Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конформационные изменения молекулярного шаперона GrоEL в растворе

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Конформационные изменения молекулярного шаперона GrоEL в растворе"

: • : .! V Л

О 2 ИЮН 1997

На правах рукописи УДК 577.322

Сурнн Алексей Константинович

КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО ШАПЕРОНА ОгоЕЬ В РАСТВОРЕ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата.физико-математических наук

Пущине - 1996 г.

Работа выполнен;) в Институте белка РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор физико-математических наук Г. В, Семисотнов

доктор физико-математических наук H.H. Хечинашвили

кандидат биоюгических наук В.Н. Ксензенко

Филиал Института биоорганической химии РАН, г. ГГущино

Защита состоится в часов

на заседании диссертационного совета Д 20(1.22.01 Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 г. Пущино, ИТЭБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ.

Автореферат разослан "/¿" 199^г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

(/■*H£LLLtu%-i П.А: Нелипович

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Первые опыты по ренатурации белка (рибонуклеазы) in vitro, проведенные Анфинсеном более 30 лет назад позволили предположить, что вся информация необходимая для приобретения белком уникальной структуры хранится в его первичной последовательности. Позднее это было подтверждено на ряде других белков. Однако в последнее время появляется все больше фактов, свидетельствующих о том, что не все белки способны приобретать жесткую структуру без помощи внешних помощников. Около 20-и лет назад было открыто семейство белков, названных шаперонами, которые связывают ненативные конформации белковых цепей и промотируют их сворачивание как in vivo, так и in vitro. Это явилось одним из существенных аргументов, ставящих под сомнение основной принцип самоорганизации белков, утверждающий, что вся необходимая и достаточная информация для сворачивания белка заложена в его аминокислотной последовательности. Именно это обстоятельство вызвало повышеный интерес к исследованию физико-химических свойств шаперонов.

Одним из наиболее интенсивно исследуемых представителей семейства шаперонов является белок теплового шока GroEL из E.coli. Способность GroEL пррмотировать правильное сворачивание других белков делает привлекательным его использование в биотехнологии для реактивации вновь синтезируемых белков из "тел включения", образование которых часто сопровождает экспрессию генов в чужеродных клетках. Сложная олигомерная организация структуры GroEL, наличие целого ряда субстратов, участвующих в осуществлении его функции, затрудняет выяснение механизма его участия в процессе сворачивания белков. В этой связи возникает ряд вопросов, ответы на которые могут внести ясность во взаимосвязь функции GroEL с его структурной организацией. К таким вопросам относятся, в частности, выяснение стабильности и конформационной подвижности GroEL по отношению к изменению условий внешней среды (температуры, pH, концентрации денатурантов) и наличию субстратов, выяснение природы внутримолекулярных взаимодействий, стабилизирующих внутри- и межсубъедииичную структуру GroEL. Определение диапазонов изменения внешних условий, при которых GroEL сохраняет свою структуру и функцию, является важным для использования GroEL в реактивации вновь синтезируемых белков из "тел включения", которые обычно растворяются при экстремальных внешних условиях (экстремальные pH и концентрации денатурантов).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование изменения конформации и стабильности СгоЕЬ в растворе при изменении условий внешней среды (присутствие функционально важных субстратов, изменение температуры, рН и концентрации денатурантов).

Научная новизна. Впервые подробно исследована устойчивость структуры СгоЕЬ в широком интервале изменения внешних условий (концентрации денатуранта, рН раствора и температуры) и показано наличие широкомасштабных конформационных изменений СгоЕЬ при его связывании с субстратами.

Практическая ценность. Проведенные в работе исследования с одной стороны позволяют приблизиться к пониманию природы субстрат-зависимого функционирования СгоЕЬ как молекулярного шаперона, участвующего в процессе созревания белков в клетке, а с другой стороны представляют интерес с точки зрения использования СгоЕЬ в биотехнологии при реактивации вновь синтезированных белков из "тел включения", часто образующихся при суперэкспрессии генетического материала в чужеродных клетках.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы докладовались на ежегодных научных конференциях Института белка РАН (1994, 1995, 1996). По теме диссертации опубликовано три работы, и одна принята к печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения. глав,

заключения, выводов и списка цитируемой литературы(из _наименований).

Работу иллюстрируют рисунка и о таблицы, общий объем

диссертации Т^1 страниц.

II СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение

Согласно данным электронной микроскопии и последним данным рентгеноструктурного анализа, СгоЕЬ представляет собой олигомерную частицу, состоящую из 14 идентичных субъединиц с молекулярным весом около 60 кДа каждая. Субединицы организованы в два стекиш ованных гептамерных кольца, образуя тороид с внешним диаметром 137 А, внутренним диаметром 45 А и толщиной 146 А. Внутри кольцевых структур электронная плотность резко

понижена. Это дает основание считать, что олигомерная структура GroEL имеет обширную полость, в которой, как предполагается, и происходит связывание ненативной молекулы белка. Кроме того, GroEL является слабой АТФ-азой. Установлено, что наиболее эффективно GroEL осуществляет свою функцию в присутствии его субстратов A DP, ATP, белкового ко-шаперона GroES (состоящего из 7 субъединиц с молекулярным весом 10 кДа каждая, организованных в кольцевую структуру) и ионов К+ и Mg++. Кроме того эти субстраты также участвуют и в эффективной сборке самой GroEL частицы из его мономерной формы.

Выделение и реактивация белков суперпродуцентов из тел включения обычно связаны с использованием экстремальных условий окружающей среды (высокие концентрации денатуранта, экстремальные значения рН и температуры). Использование GroEL с целью повышения выхода нативных белков при их реактивации из тел включения сталкивается с необходимостью знать диапазоны внешних условии, в которых GroEL сохраняет свои структурные и функциональные свойства. Эту информацию можно получить изучая денатурационные конформационные переходы белка. Кроме того, изучение этих переходов является одним из способов исследования механизма самоорганизации самого GroEL, и природы внутримолекулярных взаимодействий, стабилизирующих различные уровни структурной организации белка.

2.1. Денатурационные конформационные изменения GroEL.

2.1.1. Денатурация повышением температуры. На рисунке 1 представлена зависимость эллиптичности белка на длине волны-220 нм от температуры. Видно, что повышение температуры выше 330 К приводит к резкому уменьшению амплитуды, что свидетельствует об уменьшении содержания вторичной структуры, т.е. о тепловой денатурации белка. Этот процесс заканчивается по достижении 350 К. Оценка температуры полуперехода дает температуру 340 К. Температурное плавление GroEL на сканирующем калориметре характеризуется пиком теплопоглощения в достаточно узком диапазоне температур с максимумом при 340 К (рис.2). Однако, температурное плавление GroEL является необратимым процессом, т.е. повторное плавление белка (рис.2) не сопровождается кооперативным теплопоглощением, характеризующим наличие жесткой третичной структуры (таким образом, жесткая третичная структура при

280 290 300 310 320 330 340 350 Температура (К)

Рис. 1. Температурная зависимость значения элинтичности на 220 нм для СгоЕЬ. Концентрация белка 0.3 мг/мл. Точка полуперехода - 340 К. 50 мМ НЕРЕ5, рН 7.5.

Рис.2.

Температурные зависимости удельной теплоемкости ОгоЕЬ. (1) - 50 мМ НЕРЕБ, рН 7.5; (2) - повторное плавление образца (1). Концентрация белка 1.8 мг/мл.

4 -

-а

ч о

г

2 -

* а.

и

320 340

Температура (К)

360

понижении температуры после температурной денатурации не восстанавливается). Эти обстоятельство существенно осложняет анализ и трактовку кривых зависимостей Ср от температуры. Такая необратимость температурных переходов наблюдается достаточно часто, особенно в случае субъединичных глобулярных белков, что обычно объясняют межмолекулярной ассоциацией "расплавленных"

конформаций белка. Тем не менее, плавное изменение постденатурационной части кривой зависимости теплоемкости от температуры и совпадение температур полуперехода, измеренных различными мтодами (КД и сканирующей калориметрией) при различных концентрациях белка, дает возможность предположить, что вклад ассоциации в динамику изменения теплоемкости при увеличении температуры невелик. Рассчет из кривой калориметрического плавления (рис.2.) каллориметрической (4Нкал) и эффективой (ДН'ФФ) энтальпий цает 16300 и 720 кДж/моль соответственно. Таким образом, отношение калориметрической энтальпии на мономерную субъединицу к эффективной энтальпии - квг (коэффициент Вант-Гоффа) составляет 1.6, что позволяет предполагать, что процесс тепловой денатурации белка представляет собой плавление более одного термодинамического блока в расчете на субъединицу.

2.1.2. рН зависимые депатурационпые переходы. Исследование рН зависимых конформационных переходов в белках позволяет оценить роль электростатических взаимодействий в стабилизации различных уровней структурной организации белков. На рис.3 представлена зависимость АТФ-азной активности СгоЕЬ от рН раствора, которая определялась как прирост пирофосфата при СгоЕЬ-зависимом гидролизе АТФ до АДФ и пирофосфата.

.о

образцы инкубировались в течение 30 мин при 23°С. Выход АТФ-азной реакции определялся как прирост пирофосфата при гидролизе АТФ на АДФ и пирофосфат.

Рис.3. Зависимость АТФ-азной активности GroEL от pH среды. Для каждого измерения приготовлялись растворы на основе буферной системы: 50 мМ фосфатный буфер, 100 мМ KCl, 10 мМ Mg-ацеат. Все

б

7

<

9

10

pH

Видно, что эта зависимость является достаточно сложной и характеризуется несколькими выраженными участками. В диапазоне рН от 7.0 до 8.0 АТФ-азная активность СггоЕЬ остается неизменной резко увеличиваясь в интервале рН от 8 до 9.2 и практически исчезает в диапазонах рН от 7.0 до 5.8 и от 9.2 до 9.7. Однако, уменьшение АТФ-азной активности при изменении рН от 9.2 до 9.7 и от 7.0 до5.8 не является следствием денатурации белка. На это указывает неизменность спектров КД в дальней и ближней УФ областях (рис.4а и 46, соответственно) и наличие пика на кривой калоримерического плавления белка при рН 5.6 и 9.6 (рис.5). Кроме того, в указанных инервалах рН белок сохраняет свою олигомерную структуру, о чем свидетельствует отсутствие уменьшения интенсивности светорассеяния (не показано).

Рис. -4. Спектры кругового дихроизма ОгоЕЬ. (а) - спектры КД в дальней ультрофиолетовой области: 1 - рН 9.8; 2 - рН 7.5; 3 - рН 5.5; 4 - рН 4.1; 5 - рН 3.5; 6 - в присутствие 4.5 молей мочевины, (б) -спектры КД в ближней ультрофиолетовой области: 1 - рН 9.8; 2 - рН 7.5; 3 - рН 5.5; 4 - в присутствие 4.5 молей мочевины. Растворы приготовлялись на основе 50 мМ фосфатного буфера содержащего 100 мМ КС1, ЮмМ \^-ацетат.

320 330 340

Температура (К)

350

Рис.5. Температурные зависимости удельной теплоемкости СгоНЬ при различных рН раствора. (1) - рН 9.6; (2) - рН 7.5; (3) - рН 5.6; (4) - рН 2.5 (аналогично для рН 3.1, рН3.5 и рН 3.8). Растворы приготовлялись на основе 50 шМ НЕРЕЭ, 100 шМ КС1, 10 гаМ ¡^-ацетат.

1.5

0.5

0.0

6 8 рН

Рис.б. Зависимость интенсивности флуоресценции АНС в присутствии СгоЕЬ от рН раствора. Отношение [АНС]/[СгоЕЦ=50/1, концентрация белка - 0.02 мг/мл Флуоресценция возбуждалась при >.,,., ,6=390 нм и регистрировалась при Хрсг=460 нм.

На рис. 6 представлено изменение интенсивности флуоресценции гидрофобного зонда 8-Анилинонафталин-1-сульфоновая кислота (АНС) (характеризующей степень экспонированности гидрофобных кластеров белка на растворитель) в присутствии ОгоЕЬ от рН раствора. Видно, что в области рН от 5.5 до 10.0 не происходит существенного изменения в степени экспонированности гидрофобных кластеров белка на растворитель. Дальнейшее понижение рН от 5.5 до 2.5 сопровождается резким увеличением сродства гидрофобного зонда к ОгоЕЬ -интенсивность флуоресценции АНС увеличивается практически на порядок относительно нейтральных рН (рис. 6). Это свидетельствует об утере белком жесткой третичной структуры и увеличении степени экспонированности гидрофобных кластеров ОгоЕЬ на растворитель в этом интервале рН. Отсутствие жесткой третичной структуры ОгоЕЬ при низких рН (2.7; 3.0; 3.5; 3.8) подтверждается и отсутствием выраженного пика на кривых зависимости теплоемкости от температуры (рис. 5). Тем не менее, кислая форма белка характеризуется значительным содержанием вторичной структуры (рис. 4а). Вышеприведенные свойства характерны для белков, находящихся в состоянии "расплавленной глобулы". Вместе с тем, интенсивность светорассеяния ОгоЕЬ в "кислой" области рН существенно не уменьшается по сравнению с нейтральными рН (не показано), что свидетельствует о том, что, несмотря на разрушение жесткой третичной структуры белка в кислой области рН не происходит распад олигомерной частицы ОгоЕЬ на мономерные субъединицы.

Таким образом, установлено, что в диапазоне рН от 5.7 до 9.7 олигомерная частица ОгоЕЬ не претерпевает существенных внутрисубъединичных конформационных изменений и сохраняет жесткость третичной структуры. Сложное поведение АТФ-азной активности в этом интервале рН связано, по-видимому, с титрованием аминокислотных остатков ОгоЕЬ, входящих в активный центр или находящихся в непосредственной близости от него. Ими предположительно могут быть гистидиновые, цистеиновые и лизиновые остатки, рКа которых в белках (рК=б.5 + 7.0 - гистидин, рК=8.5 -:- 8.8 - цистеин, рК=9.8 ^ 10.2 - лизин) находятся в районе точек полупереходов изменения АТФ-азной активности ОгоЕЬ (рНт=6.3, рНш=8.7 и рН1/г=9.5). Заметим, что важность цистеиновых остатков для осуществления АТФ-азной реакции ОгоЕЬ отмечалась в литературе ранее.

2.1.3. Денатурация мочевиной. Исследования денатурационных переходов с использованием таких денатурантов, как мочевина позволяет получать информацию о степени кооперативности структурной организации белка, стабильности различных уровней организации белковой молекулы и выявить возможные промежуточные состояния на пути сворачивания.

На рис. 7 представлены нормированные кривые зависимостей АТФ-азной активности, эллиптичности на 220 нм и интенсивности светорассеяния СгоЕЬ от концентрации мочевины. Параметр Рк соответствует доле нативных молекул и определяется формулой:

где/- текущее значение параметра, а/и ¡1" /.,• - значения данного параметра для денатурированного и нативного состояний, соответственно. Хорошо видно, что вплоть до концентрации мочевины 2.5 моля отсутствует заметное уменьшение АТФ-азной активности, интенсивности светорассеяния и амплитуды спектра КД в области поглощения пепдных связей, что свидетельствует о сохранении нативной структуры белка в этом интервале концентраций денатуранта. Дальнейшее увеличение концентрации мочевины инициирует резкий денатурационный переход, который полностью завершается при достижении концентрации мочевины 4.0 моля. Из рис; 7 видно также, что рассеяние света, АТФ-азная

FN=(f-fv)/(Mu) ,

зависимости Д - АТФ-азной активности, О - величины элиптичности на 220 пт, □ -

Рис.7. Нормированные

величины

.5

О

рассеяние света на 330 пт от концентрации мочевины.

А

Все растворы приготовлялись на

о.о

I—| основе 50 шМ Na-фосфат, pH 7.5, 100 шМ KCl, 10 mM Mg-ацетат. Белок инкубировался 30

0 1 2 3 4 5

[Мочевина] (моль)

5 6 минут при 23°С.

активность белка и уменьшение амплитуды спектра КД в дальней УФ области изменяются симбатно по мере возрастания концентрации денатуранта после 2.5 М. Это свидетельствует о том, что разрушение олигомерной, третичной и вторичной структур происходят одновременно. Очень узкий интервал концентраций мочевины и Б-образный характер уменьшения параметра Ем свидетельствует о высокой степени кооперативности структурной организации СтоЕЬ при данных экспериментальных условиях.

2.2. Субстрат-зависимые конформационные изменения СгоЕЬ.

Функционирование СтоЕЬ как молекулярного шаперона сопряжено с его взаимодействием с рядом субстратов: АТФ, АДФ, ионами К+ и и белковым ко-шапероном Ого ЕЯ. Исследование взаимодействий ОгоЕЬ с субстратами является одним из приорететных напрвлений в области выяснения механизма работы ОгоЕЬ как молекулярного шаперона.

2.2.1. Влияние субстратов на термостабильность СгоЕЬ. На рисунке 8 представлены температурные зависимости удельных теплоемкостей ОгоЕЬ в отсутствии и присутствии различных комбинаций субстратов. Анализ кривых зависимостей теплоемкостей от температуры при этих условиях позволяет оценить значения термодинамических величин этого процесса. Оценочные рассчеты калориметрических и эффктивных этальий, температур денатурации и коэффициентов Вант-Гоффа приведены в таблице 1. Видно, что разброс соотетствующих энальпий не превышает 20 % и укладывается в погрешность подсчета этих величин. Однако величины температур денатурации (соответствующие положению максимумов пиков на кривых плавления) имеют различия, превышающие ошибку экперимента.

Приутствие ионов К+ и М§++ увеличивает температуру денатурации ОгоЕЬ на 3 градуса. Наличие же АДФ наоборот уменьшает температуру денатурации ОгоЕЬ.

Белок ОгоЕЗ является высокомолекулярным белковым кофактором ОгоЕЬ. Его присутствие в реакционной смеси повышает выход нативной конформации при

Таблица 1. Термодинамические характеристики вгоБЬ и его комплексов с субстатами.

СгоБЬ вгоЕв ионы К.+ Д№я ДН'ФФ Тд Квг

+ Мв++ АДФ (кДж/моль) (кДж/моль) (К)

+ — — — 16300 720 340 1.6

+ — + — 16000 700 343 1.6

- + + + 1200 610 349 -

+ — 4- + 18000 760 339 1.7

+ + + 19000 790 342 1.7

Рис.8. Температурные зависимости удельной теплоемкости ОгоЕЬ. (1) - 50 шМ НЕРЕ8, рН 7.5; (2) - 50 шМ НЕРЕ8, 100 шМ К.С1, 10 шМ Мб-ацетат, рН 7.5; (3) - 50 шМ НЕРЕБ, 100 шМ КС1, 10 тМ Мц-ацетат, 2 мМ АДФ, рН 7.5; (4) - 50 тМ НЕРЕБ, 100 тМ КС1. 10 тМ Мц-ацетат, 2 мМ АДФ, вгоЕЗ, рН 7.5; отношение молярных концентраций ОгоЕЬ/ОгоЕЗ составляло 1:1.

ОгоЕЬ-ассистнруемом сворачивании некоторых белков. Известно, что в присутствии низкомолекулярных субстратов (АДФ и ионов К+ и М£++) образуется устойчивый комплекс СгоЕЬ*Сгов соотношении 1:1. На рисунке 8 представлена зависимость удельной теплоемкости от температу ры для ОгоЕЬ в присутствии низкомолекулярных субстратов и ОгоЕ.$. Значительная разница в молекулярных весах этих белков, значениях калориметрических энтальпий и температур

Температура (К)

денатураций (таблица I) позволяет пренебречь вкладом ОгоЕБ при анализе кривой плавления комплекса ОгоЕЬ*ОгоЕ8. Видно, что кривая калориметрического плавления сдвигается в сторону более высоких температур по сравнению с кривой для комплекса ОгоЕЬ с АДФ при практически неизменном значении калориметрической энтальпии (таблица 1). Таким образом образование межмолекулярного комплекса СгоЕЬ*СгоЕ8 в присутствии 1У^-АДФ стабилизирует структуру ОгоЕЬ относительно действия температуры.

2.2.2. Влияние субстратов на скорость протеолитической деградации СгоЕЬ.

Доступность белка протеазе при ограниченном протеолизе является еще одним тестом на структурные перестройки и динамику белка в растворе. Для исследования влияния субстратов ОгоЕЬ на скорость его протеолитической деградации в качестве протеазы был использован трипсин при соотношении молярных концентраций трипсин : ОгоЕЕ — I : 50. Кинетики ограниченного трипсинолиза представлены на рис. 9. Хорошо видно, что в отсутствие субстратов, при использованых условиях

12 3 4

вгоБЬ (я)

Рис. 9. Ограниченный трипсинолиз молекулярного шаперона ОгоЕЬ и его комплексов с различными субстратами. Молярное отношение трипсин : ОгоЕЬ= 1 : 5. Через каждые 30 сек из реакционной смеси извлекалась часть образца и после ингибирования действия протеазы анализировалась 808-электрофорезом -в полиакриламидном геле. Время прошедшее с момента добавления протеазы до ингибирования ее действия: 1 - 30 сек, 2-60 сек, 3-90 сек, 4-120 сек. Стрелкой (4-) указаны фрагменты которые были просиквенированы.

12 3 4 1234 1234

СгоЕЬ*АДФ СгоЕЬ'АТФ СгоЕЬ'СгоЕБ

*АДФ

(б) (в) (с)

эксперимента, ОгоЕЬ устойчив к действию протеазы (рис. 9а). Вместе с тем, добавление АТФ или АДФ (рис. 96, 9в) приводит к существенному увеличению скорости протеолиза, что свидетельствует о неких структурных перестройках в белке или об увеличении его конформационной подвижности, приводящих к увеличению доступности протеазе. Образование комплекса ОгоЕЬ'ОгоЕБ в присутствии АДФ существенным обазом не изменяет кинетику деградации комплекса ОгоЕЬ* АДФ. Кинетика ограниченного протеолиза ОгоЕЬ в присутствии субстратов характеризуется накоплением двух фрагментов с молекулярным весом ~ 30 кДа, устойчивых к действию протеазы. Больший (указанный на рисунке 9) фрагмент был идентифицирован по сиквенсу Ы-концевых аминокислотных остатков. Им оказался й-концевой фрагмент белка начиная с 268 аминокислотного остатка. Таким образом, можно заключить, что в основном/^-концевая часть белка дестабилизируется по отношению к действию протеазы в комплексе ОгоЕЬ с нуклеотидами.

2.2.5. Влияние субстратов на степень экспонированности гидрофобных кластеров (ггоЕЬ на растворитель. В настоящее время метод связывания гидрофобного зонда широко используеся в качесве теста на структурные перестройки в белках, сопровождаемые изменениями степени экспонированности гидрофобных кластеров на растворитель. Методом Скетчерда по данным прямого и обратного титрования было определено количество молекул АНС связанных с олигомерной частицей ОгоЕЬ в свободном состоянии и в комплексе с АДФ и ОгоЕЭ. Эти данные приведены в таблице 2.

Таблица 2.

ОгоЕЬ Субстраты колличество связанного АНС на молекулу белка

К+ и АДФ ОтоЕБ

+ + — — 4

+ -ь + — 12

— -Ь + 1

+ + + + 12

Видно, что присутстие ионов К+ и Mg++ не изменяет количество молекул АНС связываемых с одной молекулой ОгоЕЬ. Однако присутствие АДФ приводит к

заметному увеличению количества связанных молекул ДНС, вследствие увеличения экспонированности гидрофобных кластеров белка на растворитель. Вместе с тем, образование комплекса СгоЕЬЮгоЕБ в присутствии АДФ не приводит к изменению числа молекул АНС, связанных с молекулой вгоЕЬ в присутствии АДФ. Таким образом данные по связыванию гидрофобного зонда подтверждают результаты ограниченного протеолиза и свидетельствуют о наличии структурных изменений олигомерной частицы ОгоЕЬ при ее связывании с нуклеотидами.

ВЫВОДЫ

1. Молекулярный шаперон СгоЕЬ сохраняет свои основные структурные характеристики в интервалах концентраций мочевины до 2.5 М при 23°С и рН 7.5, температуры до 57°С и рН от 5.6 до 9.8.

2. Зависимость АТФ-азной активности СгоЕЬ от рН характеризуется наличием плато в интервале рН от 7.0 до 8.0, трехкратным увеличением в интервале рН от 8.0 до 9.2 (рНт = 8.7) и падением до нуля в интервалах рН от 7.0 до 5.8 (рНи = 6.3) и от 9.2 до 9.8 (рНш = 9.5).

3. Связывание АДФ дестабилизирует структуру ОгоЕЬ по отношению к действию температуры и трипсина, а также приводит к трехкратному увеличению мест связывания гидрофобного зонда - АНС, что свидетельствует о наличии АДФ-зависимых внутрисубъединичных конформационных изменений ОгоЕЬ.

4. Взаимодействие ОгоЕЬ с ОгоЕЗ в присутствии АДФ приводит к повышению температуры тепловой денатурации (на 3 °С), не внося заметных изменений в доступность СгоЕЬ протеазе и гидрофобному зонду.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. А.К. Surin, I.A. Kashparov, H. ICihara, N.V. Kotova, V.D. Marchenkov, S.Y. Marchenkova, B.S. Melnik, A.A. Timchenko, G.U. Semisotnov - Nucleotide action on the stability,and conformation of chaperonin, GroEL/ES . 2nd Workshop "Principles of Protein Architecture" Waseda University, Internat. Convention Center 1-6-1, Nishiwaseda, Shinjuku-ku, Tokyo Dec. 12-13, 1995, p. 165.

2. A.K. Surin, I.V. Sokolovsky, S.Y. Marchenkova, N.V. Kotova, N.A. Rodionova, S.Y. Yaklichkin, G.V. Semisotnov - Urea and pH induced denaturing transitions of the molecular chaperonin GroEL. 2nd Workshop "Principles of Protein Architecture" Waseda University, Internat. Convention Center 1-6-1, Nishiwaseda, Shinjuku-ku, Tokyo Dec. 1213, 1995, p. 166.

3. A.A. Timchenko, H. Kihara, N.V. Kotova, V.P. Kutyshenko, B.S. Melnik, A.K. Surin, G.V. Semisotnov - Conformation and stability of the co-chaperonin GroES. 2nd Workshop "Principles of Protein Architecture" Waseda University, Internat. Convention Center 1-6-1, Nishiwaseda, Shinjuku-ku, Tokyo Dec. 12-13, 1995, p. 167.

4. A.K. Сурин, И.В. Соколовский, H.A. Родионова, H.B. Ксгсша, С.Ю. Марчепкова, С.Ю. Яюпиюш, Г.В. Семисотнов. Дснатурадиошше переходы молекулярного шатсронина GroEL из E cali. Биоорганическая химия, 1997, т.23, №4, «пр. 251-256.

5. А.К. Surin, N.V. Kotova, I.A. Kashparov, V.V. Marchenkov, S.Yu. Marchenkova, G.V. Semisotnov. Ligands regulate GroEL thermostability. FEBS Letters, 1997, v. 405, n. 3, pp. 260-262.