основной причиной разрушения липидного бислоя является появление и рост критической поры в результате наложения электрического поля большой напряженности. Пробойное напряжение при этом превышало 200 мВ. Поведение БЛМ в условиях фазового перехода также является критическим, несмотря на то, что напряжение на мембране не превышает 100 мВ. В соответствии с теорией Дерягина-Гутопа-Прохорова критическими параметрами в этом случае становятся поверхностное натяжение бислоя (а) и линейное натяжение кромки поры (у). Последняя величина не поддается экспериментальной проверке. Поэтому представляется ваясным получить количественную оценку линейного натяжения кромки поры на основе измерения времени жизни БЛМ в условиях фазового перехода и расчетных формул, вытекающих из теории Дерягина-Гутопа-Прохорова.

Цель настоящего исследования - изучение процессов возникновения и затекания лшшдных пор при фазовом переходе, определение характеристик липидных пор, изучение зависимости времени жизни мембраны с порой от фазового состояния.

Для достижения цели необходимо решить следующие задачи:

- сформировать устойчивые мембраны мюллеровского типа из синтезированных фосфолипидов,

- получить стабильные куполообразные мембраны большой площади из исходно плоских БЛМ,

- определить термодинамические параметры фосфолипидов, используя метод дифференциальной сканирующей калориметрии. 8

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Богатырева, Наталья Эдуардовна

ВЫВОДЫ

1. Исследованы флуктуации тока, возникающие в модельных бимолекулярных мембранах из индивидуальных фосфолипидов (ДПФХ) или их смеси (ГЯЛ) при температурном фазовом переходе жидкий кристалл-гель. Выдерживание БЛМ в условиях фиксации напряжения и температуры, равной температуре фазового перехода, сопровождается формированием липидных пор со средним радиусом 1.1+0.2 нм и средним временем жизни 0.5+0.3 с.

2. Статистическая обработка измерений длительностей межимпульсных интервалов в длительной реализации одиночной БЛМ выявила их экспоненциальное распределение, что свидетельствует о случайном характере появления липидных пор при температурном фазовом переходе.

3. С ростом площади БЛМ более, чем на порядок, характер распределения межимпульсных интервалов, амплитуда и длительность флуктуаций тока не меняется, что указывает на локальный характер дефектов типа сквозных гидрофильных пор.

4. Обнаружена корреляционная зависимость между амплитудой и длительностью фазы спада. Коэффициент корреляции был равен 0.76+0.11, что свидетельствует о диффузионном характере затекания липидных пор. Рассчитанный коэффициент диффузии равен 10"16м2/с, что указывает на значительную вязкость бислоя в окружении поры.

5. Выявлено различие времени жизни мембран при температурах гель- и жидкокристаллического состояния и в температурной области

95. собственно фазового перехода. Анализ полученных данных в соответствии с формулой Дерягина-Гутопа-Прохорова предполагает формирование в области фазового перехода дополнительных дефектов типа сквозных гидрофильных липидных пор.

6. По времени жизни БЛМ были получены значения линейного натяжения кромки поры в жидкокристаллическом и гелевом состояниях ( в гель-фазе у=1.1 10"11 Н, в жидкокристаллическом состоянии у=0.6 10~п Н).

96

В заключение сделаем основные выводы:

1) Показано, что появление флуктуаций - это случайный процесс с экспоненциальным распределением плотности вероятности межимпульсных интервалов. Это говорит о независимости появления отдельных пор в бислое

2) Исследовано затекание липидных пор в области температурного фазового перехода. Обнаружено, что амплитуда флуктуаций тока через мембрану коррелирует с временем затекания пор. Это свидетельствует в пользу диффузионного затекания липидных пор. Рассчитанная величина коэффициента диффузии радиуса поры в пространстве радиусов оказалась ниже коэффициента латеральной диффузии молекул липида в гель-состоянии.

63

ГЛАВА 4. ПРОВОДИМОСТЬ КУПОЛООБРАЗНЫХ МЕМБРАН. 4.1. Создание куполообразной мембраны большой площади из исходно плоской БЛМ.

Регистрация флуктуаций тока на плоских БЛМ в области фазового перехода, свидетельствующая о появлении трансмембранных пор, вызвала ряд вопросов: где располагаются эти поры, зависят ли их временные и амплитудные характеристики от площади мембраны. Для ответа на эти вопросы нужно было провести измерения флуктуаций тока на мембранах различной площади или создать мембрану с меняющейся площадью. Был выбран второй вариант решения проблемы.

Выгибанием исходно плоских БЛМ на отверстии занимались Моран и Илани[64], Тьен[85], Костер и Саймон[41] и другие. Причиной выгибания мембраны было гидростатическое давление, создаваемое повышением уровня жидкости с одной стороны БЛМ. Предельным случаем выгибания мембраны являлась полусфера, при этом площадь мембраны увеличивалась в два раза по сравнению с первоначальной.

Обработка мембранообразующим раствором поверхности тефлонового стаканчика вокруг отверстия и высушивание в токе воздуха позволяет получать мембраны существенно большей площади[31]. При этом тор мембраны может выходить за пределы отверстия и скользить по подложке от отверстия к периферии. Мембрана при этом будет представляет собой полусферу с растущим основанием, и ее площадь многократно (на 1-2 порядка) превысит первоначальную.

4.2.Модель выгибания мембраны.

Рассмотрим соотношение давлений, действующих на мембрану. При одинаковых уровнях жидкости по обе стороны мембраны она плоская. Добавление электролита с одной стороны приводит к появлению гидростатического давления, выгибающего мембрану.

65

Ргид р =

42) где р- плотность электролита, ускорение силы тяжести, АИ -разность уровней электролита с двух сторон БЛМ.

Форма мембраны из плоского круга превращается в поверхность сферического сегмента. При этом часть электролита, находящаяся с внешней стороны, перемещается под искривленную мембрану, что понижает уровень жидкости во внешнем стаканчике и повышает уровень во внутреннем, при этом величина АН и гидростатическое давление уменьшаются. В пределе это может скомпенсировать действие добавленного объема.

Дй =

Ум К Ус Удоб

1 ¿>2 $2

43) где - объем добавленной жидкости, Ус- объем электролита, заполняющего сферический сегмент, который ограничен поверхностью мембраны (рис.20), Бь - площади оснований кюветы и стаканчика. яНг

3 Я-Н), (44) где Н - высота сферического сегмента.

Выгибание мембраны сопровождается появлением Лапласова давления:

4а лапл Я

45) где (7 - поверхностное натяжение мембраны, а Я - радиус кривизны. В состоянии равновесия р — Рлапл То есть:

66

4а Я

V, доб

5,

Рё зад

46)

Перенесем в левую часть формулы слагаемые, вызывающее выгибание мембраны, а в правую - препятствующие ему:

Рцоб 4сг Рё зад

47)

Проанализируем зависимость Р' = уС^ к до5 Л от высоты сегмента

Н. Лапласово давление обратно пропорционально радиусу кривизны мембраны, следовательно при н=о (в этом случае радиус кривизны равен бесконечности) эта величина равна О, с ростом Н Рлапл сначала растет, затем уменьшается, принимая максимальное значение при значении Н, равном в случае цилиндрического отверстия радиусу отверстия (мембрана принимает форму полусферы). Второе слагаемое слева связано с перемещением раствора под мембрану. Оно пропорционально Н3, однако становится сравнимым с первым слагаемым лишь при больших Н. График зависимости представлен на рис.

21. Величина Р' пропорциональна объему добавленной с одной стороны мембраны жидкости. При р'=р* мембрана из состояния, соответствующего точке В должна перейти в точку С. При этом величина Н должна измениться скачкообразно.

67 у()об

Величина Р = -, пропорциональная объему добавленной жидкости, задается в эксперименте. Определить высоту сегмента значительно сложнее. Экспериментально определяемой величиной является емкость мембраны, характеризующая ее площадь. Площадь сферического сегмента вычисляется по формуле: $сегм ~ 1

Я'

48) где г -радиус основания сегмента, Я - радиус кривизны мембраны. Я содержится в уравнении (47) , но, поскольку уравнение содержит 2 неизвестных (Я и Н), требуется дополнительное условие, связывающее эти переменные. Таким условием будет предположение, что при увеличении добавленного объема, а значит и Р', сначала происходит выгибание на отверстии , при этом

Н = Я-^Р2 - Г2

49)

После выхода тора за границы отверстия мембрана имеет форму полусферы, и Н=Я.

Учитывая это, можно построить теоретический график зависимости сегм(Р )•

68

Н, мм

Рис.21. График зависимости давления Р' от высоты сегмента

О1! =4-10 ~ъН!м.

69

Рис.22. Теоретическая зависимость площади мембраны от Р\ При равномерном росте добавленного объема АУ, а, значит иР', рост площади мембраны можно разделить на три участка: участок АВ характеризуется медленным ростом - это выгибание мембраны на отверстии из плоского состояния до полусферы, участок спонтанного роста ВС - выход тора на поверхность тефлонового стаканчика и скольжение по нему, и , наконец, участок СБ - вновь уменьшение скорости роста площади.

70

Следует заметить, что создать градиент гидростатического давления можно не только добавлением электролита с одной стороны мембраны, но и созданием различных условий его испарения по разные стороны мембраны. Если закрыть кювету с одной стороны и оставить открытой с другой, с поверхности в открытой кювете за равные промежутки времени будут испаряться равные объемы электролита. Калибровка выгибанием мембраны с помощью добавления капель электролита показывает, что за 6 мин с поверхности открытой кюветы испарялось примерно 75 мкл жидкости. Так как емкость мембраны пропорциональна площади, Р' прямо пропорционально испарившемуся объему, теоретической кривой ( рис.22), будет соответствовать экспериментальная кривая зависимости емкости от объема добавленной жидкости.

4.3. Экспериментальная зависимость площади мембраны от объема жидкости, добавленной с одной ее стороны.

Кривая экспериментальной зависимости площади мембраны от объема жидкости, добавленной с одной стороны БЛМ, приведена на рис. 23. Мембрана была сформирована из гидрированного яичного лецитина при температуре примерно 55°С и затем охлаждалась до 1=51°С. Во время экмперимента температура фиксировалась на уровне 51+1 °С. Начальная емкость соответствовала удельной емкости плоской БЛМ из лецитина, содержащей растворитель [8,9]. Дальнейший рост емкости был связан, по-видимому, с выгибанием БЛМ на отверстии (участок а) и движением тора по поверхности тефлонового стаканчика (участок б). Участок, соответствующий участку в на теоретической кривой (рис.22), не наблюдался. Емкость, а, следовательно, и площадь мембраны возросла при этом примерно в 20 раз по сравнению с первоначальной.

71 С о 500 1000 1500 V, мкл

Рис. 23 Экспериментальная зависимость относительной электрической емкости бислоя из гидрированного яичного лецитина от объема добавленной с одной стороны мембраны жидкости. С0 - емкость плоской БЛМ.

72

4.4. Измерения проводимости БЛМ из ГЯЛ при температуре фазового перехода в условиях роста площади.

Параллельно с измерением емкости на мембранах из ГЯЛ с растущей площадью проводились измерения проводимости в режиме фиксации потенциала при температуре фазового перехода гель-жидкокристаллическое состояние. Мембрана формировалась при температуре, соответствующей жидкокристаллическому состоянию, затем охлаждалась до температуры основного фазового перехода (51°С) и фиксировалась на этом уровне (51+1 °С).

Результаты измерения проводимости для одной из 15 мембраны приведены на рис.24.

Время жизни мембраны составило 90 минут. После посадки мембраны в течение 9 минут наблюдалась гладкая базовая линия, затем появлялись флуктуации. Их амплитуда составляла 4-10 пА ( при напряжении 50 мВ), длительность 0.3-2 секунды. Еще через 4 минуты на фоне малых флуктуаций наблюдалось появление существенно больших по амплитуде импульсов (около 100 пА), длительностью 0.3-2 секунды Длительность участка записи, содержащего такие импульсы, составляла около 3 минут, затем наблюдалось возрастание частоты появления флуктуаций тока и смещение базовой линии. В дальнейшем происходило чередование таких участков. Очевидно сходство наблюдаемой картины с проводимостью плоской БЛМ (рис.15). Имелись участки без флуктуаций, участки, содержащие одиночные флуктуации и участки с большим числом флуктуации и смещением базовой линии.

74

4.5. Амплитудные и временные характеристики флуктуаций тока.

Распределение амплитуд проводимости представлено на рис.25. Распределение флуктуаций по амплитудам близко к экспоненциальному. Чем больше амплитуда импульса, тем реже он встречается в выборке. Исключение составляет группа флуктуаций с амплитудой, превышающей 60 пА. Можно предположить, что эти импульсы образуют отдельную группу. Распределение импульсов по длительностям близко к нормальному. Средняя длительность импульса составляла 0.7 секунд. Среднее квадратичное отклонение - 0.3 секунды.

Коэффициент корреляции между амплитудой импульса и его длительностью для всей выборки равен 0.3, что не может служить доказательством наличия линейной корреляционной зависимости. Однако для импульсов большой амплитуды (более 40 пА) коэффициент корреляции между амплитудой и длительностью существенно выше - 0.73 +0.13, что при уровне значимости 0,05 по критерию Стьюдента позволяет сделать вывод о значимости данной корреляционной зависимости.

Таким образом, в выборке присутствуют 2 типа импульсов: импульсы малой амплитуды (до 10 пА) и импульсы существенно большей амплитуды, длительность которых растет с ростом амплитуды.

Поскольку причиной появления импульсов тока мы считаем липидные поры, значимость коэффициента корреляции для больших импульсов говорит о диффузионном характере затекания этих пор. Для пор малой амплитуды гипотеза о диффузионном затекании не подтверждается.

Рис.25. Гистограмма амплитуд импульсов тока (куполообразная мембрана растущей площади из ГЯЛ). Среда 0.1 М КС1 без буфера.

76

Рис. 26. Гистограмма распределения импульсов тока по длительностям. ГЯЛ. Среда 0.1 М КС1 без буфера.

77

В таблице 3 представлены параметры импульсов большой амплитуды и соответствующих им липидных пор.

Средний радиус поры составил 1.2+0.3 нм, это меньше значения критического радиуса как для жидкокристаллического состояния, так и для гель-фазы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Богатырева, Наталья Эдуардовна, Москва

1. Абидор И.Г., Аракелян В.Б., Пастушенко В.Ф, Тарасевич М.Р., Черномордик Л.В., Чизмаджев Ю А. Электрический пробой бислойных липидных мембран. ДАН СССР,т. 240, N 3, с. 733-736

2. Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. М. Наука, 1982. 150 с.

3. Антонов В.Ф. Липидные поры: стабильность и проницаемость мембран. Соросовский образовательный журнал, N 10, 1998, 10-17.

4. Антонов В.Ф., Смирнова Е.Ю., Шевченко Е.В. Липидные мембраны при фазовых превращениях. Наука. 1992.

5. В.Л.Бронштейн, П.Г.Исерович. Физико-математическая модель макроскопической поры в липидном бислое при фазовом переходе. Криобиология. №6, 1983, с.22-24.

6. Р.Геннис. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М.Мир., 1997. 523 с.

7. Ивенс И., Скейлак Р. Механика и термодинамика биологических мембран. М. Мир, 1982.302 с.

8. Ивков В.Г., Берестовский Г.И. Динамическая структура липидного бислоя. М. Наука. 1981. 294 с.

9. Ивков В.Г., Берестовский Г.И Липидный бислой биологических мембран. М. Наука. 1982. 224 с.

10. Козлов М.М., Маркин B.C. Теория осмотического лизиса липидных везикул. Биологические мембраны. Т. 1N 1, 1984. Р. 74-90.

11. Красильников О.В., де Круз Ж.Б., Ногуейра P.A. Как измерить диаметр каждого входа у ионного канала, регистрируя только его проводимость? Биофизика. 1998. С. 299-303.

12. Кругляков П.М., Ровин Ю.Г. Физико-химия черных углеводородных пленок. М. Наука. 175 с.

13. Маркин B.C., Козлов М.М. (1985) Статистика пор в бислойных липидных мембранах. Биологические мембраны, 2, с.205-223.97

14. Медиков К.Ч., Самсонов A.B., Пирутин С.Н., Фролов В.А. Исследование индуцированных электрическим полем малых флуктуации проводимости бислойных липидных мембран. Биологические мембраны. 1999. т. 16, N1, с.95-102.

15. Петров В.В., Мольнар A.A., Иванов A.C., Предводителев Д.А., Антонов В.Ф. 1978. Появление одиночных каналов ионной проводимости в немодифицированных бислойных мембранах при температуре фазового перехода. ДАН СССР, т.239, N 5, с. 1245-1247.

16. Регистрация одиночных каналов. Под редакцией Б. Сакмана и Э. Неера. 1987, М., Мир

17. Сенькович O.A., Чернецкий Е.А. О размерах пор, возникающих в эритроцитах под действием детергентов. Биологические мембраны. 1997. T.14.N5. с.549-556.

18. Смирнова Е.Ю., Шевченко Е.В., Антонов В.Ф. Модель формирования одиночных ионных каналов при фазовом переходе в бислойных липидных мембранах. Биофизика. 1992. Т.37, с.394. Деп.ВИНИТИ N 4801-В91.

19. Сухарев С.И. Биофизика, 1983, т. 28. С.756-760.

20. Чернецкий Е.А., Сенькович O.A. Гемолиз эритроцитов детергентами. Биологические мембраны. 1997. T.14.N 4, с. 385-393.

21. Черномордик Л.В., Сухарев С.И., Абидор И.Г., Чизмаджев Ю.А. 1982.Исследование механизма обратимого электрического пробоя98бис дойных липидных мембран в присутствии U02 2- Электрохимия, т. 18, в. 1, с.98-102.

22. Черномордик JI.B,.Сухарев С.И,.Абидор И.Г. Долгоживущие дефекты в липидных бислоях после обратимого электрического пробоя. Биологические мембраны (1984), т.1., 1230-1237.

23. Чизмаджев Ю.А., Черномордик Л.В., Пастушенко В.Ф., Абидор И.Г. Электрический пробой бислойных липидных мембран. В Биофизика мембран. Т.2. Ионные каналы и их модели. Итоги науки и техники., ВИНИТИ, АН СССР, Москва, 1982.

24. Чизмаджев Ю.А., Черномордик Л.В., Пастушенко В.Ф. Абидор И.Г. Ионные каналы и модели. М. ВИНИТИ, 1982. С. 129-226.

25. Abidor I.G., Arakelyan V.B., Pastushenko V.F., Tarasevich M.R. Chernomordik L.V.,Chizmadzhev Yu.A., DAN SSSR 240, (1978).

26. Angersen P.C., Lovrien R.E.Human red cell hemolysis rates in the subsecond and second range. Biophys.J.,1977, v.20,N 5, p. 181-200.

27. Antonov V.F., Petrov V.V., Molnar A.A., Predvoditelev D.A., Ivanov A.S. The appearance of single-ion channels in unmodified lipid bilaer membranes at the phase transition temperature. 1980. Nature, v.283, p. 585.

28. Bangham A.D., de Gier J.O., Greville G.P. Osmotic properties and water permeability of phospholipid liquid crystals. Chem. Phys. Lipids. 1967. v.l.p.225-246.99

29. Benz R., Zimmerman U. (1981) High electric field effects on the cell membranes of Halicystic parvala. Planta 152, p. 314-318.

30. R.Benz, Zimmerman U. The resealing process of lipid bilayers after reversible electrical breakdown. BBA, 640 (1981), 169-178.

31. Blok M.C. van der Neut-Kok E.C.M., van Deenen L.L.M., de Gier J. The effect of chain lenght and lipid phase transition on the selective permeability properties of liposomes. Biochimica et biophysica acta. 1975. V.406.p.l87-196.

32. Braganza L.F., Blott B.H., Coe T.J., Melville D. Dye permeability of phase transition in single binary component phospholipid bilayers. Ibid. 1983. vol.731, p. 137-144.

33. L.V.Chernomordik, M.M,Kozlov. The shape of lipid molecules and monolayer membrane fusion. BBA. 812. (1985).643-655.

34. L.V.Chernomordik, Abidor I.G. The voltage-induced local defects in unmodified BLM. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 7(1980), p.617-623.

35. Chernomordik L.V., Sukharev S.I., Abidor I.G., Chizmadzhev Yu.A.1982. The Study of the BLM Reversible Electrical Breakdown Mechanism in the Presence of U02+2. Bioelectrochem. Bioenerg., v.9, p. 149-155.

36. Coster H.G.L. A quantitative analysis of the voltage-current relationships of fixed charge membranes and associated property of «punch-through». Biophys. J. , 1965, V.5, P.669-686.

37. Coster H.G.L., Simon R. Energy of formation of bimolecular lipid membranes. BBA, 163 (1968), p.234-239.

38. Crowly J.M. Electrical breakdown of bimolecular lipid membrane as an electromechanical instability. Biophys.J., 1973,V.7, p.617-623.

39. B.V. Derjaguin, A.V.Prikhorov. On the Theory of the Rupture of Black Films. J. of Colloid and Interface Science(1981). Vol.81, N 1, p. 108-115.

40. B.V. Derjaguin, Gutop Yu. V. Kolloid. Zh. 24. 431 (1962).100

41. Dimitrov D.S., Jain R.K.(1984), Membrane stability, Biochimica et Biophysica acta, 779, (1984), .p.437-468.

42. Exerova D., Balinov B., Nikolova A., Kashchiev D. (1983) J. Colloid. Interface Sci.95, 289-291.

43. Fahey P.F., Webb W.W. Lateral diffusion in phospholipid bilayer membranes and multilamellar liquid crystals. Biochemistry, 1978, v. 17, 3046-3053.

44. R.W.Glaser, S.L.Leikin, L.V.Chernomordik, V.F.Pastushenko, A.I.Sokirko. Reversible electric breakdown of lipid bilayers: formation and evolution of pores. BBA, 940 (1988), p.275-287.

45. Habermann E.(1972), Bee and wasp venoms. Science, 177, p.314-322.

46. Helfrich, The size of bilayer vesicles generated by sonication. Phys. Lett. 50A, 115(1974).

47. Hiram Y., Nir A., Zender O.Tensile strength of the chromaffine granule membrane. Biophys.J., 1982,v.39, N3,p.65-80.

48. Hoffinan J. F. J .Gen. Physiol., 1958, v.42, N3, p.9-23.

49. Hulsheger H., Niemann E-G. Lethal effect of high-voltage pulses on E. Coli K12. Radiat.Envirin. Biophys, 1980, V.18, p.281-288.

50. Hulsheger H, Potel J., Niemann E-G. Killing of bacteria with electric pulses of high strenth. Radiat.Envirin. Biophys., 1981, V.20, P.53-65.

51. Ion channels.A practical approach.Ed.R.H.Ashley. 1995.p.290.

52. Israelashvili J.N., Pashley R.M. Measurement of the hydrophobic interaction between 2 hydrophilic aqueous-electrolyte solutions. (1984). J. Colloid. Interface.Sci., v. 98, p.500-514.

53. Israelashvili J.N., Marcelja S, Horn R.G. Physical principles of membrane organization. Quart. Rev. Biophys. 1980. Vol. 13, P. 121-200.

54. Israelashvili J.N., Mitchell D.J., Ninham B.W. Theory of selfassembly of lipid bilayers and vesicles.Ibid., 1977,vol.470, P. 185-201.

55. Kashchiev D., Exerova D. (1973). Biochim.Biophys. Acta. 732., 133-145.101

56. Katchalsky A., Kedem O., Klibansky C., de Vries A. In: Flow properties of blood and other biological systems. N.Y.: Pergamon Press. 1600,p. 155-160.

57. Lee A.G. Lipid phase transitions and phase diagram. I. Lipid, phase transitions. Biochem. etbiophys. Acta. 1977. Vol. 472.P.237-281.

58. J.D.Litster, Phys. Letters 35A, 193 (1975).

59. Marcelja S. (1977) Structural contribution to solute-solute interaction. Croatica Chemica. Acta 49, 347-357.

60. Moran A., Ilani A. Surface tension of the artificial bilaflet membrane in comparison to parent lipid solution-water interfacial tension. Chemistry and Physics of Lipids, 4 (1970), P. 168-180.

61. O.G. Mouritsen. Theoretical models of phospholipid phase transitions. Chemistry and physics of lipids. 57 (1991), p. 179-194.

62. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.Ti., Wescott W.C. Reconstruction of cell membranes structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 1962. Vol. 194.p.979-980.

63. Nuhn P., Shenk P., Richter H. et al. Untersuchungen an Liposomen aus hydriertem Eilecitin. Pharmazie. 1985. Vol.40. P 705-709.

64. Papahadjopoulos D., Niz S., Ohki S. Permeability properties of phospholipid membranes.Ibid. 1972.v.226.p.561-583.

65. Parsegian A. Energy of an ion crossing a low dielectric membrane solution to four relevant electrostatic problems. Nature, 1969, v.221, N 5183, p.844-846.

66. Pastushenko V.F., Chizmadzhev Yu.A., Arakelyan V.B. Electric Breakdown of Bilayer Lipid Membranes. II. Calculation of the membrane lifetime in the steady-stable diffusion approximation. Bioelectrochem. Bioenergl979., v.6, p.53-63.

67. Patel H.M., RymanB.E. Biochem.Soc.Trans.,1974, 2, 1014-1017.

68. Petrov A.G., Mitov M.D., Derzhansky A.I. (1980). Edge energy and pore stability in bilayer lipid membranes In Advances in Liquid Crystal Research and Applications, p. 695-737, Oxford/Budapest.102

69. Pink D.A. (1982) Theoretical models of phase changes in one- and two-component lipid bilayers, biological membranes.(D.Chapman, Ed). vol.4,p. 131-178, Academic Press, New York.

70. Pollard H.B.,Tack-Galdman K., Pazoles C.J.,Creuts C.E., Shulman N.R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA,1978,v.74,N12,p.5295-5299.

71. Ponder E. In: Hemolysis and related phenomena. N. Y. Grune and Stratton, 1948, p. 3-75.

72. Ponder E. In: Red cell structure and its breakdown. Wien: Springer, 1955, p.11-153.

73. K.T.Powell, J,C.Weaver. Transient aqueous pores in bilayer membranes: a statistical theory. Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 15(1986), p.211-227.

74. Rand R.P. (1981) Annu. Rev.Biophys. Bioenerg.10, 277-314.

75. Rand R.P. Biophys.J4, 303-316.

76. Rand R.P., Burton A.C. (1964) Mechanical properties of the red cell membranes. Biophys.J.4. 115-135.

77. Sale A.J.H., Hamilton W.A., Effects of high electric fields on microorganisms. I. Killing of bacteria and yeast. BBA. 1967, V.148, p.781-788.

78. Sale A.J.H., Hamilton W.A., Effects of high electric fields on microorganisms. II. Mechanism of lethal effect. BBA, 1967, V.148, p.789-900.

79. Sale A.J.H., Hamilton W.A., Effects of high electric fields on microorganisms. III. Lysis of erythrosytes and protoplasts.BBA, 1968, V.163, p.37-43.

80. Sudhoff T.C. Core structure, internal osmotic pressure and irreversible structural changes of chromaffin granules during osmometer behaviour. BBA, 1982,v.684, N1, p.27-39.103

81. Tien H. T. Black lipid membranes in aqueous media: interfacial free energy measurements and effect of surfactants on film formation and stability. The Journal of Physical Chemistry, v. 71, p.3395-3402.

82. Tien H. T. Bilayer lipid membrane (BLM): theory and practice. Marcel Dekker. New York, 1974.

83. Toupin C., Dvolaitzky M., Sauterey C. Biochemistry, 1975, v. 14, N 21, p.4771-4775.

84. Weaver J.C., Mintzer R.A. Decreased bilayer stability due to transmembrane potentials. Phys. Lett., 1981,v.86A,Nl, p.57-59.

85. Weaver J.C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. J.Cell.Biochem., 1993, V. 51, N 4, P. 426-435.

86. Williams E.J., Bradley J. Steady-state membrane hyperpolarization by large applied currents in Nitella translucens. Biophys.J., 1968, V.l, P. 145-147.

87. Winterhalter M., Helfrich W. Effect of voltage on pores in membranes. Rapid communications. Physical review A., (1987), v.36, p.5874-5876.

88. T-X. Xiang, B.D.Anderson. Permeability of acetic acid across gel and liquid-crystalline lipid bilayers conforms to free-surface-area theory. Biophysical Journal. 72 (1997) 223.

89. Zimmerman U., Pilwat G., Riemann F. (1974). Dielectric breakdown of the cell membranes. Biophys.J., 14, p. 881-889.

90. Zimmerman U., Schultz J, Pilwat G., (1973) Biophys.J., 13, p. 1005-1013.

91. Zingsheim H.P, Neher E. The equivalence of fluctuation analysis and chemical relaxation measurements: a kinetic study of ion pore formation in thin lipid membranes. Biophysical Chemistry. 2 (1974). P. 197-202