Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Межмембранные взаимодействия на коротких расстояниях. Исследование с помощью рассеяния нейтронов и рентгеновских лучей

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Межмембранные взаимодействия на коротких расстояниях. Исследование с помощью рассеяния нейтронов и рентгеновских лучей"

о.сковский физико-техническии институт

Факультет физико-химической биологии

кафедра молекулярной биофизики

^ 19-97-300

На правах рукописи

ЧЕРЕЗОВ Вадим Геннадьевич

МЕЖМЕМБРАННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НА КОРОТКИХ РАССТОЯНИЯХ. ИССЛЕДОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ РАССЕЯНИЯ НЕЙТРОНОВ И РЕНТГЕНОВСКИХ ЛУЧЕЙ

Специальность: 03.00.02 — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Долгопрудный 1997

Работа выполнялась в Лаборатории нейтронной физики им. И.М. Франка Объединенного института ядерных исследований (г. Дубна) и Московском физико-техническом институте.

кандидат физико-математических наук В.И. Горделий

доктор физико-математических наук Г.Н. Берестовский

доктор химических наук И.А. Василенко

Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

4о

Защита состоится¿УЛ 1997 года в^ часов на заседании Диссертационного совета К 063.91.10 при Московском физико-техническом институте по адресу. 141700, г.Долгопрудный Московской обл., Институтский пер., 9.

С диссертацией можно ознакомиться в Диссертационном совете К 063.91.10 при Московском физико-техническом институте.

Автореферат разослан " /<? " нал'ьрл 1997 г.

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведущая организация

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат физико-математических наук

В.Б. Киреев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность. Вопрос о природе взаимодействий между липндными мембранами на коротких расстояниях является в настоящее время одной из центральных проблем мембранной физики, не получившей до сих пор однозначного ответа.

Важность исследований данного вопроса неоценима с различных точек зрения. В биофизике липидпые мембраны рассматриваются в качестве подходящей модели биологических мембран. Сохраняя в общих чертах их основные физические свойства, лишщные мембраны значительно проще биологических мембран и удобнее для исследований физическими методами. В медицине липидные везикулы широко применяются для переноски и целенаправленной доставки необходимых лекарств к определенным органам. Липиды активно используются в косметической промышленности для создания легко проникающих в кожу препаратов. Привлекательно использование липидных мембран в электронной и фото промышленности в качестве ультратонкпх пленок с заданными свойствами для создания мнкросснсоров, датчиков и т.п. Помимо широкого практического значения содержание работы представляет особый интерес для коллоидной физики, физики жидких кристаллов п статистической физики.

Несмотря на достаточно продолжительную историю исследований в данной области, ряд ключевых проблем до сих пор остается открытым. Среди них особо следует отметить вопрос о природе короткодействующего отталкивания между липидными мембранами в воде [1], доминирующего на расстояниях до 20+30 А и не объясняемого общепринятой теорией устойчивости коллоидов Дерягина-Ландау-Фервея-Овербека (ДЛФО). Похожее взаимодействие было обнаружено также между молекулами ДНК, полисахаридами и молекулами коллагена [2,3]. До настоящего времени ведутся широкие дискуссии по поводу возможной интерпретации экспоненциального отталкивания между липндными мембранами, для объяснения которого выдвинуты две основные принципиально различающиеся гипотезы: шдратационных сил, возникающих из-за структурирования воды вблизи гидрофильных поверхностей, и энтропийного отталкивания, связанного с тепловыми флуктуациями отдельных липидов из

плоскости мембраны [1,2,4]. Не вполне ясен вклад тепловых длинноволновых флуктуаций липидных мембран в баланс сил при нормальных условиях [5]. Непосредственно относящимися к этим вопросам являются такие принципиальные проблемы, как адгезия и слияние мембран, а также переход от связанного мультислойного состояния к несвязанному (отдельные мембраны) [6].

Цель настоящей работы состояла в изучении природы короткодействующего взаимодействия между липидными мембранами, а также в определении относительного вклада отталкивания, связанного с длинноволновыми тепловыми флуктуациями мембран, в общий баланс межмембранных сил.

Научная новизна. Для решения поставленных в настоящей работе задач был использован ряд новых подходов, таких как совместное использование упругого и неупругого рассеяния нейтронов при исследовании межмембранных взаимодействий, а также детальный анализ формы дифракционных пиков от мультислойных структур. Очень эффективными оказались также такие специальные приемы, как, например, использование полимеризуемых липидов для подавления флуктуаций отдельных липидов из плоскости мембраны и температурные измерения в качестве инструмента для проверки существующих теорий межмембранных взаимодействий.

В настоящей работе впервые была изучена возможность исследования тепловых длинноволновых флуктуаций липидных мембран с помощью нейтронного спин-эха и определен модуль изгиба липидных мембран этим методом. Впервые было предложено определять толщину липидных * мембран методом малоуглового рассеяния нейтронов при исследовании температурной зависимости баланса межмембранных взаимодействий.

Использованные в работе подходы позволили получить ряд принципиально новых результатов о доминирующей роли энтропийного отталкивания во взаимодействии между липидными мембранами. Впервые было продемонстрировано существование перехода от связанного состояния (липидные мультислои) к несвязанному (отдельные мембраны) для липидных мембран из димиристоилфосфатидилхолина и показано, что он происходит при температурах (Т~70-5-80°С) близких к физиологическим.

Практическая ценность работы. Полученные результаты имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. Разработанные методики и

подходы представляют не только ограниченный интерес для исследования проблем, поставленных в данной работе, но также могут служить основой для решения более широкого круга новых задач. Представленные данные по вопросу межмембранных взаимодействий исключительно важны для понимания физики основных процессов, происходящих в живой клетке с участием мембран, а также могут быть использованы для усовершенствования технологических процессов при практическом применении липидных мембран.

Апробация работы. Основные положения работы и ее отдельные результаты докладывались на международном семинаре по исследованию биологических и липидных мембран (Дубна, май 1991, 1992); традиционной конференции студентов и аспирантов МФТИ (Долгопрудный, декабрь 1992); международной конференции "Neutron scattering applications" (ГТрага, октябрь 1995); международной конференции "Horizons in small-angle scattering from mesoscopic systems" (Стромболи, сентябрь 1995); 11 симпозиуме "Surfactants in solutions" (Иерусалим, июль 1996), международной конференции по жидким мембранам и полимерам (Берлин, сентябрь 1996), конференции молодых ученых (Дубна, март 1996).

Структура и объем диссертаиии. Работа состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем диссертации составляет 119 страниц машинописного текста, включая 60 рисунков, 10 таблиц и 147 библиографических ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во введении показана актуальность исследуемой темы, перечислены основные проблемы, стоящие в данной области, сформулированы цели и главные идеи работы, а также кратко описана структура диссертации.

Первая глава посвящена обзору литературных данных. Обзор содержит основные сведения о структуре и свойствах биологических и липидных мембран. Подробно описаны свойства и характер главного фазового перехода в мембранах. Особое внимание уделено анализу экспериментальных и теоретических работ по исследованию межмембранных взаимодействий.

В обзоре охарактеризовано современное представление о балансе сил, действующих между липидными мембранами, которое заключается в следующем. На коротких расстояниях ((1Ж<2СМ-30 А) между липидными мембранами доминирует короткодействующее экспоненциальное отталкивание. Оно быстро спадает при удалении мембран и нэ. расстояниях с1 и/""' 20-=-30 А в случае нейтральных мембран уравновешивается притяжением Вап-дер-Ваальса,

А

имеющим вид: Ру<..у=—

6л

2 Л

, где А - константа

с13 (с1^2с1ь)3 (с1ш+аь)3 Гамакера, - расстояние между мембранами, с!ь - толщина липидного бислоя. Кроме вышеперечисленных сил между липидными мембранами действует также стерическое отталкивание, связанное с тепловыми длинноволновыми колебаниями (ондуляциями) мембран, которое более подробно будет обсуждено ниже.

Для объяснения короткодействующего взаимодействия между липидными мембранами к настоящему времени предложены две основные принципиально противоположные гипотезы: 1) гидратационпых сил и 2) энтропийного отталкивания. В теории гидратационпых сил предполагается, что структура воды вблизи гидрофильных поверхностей отличается от объемной. При сближении таких поверхностей между ними появляется экспоненциальное отталкивание с длиной спадания, зависящей от корреляционной длины в жидкости и от корреляций в расположении локальных зарядов на поверхности.

Альтернативная теория энтропийного отталкивания предполагает существование значительных тепловых флуктуаций отдельных липвдов с поверхности мембраны. Из-за ограничения конфигурационной свободы при сближении мембран между ними возникают стернческие силы отталкивания, имеющие чисто энтропийную природу. Силы являются экспоненциальными, и их длина спадания зависит от амплитуды флуктуаций отдельных липидов с поверхности, которая, в свою очередь, определяется энергией переноса углеводородов в жидкую фазу. В многочисленных работах предложены свои аргументы за и против той или иной теории. Прямого экспериментального подтверждения какой-либо из гипотез не существует, хотя долгое время гидратационная теория считалась единственным возможным объяснением короткодействующего отталкивания. Основной причиной противоречий служит

недостаточное количество надежной информации о структуре границы раздела вода/мембрана в различных мембранных системах и при различных условиях, в то время как обе теории основываются именно на свойствах этой границы. Ситуация усложняется трудностью определения межмембранного расстояния в лнпидных мультислоях, не имеющих строгого кристаллического порядка.

Наряду с проблемой природы короткодействующего отталкивания большой интерес представляет влияние тепловых длинноволновых флуктуации (ондуляций) лнпидных мембран на межмембранные взаимодействия. Такие флуктуации также вызывают стерическое энтропийное отталкивание между липидными мембранами, называемое ондуляционным. Ондуляционные силы являются далыюдействующими. Они спадают обратно пропорционально третьей

« я V р Зтг(кТ)2 степени расстояния и зависят от модуля изгиба мембраны Кс.- РиЛ11 = . .

04|\С0Ш

Хотя существование ондуляционного отталкивания не вызывает сомнений, точный вклад его в общий баланс межмембранных взаимодействий неизвестен. Предполагается, что ондуляционное отталкивание может играть значительную роль при взаимодействии свободных мембран в избытке воды. С далыгодействующим характером ондуляционных сил (на расстояниях больших толщины липидного бислоя они спадают медленнее притяжения Ван-дер-Ваальса) связана теоретическая возможность существования для нейтральных мембран перехода от связанного мультислойного состояния к отталкиванию мембран и распаду мультислоев на отдельные липидные везикулы.

В заключении главы отмечено, что решение проблем межмембранных взаимодействий лежит на пути прецизионного исследования структуры и динамики поверхности мембран, а также отмечено, что методы рассеяния нейтронов и рентгеновских лучей обладают подходящим пространственным и энергетическим разрешением для исследования структуры, динамики и взаимодействий лнпидных мембран. Особенно подчеркивается эффективность совместного использования обоих типов излучения.

Во второй главе приведены описания материалов и методов, использованных в настоящей работе. Рассмотрены теоретические основы методов рассеяния, включающих дифракцию, малоугловое рассеяние и нейтронное спин-эхо. Подробно описаны способы приготовления образцов: ориентированных и

неориентированных липидных мультислоев и бислойных липидных везикул в растворе. Представлены краткие характеристики и схемы установок, на которых были проведены основные эксперименты.

В третьей главе обсуждаются проведенные работы по определению энтропийного вклада в короткодействующее отталкивание между липидными мембранами. Основная идея заключалась в исследовании эффекта подавления тепловых флуктуаций отдельных липидов из плоскости мембраны на межмембранное взаимодействие. Одним из способов уменьшения тепловых флуктуаций является понижение температуры в системе. При этом, однако, липидные мембраны переходят в другие фазовые состояния с изменением латеральной структуры поверхности, что может повлечь за собой изменения ка£ энтропийных, так и гидратационных сил. Более интересным было бы устранение тепловых флуктуаций липидов из плоскости мембраны без нарушения

Для этой цели в настоящей работе были использованы

синтезированные в Московском институте тонкой химической технологии полимеризуемые

липиды 1,2-ди(тетрадека-11,13-диеноил)-8п-глицеро-3-фосфохолин (ДТДФХ) [7]. Липиды являются аналогами природных

фосфолипидов димиристоил-

фосфатидилхолинов (ДМФХ), за исключением наличия сопряженных диеновых групп на концах обеих углеводородных цепочек. В бислое липиды легко полимеризуются, образуя разветвленный полимерный матрикс, устойчивый по отношению к воздействию органических растворителей и детергентов. С помощью дифракции рентгеновских лучей была изучена структура полимерных мембран из ДТДФХ. На рис.1 приведены профили электронной плотности полимерных мембран при различных гидратациях, построенные с использованием 6 дифракционных порядков. Моделирование электронной

латеральной структуры поверхности.

Рис.1. Профили электронной плотности полимерных мембран из ДТДФХ при нескольких значениях относительной влажности Профили сдвинуты по вертикали для наглядности.

плотности мембран ступенчатой функцией показало, что 1) толщина полимерной мембраны равна 43 А и не изменяется при увеличении гидратации, 2) углеводородные цепи липидов вытянуты и направлены по нормали к мембране, а также 3) существует частичное взаимное проникновение концов углеводородных цепей из противоположных монослоев. При этом наиболее вероятным представляется образование ковалентных сшивок между липидами из противоположных монослоев при полимеризации. Независимые исследования методом ЯМР [7] и проведенные измерения широкоугловой рентгеновской дифракции показали, что локальная динамика полярных групп липидов и латеральная структура мембраны после полимеризации близки к состоянию обычных мембран в жидкокристаллической фазе. Флуктуации отдельных липидов из плоскости в полимерной мембране при этом практически полностью отсутствуют благодаря разветвленной полимерной сети, связывающей вместе ближайшие липиды и липиды из различных монослоев.

Измерение сил, действующих между полимерными мембранами из ДТДФХ (см. рис.2) показало драматический эффект подавления тепловых флуктуаций отдельных липидов из плоскости мембраны на межмембранное отталкивание. Было обнаружено резкое уменьшение длины спадания экспоненциального отталкивания от Х.=2.1 А для обычных мембран из ДМФХ до А,=0.75 А для полимерных мембран из ДТДФХ. Равновесное расстояние между полимерными мембранами из ДТДФХ при отсутствии внешнего давления (относительная влажность Ч'=100%) не превышало 4.5 А (меньше двух молекулярных слоев воды).

Такой эффект не может быть объяснен в рамках гидратационной теории, которая в этом случае требует значительного изменения в латеральной упаковке полярных голов после полимеризации, чего не было обнаружено. Таким образом, в работе было предположено доминирование энтропийных сил, связанных с

Межмембранное расстояние, А

1'ис.2. Зависимость отталкивания между полимерными мембранами из ДТДФХ от расстояния

тепловыми флуктуациями отдельных лшшдов из плоскости бислоя, и отталкивании между обычными фосфолиииднымн мембранами на коротких расстояниях.

В заключении было продемонстрировано, что оставшееся после полимеризации лилпдов очень короткодействующее отталкивание с длиной спадаггия /1-0.7 А может быть объяснено сгернчсским отталкиванием гидратированных полярных групп линндов.

Помимо обсуждения основных экспериментов по определению энтропийного вклада в межнембранное взаимодействие, в третьей главе проведено исследование точности определения параметров короткодействующего отталкивания между липидными мембранами. Для этой цели использовались ориентированные липидные мультислои из дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ). Внешнее давление задавалось, поминая образцы в атмосферу с заданной влажностью. Межмембранное расстояние определялось широко распространенны;,« методом, использующим расстояние между максимумами на профилях электронной плотности лшшдных мембран. При каждой влажности было измерено до 9 дифракционных порядков от липидных мультислоев. Измерения проводились на рентгеновском дифрактометре ДРОН-4. Основные результаты проведенных исследований заключаются в том, что определяемые параметры экспоненциального отталкивания сильно зависят от количества дифракционных порядков (разрешения), используемых для реконструкции профилей электронной плотности. Было показано, что в случае, когда толщина липидного бислоя изменяется с гидратацией, точность определения длины спадания сил отталкивания таким методом может быть очень низка.

Основные выводы третьей главы:

1) показано, чго простое гидратациопное взаимодействие не распространяется дальше одного молекулярного слоя воды (~3 А) от поверхности липидных мембран;

2) на коротких межмембранных расстояниях (ё» <4-5-5 А) основную роль предположительно играет стерическое отталкивание гидратированных полярных голов липядов из противоположных мембран;

3) энтропийное взаимодействие, возникающее из-за флуктуации отдельных липидов с поверхности мембраны, доминирует на расстояниях (1«>4-н5 А.

Четвертая глава посвящена исследованию межмембранных взаимодействий вблизи температуры главного фазового перехода. Помимо проблемы, связанной с природой короткодействующего взаимодействия между липидными мембранами, исключительный интерес представляет вопрос о роли отталкивания, связанного с тепловыми длинноволновыми флуктуациями (ондуляциями) мембран, в общем балансе сил. Измерения зависимостей сил отталкивания от расстояния между мембранами обычно содержат мало информации об ондуляционном взаимодействии. Причиной этому служит тот факт, что ондуляционное отталкивание является дальнодействующим и на малых расстояниях значительно уступает преобладающему короткодействующему взаимодействию. Заметный вклад в общий баланс сил ондуляционное отталкивание может вносить только на больших расстояниях при отсутствии внешних сил, когда отталкивание между мембранами уравновешивается притяжением Ван-дер-Ваальса. Таким образом, альтернативным подходом к исследованию межмембранных взаимодействий может служить изучение отклика системы не на внешнее давление, а на изменение других параметров, например, температуры.

Для оценки относительного вклада тепловых ондуляций в баланс межмембранных взаимодействий очень интересной оказалась область вблизи температуры главного фазового перехода (Тга). Как было установлено в ряде работ температура главного фазового перехода для липидных мембран из ДМФХ близка к критической. При приближении к Тт были экспериментально обнаружены аномалии в проницаемости ионов сквозь мембрану, латеральной сжимаемости, поглощении ультразвуковых колебаний и т.д., которые являются следствием значительного увеличения флуктуаций плотности в плоскости мембраны. Эффект в большинстве случаев довольно существенен и локализован в районе 5 -*-10° вблизи Тт.

Недавно с помощью малоугловой дифракции нейтронов было обнаружено аномальное увеличение периода повторяемости мультислойных мембран из ДМФХ в избытке воды вблизи температуры главного фазового перехода [8]. Оценив толщину мембран при каждой температуре, используя моделирование рассеивающей плотности бислоя ступенчатой функцией и подгоняя экспериментальную кривую рассеяния до второго порядка отражения теоретической кривой рассеяния , авторы заключили, что вблизи Тга происходит

аномальное увеличение равновесного межмембранного расстояния. Такой эффект был приписан увеличению ондуляциондого отталкивания между мембранами, происходящему из-за уменьшения модуля изгиба, связанного с возрастанием флуктуации плотности мембраны в псевдокритической области. Однако, малая точность определения толщины мембран таким способом не позволяет делать строгого утверждения и оставляет возможность увеличения толщины бислоя вблизи Тт без изменения баланса межмембранных взаимодействий [9].

В настоящей работе предложен альтернативный способ определения толщины бислоя с помощью малоуглового рассеяния нейтронов на одиночных липидных везикулах. Для оценки точности определения толщины мембран таким способом были проведены исследования структуры лигшдных мембран из ДМФХ методом вариации контраста при двух температурах Т=180С (гель фаза) и Т=3()°С (жидкокристаллическая фаза). Была показана возможность определения толщины лигшдного бислоя из радиуса инерции толщины мембран из ДМФХ в 020 как в гель, так и в жидкокристаллической фазе с точностью до 0.5 А.

68

< 87 X*

I: ее

0

5 65

С.

3 64

1 63 П

% 62 И.

С 61

Температуря, "С

Температура, °С

Рис.3. Температурные зависимости а) периода

повторяемости мультислоев, б) толщины липидных мембран и в) межмембранного расстояния для лигшдных мембран из ДМФХ в избыбгке 0 0. Стрелкой отмечена температура фазового перехода, определенная по исчезновению пика от риппл-фазы.

Температура, °С

Измерение зависимости межмембранного расстояния от температуры вблизи главного фазового перехода проводились на спектрометре малоуглового рассеяния нейтронов ЮМО импульсного реактора ИБР-2 (Дубна). При каждой

температуре одновременно определился период повторяемости мультпелоев d из ДМФХ в избытке D20 и толщина одиночных мембран dn. Межмембранное расстояние dw рассчитывалось как разность: dw=d-dn (см. рпс.З). На рис. Зв хорошо виден эффект аномального увеличения равновесного межмембранного расстояния в избытке воды при приближении к температуре главного фазового перехода. Такое возрастание равновесного межмембранного расстояния при приближении к Тп, является следствием нарушения баланса межмембранного взаимодействия в этой области. Наиболее вероятным, по-видимому, является увеличение ондуляционного отталкивания, происходящее из-за уменьшения модуля изгиба мембраны Кс- Предполагается, что возрастание флуктуаций плотности в плоскости мембраны при приближении к псевдокритической температуре приводит к уменьшению жесткости мембраны. Для проверки данной гипотезы было проведено измерение температурной зависимости модуля изгиба мембран из ДМФХ методом нейтронного спин-эха.

Традиционным способом определения модуля изгиба липидных мембран является Фурье-анализ снимков флуктуирующих мембран, записанных на видеокамеру, используя фазовый контрастирующий микроскоп. Однако недостатки данного метода: ограниченное количество анализируемых снимков, малое пространственное и временное разрешение, множество допущений, использующихся при обработке, приводят к различающимся почти на порядок у разных авторов модулям изгиба для одних и тех же мембран. В настоящей работе была впервые предпринята попытка определения модуля изгиба липидных мембран с помощью нейтронного спин-эха, метода обладающего подходящим временным и пространстгенным разрешением для исследования ондуляций липидных везикул с радиусом 100-;-500 Ä.

Предварительные измерения липидных везикул на сшш-эхо спектрометре и компьютерные моделирования спин-эхо сигнала показали заметную чувствительность метода к тепловым длннноволнозым колебаниям липидных мембран и позволили выбрать оптимальные условия (размер липидных везикул, длина волны нейтронов, угол рассеяния) для исследования температурной зависимости модуля изгиба.

Измерения проводилась на нейтронном спин-эхо спектрометре MESS н Лаборатории Леона Бриллюзна (Сакле, Франция) при длине волны нейтронов

Х=6 А, угле рассеяния 6° (вектор рассеяния срО.ЮОб А1), в диапазоне температур от 20°С до 32°С. В качестве образцов использовался 4% раствор (по весу) однослойных липидных везикул из ДМФХ, полученных путем экструдирования мультислойных везикул через ядерные фильтры с диаметром пор 100 нм, в 020. Было показано, что при температурах ниже фазового перехода (Т<23.5°С) спин-эхо сигнал хорошо описывался только диффузионным вкладом. Из определенного коэффициента диффузии был оценен средний гидродинамический радиус везикул Яь=450 А в гель фазе. При Т>23.5°С спектры нейтронного спин-эха подгонялись по формуле, учитывающей как поступательную диффузию липидных везикул, так и тепловые ондуляции мембран, с модулем изгиба Кс в качестве свободного параметра. Полученная таким образом зависимость модуля изгиба липидных мембран из ДМФХ от температуры показана на рис.4.

Как видно из рис.4, для мембран из

ДМФХ в жидко-кристаллической

фазе Кс=(1.5±0.2)1012 эрг, что

находится в пределах значений

модуля изгиба, полученных

разными авторами для больших

(диаметром 0~10мкм) везикул

Кс~(0.5-2.4)1012 эрг. При

приближении к температуре , Рис.4. Зависимость модуля изгиба липидных

фазового перехода заметно мембран из ДМФХ от температурь,.

уменьшение модуля изгиба до 1012эрг и затем его резкое увеличение при переходе в гель-фазу. Приведенные оценки показали, что уменьшение модуля изгиба в 1.5 раза вполне может объяснить возрастание равновесного межмембранного расстояния, полученное с помощью малоуглового рассеяния нейтронов.

Обнаруженная аномалия в температурной зависимости модуля изгиба вблизи фазового перехода может иметь важное биологическое значение. Межмембранное взаимодействие может контролироваться приближением к критической области, что при постоянной внешней температуре на клеточном уровне может достигаться путем варьирования вида и состава липидов в биологической мембране, а также путем растворения в мембране малых молекул, таких как холестерин, грамицидин и т.д., изменяющих жесткость мембраны.

■ I ■' ■11 ■ ■ ■ ■ I' ■' ■ I ■ ■ ■ ■ I ■1 ■ ■ I ■ ■ ■ ■ I'

24.0 24 5 25.0 25 5 26.0 26 5 27.0

Температура, °С

Основные выводы четвертой главы:

1. Показано, что вблизи температуры главного фазового перехода происходит аномальное увеличение равновесного расстояния между липидными мембранами в избытке воды, являющееся следствием нарушения баланса межмембранных взаимодействий;

2. Получено экспериментальное подтверждение гипотезы о возрастании ондуляционного отталкивания между липидными мембранами вблизи температуры фазового перехода.

Б пятой главе представлены результаты по температурной зависимости межмембранных взаимодействий п широком диапазоне температур. Существующие в настоящее время гипотезы о природе отталкивания между липидными мембранами на малых расстояниях дают различные зависимости сил от температуры. Поэтому одной из возможностей разделить вклад от разных компонент является исследование межмембранного взаимодействия в широкой интервале температур.

Температура, °С

Температура. "Г

Рис.5. Температурные зависимости а) периода повторяемости, б) толщины лппидного бислоя и в) межмембранног о расстояния дня липидных мембран из ДМФХ в избьпке О О,

Температура, °С

Были проведены одновременные измерения периода повторяемости мультислоев из ДМФХ в избытке ОгО и толщины липидных мембран с помощью

40

малоуглового рассеяния нейтронов в диапазоне температур от 30°С до 95°С на малоугловом спектрометре РАХЕ в Лаборатории Леона Бриллюэна (Сакле, Франция). Полученные зависимости периода повторяемости, толщины липидного бислоя и равновесного межмембранного расстояния от температуры показаны на рис.5. Из рис.5 хорошо видно, что увеличение периода повторяемости при Т>70°С происходит за счет сильного роста межмембранного расстояния при повышении температуры. Такое поведение характерно для доминирования энтропийного отталкивания, но не может быть объяснено в рамках гидратационной гипотезы, поскольку в этом случае надо было бы предполагать увеличение структурирования воды при повышении температуры.

Кроме эффекта увеличения равновесного межмембранного расстояния с температурой с помощью малоуглового рассеяния нейтронов было также показано, что при Т>70-ь80°С происходит частичный распад мультислоев на отдельные липидные везикулы. Для получения дополнительной информации о балансе межмембранных сил в том же диапазоне температур был проведен анализ формы дифракционных пиков от липидных мультислоев в избытке D2O с помощью дифракции рентгеновских лучей высокого разрешения.

Интенсивность рассеяния от липидных мультислоев может быть записана в виде

где S(q) - так называемый, структурный фактор, характеризующий корреляции в расположении слоев, F(q) - форм-фактор, представляющий собой Фурье-преобразование плотности рассеяния липидного бислоя. В случае идеально периодичной системы S(q) содержит набор отдельных узких пиков, расположенных на одинаковом по q расстоянии друг от друга. Тепловые длинноволновые флуктуации липидных мембран нарушают порядок в системе и оказывают значительное влияние на дифракцию от мультислоев, изменяя форму дифракционных пиков. Пики приобретают длинные, спадающие

. I 1-0-4) q2kT

по степенному закону, хвосты S(q) - |q — qh| , где параметр т| = g Jkb зависит

от модулей сжатия В и изгиба К мультислоев. Поскольку Т] имеет довольно сильную зависимость от q (r|~q2), начиная с некоторого порядка отражения сингулярность в выражении для S(q) пропадает и дифракционные пики становятся ненаблюдаемыми.

функция разрешения

Рис.6. Первые дифракционные пики от неориентированных липидных мультислоез из ДМФХ в избытке D20 (после вычета фона и нормировки на единицу) при нескольких температурах.

Измерения первого дифракционного пика от неориентированных мультислоев

нз ДМФХ в избытке D20 (30% липидов по весу) с высоким разрешением в

широком диапазоне температур от 30 С до 95°С были проведены на

высокопоточном рентгеновском спектрометре ГО2 Европейского синхротронного

источника. Разрешение в использованной конфигурации полностью определялось

разрешением детектора и составляло

-10-3Â-' (полная ширина на половине

высоты). Полученные спектры при

нескольких температурах после

радиального усреднения по детектору,

вычета фона и проведения

нормировки представлены на рис.6.

Дифракционные пики при всех

температурах имеют длинные хеосты,

Рис.7. Примеры подгонки формы первого С1ШЫЮ асимметричны, при

дифракционного пика после проведения г

поправки на форм-фактор при нескольких увеличении температуры уширяются, температурах.

а их интенсивность существенно падает (не показано).

Во всех опубликованных до настоящего времени работах по исследованию формы дифракционных пиков авторы пренебрегают зависимостью форм-фактора от вектора рассеяния, мотивируя это тем, что Р^) изменяется гораздо слабее, чем Б^) в непосредственной близости от центра дифракционного пика. В настоящей работе показано, что на расстояниях Дq=10"2A-1 от центра пика (интервал, обычнс используемый при анализе формы пика) отклонение интенсивности, связанное с форм-фактором может достигать 20%, чего нельзя не учитывать при обработке экспериментальных данных. В работе был предложен способ проведения поправки на форм-фактор и показано, что при всех температурах асимметрия пика исчезает после такой коррекции.

После проведения поправки форма дифракционных пиков в широком интервале векторов рассеяния Дд=2-10-2А-1 подгонялась по формуле, описывающе1! рассеяние от набора мультислоев, в которых отдельные слои совершают тепловые длинноволновые колебания (рис.7). Параметрами подгонки являлись средниг размер мультислойных структур, их полидисперсность и параметр г| определенный выше. Полученная зависимость параметра г| от температурь: показана на рис.8. На рис.8 хорошо виден резкий излом в зависимости прр температурах Т~7СМ-80°С. Было показано, что такой излом может быть обьясне} переходом в режим доминирования далыюдействующего ондуляционногс отталкивания между липидными мембранами.

Таким образом, рост тепловых ондуляций липидных мембран и флуктуаций отдельных липидов из плоскости мембран с увеличением температуры приводит к переходу от связанного состояния липидных мембран с преобладанием притяжения Ван-дер-Ваальса на больших расстояниях к режиму доминирования ондуляционного

Температура, °С Рис.8. Зависимость параметра Г| от температуры.

отталкивания и распаду мультислоиных структур на отдельные липидньп везикулы. Существующие в настоящее время оценки константы Гамакера, модул:

изгиба липндных мембран, амплитуд флуктуаций отдельных липндов, а также отсутствие полной ясности с численным коэффициентом в выражении для ондуляционного отталкивания раздвигают пределы возможных температур такого перехода от 50°С до 2000°С. Проведенные эксперименты впервые показали, что для липидных мембран из ДМФХ переход находится при температурах, близких к физиологическим. Таким образом, по-видимому, баланс межмембранных взаимодействий при обычных условиях довольно неустойчив. Небольшие изменения в системе (повышение температуры, уменьшение модуля изгиба мембран, увеличение амплитуды флуктуаций больших полярных групп липидов или отдельных липидов с поверхности мембраны и т.д.) легко могуг привести к переходу от связанного состояния липидных мембран (липидные мультислои) к отталкиванию между мембранами на всех расстояниях и наоборот.

Выводы пятой главы.

1) С помощью малоуглового рассеяния нейтронов и дифракции рентгеновских лучей высокого разрешения показано, что при увеличении температуры происходит значительный рост межмембранного отталкивания.

2) Данный эффект характерен для энтропийного взаимодействия и не может быть объяснен в рамках теории гидратационных сил.

3) Увеличение отталкивания происходит за счет роста флуктуаций отдельных липидов из плоскости мембраны и тепловых ондуляций целой мембраны.

4) При Т>70°С для липидных мембран из ДМФХ наблюдается переход от связанного состояния к доминированию ондуляционного отталкивания на больших расстояниях.

Основные результаты и выводы.

1. Исследована точность измерений параметров короткодействующего отталкивания между липидными мембранами. Установлены пределы надежности широко распространенного метода определения межмембранного расстояния из профилей электронной плотности.

2. Изучена возможность исследования мембранных ондуляций с помощью нейтронного спин-эха и впервые определена величина модуля изгиба липидных мембран таким методом.

3. Предложена и осуществлена методика определения толщины липидных мембран с помощью малоуглового рассеяния нейтронов.

4. Впервые показана необходимость коррекции интенсивности на форм-фактор при анализе формы дифракционных пиков от липидных мультислоев и продемонстрировано, как такая коррекция может быть сделана.

5. Установлено, что гидратационные силы не распространяются дальше 1+2 молекулярных слоев воды между поверхностями.

6. Показано, что на коротких расстояниях между липидными мембранами доминируют энтропийные силы отталкивания, возникающие из-за тепловых флуктуаций отдельных липидов из плоскости мембраны.

7. Установлено, что отталкивание, связанное с тепловыми коллективными длинноволновыми флуктуациями мембран, вносит существенный вклад во взаимодействие между липидными мембранами в избытке воды при нормальных условиях.

8. Показано, что повышение температуры индуцирует переход от связанного состояния (липидные мультислои) к несвязанному (одиночные мембраны).

9. Установлено, что такой переход для мембран из димиристоил-фосфатидилхолина происходит при температурах (Т~70+80°С) близких к физиологическим.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. В.И. Горделий, В.И. Лущиков, А.Г. Сырых, В.Г. Черезов, " Использование рентгеновского дифрактометра ДРОН для исследования длиннопериодных структур ", Сообщения ОИЯН, (1991), 14-91-387;

2. V.I. Gordeliy, V.G. Cherezov, A. islamov, Th. Hauss, "To the question of so-called vapour pressure paradox", BENSC experimental reports 1995, pp. 200-201;

3. V.I. Gordeliy, V.G. Cherezov, A.V. Anikin, M.V. Anikin, V.V. Chupin and J.Teixeira, "Evidence of Entropie Contribution to 'Hydration' Forces between Membranes. 1. The Forces between Polymeric Lipid Membranes", Progr. Colloid Polym. Sci, (1996), 100: 338-344;

4. V.I. Gordeliy, V.G. Cherezov, J. Teixeira, "Evidence of Entropie Contribution to 'Hydration ' Forces between Membranes. II. Temperature dependence of the 'hydration ' force: a small-angle neutron scattering study", J. of Molecular Structure, (1996), 383: 117-124.

5. V.I. Gordeliy, V.G. Cherezov, A.V. Anikin, M.V. Anikin, K. Bartels, E. Bellet-Amalric, V.V. Chupin, A.Kh. Islamov, Th. Hauss, J. Teixeira, "Origin of short-range forces between amphiphilic surfaces", XI Symposium "Surfactants in solutions", July 1996, Jerusalem.

6. V.I. Gordeliy, V.G. Cherezov, A.Kh. Islamov, K. Bartels, A. Brulet, B. Farago, Th. Hauss, J. Teixeira, "Structure, dynamics and interactions of membranes as it is seen via neutron scattering", International meeting on fluid membranes and polymers, September 1996, Berlin.

Цитируемая литература.

1. R.P. Rand, V.A. Parsegian, "Hydration forces between phospholipid bilayers", Biochim. Biophys. Acta, 988, (1989), pp.351-376;

2. S.Leikin, V.A. Parsegian, D.C. Rau, "Hydration forces", Ann. Rev. Phys. Chem., 44, (1993), 369-395;

3. D.C. Rau, V.A. Parsegian, "Direct Measurement of Forces Between Linear Polysaccharides Xanthan and Schizophyllan", Science, 249 (4974), (1990), 1278;

4. J. Israelachvili, H. Wennerstrom, "Role of hydration and water structure in biological and colloidal interactions", Nature, 379, (1996), pp. 219-225;

5. W. Helfrich, "Steric interaction of fluid membranes in multilayer systems", Z. Naturforsch., 33a, (1978), pp.305-315;

6. R. Lipowsky. "The conformation of membranes", Nature, 349, (1991), 475-481;

7. A. Anikin, V. Chupin, M. Anikin, G. Serebrennikova, J. Tarahovsky, "Polymeric liposomes formed from a new phosphatidylcholine with terminal diene groups", Makromol. Chem., 194, (1993), pp. 2663-2673;

8. J. Lemmich, K. Mortensen, J.H. Ipsen, T. Honger, R. Bauer, O.G. Mouritsen, "Pseudocritical behavior and unbinding of phospholipid bilayers", Phys. Rev. Lett., 75(21), (1995), pp. 3958-3961;

9. R. Zhang, W. Sun, S. Tristram-Nagle, R.L. Headrick, R.M. Suter, J.F. Nagle, "Critical fluctuations in membranes", Phys. Rev. Lett., 74, (1995), pp.2832-2835;

Рукопись поступила в издательский отдел 6 октября 1997 года.