Шапероны в реакции клеток К562 на тепловой стресс

Новоселов, Сергей Станиславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Шапероны в реакции клеток К562 на тепловой стресс
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Шапероны в реакции клеток К562 на тепловой стресс"

На правах рукописи

НОВОСЕЛОВ Сергей Станиславович

ШАПЕРОНЫ В РЕАКЦИИ КЛЕТОК К562 НА ТЕПЛОВОЙ СТРЕСС

03.00.25. - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в лаборатории защитных механизмов клетки Института цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Маргулис Борис Александрович Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Медведева Наталья Дмитриевна Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук Сапожников Александр Михайлович Институт биоорганической химии РАН, Москва

Ведущая организация: НИИ экспериментальной

медицины РАМН, Санкт-Петербург

Защита состоится «1Д» ноября 2004 г в К часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, д. 4. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН. Автореферат разослан « » октября 2004 года

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук г-А *-.1-^ И.И.Марахова

2005-4 Общая характеристика работы

13037 ! Актуальность проблемы

Роль белков теплового шока (Heat shock proteins, Hsp) в защите клеток от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды, а также в процессах клеточной репарации, сегодня не вызывает сомнений. Наиболее изученным является основной белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа - Hsp70 (Маргулис, Гужова, 2ООО). Защитная роль этого белка во многом обусловлена его шаперонной активностью - способностью поддерживать денатурированные и вновь синтезированные полипептиды в развернутой конформации. Из этого вытекает участие шаперонов в таких жизненно-важных клеточных процессах, как транспорт белков в различные компартменты, сборка из них активных структур, а также утилизация необратимо денатурированных белковых молекул. На сегодняшний день достоверно показано участие белков теплового шока в патогенезе многих заболеваний, а также накапливаются факты о возможном терапевтическом и иммуномодулируюшем эффекте Hsp70.

В основе шаперонного механизма Hsp70 лежит связывание им гидрофобных участков последовательности белков-мишеней, оказавшихся на поверхности белковых молекул вследствие утраты ими нативной конформации. Hsp70 может восстановить нарушенную исходную укладку полипептидной цепи, однако работа этого шаперона невозможна без участия регуляторных белков-помощников, в первую очередь Hdjl (Hsp40) и Bagl. Именно взаимодействие этих белков-кошалеронов с Hsp70 вызывает последовательное АТФ-зависимое изменение его конформации, делающее возможным захват и высвобождение субстратов (Takayama et al., 1997; 1999; Zeiner et al., 1997; Cheetham et al„ 1998, Kelley, 1998).

Общие принципы работы шанеронного механизма на базе Hsp70 в настоящее время достаточно полно описаны, в основном благодаря интенсивным экспериментам in vitro, проводившимся в конце 90-х годов с изолированными рекомбинантными белками, происходящими из разных видов млекопитающих и микроорганизмов. Исключительно важное, на наш взгляд, значение имеют количественные характеристики взаимодействия Hsp70 с двумя основными белками-помощниками. Их соотношения, по-видимому, являются определяющим звеном регуляции работы всего шаперонного механизма Hsp70. Смещения баланса между рассматриваемыми белками может приводить к изменениям активности системы на тех или иных этапах ответа клетки на стресс. Значительный прогресс в понимании влияния кошаперонов Hdjl и Bagl на активность Hsp70 был получен благодаря опытам in vivo. Однако попытки описания взаимодействия участников шаперонно-субстратного комплекса, оверэкспрессируемых в модельных клетках, также не внесли полной ясности. Основной проблемой исследователей явилось нарушение клеточного метаболизма множественной трансфекцией. Таким образом, сегодня все еще не хватает информации о взаимодействии Hsp70 с белками-помощниками Hdjl и Bagl в живых клетках, располагающих естественным полем деятельности для клеточных шаперонов. Оптимальной системой для оценки шаперонной активности Hsp70 является, на наш взгляд, клеточный экстщщ^__содержащий шапероны, белки-помощники и белки-мишени в реальных коли Кроме того,

БИБЛИОТЕКА 1 (.Петербург V О, О» МО 4kd-H

внесение дополнительных факторов в экстракт не вызывает усложнения системы или ее искажения, особенно при применении рекомбинантных белков человека, практически идентичных эндогенным.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилась характеристика шаперонной активности Hsp70 и выявление при помощи традиционных и новых оригинальных методов степени ее регуляции количественными изменениями кошапсронов Hdjl и Bagl в реакции клеток человека на тепловой стресс.

Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи:

• показать взаимодействие белков Hsp70, Hdjl и Bagl на разных стадиях ответа клеток на тепловой стресс с помощью методов реципрокной ко-иммунопреципитации и конфокальной микроскопии;

• разработать, изготовить и апробировать специальную разновидность иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного определения Hsp70 в различных образцах;

• оценить с ее помощью изменение количества Hsp70 в клетках человека в развитии реакции на тепловой шок;

• определить степень влияния АТФ и АДФ на шаперонную активность Hsp70, очищенного и в составе клеточных экстрактов;

• охарактеризовать влияние кошаперонов Hdjl и Bagl на шаперонную активность Hsp70 , очищенного и в составе клеточных экстрактов;

• выяснить направленность воздействия Bag- и J-доменов белков семейств Bag и Hdj на шаперонную активность Hsp70.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. степень связывания белком теплового шока 70 кДа своих кошаперонов Hdj 1 и Bagl определяется этапом реакции клетки на стресс;

2. созданная принципиально новая система иимуноферментного анализа для количественного определения Hsp70 может быть успешно использована на практике, в том числе вместе с оригинальной системой ИФА для оценки шаперонной активности данного белка;

3. шаперонная активность Hsp70 регулируется ею количественными соотношениями с кошаперонами Hdj 1 и Bagl ;

4. молярная концентрация АТФ является критичной для выполнения Hsp70 его шаперонной функции;

5. консервативные J- и Bag-домены кошаперонов Hdjl и Bagl способны модулировать шаперонную активность Hsp70, очищенного и в составе клеточных экстрактов.

Научная новизна.

Прослежено изменение шаперонной активности основного белка теплового шока Hsp70 в развитии реакции клеток лейкемии человека К562 на тепловой стресс. Показано, что при этом изменяется как предпочтительность связывания Hsp70 с кошаперонами Hdjl и Bagl, так и внутриклеточная локализация этих белков. Произведено точное измерение количеств основного белка теплового шока Hsp70 и его кошаперонов, в том числе с помощью разработанной нами принципиально новой разновидности иммуноферментного анализа. Эти данные впервые позволили сделать вывод, что шаперонная активность Hsp70 определяется его соотношением с белками-помощниками Hdjl и Bagl.

Получены данные о критичности АТФ для выполнения шаперонной функции белком Hsp70. Показано, что высокоафинные к Hsp70 консервативные домены кошаперонов Hdjl и Bag! способны угнетать его шаперонную активность, что подтверждает возможность регуляции функции Hsp70 специфическими петидами на клеточном и организменном уровнях.

Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные результаты свидетельствуют о саморегуляции шаперонной системы на базе Hsp70 в процессе реакции клеток К562 на тепловой стресс соотношением белков Hsp70, Hdj 1 и Bagl. Успешное использование консервативных доменов белков Hdjl и Bagl для угнетения шаперонной активности Hsp70 позволяет проводить разработку различных пептидных модуляторов активности шаперонов. Помимо фундаментальных исследований, такие пептидные модуляторы могут быть использованы в медицинской практике для выключения защитных систем раковых клеток и активации таких систем в клетках, моделирующих протеотоксические заболевания.

Разработанная принципиально новая разновидность иммуноферментного анализа для количественного определения Hsp70 успешно апробирована в научных и медицинских исследованиях и готова к широкому применению. Результаты работы войдут в материалы специального учебного курса по шаперонным системам, читаемым на биолого-почвенном факультете СПбГУ.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 3 статьи и 1 свидетельство о патентной защите. Основные положения представлены на 1-ой ежегодной Международной конференции северных стран по ответу на стресс (The Nordic Stress Response Network), (21-23 сентября 2001 г, Копенгаген, Дания); Международной конференции балтийских стран по клеточной биологии (NorFA Baltic Meeting on Cell Biology), (22-25 мая 2003 г, Тарту, Эстония); 13-ой Европейской конференции по артериальной гипсртензии (13-17 июня 2003 г, Милан, Италия); 1-ом съезде Общества клеточной биологии, (14-16 октября 2003 г, Санкт-Петербург); Международном междисциплинарном семинаре «Прогресс в биотехнологии и нейробиологии - интегративная медицинам, (14-24 февраля 2004 г, Хургада, Египет);

8-ой Междисциплинарной Международной конференции «Стресс и поведение», (1719 мая 2004 г, Санкт-Петербург); 4-ой Международной конференции по молекулярной биологии ответа на стресс, (13-16 мая 2004 г, Вуан, Китай); 13-ой Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (24-27 мая 2004 г, Санкт-Петербург), 14-ой Европейской конференции по артериальной гипертензии (13-17 июня 2004 г, Париж, Франция).

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 140 публикаций. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста и иллюстрирована 18 рисунками и 2 схемами.

Материал и методика.

Культивирование клеток и тепловой стресс.

Клетки эритролейкемии человека К562 (Lozzio and Lozzio, 1975), полученны из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН. За 1 ч до теплового шока отбирали аликвоты клеточных суспензий и производили подсчет мертвых клеток в камере Ньюбауэра, окашивая их трипановым синим. Если доля таковых не превышала 5%, клеточные суспензии переносили в свежую среду до конечной концентрации 0.5х106 кл/мл, и флаконы с клетками нагревали на водяной бане при 43 °С в течении 60 мин, после этого клетки возвращали на 37 °С. По прошествии различных временных периодов флаконы с клетками извлекали из термостата и клетки лизировали с добавлением ингибиторов протеолиза. Далее определяли концентрацию белка в экстрактах (Bradford, 1976) и использовали 100 мкг белка для приготовления электрофорезных проб, а 1 мг - для иммунопреципитации или определения шаперонной активности Hsp70.

Иммунопреципитация.

Иммунопреципитацию белков Hsp70, Hdjl и Bagl осуществляли из экстрактов, полученных из клеток через 4, 20, 24 и 48 ч после теплового шока, а также из экстракта контрольных клеток. Для иммуноиреципитации использовали полученные в нашей лаборатории мышиные моноклональные антитела ЗВ5 (Guzhova et al., 1997) и J25 (Новоселов и др., 2004), к белкам Hsp70 и Hdjl соответственно, и очищенные поликлональные кроличьи антитела RHAP, узнающие все изоформы белка Bagl. Антитела добавляли в приготовленные клеточные экстракты, после чего смесь инкубировали в течении 16 ч при +5 °С в микроцентрифужных пробирках с постоянным плавным перемешиванием содержимого. После этого в пробирки добавляли избыток белка G, иммобилизованного на 4В-сефарозе, и содержимое перемешивали в тех же условиях еще три часа. Затем гель отмывали четыре раза последовательными циклами добавления 1 мл буфера К и осаждения с удалением надосадочной жидкости. После отмывки к гелю добавляли 20 мкл буфера Лэммли

Приготовление проб завершали 5-минутной инкубацией проб при 100 °С с последующим центрифугированием.

Иммуноблотинг.

Электрофоретическое разделение белков проводили ио методу Лэммли (Laemmli, 1970) в 11 % полиакриламидном геле с додецил-сульфатом натрия. Перенос электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану производили при помощи аппарата Novablot. Иммунную детекцию Hsp70, Hdjl и Bagl проводили теми же антителами, которые использовали для иммунопреципитации, а также вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Для визуализации пероксидазной реакции использовали методику усиленной хемилюминесценции.

Конфокальная микроскопия.

Клетки выращивали на покровных стеклах в лунках 24-луночной платы в течение 4, 24 и 48 ч после теплового шока. По окончании инкубации клетки фиксировали 30 мин 4 % формальдегидом, а затем еще 5 мин холодным 95 % этанолом, после чего дважды отмывали PBS. Далее клетки инкубировали 1 ч с 1 % бычьим сывороточным альбумином для уменьшения неспецифического связывания. Аналогично поступали с контрольными клетками. Для выявления Hsp70, Hdjl и Bagl использовали антитела, описанные выше, в разведении 1:150. Соответствующие вторые антитела, конъюгированные с TRITC или FITC, использовали, следуя рекомендациям производителя. Затем препараты тщательно отмывали PBS, монтировали на предметные стекла и исследовали при помощи конфокального микроскопа.

Определение количеств белков Hsp70. Hdjl. и Bagl.

Определение количеств белков Hsp70, Hdjl и Bagl в клеточных экстрактах производили с помощью компьютерной программы TotalLab v2.00. В качестве входных данных программа использовала результаты иммуноблотинга. Программа сравнивала интенсивность окраски специфическими антителами белковых зон в электрофоретически разделенных пробах клеточных экстрактов с интенсивностью окраски теми же антителами известных количеств высокоочищенных белков.

Определение количеств Hsp70 методом ИФА.

Для более точного определения количеств основного белка теплового шока Hsp70 в клеточных экстрактах использовали новую разновидность иммуноферментного анализа (Новоселов и др., 2004; Моисеева и др., 2004).

В лунки 96-луночной платы для ИФА вносили раствор альбумина, конъюгированного с АТФ. За время 60 минутной инкубации при 37 °С происходила иммобилизация молекул белка, а, следовательно, и производного АТФ на внутренней поверхности лунок. Далее в лунки вносили буферный раствор, содержащий опытные образцы, а также стандартные разведения очищенного Hsp70, необходимые в дальнейшем для построения калибровочной кривой. Следующим реактивом,

помещавшимся в лунки, являлся раствор поликлональных кроличьих антител R2 против Hsp70, коньюгированных с пероксидазой хрена. Все этапы ИФА чередовали трехкратной промывкой лунок. Растворы опытных образцов и антител инкубировали по 60 мин при комнатной температуре после чего вносили в лунки раствор ортофенилендиамина в цитратном буфере с добавлением перекиси водорода. После 30 минутной инкубации ферментативную реакцию останавливали. Интенсивность окраски определяли спектрофотометрически с помощью анализатора иммуноферментных реакций АИФР-01 Униплан на длине волны 450 нм. По значениям оптической плотности для известных концентраций Hsp70 строили калибровочную кривую. Используя эту кривую, определяли искомую концентрацию Hsp70 в исследуемых образцах.

Определение шаперонной активности Hsp70.

Определение субстрат-связывающей (шаперонной) активное га Hsp70 производили с помощью ИФА по методу Ваврзинов (Wawrzynow, Zylicz, 1995), с изменениями. Необратимо денатурированный белок-мишень - альфа-карбоксиметилированный лактальбумин, иммобилизовывали на 96-луночном планшете для ИФА часовой инкубацией при 37 °С, производили забивку лунок раствором бычьего сывороточного альбумина для предупреждения неспецифического связывания. Далее в лунки вносили различные разведения очищенного Hsp70 или клеточные экстракты с добавлением тех или иных белков и/или АТФ. Белок теплового шока 70 в различной степени связывался с денатурированным белком-мишенью, после чего в лунки вносили раствор Н$р70-специфических поликлональных антител R2, коньюгированных с пероксидазой хрена. На последнем этапе проводили оценку количеств связавшегося с субстратом Hsp70, внося в лунки раствор перекиси водорода и хромогена, ортофенилендиамина. Пероксидазная реакция развивалась 15 мин в темноте, после чего ее останавливали добавлением 0.19М раствора серной кислоты и производили измерение оптической плотности на длине волны 450 нм анализатором иммуноферментных реакций АИФР-01 Униплан. Все этапы ИФА чередовали трехкратной промывкой лунок. Растворы забивки, опытных образцов и антител инкубировали по 60 мин при комнатной температуре. Шаперонная активность выражена в относительных единицах (относительная единица равна значению оптической плотности, умноженному на 1000) В качестве отрицательного контроля использовали бычий сывороточный альбумин (BSA) и рскомбинантный белок глютатион-в-трансферазу (GST), не оказавшие никакого влияния на шаперонную активность Hsp70.

Плазмиды.

Для изготовления плазмиды pGEX-2T-JDom кодирующая последовательность J-домена (аминокислоты 1-70 человеческого белка Hdjl) была амплифицирована посредством ПЦР (праймеры: 5'-AAG СТТ CGG АТС CAT GGG ТАА AGA СТА СТА С-3'; 5'-AAG СТТ GGA ТСС СТА ССС СТТ TAG GCC TTC СТ-3') на матрице плазмидной ДПК pGEX-4Tl-Hdjl (любезно предоставлена д-ром С. Фокс, США) и субклонирована в вектор pGEM-T. После проверки правильности нуклеотидной

последовательности секвенированием, фрагмент вырезали рестрикгазой BamHI и клонировали в вектор pGEX-2T.

Для изготовления плазмиды pGEX-2T-BagDom кодирующая последовательность Bag- домена (аминокислоты 280-352 человеческого белка BaglM) была амплифицирована посредством ПЦР (праймеры: 5'-GCC CGG АТС СТТ GCA AGC TGA AGC ТСТ CTG-3'; 5'-GCA GTT GAA TTC CTG CAG CCG CTC AGT CTC CT-3') на матрице плазмидной ДНК pMal-c2-BAGl (любезно предоставлена д-ром Й. Хохфельдом, Германия) и субклонирована в вектор pGEM-T. Далее следовало секвенирование, затем фрагмент вырезали реириктазами BamHI и EcoRI и клонировали в вектор pGEX-2T.

Белки.

Hsp70 получали из красной мышцы быка по ранее описанной методике (Schlossman et al., 1984; Guzhova et al., 1998), состоящей из последовательно примененных ионно-обменной и аффинной хроматографии.

Рекомбинантные высокоочищенные белки человека Hdjl и Bagl были получены в дар от профессора Й. Хохфельда (Германия).

Рекомбинантные белки JD-GST, BD-GST и GST представляли собой продукты плазмид pGEX-2T-JDom, pGEX-2T-BagDom и pGEX-2T соответственно. Препараты белков были получены путем продукции в E.coli (штамм JM109) и очистки на глютатион-сефарозе с использованием стандартных протоколов.

Для дальнейшей работы использовали только высокоочищенные препараты белков с чистотой не менее 95%.

Статистический анализ.

Графическое представление числовых экспериментальных данных сделано при помощи программы Microsoft Excel. Результаты исследования количеств и шаперонной активности Hsp70 методом иммуноферментного анализа получены в ходе трех независимых экспериментов, каждый из которых дублировался. Обработка результатов проведена с помощью стандартного пакета статистических программ Statistica 5.5 for Windows.

Результаты.

В качестве модельной системы были выбраны клетки эритролейкемии человека К562. Выбор данной клеточной линии объяснялся высоким базовым уровнем содержания белков Hsp70, Hdjl и Bagl, классическим характером изменения их количеств в клетках после теплового шока, а также приобретением клетками термотолерантности под действием мягкого теплового шока.

Было показано, что тепловой шок вызывает накопление Hsp70 и Hdjl (Hsp40), количество которых в клетках К562 достигает максимума через 20-24 ч и затем, спустя 48 ч, практически возвращается к исходному уровню. Количество второго кошаперона - Bagl, представленного четырьмя изоформами - BaglL, BaglM, BaglS и р29 -практически не изменяется (рис. 1).

Рис. 1. Содержание белков №р70, Нф и Ва§1 в экстрактах клеток К562, приготовленных в разное время после теплового воздействия.

а - иммуноблот, б - график изменения содержания белков, построенный по результатам сканирования блота

Дальнейшие эксперименты были выполнены в периоды времени, соответствующие началу накопления белков (4 ч), максимуму (20-24 ч) и спаду их содержания в клетках (48 ч).

В первую очередь мы показали факт физического взаимодействия Нзр70 с его кошаперонами в выбранных нами точках кривых накопления. Для этого были приготовлены экстракты клеток К562, собранных в соответствующие моменты времени. Проведенная далее ко-иммунопреципитация Шр70, Нф 1 и Bagl носила реципрокный характер: используя антитела к №р70 мы со-осаждали связанные с ним в данный момент кошапероны Нф 1 и Ва§1, а используя антитела к кошаперонам - со-осаждали связанный с ними №р70 Искомое взаимодействие было обнаружено во всех временных точках (рис. 2). В качестве отрицательного контроля использовали преиммунные сыворотки, которые не вызвали осаждения рассматриваемых белков.

Данные иммунопреципитации Нэр70 моноклональными антителами ЗВ5 в целом соответствовали картине нарастания количества этого белка в клетках с течением времени после теплового шока. Однако наибольшее количество белка Нвр70, преципитируемого антителами, содержалось в клетках, культивированных 4 ч после нагрева (рис. 2, а и б), т.е. в точке, в которой содержание Шр70 не было максимальным. Оба кошаперона - Н(Щ и Bagl- ко-иммунопреципитировались с Нвр70. Оказалось, что рост количества образовавшихся комплексов Н5р70-Ш] 1 происходил на ранних сроках после теплового шока (рис. 2, а). Образование комплексов Нэр70 - Bagl, напротив, имело место в основном на более поздних сроках ответа клеток на тепловой шок (рис. 2, в и г).

и**»

К 4 20 24 48 ■■■■■И к<1; 1

в_

К 4 20 24 48

[Я* 1

Рис. 2. Реципрокная ко-иммушлфеципигация пар белков Нзр70 и Н<1)1, Нкр70 и Ва§1 специфическими антителами из клеточных экстрактов, полученных через разные промежутки времени после гипертермии (обозначены цифрами; К - контрольные клетки).

а, в - осаждение антителами ЗВ5 к Нзр70, б - антителами 125 к Нф1, г -антителами ИНАР к Ва§1

С помощью метода конфокальной микроскопии установлено, что локализация Нзр70 и его кошаперонов в клетках в реакции на тепловой шок претерпевают существенные изменения. В контрольных клетках локализация НБр70 и Нё] 1 различна, хотя оба они находятся в цитоплазме. Отчетливо видно, что количества Нвр70 и Нф! заметно нарастает уже через 4 ч, при этом оба белка частично идут в ядро, а расположение их совпадает в цитоплазме и частично в ядре. Через 24 ч после стресса клетки характеризуются максимальным количеством шаперонов. Совпадение локализации Шр70 и Нф 1 теперь имеет место только в цитоплазме. По истечении 48 ч после теплового шока количество белков уменьшается практически до исходного уровня и они, преимущественно, имеют различную локализацию.

Иначе обстоит дело с белком Bagl. Он не относится к белкам теплового шока и его количество остается постоянным в ходе реакции клеток на гипертермию. В контрольных клетках Шр70 и Bagl находятся в цитоплазме, где их локализации преимущественно не совпадают. Через 4 ч после теплового шока Нвр70 и Bagl частично переходят в ядро, причем количество Нзр70 увеличивается, а Bagl - нет. Локализации белков совпадают как в цитоплазме, так и в ядре. Через 24 ч после теплового шока количество Нзр70 еще велико, но при этом его локализация, в основном, не совпадает с локализацией белка Bagl. Через 48 ч количество Нзр70 падает, но именно в это время его расположение максимально близко к Bagl, особенно там, где его еще относительно много - в цитоплазме.

Более точное определение количеств Нэр70 в экстрактах клеток К562 было осуществлено с помощью принципиально новой системы иммуноферментного анализа, основанной на использовании высокого сродства белка НБр70 к иммобилизованному АТФ. Прототип системы прошел успешные испытания в двух независимых работах: по определению количеств Шр70 в сыворотках крови больных

К 4 20 24 48

Нчр70

ВаВ 1

гипертонической болезнью (Моисеева и др., 2004) и в образцах опухолей женской мочеполовой сферы (Новоселов и др., 2004).

Выяснилось, что примененный нами тепловой шок вызывал 5-кратный прирост количества Нвр70 к 24 ч (рис. 3), что несколько расходилось с данными компьютерной обработки результатов иммуноблотинга, предсказуемо продемонстрировавшего меньшую точность и чувствительность.

в 0.8

§ 0,6

о 0,2

* 0

Рис. 3. Количественное определение Нвр70 в экстрактах клеток К562 на разных этапах ответа на тепловой шок (сравнение результатов, полученных с помощью ИФА и иммуноблотинга).

со <М.о"

D ИФА

ЕЭбЛОТ

со

а* £

а. тг £

аЗ

— W Я в J (Ч А *

■о X

Дальнейшие эксперименты по оценке шаперонной активности Hsp70 проводились в системах in vitro и ex vivo с использованием другой, модифицированной нами, разновидности иммуноферментного анализа.

В первую очередь нами было исследовано влияние различных концентраций АТФ и АДФ на шаперонную активность изолированного Hsp70. Выяснилось, что повышение концентрации АТФ выше физиологического уровня вызывало резкое дозозависимое угнетение шаперонной активности, а АДФ не влиял на нее (рис 4).

Шаперонная активность Hsp70 неразрывно связана с циклами гидролиза-замены АТФ, происходящих под действием белков-помощников Hdjl и Bagl. Проведенная нами оценка выявила АТФ-зависимое стимулирование шаперонной активности Hsp70 его белками-помощниками. При этом Hdjl,

Рис. 4. Влияние АТФ и АДФ на шаперонную активность изолированного Hsp70.

запуская первую фазу тпаперонного цикла, обладал большим стимулирующим воздействием, чем белок Ва§1. Внесение АТФ в физиологической микромолярной концентрации усиливало потенцирующий эффект кошаперонов на активность Нзр70

Поскольку в клетках все участники шаперонного комплекса присутствуют одновременно, нами было исследовано совокупное влияние различных соотношений очищенных белков НсЩ и на шаперонную активность изолированного Нзр70 (рис. 5). Для этого были выбраны три соотношения кошаперонов Нф1/Ва§1: 5ng/5ng (моделирует ситуацию в контрольных клетках), 50ng/5ng (моделирует накопление Нф1 после теплового шока) и (для выяснения влияния повышенных

концентраций на активность Нвр70). В отсутствие АТФ активирующее действие белков-помощников было незначительным (рис. 5, а), однако внесение АТФ до конечной концентрации 1 мкМ/мл вызывало значительный рост субстрат-связывающей активности Нзр70 (рис. 5, б).

600

500

Hsp70, пд/лунку

100

Hsp70

Hsp70 uATP 5/5 Hsp70 uATP 50/50 Hsp70 uATP 50/5

Hsp70, пд/лунку

100

Рис. 5. Влияние разных количеств белков Hdjl/Bagl на шаперонную активность Hsp70 в отсутствие (а) и в присутствии (б) АТФ (1 мкМ/мл). Наибольшим активирующим влиянием обладает соотношение кошаперонов Hdjl/Bagl = 50/5. Повышение количества Bagl не дает роста активности Hsp70.

Шаперонная активность Нзр70 в экстрактах клеток К562, приготовленных на разных этапах их реакции на тепловой шок, оказалась подвержена значительным

колебаниям. Достоверно нарастая уже к 4 ч после теплового шока, она достигала максимального уровня к 24 ч и практически возвращалась к исходному к 48 ч (рис. 6).

1200 -

О 1000 --

-ЕхКК -■Ех^4

- Ех1г 24

- Ех1г 48

800 -

I» 600 ■

I 400 -

ё 200 -1-'"

-х-

(Общ белок], пд/лунку

100

Рис. 6. Шаперонная активность Н«р70 в экстрактах, приготовленных из клеток К562 на разных сроках после теплового шока, значительно изменяется.

Точно определив количество белка Нвр70 в экстрактах клеток К562 на разных стадиях реакции на тепловой шок (рис. 3), мы соотнесли значение шаперонной активности Ньр70 в экстракте со значениями тпаперонной активности таких же количеств очищенного белка. Выяснилось, что шаперонная активность Нвр70 в экстрактах значительно выше таковой чистого №р70, превышая ее в 2 раза в экстракте, приготовленном из клеток, инкубировавшихся 4 ч после теплового шока и в 3 раза в экстракте, приготовленном из клеток через 24 ч после теплового тока (рис. 7). Общий же прирост шаперонной активности к 24 ч составлял 14 раз при росте количества Нзр70 в экстракте в 5 раз по сравнению с экстрактом контрольных клеток

Рис. 7. Шаперонная активность НБр70 в клеточных экстрактах отлична от активности таких же количеств изолированного белка Нзр70.

Наблюдаемое расхождение значений потенциально ожидавшейся и реально регистрируемой шаперонной активности могло говорить о растущем влиянии некого агента на активность Нвр70 в развитии реакции клеток на тепловой шок. Наиболее вероятным претендентом на роль такого агента являлся белок Нф 1.

(рис. 3,7).

Шр70 Экстр К Нзр70 Экстр 4 №р70 Экстр 24 Нзр70 Экстр 48

Для проверки предположения об определяющей роли белка Нф1 в стимуляции шаперонной активности Нвр70 в развитии реакции клеток на тепловой стресс нами было осуществлено внесение избыточных количеств очищенного кошаперона Нф 1 во все клеточные экстракты. Это действительно вызвало рост шаперононой активности НярТО.

Максимальный прирост наблюдался в экстракте, приготовленном из контрольных клеток, затем следовали экстракты, приготовленные из клеток, инкубировавшихся 4 и 48 ч после стресса. Минимальный же прирост активности сопровождал внесение Нф 1 в экстракт клеток, инкубировавшихся 24 ч после теплового шока с максимальным содержанием эндогенных шаперонов (рис. 8).

3,5

| 3

¡5 2,5

i 2

" 14

Й л*

а 1

а. 0,5 i

с о!

2,99

11 ■ В

1,63

Экстр К Экстр 4 Экстр 24 Экстр 48 Экстр К Экстр 4 Экстр 24 Экстр 48

Hd.il НсЦ1 Ш}1 Н<Ц1

Рис. 8. Внесение избытка очищенного НИЦ в клеточные экстракты вызывает прирост шаперонной активности НБр70, обратно пропорциональный различиям в активности Н.чр70 в экстрактах и соответствующих количеств изолированного №р70

Для решения вопроса о наличии и направленности модулирующего действия консервативных J- и Bag-доменов белков Hdjl и Bagl на шаперонную активность Hsp70, были изготовлены плазмиды для продукции этих доменов в E.coli в слитом с белком GST виде. Эксперименты показали, что оба домена обладают выраженным ингибирующим воздействием на шаперонную активность Hsp70 (рис. 9).

I Hsp70 Hsp70 + J- Hsp70+ Ейг24 Exlr24 + J- Extr 24 +

э Dom Bag-Dom Dom Bag-Dom

Рис. 9. I- и Ва£-домены белков Нсу 1 и Bagl угнетают акгавность Нзр70, как чистого, так и входящего в состав клеточных экстрактов.

Обсуждение.

Основной задачей настоящей работы являлось описание динамики шалеронной системы в ходе реакции клеток на тепловой стресс. Увеличение количеств основного шаперона Hsp70 и кошаперона Hdjl, также известного своей субстрат-связывающей активностью (Freeman, Morimoto, 1996; Michels et al., 1997), приводило к повышению шаперонного потенциала клеток. Активность Hdjl, тем не менее, лишь предупреждает ахрегацию поврежденных белков, не восстанавливая их структуру (Johnson, Craig, 2001). Более важным моментом являлось, на наш взгляд, качественное смещение равновесия фаз шаперонного цикла на первом этапе ответа клеток на тепловой шок в сторону первой - фазы прочного связывания субстрата основным шапероном Hsp70 под действием растущих количеств Hdjl. Действительно, количество выявленных комплексов Hsp70-Hdjl растет после теплового шока и максимально спустя 4 ч, а не 20 (рис. 2, а), когда количества белков теплового шока достигают своего максимума. Биологический смысл этого, по-видимому, заключается в быстрейшем связывании как можно большего числа поврежденных белковых молекул с целью предупреждения их агрегации, причем рост количества Hdjl также существенно уменьшает время, необходимое Hsp70 для «выбора» субстрата (Angelidis et al., 1999). В ходе развития реакции на тепловой шок, количество поврежденных белков постепенно снижается благодаря координированной работе всех участников, в том числе и Bagl, основной задачей которого в данном случае является осуществление нуклеотидного обмена (Takayama et al., 1999). Такая картина, с нашей точки зрения, характерна для второй фазы ответа клеток на стресс. Постепенно происходит элиминация избыточных количеств шаперонов, которые в нротивном случае могли бы нежелательным образом вмешиваться в клеточные процессы. Это, по-видимому, происходит вследствие открытия сайтов протеолша на молекулах Hsp70 и Hdjl, которые уже не экранированы белками-мишенями от узнавания клеточными протеазами (Гужова, Маргулис, 2000).

Некоторая часть поврежденных белков, однако, не может быть ренатурирована. Следовательно, они должны элиминироваться. Непосредственными участниками этого процесса являются все те же Hsp70, Hdjl и Bagl, с той, однако, разницей, что ведущая роль теперь принадлежит Bagl. Все изоформы этого белка имеют в своем составе убиквитин-подобные последовательности, способные выступать в качестве связующего мостика между комплексом шаперон-субстрат и 26S протеасомой (Luders et al., 1998; Jentsch, Pyrowolakis, 2000; Hohfeld et al., 2001). Когда большая часть белков-мишеней восстановлена, доля комплексов шаперонов с необратимо денатурированными белками растет. Это подтверждается результатами иммунопреципитации: увеличивается число захваченных антителами комплексов Bagl-Hsp70 (рис. 2, в и г). Дело в том, что такие комплексы существуют более длительное время, чем комплексы с ренатурируемыми субстратами, поскольку для эффективного связывания с протеасомой требуется дополнительное убиквитинилирование Bagl и подлежащего деградации белка при участии дополнительных факторов (Alberti et al., 2002). Таким образом, для последней, третьей, фазы ответа клеток на тепловой шок характерно торможение шаперонных процессов, и Hsp70 оказывается преимущественно связанным с Bagl.

Наши предположения, сделанные на основании данных иммунопреципитации, подтверждаются также результатами микроскопического анализа препаратов. Для выделенной нами первой фазы ответа клеток на тепловой шок характерна ко-локализация Hsp70 и Hdjl. К 24 ч она становится еще более очевидной. Это соответствует второй фазе ответа - пику ренатурации субстрата. В это же время наблюдается минимальное перекрытие антигенов Hsp70 и Bagl, хотя таковое и имеет место во все периоды процесса постстрессового восстановления в той или иной степени. Для третьей фазы характерно совпадение месторасположений Hsp70 и Bagl, наблюдаемое даже спустя 48 ч после теплового шока, когда взаимодействие с Hdjl уже не регистрируется.

Известные на сегодняшний день работы, посвященные изучению функционирования шаперонного механизма на базе Hsp70, лишены сведений о реальных количественных соотношениях участников шаперонных циклов в живых клетках, несмотря на то, что большинство исследователей сходятся во мнении о саморегуляции шаперонной системы количественным составом ее участников. Во многом это определяется отсутствием подходящих средств для высокоточного количественного определения белков-участников шаперонного комплекса на базе Hsp70, и, в первую очередь, его самого.

Предлагаемый нами метод количественного определения Hsp70 обладает быстротой и легкостью в осуществлении и возможностью одновременной обработки большого числа опытных образцов с высокой чувствительностью. Использование иммобилизованного АТФ в качестве одного из лигандов Hsp70 не только избавляет от необходимости поиска пары антител, имеющих неперекрывающиеся сайты узнавания на молекуле Hsp70, но и вызывает при присоединении диссоциацию всех связанных с шапероном белков. Это способствует выявлению всего пула Hsp70, позволяя анализировать практически любые образцы и биологические жидкости без их специальной подготовки. При этом нижний порог определения IIsp70 составяет около 250 пг/мл опытного образца.

Данные по выяснению влияния АТФ, кошаперонов Hdjl и Bagl и их активных доменов на шаперонную активность изолированного и входящего в состав клеточных экстрактов Hsp70, были получены благодаря использованию модификации известной ранее системы ИФА для оценки субстрат-связывающей (шаперонной) активности.

Наблюдавшийся эффект резкого угнетения шаперонной активности Hsp70 концентрациями АТФ, превышающими физиологические (рис. 4), подтверждает факт диссоциации шаперонных комплексов при связывании АТФ белком теплового шока 70 кДа и был ожидаем. То же можно сказать и об отсутствии достоверного влияния АДФ на шаперонную активность изолированного Hsp70 (рис. 4), поскольку по существующим представлениям, Hsp70 переходит в это состояние после гидролиза АТФ под действием белка Hdj 1, сопровождающееся прочным связыванием субстрата. При этом происходит также изменение конформации пептид-связывающего сайта молекулы Hsp70, приводящее к его закрытию. Иными словами, в АДФ-связанном состоянии Hsp70 не способен осуществлять захват молекул субстрата.

Наиболее результативным в плане стимуляции шаперонной активности Hsp70 явилось такое соотношение белков-помощников, при котором количество Hdjl

десятикратно превышает количество Bagl (рис. 5). Соотношение, близкое к таковому, имеет место на пике индукции белков-шаперонов тепловым стрессом (рис. 1, 3). Интересно, что повышение количества белка Bagl не вызывало дальнейшего выраженного роста шаперонной активности, равно как и не угнетало ее. Из этого можно сделать вывод о том, что он не являемся фактором, лимитирующим шаперонную активность Hsp70 при ответе клеток на тепловой шок, хотя и принимает в нем активнейшее участие, что дополняет данные, полученные в системе in vivo (Nollen et al., 2000; 2001).

Определяющее значение кошаперона Hdjl в регуляции шаперонной активности Hsp70 в системе ex vivo подтверждается совокупностью следующих фактов.

Во-первых, шаперонная активность Hsp70 в экстрактах клеток К562, инкубировавшихся 4 и 24 ч после теплового шока, в 2 и 3 раза превышала активность соответствующих количеств очищенного белка (рис. 7), что соотносимо с ростом количества Hdj 1 в этих экстрактах по данным компьютерной обработки результатов иммуноблотинга (рис. 3).

Во-вторых, в экстракте контрольных клеток и клеток, инкубировавшихся 48 ч после теплового шока, его количества были минимальны. При этом значения шаперонной активности Hsp70, находящегося в соответствующих клеточных экстрактах, практически совпадали с потенциально ожидавшимися для таких количеств изолированного белка.

В-третьих, кратность прироста активности Hsp70 после добавления очищенного Hdjl обратно пропорциональна разнице между ожидаемой и имеющейся активностью в экстрактах (рис. 7, 8). Относительно невысокий прирост активности в экстракте клеток, инкубировавшихся 48 ч после теплового шока, объясняется, по-видимому, большим процешным соотношением в таком экстракте необратимо денатурированных белков, накапливающихся к концу реакции клеток на тепловой стресс. Такие белки могут успешно конкурировать с белком-мишенью, иммобилизованным на планшете для ИФА и снижать, таким образом, сигнал.

Заключительной частью работы явилось выявление ингибирующего действия консервативных доменов белков Hdjl и Bagl на шаперонную активность Hsp70. Предположительно, данные пептидые домены кошаперонов обладают гораздо большей аффинностью к Hsp70, чем целые белки (Brive et al., 2001), и, прочно связываясь с ним, они не позволяют ему вступать во взаимодействие с другими белками, «выключая» его шаперонную активность.

Возможность выключения шаперонной Hsp70 активности пептидами давно привлекает ученых, работающих в этой области, и врачей-онкологов. Известно, что Hsp70, в том числе благодаря своей шаперонной активности, повышает устойчивость клеток злокачественных опухолей к нескольким видам терапии (Hwang et al., 2003; Syrigos et al., 2003). С другой стороны, есть данные о его иммуномодулирующем действии. Так, в некоторых случаях, он способен выходить на наружную мембрану некоторых опухолевых клеток и презентировать опухолевые антигены иммунной сисхеме организма (Multhoff et al., 1995; Kleinjung et al., 2003; Gehrmann et al., 2004). Дуализм роли Hsp70 в судьбе опухолевой клетки не дает возможности однозначно остановить свой выбор ни на усилиях, направленных на его элиминацию из клетки, ни

на полном безучастии к его присутствию там. Возможно, что модуляция его активности высокоаффинными пептидными агентами явилась бы шагом в правильном направлении в плане выяснения его роли в течении и терапии злокачественных новообразований.

Выводы.

1. Разработанная, апробированая и запатентованая принципиально новая система количественного определения Hsp70 может быть успешно использована на практике, в том числе в клинической лабораторной диагностике и мониторинге загрязнения окружающей среды.

2. Степень связывания белком теплового шока 70 кДа своих кошаперонов Ildjl и Bagl зависит от стадии реакции клетки на стресс, при этом меняется и их внутриклеточная локализация.

3. Шаперонная активность Hsp70 регулируется его количественными соотношениями с кошаперонами, в особенности с Hdjl, при этом количество АТФ является критичным для выполнения Hsp70 его функции.

4. Высокоафинные к Hsp70 J- и Bag-домены белков Hdjl и Bagl способны угнетать его шаперонную активность, что подтверждает возможность регуляции функции Hsp70 пептидами на клеточном и организменном уровнях.

Публикации по теме диссертации.

1. Новоселов С С., Суржиков С.А, Воронин А.П., Гужова И.В, Маргулис Б А , 2004. Способ определения основного белка теплового шока 70 кДа. Заявка в Федеральный институт промышленной собственности №2003124736/15(026274) от 07.08.2003, получено решение о выдаче патента 02.07.2004.

2. Новоселов С.С, Вербова MB, Васильева ЕВ, Воробьева Н.К., Маргулис Б.А., Гужова И.В., 2004 Анализ экспрессии белков-шаперонов, Hsp70 и Hdjl, в опухолевых клетках человека. Вопросы онкологии 50(2): 174-178.

3. Моисеева О.М., Новоселов С.С, Лясникова Е.А., Иванов С.Ю., Иванова Т.Г., Шляхто Е.В., 2004. Белки теплового шока 70кДа - новый маркер повреждения органов-мишеней при гипертонической болезни. Вестник РАМН (2): 6-9.

4. Новоселов С.С., Новоселова Т.В, Москалева ОС, Маргулис Б А., Гужова И.В, 2004. Динамика шаперонных комплексов Hsp70 с белками-помощниками Hdjl и Bagl в реакции клеток эритролейкемии человека К562 на тепловой стресс. Цитология. 46 (7): 620-627.

5. Moiseeva О.М., Novoselov S.S., Lyasnikova ЕА, Shlyakhto E.V., 2003 Sérum heat shock protein 70 concentration is associated with left ventricular hypertrophy and endothelial dysfunction in essentiel hypertension. 13ft European Conférence on Hypertension (June, 13-17,2003, Milan, Italy) J. Hypert., 21 (s 4): s240.

6. Новоселов С.С.,Вербова M.B., Москалева О.С., Васильева ЕВ, Воробьева H К, Гужова И.В 2003. Белки теплового шока 70 и 40 кДа как маркеры злокачественности в онкогинекологии. 1-й съезд Общества клеточной биологии (14-16 октября 2003, Санкт-Петребург). Цитология 45 (9): 907.

7. Маргулис Б.А, Гужова И.В., Москалева О.С., Новоселов С.С., 2004. Перспективные области применения белков-шаперонов. Международный междисциплинарный семинар «Прогресс в биотехнологии и нейробиологии -интегративная медицина» (14-24 февраля 2004 Хургада, Египет), тезисы докл. с.107.

8. Guzhova 1. V., Novoselova Т. V., Novoselov S S., Margulis В. A, 2004 The route to the application of Hsp70 chaperone in the therapy of neurodegenerative diseases. 8-th Multidisciplinary International Conference of Biological Psychiatry "Stress and Behavior" (17-19 May 2004, St-Petersburg, Russia). Psychopharmacol. Biol. Narcol., 4(2-3): 698.

9. Guzhova IV, Andreeva L.I., Mokrushin A A, Novoselov S.S., Novoselova T.V, Margulis B.A., 2004. Possible applications of protein chaperones. 4th International Workshop on the Mol. Biology of Stress Responses (13-16 May 2004, Wuhan, China), abstracts p. 38.

10. Андреева Л.И., Маргулис Б.А., Гужова ИВ, Новоселов С.С., Бойкова А А., Шабанов П.Д., 2004. Белки теплового шока 70 кДа участвуют в регуляции иммунной и нервной систем. 13-ая Всероссийская конференция «Нейроиммунология» (24-27 мая 2004, Санкт-Петербург) Нейроиммунология, 2 (2): 6.

11. Moiseeva О., Novoselov S., Villevalde S., Lyasnikova E„ Emelyanov I., Shlyachkto E„ 2004. Markers of endothelial dysfunction and angiogenesis in hypertensive patients with left ventricular hypertrophy. 14th European Meeting on Hypertension June 13-17, 2004, Paris, France; J Hypertension 22 (s 2): SI84

Список цитируемой литературы.

Гужова ИВ, Маргулис Б А, 2000 Индукция и накопление БТШ70 приводят к формированию его комплексов с другими клеточными белками. Цитология. 42(7): 647-652.

Маргулис Б.А., Гужова ИВ., 2000. Белки стресса в эукариотической клетке. Цитология. 42(4): 323-342.

Моисеева О.М., Новоселов С.С., Лясникова ЕА., Иванов С.Ю., Иванова ТГ., Шляхто Е.В., 2004. Белки теплового шока 70кДа - новый маркер повреждения органов-мишеней при гипертонической болезни Вестник РАМН. №2: 6-9.

Новоселов С С., Вербова М.В., Васильева Е.В., Воробьева Н.К., Маргулис Б А., Гужова И.В., 2004. Анализ экспрессии белков-шаперонов, Hsp70 и Hdjl, в опухолевых клетках человека. Вопросы онкологии 50(2): 174-178.

Alberti S., Demand J., Esser C., Emmerich N, Schild H, Hohfeld J. 2002. Ubiquitylation of BAG-1 suggests a novel regulatory mechanism during the sorting of chaperone substrates to the proteasome. J. Biol. Chem. 277(48): 45920-45927.

Angelidis C.E., Lazaridis I., Pagoulatos GN 1999. Aggregation of hsp70 and hsc70 in vivo is distinct and temperature-dependent and their chaperone function is directly related to non-aggregated forms. Eur. J. Biochem. 259: 505-512.

Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248254.

Brive L„ Takayama S., Briknarova K, Homma S, Ishida S.K., Reed J.C., Ely KR, 2001. The carboxyl-terminal lobe of Hsc70 ATPase domain is sufficient for binding to BAG1. Biochem Biophys Res Commun. 289(5): 1099-1105.

Cheetham M.E., Caplan A.J. 1998. Structure, function and evolution of DnaJ: conservation and adaptation of chaperone function. Cell Stress Chaperones. 3 :28-36.

Freeman B.C., Morimoto R1 1996. The human cytosolic molecular chaperones hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native protein and protein refolding. EMBO J. 15 : 2969-2979.

Gehrmann M, Schmelzer H„ Eissner G, Haferlach T, Hiddemann W, Multhoff G„ 2003. Membrane-bound heat shock protein 70 (Hsp70) in acute myeloid leukemia: a tumor specific recognition structure for the cytolytic activity of autologous NK cells. Haematologica. 88(4): 474-476.

Guzhova I.V., Darieva Z.A., Meto A.R., Margulis B.A, 1997. Major stress protein Hsp70 interacts with NF-kB regulatory complex in human T-lymphoma cells. Cell Stress Chaperones. 2:132-139.

Guzhova I.V., Arnholdt A.C.V, Darieva ZA., Kinev A.V, Lasunskaia E.B., Nilsson K, Bozhkov V.M., Voronin A.P, Margulis BA 1998. The pleiotropic effect of an extracellular Hsp70 on functional properties of human promonocytes through binding to cell surface and internalization. Cell Stress and Chap. 3: 67-77.

Hohfeld J., Cyr D.M., Patterson C, 2001. From the cradle to the grave: molecular chaperones that may choose between folding and degradation. EMBO Rep. 2: 885-890.

Hwang T.S, Han HS, Choi H.K, 2003 Differential, stage-dependent expression of Hsp70, Hspl 10 and Bcl-2 incolorectal cancer. J Gastroenterol Hepatol. 18(6): 690-700

Jentsch S, Pyrowolakis G 2000. Ubiquitin and its kin: how close are the family ties? Trends Cell Biol. 10:335-342.

Johnson J.L., Craig E.A., 2001. An essential role for the substrate-binding region of Hsp40s in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 152: 851-856.

Kelley W.L., 1998. The J-domain family and the recruitment of chaperone power. Trends Biochem. Sei. 23:222-227.

Kleinjung T., Arndt O., Feldmann HJ, Bockmuhl U., Gehrmann M, Zilch T., Pfister K, Schönberger J., Marienhagen J, Eilles C„ Rossbacher L., Multhoff G., 2003. Heat shock protein 70 (Hsp70) membrane expression on head-and-neck cancer biopsy-a target for natural killer (NK) cells. Int J Radiat Oncol Biol Phys 57(3): 820-826.

Laemli UK, 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of bacteriophage T4. Nature. 227:680-685.

Lozzio C.B, Lozzio B.B, 1975 Human chronic myelogenous leukemia cell line with positive Philadelphia chromosome. Blood. 45: 321-324.

Luders J, Demand J, Hohfeld J. 2000 The ubiquitin-related BAG-1 provides a link between the molecular chaperones Hsc70/Hsp70 and the proteasome. J. Biol. Chem. 275: 4613-4617.

Michels A.A., Kanon B., Konings A. W, Ohtsuka K, Bensaude O., Kampinga HH, 1997 Hsp70 and Hsp40 chaperone activities in the cytoplasm and the nucleus of mammalian cells. J. Biol. Chem. 272: 33283-33289.

MulthoffG., Botzler C„ Wiesnet M, Muller E., Meier T„ Wilmanns W., Issels R.D, 1995. A stress-inducible 72-kDa heat-shock protein (HSP72) is expressed on the surface of human tumor cells, but not on normal cells. Int J Cancer. 61(2): 272-279.

Murata S„ Minami Y„ Minami M., Chiba T, Tanaka K., 2001. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Rep. 2: 1133-1138.

Nollen E.A., Brunstmg J.F, Song J., Kampinga H.H, Morimoto R.I., 2000. Bagl functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol. Cel. Biol. 20: 1083-1088.

Nollen E.A., Kabakov A.E., Brunsting J.F., Kanon B., Hohfeld J., Kampinga H.H., 2001. Modulation of in vivo HSP70 chaperone activity by Hip and Bag-1. J Biol Chem 276(7): 4677-4682.

Schlossman D.M., Schmid SL, Braell W.A., Rothman JE, 1984 An enzyme that removes clathrin coats: purification of an uncoating ATPase. J Cell Biol. 99(2): 723-733.

Sondermann H., Scheufler C., Schneider C, Hohfeld J, Hartl F.U., Moarefi 1, 2001. Structure of a Bag/Hsc70 complex: convergent functional evolution of Hsp70 nucleotide exchange factors. Science. 291:1553-1557.

Syrigos K.N., Harrington K.J., Karayiannakis A J, 2003. Clinical significance of heat shock protein-70 expression in bladder cancer. Urology. 61(3): 677-680.

Takayama S., Bimston D.N., Matsuzawa S., Freeman B.C., Aime-Sempe C, Xie Z., Morimoto R.I., Reed J. C., 1997. BAG-1 modulates the chaperone activity of Hsp70/Hsc70. EMBO J. 16: 4887-4896.

Takayama S„ Xie Z„ Reed J.C. 1999. An evolutionarily conserved family of Hsp70/Hsc70 molecular chaperone regulators. J. Biol. Chem. 247: 781-786.

Wawrzynow A., Zylicz M., 1995. Divergent effects of ATP on the binding of the DnaK and DnaJ chaperones to each other, or to their various native and denaturated protein substrates. JBC 270:19300-19306.

Zeiner M., Gebauer M., Gehring U, 1997. Mammalian protein RAP46: an interaction partner and modulator of 70 kDa heat shock proteins. EMBO J. 16: 5483-5490.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать 07 /'О . Формат 60x84/16. Печать офсетная. Усл. печ. л Тираж /Я? . Заказ 46$ .

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая, 29.

№19382

РНБ Русский фонд

2005-4

13037 4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Новоселов, Сергей Станиславович

I. Введение

II. Обзор литературы

1 .Hsp70 и его свойства

1.1 Структура молекулы Hsp

1.2 Индукторы синтеза Hsp

1.3 Регуляция экспрессии генов hsp

1.4 Шаперонная активность Hsp

1.5 Протективная функция Hsp

2. Кошапероны Hsp

2.1 Hdjl

2.2 Bagl

2.3 CHIP

2.4 Hip

2.5 Hop

2.6 Tprl и Tpr

2.7 HspBPl

2.8 hSGT

2.9 Гипотетическая схема шаперонного цикла Hsp

3. Задачи и пути их решения

3.1 Цель работы

3.2 Задачи

III. Материалы и методы

1. Культуры клеток

2. Иммунопреципитация

3. Электрофоретическое разделение белков

4. Конфокальная микроскопия

5. Определение количеств Hsp70, Hdj 1 и Bagl

6. Определение количества Hsp70 методом ИФА

7. Определение шаперонной активности Hsp

8. Плазмиды

9. Белки

10. Статистический анализ

IV. Результаты

1. Модельная система

2. Взаимодействие белков Hsp70, Hdj 1 и Bagl на разных стадиях ответа клеток на тепловой стресс

3. Разработка и апробация системы ИФА для количественного определения Hsp

4. Оценка количеств Hsp70 в экстрактах клеток К

5. Влияние кошаперонов, АТФ и АДФ на активность очищенного Hsp

6. Активность Hsp70, входящего в состав клеточных экстрактов, АТФ- и Hdj 1 -зависима

7.Консервативные J- и Bag-домены белков Hdj 1 и Bagl угнетают активность Hsp

V. Обсуждение

VI. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Шапероны в реакции клеток К562 на тепловой стресс"

Роль белков теплового шока (Heat shock proteins, Hsp) в защите клеток от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды, а также в процессах клеточной репарации, сегодня не вызывает сомнений. Наиболее изученным является основной белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа - Hsp70 (Маргулис, Гужова, 2000). Защитная роль этого белка во многом обусловлена его шаперонной активностью - способностью поддерживать денатурированные и вновь синтезированные полипептиды в развернутой конформации. Из этого вытекает участие шаперонов в таких жизненно-важных клеточных процессах, как транспорт белков в различные компартменты, сборка из них активных структур, а также утилизация необратимо денатурированных белковых молекул. На сегодняшний день достоверно показано участие белков теплового шока в патогенезе многих заболеваний, а также накапливаются факты о возможном терапевтическом и иммуномодулирующем эффекте Hsp70.

В основе шаперонного механизма Hsp70 лежит связывание им гидрофобных участков последовательности белков-мишеней, оказавшихся на поверхности белковых молекул вследствие утраты ими нативной конформации. Hsp70 может восстановить нарушенную исходную укладку полипептидной цепи, однако работа этого шаперона невозможна без участия регуляторных белков-помощников, в первую очередь Hdjl (Hsp40) и Bagl. Именно взаимодействие этих белков-кошаперонов с Hsp70 вызывает последовательное АТФ-зависимое изменение его конформации, делающее возможным захват и высвобождение субстратов (Takayama et al., 1997; 1999; Zeiner et al., 1997; Cheetham et al., 1998, Kelley, 1998). Если такие последовательные циклы связывания-высвобождения субстрата в попытках осуществить его ренатурацию не увенчиваются успехом, то он направляется на «утилизацию» в протеасомы с помощью белков Bagl и CHIP (Luders et al., 2000; Murata et al., 2001; Sondermann et al., 2001).

Общие принципы работы шаперонного механизма на базе Hsp70 в настоящее время достаточно полно описаны, в основном благодаря интенсивным экспериментам in vitro, проводившимся в конце 90-х годов с изолированными рекомбинантными белками, происходящими из разных видов млекопитающих и микроорганизмов (Takayama et al., 1995; Freeman, Morimoto, 1996; Hohfeld, Jentsch, 1997; Bimston et al., 1998). Исключительно важное, на наш взгляд, значение имеют количественные характеристики взаимодействия Hsp70 с двумя основными белками-помощниками. Их соотношения, по-видимому, являются определяющим звеном регуляции работы всего шаперонного механизма Hsp70. Смещения баланса между рассматриваемыми белками может приводить к изменениям активности системы на тех или иных этапах ответа клетки на стресс. Значительный прогресс в понимании влияния кошаперонов Hdjl и Bagl на активность Hsp70 был получен благодаря опытам in vivo. Однако попытки описания взаимодействия участников шаперонно-субстратного комплекса, оверэкспрессируемых в модельных клетках, также не внесли полной ясности. Основной проблемой исследователей явилось нарушение клеточного метаболизма множественной трансфекцией. Таким образом, сегодня все еще не хватает информации о взаимодействии Hsp70 с белками-помощниками Hdjl и Bagl в живых клетках, располагающих естественным полем деятельности для клеточных шаперонов. Оптимальной системой для оценки шаперонной активности Hsp70 является, на наш взгляд, клеточный экстракт, содержащий шапероны, белки-помощники и белки-мишени в реальных количественных соотношениях. Кроме того, внесение дополнительных факторов в экстракт не вызывает усложнения системы или ее искажения, особенно при применении рекомбинантных белков человека, практически идентичных эндогенным.

Целью настоящей работы явилась характеристика шаперонной активности Hsp70 и выявление при помощи традиционных и новых оригинальных методов степени ее регуляции количественными изменениями кошаперонов Hdjl и Bagl в реакции клеток человека на тепловой стресс.

II. Обзор литературы.

1. Hsp70 и его свойства.

История белков теплового шока берет свое начало в 1962 году, когда была открыта индукция их синтеза в клетках плодовой мушки (Ritossa). В 1974 году были описаны сами белки (Tissieres et al., 1974). В эукариотической клетке тепловой шок или другие стрессорные воздействия способны вызвать синтез Hsp, относящихся к нескольким семействам, названным в соответствии со средней молекулярной массой - Hsp 110, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40, Hsp27 и Hsp 10 (Feige et al., 1996). Каждое семейство представляет собой продукт группы родственных генов, представители которого характеризуются высокой степенью внутригрупповой гомологии. Белки теплового шока обнаружены у всех известных организмов, причем их консервативность в процессе эволюции очень высока. Это особенно относится к семейству Hsp70, схожесть последовательности которого у человека и кишечной палочки составляет более 50% (Bardwell, Craig, 1984).

У млекопитающих семейство белков теплового шока с массой 70 кДа представлено двумя основными формами: конститутивной, экспрессия генов которой идет постоянно, Hsc70 (Hsc73), и индуцибельной - Hsp70 (Hsp72). Кроме того, к данному семейству относят изоформы, специфичные для различных клеточных органелл, например митохондриальный белок Mtp70 или глюкозо-регулируемый белок Grp78 (Feige, Polla, 1994).

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Новоселов, Сергей Станиславович

VI. Выводы.

1. Разработанная, апробированная и запатентованная принципиально новая система количественного определения Hsp70 может быть успешно использована на практике, в том числе в клинической лабораторной диагностике и мониторинге загрязнения окружающей среды.

2. Степень связывания белком теплового шока 70 кДа своих кошаперонов Hdjl и Bagl зависит от стадии реакции клетки на стресс, при этом меняется и их внутриклеточная локализация.

4. Высокоаффинные к Hsp70 J- и Bag-домены белков Hdjl и Bagl способны угнетать его шаперонную активность, что подтверждает возможность регуляции функции Hsp70 пептидами на клеточном и организменном уровнях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Новоселов, Сергей Станиславович, Санкт-Петербург

1. Абрамова Е Б., Шарова Н.П., Карпов В.Л., 2002. Протеасома: разрушать, чтобы жить. Молекулярная биология. 36(5): 761-776.

2. Гужова И.В., Маргулис Б.А., 2000. Индукция и накопление БТШ70 приводят к формированию его комплексов с другими клеточными белками. Цитология. 42(7): 647-652.

3. Гужова И.В., Ласунская Е.Б., Нильссон К, Дариева З.А., Маргулис Б А. 2000. Влияние теплового шока на процессы дифференцировки и апоптоза в клетках U-937. Цитология. 42(7): 653-658.

4. Комарова Е.Ю., Маргулис Б. А., Гужова И. В., 2004. Роль шаперона Hsp70 в реакции клеток лейкемии человека на противоопухолевые препараты. Цитология. 46(6): 550-556.

5. Маргулис Б.А., Гужова И.В., 2000. Белки стресса в эукариотической клетке. Цитология. 42(4): 323-342.

6. Моисеева О.М., Новоселов С.С., Лясникова Е.А., Иванов С.Ю., Иванова Т.Г., Шляхто Е.В., 2004. Белки теплового шока 70кДа новый маркер повреждения органов-мишеней при гипертонической болезни. Вестник РАМН. №2: 6-9.

7. Новоселов С.С., Вербова М.В., Васильева Е.В., Воробьева Н.К., Маргулис Б А., Гужова И.В., 2004а. Анализ экспрессии белков-шаперонов, Hsp70 и Hdjl, в опухолевых клетках человека. Вопросы онкологии 50(2): 174-178.

8. Новоселов С.С., Новоселова Т.В., Москалева О.С., Маргулис Б.А., Гужова И.В., 20046. Динамика шаперонных комплексов Hsp70 с белками-помощниками Hdjl и Bagl в реакции клеток эритролейкемии человека К562 на тепловой стресс. Цитология. 46(7): 614-621.

9. Alberti S., Demand J., Esser С., Emmerich N., Schild H., Hohfeld J. 2002. Ubiquitylation of BAG-1 suggests a novel regulatory mechanism during the sorting of chaperone substrates to the proteasome. J. Biol. Chem. 277(48): 45920-45927.

10. Alberti S, Esser C, Hohfeld J., 2003. BAG-1—a nucleotide exchange factor of Hsc70 with multiple cellular functions. Cell Stress Chaperones. 8(3):225-31.

11. AHA., Bharadwaj S„ О'Carroll R., Ovsenek N. 1998. Hsp90 interacts with and regulates the activity of heat shock factor 1 in Xenopus oocytes.Mol. Cell. Biol. 18:4949-4960.

12. Angelidis C.E., Lazaridis I., Pagoulatos G.N. 1999. Aggregation of hsp70 and hsc70 in vivo is distinct and temperature-dependent and their chaperone function is directly related to non-aggregated forms. Eur. J. Biochem. 259: 505-512

13. AzemA., Oppliger W., LustigA., Jeno P., Feifel В., Schatz G., Horst M. 1997. The mitochondrial hsp70 chaperone system. Effect of adenine nucleotides, peptide substrate, and mGrpE on the oligomeric state of mhsp70. J. Biol. Chem. 272: 2090120906.

14. Bardwell J.C., Craig E.A., 1984. Major heat shock gene of Drosophila and the Escherichia coli heat-inducible dnaK gene are homologous. Proc Natl Acad Sci USA. 81(3):848-852.

15. Barr R.K, Bogoyevitch M.A., 2001. The c-Jun N-terminal protein kinase family of mitogen-activated protein kinases (JNK MAPKs) Int.J.Biochem.Cell.Biol 33: 10471063.

16. Beere H.M. Wolf B.B., Mosser D.D. Mahboubi A., Kuwana Т., Tailor, P. Morimoto R.I., Cohen G.M., Green D.R. 2000. Heat-shock protein 70 inhibits apoptosis by preventing recruitment of procaspase-9 to the Apaf-1 apoptosome. Nat.Cell.Biol. 2: 469-475.

17. Beere H.M., Green D.R., 2001. Stress management heat shock protein-70 and the regulation of apoptosis. Trends.Cell.Biol. 11:6-10.

18. Bimston D., Song J., Winchester D., Takayama S., Reed J.C., Morimoto R.I., 1998. BAG-1, a negative regulator of Hsp70 chaperone activity, uncouples nucleotide hydrolysis from substrate release. EMBO J. 17(23): 6871-6878.

19. Blatch G.L., Lassie, M., Zetter, B.R., Kundra, V. 1997. Isolation of a mouse cDNA encoding mSTIl, a stress-inducible protein containing the TPR motif. Gene. 194(2): 277-282.

20. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.

21. В rive L., Takayama S., Briknarova K., Homma S., Ishida S.K., Reed J C., Ely K.R., 2001. The carboxyl-terminal lobe of Hsc70 ATPase domain is sufficient for binding to BAGl. Biochem Biophys Res Commun. 289(5): 1099-1105.

22. Brown C.R., Martin R.L., Hansen W.J., Beckmann R.P., Welch W.J. 1993. The constitutive and stress inducible forms of hsp 70 exhibit functional similarities and interact with one another in an ATP-dependent fashion. J. Cell Biol. 120: 1101-1112.

23. Brychzy A., Rein Т., Winklhofer K.F., Hartl F.U., Young J.C., Obermann W.M., 2003. Cofactor Tpr2 combines two TPR domains and a J domain to regulate the Hsp70/Hsp90 chaperone system. EMBO J. 22(14): 3613-3623

24. Bush K.T., Goldberg A.L., Nigam S.K. 1997. Proteasome inhibition leads to a heat-shock response, induction of endoplasmic reticulum chaperones, and thermotolerance. J. Biol. Chem. 272:9086-9092.

25. Caamaco C.A., Morano M.I., Dalman F.C., Pratt W.B., Akil H. 1998. A conserved proline in the hsp90 binding region of the glucocorticoid receptor is required for hsp90 heterocomplex stabilization and receptor signaling. J. Biol. Chem. 273:20473-20480.

26. Cande С., Cecconi F., Dessen P., Kroemer G. 2002. Apoptosis-inducing factor (AIF): key to the conserved caspase-independent pathways of cell death? J Cell Sci. 115(Pt 24):.4727-4734.

27. Caplan A.J., 1999. Hsp90's secrets unfold: new insights from structural and functional studies. Trends Cell Biol. 9(7): 262-268.

28. Cardozo C.P., Michaud C., Ost M.C., Fliss A.E., Yang E., Patterson C., Hall S.J., Caplan A.J., 2003. C-terminal Hsp-interacting protein slows androgen receptor synthesis and reduces its rate of degradation. Arch Biochem Biophys. 410(1): 134-140.

29. Cato A.C., MinkS., 2001. BAG-1 family of cochaperones in the modulation of nuclear receptor action. J Steroid Biochem Mol Biol 78(5): 379-388.

30. Chappel T.G., Welch W.J., Schlossman D.M., Palter K.B., Schlesinger MJ., Rothman J.E. 1986. Uncoating ATPase is a member of the 70 kilodalton family of stress proteins. Cell. 45: 3-13.

31. Cheetham M.E., Caplan A.J. 1998. Structure, function and evolution of DnaJ: conservation and adaptation of chaperone function. Cell Stress Chaperones. 3 : 28-36.

32. Chen J.S., Coustan-Smith E., Suzuki 71, Neale GA., Mihara K., Pui C.H., Сатрапа D. 2001. Identification of novel markers for monitoring minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 97(7): 2115-2120.

33. Chen S., Smith D.F. 1998. Hop as an adaptor protein in the heat shock protein 70 (Hsp70) and Hsp90 chaperone machinery. J. Biol. Chem. 273: 35194-35200

34. Cornell P., Meacham G.C., Patterson C., Zhang W„ Younger J.M., Cyr D M., 2001. The Hsc70 co-chaperone CHIP targets immature CFTR for proteasomal degradation. Nat Cell Biol. 3(1): 100-105.

35. Demand J., Luders J., Hohfeld J., 1998. The carboxy-terminal domain of Hsc70 provides binding sites for a distinct set of chaperone cofactors. Mol Cell Biol. 18: 2023-2028.

36. Doong H., Price J., Kim Y.S., Gasbarre C., Probst J., Liotta LA., Blanchette J., Rizzo K., Kohn E„ 2000. CAIR-l/BAG-3 forms an EGF-regulated ternary complex with phospholipase C-gamma and Hsp70/Hsc70. Oncogene. 19(38): 4385-4395.

37. Duina A.A., Kalton H.M., Gaber R.F. 1998. Requirement for Hsp90 and a CyP-40-type cyclophilin in negative regulation of the heat shock response. J. Biol. Chem. 273: 18974-18978.

38. Ellis RJ. 1990. The molecular chaperone concept. Semin Cell Biol. 1(1): 1-9.

39. Feige U., Polla B.S., 1994. Hsp70 a multi-gene, multi-structure, multifunction family with potential clinical applications. Experientia. 50: 979-986.

40. Feige U., van Eden W., 1996. Infection, autoimmunity and autoimmune disease.EXS. 1996;77:359-73.

41. Ferris D.K., Harel-Bellan A., Morimoto R.I., Welch W.J., Farrar W.L. 1988. Mitogen and lymphokine stimulation of heat shock proteins in T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3850-3854.

42. Flaherty K.M., DeLuca-Flaherty C., McKay D.B. 1990. Three-dimensional structure of the ATP-ase fragment of a 70K heat-shock cognate protein. Nature. 346: 623-628.

43. Freeman В С., Morimoto R.I 1996. The human cytosolic molecular chaperones hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native protein and protein refolding. EMBO J. 15 : 2969-2979.

44. Freeman B.C., Yamomoto K.R., 2002. Disassembly of transcriptional regulatory complexes by molecular chaperones. Science 296: 2232-2235.

45. Froesch В A., Takayama S, Reed J C. 1998. BAG-1L protein enhances androgen receptor function. J. Biol. Chem. 273 : 11660-11666.

46. Frydman J., Hohfeld J., 1997. Chaperones get in touch: the Hip-Hop connection. Trends Biochem Sci. 22(3): 87-92.

47. Frydman J. 2001. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annu Rev Biochem. 70: 603-647.

48. Gabai V.L., Meriin A.B., Mosser D.D., Caron A.W., Rits S., Shifrin V.I., Sherman M.Y., 1997. Hsp70 prevents activation of stress kinases. A novel pathway of cellular thermotolerance. J Biol Chem. 272(29): 18033-18037.

49. Gebauer M., Zeiner M., Gehring U., 1997. Proteins interacting with the molecular chaperone hsp70/hsc70: physical associations and effects on refolding activity. FEBS Lett. 417(1): 109-113.

50. Gebauer M, Zeiner M., Gehring U., 1998. Interference between proteins Hap46 and Hop/p60, which bind to different domains of the molecular chaperone hsp70/hsc70. Mol Cell Biol. 18(11): 6238-6244.

51. Gehrmann M, Pfister K, Hutzler P, Gastpar R, Margulis B, Multhoff G. 2002. Effects of antineoplastic agents on cytoplasmic and membrane-bound heat shock protein 70 (Hsp70) levels. Biol Chem. 383(11): 1715-1725.

52. Gessler C.S, Buchberger A, Laufen T, Mayer M.P., Schreder H., Valencia A., Bukau В., 1998. Mutations in the DnaK Chaperone Affecting Interaction with the DnaJ Cochaperone Biochemistry 95(26): 15229-15234.

53. Goodman R., Blank M. 2002. Insights into electromagnetic interaction mechanisms. J Cell Physiol. 192(l):16-22.

54. Gotoh Т., Terada K., Mori M., 2001. Hsp70-DnaJ chaperone pairs prevent nitric oxide-mediated apoptosis in RAW 264.7 macrophages. Cell Death Differ. 8(4): 357-366.

55. Graumann K., Jungbauer A., 2000. Quantitative assessment of complex formation of nuclear-receptor accessory proteins. Biochem J 345(3): 627-636.

56. Gunther E., Walter L. 1994. Genetic aspects of the hsp70 multigene family in vertebrates. Experientia. 50: 987-1001.

57. Guzey M., Takayama S, Reed J.С., 2000. BAGIL enhances trans-activation function of the vitamin D receptor. J Biol Chem. 275(52): 40749-40756.

58. Guzhova I.V., Darieva Z.A., Melo A.R., Margulis B.A., 1997. Major stress protein Hsp70 interacts with NF-kB regulatory complex in human T-lymphoma cells. Cell Stress Chaperones. 2: 132-139.

59. Haas I.G. 1994. BiP (GRP78), an essential hsp70 resident protein in the endoplasmic reticulum. Experientia. 4: 1012-1020.

60. Hata M., Ohtsuka K., 2000. Cloning and expression of murine sp40 gene: differences in initiation sites between heat-induced and constitutive transcripts. DNA Seq. 11:213-223.

61. Hattori H, Liu YC, Tohnai I, Ueda M, Kaneda T, Kobayashi T, Tanabe K, Ohtsuka K, 1992. Intracellular localization and partial amino acid sequence of a stress-inducible 40-kDa protein in HeLa cells. Cell Struct Funct.;17(l):77-86.

62. Herget Т., Коек M. 1999. Apoptosis a double-edged sword. B.I.F. Futura. 14:173-186.

63. Hernandez M.P., Sullivan W.P., Toft D.O., 2002. The assembly and intermolecular properties of the hsp70-Hop-hsp90 molecular chaperone complex. J Biol Chem. 277(41): 38294-38304

64. Heyrovska N., Frydman J., Hohfeld J., Hartl F.U. 1998. Directionality of polypeptide transfer in the mitochondrial pathway of chaperone-mediated protein folding. Biol. Chem. 379: 301-309.

65. Hohfeld J., Jentsch S., 1997. GrpE-like regulation of the hsc70 chaperone by the anti-apoptotic protein BAG-1. EMBO J. 16(20): 6209-6216.

66. Hohfeld J., Cyr D.M., Patterson C., 2001. From the cradle to the grave: molecular chaperones that may choose between folding and degradation. EMBO Rep. 2: 885-890.

67. Jaattela M. 1993. Overexpression of major heat shock protein hsp70 inhibits tumor necrosis factor-induced activation of phospholipase A2. J Immunol. 151: 42864294.

68. Jaattela M, Wissing D, Kokholm K, Kallunki T, Egeblad M. 1998. Hsp70 exerts its anti-apoptotic function downstream of caspase-3-like proteases. EMBO J. 17(21):6124-6134.

69. Jaattela M. 1999. Escaping cell death: survival proteins in cancer. Exp.Cell.Res. 248: 30-43.

70. Jentsch S., Pyrowolakis G. 2000. Ubiquitin and its kin: how close are the family ties? Trends Cell Biol. 10: 335-342.

71. Jiang Y., Woronicz J.D., Liu W., Goeddel D.V., 1999. Prevention of constitutive TNF receptor 1 signaling by silencer of death domains. Science, 283: 543546.

72. Johnson J.L., Craig E.A., 2001. An essential role for the substrate-binding region ofHsp40s in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 152: 851-856.

73. Kabani M., McLellan C., Raynes D.A., Guerriero V., Brodsky J.L., 2002. HspBPl, a homologue of the yeast Fesl and Slsl proteins, is an Hsc70 nucleotide exchange factor. FEBS Lett. 531(2): 339-342.

74. Kampinga H.H., Kanon В, Salomons F.A., Kabakov A.E., Patterson С., 2003. Overexpression of the eochaperone CHIP enhances Hsp70-dependent folding activity in mammalian cells. Mol Cell Biol. 23(14): 4948-4958.

75. Kanelakis K.C., Shewach D.S., Pratt W.B., 2002. Nucleotide binding states of hsp70 and hsp90 during sequential steps in the process of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplex assembly. J Biol Chem. 277(37): 33698-33703.

76. Kelley W.L., 1998. The J-domain family and the recruitment of chaperone power. Trends Biochem. Sci. 23: 222-227.

77. Kermer P., Krajewska M, Zapata J.M., Takayama S., Mai J., Krajewski S., Reed J.C., 2002. Bagl is a regulator and marker of neuronal differentiation. Cell Death Differ 9(4): 405-413.

78. Kerr J.P.R., Wyllic A.H., Currie A R. 1972. Apoptosis: a basic biologocal phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics. Br.J.Cancer. 26: 239245.

79. King F. W., Wawrzynow A., Hohfeld J., Zylicz M., 2001. Co-chaperones Bag-1, Hop and Hsp40 regulate Hsc70 and Hsp90 interactions with wild-type or mutant p53. EMBO J. 20(22): 6297-6305.

80. Kosano H., Stensgard В., Charlesworth M.C., McMahon N. Toft D. 1998. The assembly of progesterone receptor-hsp90 complexes using purified proteins. J. Biol. Chem. 273: 32973-32979.

81. Marti C., Browning D.D., Ye R.D., 2003. Identification of Tetratricopeptide Repeat 1 as an Adaptor Protein That Interacts with Heterotrimeric G Proteins and the Small GTPase Ras Mol Cell Biol. 23(11): 3847-3858.

82. Mathew A., Mathur S.K., Morimoto R.I. 1998. Heat shock response and protein degradation: regulation of HSF2 by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol.Cell.Biol. 18:5091-5098.

83. McLellan C.A., Raynes D.A., Guerriero V., 2003. HspBPl, an Hsp70 cochaperone, has two structural domains and is capable of altering the conformation of the Hsp70 ATPase domain. J Biol Chem. 278(21): 19017-19022.

84. Meacham G.C., Patterson C., Zhang W., Younger J.M., Cyr D.M., 2001. The Hsc70 co-chaperone CHIP targets immature CFTR for proteasomal degradation. Nat Cell Biol. 3(1): 100-105.

85. Michels A.A., Kanon В., Konings A.W., Ohtsuka K., Bensaude O., Kampinga H.H., 1997 Hsp70 and Hsp40 chaperone activities in the cytoplasm and the nucleus of mammalian cells. J. Biol. Chem. 272: 33283-33289.

86. Mizushima Т., Natori S., Sekimizu K. 1993. Relaxation of supercoiled DNA associated with induction of heat shock proteins in Escherichia coli. Mol Gen Genet. 238(1-2): 1-5.

87. Mori M, Rothman AL, Kurane I, Montoya JM, Nolte KB, Norman JE, Waite DC, Koster FT, Ennis FA. 1999. High levels of cytokine-producing cells in the lungtissues of patients with fatal hantavirus pulmonary syndrome.J Infect Dis.;179(2):295-302.

88. Morimoto R.I., Kline M.P., Bimston D.N., Cotto J.J. 1997. The heat shock response: regulation and functions of heat shock proteins and molecular chaperones. Essays Biochem. 32: 17-29.

89. Mosser D.D., Duchaine J., Massie B. 1993. The DNA-binding activity of the human heat shock transcription factor is regulated in vivo by hsp70. Mol. Cell. Biol.13: 5427-5438.

90. Mosser DD, Caron AW, Bourget L, Denis-Larose C, Massie B, 1997. Role of the human heat shock protein hsp70 in protection against stress-induced apoptosis. Mol Cell Biol.; 17(9):5317-5327.

91. Multhoff G., Botzler C., Wiesnet M., Muller E., Meier Т., Wilmanns W, Issels R.D., 1995. A stress-inducible 72-kDa heat-shock protein (HSP72) is expressed on the surface of human tumor cells, but not on normal cells. Int J Cancer. 61(2): 272-279.

92. Murata S., Minami Y., Minami M., Chiba Т., Tanaka К., 2001. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Rep. 2: 1133-1138.

93. Murthy A.E., Bernards A., Church D., Wasmuth J., Gusella, J.F., 1996. Identification and characterization of two novel tetratricopeptide repeat-containing genes. DNA Cell Biol. 15: 727-735.

94. Naishiro Y, Adachi M., Okuda H., Yawata A., Mitaka Т., Takayama S., Reed J.C., Hinoda Y, Imai K, 1999. BAG-1 accelerates cell motility of human gastric cancer cells. Oncogene. 18(21): 3244-3251.

95. Nakai A., Kawazoe Y., Tanabe M, Nagata K., Morimoto R.I. 1995. The DNA-binding properties of two heat shock factors, HSF1 and HSF3, are induced in the avian erythroblast cell line HD6. Mol.Cell.Biol. 15(10): 5268-5278.

96. Nakai A., Tanabe M., Kawazoe Y., Inazawa J., Morimoto R.I., Nagata K. 1997. HSF4, a new member of the human heat shock factor family which lacks properties of transcriptional activator. Mol.Cell.Biol. 17:469-481.

97. Nollen E.A., Brunsting J.F., Song J., Kampinga H.H., Morimoto R.I., 2000. Bagl functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol. Cel. Biol. 20: 1083-1088.

98. Nollen E.A., Kabakov A.E., Brunsting J.F., Kanon В., Hohfeld J., Kampinga H.H., 2001. Modulation of in vivo HSP70 chaperone activity by Hip and Bag-1. J Biol Chem 276(7): 4677-4682.

99. Oh W.K., Song J., 2003. Cooperative interaction of Hsp40 and TPR1 with Hsp70 reverses Hsp70-HspBpl complex formation. Mol Cells. 16(1): 84-91.

100. Ohtsuka K, 1993. Cloning of a cDNA for heat-shock protein hsp40, a human homologue of bacterial DnaJ. Biochem Biophys Res Commun.;197(l):235-40.

101. Oka M., Sato S., Soda H., Fukuda M., Kawabata S, Nakatomi K, Shiozawa K.,Nakamura Y., Ohtsuka K, Kohno S. 2001. Autoantibody to heat shock protein Hsp40 in sera of lung cancer patients. Jpn. J. Cancer Res. 92: 316-320.

102. Palleros DR, Welch WJ, Fink AL., 1991. Interaction of hsp70 with unfolded proteins: effects of temperature and nucleotides on the kinetics of binding. Proc Natl Acad Sci U S A.;88(13):5719-23.

103. Papp E, Nardai G, Soti C, Csermely P. 2003. Molecular chaperones, stress proteins and redox homeostasis. Biofactors. 17(1-4): 249-257.

104. ParkH.S., Lee J.S., Huh S., Seo J., Choi E. 2001. Hsp72 functions as a natural inhibitory protein of c-Jun N-terminal kinase. EMBO J. 20(3): 446-456

105. Pelham H.R.B. 1982. A regulatory upstream promoter element in the Drosophila hsp70 heat-shock gene. Cell. 30: 517-528.

106. Pelham H.R.B., 1986. Speculations on the function of major heat shock and glucose-regulated proteins. Cell. 46:959-961.

107. Pockley A.G., Shepherd J, Gorton J.M., 1998. Detection of Heat Shock Protein 70 (Hsp70) and Anti-Hsp70 Antibodies in the Serum of Normal Individuals. Immunol.Investig., 27: 367-377.

108. Pratt W.B, Toft D.O., 2003. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp Biol Med (Maywood). 228(2): 111-133.

109. Raynes D.A., Guerriero V. Jr., 1998. Inhibition of Hsp70 ATPase activity and protein renaturation by a novel Hsp70-binding protein. J Biol Chem. 273(49): 3288332888.

110. Raynes D.A., Guerriero V. Jr., 2000. Isolation and characterization of isoforms of HspBPl, inhibitors of Hsp70. Biochim Biophys Acta. 1490(1-2): 203-207.

111. Ritossa F. 1962. A new puffing pattern induced by heat shock and DNP in Drosophila. Experientia. 18:571-573.

112. Rudiger S., Schneider-Mergener J., Bukau В., 2001. Its substrate specificity characterizes the DnaJ co-chaperone as a scanning factor for the DnaK chaperone. EMBO 20(5): 1042-1050.

113. Saleh A., Srinivasula S.M., Balkir L., Robbins P.D., Alnemri E.S. 2000. Negative regulation of the Apaf-1 apoptosome by Hsp70. Nature Cell Biol 2:, 476483.

114. Schlossman DM, Schmid SL, Braell WA, Rothman JE. 1984. An enzyme that removes clathrin coats: purification of an uncoating ATPase. J Cell Biol. 99(2): 723733.

115. SchneikertJ, Hubner S, hanger G., Petri Т., Jaattela M., Reed J., Cato A.C., 2000. Hsp70-RAP46 interaction in downregulation of DNA binding by glucocorticoid receptor. EMBO J. 19: 6508-6516.

116. Sedger L., Ruby J. 1994. Heat shock response to Vaccinia virus infection. J. Virol. 68: 4685-4689.

117. Sen S. 1992 .Programmed cell death: concept, mechanism and control. Biol.Rev. Camb. Phil. Soc. 67: 287-319.

118. Shi Y, Mosser D.D., Morimoto R.I., 1998. Molecular chaperones as HSF1-specific transcriptional repressors. Genes Dev. 12: 654-666.

119. Sirrenberg C., Bauer M.F., Guiard В., Neupert W., Brunner M. 1996. Import of carrier proteins into the mitochondrial inner membrane mediated by Tim22. Cytosolic factors in mitochondrial protein import. Nature. 384: 582-585.

120. Sondermann H., Scheufler C., Schneider C., Hohfeld J., Hartl F.U., Moarefi I., 2001. Structure of a Bag/Hsc70 complex: convergent functional evolution of Hsp70 nucleotide exchange factors. Science. 291: 1553-1557.

121. Song J., Takeda M., Morimoto R.I., 2001. Bagl-Hsp70 mediates a physiological stress signalling pathway that regulates Raf-l/ERK and cell growth. Nat Cell Biol. 3(3): 276-282.

122. Stennicke H.R., Ryan C. A., Salvesen G.S. 2002 .Reprieval from execution: the molecular basis of caspase inhibition. Trends.Biochem.Sci. 27(2): 94-101.

123. Syrigos K.N., Harrington KJ., Karayiannakis A.J., 2003. Clinical significance of heat shock protein-70 expression in bladder cancer. Urology. 61(3): 677-680.

124. Takayama S, Sato Т., Krajewski S., Kochel K, Irie S., Millan J.A., Reed J.C., 1995. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell. 80(2): 279-284.

125. Takayama S., Bimston D.N., Matsuzawa S., Freeman B.C., Aime-Sempe C., Xie Z, Morimoto R.I., Reed J.C., 1997. BAG-1 modulates the chaperone activity of Hsp70/Hsc70. EMBO J. 16: 4887-4896.

126. Takayama S, Xie Z, Reed J.C. 1999. An evolutionarily conserved family of Hsp70/Hsc70 molecular chaperone regulators. J. Biol. Chem. 247: 781-786.

127. Tanabe M., Kawazoe Y., Takeda S., Morimoto R.I., Nagata K., Nakai A. 1998. Disruption of the HSF3 gene results in the severe reduction of heat shock gene expression and loss ofthermotolerance. EMBO J. 17: 1750-1758.

128. Terada K., Kanazawa M., Bukau B, Mori M. 1997. The human DnaJ homologue dj2 facilitates mitochondrial protein import and luciferase refolding. J. Cell Biol. 139: 1089-1095.

129. Thompson C.B. 1995. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science. 267: 1456-1462

130. Thress K., Song J., Morimoto R.I., Kornbluth L., 2001. Reversible inhibition of Hsp70 chaperone function by Scythe and Reaper. EMBO J. 20: 1033-1041.

131. Tissieres A., Mitchell H.K., Tracy U.M. 1974. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster. J.Mol.Biol. 84: 389-398.

132. Townsend P.A., Cutress R.I., Sharp A., Brimmell M., Packham G., 2003. BAG-1 prevents stress-induced long-term growth inhibition in breast cancer cells via a chaperone-dependent pathway. Cancer Res. 63(14): 4150-4157.

133. Tschopp J., Martinon F., Hofmann K., 1999. Apoptosis: Silencing the death receptors. Curr. Biol. R9: 381-384.

134. Turner B.C., Krajewski S., Krajewska M., Takayama S., Gumbs A.A., Carter D., Rebbeck T.R., Haffty B.G., ReedJ.C., 2001. BAG-1: a novel biomarker predicting long-term survival in early-stage breast cancer. J. Clin. Oncol., 19: 992-1000.

135. Velten M., Gomez-Vrielynck N., Chaffotte A., Ladjimi M.M., 2002. Domain structure of the HSC70 cochaperone, HIP. J Biol Chem 277(1): 259-266.

136. Wang C.-Y., Mayo M.W., Baldwin A.S. Jr, 1996. TNF- and cancer therapy-induced apoptosis: potentiation by inhibition of NF-kappaB. Science. 274(5288): 784787.

137. Wang H., Zhang Q., Zhu D., 2003. hSGT interacts with the N-terminal region of myostatin. Biochem Biophys Res Commun. 311(4): 877-883.

138. Wawrzynow A., Zylicz M., 1995. Divergent effects of ATP on the binding of the DnaK and DnaJ chaperones to each other, or to their various native and denaturated protein substrates. JBC 270: 19300-19306.

139. Westermann В., Gaume В., Herrmann J.M., Neupert W., Schwartz E. 1996. Role of the mitochondrial DnaJ homolog Mdjlp as a chaperone for mitochondrially synthesized and imported proteins. Mol. Cell. Biol. 16: 7063-7071.

140. Wittung-Stafshede P., GuidryJ., Home B.E., Landry S.J., 2003. The J-domain of Hsp40 couples ATP hydrolysis to substrate capture in Hsp70. Biochemistry. 42(17): 4937-4944.

141. Wu C. 1984. Activating protein factor binds in vitro to upstream control sequences in heat shock gene chromatin. Nature. 311: 81-84.

142. Wu C. 1995. Heat shock transcription factors: structure and regulation . Annu.Rev. Cell Dev. 11:441-469.

143. Wu S.-J., Liu F.-H., Ни S.-M., Wang C., 2001. Different combinations of the heat-shock cognate protein 70 (hsc70) C-terminal functional groups are utilized to interact with distinct tetratricopeptide repeat-containing proteins. Biochem J. 359: 419426.

144. XiangS.-L., Kumano Т., Iwasaki S, SunX., Yoshioka K., Yamamoto K., 2001. The J Domain of Tpr2 Regulates Its Interaction with the Proapoptotic and Cell-Cycle Checkpoint Protein, Rad9 Biochem Biophys Res Commun. 287(4): 932-940.

145. Xu Q., 2002. Role of heart shock proteins in atherosclerosis Arterioscler Thromb Vase Biol. 22: 1547-1559.

146. Xu W, Marcu M., Yuan X., Mimnaugh E., Patterson C., Neckers L., 2002. Chaperone-dependent E3 ubiquitin ligase CHIP mediates a degradative pathway for c-ErbB2/Neu. Proc Natl Acad Sci USA. 99(20): 12847-12852.

147. Yang Y, Turner R.S., Gaut J.R. 1998. The chaperone BiP/GRP78 binds to amyloid precursor protein and decreases Abeta40 and Abeta42 secretion. J. Biol. Chem. 273:25552-25555.

148. Zeiner M, Gehring U., 1995. A protein that interacts with members of the nuclear hormone receptor family: identification and cDNA cloning. Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Dec 5;92(25):11465-9.

149. Zeiner M., Gebauer M., Gehring U, 1997. Mammalian protein RAP46: an interaction partner and modulator of 70 kDa heat shock proteins. EMBO J. 16: 54835490.

150. Zeiner M, Niyaz Y., Gehring U., 1999 The hsp70-associating protein Hap46 binds to DNA and stimulates transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1019410199.

151. Zhang Z, Quick M.K., Kanelakis K.C., Gijzen M, Krishna P., 2003. Characterization of a plant homolog of Hop, a cochaperone of Hsp90. Plant Physiol. 131(2): 525-535.

152. Zhou P., Fernandes N., Dodge IL, Reddi A.L , Rao N., Safran H., DiPetrillo T.A., Wazer D.E., Band V., Band H., 2003. ErbB2 degradation mediated by the cochaperone protein CHIP. J Biol Chem. 278(16): 13829-13837.

Информация о работе

Новоселов, Сергей Станиславович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.25

Диссертация

Шапероны в реакции клеток К562 на тепловой стресс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы