Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли шаперонов DnaK и DnaJ в формировании активных белков IN VIVO и IN VITRO

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли шаперонов DnaK и DnaJ в формировании активных белков IN VIVO и IN VITRO"



На правах

рукописи

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ШАПЕРОНОВ DnaK И DnaJ В ФОРМИРОВАНИИ АКТИВНЫХ БЕЛКОВ т VIVO И IN VITRO.

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации ка соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН (Москва, Россия) и в Йельском университете (Нью Хейвен, США).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук А.И.Грагеров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Р.С.Шакулов доктор химических наук И. Н.Шатский

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Защита состоится " ^ " ^с(ртО 1996 года в Ц±_ часов на заседании Диссертационного совета Д 098. 12.01. при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва, 1ый Дорожный проезд, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан " ^ " зн^з 1996 года

Ученый секретарь Диссертационного совета:

кандидат биологических наук у^ , В.И.Щербакова

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы.

Уже стало общепринятым мнение, что в клетке новосинтозирухщисся белки сворачиваются в нужные конформации и собираются в соответствующие четвертичные структуры не самопроизвольно; а с участием белков-помощников, названных молекулярными шаперонами. Но на данный момент точная роль конкретных шаперонов в реакциях сворачивания и сборки конкретных белков во многом остается неясной. Часто не ясна также последовательность действия нескольких шаперонов на пути сворачивания и сборки конкретного белка.

Белок DnaK является представителем шаперонов Нзр70-семейства в клетке Е.coli, DnaJ работает вместе с DnaK, являясь его кошапероном, и взаимодействует с ним.

Про шапероны Нзр70-семейства давно высказывалась привлекательная гипотеза, что некоторые его представители могут взаимодействовать с растущими полипептидными цепями еще на рибосомах и таким образом способствовать правильному сворачиванию полипептидной цепи еще во время ее синтеза на рибосоме. И действительно, ассоциация с растущими полипептидными цепями на рибосомах была продемонстрирована для трех конкретных представителей Нзр70-семейства: белка Hsp73 из клеток млекопитающих и белков SSB1, SSB2 из дрожжей.

Но до недавне!'о времени прямые данные о взаимодействии шаперонов с растущими полипептидными цепями в бактериальных клетках отсутствовали.

Цель и задачи работы.

Целью данной работы являлось изучение влияния шаперонов DnaK и DnaJ на сворачивание и сборку белков в клетках Е. coli.

В работе ставились следующие задачи: 1) изучить взаимодействие шаперонов E.coli с транслирующими рибосомами; 2) изучить агрегацию цитоплазматических белков в мутанте E.coli, лишенном генов dnaK и dnaJ; 3) получить систему синтеза белка in vitro, лишенную шаперонов DnaK и DnaJ, и

изучить влияние шаперонов DnaK и DnaJ на сворачивание и сборку модельного тримерного белка хлорамфениколацетилтрансферазы в этой системе; 4) изучить влияние шаперонов DnaK и DnaJ на реконструкцию денатурированной гуанидинхлоридом

хлорамфениколацетилтрансферазы.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые продемонстрирована ассоциация бактериальных шаперонов DnaK и DnaJ с растущими полипептидными цепями на рибосомах Е.coll. Показано, что в противоположность DnaK и DnaJ, шаперон НэрбО-семейства GroEL с растущими полипептидными цепями не взаимодействует, но кратковременно связывает полноразмерные новосинтезированные белки после их диссоциации от рибосом.

Впервые показано, что в штамме E.colí. лишенном генов dnaK и dnaJ, происходит агрегация многих в норме растворимых цитоплазматических белков.

Получена система сопряженной транскрипции-трансляции in vitro, лишенная шаперонов DnaK и DnaJ; и изучено влияние различных факторов на работу этой системы.

Показано, что действие шаперонов DnaK и DnaJ способствует правильному сворачиванию и сборке модельного тримерного белка: хлорамфениколацетилтрансферазы во всех трех исследованных системах: in vivo, в системе синтеза in vitro и в системе реконструкции денатурированного гуанидинхлоридом энзима.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, результатов экспериментов, обсуждения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на /Ü страницах машинописного текста, включая 2£ таблиц и рисунков. Библиография включает JJS> источников русской и зарубежной литературы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Взаимодействие шаперонов РпаК и DnaJ с рибосомами.

С целью выяснить какие из трех анализируемых шаперонов Е.еоЫ: DnaK, DnaJ и GroEL, могут взаимодействовать растущими полипепткдными цепями на рибосомах, лизат К. coli fjw» подвергнут фракционированию в градиенте сахарозы, и с помощью иммуноблотинга тестировалось наличие шаперонов во фракциях, где движутся рибосомы (рис.1). Как показано на рис.1 в распределении белков DnaK и DnaJ действительно наблюдаются пики в тех же самых фракциях, где движутся рибосомы, хотя большая часть DnaK и DnaJ остается в верхней части градиента. В противоположность DnaK и DnaJ, шаперон НзрбО-семейства GroEL в рибосомных фракциях полностью отсутствует. Риль GroEL к сворачивании новоскнтезированных белков впоследствии изучалась отдельно, и было показано что GroEL всо-тзки взаимодействует со многими »одноразмерными новосинтезировнниыми белками, но взаимодействует кратковременно и уже после их диссоциации от рибосом.

Чтобы выяснить отражает ли показанная ка рис.1 комиграпия DnaK с рибосомами его реальное взаимодействие с рибосомами, лизат E.coli, содержащий преимущественно полисомы, был обработан РНК-азой с целью разрушить полисомы до монорибосом. И как видно из рис.2, после такой обработки пик DnaK также смещается и накладывается на пик монорибосом. Из этого был сделан вывод, что DnaK действительно взаимодействует с рибосомами.

Взаимодействие шаперонов с рибосомами изучалось как. in vivo, так и в сопряженной системе траискрипции-трансляции in vitro, в которой велся синтез хлорамфениколацетилтрапсферазы (CA'1'j, chloramphenicol acetyl transferase) Причем система синтеза in vitro была сконструирована как из штамма дикого типа, содержащего эндогенный DnaK, так и в варианте, где для получения БЗО-экстракта использовался штамм, лишенный генов dnaK и dnaJ (ADnaKJ-штамм), а очищенные белки DnaK и DnaJ добавлялись в систему перед началом синтеза. При изучении

GroEL

DnaJ

DnaK

Рис.1. Комиграция части клеточных шаперонов DnaK и DnaJ с рибосомами в градиенте сахарозы, и отсутствие шаперона GroEL в рибосомных фракциях. Лизат Е.coll, обработанный РНК-азсй. фракционировали центрифугированием в градиенте сахарозы. Фракции анализировали электрофорезом в присутствии SDS и затем иммуноблотингом с использованием анти-ВпаК, анти-DnaJ и анти-GroEL антител. Соответствующие иммуноблоты показаны в верхней части рисунка. Внизу показан рибосомный пик, построенный по распределению включенного клетками 3Н-уридина.

РНК-аза контроль

фракции сахарозного градиента

.2 FHK-25K н? кигразж D.wK с гр&п.'снт* сахар vsií.

Суа-наи'- лгу:-: ангп-Ьг.аК у,мчу1-: аалаь: на \j \'<.\v v. ::!-:ку:;> \':iaa-пока?"ттт-; ^рягип: ^ахзрсаппго градиента для случая, ко~дз ли:-:-; г Z ■;■ о i i дерел нанесением на градиент оораУа ?Hi-зо;:;

нижнй иммуноблот получен в контрольном эксперименте, где обработка РНК-зой не проводилась. График внизу демонстрирует миграцию моно- и полирибосом в контрольном эксперименте (построен по включению 3Н-уршдана); пик монорибосом обозначен стрелкой.

взаимодействия шаперонов DnaK и DnaJ с рибосомами, использование ADnaKJ-штамма позволяет полностью избежать проблемы загрязнения рибосомных фракций растущими полипептидными цепями самих белков DnaK и DnaJ, которые могут узнаваться соответствующими антителами.

Чтобы определить связаны ли DnaK и DnaJ с растущими полипептидными цепями на рибосомах или, напротив, они связаны с рибосомами самими по себе, лизат Е.соЫ или система синтеза белка in vitro обрабатывались антибиотиком пуромицином, который вызывает диссоциацию полипептидных цепей от рибосом. Из рис.За,б видно, что небольшая часть белков DnaK и DnaJ, добавленных в систему синтеза in vitro, полученную из ADnaKJ-штамма, при отсутствии обработки системы пуромицином, движется в области 703-рибосом. а после обработки системы пуромицином почти полностью исчезает из рибосомных фракций. Следовательно эта часть DnaK и DnaJ связана с растущими полипептидными цепями на рибосомах. Несколько иначе ведет себя эндогенный DnaK в составе системы синтеза in vitro, полученной из штамма дикого типа (рис.Зв). Из рис.Зв видно, что эндогенный DnaK движется в широкой области, захватывающей как ТОБ-рибосомы, так и бОБ-рибосомные субчастицы, а после обработки системы пуромицином DnaK исчезает из 703-области, но остается в SOS-области. Вероятно, устойчивая к действию пуромицина часть DnaK, движение которой в градиенте сахарозы в точности совпадает с движением больших рибосомных субчастиц, является физически ассоциированной с SOS-субчастицами независимо от растущих полипептидных цепей. Физиологическое значение такого взаимодействия пока не ясно, но может отражать роль DnaK в сборке рибосом или в рабочем цикле рибосомы.

Итак, из трех анализируемых шаперонов: DnaK, DnaJ и GroEL, только DnaK и DnaJ могут взаимодействовать с растущим полипептидом на рибосомах. GroEL, который также необходим для правильного сворачивания и сборки многих белков, в рибосомных фракциях отсутствует и, согласно нашим данным, действует на другой более поздней стадии сворачивния и сборки белков, чем DnaK и DnaJ.

А: ¡«•йогйиный UiiaK Пур.£ ---— ' """"eWMljl

-чу p.jg -.......

»v»o г e н н ь> й unsj

Th

+нур. ?

В- ундигенный Dn&K

-Пур. .

•«tl(

Фразами ■ : ^>: '::у гралнг-н ;

на рибосомах в системе синтеза белка in vitro. Систем? синтеза белка in vit^o, ^"ит^зггУ";';" л "А7Т . ;г\\. .-.г

анализировались электрофорезом в присутствии ББЗ и затем иммуноблотингом с использованием анти-БпаК или aнти-DnaJ антител. Наличие или отсутствие обработки системы тгопштутом по1?ед

jnsJ Л'/баьм

ilL'itíMü iW,

":учона иъ Дььагы -циаммв.. ЬпаК и

-i - - А

:!t.'KVHCСлоты. ¡r.-, Aurr-hJ- ht^mmSí. ,1 ZñaJ

добавлялись перед началом синтеза белка. В: Анти-DnaK иммуноблоты. Система получена из штамма дикого типа. Никакие белки дополнительно не добавлялись. Г: Типичный 260 нм профиль для сахарозных градиентов, соответствующих показанным иммуноблотам. Отмечены пики, соответствующие 705-рибосомам. 50S- и ЗОЗ-рибосомным субчасшцам.

Глава 2. Агрегация цитоплазматических белков в ADnaKJ штамме.

Так как мы показали, что часть клеточных DnaK и DnaJ связаны с рибосомами и, в соответствии с моделью, участвуют в сворачивании новосинтезирующихся белков, то нас интересовало какие дефекты, связанные с синтезом белка могут присутствовать в штамме E.coli, полностью лишенном белков DnaK и DnaJ. Ранее в этой лаборатории Грагеровым и сотр. было показано, что в штаммах E.coli, мутантных по б32 (субъединице RMA-полимеразы, ответственной за узнавание промоторов теплового шока), в которых снижено количество всех белков теплового шока, в том числе DnaK и DnaJ, новосинтезирующиеся белки агрегируют и образуют тела включения. Соответственно нас интересовало, будут ли агрегировать белки в ADnaKJ-мутанте.

Из рис.4 видно, что при фракционировании лизата ADnaKJ-штамма на растворимую и нерастворимую фракции, значительная часть многих в норме растворимых цитоплазматических белков оказывается в нерастворимом осадке, то есть в виде высокомолекулярных агрегатов, и сверхпродукция DnaK и DnaJ в тех же клетках предотвращает агрегацию. Практически все белки в той или иной степени агрегируют в ADnaKJ мутанте, но разные белки агрегируют в различной степени. Достоверно идентифицированными белками, склонными к интенсивной агрегации как в ADnaKJ-мутанте, так и в ряде других мутантов по системе теплового шока, являются, например, ß и ß'-субъединицы РНК-полимеразы (обозначены на рис.4).

Так как в данной работе особое внимание уделялось изучению влияния шаперонов DnaK и DnaJ на сворачивание и сборку бактериального тримерного белка

хлорамфениколацетилтрансферазы (CATj), то на правой части геля на рис.4 и на расположенном ниже иммуноблоте проиллюстрирована агрегация CAT в ADnaKJ-мутанте в сравнении с диким типом. Видно, что CAT не является интенсивно агрегирующим белком и агрегирут лишь в умеренной степени. Как и для большинства агрегирующих в ADnaKJ-мутанте белков, сверхпродукция DnaK и DnaJ в тех же клетках предотвращает агрегацию CAT.

; рСАТ

1 /\DnoiU~

а-йРпаК! +р!<и I ~ ^ ' ' р о"1 I р о I

Рис.4. Агрегация цктоплазкатических белков в ДПпаКЛ-штамме.

анализировались электрофорезом ? присутствии ЗК. Спг-эпа •доказано положение различных белков на геле. Г-Созн&ЧгЕКЯ используемых штаммов: д.т., дикий тип; ДБпаМ, ДШа1и-штамм; Д0па1и+рК.1. ДDnaKJ-штaмм с дополнительной плазмидой, несущей гены йпаК и йпа>1; +рСАТ означает наличие плазмиды, ответственной за синтез хлорамфениколацетилтрансферазы. Внизу показан иммуноблот точно такого ке геля с анти-САТ антителами.

Глава 3. Влияние шаперонов DnaK и DnaJ на Формирование активной хлорамФениколацетилтрансФеразы при ее синтезе in vitro.

Так как в соответствии с моделью DnaK и DnaJ участвуют в сворачивании новосинтезированных белков, то было интересно изучить влияние DnaK и DnaJ на сворачивание какого-либо одного конкретного белка в процессе его синтеза in vitro. В качестве такого модельного белка был выбран тримерный бактериальный энзим хлорамфениколацетилтрансфераза (CATj).

Была получена сопряженная система транскрипции-трансляции in vitro из ADnaKJ-штамма, полностью лишенная шаперонов DnaK и DnaJ. Очищенные белки DnaK и DnaJ добавлялись в систему перед началом синтеза, чтобы оценить их влияние на формирование активной CAT в процессе синтеза in vitro.

При синтезе CAT в полученной системе в используемых нами условиях мы наблюдали длительное запаздывание (около двадцати минут) между появлением полноразмерного САТ-белка и появлением САТ-активности (рис.5). Предполагается, что это время необходимо для правильного сворачивания и сборки хлорамфениколацетилтрансферазы в данных условиях.

Из рис.5 также видно, что добавление DnaK и DnaJ в систему перед началом синтеза не влияет на скорость синтеза САТ-белка, но укорачивает время запаздывания и увеличивает активность формирующейся CAT в каждый отдельно взятый момент времени. Для стимуляции удельной САТ-активности добавление DnaJ не является строго обязательным, добавление только одного DnaK обеспечивает качественно сходный эффект. DnaK стимулирует CAT- активность только в том случае, если он присутствует с самого начала работы системы. Добавление DnaK после остановки синтеза тетрациклином и последующая инкубация системы вплоть до двух часов никак не влияют на формирующуюся в системе CAT активность.

Стимуляция удельной активности формируемой в системе CAT в ответ на добавление в систему DnaK предполагает, что некоторая часть САТ-белка после завершения его синтеза присутствует в системе в неактивной форме. Чтобы выяснить, что представляет собой неактивный САТ-белок, система была

время (мин.)

i

' Рис.5. Кинетика появления полноразмерного САТ-белка (пунктирная линия) и CAT-активности (сплошная линия) в сопряженной системе транскрипции-трансляции in vitro в присутствии (черные кружочки) и отсутсвии (незакрашенные окружности) добавленных перед началом синтеза DnaK и DnaJ. Система синтеза белка in vitro получена из ADnaKJ-штамма.

подвергнута центрифугированию в градиенте сахарозы. Как показано на рис.6, фракция агрегатов составляет только 5% САТ-белка, около 10% CAT движется в рибосомных фракциях, примерно 31% движется вместе с шапероном GroEL, и около 54% остается в верхней части сахарозного градиента. Дополнительная гель-фильтрация верхних фракций сахарозного градиента на колонке Superose-12 показала, что большая часть САТ-белка из этих фракций представляет соб^ой свободный неактивный САТ-мономер. Следует отметить, что присутствие вышеупомянутых неактивных форм САТ-белка в резултате синтеза in vitro не я^яется уникальной особенностью ДШаМ-системы. Те же неактивные формы энзима, хотя и в других соотношениях, присутствуют и в аналогичной системе, полученной из штамма дикого типа.

Так как главным побочным продуктом синтеза CAT in vitro в ADnaKJ-системе в используемых нами условиях оказывается неактивный мономер, и добавление DnaK способствует формированию активного тримера, то можно предположить, что DnaK мог бы взаимодействовать с САТ-полипептидом на какой-то ранней стадии его сворачивания и таким образам либо помогать поддерживать САТ-полипептид в состоянии, компетентном для последующей тримеризации, либо переводить САТ-мономер в компетентное для тримеризации состояние.

'Л'.:.. С. Фракционирование в градиенте заззазззь: различны:-; ааа-: С.чТ посла аннтазч 'a а;--:- и АСааР. - :;;"за.'-а пйБосинтазироьакнал Chi, меченная ^J5-мбтнонином, движется в грвдийнте сахарозы в виле четырех различных Форм: в риле :садка, ^вязанная г- ги^заамамн, связанная с агару :: зг-гадкая Сверху показан радиоавтограф геля, в котором анализировались фракции сахарозного градиента. Фракции на геле расположены последовательно от низа до верха градиента. Стрелкой показано дапизз;;::-:- лазазр^зкауяг- a J/-Л :а-язз .¡ик агоМ, :: ::;:з за,:з,а-: :на ризунг.- на показана: расположены тзчн: б та-:-: за :амах !-'0'.аах, аа, а ссогветстн'/ю.ипе и/, гики ГАТ, связанная с GrcEL :: з/-Т, ;вязаннсй с рисзззмами. з1иагза:д.:а внизу лдлнатрнрузт процентный состав различных форм CAT в реакционной смеси. Следует отметить, что фракция осадка нагружена на гель в количестве, в четыре раза превышающем стандартное, поэтому полоса осадка на радиоавтографе выглядит преувеличенной.

Глава 4. Влияние аалеронов РпаК и DnaJ на реконструкцию денатурированной гуанидинхлоридом хлорамфениколацетилтрансферазы.

Кроме синтеза в бесклеточной системе, шаперон-зависимые сворачивание и сборка CAT изучались при разбавлении денатурированной CAT из 6М раствора гуанидинхлорида в буфер, не содержащий денатуранта. i

По сравнению с описанной в предыдущей главе системой синтеза in vitro, описываемая здесь система разбавления денатурированного белка из раствора гуанидинхлорида является более простой, и изначально сворачивание очень многих белков традиционно изучалось именно в такой системе. Хотя и очевидно, что реконструкция предварительно денатурированного белка в пробирке отличается от сворачивания новосинтезирующегося белка в клетке во время его синтеза на рибосоме, тем не менее считается, что у этих двух процессов может быть много общего.

Оказалось, что САТ: при разбавлении из раствора гуанидинхлорида испытывает серьезные трудности со сворачиванием в активную конформацию. После разбавления денатурированной CAT просто в буферный раствор без каких-либо добавок в наших условиях нам не удавалось получить практически никакой активности (рис.7, линия 1), при этом вся CAT оказывалась в форме высокомолекулярных агрегатов (рис.8, линии 1,2); если же в разбавляющем растворе присутствовали различные шапероны, то в растворе после разбавления обнаруживалась САТ-активность, и заметная порция САТ-белка оказывалась в растворимом, несагрегированном состоянии (рис.7, линии 2-5; рис.8, линии 3-6).

Как видно из рис.7 и рис.8, обе шаперонные системы: и DnaK-DnaJ-GrpE, и GroEL-GroES (белки DnaJ и GrpE являются кошаперонами для DnaK; GroES является кошапероном для GroEL) в той или иной степени способствуют формированию активной CAT и предотвращают ее агрегацию при разбавлении денатурированного энзима из раствора гуанидинхлорида.

При разбавлении CAT из раствора гуанидинхлорида в буфер, содержащий DnaK, существенно больший выход активного энзима получается, если в разбавляющем буфере DnaK присутствует вместе с ADP, по сравнению с ситуацией, когда DnaK

Рис.7. Разбавление CAT из раствора гуанидинхлорида в различные ' системы.

DnaK, GroELS, Буфер ATP ATP

1 2 3 4

Рис.8. Различная степень агрегации CAT при разбавлении из раствора гуанидинхлорида в буферный раствор без каких-либо добавок и при разбавлении в две различные шаперонные системы. '

Обозначения: р, растворимая фракция; о, осадок; GroELS, белки GroEL и GroES присутствовали в разбавляющем буфере.

- присутствует вместе с- АТР (рис.7, линии 2.3). -Хотя, как считает:;], в ^акгсрналыгн вл~тк'~ АРР ;i -IP хрхоутотрххт : раВНивсиний иМеСИ С ПрИОЛИЭйТсЛЬпи ДсСй l'HtvpaiпиМ НреииЛаД&НИсм

зРР, и сптуашьч, ко.'ла 'Гс'к^Т'гзу-еч Т'.дь.кх '.DP, являете-безусловно искусственней, тем по менее вышеупомянутое ;в.:л;в/;с nil- ;/■ -ffr': вал :.ухсов-ч., Ви>у.г:з •.ивхпмнЧ'-х-чх<"

обладает большим сродством к самым разнообразным субстратам,

TT/-NW ATD. пп г? о /-1 тутт/-\ П Г\ Г^ m » ft г г-. гг^^лигплшгто А^Р Mv> О I/ » m

связывать какой-то интермедиа? сворачивания CAT более эффективно. А стадия отпускания субстрата (которая, как полагают, облегчается, если DnaK связывает АТР), по-видимому, не является в этой системе решающей.

Присутствие в разбавляющем буфере вместе с DnaK его кошаперонов DnaJ и GrpE несколько повышает выход активной CAT (рис. 7. липни 4 и 5';.

Из всех нагпх зхспечхвенхОЕ по ра.кавлениг: .'а.Т п.: rexxry-i .'учнидиухлор'.'да. ухлвиа сворачивание С.-:, видимо, хап:::ее хрх: г-. : у л/вилм л-лрзчк;лх:,'0 " хлеуе,

азбевлгнхе х;:0х:х:длс в сххочнну?; в предыдущей пз?е систему вхвт-ва :"-.',ка Р" у,\г:., с'Держа it;jB лиза: Р :", а. х-:гЧ.е h.-ееталвнхе органические и неорганические кч/воневты кле.к;: Е.::\: рис.". линии . £ этом случае, хах х в :лучае синтеза CAT in vitro, добавление в Д0гшК.1-сис тему очищении!о

Пр^Х/" гтг^ттрп TTTi т/ б.пгтмпа^у тэмуотту avT^puop С ¿Т ^ ГИг ^ ЛИ^ИИ

)

ВЫВОДЫ

1. Часть клеточных DnaK и DnaJ связана как с растущими полипептидными цепями на рибосомах E.coli, так и с рибосомными субчастицами непосредственно. Шаперон GroEL с растущими цепями не взаимодействует, но кратковременно связывает полноразмерные новосинтезированные белки после их диссоциации от рибосом, что свидетельсвует о том, что в пути сворачивания и сборки белков DnaK действует раньше GroEL.

2. Существенное количество в норме растворимых цитоплазматических белков агрегирует в ÄDnaKJ-клетках E.coli.

3. Добавление DnaK и DnaJ или одного DnaK стимулирует образование активной хлорамфениколацетилтрансферазы в системе синтеза белка in vitro, полученной из ADnaKJ-штамма. Для проявления этого эффекта DnaK должен присутствовать с самого начала работы системы.

4. Значительная часть хлорамфениколацетилтрансферазы, синтезированной in vitro, а также после разбавления из раствора гуанидинхлорида, - неактивна и присутсвует либо в ферме неактивного мономера, либо в комплексе с шапероном GroEL, либо в высокомолекулярных агрегатах. DnaK повышает выход активного тримера в обеих системах.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации.

1. Vysokanov, А. V. 1995. Synthesis of chloramphenicol

acetyltransferase in a coupled transcription - translation in vitro system lacking the chaperones DnaK and DnaJ. FEBS Letters 3'/^ 2ll-2i4.

2. Gaitanarls.G. A., Vysokanov.A., Hung,C., Gottesman.M.E., Gragerov.A. 1334. Successive action of Escherichia coli chaperones in vivo. Molecular Microbiology 14 (5), 861-869.

3. Gragerov.A., Vysokanov, A., Gottesman, M.E., 1994. Successive action of Escherichia coli chaperones in vivo. Abstracts of papers presented at the 1994 meeting on Biology

of Heat Shock Proteins Molecular Chaperones. Cold Spring Harbor Laboratory. Cola Spring Harbor, New York. P.115.

■1. Грагеров A. И. , Нудлер E.A., Комиссарова H.B. , Высоканов Л.В., Никифоров В.Г. 199?.. Генетический контроль агрегации и протеолиза белков у бактерий. Тезисы докладов II Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная и Клеточная Инженерия". (Ноябрь декабрь 1991 года, Пущино-на-Оке). Москва - 1992. Стр.14.