Механизмы работы шаперона Hsp70 в нормальных клетках и при клеточной патологии

Гужова, Ирина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы работы шаперона Hsp70 в нормальных клетках и при клеточной патологии
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы работы шаперона Hsp70 в нормальных клетках и при клеточной патологии"

На правах рукописи

4. ^

ГУЖОВА Ирина Владимировна

Механизмы работы шаперона Нзр70 в нормальных клетках и при клеточной патологии

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты доктор биологических наук,

профессор В М Михельсон Институт цитологии РАН Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор А.П Перевозчиков Институт экспериментальной медицины РАМН

Санкт-Перербург

доктор биологических наук, профессор М.Б.Евгеньев Институт молекулярной биологии РАН Москва

Ведущая организация Институт биологии гена РАН

Москва

Защита состоится 4 февраля 2005 г. в Л часов на заседании диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Реферат разослан^/ декабря 2004 г

Ученый секретарь л„

диссертационного совета «

д.б.н. / И.И.Марахова

20 ОЬ -4 2559

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Белок Hsp70 является индуцибельным представителем семейства белков теплового шока БТШ70, или Hsp70 БТШ необходимы клетке во всех процессах ее жизнедеятельности, включая адаптацию к огромному числу цитотоксических факторов, как ксенобиотических, так и естественного происхождения. Структура Hsp70, как и других БТШ, очень консервативна; достаточно отметить, что бактериальный аналог Hsp70, DnaK, по своим свойствам очень напоминает соответствующий белок млекопитающих, а их гены содержат более 50% гомологичных последовательностей.

Hsp70 - первый белок, названный шапероном Функция шаперонов в клетке заключается в том, что они связываются с поврежденными или вновь синтезированными полипептидами и помогают им принять нативную конформацию; шапероны также участвуют в доставке белков в определенные органеллы. Шапероны способны находить в полипептидах-мишенях гидрофобные участки, которые открыты у поврежденных белков или могут открываться у нормальных, зрелых клеточных белков в момент изменения их конформации Подобные конформационные изменения происходят, например, вследствие каскадных модификаций белков в процессе передачи клеточного сигнала. Белки семейства Hsp70 являются одними из основных элементов систем контроля за качеством белков и участвуют в работе всех систем жизнеобеспечения клетки.

Шаперонную активность обычно связывают с защитной функцией Hsp70. То, что шаперон спасает клетки от огромного числа факторов, в том числе, вызывающих апоптоз, было подтверждено в многочисленных опытах in vitro и in vivo с использованием широкого спектра модельных организмов, находящихся на разных ступенях эволюции.

последствия высокого уровня экспрессии Н8р70 в опухолевых клетках? Не ясно, каким образом нервные клетки защищаются от неблагоприятных факторов, к примеру, от формирования нерастворимых белковых агрегатов в нервных клетках головного мозга при некоторых наследственных нейродегенеративных заболеваниях, а также в клетках мозга пожилых людей.

Несколько лет тому назад появились данные о том, что НБр70, ранее считавшийся исключительно цитоплазматическим белком, может находиться во внеклеточном пространстве, в биологических жидкостях человека. В этой связи имеет существенное значение ответ на следующие вопросы: каким образом белок может покидать клетку, какое действие он может оказать на другие клетки, находящиеся вблизи или в отдалении от клетки-донора, может ли он интернализоваться клетками-акцепторами?

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было установить механизмы, на которых основана работа шалерона Нвр70 в нормальных клетках и при клеточной патологии. Предполагалось разработать подходы к возможному использованию наших знаний о Нзр70 в фундаментальных исследованиях и биомедицинской практике.

В рамках поставленной цели представлялось необходимым решить следующие задачи. Во-первых, следовало выяснить, каким образом работает шаперонный аппарат, основанный на Нзр70, в клетках в процессе их реакции на стресс. Во-вторых, важно было понять, в какой связи находятся повышенная экспрессия Нзр70 в опухолевых клетках с разной степенью злокачественности и устойчивость этих клеток к различным, в том числе противоопухолевым препаратам. Представлялось важным определить, в какой мере повышение экспрессии Нвр70 влияет на реализацию процесса апоптоза, вызванного противоопухолевыми препаратами, и каковы механизмы защитного действия шаперона. В-третьих, особое внимание нужно было уделить исследованию вопроса о том, каковы возможные механизмы и последствия выхода во внеклеточное пространство шаперона Нвр70. Ответ на этот вопрос в особенности важен для развития новых средств противоопухолевой терапии. Наконец, предстояло решить комплекс вопросов, которые можно суммировать следующим образом: возможно ли применение препаратов на основе Нэр70 в качестве терапевтических средств при лечении онкологических и нейродегенеративных заболеваний, и каковы границы такого применения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Функция шаперона Нвр70 в клетке заключается в его способности реагировать с клеточными белками, находящимися в разных состояниях'

- вновь-синтезированными полипептидами,

- поврежденными или мутантными белками,

- зрелыми белковыми молекулами в тот момент, когда последние изменяют свою конформацию.

2. Опухолевые клетки обладают повышенной экспрессией Нвр70, благодаря чему они устойчивы к действию широкого спектра цитотоксических факторов, вызывающих апоптоз, в том числе и к действию противоопухолевых препаратов, применяемых в клинике.

3. Защитная функция Нзр70 связана с его шаперонной активностью. Белок, используя свою способность узнавать и связывать гидрофобные домены, обнажающиеся на молекулах сигнальных белков, блокирует их взаимодействие и передачу апоптозного сигнала. Таким образом, повышение содержания шаперона в клетке приводит к задержке или полной отмене апоптоза.

4. Шаперон Нвр70 может выходить и входить в живые клетки с помощью неустановленного механизма. Становясь внутриклеточным белком, он способен защищать клетки от множества цитотоксических факторов, включая те, которые имитируют известные патогены.

5. На клеточной модели болезни Хантингтона показано, что препарат Нвр70 может быть эффективным терапевтическим средством при лечении протеотоксических заболеваний Проникая в заболевающие клетки, шаперон предотвращает формирование нерастворимых агрегатов мутантных белков и спасает клетки от апоптоза.

Научная новизна. Новизна представленных в работе данных определяется несколькими обстоятельствами. Во-первых, в процессе исследований использовался комплекс современных методов клеточной и молекулярной биологии, что позволило проанализировать динамику взаимодействия Нвр70 с кошаперонами, Нс1]1 и Вад-1. Впервые удалось показать, что подобные реакции проходят в таком режиме, чтобы работа всего шаперонного аппарата была максимально эффективной на всем протяжении реакции клетки на тепловой стресс. Во-вторых, было

установлено, что помимо связывания традиционных мишеней, кошаперонов и неправильно свернутых белковых молекул, Нзр70 способен реагировать со «зрелыми», активными белками. Такое свойство позволяет Нзр70 подавлять процесс передачи апоптозного сигнала. Нам впервые удалось выявить две регуляторные системы, на которые действует шаперон; ими являются комплекс транскрипционных факторов ЫР-кВ и эффекторные каспазы, 3 и 7. Выяснилось, что Нвр70 образует комплекс с обеими группами белков и, подавляя их активность, задерживает или полностью отменяет процесс апоптоза, вызванный в раковых клетках противоопухолевыми препаратами. Таким образом, нам удалось подтвердить тот факт, что шаперон Нвр70 является негативным фактором в противоопухолевой терапии. Вместе с тем, по нашим данным, введение препаратов очищенного Нэр70 животным приводит к мобилизации иммунных, противоопухолевых систем организма. С учетом обеих групп результатов можно построить стратегию антираковой терапии, которая должна базироваться на определении количества белка в опухоли и на том факте, что внутривенное введение белка может привести к росту числа иммунных клеток, узнающих Н$р70 на раковых клетках.

Одним из серьезных вкладов в современное понимание роли Нвр70 в функционировании целого организма стало открытие экстраклеточного транспорта шаперона. Удалось показать, что появление белка во внеклеточном матриксе связано с изменениями функции сигнальных систем клеток; этот факт был впервые продемонстрирован для клеток карциномы А431, обработанных ингибитором фосфолипазы С. Далее, и это тоже было показано впервые, Нзр70, добавленный в культуру моноцитов или нейробластов, способен переходить в эти клетки и оставаться в них в течение нескольких часов. Принципиальное значение имеют данные о том, что становящийся внутриклеточным Нэр70 защищает клетки от значительного числа стрессовых факторов. Впервые удалось продемонстрировать способность Нзр70, добавленного в культуру клеток, предотвращать образование агрегатов нерастворимых белков, содержащих длинные повторы глутамина. Таким образом, установлена прямая связь между шаперонной активностью Нвр70 и его защитным, анти-апоптозным действием в модели болезни Хантингтона и других сходных заболеваний. Наконец, впервые полученные результаты показывают, что применяемый интраназально препарат Нвр70 может избавлять животных от симптомов болезни Альцгеймера и посттравматического синдрома. Все эти собранные воедино данные демонстрируют огромный терапевтический потенциал, заложенный в препаратах на основе Нзр70.

Научно-практическая значимость. Данные, показывающие, что высокий уровень экспрессии опухолевыми клетками шаперона Нвр70 делает их нечувствительными к действию противоопухолевых препаратов, позволяют рекомендовать практикующим онкологам включать признак «содержание НэрУО» в набор диагностических факторов и учитывать в выработке противоопухолевой стратегии Для этого в лаборатории разработан принципиально новый метод количественного определения содержания Нэр70 в клеточных экстрактах и биологических жидкостях. Диагностикум прост в использовании и не требует высокой квалификации персонала Анализ с его помощью занимает гораздо меньше времени, чем ныне используемый метод иммуноблоттинга. Диагностикум запатентован в Роспатенте и уже используется несколькими учреждениями медицинского профиля при анализе опухолей половой сферы и для оценки состояния пациентов с различными формами отравления; часть данных опубликована в российских журналах и часть готовится к публикации в международных изданиях.

Результаты, полученные с использованием клеточной модели болезни Хантингтона и на мышах, прошедших операцию бульб-эктомии (модель болезни Альцгеймера), позволяют рассматривать препараты, полученные на основе Нэр70 как перспективное терапевтическое средство для терапии наследственных протеотоксических заболеваний. В настоящее время продолжаются совместные исследования, в том числе с клиническими лабораториями г. Санкт-Петербурга, с целью установить рамки применения свойств препаратов Нвр70 для терапии некоторых нейропатологий или для трансплантологии. Ввиду приоритетности подобных работ ее участники, включая автора диссертации, в 2004 г. получили грант Программы РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Место проведения работы. Основная часть работы была проведена в Лаборатории защитных механизмов клетки Института цитологии РАН (зав. лабораторией д.б.н. БАМаргулис) Часть результатов была получена в соавторстве с сотрудниками Отдела патологии и генетики Университета Уппсалы, Швеция (зав. отделом проф. К.Нильссон), Института офтальмологии Университетского колледжа Лондона, Великобритания (зав лабораторией проф. М.Читам) и Лаборатории биологии распознавания Университета Северной Флуминенсы, Рио де Жанейро, Бразилия (зав. Биологическим центром университета проф. В. да Сильва).

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на конференциях «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург 1997,1998,

2000, 2002, 2003), конференции «СПИД, рак и родственные заболевания» (С -Петербург, 2000, 2003), симпозиумах Ассоциации по генам и белкам теплового шока под эгидой ESF (Париж, Франция, 1993; Рим, 1994 и Равелло, 1994, Италия; Ноттингэм, Англия, 1995), Риншокен симпозиуме (Токио, Япония, 1995), Всемирном иммунологическом конгрессе (Сан-Франциско, США, 1995), Симпозиумах по структуре и функции белков теплового шока в Лаборатории Колд Спринг Харбор (Колд Спринг Харбор, США, 1994, 1996 и 2000), Международных симпозиумах биофизического общества Бразилии (Бразилия, 1995, 1996, 1997), конгрессах иммунологов Бразилии (Бразилия, 1995,1997), симпозиуме «Жизнь и смерть клетки» (Эдинбург, Англия, 1996), 2-м Международном симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния», (Феодосия, Украина, 2003; Хургада, Египет, 2004), 8-м Интернациональном мультидисциплинарном симпозиуме по биологической психиатрии «Стресс и поведение», (Санкт-Петербург, 2004), ежегодных конференциях международной сети NorFa «Стресс и апоптоз» (Копенгаген, Дания, 2001; Санкт-Петербург, 2002; Турку, Финляндия, 2003; Лион, Франция, 2004), конференции международной сети NorFa «Гипоксия» (Тарту, Эстония, 2003), С.-Петербургском обществе естествоиспытателей -

2001, Данные, вошедшие в диссертацию, также докладывались на семинарах следующих учреждений- Отдел патологии и генетики Университета Уппсалы (Швеция, 1992-1993 гг), Университет Северной Флуминенсы (Кампос, Рио де Жанейро, Бразилия, 1995-1997), Центр биологических исследований (Мадрид, Испания, 2001), Института биологии гена РАН (семинар «Хромосома», Москва, 2002), Институт биологии моря ДВО РАН (Владивосток, 2003), Институт микробиологии и биотехнологии Университета Латвии (Рига, 2003), а также на семинарах Института цитологии РАН.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 40 рисунков. Список работ, опубликованных по теме диссертации, содержит 27 наименований.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (98-04-49611; 99-0449556; 01-04-49079; 03-03-33024; 04-04-49237), Wellcome Trust (056895/ Z/99/Z; CRIG 067604), FENORTE Foundation (Brazil), INTAS (02-0592), Гранты Программы РАН «Фундаментальная наука - медицине» и Программы РАН «Молекулярная и клеточная биология».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Работа шаперонного аппарата клетки в процессе реакции на тепловой стресс

Шаперонная функция Hsp70 основана на его способности взаимодействовать с гидрофобными участками белков-мишеней. Гидрофобные участки могут быть экспонированы на молекулах вновь синтезированных пептидов или у белков, утративших вследствие стресса свою нативную конформацию Шаперон может восстанавливать исходную укладку полипептидной цепи благодаря циклическим актам ассоциации-диссоциации с молекулами-мишенями. В ходе этого процесса происходит АТФ-зависимое изменение конформации Hsp70, которое невозможно без взаимодействия Hsp70 с белками-помощниками, или кошаперонами, Hdj1 и Вад-1. Хотя общие принципы работы шаперонной системы достаточно полно описаны, благодаря опытам в системе in vitro с использованием рекомбинантных белков и денатурированных субстратов, что происходит с шаперонами в живой клетке в ответ на стресс, остается во многом не ясным.

Любая клетка в ходе реакции на действие стрессового фактора начинает синтез БТШ По данным иммуноблоттинга с применением антител, узнающих только Hsp70, содержание этого белка в клетке заметно возрастает в течение 12 ч после теплового шока и затем остается постоянным в течение, по меньшей мере, 48 ч. Такой же динамике подчиняется и уровень накопления Hdj1, хотя его количество в клетке гораздо ниже, чем основного шаперона. Другой кошаперон, Вад-1, белком теплового шока не является, и его количество после стресса не изменяется.

Эффективность работы шаперонного механизма определяется взаимодействием составляющих его белков. Анализ динамики реакций между Hsp70 и обоими кошаперонами в клетках К-562, проведенный с помощью методов реципрокной коиммунопреципитации и конфокальной микроскопии показал, что между шапероном и его помощниками существует физическая связь, но характер межбелковых связей, так же как и клеточная локализация комплексов, изменяется с течением времени после стресса (Новоселов и др.2004а). В ходе анализа связавшихся с Hsp70 белков было установлено, что оба рассматриваемых кошаперона соосаждались с Hsp70, причем комплексы с Hdj1 имели место на ранних сроках после стресса, а с Вад-1- на более поздних (рис. 1).

Биологический смысл этого, по-видимому, заключается в быстрейшем связывании как можно большего числа поврежденных белковых молекул с целью предупреждения их агрегации, причем рост количества Hdj1 также

существенно уменьшает время, необходимое Нзр70 для выбора субстрата Вероятно, в этот момент судьба клетки еще не определена, и события могут повернуться в сторону ее программированной гибели

IPHsp70 WB. Hdjl

Время после ТШ К 4 20 24 48

Рис.1. Динамика образования шаперонных комплексов между Hsp70 и его кошаперонами Hdj1 и Вад1 в клетках К-562.

Hdj1

Реципрокная ко-иммунопреципитация Нзр70 и Нсу1 или Вад-1 из клеточных экстрактов К-562, полученных через разное время после нагревания.

IP Вад-1 W8:Hso70

4-Hsp70

Если клетка все же идет по пути восстановления функции, количество поврежденных белков постепенно снижается благодаря координированной работе всех участников, в том числе и Вад-1, основной функцией которого в данном случае является обмен нуклеотидов в молекуле АТФ Постепенно происходит снижение избыточных количеств шаперонов, которые могли бы в противном случае нежелательным образом вмешиваться в клеточные процессы Это, по-видимому, является результатом экспонирования сайтов для атаки протеолитических ферментов на молекулах Hsp70 и Hdj1, которые уже не экранированы белками-мишенями от узнавания клеточными протеазами Некоторая часть поврежденных белков, однако, не может быть ренатурирована Следовательно, они должны быть уничтожены Непосредственными участниками этого процесса являются все те же Hsp70, Hdj1 и Bag-1 с той лишь разницей, что ведущая роль теперь принадлежит Вад-1 Все изоформы этого белка имеют в своем составе убиквитин-подобные последовательности, способные выступать в качестве связующего мостика шапероно-субстратного комплекса с протеасомой Теперь, когда большая часть белков-мишеней восстановлена, процент комплексов шаперонов с необратимо денатурированными белками растет Это подтверждается результатами иммунопреципитации- увеличивается число захваченных антителами комплексов Bag-1-Hsp70 (Рис.1) Дело в том, что такие комплексы существуют более длительное время, поскольку для эффективного связывания с протеасомой требуется дополнительное убиквитинилирование самого Вад-1 и подлежащего деградации субстрата при участии дополнительных белковых факторов (Luders et al, 2000). Таким образом, для последней, третьей, фазы ответа клеток на тепловой

шок характерно торможение шаперонных процессов, и Нзр70 оказывается преимущественно связанным с Вад-1,

Мы также оценили собственно шаперонную или субстрат-связывающую активность Нзр70 в экстрактах клеток К-562 по истечении различного времени после теплового стресса, которая, как оказалось, подвержена значительным колебаниям (рис. 2а) Достоверно нарастая уже к 4 ч после теплового шока, она достигала максимального уровня к 24 ч и возвращалась практически к исходной величине к точке 48 ч. Однако, прирост активности не соответствовал той величине активности, которая была измерена для равных количеств очищенного белка НБр70 (Новоселов и др.2005). Так активность белка в экстракте, приготовленном 4 ч после теплового шока, превышала таковую для аналогичного количества чистого белка в 2 раза, а для экстракта, приготовленного через 24 ч, - в 3 раза. Через 24 ч активность шаперона возрастала в 14 раз, в то время как его количество в клетке - всего в 5 раз (рис 2а)

1600

О 1200

800

400

13» 1 а

ж ■ 1

Я 100 я | 11 130 120

• й ■ 1 • ■

Контроль

4ч

24ч

48ч

Время после ТШ

Рис 2 Влияние кошаперона Нф на субстрат-связывающую активность Нзр70 а - Сравнение шаперонной активности Нэр70 в клеточном экстракте с шаперонной активностью изолированного белка В лунках 96-луночной платы иммобилизовали необратимо денатурированный белок-мишень, после чего добавляли или чистый Нэр70 в известном количестве, или клеточный экстракт Количество связавшегося белка определяли с помощью антител к Нзр70 6 - Прирост шаперонной активности Нзр70 после добавления к клеточным экстрактам экзогенного НсУ1

Внесение экзогенного Нф в экстракты вызвало рост субстрат-связывающей активности Нвр70 (рис.2б) При этом степень прироста была неодинакова в экстрактах, приготовленных на разных этапах реакции клеток на тепловой шок. Максимальный прирост наблюдался в экстракте, соответствующем 4 ч после теплового шока, затем следовали экстракты, приготовленные из контрольных клеток и клеток, инкубировавшихся 48 ч после стресса. Минимальный прирост активности сопровождал внесение

Нф в экстракт клеток с максимальным содержанием эндогенных шаперонов. Относительно невысокий прирост активности в экстракте клеток, инкубировавшихся 24 ч после теплового шока можно объяснить тем, что в таком экстракте присутствует большое количество необратимо денатурированных белков, которые накапливаются к концу реакции на тепловой стресс. Эти данные, полученные впервые с использованием клеточных экстрактов, позволяют сделать вывод о том, что на начальных этапах реакции клеток на стресс шаперонный механизм использует пару Нэр70-Нф, а на последующих - Нэр70-Вад-1.

Глава 2. Защитная роль Нзр70 в опухолевых клетках.

Синтез Нвр70 запускается в основном в ответ на действие стрессовых факторов, однако в нормальных тканях человека экспрессия Нзр70 также имеет место, но происходит она на низком уровне. В то же время в злокачественных новообразованиях разного гистогенеза был продемонстрирован повышенный уровень экспрессии Нэр70 по сравнению с нормальной тканью (За^агова е1 а1., 1997); с неблагоприятными прогнозами для онкологического больного также был связан повышенный уровень белка Вад-1. Для НсЦ1 такие данные практически отсутствуют, увеличение уровня Нф было показано только для клеток рака легкого (Ока е1 а!., 2001).

2.1. Диагностикум для определения концентрации Нвр70 в биологических жидкостях.

Для того чтобы определять количество Нэр70 в клеточных, тканевых экстрактах или биологических жидкостях, необходим простой и доступный инструмент. Метод иммуноблоттинга в этом случае представляется не применимым, поскольку количество детектируемого белка слишком невелико, а белки, например, сыворотки крови с аналогичной молекулярной массой способны маскировать Нвр70 на блоте. Более подходящей является комбинация иммуноблоттинга с предварительной иммунопреципитацией, однако подобная стратегия требует высокой квалификации персонала, занимает много времени и достаточно трудоемка. Кроме того иммуноблоттинг нельзя назвать количественным методом определения белка.

Наиболее перспективным для массового скрининга биологических жидкостей представляется иммуноферментный анализ. Этот метод широко применяется в медицинской практике, например для определения уровня

гормонов в крови. Как правило, подобный набор организован следующим образом: на дне лунки помещаются антитела (capture antibody) против интересующего белка Далее в эти лунки вносится биологическая жидкость, и, если в ней искомый белок присутствует, он узнается и связывается антителами. После отмывки снова вносятся антитела к интересующему белку, но эти антитела (detection antibody) должны быть направлены к другому эпитопу молекулы выявляемого белка. В случае Hsp70 получить подобную пару антител очень сложно, большинство существующих моно- и поликлональных антител направлены против небольшого участка С-терминальной части молекулы; поэтому между специфическими антителами существует конкуренция за близко расположенные сайты узнавания.

Мы использовали свойство Hsp70 высокоспецифично взаимодействовать с иммобилизованным аденозинтрифосфатом (АТФ). АТФ пришивали к гексаметилендиамину и полученную таким образом производную конъюгировали с овальбумином, используя длинный гидрофильный спэйсер (SMBP, Pierce). Сконструированный таким образом белок иммобилизовали на поверхности лунок 96-луночного планшета, и после промывки в последние вносили исследуемые образцы биологических жидкостей или стандартные образцы очищенного белка. После дополнительных промывок в лунки вносили раствор поликлональных антител R2 и далее - антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена. Чувствительность нашего набора - 250 пкг/мл (Новоселов и др ,20046).

2.2. Анализ экспрессии белков-шаперонов, Hsp70 и Hdj1, в опухолевых клетках человека.

Мы сравнили содержание Hsp70 и Hdj-1 в клетках злокачественных и доброкачественных опухолей женской урогенитальной сферы и молочной железы, диагностированных с октября 2002 г. по апрель 2003 г. в Онкологическом городском диспансере С -Петербурга. Для более точного количественного анализа содержания Hsp70 в опухолевых клетках мы использовали диагностикум, описаный в предыдущей главе. Результаты иммуноферментного анализа подтвердили данные, полученные с помощью иммуноблоттинга.

Было проанализировано 57 опухолевых образцов различных органов урогенитальной сферы (8 опухолей яичника, 19 опухолей эндометрия, 15 опухолей матки) и 15 опухолей молочной железы. 16 опухолей были доброкачественными, 41 - злокачественными. Пробы доставлялись не

позднее 1 ч после операции, половину каждого образца замораживали при -20°С и хранили до момента иммунохимического анализа Вторую половину пробы после фиксации в формалине использовали для постановки диагноза на основании морфологических изменений ткани (Новоселов и др., 2004в).

Рисунок 3 демонстрирует распределение опухолевых образцов по содержанию Hsp70 и Hdj1. Количество Hsp70 было определено с помощью диагностикума и представлено в количестве нг шаперона на 1 мг общего белка. Количество Hdj1 выражали в относительных единицах (O.E., показывающих отношение уровня экспрессии Hdj1 к уровню экспрессии актина).

Средний уровень экспрессии Hsp70 был повышен в злокачественных опухолях по сравнению с доброкачественными в тканях яичника и молочной железы. Однако это повышение не было статистически достоверным. Для опухолей матки не было отмечено повышение уровня Hsp70 в злокачественных новообразованиях по сравнению с доброкачественными По-видимому, увеличение содержания Hsp70 в опухолях матки происходит на самых ранних этапах опухолевой прогрессии, пока опухоль еще доброкачественная. В пользу этого предположения говорит довольно высокий уровень экспрессии Hsp70 в доброкачественных новообразованиях. Конечно, необходимо исследование нормальных, немалигнизированных тканей, близких опухолевым образованиям, однако получить контрольные образцы от здоровых людей представляется затруднительным ввиду ряда этических проблем.

Рис 3 Распределение образцов опухолевой ткани по содержанию шаперонов Нзр70 и Нф-

Уровень экспрвсии Н8р70 определяли с помощью иммуноферментиого диагностикума. Для НерТО данные представлена в количестве •¡нг На 1 мг тотальною белка, а дли Нф - в относитвльныхадиницах.

ДК - образцы доброкачественных опухолей, ЗК - злокачественных

Уровень Нс1]1, напротив, был значительно повышен в злокачественных образцах по сравнению с доброкачественными в тканях яичника и матки (см. рис.3). Такое повышение экспрессии Нсу-1было признано статистически достоверным. В тканях молочной железы не было обнаружено корреляции

между уровнем Нф и злокачественностью, возможно, потому, что в доброкачественных она уже была достаточно высокой Хотя шаперонная активность Нф изучена достаточно полно, роль этого белка в физиологии клетки не вполне ясна; именно поэтому необходим дальнейший анализ функций этого белка и его количества в нормальных и опухолевых клетках. В заключение необходимо отметить, что НсЦ1, наряду с Нзр70, является перспективным маркером опухолевого роста.

2.3. Зависимость устойчивости опухолевых клеток к индукторам апоптоза от уровня экспрессии Hsp70.

Содержание Hsp70 можно модулировать, используя ряд различных приемов. Самый простой из них - тепловой шок. Очень эффективными также являются трансфекция клеток соответствующим геном и транспорт очищенного белка в клетки с помощью липосом. Содержание шаперона можно и понизить, например с помощью специфических малых интерферирующих РНК (siRNA) или некоторых препаратов, понижающих его экспрессию, в частности флавоноида кверцитина.

Клетки миелоидной лейкемии U-937 представляют собой хорошую модель для испытания таких цитостат'икбв, как этопозид (ЕТО) и адриамицин (ADR). В ответ на их действие темпы роста клеточной популяции снижаются до минимальных величин (Тroyano et al., 2001), а апоптоз в клетках U-937 сопровождается типичными проявлениями: фрагментацией ядра, диссоциацией ДНК на олигонуклеосомы и активацией каспаз 3 и 7. Для того, чтобы вызвать накопление Hsp70, мы нагревали клетки в течение 30 мин при 43° С После этого клетки инкубировали при 37° С в течение разных промежутков времени, чтобы определить момент, в который уровень Hsp70 становился достаточно высоким и можно было вводить противоопухолевые препараты (Комарова и др., 2004). Данные иммуноблоттинга показали, что значительное накопление Hsp70 имеет место уже через 3 ч после теплового воздействия, этот интервал времени и был выбран для введения в клеточную культуру ADR и ЕТО (рис.4а)

Однако гипертермия вызывает индукцию целого ряда белков стресса, а не только Hsp70, причем некоторые из них также могут внести свой вклад в защиту клеток от неблагоприятных факторов. Для того чтобы отделить эффекты Hsp70 от действия других белков, мы трансфецировали клетки U-937 плазмидой, содержащей полноразмерный ген hsp70 под контролем конститутивного цитомегаловирусного промотора, pcDNA3HSP. Как

показали результаты иммуноблотинга и иммунофлуоресценции полученные в результате трансфекции клетки экспрессировали значительное количество Нэр70 (рис 46) Независимо от того, каким образом мы повышали количество Нвр70 в клетках 11-937, - с помощью мягкого прогревания или вследствие трансфекции соответствующим геном - клетки с высоким содержанием белка демонстрировали повышенную устойчивость к индуцирующему апоптоз действию обоих противоопухолевых препаратов, как показало окрашивание акридиновым оранжевым (рис 4г) Повышение уровня Нэр70 благодаря нагреванию или трансфекции соответствующим геном приводило к снижению количества апоптозных клеток примерно на 50% по сравнению с контрольной популяцией после действия обоих противоопухолевых препаратов

® Время после ТШ с 3 6 24

еНвр70

Нвр70

.л 70

Е го

к тш к тш<к%к тш о,\ к тшк тш

л?"-а Чг'Ь

Рис 4

| | АОЯ ЕГО | АОИ | ЕГО Тропа рет

| 6 часов 18 часов Время

1 трансфекции

одноименным геном приводит к повышению устойчивости клеток лимфоидной лейкемии и-937 к действию противоопухолевых препаратов

а -накопление Нэр70 в клетках 11-937, подвергнутых тепловому шоку (ТШ) 43° С, 30 мин, после стресса клетки инкубировали в С02 инкубаторе при 37° С в течение указанного времени Клеточные экстракты полученные через данные интервалы времени анализировали с помощью иммуноблоттинга с антителами 2Н9 б- контрольные (а) клетки, клетки после теплового шока (Ь), и клетки, трансфецированные геном Ьвр70 (с) анализировали с помощью иммунофлюоресценции, используя монокпональные антитела 2Н9

в - иммуноблоттинг тех же клеток что и в б г - Реакция тех же групп клеток что вбив ча действие адриамицина и этопозида

Третий способ увеличения Нзр70 в клетке - введение экзогенного белка, выделенного из мышцы быка, с помощью липосом (1_а8ип8ка1а е1 а1., 1997). В этой серии экспериментов мы использовали N80/1 клетки, которые не экспрессируют Нзр70 и очень чувствительны и к действию высоких температур Клетки, предварительно инкубированные с липосомами, содержащими Нэр70 или буфер, были подвергнуты "жесткому" тепловому шоку (44°С, 20 мин), и через 4 ч был произведен подсчет апоптозных клеток. Доставку Нэр70 в клетки контролировали с помощью иммуноблоттинга с антителами против Нэр70. Введение Нвр70 в клетки N80/1 перед тепловым шоком приводило к значительному понижению числа апоптозных клеток по сравнению с популяцией клеток, в культуру которых вносили "пустые" липосомы.

Чувствительность клеток к цитотоксическим факторам обычно зависит от того, какое количество Нэр70 присутствовало в клетке в момент повреждающего воздействия. Кверцетин, примененный за 5 ч до жесткого теплового шока или до внесения этанола в культуральную среду, значительно понижал содержание Нзр70 даже в тех клетках, которые прошли мягкое тепловое пре-кондиционирование. Это приводило к резкому повышению чувствительности клеток к действию обоих цитотоксических факторов (1_а8ип$ка1а et а1., 1997). В другой серии экспериментов прицельное подавление экспрессии Нйр70 с помощью технологии к Нзр70, успешность которой была подтверждена с помощью иммуноблоттнига, приводило к тому, что клетки и-937л/-тус становились достоверно более чувствительными к действию противоопухолевых препаратов ЕЮ и камптоцесина

Подводя итоги этой главы, хотелось бы отметить, что Нвр70, представляя собой универсальную защитную систему клетки, обеспечивает устойчивость опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам, широко применяемым в клинике. Мы повышали уровень Нэр70 в клетках разными способами. Во всех случаях клетки становились более устойчивыми к действию всех использованных нами повреждающих факторов, в норме индуцирующих апоптоз. При понижении же уровня экспрессии Нвр70 клетки, напротив становились более чувствительными к действию всех повреждающих агентов, использованных в эксперименте. Исходя из наших данных, а также на основе многочисленных литературных источников, можно сделать вывод о том, что Нвр70, экспрессируемый опухолевыми клетками на высоком уровне, представляет серьезную защитную систему раковой клетки, в том числе и для действия противоопухолевых препаратов. Вопрос о том, каков молекулярный механизм защитной функции белка, будет обсуждаться в следующей главе.

2.4. Вмешательство Нэр70 в сигнальные пути апоптоза, подавление действия эффекторных каспаз.

Апоптоз - сложный молекулярный процесс, вовлекающий в себя множество сигнальных клеточных систем и работающий по механизму каскада Подразумевается, что каждый предыдущий участник каскада активирует последующий, изменяя конформацию его молекулы Если в силу каких-то причин такого изменения не происходит, весь каскад может остановиться Другими словами, процесс апоптоза можно задержать или даже предотвратить, если каким-либо образом прервать цепь конформационных изменений одной молекулой последующих Препятствие может иметь белковую природу, и действительно, существует ряд белковых систем, признанных как антиапоптозные молекулы Одна из таких систем основана на Нвр70

Исследуя роль Нэр70 в процессе апоптоза, вызванного действием противоопухолевых препаратов на клетки 11-937, мы сравнили кинетику развития процесса на уровне регуляции эффекторных каспаз 3 и 7 Оказалось, что протеолиз каспаз в клетках и-937, трансфецированных геном Ьзр70 под контролем промотора цитомегаловируса, происходит с большим опозданием, и задержка составляет примерно 18 ч. Для клетки, чье время жизни от деления до деления составляет 24 ч, этот период огромен

Время в культуре,ч О 48 60 72

|«_ 34кДа 5-32кДа

Рис 5 Подавление in vitro активности каспаз 3 и 7 с помощью Hsp70

а- активация каспаз 3 (нижняя панель) и 7 (верхняя панель) в клетках NS0/1 при сывороточном голодании в течение указанного времени б - кинетика активации каспаз 3 и 7 при сывароточном голодании (в часах) в - активность каспаз 3 и 7 при добавлении к клеточный экстрактам очищенного Hsp70 г - каспазная активность в экстрактах клеток U-937, контрольных и после индукции ETO. Нзр70 добавляли в указанных количествах, а его

активность блокировали с помощью специфических моноклональных антител 2H9 Неспецифические IgG мыши были использованы в качестве контроля

Contf 1 ETO умеют

- 50 60 1 26 50 10 25 60 50н»ЛЖкЛ>

. - + . - - ♦ + + - *4Hfp7(M8

Время в культуре,ч

Для того чтобы определить, в какой точке сигнального пути Hsp70 задерживает проведение сигнала, мы выбрали в качестве модельной систему апоптоза в клетках NS0/1 в условиях сывороточного голодания. Преимущество этих клеток для исследований подобного рода заключается в отсутствии экспрессии гена hsp70 как в нормальных условиях, так и в ответ на стресс (Lasunskaia et al, 2003). Профиль активации эффекгорных каспаз в голодающих клетках был исследован с помощью имуноблоттинга. Протеолиз обеих каспаз, 3 и 7, начинался на второй день голодания, и к третьему дню можно было видеть только активные формы обеих каспаз (рис. 5а). Обе протеазы имеют одну и ту же последовательность, по которой происходит их расщепление: - DEVD-, поэтому их называют DEVD-азами.

Мы определили DEVD-азную активность в лизате клеток NS0/1 в разные временные точки после начала голодания (рис 56) и обнаружили, что она достигает своего максимума к 72 ч от начала голодания. На иммуноблоте эта точка соответствовала полному протеолизу обеих эффекторных каспаз. Когда к клеточным лизатам, приготовленным из клеток NS0/1 через указанные промежутки времени (рис 5в), добавляли очищенный препарат Hsp70, DEVD-азная активность снижалась на 40% через 48 ч (точка начала каспазного протеолиза) и на 60% через 60 ч (временная точка, в которой в лизате в равном количестве присутствовали зимоген и активная субъединица). Через 72 ч сывороточного голодания, когда в лизате присутствует только активная каспаза, подавление активности с помощью Hsp70 было незначительным, возможно в силу того, что протеолиз каспаз уже прошел ту точку, когда Hsp70 мог бы сыграть какую-то роль (Komarova et al., 2004).

Мы предположили, что ингибирующий эффект Hsp70 может быть связан с формированием комплексов Hsp70 с незрелыми каспазами Чтобы проверить эту гипотезу, мы применили тест имунопреципитации с использованием специфических антител 2Н9, иммобилизованных на CNBr-Sepharose, и реципрокную систему - с антителами против каспазы 3 или 7 с дальнейшим осаждением с помощью геля Protein G-Sepharose (рис 6а). Лизаты клеток U-937, контрольных и индуцированных к апоптозу, были пропущены через колонку с антителами 2Н9, и белки, связавшиеся с гелем, были проанализированы с помощью антител к каспазам 3 или 7. В реципрокной системе каспазы и связанные с ними белки анализировали с помощью антител к Hsp70 Обе незрелые каспазы 3 и 7 были найдены в комплексе с шапероном как в контрольных клетках, так и клетках, стимулированных к апоптозу (рис.ба). В случае использования неспецифических антител того же изотипа вместо антител 2Н9 в

иммунопреципитатах не наблюдали ни Hsp70, ни каспаз. После воздействия на клетки ADR Hsp70 связывался с прокаспазой 7 и частично с 32 кДа компонентом, т е ферментом, утратившим свой продомен рис б а Не было обнаружено также связывания со зрелой каспазой - компонентом с мол весом 19 кДа Hsp70 был связан также с прокаспазой 3 и не связан с конечным продуктом ее протеолиза

иии^огвдипитат Суп*(Жвт»кт

IP онг«еп7 jlge емсаслГ

Индукция к А А К А А

а тмла кж

|WB a-Hsp70 АВ |

IP a-Hsp70ltoe a-Hsp70| по

Индукция К А А к А А

*-Hsp70

34 «Да

32 «Да

<-19кДа

|WB | а-касп 7 |

Иымунолр*ци|мт&т CyntpMTiMT

таспз |1дО емоепэ |1дб

К А А К А А

Hsp70

O-HSP70 АВ

a-HSD701 йО a-Hsp7d tao

К А А К А А

32кДа 17 кДа

а-каслЗ

IP: касп7 Клет.лизат IP: к Клет.лизат

Hsp70 + - - +

Иидук. ' k А К А К А К А К А К А

б МИ щ »-34кДа "32кДа

|WB a-Hsp70 1 а-касл a-Hsp70 а- касп 3

■32кДа

Рис 6 Hsp70 физически взаимодействует с каспазами 3 и 7 в клетках U-937 а - Реципрокная иммунопреципитация Экстракты клеток, полученные из контрольных (К) клеток и клеток, индуцированных ADR в течение 6 ч инкубировали с антителами 2Н9, лигированными на геле CNBr-Sepharose (нижняя панель) или с антителами против каспазы 3 или каспазы 7 (верхняя панель), или неспецифическими антителами того же класса (IgG) б - FarWestern Иммунопреципитаты каспаз 3 и 7 также инкубировали с изолированным Hsp70, а затем с антителами 2Н9 Мембраны с каспазами 2 и 7 также инкубировали с антителами 2Н9, чтобы показать отсутствие реакции антител 2Н9 с каспазами Для подтверждения позиции каспаз на блоте тотальные лизаты клеток инкубировали с антителами к каспазам

Чтобы показать, что взаимодействие Нэр70 с прокаспазами - прямое и происходит без вовлечения белков-посредников, мы использовали метод РаЫЛ^егл блоттинга Лизаты тех же клеток, что и в предыдущем опыте, также инкубировали с антителами против каспаз 3 и 7 и после электрофореза в системе Лэмли переносили на нитроцеллюлозную мембрану Блоты с зонами прокаспаз инкубировали с препаратом очищенного белка Нэр70, а затем, после тщательной промывки, с

антителами 2Н9 Другую часть мембраны с зонами очищенных в результате иммунопреципитации каспаз 3 и 7 инкубировали непосредственно с антителами против Hsp70, чтобы исключить возможность неспецифического связывания антител с каспазами. Положение зон прокаспаз на блоте подтверждали инкубацией полос нитроцеллюлозы с соответствующими антителами (рис 66). Результаты этих опытов показали, что Hsp70 из лизатов и чистый препарат шаперона узнают обе прокаспазы в лизатах контрольных и стимулированных к алоптозу клеток U-937.

Наблюдения, приведенные в этой главе, указывают на то, что Hsp70 может влиять на процесс созревания эффекторных каспаз, благодаря прямой ассоциации с этими ферментами. Серия экспериментов с использованием реципрокной коимунопреципитации и Far-Western блоттинг убедительно показывают, что взаимодействие шаперона с эффекторными каспазами в момент, когда их протеолиз только начинается, (а, следовательно, могут приоткрываться гидрофобные сайты, привлекательные для шаперона), является специфическим и прямым (Komarova et ai , 2004)

Надо отметить, что эффекторные каспазы - не единственные участники апоптозного процесса, которые могут быть связаны с Hsp70 Шаперон может подавлять процесс апоптоза почти во всех его критических точках Он может связываться с CARD-доменом Apaf-1 (Beere et al, 2000; Saleh et al, 2000), предотвращая формирование апоптосом и, таким образом препятствовать созреванию каспазы 9 и, соответственно, всех остальных каспаз, которые следуют за ней «вниз по течению» Hsp70 способен взаимодействовать с AIF (Ravagnan et al, 2001), р65, р50 (Гужова и др 2004; Guzhova et al, 1997) и l-кВ (Kohn et al, 2002) - членами транскрипционного комплекса NF-кВ Hsp70 может ингибировать активность стресс-киназ (Mosser et al, 2000) и подавлять активированную каспазами ДНКазу (Liu et al, 2003) Существенно, что он может также связываться с некоторыми белками на поверхности опухолевой клетки, играющими важную роль в опухолевой профессии

2.5. Поверхностный белок клеток рабдомиосаркомы крыс, р58, ответственный за метастазирование в легкие, ассоциирован с Hsp70.

Одно из самых опасных последствий возникновения злокачественных образований - формирование вторичных опухолевых узлов, расположенных в участках организма, удаленных от первичного очага -метастазов. Опухолевая клетка, вовлеченная в процесс метастазирования, должна успешно пройти несколько этапов: отделение от первичной опухолевой массы, проникновение через базальную мембрану или эндотелиальные стенки кровеносных сосудов, путешествие по

кровеносному руслу в удаленный орган или ткань. В Лаборатории генетики клеточных популяций Института цитологии РАН была создана удобная модель метастазирующих клеток Это рабдомиосарома крыс РА-2, полученая в результате инъекции метилхолантрена в ножную мышцу животного (Степаньян, Бахтин, 1980). Клетки полученной опухоли в виде суспензии вводили в хвостовую вену крыс, и те приживались в основном в легких (первое капиллярное сито на пути клеток из хвостовой вены), но на первых пассажах также встречались опухолевые узлы в печени, почках, сердце. Пройдя несколько десятков циклов подобного пассирования, опухолевая популяция приобрела высокую органотропность к легочной ткани Поскольку для каждого последующего пассажа выбирались клетки наиболее крупных клонов из наиболее обсемененных легких, постепенно шла селекция на повышение метастатического потенциала (Каминская, Бахтин, 1989). К тому времени, когда мы приступили к этому исследованию, линия РА-2 обладала такой степенью злокачественности, что примерно 10% клеток, введенных в хвостовую вену, давали начало опухолевым узлам (Каминская и др., 1995)

Чтобы выяснить, какие молекулы на клеточной поверхности могут быть ответствены за прикрепление метастазирующих клеток к эндотелиальным клеткам легких, мы выделили фракцию плазматических мембран на сахарозной подушке, и белки этой фракции использовали в качестве антигена для иммунизации кроликов Полученную сыворотку инкубировали со смешанными экстрактами, полученными из легких, печени, почек, сердца и мышц интактных крыс в течение1 сут; по завершении преципитации сыворотки центрифугировали, фракцию специфических антител очищали на колонке с Protein A-Sepharose 4В и анализировали в тесте иммуноблоттинга с экстрактами клеток РА-2. Оказалось, что антитела узнают белок с молекулярной массой 58 кДа, р58. Когда перед инъекцией клеток животным мы проинкубировали клетки РА-2 с этими антителами (во избежание эндоцитоза инкубация проходила на льду), оказалось, что количество опухолевых узлов значительно упало. Мы использовали разные концентрации антител, и подавление формирования метастазов имело выраженный дозо-зависимый эффект. Клетки оставались жизнеспособными, что было подтверждено окраской трипановым синим, и сохраняли пролиферативный потенциал. Подкожное введение клеток, предварительно проинкубированных с антителами в самой высокой из использованных концентраций (800 мкг/мл), никак не сказалось на темпах роста опухолей по сравнению с интактными клетками РА-2 или клетками, инкубированными с неспецифическими антителами такого же изотипа (Guzhova etal., 1992).

То, что пролиферативный потенциал клеток оказался неизмененным после обработки антителами, а количество сформированных в легких узлов значительно упало, говорит в пользу того, что маскирование р58 специфическими антителами препятствует именно прикреплению клеток к эндотелиальным стенкам легочных капилляров

Наши попытки выделить чистый р58 с помощью хроматографических процедур с применением ионообменной и аффинной хроматографий привели к тому, что во фракции выделенного белка всегда присутствовала примесь белка с молекулярной массой около 70 кДа. Позиция этого белка на двухмерной электрофореграмме, его изоэлектрическая точка, заставили нас предположить, что это Нзр70. Это предположение подтвердилось, когда мембрану после двухмерного электрофореза элюата с колонки, на которой были лигированы антитела к р58, проинкубировали с антителами к Нэр70

Нам не удалось выделить достаточное количество р58 и расшифровать его последовательность, чтобы идентифицировать с помощью банка данных Поэтому сейчас мы можем только предполагать о том, какой смысл может иметь его связь с Нзр70. Однако многочисленные данные о том, что шаперон способен связывать поверхностные опухолевые антигены привели нас к постановке задачи исследования, о котором пойдет речь в следующем разделе.

2.8. Введение животных препарата очищенного Нвр70 приводит к предотвращению формирования опухолевых узлов в легких при введении опухолевых клеток.

Нэр70 может связываться с белками на поверхности раковой клетки, включая те из них, которые играют существенную роль в опухолевой прогрессии и процессе метастазирования Кроме того, в условиях высокого содержания Нвр70 в опухолевой клетке, шаперон выходит на поверхность (МиШюА е! а1., 1995) вместе с набором опухолевых антигенов, и, как это бывает в некоторых случаях, представляет их иммунной системе. Мы предположили, что если это так, то и Нзр70, находящийся в кровеносном русле, также может сыграть иммуномодулирующую роль.

Для того чтобы проверить это предположение, мы приготавливали экстракт клеток рабдомиосаркомы крыс РА-2, смешивали его с Нвр70 и использовали для внутримышечного введения крысам. Кроме того, мы использовали для иммунизации чистый экстракт и очищенный препарат Нзр70. Крысы получали внутримышечные инъекции указанных препаратов с интервалом 11 сут; контрольной группе животных вводили тот же объем физиологического раствора. Всего было 3 цикла иммунизаций. Через 3 дня после последней инъекции внутривенно вводили порцию клеток РА-2.

Через 20 сут животных умерщвляли, взвешивали легкие, производили в них подсчет поверхностных опухолевых узлов, из каждого легкого по произвольному выбору извлекали 20 узелков, которые также взвешивали. У каждого животного отбирали кровь для приготовления сыворотки для последующего анализа наличия Нзр70 в крови.

К нашему удивлению оказалось, что предварительная иммунизация клеточным экстрактом не приводила к значительному уменьшению числа легочных метастазов. Не было найдено достоверной разницы и в количестве общей опухолевой массы, и размеры опухолевых узлов также не отличались от таковых у животных контрольной группы. Некоторое понижение всех перечисленных параметров мы наблюдали в случае иммунизации смешанным антигеном, т.е. лизатом опухолевых клеток и Нзр70. Однако в том случае, когда в качестве антигена использовался чистый препарат Нзр70, разница и в числе, и в размере опухолевых узлов, а также в общей опухолевой массе была достоверной.

Уже давно известно, что животные, которые были "вакцинированы" ослабленными опухолевыми клетками, например, после облучения нелетальными дозами, приобретают иммунитет к последующему введению "здоровых" опухолевых клеток того же происхождения; опухолевые клетки не приживаются, и опухоль не развивается То, что в наших опытах не происходило понижения метастатического потенциала после введения экстракта клеток РА-2, можно объяснить тем, что при его приготовлении удалялись обрывки плазматических мембран клеток, белки которых, видимо, и являются антигеном в случае вакцинации ослабленными опухолевыми клетками.

Хочется обсудить еще одну группу данных, полученных в той же серии опытов. Измерение содержания Нзр70 в сыворотке крови с помощью разработанного в нашей лаборатории диагностикума показало, что внутримышечные инъекции Нэр70 незначительно повысили его содержание в крови. Разница нивелировалась еще и тем, что в сыворотке крови животных контрольной группы, и группы, получавшей чистый лизат клеток РА-2, попадались индивидуумы с высоким содержанием белка. Когда всех животных, участвующих в опыте, поделили на две группы по признаку "Содержание Нзр70 в сыворотке крови" (т.е. выше или ниже 200 нг/мл), оказалось, что все изучаемые нами параметры были значительно ниже у тех особей, у которых в крови находилось высокое содержание Нзр70.

Выполняя свою шаперонную работу внутри клетки, т.е., помогая полипептидам сворачиваться в правильную структуру, подготавливая денатурированные белки к деградации, вмешиваясь в сигнальные пути апоптоза, Нзр70 соединяется с множеством белков. Это означает, что в каждый

момент Hsp70 может "представлять" внутри клетки целую библиотеку полипептидов Эта библиотека содержит нормальные белки, которые присутствуют во всех клетках, и ненормальные полипептиды, которые встречаются только в "больных" или раковых клетках

В норме Hsp70 находится внутри клеток, однако в последние годы появилось множество публикаций, указывающих на то, что он также может находиться и внеклеточном пространстве, в биологических жидкостях человека - крови, слюне (Febraio et al., 2002; Fabian et al., 2003). Возникает вопрос, каким образом Hsp70 появляется вне клетки? По мнению проф. П Сривастава источник экстраклеточного Hsp70 - клетки, погибшие по механизму некроза (Basu et al., 2002). Некротическая гибель - процесс внезапный, клетки разрушаются, и их содержимое выплескивается наружу, в том числе во внеклеточном пространстве оказываются и белки теплового шока. Однако, будучи шапероном, Hsp70 появляется там не сам по себе, а вместе с теми пептидами, с которыми он был связан в момент гибели клетки. Если речь идет об опухолевой клетке, то помимо нормальных белков Hsp70 может быть связан и с чужеродными (например, вирусными), неправильно экспрессированными или измененными в результате мутации белками. Если к первым иммунная система выработала состояние иммунотолерантности еще во времена раннего развития организма, то вторые, особенно соединенные с Hsp70, а значит и изменившие свою конформацию, приоткрыв скрытые в нативном состоянии сайты, становятся красной тряпкой для иммунной системы.

Заключая эту главу, хотелось бы отметить, что признак "содержание Hsp70" нам представляется очень важным в выработке стратегии противоопухолевой терапии. Если в опухолевой клетке Hsp70 экспрессирован на высоком уровне, препараты, призванные вызывать апоптоз, будут неэффективными, поскольку шаперон вмешивается в сигнальные пути апоптоза и может прервать ход событий на многих этапах каскада. Однако если опухолевую клетку, содержащую большое количество Hsp70, подвергнуть действию жесткой терапии (лазерная терапия, локальная гипертермия опухоли), это приведет к некрозу части опухолевой ткани, а, значит, и к высвобождению шаперона во внеклеточное пространство и презентации специфических опухолевых антигенов клеткам иммунной системы. В наших опытах in vivo с клетками рабдомиосаркомы крыс РА-2 при анализе крови животных на предмет содержания Hsp70 мы обнаружили, что предварительное введение чистого белка, самого по себе или в сочетании с лизатом опухолевых клеток, не повышала достоверно его количество в крови. Однако ряд животных, которые не получали инъекций Hsp70, демонстрировали высокое содержание шаперона, и этот факт, судя

по всему, благотворно влиял на течение болезни. У крыс этой группы и число, и размер опухолевых узлов были значительно меньше Встает вопрос, откуда у здоровых интактных животных в крови появляется Hsp70? Связано ли это с неизвестным патологическим процессом, или же с образом жизни, физической активностью"? Не может ли Hsp70 выходить из живых клеток?

Глава 3. Hsp70 во внеклеточном пространстве.

3.1. В экспорт Hsp70 вовлечены сигнальные механизмы клетки.

Впервые выход Hsp70 из живых клеток был показан при исследовании транспорта белков между гигантским аксоном кальмара и окружающими его глиальными клетками (Tytell et al., 1986) Надо подчеркнуть, что эти данные были получены для клеток беспозвоночных животных; справедливо ли это для клеток млекопитающих и человека, долгое время оставалось не ясным.

В наших опытах мы использовали клетки глиобластомы T98G человека Эти клетки отвечают на тепловой стресс хорошо известным способом' в контрольных, не гретых клетках Hsp 70 локализуется в цитоплазме. В течение часа после начала нагрева он переходит в ядро, что является типичным в ответе клеток на стресс (Welch and Suhan, 1986), а через 24 ч белок снова распределен в цитоплазме, а его количество увеличено в 40-50 раз. Смертность клеток после теплового шока при 44° С, 20 мин, незначительна, через 24 ч в популяции наблюдается не более 8% мертвых клеток.

Для того, чтобы выявить возможный экспорт Hsp70 клетками глиального происхождения, мы использовали важное свойство членов семейства Hsp70 связываться с АТФ. Белки из культуральной среды, элюированные с колонки с АТФ-агарозой, анализировали с помощью иммуноблоттинга. В качестве контроля использовали культуральную среду, в которой клетки T98G не инкубировались. Как показали результаты, в кондиционированной среде находился Hsp70 в количестве, достаточном для анализа с помощью специфических антител. Клетки, предварительно нагретые до 44° С в течение 20 мин, высвобождали Hsp70 в количестве в 510 раз большем, чем контрольные, не гретые клетки Количество высвобожденного Hsp70 оценили сравнением с известным количеством препарата Hsp70/Hsc70, который был нанесен на тот же нитроцеллюлозный фильтр. Согласно этим расчетам, 106 контрольных клеток в течение 1 сут высвобождали в среду 5-15 пкг Hsp70, клетки, предварительно подвергнутые тепловому шоку - 25-50 пкг (Guzhova et al., 2001).

Наличие белка в среде не может быть объяснено некротической гибелью клеток, поскольку их доля в популяции была крайне незначительной. Кроме того, белок, хоть и в меньшем количестве высвобождался из клеток, не подвергнутых тепловому стрессу Таким образом, процесс высвобождения Hsp70 из клеток обусловлен более сложным механизмом, это не просто результат простого выплескивания содержимого внезапно погибшей клетки в окружающую среду. Не может ли этот процесс регулироваться сигнальными механизмами клетки?

Отвечая на этот вопрос нужно вспомнить о том, что сам Hsp70 может вмешиваться в различные сигнальные пути клетки, включая белки апоптотического каскада (Beere et al., 2000, Komarova et al., 2004), стресс-киназы (Mosser et al, 2000), транскрипционные факторы NF-кВ (Guzhova et al., 1997) Некоторые участники сигнальных цепей тоже могут оказывать влияние на поведение Hsp70, например, через стимуляцию протеинкиназы С, что приводит к усилению экспрессии шаперона (Khana et al.,1995).

В то же время многие из перечисленных выше сигнальных систем связаны с активностью фосфолипазы С (PLC). Одна из разновидностей этой фосфолипазы , PLC-/, активируется в клетках при взаимодействии с множеством экстраклеточных лигандов PLC активируется при олигомеризации рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). В клетках карциномы человека А-431, EGFR всегда активирован, соответственно, в активном состоянии находится и PLC. В этих клетках, как вообще в клетках эпителиального происхождения, Hsp70 также присутствует в высокой концентрации. Нам удалось показать, что подавление активности PLC в клетках А-431 с помощью специфического ингибитора U73122 приводит к резкому снижению уровня Hsp70, причем это снижение происходит в первые минуты после добавления ингибитора в клеточную среду. Низкое содержание белка наблюдалось в течение последующих 6 ч. Подобного эффекта не было при применении неактивного аналога U73122, U73343 (Evdonin et al., 2004).

Столь быстрое падение содержания белка не может быть объяснено транскрипционными событиями в клетке, поэтому мы предположили, что Hsp70 покидает клетки. Для проверки этого предположения мы использовали тот же метод, что и при доказательстве высвобождения Hsp70 клетками глиапьного происхождения, т.е. аффинную хроматографию среды, кондиционированной клетками, основанную на сродстве Hsp70 к АТФ. Кроме того, использовали тест иммунопреципитации Hsp70 из кондиционированной среды с моноклональными антителами 2Н9. Hsp70 был обнаружен в среде клеток после подавления в них активности PLC при обоих способах детекции. То, что инактивация одного из ключевых

участников передачи сигнала с рецептора эпидермального фактора роста, PLC, приводит к мгновенному высвобождению Hsp70 в окружающую среду, говорит в пользу того, что появление шаперона в биологических жидкостях -процесс не пассивный, он требует участия сигнальных цепей. Однако механизм высвобождения шаперона еще требует детального исследования. Как такая крупная молекула, имеющая молекулярную массу 70 кДа (а в нативных условиях Hsp70 обычно существует в виде димера или тримера), может проходить сквозь мембраны? Возможно, это также связано с шаперонными свойствами белка, или с тем, что он имеет сродство к гидрофобным молекулам. Липидная часть плазматических мембран представляет собой гидрофобное образование. Было показано, что Hsp70 может формировать в искусственных билипидных мембранах ион-проводящие поры (Adler et al., 1990; Arispe, DeMaio, 2000). Белок был обнаружен в составе так называемых липидных плотиков (lipid rafts), которые представляют собой платформы для доставки белков к клеточной мембране (Broquet et al., 2003).

Таким образом, Hsp70, который обнаруживается в биологических жидкостях, в частности в сыворотке крови, в том числе и у здоровых индивидуумов, по всей видимости, оказывается там не в результате разрушения клеток вследствие патологического процесса, а может высвобождаться в окружающую среду из нормальных, здоровых клеток.

3.2. Интернализация белка клетками разного тканевого происхождения.

Маловероятно, что появление шаперона Hsp70 в кровеносном русле, не повлияет на физиологию клеток или тканей, окружающих источник белка Для того, чтобы проверить гипотезу о том, что он может не только выходить, но и входить в живые клетки, мы выделили Hsp70 из красной мышцы быка, используя хроматографические процедуры. Полученный препарат, кроме Hsp70, содержал его конститутивно экспрессирующийся аналог, Hsc70. Соотношение Hsp70 Hsc70 составляло примерно 7'3. Чистота препарата, оцененная методом электрофореза, была выше 97%. Hsp70, а также бычий сывороточный альбумин и яичный альбумин, использовавшиеся в качестве контрольных белков, биотинилировали. Упомянутые препараты вносили в культуральную среду клеток так, чтобы конечная их концентрация составляла 20 мкг/мл. В этих экспериментах были использованы клетки лейкемии человека U-937 и нейробластом человека LA-N-5 и SK-N-SH.

Мы использовали три разных метода для оценки интернализации: иммуноферментный анализ, методы проточной цитометрии и

иммунофлуоресцентной микроскопии. Меченый препарат связывался с клетками U-937 в течение первых 40 мин инкубации, количество связавшегося белка достигало своего пика через 1 ч, в течение 6 ч находилось на том же уровне, а затем прогрессивно понижалось (Guzhova et al., 1998). Подобный профиль интернализации демонстрировали клетки нейробластомы SK-N-SH, что было показано с помощью метода проточной цитометрии, однако в этом случае количество включенного белка возрастает в течение 6 ч, т. е, несколько медленнее, чем в случае с U-937 (Novoselova et al., 2005). Еще более медленно этот процесс проходит в популяции клеток LA-N-5, в которых белок можно было детектировать по прошествии 18 ч с начала инкубации (Guzhova et al., 2001).

Разным был и характер интернализации. В случае клеток U-937 в первые минуты после введения меченого препарата в среду Hsp70 равномерно распределялся по клеточной поверхности. По прошествии 5-10 мин он собирался на отдельных участках плазматической мембраны, формируя "patch" -подобные структуры, через 30 мин большинство положительно окрашенных клеток демонстрировали наличие "cap" -подобных структур Спустя 3 ч клеточная поверхность полностью освобождалась от меченого белка, и он наблюдался в цитоплазме, причем распределен был равномерно.

Ничего подобного мы не наблюдали в опытах на клетках обеих линий нейробластом. В то время, когда в клетках можно было наблюдать меченый белок, он преимущественно был распределен в цитоплазме и, крайне редко, в ядре. Следует отметить, что ни у одного из контрольных белков транспортных свойств выявлено не было.

3.3. Защитные свойства экзогенного Hsp70

Поскольку данные, собранные в предыдущей главе, показывают, что Hsp70 может интернализироваться живыми клетками и формировать дополнительный, внутриклеточный пул белка, было естественным проверить, как этот белок влияет на жизнеспособность включивших его клеток. Для выяснения этого вопроса мы инкубировали клетки миелоидной лейкемии U-937 и нейробластомы LA-N-5 с препаратом Hsp70, после чего подвергали их действию различных стрессовых факторов. В качестве контрольного белка использовали бычий сывороточный альбумин (BSA), поскольку его молекулярная масса близка таковой у Hsp70, и он также отличается значительной белок-связывающей активностью. Цитотоксическими факторами в опытах с клетками U-937 были противоопухолевые препараты этопозид (ЕЮ) и адриамицин (ADR), фактор некроза опухоли TNF-cc и стауроспорин. Все эти агенты

индуцировали процесс апоптоза. Для изучения действия экзогенного Hsp70 на клетки LA-N-5 были использованы жесткая гипертермия, Н202 и универсальный индуктор апоптоза стауроспорин. Как видно на рис. 7, предварительная инкубация с Hsp70 (концентрация белка в эксперименте составляла 20-25 мкг/мл культуральной среды), значительно защищала и те, и другие клетки от всех типов цитотоксических воздействий. Такого эффекта не оказывала предварительная инкубация клеток с BSA

1Ш7!

* . Н8Р70

Contr TNF-a ЕГО ADR Stauro

* 80

LA-N-5

illlil

_;_t— - .+ • ♦ H6P70

Contr HS Н2Оз Stauro

Рис.7 Защитный эффект экзогенного Нбр70.

а- белок добавляли к клеткам и-937 в концентрации 25мкг/мл за 3 ч до индукции апоптоза цитотоксическими факторами, б- Клетки 1_А-Ы-5 инкубировали с белком (в той же концентрации) в течение 18 ч, после чего подвергали тепловому шоку (45°С, 20 мин) или добавляли НгОг-

3.4. Нвр70 и нейродегенеративные заболевания.

3.4.1. Формирование агрегатов мутантных белков в нервных клетках приводит к их гибели.

Универсальность действия препарата НврУО, показавшего защитный эффект во всех использованных нами моделях с применением разнообразных факторов, вызывающих апоптоз, побудила нас исследовать его поведение в моделях реальных болезней человека. Особый интерес представляли заболевания, в которых нарушения в работе шаперонного аппарата клетки могут иметь принципиальное значение. К таким заболеваниям относятся протеотоксические патологии, в которых патогеном являются неправильно свернутые полипептиды

Одна из типичных мутаций, приводящая к формированию нерастворимых белковых агрегатов, ответственных за гибель клеток нейронального происхождения - элонгация триплета САС в гене, кодирующем хантингтин (> 36 триплетов), что приводит к появлению ро!уС5

домена патологической длины в Ы-концевой части белка. Клеточная модель подобных заболеваний может быть получена, если трансфецировать клетки нейробластомы плазмидой, содержащей большое количество повторов САС. В наших экспериментах мы использовали подобную плазмиду, содержащую 103 повтора САС, <2103, и контрольную к ней плазмиду, содержащую 25 повторов, 025; в обеих конструкциях последовательность вАС-повторов были связаны с геном зеленого флуоресцирующего белка (СРР), чтобы за процессом образования нерастворимых агрегатов можно было следить с помощью флуоресцентного микроскопа.

Белок, кодируемый короткой плазмидой, 025-Е0РР, был распределен в цитоплазме клеток ЗК-Ы-БН диффузно, и не влиял на жизнеспособность экспрессирующих его клеток. Если клетки были трансфецированы плазмидой ОЮЗ-ЕвРР, то через 48 ч можно было наблюдать образование ярких зеленых пятен, указывающих на формирование нерастворимых белковых агрегатов. Появление этих агрегатов приводило к изменениям в ядрах, характерным для процесса апоптоза, и через 72 ч после трансфекции более 70% клеток, в которых экспрессировапся мутантный белок, погибали по механизму апоптоза.

3.4.2. Н$р70, проникая в нервные клетки, подавляет процесс образования агрегатов и отменяет апоптоз.

Очевидно, что процесс образования нерастворимых белковых агрегатов связан с нарушениями в работе шаперонного и протеолитического аппаратов клетки. Почему шаперонная машина неудовлетворительно работает в нервных клетках? На этот вопрос есть несколько ответов. Во-первых, многие нервные клетки в терминальной стадии дифференцировки утрачивают способность к экспрессии Нэр70, в том числе и в ответ на стресс. Более того, клетки нейробластомы, дифференцированные в нейрональном направлении, утрачивают способность к базальной экспрессии Нзр70, а также не экспрессируют его в ответ на стресс (1Э\л/уег а1., 1996) В-третьих, с возрастом работа шаперонного аппарата ухудшается Хотя его базальный уровень Нвр70 в клетках остается на довольно высоком уровне, способность к его экспрессии в ответ на стресс значительно ослабевает (во«, Свегте1у, 2002).

Протективный эффект Нэр70 был показан в экспериментах с большим количеством цитотоксических факторов, включая и такие, как формирование полиглутаминовых трактов (Ас1ас111 е1 а1., 2003). Эти данные заставили многих исследователей искать пути повышения уровня экспрессии Нзр70 в больных клетках. Действительно, одновременная трансфекция клеток полиглутаминовыми последовательностями большой

длины и шаперонами Hsp70, Hdj1,2 вместе или отдельно приводила к понижению образования нерастворимых белковых агрегатов и соответственно, спасала клетки от апоптоза (Sakahira et al., 2002; Zhou et a!., 2001; Wyttenbach et al., 2002). Hsp70 был найден в составе агресом, и его комплекс с нерастворимыми белками был динамичным (Kim et al., 2002)

Из анализа литературных данных становится понятным, что повышение уровня шаперона в клетках должно стать основной целью терапии протеотоксических заболеваний. Однако трансфекция нейронов определенными генами в клинической практике представляется сомнительной; более вероятной видится доставка Hsp70 в больную клетку. Как было показано в предыдущей главе, белок способен входить в клетки, в том числе и в клетки нейробластомы SK-N-SH.

В наших опытах мы вносили очищенный препарат Hsp70 в разной концентрации в клетки SK-N-SH одновременно с трансфекцией их конструкциями, несущими 1 экзон хантингтина Q25 и Q103. Подсчет апоптозных ядер показал, что количество погибающих клеток значительно понижается, и защитный эффект Hsp70 является дозо-зависимым . Важно, чтобы шаперон находился в клетках до того, как агресомы начнут формироваться; если вносить его позднее, то его защитный эффект заметно ослабевает. Чем позже после трансфекции вносили белок, тем слабее был его эффект. Применение контрольного белка, сывороточного альбумина, не оказывало влияния на количество погибших клеток При введении в культуру клеток Hsp70 также снижалась активность эффекторных каспаз.

Чтобы проверить способность экзогенного Hsp70 связываться с полиглутаминовыми включениями, мы анализировали клетки с помощью конфокальной микроскопии. Биотинилированный Hsp70 детектировали с помощью стрептавидина, меченого TRITC В клетках, в которых не наблюдалось агрегатов, он был расположен равномерно в цитоплазме, в то время как в клетках с агресомами он был колокализован с последними. В клетках, трансфецированных короткой последовательностью Q25, колокализации Hsp70 с EGFP не наблюдалось.

Мы заметили, что в культурах клеток, трансфецированных длинной последовательностью (Q103), в среду которым был добавлен препарат Hsp70, количество агресом было меньшим, а клеток с диффузно распределенным EGFP - больше. Подсчет показал, что добавление Hsp70 на 25% понижало образование агресом. Это наблюдение было подтверждено биохимическими методами, и в качестве наиболее эффективного был выбран Filter Trap Assay. Экстракты клеток, трансфецированных Q103, после инкубации с Hsp70 или без нее, наносили

на ацетатную нитроцеллюлозную мембрану, используя аппарат для дот-блоттинга, присоединенный к вакуумному насосу. Растворимые клеточные белки проходили через поры мембраны, а нерастворимые в БОБ белковые агрегаты на ней задерживались Чтобы их выявить, мембрану инкубировали с антителами против ЕвРР Экстракты трансфецированных клеток дали положительный результат, в то время как белки экстрактов клеток, инкубированных с Н$р70, в основном проходили через мембранные поры (рис 8а).

Мы также измерили размеры агресом в клетках, трансфецированных плазмидой (2103. Если трансфецированные клетки были инкубированы с препаратом Нзр70 в течение 48 ч, средний диаметр агресом был меньше в два раза Более того, при инкубации с Нэр70 примерно 60% клеток имели включения размером от 2,5 до 4 мкм, а крупных включений с диаметром более 7мкм не встречалось вообще. В тех клетках, которые с белком не

10 25 50 МКЛ ♦ ft +

* # Ф -

Э»5 87±0 94 гиЮЮ

Л I I I I ■

60 40 20, 0.

3=5 97*1 21 г>=1012

40 BSA

20 ■ О I I I 1 I I

60 â=3 02±0 66 п*1022 40 I Hsp70/Hsc70

20 О

■ Hsp7

III-

<25 гг а

■?s s

Рис 8 Экзогенный Hsp70, входя в клетки SK-N-SH, предотвращает формирование крупных агрегатов нерастворимых белков

а - Filter TRAP assay Немедленно после трансфекции плазмидой Q103-EGFP клетки SK-N-SH инкубировали с препаратом Hsp70 Через 48 ч клетки лизировали в буфере с высоким содержанием SDS Полученные лизаты наносили на нитроцеллюлозный ацетатный фильтр с помощью прибора для точечного блоттинга с нагрузкой на фильтр в серии разведений (1 10-1.1) После промывки нитроцеллюлозный фильтр инкубировали с антителами против GFP б - распределение по размеру агресом в клетках SK-N-SH, трансфецированных Q103, в присутствии или в отсутствие Hsp70 или инкубированных с BSA

Диаметр включений (мкм)

инкубировались, более 30% имели агресомы диаметром 4,5-5 мкм, 28% -5,5-7 мкм и 13% включений были крупнее, чем 7 мкм (рис. 86). Препарат контрольного белка, сывороточного альбумина, на размеры агрегатов влияния не оказывал Эти данные говорят в пользу того, что, хотя Hsp70 формирует динамические комплексы с нерастворимыми белковыми включениями (Kim et al ,2002), он скорее предотвращает их формирование,

нежели разбирает уже готовые. Нельзя исключить и возможности, что экзогенный Нзр70, проникая в больные клетки, вмешивается также и в сигнальные пути апоптоза, как было показано на примере клеток 11-937.

В любом случае, два свойства Нэр70 - способность проникать внутрь клеток и шаперонная активность - делают его потенциально мощным терапевтическим препаратом для терапии нейродегенеративных заболеваний, имеющих протеотоксическую природу.

3.4.3. Нэр70, введенный животным, корректирует поведение бульб-эктомированных животных (модель болезни Альцгеймера) и животных в моделях психо-физического стресса.

Возможность использования Нзр70 в качестве терапевтического препарата была исследована на модели болезни Альцгеймера у бульб-эктомированных мышей совместно с лабораторией Н. В. Бобковой из Института биофизики РАН (Пущино) и на модели неизбегаемого стресса (пост-травматический синдром) совместно с МАФлеровым и Н.Э.Ордян из Института физиологии РАН.

Удаление обонятельных луковиц у мышей приводит к необратимым изменениям в мозгу у животных. Развивается специфический нейродегенеративный процесс, сопровождающийся массовой гибелью нейронов в височной коре и гиппокампе. В течение одного месяца происходит дистрофия пирамидальных клеток вплоть до их полного исчезновения, что ведет к нарушению цитоархитектоники темпоральной коры (Бобкова и др., 2003). В коре выявляются бляшкоподобные образования, содержащие (5-амилоид (Александрова и др., 2004). Хотя в ряде случаев на месте удаленных бульбусов у оперированных животных вырастали новые, у экспериментальных животных происходило резкое ухудшение пространственной памяти. Все перечисленные особенности являются характерными диагностическими признаками болезни Альцгеймера у человека.

В опытах по изучению препарата Нвр70 в качестве терапевтического средства для лечения болезни Альцгеймера использовались бульб-эктомированные мыши через 2 мес после операции и ложнооперированные животные с тем же сроком после хирургического вмешательства Препарат мыши получали интраназально, в количестве 2 мкг на мышь. Препарат вводился каждый день в течение двух недель, и, начиная со второй недели, шло обучение, после чего начинали тестирование памяти. Регулярное введение препарата Нэр70 достоверно улучшало память бульб-эктомированных мышей. Число заходов в правильный отсек лабиринта Морисона и время пребывания в нем

достоверно возрастали В опытах использовались и самцы, и самки, и разницы в реакции на введение препарата между ними не наблюдалось.

Препарат Нэр70 также может быть эффективным средством для повышения адаптивных возможностей организма. В настоящее время потребность в препаратах подобного действия становится все более насущной. Социальные факторы, необъявленная война, террористические акты и просто их угроза негативно сказываются на системе поддержания гомеостаза. Одно из серьезных последствий тяжелых стрессов - так называемый пост-травматический синдром, отложенное действие стресса Известно, что люди, пережившие трагедии, выходящие за пределы обычного человеческого опыта, через отдаленное время приобретают серьезные проблемы, не только психологического, но и соматического характера В нашей совместной работе с Институтом физиологии РАН было исследовано протективное действие Нэр70 у крыс, подвергнутых неизбегаемому стрессу, который создает у них состояние "выученной беспомощности" и является моделью депрессивного синдрома человека.

Неизбегаемый стресс у животных достигался следующим образом. Подопытные животные (крысы линии Вистар), помещенные в клетку с токопроводящим полом, в течение часа получали разряды тока по схеме 15 с - ток, 45 с - пауза. Контрольные животные помещались в ту же клетку на 1 ч, но разрядов тока они не получали. Состояние выученной беспомощности после неизбегаемого стресса сохраняется, по крайней мере, 6 сут.

Половине крыс после стрессовой обработки интраназально вводили препарат Нэр70 в дозе 3,25 мкг на животное один раз в сутки, а другой половине - то же количество сывороточного альбумина. Такой же процедуре подвергались крысы, не испытавшие действия стресса Через 5 мин после последнего интраназального введения белка поведение крыс подопытной и контрольной групп изучали в тесте "открытое поле".

Депрессивный синдром включает серьезные расстройства различных форм поведения, в том числе локомоторной и ориентировочно-исследовательской активности, поэтому оценка влияния препарата Нэр70 на поведение крыс оценивалась в тесте "открытое поле". Открытое поле представляет собой открытую четырехугольную камеру размером 100X100X45 см, расчерченную на квадраты 20X20 см. В центре поля на высоте 60 см находился источник света. Крысу помещали в центр поля и в течение 5 мин регистрировали число пересеченных квадратов (горизонтальная двигательная активность), число вертикальных стоек (исследовательская активность) и продолжительность реакции замирания.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С. Петербург I

По числу дефекаций судили об эмоциональности, а по времени пребывания в четырех центральных квадратах - об уровне тревожности.

Введение Hsp70 не оказало существенного влияния на горизонтальную и вертикальную исследовательскую активность, о чем свидетельствует отсутствие достоверных различий с животными, которым вводили BSA. Введение препарата резко снизило время замираний и увеличило время пребывания животного в центре камеры, что свидетельствует о снижении уровня тревожности. Кроме того крысы, получившие Hsp70, становились менее эмоциональными. Можно сказать, что под влиянием Hsp70, животное переходит на другой, более активный уровень организации адаптивного поведения.

Через 2 сут после неизбегаемого стресса у животных, которые получали контрольный раствор, все изучаемые компоненты поведения резко изменились (по сравнению с контрольными животными, которые стрессу не подвергались) У них наблюдалось достоверное снижение горизонтальной и вертикальной исследовательской активности, а также увеличивалось время замираний. Поведение крыс, которые сразу после стрессовой обработки получили препарат Hsp70 от поведения контрольных, нестрессированных животных не отличалось. Суммируя эти данные, можно сделать вывод о том, что препарат Hsp70 обладает широким спектром действия и нормализует работу сразу нескольких типов нейронов. Поскольку значительное количество патологий определяется повышением концентрации свободных радикалов и иных протео- и цитотоксических факторов, мы предполагаем, что основой нормализации функции больших клеточных популяций, в том числе нейронов, является защитная активность Hsp70, благодаря которой определенная часть клеток выживает даже при действии мощных токсинов. Поэтому нам представляется, что у препаратов, основанных на молекуле шаперона Hsp70, есть перспективные области применения в неврологии.

Шаперонные свойства Hsp70 определяют его защитную функцию, и проявляться они могут по-разному. Сродство Hsp70 к гидрофобным сайтам определяет его связывание со вновь синтезированными пептидами и поврежденными белками, что отражает классическое определение шаперона. Именно неправильные, мутантные белки в модели протеотоксических заболеваний становились мишенью для Hsp70. Если его количество в клетке в момент формирования нерастворимых агрегатов было достаточным, то, связываясь с этим мутантным полипептидом, белок препятствовал образованию агресом. Т.е. g этом случае он демонстрировал работу классического шаперонного механизма.

Однако гидрофобные сайты могут открываться и на нормальных, зрелых и неповрежденных белковых молекулах, в тот момент, когда они изменяют свою конформацию. Изменение конформации может происходить у многих клеточных белков, участвующих в передаче сигнала, в том числе и аполтозного. Связывание Нзр70 с такими молекулами приводит к тому, что шаперон, образуя с ними комплекс, существующий довольно продолжительное время, выключает эти молекулы из сигнальной цепи, а следовательно, прерывает и всю цепь. Это было продемонстрировано в модели защиты клеток миелоидной лейкемии от действия противоопухолевых препаратов.

ВЫВОДЫ

1 В процессе реакции клетки на тепловой стресс белки-кошапероны, НсЦ1 и Вад-1, взаимодействуют с основным шапероном Нзр70 попеременно Нф многократно усиливает субстрат-связывающую активность Нэр70 и необходим клетке в начальные периоды ее реакции на стресс, а Вад-1 - на последних этапах этого процесса.

2. Шаперонные свойства Нзр70, а именно его способность связываться с гидрофобными сайтами денатурированных или мутантных белков, обуславливают его защитную функцию Устойчивость клеток к многочисленным цитотоксическим факторам, действие которых изменяет конформацию клеточных белков, непосредственно связана с количеством шаперона в клетке в момент воздействия. В опухолевых клетках высокий уровень экспрессии Нэр70 коррелирует с их устойчивостью к действию противоопухолевых препаратов.

3. Защитное действие Нвр70 в процессе апоптоза состоит в подавлении процесса передачи апоптозного сигнала. В этом случае проявляется еще одна сторона работы шаперонного механизма - способность к связыванию гидрофобных сайтов нормальных клеточных белков в тот момент, когда они изменяют свою конформацию при межмолекулярных взаимодействиях. Впервые установлено, что шаперон связывается с участниками апоптотического каскада, эффекторными каспазами, инактивирует их и, таким образом, задерживает или полностью отменяет процесс апоптоза.

4. Нэр70 может высвобождаться из живых клеток организма, причем впервые было показано, что в механизм экспорта белка вовлечены сигнальные системы клетки, в частности те, которые связаны с плазматической мембраной.

5 В серии оригинальных экспериментов показано, что Нзр70 является одним из основных партнеров для полипептида р58, представленного на поверхности опухолевых клеток рабдомиосаркомы РА-2 и необходимого клеткам для успешного завершения процесса метастазирования. Эта связь, по-видимому, имеет существенное значение для формирования противоопухолевого ответа иммунной системы животного-хозяина

6 Как установлено в опытах с применением препарата очищенного Нзр70, добавленного в культуру клеток, шаперон захватывается клетками разного гистогенеза с использованием различных механизмов интернализации. Становясь эндогенным, Нэр70, сохраняет свою протективную активность по отношению к значительному числу цитотоксических факторов

7 В экспериментах с применением модели протеотоксических заболеваний (болезнь Хантингтона) установлено, что препарат очищенного Нзр70 спасает клетки нейронального происхождения от апоптоза, вызванного токсическим действием агрегатов мутантных белков Впервые выявлен механизм защитного действия шаперона, который заключается в том, что молекулы белка проникают в клетки и, благодаря своей шаперонной активности, снижают агрегационную способность цепей полиглутамина.

8 Применение шаперона в животных моделях приводило к значительному улучшению памяти у бульб-эктомированных животных (модель болезни Альцгеймера), что установлено в опытах по анализу поведенческих реакций. Впервые продемонстрировано, что интра-назальное введение препарата Нэр70 снижает губительные последствия пост-травматического синдрома в модели неизбегаемого стресса.

Список цитированной литературы:

1 Александрова И Ю, Кувичкин В В, Кашпаров И А Медвинская Н И, Нестерова И В, Лунин С М, Самохин А Н, бобкова Н В 2004 Биохимия (Моек) 69(2) 176-180

2 Бобкова Н в, Нестерова И В, Дана Р, Дана Е, Нестеров В И, Александрова И Ю, Медвинская Н И, Самохин А.Н 2003 Морфология 123(3) 27-31

Гужова И В, Ласунская Е Б, Дариееа 3 А , Нильссон К, Маргулис Б А 2000 Цитология 42' 653658

3 Каминская Е В, Вахтин Ю Б 1989 Бюлл Экспер Биол и Мед 108 613-616

Каминская Е В., Гужова И В, Федорова Е В, Вахтин Ю Б. Патент N 2026344 Зарегистрирован '05 01 1995, Россия

4 Комарова Е Ю, Маргулис Б А, Гужова И В 2004 Цитология 46 550-556

Новоселов С С, Новоселова Т В, Москалева О С Маргулис Б А Гужова И В 2004а Цитология 46 620-627

5 Новоселов С С Суржиков С, Воронин АП, Гужова И В, Маргулис Б А 20046 Заявка в Федеральный институт промышленной собственности N 2003124736/15(026274) от 07 08 2003, получено разрешение о выдаче патента 02 07 2004

6 Новоселов С С, Вербова М В Васильева Е В , Воробьева Н К, Маргулис Б А, Гужова И В 2004в Вопросы онкологии 50 174-178

7. Новоселов С С, Новоселова Т В, Вврбова М В, Маргулис Б А, Гужова И В 2005 Цитология 47 205-209

8 Степаньян Л И., Вахтин Ю.Б 1980 Цитология 22'198-204

9. Флеров МА, Ордян Н Э., Маргулис Б. А, Гужова И В, Вьюшин А В, Пивина СГ, Герасимова И.А 2003. Бюлл экпер. биол и мед 388' 41-44

WAdachi Н, Katsuno М, Minamiyama М, Sang С, Pagoulatos G, Angelidis С, Kusakabe М, Yoshiki А, Kobayashi У, Doyu М, Sobue G 2003 J Neurosc I, 23 2203-2211

11 Alder GM., Austen В M, Bashford С L.Mehlert A, Pasternak С. A 1990 Biosci Rep 10 509-518

12 Basu S, Binder R.J, Suto R, Anderson К M, SrlvastavaPK 2000 Int Immunol 12 1539-1546

13 Beare H M Wolf В. В, MosserDD. Mahboubi A, Kuwana T, Tailor, P Monmoto RI, Cohen G M, Green DR 2000 Nat.Cell. Biol. 2 469-47

14 Broquet AH, Thomas G, Mashah J, Trugnan G, Bachelet M. 2003 J Biol Chem 278 2160121606.

15 Evdonm A L, Guzhova I. V, Margulls В A, Medvedeva N D 2004 Cancer Cell International 4 2

16 FSbiin TK, G6spar J, Fej6rdy L, KaSn В, Bilmt M, Csermely P, Fej6rdy P 2003 Med Sci Monit

9 BR62-5

17 Febraio MA, Ott P, Nielsen H В, Steensberg A, Keller С, Krustrup P, Secher N H, Pedersen В К 2002 J Physiol 544(Pt 3) 957-962

Guzhova I V, Margulis B.A, Kammskaya E V 1992 Int J Cancer 52 892-895

18 Guzhova I V, Daneva Z.A., Roch Melo A, Margulis В A 1997 Cell Stress & Chap 2 132-139

19 Guzhova I, Kislyakova К, Moskaliova О, Fndlanskaya I., Tytell M, Cheetham M, Margulis В 2001 Brain Res 914 66-73.

20 Guzhova I V, Amhold ACV., Daneva Z.A, Kinev A V, Lasunskala E В, Nilsson К, Bozhkov V M, Voronm A P, Margulis В A 1998 Cell Stress & Chap , 3' 67-77.

21 Kohn G, Wong H R, Bshesh К, Zhao В, Vasi N., Denenberg A, Morns C., Stark J, Shanley T P 2002 Shock 17- 91-97

22 Komarova E Y, Afanasyeva E. A, Bulatova M M, Cheetham M E , Margulis В A., Guzhova I V 2004 Cell Stress &Chap. 9 265-275.

23 Lasunkata E.B., Fndhanskaya 11, Guzhova I V., Bozhkov V M, Margulis В A. 1997 Apoptosis 2 156-163

24 Uu Q -L, Kishi H, Ohtsuka K, Muraguchi A 2003 Blood 102 1788-1796

25 Luders J., Demand J., HohfeldJ 2000 J Biol Chem 275' 4613-4617

26 Novoselova TV., Novoselov, S. S, Margulis В A, SapozhnikovA M„ Cheetham M E, I

V Guzhova 2005 J Neurochem In Press

27 OkaM, Sato S, SodaH, Fukuda M„ Kawabata S, NakatomiK, Shiozawa К ,Nakamura Y, Ohtsuka К, Kohno S 2001 Jpn J. Cancer Res 92 316-320

28 Safeft A, Srintvasula S M, Balkir L, Robbins P D, Alnemn E S 2000 Nat Cell Biol 2 476 -483

29 Soti С, Csermely P 2002 Cell Stress & Chap 7 186-190 30TytellM Greenberg S С, Lasek R J 1986 Brain Res 363 161-164

31 Wyttenbach A, Sauvageot 0, Carmichael J, Diaz-Latoud C, Arrigo AP, Rubinsztein DC 2002 Hum Mol Genet 11:1137-1151

32 Zhou H„ Li S.H., LiXJ 2001 JBiolChem 276(51)48417-48424

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Guihova I V, MargulisBA , Kaminskaya Е V 1992 Antibody against p58 surface antigen of RA-2 rat rhabdomyosarcoma cells inhibits their metastatic activity. Int J Cancer 62. 892-895.

2 Каминская E В, Гужова И В, Федорова Е В, Вахтин Ю.Б Штамм клеток рабдомиосаркомы крыс РА-23, используемый в качестве модели для изучения процессов органотропного метастазирования и скрининга противоопухолевых препаратов Патент N 2026344 Зарегистрирован 09 01 1995, Россия

3 Guzhova I V, Darleva Z.A., Fridlankaya /., Roch MeloA., Margulis B.A. 1996. Hsp70 is functionally and physically associated with active NF-xB complex in human T-leukemia cells Biochem Soc Trans 24' 597S

4 Guzhova I V, Darieva 1A, Rocha Melo A., Margulis В A 1997 Major stress protein Hsp7Q interacts with NF-kB regulatory complex in human T-lymphoma cells. Cell Stress & Chap. 2. 132-139

5 Lasunkaia E В, Fridlianskaya 1.1., Guzhova I V, Bozhkov V.M., Margulis B.A. 1997. Acumulation of major stress protein 70 kDa protects myeloid and lymphoid cells from death by apoptosis Apoptosis2:156-163

6 Guzhova I V, Arnhold A.C V, Darieva Z A., Kinev A V., Lasunskaia E.B., NilssonK, Bozhkov V M, Voronin A P., Margulis B.A 1998. Effect of exogenous stress protein 70 on functional properties of human promonocytes throu gh binding to eel surface and internalization. Cell Stress & Chap 3 67-77

7 Маргупис Б А., Гужова И В 2000 Белки стресса в эукариотической клетке Цитология 42' 323-342

8 Гужова И В , Маргулис Б А 2000 Индукция и накопление БТШ70 приводит к формированию его комплексов с другими клеточными белками Цитология 42' 647-652

9 Гужова И В , Ласунская Е Б, Дариева 3 А , Нильссон К., Маргулис Б А 2000 Влияние теплового шока на процессы дифференцировки и апоптоза в клетках U-937 Цитология 42: 653-658.

10. Фридлянская И.И, Демидов О Н, Булатова М М, Игнатьева Е В., Семкина А Н., Гужова И В, Маргулис Б А 2000 Индукция апоптоза в клетках мышиной миеломы NS0/1, трансфицированной геном основного белка теплового шока БТШ70и Цитология 42 1053-1059.

11 Guzhova I.V, HulquistA , Cetinkaya С., Nilsson К, Pahlman S, Larsson L G 2001. Interferon у cooperates with retlnoic acid and phorbol ester to induce differentiation and growth inhibition of human neuroblastoma cells. Int. J.Cancer 94: 97-108.

12 Guzhova I, Kislyakova К, Moskaliova О, Fndlanskaya I, Tytell M, Cheatham M, Margulis В 2001 In vitro studies show that Hsp70 can be released by glia and that exogenous Hsp70 can enhance neuronal stress tolerance Brain Res 914- 66-73

13 Efremova SM„ Margulis BA, Guzhova IV, Itskovich VS., Lauenroth S., Mutter WEG., Schroder HC. 2002 Heat shock protein Hsp70 expression and DNA damage in Baikalian sponges exposed to model pollutants and wastewater from Baikalsk Pulp and Paper and Paper Plant. Aquatic Tox 57: 267-280.

14. Пастухов Ю Ф., Екимова И.В , Ченцов И.Г , Гужова И.В. 2003 Основной белок стресса обладает пирогенным действием. ДАН 388: 837-841.

15. Флеров М.А, Ордян Н.Э., Маргулис Б.А., Гужова И.В., Вьюшин А.В, Пивина С Г, Герасимова И.А. 2003. Использование БТШ70 для нормализации последствий неизбегаемого стресса у крыс Бюлл. экпер биол и мед. 388:41-44

16. EvdonmA.L, Guzhova I.V., Margulis В.А., Medvedeva N.D. 2004. Phospholipase с inhibititor U73122, stimulates release of hsp70 stress protein from A431 human carcinoma cells Cancer Cell International 4: 2

17. Мокрушин A.A., Павлинова Л.И., Гужова И.В., Маргулис Б.А. 2004. Белок теплового шока (Hsp70) протестирует активность глутуматергической синаптической передачи в обонятельной коре мозга крыс in vitro от тяжелой аноксии. ДАН 394:12-15.

18. Мокрушин А. А , Павлинова Л И., Гужова И. В., МаргулисБ.А 2004 Белок теплового шока (Hsp70) модифицирует активность клеток обонятельной коры мозга крыс in vitro ДАН 395-118-120

19. Комарова Е.Ю., Маргулис БА,Гужова И В 2004. Роль шаперона Hsp70 в реакции клеток лейкемии человека на противоопухолевые препараты. Цитология 46. 550-556

20. Новоселов С.С, Вербова М В., Васильева Е.В., Воробьева Н К, Маргулис Б А., Гужова И В 2004 Анализ экспрессии белков-шаперонов, Hsp70 и Hdj1 в опухолевых клетках человека. Вопросы онкологии 50-174-178.

21. Komarova Е У, Afanasyeva Е. А, Bulatova М.М, Cheetham М.Е, Margulis В.А., Guzhova / V 2004 Downstream caspases are novel targets for the anti-apoptotic activity of the molecular chaperone Hsp70 Cell Stress & Chap - 9: 265-275

22. Новоселов С С, Новоселова Т В, Москалева О С, Маргулис Б А, Гужова И В 2004. Взаимодействие белков Hdj1 и 8ад-1 с Hsp70 в процессе реакции клеток эритролейкемии человека К562 на тепловой стресс Цитология 46 620-627

23 Новоселов С С, Новоселова Т В, Вербова М В, Маргулис Б А., Гужова И В. 2005

Модуляция субстрат-связывающей активности Hsp70 кошаперонами

Hdj1 и Вад-1 в реакции клеток К562 на тепловой стресс. Цитология 47 205-209

24. И.В Гужова, С С Новоселов, Б А Маргулис. 2005 Шаперон Hsp70 и перспективы его использования противоопухолевой терапии Цитология 47 210-227

25. Zhanaeva S.Ya. Korolenko ТА, Shilov A G., Halikova ТА, Guzhova I V, Margulis В A, Yarygina E S 2004. Effect of Ucrain on human lymphoma cells growth with different expression of heat shock protein 70 (Hsp70). Int J. Immunother XIX- 70-74.

26. Маргулис Б. А., Гужова И В. 2004 Белки теплового шока - маркеры и защитники от стресса В книге "Морская флора и фауна северных широт: механизмы адаптации и регуляции роста морских организмов" Материалы 2 международной школы по морской биологии. Изд-во КНЦ РАН, Апатиты. 2004.

27. Новоселов С С. Суржиков С., Воронин А.П., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Способ определения концентрации основного белка теплового шока 70 кДа Заявка в Федеральный институт промышленной собственности N 2003124736/15(026274) от 07.08.2003, получено разрешение о выдаче патента 02.07.2004.

Подписано в печать 21.12.2004. Формат 60x84/16. Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ № 2/2112. П. л. 2.5. Уч.-изд. 2.5. Т^раж 120 экз.

ЗАО «КопиСервис», 194017, Санкт-Петербург, Скобелевскийпр., д. 16

тел.: (812) 234 4333

РНБ Русский фонд

Р — 3 8 7 2006-4

2359

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гужова, Ирина Владимировна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Белки теплового шока, их индукторы и классификация.

2.2. Структура и свойства Hsp

2.3. Молекулярные механизмы апоптоза и протективная функция Hsp

2.4. Экспрессия белков теплового шока в опухолевых клетках

2.5. Hsp70 и иммуногенность опухолей

2.6. Роль шаперонов в нейропатологиях

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Клеточные линии и их культивирование

3.2. Животные

3.3. Белки

3.4. Антитела.

3.5. Электрофоретические методы.

3.6. Очистка Hsp70 для иммунизации и использования в опытах 47 по введению в клетки и/или в культуральную среду.

3.7. Иммунохимические методы

3.8. Конфокальная микроскопия

3.9. Filter Trap Assay

3.10. Protein Interaction Assay (PIA)

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Работа шаперонного аппарата клетки в процессе реакции 52 на тепловой стресс

4.2. Защитная роль Hsp70 в опухолевых клетках.

4.2.1. Диагностикум для определения концентрации Hsp70 в 64 биологических жидкостях.

4.2.2. Анализ экспрессии белков-шаперонов, Hsp70 и Hdj1, в 66 опухолевых клетках человека.

4.2.3. Зависимость устойчивости опухолевых клеток к индукторам апоптоза от уровня экспрессии Hsp70.

4.2.4. Вмешательство Hsp70 в сигнальные пути апоптоза, g^ подавление действия эффекторных каспаз.

4.2.5. Комплексы шаперона Hsp70 с членами семейства NF-kB.

4.2.6. Поверхностный белок клеток рабдомиосаркомы крыс, р58, ответственный за метастазирование в легкие, ассоциирован с юо Hsp70.

4.3.7. Введение животным препарата очищенного Hsp приводит к предотвращению формирования опухолевых узлов в Ю4 легких при введении опухолевых клеток.

4.3. Hsp70 во внеклеточном пространстве.

4.3.1. В экспорт Hsp70 вовлечены сигнальные механизмы клетки.

4.3.2. Примеры интернализации белка клетками разного тканевого происхождения.

4.3.3. Защитные свойства экзогенного Hsp70.

4.4. Hsp70 и нейродегенеративные заболевания.

4.4.1. Формирование агрегатов мутантных белков в нервных клетках приводит к их гибели

4.4.2. Hsp70, проникая в нервные клетки, подавляет процесс образования агрегатов и отменяет апоптоз

4.4.3. Hsp70, введенный животным, корректирует поведение бульб- эктомированных животных (модель болезни Альцгеймера).

4.5. Защитное действие Hsp70 в моделях психо-физического стресса

5. ОБСУЖДЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы работы шаперона Hsp70 в нормальных клетках и при клеточной патологии"

Белок Hsp70 является индуцибельным представителем семейства белков теплового шока БТШ70 или Hsp70. HSP необходимы клетке во всех процессах ее жизнедеятельности, включая адаптацию к огромному числу цитотоксических факторов, как ксенобиотических, так и естественного происхождения. Структура Hsp70, как и других HSP, очень консервативна; достаточно отметить, что бактериальный аналог Hsp70, DnaK, по своим свойствам очень напоминает соответствующий белок млекопитающих, а их гены содержат более 50% гомологичных последовательностей.

Hsp70 - первый белок, названный шапероном. Функция шаперонов в клетке заключается в том, что они связываются с поврежденными или вновь синтезированными полипептидами и помогают им принять нативную конформацию; шапероны также участвуют в доставке белков в определенные органеллы. Шапероны способны находить в полипептидах-мишенях гидрофобные участки, которые открыты у поврежденных белков или могут открываться у нормальных, зрелых клеточных белков в момент изменения их конформации. Подобные конформационные изменения происходят, например, вследствие каскадных модификаций белков в процессе передачи клеточного сигнала. Белки семейства Hsp70 являются одними из основных элементов систем контроля за качеством белков, и участвуют в работе всех систем жизнеобеспечения клетки.

Несмотря на огромное число исследований, посвященных различным аспектам функционирования Hsp70, нерешенным остается множество вопросов, имеющих принципиальное значение. Хотя Hsp70 и считается индуцибельным, что означает, что его экспрессия резко возрастает в ответ на стресс, в клетках человека его синтез, хотя и на невысоком уровне, происходит и в нормальных условиях. Надо отметить, что в разных тканях и клетках организма степень экспрессии Hsp70 различается. Например, она очень высока в тканях сердца, и крайне низка (и не запускается в ответ на стресс) в некоторых типах нейронов головного мозга. Уровень экспрессии Hsp70 высок в опухолях, особенно злокачественных. В связи с этим возникает ряд вопросов. Каковы последствия высокого уровня экспрессии Hsp70 в опухолевых клетках? Не ясно, каким образом нервные клетки защищаются от неблагоприятных факторов, к примеру, от формирования нерастворимых белковых агрегатов в нервных клетках головного мозга при некоторых наследственных нейродегенеративных заболеваниях, а также в клетках мозга пожилых людей.

Несколько лет тому назад появились данные о том, что Hsp70, ранее считавшийся исключительно цитоплазматическим белком, может находиться во внеклеточном пространстве, в биологических жидкостях человека. В этой связи имеет существенное значение ответ на следующие вопросы: каким образом белок может покидать клетку, какое действие он может оказать на другие клетки, находящиеся вблизи или в отдалении от клетки-донора, может ли он интернализоваться клетками-акцепторами? Цель настоящей работы была ответить на эти вопросы.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Гужова, Ирина Владимировна

6. ВЫВОДЫ

1. В процессе реакции клетки на тепловой стресс белки-кошапероны, Hdj1 и Вад-1, взаимодействуют с основным шапероном Hsp70 попеременно. Hdj1 многократно усиливает субстрат-связывающую активность Hsp70 и необходим клетке в начальные периоды ее реакции на стресс, а Вад-1 -на последних этапах этого процесса.

2. Шаперонные свойства Hsp70, а именно его способность связываться с гидрофобными сайтами денатурированных или мутантных белков, обуславливают его защитную функцию. Устойчивость клеток к многочисленным цитотоксическим факторам, действие которых изменяет конформацию клеточных белков, непосредственно связана с количеством шаперона в клетке в момент воздействия. В опухолевых клетках высокий уровень экспрессии Hsp70 коррелирует с их устойчивостью к действию противоопухолевых препаратов.

3. Защитное действие Hsp70 в процессе апоптоза состоит в подавлении процесса передачи апоптозного сигнала. В этом случае проявляется еще одна сторона работы шаперонного механизма - способность к связыванию гидрофобных сайтов нормальных клеточных белков в тот момент, когда они изменяют свою конформацию при межмолекулярных взаимодействиях. Впервые установлено, что шаперон связывается с участниками апоптотического каскада, эффекторными каспазами, инактивирует их и, таким образом, задерживает или полностью отменяет процесс апоптоза.

4. Hsp70 может высвобождаться из живых клеток организма, причем впервые было показано, что в механизм экспорта белка вовлечены сигнальные системы клетки, в частности те, которые связаны с плазматической мембраной.

5. В серии оригинальных экспериментов показано, что Hsp70 является одним из основных партнеров для полипептида р58, представленного на поверхности опухолевых клеток рабдомиосаркомы РА-2 и необходимого клеткам для успешного завершения процесса метастазирования. Эта связь, по-видимому, имеет существенное значение для формирования противоопухолевого ответа иммунной системы животного-хозяина.

6. Как установлено в опытах с применением препарата очищенного Hsp70, добавленного в культуру клеток, шаперон захватывается клетками разного гистогенеза с использованием различных механизмов интернализации. Становясь эндогенным, Hsp70, сохраняет свою протективную активность по отношению к значительному числу цитотоксических факторов.

7. В экспериментах с применением модели протеотоксических заболеваний (болезнь Хантингтона) установлено, что препарат очищенного Hsp70 спасает клетки нейронального происхождения от апоптоза, вызванного токсическим действием агрегатов мутантных белков. Впервые выявлен механизм защитного действия шаперона, который заключается в том, что молекулы белка проникают в клетки и, благодаря своей шаперонной активности, снижают агрегационную способность цепей полиглутамина.

8. Применение шаперона в животных моделях приводило к значительному улучшению памяти у бульб-эктомированных животных (модель болезни Апьцгеймера), что установлено в опытах по анализу поведенческих реакций. Впервые продемонстрировано, что интра-назальное введение препарата Hsp70 снижает губительные последствия пост-травматического синдрома в модели неизбегаемого стресса.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гужова, Ирина Владимировна, Санкт-Петербург

1. Александрова И. Куличкин В.В., Каспаров И.А., Медвинская Н.И., Нестерова И.В., Лунин С.М., Самохин А.Н., Бобкова Н.В. 2004. Повышенный уровень бета-амилоида в мозгу бульбэктомированных мышей. Биохимия (Москва) 69:176-180.

2. Бобкова Н.В., Нестерова И. В.,Дана Р., Дана Е. Александрова И. Медвинская Н.И., Самохин А.Н. 2003. Морфофункциональные изменения в нейронах темпоральной коры у бульбэктомированных мышей после действия минералов. Морфология 123: 27-31.

3. Гужова И.В., Маргулис Б.А. 2000. Индукция и накопление БТШ70 приводит к формированию его комплексов с другими клеточными белками. Цитология 42: 647-652.

4. Гужова И.В., Ласунская Е.Б., Дариева З.А., Нильссон К., Маргулис Б.А. 2000. Влияние теплового шока на процессы дифференцировки и апоптоза в клетках U-937. Цитология 42: 653-658.

5. Каминская Е.В., Бахтин Ю.Б. 1989. Искусственный отбор на повышение метастатического потенциала в клеточной популяции перевивной рабдомиосаркомы РА-2 в крысах. Бюлл. Экспер. Биол. и Мед. 108:613-616

6. Комарова Е.Ю., Маргулис Б.А., Гужова И.В. 2004. Роль шаперона Hsp70 в реакции клеток лейкемии человека на противоопухолевые препараты. Цитология 46: 550-556.

7. Маргулис Б.А., Гужова И.В., 2000. Белки стресса в эукариотической клетке. Цитология 42: 323-342.

8. Моисеева О.М., Новоселов С.С., Лясникова Е.А., Иванов С.Ю., Иванова Т.Г., Шляхто Е.В. 2004. Белки теплового шока 70 кДа новый маркер повреждения органов-мишеней при гипертонической болезни. Вестник РАМН (2): 6-9.

9. Мокрушин А.А., Павлинова Л.И., Гужова И.В., Маргулис Б.А. 2004а. Белок теплового шока (Hsp70) протестирует активность глутуматергической синаптической передачи в обонятельной коре мозга крыс in vitro от тяжелой аноксии. ДАН 394: 12-15.

10. Мокрушин А. А., Павлинова Л. И., Гужова И. В., Маргулис Б. А. 20046. Белок теплового шока (Hsp70) модифицирует активность клеток обонятельной коры мозга крыс in vitro. ДАН 395: 118-120.

11. Новоселов С.С., Вербова М.В., Васильева Е.В., Воробьева Н.К., Маргулис Б.А., Гужова И.В. 2004а. Анализ экспрессии белков-шаперонов, Hsp70 и Hdj1 в опухолевых клетках человека. Вопросы онкологии 50:174178.

12. Новоселов С.С., Новоселова Т.В., Москалева О.С., Маргулис Б.А., Гужова И.В. 20046. Взаимодействие белков Hdj1 и Bag-1 с Hsp70 в процессе реакции клеток эритролейкемии человека К562 на тепловой стресс. Цитология 46: 620-627.

13. Новоселов С.С., Новоселова Т.В., Вербова М.В., Маргулис Б.А., Гужова И.В. 2005. Модуляция субстрат-связывающей активности Hsp70 кошаперонами Hdj1 и Bag-1 в реакции клеток К562 на тепловой стресс. Цитология 47: 205-209.

14. Оленев С.Н., Оленева А.С. 1995. Нейробиология-95 (на примере крысы как наиболее изученном объекте биологии и медицины) Издательство СПбГПМА, С247.

15. Степаньян Л.И., Бахтин Ю.Б. 1980. Отбор на аффинитет к легочной ткани в клетчных популяциях экспериментальных новообразований. Цитология 22:198-204.

16. Флеров М.А., Ордян Н.Э., Маргулис Б.А., Гужова И.В., Вьюшин А.В., Пивина С.Г., Герасимова И.А. 2003. Использование БТШ70 для нормализации последствий неизбегаемого стресса у крыс. Бюлл. экпер. биол и мед. 388: 41-44.

17. Фридляндская И.И. Демидов О.Н., Булатова М.М., Игнатьева Е.В., Семкина А.Н., Гужова И.В., Маргулис Б.А. 2000. Индукция апоптоза в клетках мышиной миеломы NS0/1, трансфицированной геном основного белка теплового шока, БТШ70и. Цитология, 42: 1053-1059.

18. Abbadie С., Karbun N., Bouali F., Smardova J., Stehelin D., BandenbunderB. Enrietto P. J. 1993. High levels of c-rel expression are associated with programmed cell death in the developing avian embryo and in bone marrow cells in vitro. Cell 75: 899-912.

19. Adrain C., Martin S.J. 2001. The mitochondrial apoptosome: a killer unleashed by the cytochrome seas. Trends.Biochem.Sci. 26: 390-396.

20. Alder G.M., Austen B.M., BashfordC.L., MehlertA., Pasternak C.A. 1990. Heat shock proteins induce pores in membranes, Biosci. Rep. 10 509-518.

21. Amati B, Frank SR, Donjerkovic D, Taubert S. 2001.Function of the c-Myc oncoprotein in chromatin remodeling and transcription. Biochim Biophys Acta. 1471(3): M135-145.

22. Angelidis C.E., Lazaridis I., Pagoulatos G.N. 1999. Aggregation of hsp70 and hsc70 in vivo is distinct and temperature-dependent and their chaperone function is diretly related to non-aggregated forms. Eur. J. Biochem. 259: 505512.

23. Arispe N. De Maio A. 2000. ATP and ADP modulate a cation channel formed by Hsc70 in acidic phospholipid membranes, J. Biol. Chem. 275: 30839-30843

24. Ashkenazi A., Dixit V.M., 1998. Death receptors: signaling and modulation^ Science. 281: 1305-1308.

25. Aujame L, Firko H. 1988. The major inducible heat shock protein hsp68 is not required for acquisition of thermal resistance in mouse plasmacytoma cell lines. Mol Cell Biol 8: 5486-5494.

26. Baeuerle P.A., Henkel T. 1994. Function and activation of NF-кВ in the immune system. Annu.Res.Immunol. 12: 141-175.

27. Baldwin JrA.S. 1996. The NF-kB and IkB proteins: New discoveries and insights. Annu.Res.Immunol. 14. 649-681.

28. Barbe M.F., Tytell M., GowerD,J„ Welch W. J. 1988 Hyperthermia protects against light damage in the rat retina. Science. 241:1817-1820.

29. Barque J.P., Abahamid A., Chacun H., BonalyJ. 1996. Different heat-shock proteins are constitutively overexpressed in cadmium and pentachlorophenol adapted Euglena gracilis cells. Biochem Biophys Res Commun. 223(1):7-11

30. Banr R.K., Bogoyevitch M.A., 2001. The c-Jun N-terminal protein kinase family of mitogen-activated protein kinases (JNK MAPKs) Int.J.Biochem.Cell.Biol. 33: 1047-1063.

31. BattistiniL., Salvetti M., Ristori G., Falcone M., Raine C.S., Brosnan C.F. 1995. Gamma delta T cell receptor analysis supports a role for HSP 70 selection of lymphocytes in multiple sclerosis lesions. Mol Med. 1(5):554-62.

32. Beere H.M. Wolf B.B., Mosser D.D. Mahboubi A., Kuwana Т., Tailor, P. Morimoto R.I., Cohen G.M., Green D.R. 2000. Heat-shock protein 70 inhibits apoptosis by preventing recruitment of procaspase-9 to the Apaf-1 apoptosome. Nat.Cell.Biol. 2: 469-475.

33. Beere H.M., Green D.R., 2001. Stress management heat shock protein-70 and the regulation of apoptosis. Trends.Cell.Biol. 11: 6-10.

34. Beg А.А., Baltimore D. 1996. An essential role for NF-kappaB in preventing TNF-alpha-induced cell death. Science 274: 782-784.

35. Berg G.R., Inniss W.E., Heikkila J.J. 1987. Stress proteins and thermotolerance in psychrotrophic yeasts from Arctic environments. Can. J. Microbiol. 33: 383-389.

36. Blachere N.E., Udono H., Janetzki S., Li Z., Heike M., Srivastava P.K. 1993. Heat shock protein vaccines against cancer. J Immunother. 14:.352-356.

37. Bonini NM. 2002. Chaperoning brain degeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 99 Suppl 4:16407-16411.

38. Botzler C, Issels R, Multhoff G. 1996. Heat-shock protein 72 cell-surface expression on human lung carcinoma cells in associated with an increased sensitivity to lysis mediated by adherent natural killer cells. Cancer Immunol. Immunother. 43: 226-230.

39. BroquetAH, Thomas G, Masliah J, Trugnan G, Bachelet M. 2003. Expression of the molecular chaperone Hsp70 in detergent-resistant microdomains correlates with its membrane delivery and release. J Biol Chem. 278(24): 21601-21606.

40. Brown C.R., Martin R.L., Hansen W.J., Beckmann R.P., Welch W.J. 1993. The constitutive and stress inducible forms of hsp 70 exhibit functional similarities and interact with one another in an ATP-dependent fashion. J. Cell Biol. 120: 1101-1112.

41. Buret C., Mezger V., Pinto M., Rallu M., Trigon S., Morange M. 1992.Mammalian heat shock protein families. Expression and functions. Experientia. 48(7):629-34.

42. Cande С., Cohen I., Daugas E., Ravagnan L., Larochette N., Zamzami N., KroemerG. 2002. Apoptosis-inducing factor (AIF): a novel caspase-independent death effector released from mitochondria. Biochimie 84: 215222.

43. ChenX., Easton D., Oh H.J., Lee-Yoon D.S., LiuX., SubjeckJ. 1996. The 170-kda glucose regulated protein is a large HSP70-, HSP110-like protein of the endoplasmic reticulum. FEBS Lett. 380: 68-72.

44. Chuma M., Sakamoto M., Yamazaki K., Ohta Т., Ohki M., Asaka M., Hirohashi S. 2003. Expression profiling in multistage hepatocarcinogenesis: identification of HSP70as a molecular marker of early hepatocellular carcinoma. Hepatology. 37: 198-207.

45. C/arfc B.D., Brown I.R. 1985. Axonal transport of a heat shock protein in the rabbit visual system. Proc Natl Acad Sci U S A 82(4): 1281-1285.

46. Creighton Т.Е. 1990. Protein folding. Biochem. J. 270:1-16.

47. DedharS. 1990. Integrins and tumor invasion. Bioessays. 12(12):583-90.

48. Dignam J., Lebovitz R., RoederR. 1983. Accurate transcription initiation by RNA-polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucl.Acids Res. 5: 1475-1489.

49. DwyerD.S., Liu Y.f Miao S., Bradley R.J. 1996. Neuronal differentiation in PC12 cells is accompanied by diminished inducibility of Hsc/Hsp70 and Hsp60 in response to heat and ethanol. Neurochem. Res., 21: 659-666,

50. Ellis RJ. 1990. The molecular chaperone concept. Semin. Cell Biol. 1:1-9.

51. Evan G., Littlewood T. 1998. A matter of life and cell death. Science. 281: 1317-1322

52. Evdonin A.L., Guzhova I.V., Margulis B.A., Medvedeva N.D. 2004. Phospholipase с inhibititor U73122, stimulates release of hsp70 stress protein from A431 human carcinoma cells. Cancer Cell International 4: 2

53. Fabian Т.К., GasparJ., FejerdyL., Kaan В., Balint M., CsermelyP., Fej6rdy P. 2003. Hsp70 is present in human saliva. Med Sci Monit. 9(1):BR62-5.

54. Febbraio M.A., Ott P., Nielsen H.B., Steensberg A., Keller C., Krustrup P., SecherN.H., Pedersen B.K. 2002. Exercise induces hepatosplanchnic release of heat shock protein 72 in humans. J Physiol. 544(Pt 3):957-62.

55. Feige U., Morimoto R.I., Yahara I., Polla B.S. 1996. Stress-inducible cellular responses, eds. Basel: Birkhauser.

56. Feige U., Polla B.S. 1994. Hsp70- a multi-gene, multi-structure, multi-function family with potential clinical applications. Experientia. 50: 979-986.

57. Feinstein D.L., Galea E., Aquino D.A. Li G.C. Xu H., Reis D.J. 1996. Heat shok protein 70 supresses astroglial-inducible nitric-oxide synthase expression by decreasing NF-кВ activation. J.Biol.Chem. 271: 17721-17732.

58. Ferrigno P., Silver P.A. 2000. Polyglutamine expansions: proteolysis, chaperones, and the dangers of promiscuity. Neuron. .26(1):9-12.

59. Ferris D.K., Harel-Bellan A., Morimoto R.I., Welch W.J., FarrarW.L. 1988. Mitogen and lymphokine stimulation of heat shock proteins in T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 85: 3850-3854

60. Flajnik M.F., Canel C., Kramer J., Kasahara M. 1991. Which came first, MHC class I or class II? Immunogenetics. 33: 295-300.

61. Flynn M.D., Sandeman D.D., Mawson DM., Shore A.C., Tooke J.E. 1991. Cyclical hypothermia: successful treatment with ephedrine. J R Soc Med. 84(12):752-3.

62. Froesch B.A,. Takayama S., Reed J. C. 1998. BAG-1L protein enhances androgen receptor function. J Biol Chem. 273:11660-11666.

63. Frydman J. 2001. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annu. Rev. Biochem. 70: 603-647.

64. Gabai V.L., Meriin A.B., MosserD.D., Caron A.W., Rits S., Shifrin V.I., Sherman M.Y. 1997. Hsp70 prevents activation of stress kinases. A novel pathway of cellular thermotolerance. J Biol Chem. 272:18033-18037.

65. Garcia-Mata R., BebokZ., Sorscher E.J., Sztul E.S. 1999.Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. J Cell Biol. 146(6):1239-1254.

66. GastparR, Gross C., Rossbacher L., EllwartJ., RieggerJ., MulthoffG. 2004. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J. Immunol. 172: 972-980.

67. Goodman R., Blank M. 2002. Insights into electromagnetic interaction mechanisms. J. Cell Physiol. 192:16-22.

68. Green D.R., Evan G.I. 2002. A matter of life and death. Cancer Cell. 1:19-30.

69. Green D.R., Reed J. C. 1998. Mitochondria and apoptosis. Science. 281:13091312

70. Grilli M., Chiu J., Lenardo MJ 1993. NF-kB and rel participans in multiform transcriptional regulatory system/ Int.Rev.Cytol. 143:1-62.

71. Guzhova I.V., Margulis B.A., Kaminskaya E.V. 1992. Antibody against p58 surface antigen of RA-2 rat rhabdomyosarcoma cells inhibits their metastatic activity. Int. J. Cancer 52: 892-895.

72. Guzhova I. V., Darieva Z.A., Rocha Melo A., Margulis B.A. 1997. Major stress protein Hsp70 interacts with NF-kB regulatory complex in human T-lymphoma cells. Cell Stress & Chap. 2: 132-139.

73. Guzhova I. V., K. Kisiyakova, O. Moskaiiova, I. Fridlanskaya, M. Tyteil, M. Cheetham, B. Margulis. 2001a. In vitro studies show that Hsp70 can be released by glia and that exogenous Hsp70 can enchance neuronal stress tolerance. Brain Res 914:66-73.

74. Guzhova I.V., HulquistA., Cetinkaya C., Niisson K., Pahlman S., Larsson L.G. 2001b. Interferon у cooperates with retinoic acid and phorbol ester to inducedifferentiation and growth inhibition of human neuroblastoma cells. Int. J.Cancer 94: 97-108.

75. GusellaJ.F., Wexler N.S., Conneally P.M., NaylorS.L., Anderson M.A., Tanzi R.E., WatkinsP.C., Ottina K., Wallace M.R., SakaguchiA.Y., et a/. 1983. A polymorphic DNA marker genetically linked to Huntington's disease. Nature. 306: 234-238,

76. Haas LG. 1994. BiP (GRP78), an essential hsp70 resident protein in the endoplasmic reticulum. Experientia. 4: 1012-1020.

77. Haas C., Cazorla P., Miguel C.D., Valdivieso P., Vazquez J. 1997. Apolipoprotein E forms stable complexes with recombinant Alzheimer's disease beta-amyloid precursor protein. Biochem J. 325 ( Pt 1): 169-75.

78. Herget Т., Коек M. 1999. Apoptosis-a double-edged sword. B.I.F. Futura. 14: 173-186

79. Hostein I., Robertson D., DiStefano P., Workman P., Clarke P.A. 2001. Inhibition of signal transduction by the Hsp90 inhibitor 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin results in cytostasis and apoptosis. Cancer Res. 61: 4003-4009.

80. Huang P., OliffA. 2001. Signaling pathways in apoptosis as potential targets for cancer therapy. Trends.Cell.Biol. 11: 343-348

81. Hwang T.S., Han H.S., ChoiH.K., Lee Y.J., Kim Y.J., Han M.Y., Park Y.M. 2003. Differential, stage-dependent expression of Hsp70, Hsp110 and Bcl-2 incolorectal cancer. J Gastroenterol. Hepatol. 18: 690-700

82. Jaattela M. 1999. Escaping cell death: survival proteins in cancer. Exp.Cell Res. 248: 30-43.

83. Jaattela M. 2002. Programmed cell death: many ways for cells to die dissently. Ann. Med. 34:480-488.

84. Jaenicke R. 1991. Protein folding: local structures, domains, subunits, and assemblies. Biochemistry. 30: 3147-3161.

85. Joza N., Kroemer G., Penninger J.M. 2002. Genetic analysis of the mammalian cell death machinery. Trends.Genet.18:142-150.

86. Kato K., Hasegawa K, Goto S., Inaguma Y. 1994. Dissociation as a result of phosphorylation of an aggregated form of the small stress protein, hsp27. J. Biol. Chem. 269: 11274-11278.

87. Kelty J.D., Noseworthy P.A., Feber M.E. et al. II J. Neurosci. 2002. V. 22 P. 16.

88. Kerr J.P.R., Wyllic A.H., Currie A.R. 1972. Apoptosis: a basic biologocal phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics. Br.J.Cancer. 26: 239-245.

89. Kim S., Nollen E., Kitagawa K., Bindokas V. P., Morimoto R. I. 2002. Polyglutamine protein aggregates are dynamic. Nature Cell Biol 4: 826-831,

90. KhannaA., Aten R.F., Behrman, H.R. 1995. Physiological and pharmacological inhibitors of luteinizing hormone-dependent steroidogenesis induce heat shock protein-70 in rat luteal cells. Endocrinology 136:1775 -1781

91. Kohn G., Wong H.R., Bshesh K., Zhao В., Vasi N., Denenberg A., Morris C., Stark J., Shanley T.P. 2002. Heat shock inhibits tnf-induced ICAM-1 expression in human endothelial cells vial kappa kinase inhibition. Shock 17: 91-97.

92. Komarova E.Y., Afanasyeva E. A., Bulatova M.M.,.Cheetham M.E, Margulis B.A., Guzhova I.V. 2004. Downstream caspases are novel targets for the anti-apoptotic activity of the molecular chaperone Hsp70. Cell Stress & Chap. 9: 265-275.

93. Kretz-Remy C., Arrigo A.P., 1994. The kinetics of HlV-1 long terminal repeat transcriptional activation resemble those of hsp70 promoter in heat shock treated HeLa cells. FEBS Lett. 351: 191-196.

94. C.Y., Lee J.S., Ко Y.G., Kim J.I., Seo J.S. 2000. Heat shock protein 70 inhibits apoptosis downstream of cytochrome с release and upstream of caspase-3 activation. J Biol. Chem. 275: 25665-25671

95. Margulis В.А., Nacharov P.V., Tsvetkova 0.1., Welsh M., KinevA.V. 1991. The characterization and use of different antibodies against the hsp70 major heat shock protein family for the development of an immunoassay. Electrophoresis 12: 670-673.

96. Margulis B.A., Welsh M. 1991. Isolation of hsp70-binding proteins from bovine muscle. Biochem.Biophys.Res.Commun., 178, 1-7.

97. Martin J.B. 1999. Molecular basis of the neurodegenerative disorders. N Engl J Med. Jun 24;340(25):1970-1980.

98. Maruya M., Sameshima M., Nemoto Т., Yahara I. 1999. Monomer arrangement in HSP90 dimer as determined with N and C-terminal region specific antibodies. J. Mol. Biol. 285: 903-907.

99. Masing Т.Е., Brown I.R. 1989. Cellular localization of heat shock gene expression in rabbit cerebellum by in situ hybridization with plastic-embedded tissue. Neurochem Res. 14:725-731.

100. MelcherA., Murphy S., Vile R. 1999. Heat shock protein expression in target cells infected with low levels of replication-compliment virus contributes to immunogenecity of adenoviral vectors. Hum. Gene Therapy. 10:1431-1442.

101. MenoretA., Patry Y., Burg C., Le Pendu J. 1995. Co-segregation of tumor immunogenioity with expression of inducible but not-constitutive hsp70 in rat colon carcinomas. J. Immunol. 155: 740-747

102. Mizushima Т., Natori S., Sekimizu K. 1993. Relaxation of supercoiled DNA associated with induction of heat shock proteins in Escherichia coli. Mol.Gen Genet. 238:1-5.

103. Morimoto R.I., TissieresA., Georgopoulos C. 1994. The biology of heat shock proteins and molecular chaperones. eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 372 pp.

104. MorleyJ.F., Morimoto R.I. 2004. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Mol Biol Cell. 15(2): 657-64.

105. MosserD.D., Caron A.W., Bourget L., Denis-Larose C., Massie B. 1997. Role of the human heat shock protein hsp70 in protection against stress-induced apoptosis. Mol. Cell Biol. .17: 5317-5327.

106. MosserD.D., Caron A.W., Bourget L, Meriin A.B., Sherman M.Y., Morimoto R.I., Massie B. 2000. The chaperone function of hsp70 is required for protection against stress-induced apoptosis. Mol. Cell Biol. 20:7146-7159.

107. MulthoffG., BotzlerC., Wiesnet M., MullerE., Meier Т., Wilmanns W., Issels R.D. 1995. A stress-inducible 72-kDa heat-shock protein (HSP72) is expressed on the surface of human tumor cells, but not on normal cells. Int.J.Cancer. 6:.272-279

108. Naishiro У., Adachi M., Okuda H., Yawata A., Mitaka Т., Takayama S., Reed J.C., HinodaY., Imai K. 1999. BAG-1 accelerates cell motility of human gastric cancer cells. Oncogene. 18: 3244-3251.

109. Nakamura S., Murayama N., Noshita Т., Annoura H., Ohno T. 2001. Progressive brain dysfunction following intracerebroventricular infusion of beta(1-42)-amyloid peptide. Brain Res. 912(2):128-136.

110. Nicolson G.L. 1987. Tumor cell instability, diversification, and progression to the metastatic phenotype: from oncogene to oncofetal expression. Cancer Res. 47(6): 1473-1487.

111. Nishimura R.N., DwyerB.E., Clegg K., Cole R., VellisJ. 1991. Comparison of the heat shock response in cultured cortical neurons and astrocytes. Mol. Brain Res.9: 39-45.

112. Nollen E.A., Morimoto R.I. 2002. Chaperoning signaling pathways: molecular chaperones as stress-sensing 'heat shock' proteins. J. Cell Sci. 115: 28092816.

113. Obermann W.M., Sondermann H., RussoA.A., Pavletich N.P., Hartl F.U. 1998. In vivo function of Hsp90 is dependent on ATP binding and ATP hydrolysis. J.Cell Biol. 143: 901-910.

114. Oh H.J., ChenX., SubjeckJ.R.-1997. Hsp110 protects heat-denaturated and confers cellular thermoresistance. J. Biol. Chem. 272: 31636-31640.

115. Oka M., Sato S., Soda H., Fukuda M., Kawabata S., Nakatomi K., Shiozawa K.,Nakamura V., Ohtsuka K., Kohno S. 2001. Autoantibody to heat shock protein Hsp40 in sera of lung cancer patients. Jpn. J. Cancer Res. 92: 316320.

116. Papp E, Nardai G, Soti C, Csermely P. 2003. Molecular chaperones, stress proteins and redox homeostasis. Biofactors. 17: 249-257.

117. Pardue S., Groshan K., Raese J.D., Morrison-Bogorad M. 1992. Hsp70 mRNA induction is reduced in neurons of aged rat hippocampus after thermal stress. Neurobiol Aging. 13(6):661-72

118. Park H.S., Lee J.S., Huh S., Seo J., Choi E. 2001.Hsp72 functions as a natural inhibitory protein of c-Jun N-terminal kinase. EMBO J. 20: 446-456.

119. Pelham H.R.B. 1986. Speculations on the function of major heat shock and glucose-regulated proteins. Cell. 46:959-961.

120. Petersen A, Mani K., Brundin P. 1999. Recent advances on the pathogenesis of Huntington's disease. Exp. Neurology 157:1-18,.

121. Pockley A.G., Georgiades A., Thulin Т., de Faire U., Frostegard J. 2003. Serum heat shock protein 70 levels predict the development of atherosclerosis in subjects with established hypertension. Hypertension 42(3):235-238

122. Pierce S.K. 1994. Molecular chaperones In the processing and presentation of antigen to helper T-cells. Experientia. 50: 1026-1030

123. Piura B, Rabinovich A, Yavelsky V, Wolfson M. 2002. Heat shock proteins and malignancies of the female genital tract. Harefuah. 141: 969-1010

124. Prodromou C., Roe S.M., O'Brien R., LadburyJ.E., PiperP.W., Pear!L.H. 1997. Identification and tructural characterization of the ATP/ADP-binding site in the Hsp90 molecular chaperone. Cell. 90: 65-75.

125. Ralhan R., KaurJ. 1995. Differential expression of Mr 70,000 heat shock protein in normal, premalignant, and malignant human uterine cervix. Clin Cancer Res. 1(10): 1217-22.

126. Ravagnan L., Gurbuxani S., Susin S.A., Maisse C., Daugas E., Zamzami N. Мак Т., Jaattela M., Penninger, J.M., Garrido C., KroemerG. 2001 Heat-shock protein 70 antagonizes apoptosis-inducing factor. Nat Cell Biol 3: 839843.

127. Reddy P.S., Housman D.E. 1997. The complex pathology of trinucleotide repeats. Curr Opin Cell Biol. 9(3):364-372.

128. RetzlaffC., Yamamoto Y., Hoffman P.S. Friedman H., Klein T. 1994. Bacterial het shock proteins directly induce cytokine mRNA and interleukin-1 secretion in macrophage cultures. Infect. Immun. 62, 5989-5993.

129. Rubinsztein D.C., Wyttenbach A., Rankin J. 1999 Intracellular inclusions, pathological markers in diseases caused by expanded polyglutamine tracts? J Med Genet. 36(4):265-270.

130. RudigerS., Schneider-Mergener J., Bukau B. 2001. Its substrate specificity characterizes the DnaJ co-chaperone as a scanning factor for the DnaK chaperone. EMBO J. 20(5):1042-1050.

131. Ruiz-Vela A., AlbarJ.P., Martinez C.A. 2001. Apaf-1 localization is modulated indirectly by Bcl-2 expression. FEBS Lett. 501: 79-83.

132. Sakahira H., BreuerP., Hayer-Hartl M.K., Hartl F.U. 2002. Molecular chaperones as modulators of polyglutamine protein aggregation and toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 99 Suppl 4:16412-16418.

133. Samali A., Cotter T.G. 1996. Heat shock proteins increase resistance to apoptosis. Exp Cell Res 223: 163-170.

134. Santarosa M., Favaro D., Quaia M., Galligioni E. 1997. Expression of heat shock protein 72 in renal cell carcinoma: possible role and prognostic implications in cancer patients. Eur J Cancer 33(6):873-877.

135. Sapozhnikov A.M., Gusarova G.A., Ponomarev E.D., Telford W.G. 2002. Translocation of cytoplasmic HSP70 onto the surface of EL-4 cells during apoptosis. Cell Prolif. 35:193-206.

136. Saleh A., Srinivasula S.M., BalkirL., Robbins P.D., Alnemri E.S. 2000. Negative regulation of the Apaf-1 apoptosome by Hsp70. Nat.Cell Biol. 2: 476483.

137. Scheibel Т., Siegmund H.I., Jaenicke R., Ganz P., Lilie H., BuchnerJ. 1999. The charged region of Hsp90 modulates the function of the N-terminal domain. Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 96: 1297-1302

138. SchirrmacherV. 1985. Cancer metastasis: experimental approaches, theoretical concepts, and impacts for treatment strategies. Adv Cancer Res. 43:1-73.

139. Schlossman DM, Schmid SL, Braell WA, Rothman JE. 1984. An enzyme that removes clathrin coats: purification of an uncoating ATPase. J Cell Biol. 99(2): 723-733.

140. SedgerL., Ruby J. 1994. Heat shock response to Vaccinia virus infection. J. Virol. 68: 4685-4689.

141. Sen S. 1992 .Programmed cell death: concept, mechanism and control. Biol.Rev.Camb.Phil. Soc. 67: 287-319

142. ShelterR.A., Smyers M.E., Grossfetd R.M., BallingerM.L., BittnerG.D. 1998. Heat-shock proteins in axoplasm: high constitutive levels and transfer of inducible isoforms from glia. Comp Neurol. Jun 22;396(1):1-11.

143. Sherman M.Y., Goldberg A.L. 2001. Cellular defenses against unfolded proteins: a cell biologist thinks about neurodegenerative diseases. Neuron. 29(1): 15-32.

144. Sondermann H., ScheuflerC., Schneider С., Hohfeld J., Hartl F.U., Moarefi I. 2001. Structure of a Bag/Hsc70 complex: convergent functional evolution of Hsp70 nucleotide exchange factors. Science. 291 : 1553-1557

145. Soti C., Csermely P. 2002. Chaperones come of age. Cell Stress Chaperones. 7(2):186-190

146. Syrigos K.N., Harrington K.J., Karayiannakis A.J., Sekara E., Chatziyianni E., Syrigou E.I., Waxman J. 2003. Clinical significance of heat shock protein-70 expression in bladder cancer. Urology. 61: 677-680.

147. Takayama S., Bimston D.N., Matsuzawa S., Freeman B.C., Aime-Sempe C., XieZ., Morimoto R.I., Reed J.C. 1997. BAG-1 modulates the chaperone activity of Hsp70/Hsc70. EMBO J. 16: 4887-4896

148. Thanos D., Maniatis Т., 1995. NF-kB: A lesson in family values. Cell 80: 529532.

149. Thompson C.B. 1995. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science. 267: 1456-1462.

150. Thomberry N.A., Lazebnik Y. 1998. Caspases: enemies within. Science. 281: 1312-1316.

151. Trautinger,F., Trautinger, I., Kindas-Mugge, I., Metze, D., and Luger, T.A. 1993. Human keratinocytes in vivo and in vitro constitutively express the 72-kD heat shock protein J.Invest, dermato). 101, 334-338

152. Turner В. C., Krajewsk, S., Krajewska M., Takayama S., Gumbs A. A., Carter D., Rebbeck T. R., Haffty B. G., Reed J. C. 2001. BAG-1: a novel biomarker predicting long-term survival in early-stage breast cancer. J. Clin. Oncol. 19: 992-1000.

153. Tytell M., Greenberg S.C., Lasek R.J. 1986. Heat shock-like proteins is transferred from glia to axon. Brain Res. 363:.161-164.faux D.L., StrasserA. 1996. The molecular biology of apoptosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 93: 2239-2244.

154. Vayda M.E., Yuan M.L. 1994. The heat shock response of an Antarctic alga is evident at 5 degrees C. Plant Mol. Biol. 24: 229-233

155. Voisin P.J., Pardue S., Macouillard F., Yehia G., Labouesse J., Morrison-Bogorad M. 7996.Differential expression of heat shock 70 proteins in primary cultures from rat cerebellum. Brain Res. 739(1-2):215-234.

156. Wang C.-Y., Mayo M.W., Korneluk R.G., GoeddelD.V., Baldwin A.S.,Jr.1998. NF-кВ antiapoptosis: induction of TRAF1 and TRAF2 and C-IAP1 and C-IAP2 to suppress caspase-8 activation. Science 281:1680-1683.

157. Wang H.G., Takayama S., Rapp U.R., Reed J.C. 1996. Bcl-2 interacting protein, BAG-1, binds to and activates the kinase Raf-1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:7063-7068.

158. Walsh R.C., Koukoulas I., Garnham A., Moseley P.L., Hargreaves M., Febbraio M.A. 2001. Exercise increases serum Hsp72 in humans. Cell Stress Chaperones. 6(4):386-393.

159. Welch W.J., Feramisco J.R. 1985. Rapid purification of mammalian70 kDa stress proteins: affinity of the proteins for nucleotides. Mol.Cell Biol. 5: 12291237.

160. Welch W.J., Suhan J. 1986.Cellular and biochemical events in mammalian cells during and after recovery from physiological stress. J Cell Biol. 103(5):2035-2052.

161. Zeiner M., Gebauer M., Gehring U. 1997. Mammalian protein RAP46: an interaction partner and modulator of 70 kDa heat shock proteins. EMBO J. 16 : 5483-5490.

162. Zhou H., Li S.H., Li X.J. 2001. Chaperone suppression of cellular toxicity of huntingtin is independent of polyglutamine aggregation. J.Biol Chem. 276(51 ):48417-48424.

163. Young J.C., Schneider C., Hartl F.U. 1997. In vitro evidence that hsp90 contains two independent chaperone sites. FEBS Lett. 418: 139-143.

Информация о работе

Гужова, Ирина Владимировна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.25

Диссертация

Механизмы работы шаперона Hsp70 в нормальных клетках и при клеточной патологии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы