Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Защита эндотелиальных клеток сосудов человека от повреждения при ишемии in vitro

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Локтионова, Светлана Анатольевна, Москва

/

М-¿/ЛУЗ- ?

РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КОМПЛЕКС МЗ МП РФ НИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КАРДИОЛОГИИ

_На правах рукописи

ЛОКТИОНОВА Светлана Анатольевна

ЗАЩИТА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК СОСУДОВ ЧЕЛОВЕКА ОТ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПРИ ИШЕМИИ IN VITRO: РОЛЬ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА HSP27

03.00.25 - клеточная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Научные руководители: кандидат биологических наук А.Е. Кабаков доктор медицинских наук, профессор Э.М. Тарарак

Москва, 1998 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ В ТЕКСТЕ

ДИССЕРТАЦИИ..................................................................................6

I.ВВЕДЕНИ Е......................................................................................7

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: Белки теплового шока, истощение АТФ и

толерантность к ишемии..................................................................10

1. Белки теплового шока: свойства, функции, регуляция экспрессии.

1.1. Общая характеристика белков теплового шока.........................................10

1.2. Класс НБРЮО..............................................................................10

1.3. Класс НЭРЭО...............................................................................11

1.4. Класс НвР70...............................................................................12

1.4.1. Краткая характеристика класса НЭР70........................................12

1.4.2. Функции НБР70...................................................................13

1.5. Класс НЭРбО...............................................................................14

1.6. Семейство малых НБРэ (НЭР27 и альфа-кристаллины)....................................................................................15

1.6.1. Краткая характеристика семейства малых НБРв.............................................................................................15

1.6.2. Фосфорилирование малых НЭРэ...............................................16

1.6.3. Функции малых НБРэ............................................................18

1.7. Убиквитин ..................................................................................19

1.8. Другие представители стресс-белков и шаперонов.....................................20

1.9. Индукция НЭРэ.............................................................................20

2. Истощение АТФ как "протеотоксический" стресс..........................................23

2.1. Энергетический баланс клетки............................................................24

2.2. Падение уровня клеточного АТФ как причина ионного дисбаланса при ишемии..........................................................................................25

2.3. Агрегация и инактивация ферментов....................................................27

2.4. Дефосфорилирование белков............................................................29

2.5. Разрушение и реорганизация цитоскелета..............................................30

2.5.1. Разрушение актиновых микрофиламентов при падении уровня клеточного АТФ..............................................................................................31

2.5.2. Влияние истощения АТФ на организацию микротрубочек...................34

2.5.3. Влияние истощения АТФ на промежуточные филаменты....................35

2.6. Увеличение коньюгации внутриклеточных белков с убиквитином.....................35

2.7. Истощение клеточного АТФ вызывает активацию генов теплового шока.............................................................................................36

3. Участие НЭРэ в защите клеток от ишемического повреждения.........................39

3.1. Участие НЭР70 в защите клеток от ишемического стресса............................40

3.2. Участие малых НБРэ в защите клеток от ишемического стресса......................41

Заключение.....................................................................................42

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................43

1. Выделение, культивирование и идентификация в культуре эндотелиальных клеток сосудов человека...............................................................................43

1.2. Выделение эндотелиальных клеток......................................................43

1.3. Культивирование эндотелиальных клеток...............................................43

1.4. Идентификация эндотелиальных клеток в культуре....................................43

2. Имитирующий ишемию метаболический стресс..........................................44

3. Предобработка клеток.......................................................................45

4. Измерение уровня АТФ в клетках...........................................................46

5. Измерение внутриклеточного Са2+.........................................................46

6. Флуоресцентная микроскопия..............................................................46

7,Определение концентрации F-актина в ЭК на спектрофлуориметре...........................................................................47

8. Клеточное фракционирование неионным детергентом Тритоном X-100...............................................................................................47

9. Электрофорез и иммуноблоттинг...........................................................48

10. Анализ изоформного спектра HSP27.....................................................48

11. Статистическая обработка результатов..................................................49

Материалы......................................................................................49

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ................................................................................50

1. Архитектура актинового цитоскелета, распределение и статус HSP27 в культивируемых эндотелиальных клетках сосудов человека..............................50

2. Блокада энергетического метаболизма как in vitro модель ишемического повреждения эндотелия сосудов человека..................................................................52

3. Изменения морфологии, актинового цитоскелета и статуса HSP27 в ЭК сосудов человека, подвергнутых ишемическому стрессу in

vitro...............................................................................................58

4. Ранние эффекты теплового шока на HSP27, актин и устойчивость эндотелиальных клеток к ишемии in vitro.........................................................................63

5. Индуцированная тепловым шоком "поздняя" толерантность эндотелиальных клеток к ишемии in vitro..................................................................................73

6. Ингибиторы протеинфосфатаз защищают эндотелиальные клетки при ишемическом стрессе in vitro...................................................................................83

V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.............................................................89

VI. ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................................98

VII. ВЫВОДЫ..................................................................................101

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................102

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ В ТЕКСТЕ ДИССЕРТАЦИИ

AT - антитела

ГА -гербимицин А

ГМК - гладкомышечные клетки

ДАБ - диаминобензидин

ИЭФ - изоэлектрическая фокуссировка

ТРИТЦ - тетраметилродаминизотиоцианат

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЭК - эндотелиальные клетки

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

BSA - бычий сывороточный альбумин

СССР - карбонилцианид хлорфенилгидразон

DMEM - Dulbecco's modified Eagle medium

ECL - enhanced chemiluminiscence (метод)

HEPES - оксиэтилпиперазинэтансульфокислота

HSE - heat shock element

HSF - heat shock factor

HSPs - белки теплового шока

Ig - иммуноглобулины

MAP киназы - митогенактивируемые протеинкиназы PBS - фосфатный буфер РР - протеинфосфатазы TxRd - техасский красный Ub - убиквитин

ВВЕДЕНИЕ

Ишемия - состояние, при котором из-за спазма или тромбоза сосудов кровоснабжение части органа оказывается недостаточным для обеспечения метаболизма, является причиной таких патологий как инфаркт миокарда и инсульт головного мозга. На клеточном уровне ишемия характеризуется падением уровня АТФ в результате угнетения гликолиза и окислительного фосфорилирования, нарушением ионного баланса (ростом концентрации Са2+, Na+, Н+ и падением содержания К+), а также накоплением конечных продуктов метаболизма, что ведет к повреждению и гибели клеток. Известно, что клетки млекопитающих способны адаптироваться к ишемическому состоянию. Предобработка клеток и органов коротким ишемическим стрессом, тепловым шоком [Currie et al., 1988; 1990; 1993; Donnelly, 1992; Yellon, 1992; Marber, 1993], гипоксией [Меерсон и др., 1990] или иммобилизационным стрессом [Меерсон и Малышев, 1993] уменьшает их чувствительность к повреждающему действию последующей ишемии. Таким образом, существует реальная возможность, используя внутренние ресурсы клеток, сохранить их жизнеспособность в течение острого ишемического приступа. В связи с этим особое значение приобретает раскрытие эндогенных механизмов клеточной защиты, использование которых позволило бы разработать методы уменьшения структурных и функциональных повреждений клеток в период недостаточного снабжения органа кровью.

Работы последних лет позволяют предположить, что важную роль в приобретении клетками толерантности к ишемии играют стресс-белки или белки теплового шока (HSPs). В экспериментах на трансгенных мышах установлено, что избыток внутриклеточного HSP70 уменьшает зону инфаркта и обеспечивает восстановление сократительной функции миокарда после ишемии [Marber et al., 1995, Plumier et al., 1995]. Показано, что гиперэкспрессия HSP27 и альфа В-кристаллина [Martin et al., 1997], а также совместная гиперэкспрессия HSP60 и HSP10 [Lau et al., 1997] в трансфицированных крысиных кардиомиоцитах защищает трансфектанты от гибели

при длительном истощении АТФ. Тем не менее, механизм такой обусловленной стресс-белками защиты не ясен.

Объектами модельных исследований, проводимых в этой области, как правило, являются кардиомиоциты, гепатоциты, клетки мозга и некоторые клеточные линии миогенного и опухолевого происхождения. В то же время, мало внимания уделяется эндотелиальным клеткам (ЭК), при этом используется эндотелий животных, а не человека. Тем не менее, именно степень повреждения ЭК может определять выживаемость той или иной ткани после острого ишемического приступа. ЭК кровеносных сосудов образуют монослой, выполняющий физиологическую функцию избирательно проницаемого барьера между кровью и подлежащими тканями. Осуществление этой функции контролируется актиновым цитоскелетом ЭК [Gotiieb et al., 1991; Garcia et al., 1995]. Показано, что разрушение актиновых филаментов ведет к увеличению проницаемости эндотелиального монослоя для макромолекул и клеток крови [Phillips et al., 1989; Watanabe et al., 1991; Molony et al., 1991; Garcia, 1992; Hart et al., 1993], что может приводить к отеку и образованию тромба. Ишемия in vivo вызывает разрушение актинового цитоскелета [Armstrong and Gannote, 1993] и повышает проницаемость эндотелия сосудов и капилляров [Sunnergen and Rovetto, 1987; Svendsen et al., 1991]. Известно также, что истощение клеточного АТФ приводит к фрагментации и агрегации F-актина в культивируемых ЭК [Hinshaw et al., 1988; 1993; Watanabe, 1991; Kühne et al., 1993]. В то же время, было показано, что стресс-белок HSP27 влияет как на полимеризацию актина, так и на его резистентность к различным стрессам, причем эти функции HSP27 определяются его уровнем экспрессии, степенью фосфорилирования и структурной организацией. Мономеры нефосфорилированного HSP27 способны кэпировать актиновые филаменты [Benndorf et al., 1994], а гиперэкспрессия мутантного неспособного фосфорилироваться HSP27 коррелирует с пониженным содержанием F-актина в трансфицированных клетках [Lavoie et al., 1993Ь]. С другой стороны, повышенная экспрессия фосфорилированного HSP27 снижает чувствительность клеток

к повреждающему действию теплового шока [Lavoie et al., 1993а; 1995], окислителей [Huot et al., 1995; 1996] и цитохалазина D [Lavoie et al., 1993a; Guay et al., 1997]. Исходя из этого, а также принимая во внимание, что гиперэкспрессия HSP27 защищает трансфицированные кардиомиоциты от истощения АТФ, мы выдвигаем предположение, что устойчивость клеток к ишемическому стрессу связана с защитой HSP27 актинового цитоскелета.

Целью представляемой работы является исследование роли HSP27 в механизмах защиты ЗК от ишемического повреждения.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать экспериментальную in vitro модель ишемического повреждения ЭК сосудов человека.

2. Показать, как реагирует HSP27 в ЭК на имитирующий ишемию метаболический стресс.

3. Установить связано ли изменение степени фосфорилирования, структурной организации и локализации HSP27 с состоянием актинового цитоскелета в ЭК при экспериментальной ишемии in vitro.

4. Исследовать, как влияет предварительное накопление HSP27 в ЭК на их устойчивость к ишемическому повреждению.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: Белки теплового шока, истощение АТФ и толерантность к ишемии.

1. Белки теплового шока: свойства, функции, регуляция экспрессии.

1.1. Общая характеристика белков теплового шока.

Тепловой шок и такие стрессорные воздействия как ишемия, гипоксия, действие цитотоксических агентов стимулируют экспрессию ряда белков, называемых белками теплового шока (НБРэ) или стресс-белками. Одной из основных функций, выполняемых НЭРэ, является защита белков клетки от денатурации и агрегации (отсюда еще одно их название - молекулярные шапероны). Необходимость в шаперонах обусловлена существованием в клетке ряда факторов, способных приводить к спонтанной агрегации белков. К таким факторам относятся экстремально высокая концентрация белка (100-150 мг/мл) в цитозоле и компартментах, присутствие на рибосомах незавершенных полипептидных цепей, наличие у многих белков гидрофобных доменов. При повышении температуры и других стрессах риск агрегации внутриклеточных белков сильно увеличивается, что вызывает необходимость повышения концентрации НЭРэ. Кроме того, белки теплового шока участвуют в укладке вновь синтезированных полипептидов, контролируют распределение белков в клетке и перенос их через мембраны, деградацию белков, образование олигомерных комплексов и другие процессы. Члены семейства НЭРэ представлены в клетках всех ныне живущих организмов: от бактерий до высших растений и животных. По своему молекулярному весу, структуре и свойствам стресс-белки делятся на несколько классов.

1.2. Класс НБРЮР.

Класс НЭРЮО образован высоко консервативными белками с молекулярной массой 104-110 кДа. Они обнаружены как в прокариотических клетках, так и в клетках эукариот. Все белки данного класса являются АТФ-азами, имеющими два, реже - один АТФ-связывающий домен. Эти белки экспрессируются в ответ на стрессы и

конститутивно [Parsell et al. 1991, 1994а]. По крайней мере, часть представителей этого класса шаперонов участвует в процессах протеолиза поврежденных белков [Parsell and Lindquist, 1994а]. Активность HSP104 и HSP110 функционально связана с активностью HSP70 [Parsell et al., 1994b; Oh et al., 1997]. Гиперэкспрессия HSP110 защищает клетки от повреждения тепловым шоком, поддерживая денатурированные белки в растворимом состоянии до дальнейшего взаимодействия с другими представителями HSP [Parsell and Lindquist, 1994b; Oh et al., 1997].

1.3. Класс HSP90.

Белки класса HSP90 также представлены в прокариотических и в эукариотических клетках. При этом для E.coli показано, что делеция гена HSP90 не имеет драматических последствий [Brandwell, 1988], в то же время, HSP90 необходимы для существования эукариотических клеток [Parsell and Lindquist, 1994а] и их защиты от теплового шока [Bansal et al., 1991]. Это одни из основных цитозольных молекулярных шаперонов эукариот. In vitro HSP90 предотвращают денатурацию и агрегацию белков и ускоряют их переукладку [Wiech et al., 1994]. Белки этого класса взаимодействуют с несколькими протеинкиназами, включая pp60src, с рецепторами стероидных гормонов, факторами транскрипции, актином, тубулином и кальмодулином, выполняя регуляторную функцию [Koyasu et al., 1986; Lindquist and Craig, 1988; Gething and Sambrook,1992; Welch 1992]. В нестрессированных клетках для HSP90 показана также внутриядерная локализация, где они связываются с гистонами и, вероятно участвуют в конденсации хроматина [Csermely et al., 1994; 1997]. При тепловом шоке HSP90 фосфорилируются и накапливаются в ядре [Legagneux et al., 1991; Akner et al., 1992]. HSP90, наряду с HSP70, участвуют в негативной регуляции экспрессии шаперонов, связываясь с heat shock factor (HSF) (см. п.

1.4.), запускающим транскрипцию генов теплового шока [Nadeau et al., 1993]. Снижение уровня HSP90 в клетке приводит к активации HSF1; в свою очередь, последняя может быть подавлена добавлением очищенного HSP90 [Zou et al., 1998].

1.4. Класс HSP70.

1.4.1. Краткая характеристика класса HSP70.

Белки этого класса составляют большую группу молекулярных шаперонов, представленных во всех компартментах и органеллах прокариотических и эукариотических клеток [Lindquist and Craig, 1988; Welch, 1992; McKay et al., 1994]. Все они имеют высоко консервативный N-концевой домен и являются АТФ-азами. В клетках эукариот HSP70 является главным компонентом шаперонного механизма. У человека гены HSP70 локализованы в 1, 5, 6, 11, 14 и, предположительно, в 21 хромосомах [Favaier, 1997]. Они представлены генами HSP70-1 и HSP70-2, кодирующими одинаковые белковые продукты из 641 аминокислоты и геном HSP70-HOM. HSP70-1 и HSP70-2 отличаются З'-концевыми некодирующими сегментами. Все три гена имеют различную регуляцию. HSP70-1 экспрессируется конститутивно на низком уровне, а также в ответ на тепловой шок, HSP70-2 экспрессируется только в ответ на повышение температуры, HSP70-HOM экспрессируется в обоих случаях, но на низком уровне. Для каждого гена показан генный полиморфизм по определенным положениям. Экспрессия того или иного типа гена может быть ответом на определенный стресс, а также показана ее связь с определенными патологиями [Favatier et al., 1997]. В клетках эукариот шапероны данного класса локализованы в цитоплазме, а также в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР), где они представлены глюкозо-регулирующим белком 78 кДа (GRP 78) или BiP [Gething and Sambrook, 1992; Welch, 1992]. BiP осуществляет АТФ-зависимый перенос белков через мембрану эндоплазматического ретикулума и участвует в их сборке в просвете ЭПР [Brodsky and Schekman, 1994; Gething et al., 1994; Rassow et al., 1995а]. Этот белок экспрессируется конститутивно на высоком уровне, при этом его синтез может быть увеличен после теплового шока, гипоксии, отсутствия глюкозы и других стрессов, нарушающих посттрансляционную модификацию секретируемых белков [Gething et al., 1992; 1994]. Митохондриальный гомолог H