Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование конформационной изменчивости молекулярных шаперонинов GroEL/GroES в растворе методом малоуглового диффузного рассеяния рентгеновских лучей

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование конформационной изменчивости молекулярных шаперонинов GroEL/GroES в растворе методом малоуглового диффузного рассеяния рентгеновских лучей"

на правах рукописи

МЕЛЬНИК БОГДАН СТЕПАНОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ШАПЕРОНИНОВ GroEL/GroES В РАСТВОРЕ МЕТОДОМ МАЛОУГЛОВОГО ДИФФУЗНОГО РАССЕЯНИЯ РЕНТГЕНОВСКИХ ЛУЧЕЙ

03.00.02. -биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ПУЩИНО-2004

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научные руководители:

доктор физико-математических наук Семисотнов Геннадий Васильевич, кандидат физико-математических наук Тимченко Александр Александрович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Кутышенко Виктор Павлович, доктор физико-математических наук Денесюк Александр Ильич

Ведущая организация:

Институт кристаллографии имени А.В. Шубникова РАН

Защита состоится 22.12.2004 г. в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московской области, Институтская ул., 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Пущинского НЦБИ РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат физико-математических наук

Н.Ф. Панина

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Более 30 лет назад опыты Анфинсена продемонстрировали возможность правильного сворачивания in vitro (ренатурации) фермента (рибонуклеазы), пространственная структура которого была полностью разрушена денатурирующими агентами. Следствием этих работ стало утверждение, что вся необходимая и достаточная информация для детерминации всех уровней организации белковой молекулы определяется ее первичной структурой, т.е. сворачивание полипептидной цепи, приводящее к образованию нативной конформации, является спонтанным процессом, не требующим никаких дополнительных факторов. Однако во многих случаях попытки ренатурации тех или иных белков завершались неудачей. К середине 80-х годов стали складываться представления, согласно которым определенные белковые факторы могут играть весьма важную роль в процессах созревания и поддержания нативной конформации белка в клетке. Позднее была сформулирована идея ассистируемой самоорганизации белков, в противоположность спонтанной. Эта концепция предполагает, что хотя сворачивание белков является спонтанным процессом, существуют критические стадии, на которых участие специальных клеточных факторов может оказаться необходимым. Роль таких факторов (в том числе белковых, названных молекулярными шаперонами) состоит в обеспечении оптимальных условий протекания процесса сворачивания белка путем устранения "помех" или "неадекватных контактов". Олигомерный белок теплового шока клеток Escherichia coli GroEL является одним из представителей семейства шаперонов, участие которого в сворачивании других белков установлено наиболее полно. В процессе своего функционирования этот белок взаимодействует с ненативной белковой мишенью, Mg2+-AT<D и Mg^-АДФ, а также с белковым ко-фактором GroES и проявляет слабую АТФ-азную активность. Многие детали этого сложного многостадийного процесса до сих пор не ясны. Однако из данных по электронной микроскопии и рентгеноструктурному анализу известно, что

функционирование GroEL как молекулярного шаперона связано с его

рЖтурь

, „ „ рос НАЦИОНАЛЬНАЯ I

конформационнои изменчивостью. Поэтому стрэустуры этого

С Петер! ОЭ

BRftg]

белка в растворе, а также его комплексов с лигандами и субстратами является актуальным и позволяет прояснить механизм шаперон-зависимого сворачивания белков.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование структуры GroEL в растворе и ее изменений при взаимодействии с субстратами и лигандами, необходимыми для осуществления процесса шаперон-зависимого сворачивания белков.

Научная новизна. Впервые проведено детальное исследование структуры и индуцируемых лигандами конформационных изменений GroEL непосредственно в растворе. Показано наличие широкомасштабных изменений в структуре GroEL (связанных с изменением положения доменов и субьединиц) при его переходе из кристалла в раствор и взаимодействии с лигандами.

Практическая ценность. Проведенные в работе исследования позволяют приблизиться к пониманию природы субстрат-зависимого функционирования GroEL как молекулярного шаперона, участвующего в процессе созревания белков в клетке. Программы, разработанные для моделирования олигомерной структуры GroEL в растворе по данным малоуглового рентгеновского рассеяния, позволяют проводить аналогичные исследования для других олигомерных белков в растворе.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на съездах биофизиков России (1999 год, Москва; 2004 год, Воронеж); на II съезде биохимического общества России, 2002 год, Санкт-Петербург; на конференции европейского научного общества «Биология молекулярных шаперонов», 2003 год, Томар (Португалия). Основные результаты диссертации опубликованы в 14 печатных работах, в том числе 1 статья.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора. Материалов и методов, 5 глав, посвященных обсуждению экспериментальных данных и полученных результатов, Выводов и Списка цитируемой литературы (из 105 работ). Работу иллюстрируют 22 рисунка и 2 таблицы.

II СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Шаперон GroEL является олигомерным белком, состоящим из 14 идентичных субьединиц (57 кДа каждая), образующих два кольца (по 7 субьединиц в каждом), лежащих друг на друге (Рис.1). Установленная рентгеноструктурным анализом структура GroEL представляет собой цилиндр высотой 145 А и диаметром 135 А, с центральным каналом диаметром порядка 45А. Каждая субъединица GroEL состоит из трех доменов. Верхний (апикальный) домен формирует концевые части цилиндра GroEL и вовлечен в связывание ненативных белковых мишеней и ко-шаперона GroES. Экваториальные домены формируют основание кольца GroEL, обеспечивая основные контакты между субъединицами в кольце и контакты между кольцами. 24 С- и 5 N концевых аминокислот GroEL являются очень подвижными и их координаты не решены рентгеноструктурным анализом. Однако, методом электронной микроскопии показано, что в центральном канале GroEL на уровне экваториальных доменов в обоих кольцах наблюдаются электронные плотности, которые можно объяснить наличием этих концевых остатков. GroEL является слабой АТФ-азой. Сайт связывания АТФ расположен в верхней части экваториального домена на внутренней поверхности центрального канала GroEL. При гидролизе АТФ происходят конформационные изменения в структуре GroEL. Самый маленький средний домен субъединицы GroEL образует связь наподобие шарнирного соединения между верхним и экваториальным доменами.

Ко-шаперон GroES также является олигомерным белком, состоящим из 7 идентичных субьединиц по 10 кДа каждая (рис.2). В присутствии адениловых нуклеотидов (АТФ или АДФ) и ионов Mg2+ GroES связывается с GroEL, что приводит к изменению конформации GroEL. Анализ структуры GroES в кристалле показывает, что GroES представляет собой купол с диаметром ~75 А и высотой 30 А с внутренним углублением диаметром ~30 А и высотой ~20 А. Структура каждой субъединицы GroES представляет собой р-бочонок с двумя

Рис 1 Структура GгoEL по данным рентгеноструктурного анализа и электронной микроскопии, a, ^ e - обозначение апикального, промежуточного и экваториального доменов соответственно.

Ого1Х

Рис.2 Структура GгoES и его комплекса с GгoEL по данным рентгеноструктурного анализа

петлями, одна из которых формирует "крышу" ОгоБ8 купола, а другая участвует во взаимодействии с ОгоБЬ при образовании комплекса ОгоБЬ-ОгоБ8 (рис.2,4). В свободном ОгоБ8 петли, контактирующие с ОгоБЬ, подвижны и не решены ренттеноструктурным анализом.

Изучение структуры ОгоБЬ в растворе, а также ее изменений при взаимодействии с лигандами и субстратами (ионами М^2+, АТФ, АДФ, ОгоБ8 и ненативным белком), позволит яснее представить различные стадии функционирования ОгоБЬ как молекулярного шаперона и оценить масштаб его конформационной изменчивости в растворе. Для решения этой задачи был использован метод малоуглового рентгеновского рассеяния, позволяющий изучать структуру больших олигомерных белков непосредственно в растворе.

Моделирование структуры белков в растворе с использованием метода

Для изучения структуры белков в растворе малоугловое рентгеновское рассеяние (8ЛХ8) является одним из наиболее информативных методов. В случаях, когда из кристаллографии известны координаты атомов белка, 8ЛХ8 позволяет получить информацию о пространственной структуре белка в

малоуглового рентгеновского рассеяния

Рис. 3 Схема исследований структуры белков в растворе с использованием SAXS.

Рис 4 Схема модификаций кристаллических структур ОгоБЬ и GroБS для получения лучшего согласия кривых малоуглового рентгеновского рассеяния,

рассчитанных для моделей, с экспериментальными кривыми.

растворе и ее крупномасштабных изменениях при взаимодействии с лигандами или другими белками. Такая информация получается благодаря возможности рассчитывать кривые малоуглового рентгеновского рассеяния по координатам атомов. Если кривая 8АХ8, рассчитанная от кристаллической структуры белка, отличается от экспериментально измеренной в растворе, координаты атомов кристаллической структуры белка изменяют таким образом, чтобы устранить различие между теоретически рассчитанной от модели и экспериментальной кривыми (рис.3). Поскольку кривые 8АХ8 чувствительны, в основном, к изменениям общих размеров белка и его формы, при моделировании изменяют положение

больших структурных блоков его кристаллической структуры, таких как домены и субъединицы (рис.4).

Структура GгoES в растворе.

На рисунке 5 представлены экспериментально измеренная кривая малоуглового рентгеновского рассеяния GroES в растворе и рассчитанная от его кристаллической структуры. Видно, что кривые отличаются в широком диапазоне значений вектора рассеяния Эта разница, в основном,

обусловлена различием между радиусами инерции белка в растворе и кристалле. Значение вычисленное из начального участка кривой рассеяния, для GroES в растворе равно 34.0 ± 0.5 А, в то время как рассчитанное из кристаллической структуры - 31 А. Увеличив радиус кольца GroES, то есть, удалив друг от друга субъединицы, как показано на рис.4 и рис.7 (модель 1), можно получить увеличение ^ без значительного изменения общей формы белка. Кривая малоуглового рентгеновского рассеяния, рассчитанная от такой модифицированной структуры, очень близка к экспериментальной (рис.5). Однако, такое изменение приводит к потере межсубъединичных контактов (рис.7). Чтобы сохранить межсубъединичные контакты в структуре GroES с

Рис. 5 Кривые малоуглового рентгеновского рассеяния ОгоЕЗ: экспериментальная (—) и рассчитанные от кристаллической структуры (о), модельной структуры с увеличенным значением Rg с 31А до 34А (А) и от модельной структуры с сохраненными межсубъединичными контактами (о). Во вставке указаны участки Гинье кривых рассеяния ОгоЕв: рассчитанной от кристаллической структуры и

экспериментальной (• , 11(5=34А)

Рис. 6 Зависимость Я-фактора (значения показаны вдоль линий) от угла поворота субъединиц ОгоЕЗ вокруг осей X и Ъ в модельной структуре с фиксированным радиусом инерции Яд=34А. Локальный минимум Я-фактора 1.6 выделен кругом.

увеличенным радиусом инерции (11|5=34А), необходимо осуществить повороты каждой субъединицы вокруг их центров масс (рис.4). Повороты субъединиц, которые не ухудшают, а, по возможности, улучшают согласие между кривой рассеяния модели и экспериментальной кривой, можно выбрать, если проанализировать зависимость Я-фактора (см. рис.3) от углов поворотов субъединиц. Такая зависимость представлена на рис.6. На этой зависимости существуют глобальный минимум значения Я-фактора в области поворота на 15° вокруг оси X и на 25° - вокруг оси Ъ. Присутствие только одного глубокого минимума на рис.6 указывает на однозначность полученного результата. Изменение положения малых частей ОгоБ8, таких как, например, подвижные петли, не сказывается на кривой рассеяния ОгоБ8.

Таким образом, окончательная модель структуры ОгоБ8 в растворе получается в результате следующих модификаций его кристаллической структуры: 1) равномерное увеличение радиуса ОгоБ8 кольца на ЗА (что увеличивает и 2) поворот каждой субъединицы вокруг осей

X и Ъ на 15° и 25° соответственно (что обеспечивает межсубъединичные контакты). Такая модель (модель 2, рис.7) обеспечивает как наличие контактов между субъединицами, так и совпадение кривой рассеяния, рассчитанной от модели, с экспериментальной (рис.5). Заметим, что описанные модификации кристаллической структуры ОгоБ8 приводят к существенному увеличению центрального отверстия в верхней части купола (ЗгоЕБ с 8А до 21А (см. рис.7). к^жоага» !>ачгщ> Высокая лабильность

Мов*ль1

Модель 2

структуры ОгоБ8 была предположена ранее при анализе рентгенострук-

турных данных, когда

гк иА дА,

был сделан вывод, что

раян«м*]Жвч удодок «увьелтп от центра бежа ш

ЗА

дооолшгмшшв повороты субмдамп и» 15° я вокруг X и 2 «*й ляя попуски* хороших жямубмдлппнык жмтжпе

взаимодействие между -шпильками, формиру-

ющими крышу купола

Рис. 7. Структура GгoБS

ОгоБ8, очень слабое. Это

наблюдение позволило авторам высказать предположение, что GroES имеет метастабильную структуру, позволяющую открывать отверстие в верхней части GroES купола. Результаты, полученные в данной работе, являются экспериментальным подтверждением лабильности четвертичной структуры GroES в растворе.

Структура GгoEL в растворе.

На рисунке 8 показаны кривые малоуглового рентгеновского рассеяния GroEL, как измеренная экспериментально в растворе, так и рассчитанная от кристаллической структуры. Кривые рассеяния представлены в координатах (S*Rg), в которых они не зависят от общих размеров макромолекулы и характеризуют только форму макромолекулы. Видно, что экспериментальная и рассчитанная от кристаллической структуры кривые отличаются в диапазоне значений S*Rg от 2.5 до 6.5 (значения вектора рассеяния Б от 0.04 А"1 до 0.1 А" '), что соответствует Брэгговским расстояниям от 12 до 40А. Кривые рассеяния в этом районе чувствительны к перемещению больших структурных блоков белка, например, к смещению доменов и субъединиц белка. В нашем случае, различие кривых рассеяния, рассчитанной от кристаллической структуры GroEL и экспериментально измеренной в растворе, свидетельствует о том, что форма GroEL в растворе и в кристалле отличается. Чтобы устранить это отличие, мы внесли следующие изменения в кристаллическую структуру GroEL.

Анализ кристаллографических данных позволяет сделать несколько заключений, важных для моделирования структуры GroEL в растворе с использованием малоуглового рентгеновского рассеяния. Во-первых, верхний и средний домены GroEL в кристалле обладают повышенной лабильностью. Во-вторых, взаимодействие между субъединицами белка довольно слабое. В-третьих, 5 N и 24 С- концевых аминокислотных остатка принадлежащих к экваториальному домену каждой субьединицы GroEL, нелокализованы рентгеноструктурным анализом.

Рис. 8 Кривые малоуглового рентгеновского рассеяния ОгоЕЬ: экспериментальная (—), рассчитанные от кристаллической структуры (о) и от оптимальной модели (■).

Исходя из этого, при

Рис. 9 Структура ОгоЕЬ в кристалле и

моделировании структуры ОгоЕЬ в модельная структура ОгоЕЬ в растворе. В

растворе у ОгоЕЬ верхние домены (а)

растворе использовались следующие .„о -V

г г повернуты на 10 , средние (1) - на -20 ,

наиболее вероятные модификации его субъединицы, как целое, на -30°, радиус

колец уменьшен на 4А, а расстояние меящу кристаллической структуры: кольцами увеличено на 4А.

Нелокализованные рентгеноструктурным 1) поворачИвалИСЬ верхНИе И анализом М- и С- концевые аминокислотные _г остатки моделируются двумя цилиндрами

средние домены каждой субъединицы . ,

г (заштрихованные области), расстояние меящу

вокруг наиболее гибких мест в районе которыми составляет

зоА.

в1у374 и в1у410 соответственно; 2) перемещалась каждая субъединица, как целое; 3) нелокализованные в кристаллической структуре белка М- и С-концевые аминокислотные остатки моделировались двумя цилиндрами и помещались в центральном канале ОгоЕЬ на уровне экваториальных доменов согласно данным электронной микроскопии (рис.1, 4). Таким образом, чтобы устранить отличия между экспериментально измеренной и теоретической кривыми рассеяния, изменялись следующие параметры кристаллической структуры ОгоЕЬ: 1)ориентация верхних доменов; 2) ориентация средних доменов; 3)поворот каждой субъединицы, как целого, вокруг оси, параллельной оси центрального канала ОгоЕЬ; 4) расстояние между кольцами вгоЕЬ (¿И); 5) радиус колец вгоЕЬ (¿Я). Нелокализованные рентгеноструктурным анализом М- и С-концевые аминокислоты моделировали двумя цилиндрами диаметром и толщиной каждый, которые вмещали

в себя 406 плотноупакованных неразрешенных аминокислот с общей молекулярной массой ~46 кДа (по 23 кДа в каждом кольце), расстояние между которыми также изменялось.

Для всех вариантов модификации кристаллической структуры вгоЕЬ были рассчитаны кривые рассеяния, и эти кривые сравнивались с экспериментальной кривой рассеяния с использованием R-фактора (см. рис.3). Таким образом, поиск модели, кривая рассеяния от которой хорошо согласуется с экспериментально измеренной в растворе, сводился к поиску минимума R-фактора при изменении всех используемых параметров. Во всем пространстве изменения выбранных параметров обнаружен только один минимум R-фактора. Это говорит о том, что выбранные изменения кристаллической структуры вгоЕЬ позволяют удовлетворительно описать экспериментальные данные. Модельная структура, кривая рассеяния от которой хорошо совпадает с экспериментальной (рис. 8 и 9), имеет следующие отличия от кристаллической: верхние и средние домены GгoEL повернуты на +10° и -20° соответственно, каждая субъединица повернута как целое на -30°, уменьшен радиус колец вгоЕЬ на 4А и увеличено расстояние между центрами масс колец на 4А. Кроме этого, оптимальное расстояние между двумя цилиндрами, аппроксимирующими неразрешенные N и С- концевые аминокислотные остатки экваториальных доменов, составило ЗОА (рис.9).

Комплекс СгоЕЬ с М^-АТФ и М^-АДФ в растворе.

Известно, что адениловые нуклеотиды АТФ и АДФ в присутствии ионов Mg2+ уменьшают взаимодействие шаперонина вгоЕЬ с ненативными белками. Предполагается, что это происходит вследствие конформационных изменений в структуре вгоЕЬ, возникающих при связывании нуклеотидов. Чтобы выяснить, существуют ли широкомасштабные конформационные изменения структуры вгоЕЬ в растворе при его взаимодействии с адениловыми нуклеотидами, были измерены кривые малоуглового рентгеновского рассеяния комплексов вшЕЬ с АТФ и АДФ и сравнены с экспериментальной кривой рассеяния свободного вгоЕЬ. На рисунке 10 представлены разностные кривые рассеяния комплексов

ОгоЕЬ с нуклеотидами и свободного ОгоЕЬ. Видно, что взаимодействие с АДФ

не приводит к широкомасштабным конформационным изменениям ОгоЕЬ,

которые повлияли бы на его кривую рассеяния. Напротив, взаимодействие с

АТФ изменяет кривую рассеяния ОгоЕЬ, и она отличается от кривой

свободного ОгоЕЬ в области значений вектора рассеяния от 0.03 А"1 до 0.1 А"1

(8*^ - от 3 до 8). Несмотря на то, что это отличие небольшое, оно измеряется с

высокой достоверностью, поскольку после 12 часов инкубации ОгоЕЬ с АТФ

происходит его расщепление до АДФ (вследствие АТФ-азной активности

ОгоЕЬ) и кривая рассеяния приближается к кривой рассеяния комплекса ОгоЕЬ

с АДФ (рис.10). Влияние гидролиза АТФ на структуру ОгоЕЬ и ОгоЕЬ-

ассистируемое сворачивание белка пока неясно. Существуют

экспериментальные данные, из которых следует, что АТФ и АДФ по-разному

влияют как на конформацию ОгоЕЬ, так и на его сродство к белковым

мишеням. Самые популярные модели ОгоЕЬ-зависимого сворачивания

предполагают, что АТФ и АДФ связываются кооперативно в разных кольцах

ОгоЕЬ, а между кольцами существует антикооперативность (т.е. пока в одном

кольце ОгоЕЬ не произошло расщепление АТФ до АДФ, противоположное

кольцо не связывает АТФ). Поэтому были проанализированы симметричный и

несимметричный комплексы ОгоЕЬ с АТФ. Под симметричным комплексом

подразумевается связывание АТФ с субъединицами обоих колец ОгоЕЬ и при

этом конформация колец меняется одинаковым образом. Несимметричный

комплекс подразумевает, что молекулы АТФ связаны только с одним из колец

ОгоЕЬ, в то время как другое либо свободно, либо занято молекулами АДФ. В

этом случае предполагается, что конформация кольца, содержащего АТФ,

изменяется, а противоположное кольцо остается практически без изменений.

Рис. 10 Разностные кривые

малоуглового рентгеновского

рассеяния свободного ОгоЕЬ и его комплексов с АТФ и АДФ: 1- комплекс ОгоЕЬ с АТФ; 2- комплекс ОгоЕЬ с АТФ после инкубации в течении 12 часов; 3- комплекс ОгоЕЬ с АДФ; разность рассеяния от комплекса , , , , ОгоЕЬ с АТФ и от модельной структуры ОгоЕЬ в комплексе с АТФ.

При моделировании структуры вгоЕЬ в комплексе с АТФ изменялись те же параметры, что и при моделировании структуры свободного вгоЕЬ в растворе (см. выше). Для каждой из моделей (симметричной и несимметричной) существует только один минимум R-фактора, соответствующий оптимальной конформации, рассеяние от которой близко к экспериментальному. Для симметричного комплекса верхние домены повернуты на 20° внутрь, средние на 20° наружу центрального канала вгоЕЬ, а расстояние между кольцами увеличено на 2А (табл.1 и рис.12). В случае несимметричной модели положение верхних и средних доменов в кольце, не занятом АТФ, остается таким же, как в модели свободного вгоЕЬ в растворе (табл.1 и рис.12), а в противоположном кольце (связанном с АТФ) верхние домены повернуты на 40° внутрь, а средние домены на 20° наружу вгоЕЬ канала. Кроме того, радиус колец и расстояние между кольцами уменьшились на 2А (табл.1 и рис.12). В обеих моделях структуры вгоЕЬ в комплексе с АТФ нелокализованные рентгеноструктурным анализом С- и N концевые аминокислоты помещали в середине центрального канала вгоЕЬ, так же, как для модели свободного вгоЕЬ в растворе (рис.9). В таблице 1 суммированы результаты моделирования. Можно видеть, что основные конформационные изменения вгоЕЬ при связывании с АТФ заключаются в поворотах его верхних и средних доменов.

Комплекс GгoEL с ненативным белком.

Современные представления о том, как функционирует вгоЕЬ, предполагают, что в присутствии АТФ, АДФ и вгс^ происходят конформационные перестройки олигомерной частицы вшЕЬ, связанной с ненативной белковой мишенью, которые приводят к ее правильному сворачиванию. В настоящей работе предпринята попытка выяснить, влияет ли связывание ненативного белка с вгоЕЬ на конформацию шаперона в отсутствие нуклеотидов и ко-шаперона вгс^. На рисунке 11 представлены экспериментально измеренные кривые малоуглового рентгеновского рассеяния свободного вгоЕЬ и вгоЕЬ в присутствии эквивалентного количества пепсина. Известно, что пепсин при нейтральных рН утрачивает нативную конформацию

Рис. 11 Кривые малоуглового

и существует в промежуточном состоянии типа "расплавленная глобула", которое в присутствии ионов М^2+ образует прочный комплекс с ОгоЕЬ (по данным гель-хроматографии). Видно, что связывание с этой белковой мишенью влияет на кривую рассеяния вгоЕЬ. Моделирование структуры

рентгеновского рассеяния свободного ОгоЕЬ В комплексе С ИенаТИВНЫМ беЛКОМ ОгоЕЬ (---) и его комплекса с

пепсином (-) и модели комплекса ПРОВОДИЛОСЬ аналогично ОПИСаННЫМ ВЫШе

ОгоЕЬ с ненативной белковой

мишенью (□) моделированиям структуры ОгоЕЬ.

Таблица 1 Повороты доменов 1-го кольца (град) Повороты доменов 2-го кольца(град) Изменение радиуса кочец (А) Изменение расстояния между кольцами (А)

верхние средние верхние средние

ОгоЕЬ в растворе 0 0 0 0 0 0

СгоЕ1.+14АТР симметричный -20 +20 -20 +20 0 +2

ОгоЕЬ^7АТР асимметричный 0 0 -40 +20 -2 -2

ОгоЕЬ - пепсин 0 0 +10 -10 0 -4

Рис. 12 Результаты моделирования структуры ОгоЕЬ в комплексе с АТФ и в комплексе с негативной белковой мишенью (пепсин) в растворе (параметры моделей см табл 1)

В результате получена модель, рассеяние от которой хорошо согласуется с экспериментальной кривой рассеяния (рис 11) В полученной модели (рис 12, табл 1) положение верхних и средних доменов в одном кольце остается таким же, как и в модели свободного ОгоЕЬ в растворе (см. выше), а в

противоположном кольце верхние домены повернуты наружу канала ОгоЕЬ на 10°, а средние домены - внутрь на 10°, что приводит к уменьшению диаметра внутренней полости в этом кольце. Кроме того, расстояние между кольцами уменьшилось на 4А, хотя радиус колец ОгоЕЬ остался таким же, как и в модели свободного ОгоЕЬ (см. табл. 1).

Структура GгoEL в комплексе с GгoES.

Взаимодействие ОгоЕЬ с ОгоЕ8 приводит к большим конформационным изменениям в структуре ОгоЕЬ. Наличие этих изменений показано электронной микроскопией и рентгеноструктурным анализом.

На рисунке 13 представлены кривые малоуглового рентгеновского рассеяния, экспериментально измеренные для комплекса ОгоЕЬ-ОгоЕ8-АДФ и свободного ОгоЕЬ в растворе, а также кривая рассеяния, рассчитанная для закристаллизованного комплекса ОгоЕЬ-ОгоЕ8-АДФ. Рисунок представлен в координатах, в которых кривая рассеяния не зависит от общих размеров белка. Видно, что экспериментально измеренная кривая рентгеновского рассеяния отличается и от рассеяния свободного ОгоЕЬ в растворе и от кривой рассеяния, рассчитанной для комплекса в кристалле. Таким образом, можно сделать вывод, что структура ОгоЕЬ в составе комплекса ОгоЕЬ-ОгоЕ8-АДФ в растворе отличается как от структуры свободного ОгоЕЬ в растворе, так и от структуры ОгоЕЬ в составе закристаллизованного комплекса.

При моделировании структуры ОгоЕЬ в комплексе с ОгоЕ8 изменялись те же параметры, что и при выше приведенных моделированиях. Однако, в этом случае моделирование выявило две модельные структуры (рис.14 и 15, табл.2), кривые рассеяния от которых достаточно хорошо совпадают с экспериментально измеренным рассеянием этого комплекса в растворе (т.е. зависимость Я-фактора от изменения используемых структурных параметров имеет два глобальных минимума). Это не удивительно, если учесть, что для описания комплекса приходится использовать слишком большое количество параметров (поскольку положение доменов в каждом кольце ОгоЕЬ изменяется независимо). Решить эту неопределенность можно, только используя дополнительную информацию о структуре комплекса, полученную другими методами.

ч\Л •2л!!'"0

\

Ч

» к £

8-Пв

Рис. 13 Кривые малоуглового рентгеновского рассеяния комплекса ОгоЕЬ-ОгоЕ8 экспериментально измеренная в растворе (—) и рассчитанная для кристаллической структуры комплекса ("О") Для сравнения приведена экспериментально измеренная кривая рассеяния свободного ОгоЕЬ в растворе (---)

Рис. 14 Кривые малоуглового рентгеновского рассеяния комплекса ОгоЕЬ-ОгоЕЗ-АДФ экспериментально

измеренная (-) и рассчитанная от

модели ( А) и модели 2 (о) (см таблицу 2)

Таблица 2 Повороты доменов 1-го кольца (связанного с (ЗгоЕБ) (град) Повороты доменов 2-го кольца (град) Поворот субьединиц (град.) Изменение радиуса колец (А) Изменение расстояния между кольцами (А)

верхние средние верхние средние

ОгоЕЬ в кристалле 0 0 0 0 0 0 0

ОгоЕЬ в растворе 10 -20 10 -20 -30 -4 4

ВгоЕЮгоЕЗ 10 -20 0 -20 -30 -2 2

йоЕЬ-СтоЕЗ 0 -10 70 0 -30 0 -6

Рис. 15 Структуры комплекса ОгоЕЬ-ОгоЕ8 в кристалле и в растворе модель 1 - основные изменения в кольце, связанном с ОгоЕ8, модель 2 - основные изменения в кольце противоположном кольцу, связанному с ОгоЕ8 (см табл 2)

Выводы

1. Структуры молекулярного шаперона GroEL и его ко-шаперона GroES в растворе отличаются от их структур в кристалле. Эти отличия обусловлены изменениями положений доменов и субъединиц этих белков (т.е. их широкомасштабной конформационной изменчивостью).

2. Взаимодействия с ненативной белковой мишенью и GroES в растворе индуцируют широкомасштабные конформационные изменения в структуре GroEL, связанные с изменением положения апикальных и промежуточных доменов и субъединиц белка.

3. .Показан масштаб конформационных изменений, происходящих в структуре GroEL в процессе его функционирования в растворе. Он составляет от 10° до 60° угловые изменения и до 10А -линейные.

4. С помощью пакета разработанных программ можно рассчитывать кривые малоуглового рентгеновского рассеяния сложных олигомерных белков по известным из кристаллографии координатам атомов этих белков и осуществлять поиск моделей, рассчитанные кривые рассеяния от которых наилучшим образом совпадают с кривыми, измеренными экспериментально.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1) G.V.Semisotnov, T.Ikura, K.Ichimura, H.Kihara, K.Kimura, N.V.Kotova, B.S.Melnik,

A.A.Timchenko and K.Kuwajima. Urea-induced unfolding of the oligomeric proteins GroEL and GroES studied by small-angle X-ray scattering Photon Factory Activity Report 1996 #14

2) G.V.Semisotnov, A.A.Timchenko, H.Kihara, K.Kimura, N.V.Kotova, B.S.Melnik, Y.Igarashi, KJchimura, S.Matsuzaki and K.Kuwajima. The solution structure of the chaperonin GroEL/ES studied by small-angle X-ray scattering Photon Factory Activity Report 1996 #14

3) A.K.Surin, I.A.Kashparov, H.Kihara, N.V.Kotova, V.D.Marchenkov, S.Yu.Merchenkova,

B.S.Melnik, A.A.Timchenko, G.V.Semisotnov. Nucleotide action on the stability and conformation of chaperonin GroEL/ES. 2nd Workshop Principles of Protein Architecture Waseda University International Convention Center 1-6-1 Nishiwaseda, Shinjuku-ku, Tokyo Dec. 12-13, 1995.

4) A.A.Timchenko, H.Kihara, N.V.Kotova, V.P.Kutyshenko, B.S.Melnik, A.K.Surin, G.V.Semisotnov. Conformation and stability ofthe co-chaperonin GroES. 2nd Workshop Principles of Protein Architecture Waseda University International Convention Center 1-6-1 Nishiwaseda, Shinjuku-ku, Tokyo December 12-13,1995.

5) B.S.Melnik, A.A.Timchenko, N.V.Kotova, G.V.Semisotnov. The conformational changes in solution structure of the chaperonin GroEL/ES by small-angle X-ray scattering International Symposium Protein structure, stability and folding. Fundamental and medical Aspects. Moscow, Russia. June 22-26,1998

6) A.A.Timchenko, B.S.Melnik, H.Kihara, K.Kimura, G.V.Semisotnov. GroES co-chaperonin small-angle X-ray scattering study shows ring orifice increase in solution. FEBS Letters All (2000) 211-214.

7) A.A.Timchenko, B.S.Melnik, H.Kihara, K.Kimura, G.V.Semisotnov. Conformational plasticity of GroEL/ES chaperonins studied by synchrotron X-Ray diffuse scattering. Photon Factory Workshop on: New prospects of non-crystalline structural science by X-Ray and neutron diffraction/scattering. KEK, Tsukuba, Japan, 15-20, December, 2000.

8) B.S.Melnik, A.A.Timchenko, K.Kimura, H.Kihara, K.Kuwajima, G.V.Semisotnov. The ligand induced large-scale conformational changes of GroEL chaperonin in solution demonstrated by small-angle X-ray scattering. EURESCO Conference and FEBS Advanced Course Biology of molecular chaperones 2003 august 30- sept. 4 Tomar, Portugal.

9) Б.С.Мельник, А.А.Тимченко, Н.В.Котова, Г.В.Семисотнов. Структура шаперонина GroEL и его комплексов с субстратами в растворе по данным малоуглового рентгеновского рассеяния. II открытая городская научная конференция молодых ученых г. Пущино, 1997г.

10)Б.С.Мельник, А.А.Тимченко и Г.В.Семисотнов. Крупномасштабные структурные перестройки ОгоЕЬ и ОгоЕ8 наблюдаемые в растворе методом синхротронного рентгеновского рассеяния. IV Пущинская конференция молодых ученых. 1999г.

11)Б.С.Мельник, А.А.Тимченко и Г.В.Семисотнов Структура молекулярных шаперонов ОгоЕЬ, ОгоЕ8 и их комплекса в растворе по данным малоуглового рентгеновского рассеяния. Горизонты физико-химической биологии. Отделение физико-химической биологии РАН Пущинский научный центр. 28.05-02.06 2000г.

12)Б.С.Мельник, А.А.Тимченко и Г.В.Семисотнов ОгоЕЬ/Е8 шаперонин: структура в растворе и конформационная изменчивость при взаимодействии с лигандами. II Съезд биохимического общества Санкт-Петербург. 26.06.2002-01.07.2002.

13)С.Ю.Марченкова, Н.В.Котова, В.В.Марченков, Б.СМельник, А.К.Сурин, А.А.Тимченко и Г.В.Семисотнов. Молекулярный шаперон ОгоЕЬ: структура в растворе и изменчивость при взаимодействии с субстратами. II Съезд биофизиков России. Москва. 23-27 авг. 1999г.

14) Б.СМельник, АА.Тимченко, Н.В.Котова, Г.В.Семисотнов. Структура и индуцируемые лигандами конформационные изменения молекулярного шаперона ОгоЕЬ в растворе по данным малоуглового диффузного рассеяния рентгеновских лучей. Ш Съезд биофизиков России. Воронеж. 24-29 июня 2004г.

Принято к исполнению 19/11/2004 Исполнено 19/11/2004

Заказ № 471 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)747-64-70 (095)318-40-68

www.autoreferat.ru

»2 28 82

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Мельник, Богдан Степанович

I. Введение

II. Литературный обзор

1. Концепция шаперон-ассистируемого сворачивания белков.

1.1. Белки теплового шока

1.2. Белки семейства ИврбО и ЬврЮ (шаперонины).

2. Структура и функция олигомерных белков шаперонной системы 8 клеток Е.СоИ ОгоЕЬ и ОгоЕБ.

2.1. Структура ОгоЕЬ и ОгоЕБ по данным электронной 9 микроскопии и рентгеноструктурного анализа.

2.2. Связывание полипептидных цепей с нежесткой третичной 12 структурой - одно из основных свойств ОгоЕЬ.

2.3. Связывание и гидролиз АТФ - основа реакционного цикла 21 ОгоЕЬ.

2.4. Формирование тройного комплекса ОгоЕЬ-ОгоЕБ- 23 полипептид.

3. Малоугловое диффузное рассеяние рентгеновских лучей и 28 нейтронов как метод исследования конформационной изменчивости белков в растворе.

III. Материалы и Методы

1. Объекты исследования и материалы.

2. Экспериментальное измерение малоуглового рентгеновского 31 рассеяния белков.

3. Метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей в растворе.

4. Расчет кривых малоуглового рентгеновского рассеяния белков 36 по данным рентгеноструктурного анализа.

5. Расчет кривых малоуглового рентгеновского рассеяния и 38 моделирование структуры олигомерных белков в растворе.

IV. Результаты и обсуждения

1. Структура ОгоЕБ в растворе.

2. Структура ОгоЕЬ в растворе.

3. Структура комплексов ОгоЕЬ с АТФ и АДФ в растворе.

4. Комплекс ОгоЕЬ с ненативным белком.

5. Комплекс ОгоЕЬ с ОгоЕБ.

VI. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование конформационной изменчивости молекулярных шаперонинов GroEL/GroES в растворе методом малоуглового диффузного рассеяния рентгеновских лучей"

Олигомерные белки теплового шока - 14-субьединичный "двухкольцевой" GroEL (800kDa) и 7-субъединичный "однокольцевой" GroES (70kDa) играют важную роль в процессах сворачивания и транспорта других белков в клетках E.coli, связываясь с ненативными конформационными состояниями белковых цепей и участвуя в их сворачивании. Благодаря этой функции они названы молекулярными шаперонами. Способность GroEL содействовать правильному сворачиванию других белков [Todd et al., 1995, Gray et al., 1991] делает привлекательным его использование в биотехнологии для реактивации вновь синтезируемых белков [Keresztessy et al., 1996]. Однако, сложная олигомерная структура GroEL и наличие ряда лигандов, участвующих в осуществлении его функции [Goloubinoff et al., 1989, Vitannen et al., 1990] затрудняют выяснение механизма его участия в процессе сворачивания белков. В этой ситуации может помочь исследование структурной организации GroEL в присутствии низкомолекулярных субстратов (ионов К и Mg , нуклеотидов АДФ и АТФ) а также при его взаимодействии с GroES и ненативным субстратом. Информацию о структуре белков в растворе можно получить несколькими методами, например ядерным магнитным резонансом (ЯМР), электронной микроскопией, а также рентгеноструктурными исследованиями. Однако эти методы не только очень трудоемки, но, к сожалению не всегда применимы. В частности методом ЯМР невозможно исследовать большие белки. Структура белка, полученная электронной микроскопией, может быть искажена из-за влияния подложки, а для рентгеноструктурных исследований не всегда удается получить кристаллы белков с лигандами. К тому же, неструктурированные субстраты не могут быть исследованы этим методом.

В данной работе мы исследовали структуру СгоЕЬ и ОгоЕБ, а также их комплекса в растворе, используя метод диффузного малоуглового рентгеновского рассеяния. Этот метод позволяет получать информацию об изменении общих размеров белков в растворе (радиус инерции белка). Однако если применить компьютерное моделирование, используя известные из кристаллографии координаты атомов белка, то возможности метода существенно расширяются, и оказывается возможным получить информацию о крупномасштабных изменениях в структуре белка. При моделировании использовались координаты атомов СтгоЕЬ и СгоЕБ известные из данных по рентгеноструктурному анализу этих белков в кристалле. Задача моделирования состоит в том, чтобы рассчитать кривые рассеяния, меняя некоторым образом предполагаемую модель, до получения наилучшего согласия рассчитанных от модели кривых рентгеновского рассеяния с экспериментально измеренными.

Проведенные в работе исследования позволяют приблизиться к пониманию природы субстрат-зависимого функционирования ОгоЕЬ как молекулярного шаперона, участвующего в процессе созревания белков в клетке. Показан масштаб конформационных изменений, происходящих в структуре ОгоЕЬ в процессе его функционирования в растворе.

II. Литературный обзор