Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональная характеристика эндотелиальных прогениторных клеток при хронической сердечной недостаточности

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональная характеристика эндотелиальных прогениторных клеток при хронической сердечной недостаточности"

На правах рукописи

Бондаренко Наталья Анатольевна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005544867

Новосибирск - 2013

005544867

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, доцент

Коненков Владимир Иосифович Повещенко Александр Федорович

Толстикова Татьяна Генриховна

заведующая лабораторией фармакологических исследований ФГБУН «Новосибирский институт органической химии им. Н.Н.Ворожцова» СО РАН

Постникова Ольга Алексеевна

заведующая кафедрой информатики и математики Новосибирского государственного медицинского университета МЗ РФ

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Защита диссертации состоится « /3 » на заседании Совета по защите докторей

2013 г. в

час.

и кандидатских диссертации Д 001.037.01 в ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2, тел. 334-84-38.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан «

2013 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских

и кандидатских диссертаций.¿^Молодых Ольга Павловна Д 001.037.01 /Л, доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Эндотелиальные прогениторные клетки (ЭПК) представляют собой уникальную популяцию клеток, которые, как и эмбриональные ангиобласты, способствуют формированию сосудов в постнаталь-ном периоде как за счет ангиогенеза, так и путем васкулогенеза, когда в ответ на ангиогенные ростовые факторы ЭПК мигрируют из ниши костного мозга в кровеносное русло, циркулируют и трансформируются в тканях в локальные адгезивные ЭПК (Kawamoto А., 2003; Кескинов A.A., 2008; Fadini G., 2008; Jiga J., 2013). Доступным источником аутологичных ЭПК является периферическая кровь после фармакологической мобилизации клеток костного мозга человеческим рекомбинантным гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (G-CSF) (Дыгай А.М., 2010; Румянцев С.А., 2010).

Участие ЭПК в неоваскуляризации обусловлено не только их способностью дифференцироваться в эндотелиальные клетки, участвуя в формировании новых сосудов, но и способностью продуцировать различные регуляторные ростовые факторы и цитокины, стимулирующие васкуло- и ангиогенез (Kinnaird Т., 2004; Kim WS., 2013).

На сегодняшний день изучение ангиогенных свойств ЭПК осуществляется с использованием клеточных линий. Так, эндотелиальные клетки человека линии ЕА.Ну92 как морфологически, так и функционально отражают свойства зрелых эндотелиальных клеток, что позволяет оценить как влияние ЭПК на зрелые эндотелиальные клетки, так и влияние зрелых эндотелиальных клеток на ЭПК, моделируя взаимодействие различных популяций клеток в организме (Bauer J., Edgell C.J., 1992).

В экспериментальных моделях ишемии тканей показано стимулирующее действие ЭПК на формирование сосудистой сети как in vitro, так и in vivo (Rafii S., 2003). Хотя ЭПК уже используются в клеточной терапии хронической сердечной недостаточности (ХСН), их свойства у пациентов практически не изучены. В связи с этим необходимо более полное понимание биологических свойств используемых клеток у пациентов с хронической сердечной недостаточностью.

Таким образом, представляется актуальным изучение функциональных свойств, таких как пролиферация, миграция, продукция проангиогенных факторов и способность стимулировать ангиогенез, различных популяций ЭПК пациентов с ХСН.

Цель исследования - охарактеризовать морфологические и функциональные свойства циркулирующих эндотелиальных прогениторных клеток пациентов с хронической сердечной недостаточностью, мобилизованных в периферическое русло введением G-CSF, и эндотелиальных клеток, выращенных in vitro.

Задачи исследования:

1. Оценить фенотип и морфологию циркулирующих и культивируемых ЭПК при хронической сердечной недостаточности.

2. Изучить спектр продукции цитокинов и ростовых факторов ЭПК до и после мобилизации в периферическое русло введением G-CSF и с учетом условий культивирования на различных адгезионных белках и сроках культивирования.

3. Выявить тип влияния биоактивных веществ, продуцируемых ЭПК, на функциональную активность (пролиферация, миграция) клеток эндо-телиальной линии человека ЕА.Ну926.

4. Изучить влияние биоактивных веществ, продуцируемых клетками эндотелиальной линии человека ЕА.Ну926, на функциональную активность (пролиферация, миграция) ЭПК пациентов с хронической сердечной недостаточностью.

Научная новизна. Впервые исследован популяционный состав и функциональная активность циркулирующих ЭПК, мобилизованных введением G-CSF, пациентов с тяжелой формой хронической сердечной недостаточности. Показано, что при мобилизации G-CSF клеток из костного мозга происходит увеличение количества различных популяций ЭПК, находящихся на разных стадиях дифференцировки.

Впервые показано, что у мобилизованных G-CSF мононуклеарных клеток (МНК), обогащенных ЭПК, отмечена высокая пролифератив-ная активность, способность к хоумингу, продукция широкого спектра цитокинов и ростовых факторов. Показано, что циркулирующие ЭПК различной степени зрелости пациентов с хронической сердечной недостаточностью сопряжены с продукцией цитокинов и ростовых факторов, продуцируемых МНК.

Впервые установлено, что культура ЭПК, полученная из мононуклеарных клеток, мобилизованных введением G-CSF при хронической сердечной недостаточности, характеризуется пролиферативной и миграционной активностью. Показано, что «ранние» и «поздние» ЭПК in vitro обладают различной продуцирующей активностью цитокинов, ростовых факторов и оксида азота (N0).

Впервые выявлены аутокринные и паракринные взаимодействия ЭПК и зрелых эндотелиальных клеток.

Научно-практическая значимость работы. Результаты, полученные в ходе исследования влияния G-CSF на мобилизацию стволовых/ прогениторных клеток из костного мозга пациентов с ХСН, расширяют представления о фенотипических и таких функциональных свойствах стволовых/прогениторных клеток, как пролиферация, миграция, продукция цитокинов и ростовых факторов.

Результаты диссертационной работы учитываются при комплексной терапии пациентов с ХСН в ФГБУ «ННИИ патологии кровообращения имени академика E.H. Мешалкина» МЗ РФ (Новосибирск). Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры анатомии, физиологии и безопасности жизнедеятельности ФГБОУ ВПО НГПУ (Новосибирск).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Введение G-CSF приводит к мобилизации из костного мозга пациентов с хронической сердечной недостаточностью различных популяций ЭПК, находящихся на различных этапах дифференцировки.

2. МНК, обогащенные ЭПК, периферической крови и ЭПК, полученные in vitro, обладают высоким пролиферативным потенциалом и в процессе дифференцировки секретируют целый ряд проангиогенных цитокинов и ростовых факторов.

3. ЭПК обладают аутокринным и паракринным регуляторным потенциалом.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010); X Международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии» (Новосибирск, 2011); VII научных чтениях, посвященных памяти академика РАМН Е.Н.Мешалкина (Новосибирск, 2011); IV Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2011); III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012); V Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы клеточной и тканевой трансплантологии» (Уфа, 2012); Всероссийской научно-практической конференции «Технологии оптимизации процесса репаративной регенерации в травматологии, ортопедии и нейрохирургии» (Саратов, 2013); XI Международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии» (Новосибирск, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения и выводов, иллюстрирована 4 таблицами и 21 рисунком. Библиографический указатель включает 194 источников, в том числе 162 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на базе лаборатории клеточных технологий ФГБУ «НИИКЭЛ СО РАМН», г. Новосибирск. В исследовании использованы клетки периферической крови от 72 пациентов (64 мужчины и 8 женщин) в возрасте от 37 до 76 лет, страдающих ИБС с III-IV функциональным классом ХСН по Нью-Йоркской классификации (NYHA), проходящих лечение в ФГБУ «ННИИ патологии кровообращения имени академика E.H. Мешалкина» МЗ РФ. (Новосибирск). От всех пациентов было

получено информированное согласие на проведение исследования.

Рекомбинантный человеческий G-CSF (Grasalva, Израиль) вводился подкожно в дозе 3,3 - 5,0 мкг/кг/сутки в течение 5 дней. МНК до и после мобилизации выделяли из сепарированной крови на градиенте плотности фиколла/верографина (р= 1,078 г/л).

Фенотип ЭПК исследовали на проточном цитометре FACSCantoII (Becton Dickinson, США) с использованием моноклональных антител меченых FITC, РЕ и АРС kCD34, CD45, CD133, рецептору к фактору роста эндотелия сосудов (VEGFR2), CD31, CXCR4, CD14 (Becton Dickinson, США). Иммуноцитохимическим методом исследовали экспрессию CD34 на поверхности клеточной мембраны МНК после мобилизации G-CSF. ГГролиферативную активность МНК крови исследовали в спонтанном и стимулированном тестах (Кон А - 5 мкг/мл; ЛПС - 10 мкг/мл (США)), в присутствии G-CSF (50 Ед/мл; Грасальва, Израиль) и Еро (33 Ед/мл; Рекор-мон, США) спектрофотометрически по включению 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида (МТТ).

Уровень продукции TNF-a, IL-8, IL-10, IL-18, VEGF, Еро и G-CSF в кондиционных средах (КС) культур МНК, ЭПК и клеточных линий определялся с помощью иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора ЗАО «Векгор-Бест», Россия.

Культура ЭПК была получена из МНК, мобилизованных введением G-CSF, от пациентов с ХСН. МНК культивировали в эндотелиальной среде (EGM-2, Lonza, Switzerland) с 10% FCS (Биолот, Россия), 160 мкг/мл гентамицин сульфата (Дальхимфарм, Россия), 2 ммоль L-глютамина (ICN, США) в культуральных флаконах, предварительно обработанных фибро-нектином (Sigma-Aldrich, США) и желатином (Мосхимфармпрепараты, Россия). Через 48 часов адгезивные клетки культивировали в течение 8 и 16 суток для получения культуры «ранних» и «поздних» ЭПК.

Клетки эндотелиальной линии ЕА.Ну926 были любезно предоставлены Dr. C.J. Edgel (Университет Каролины, США). Культивирование клеток ЕА.Ну926 проводили в питательной среде DMEM/F12 (Биолот, Россия) в присутствии гипоксантина, аминоптерина и тимидина (ICN, США). КС ЭПК и клеток ЕА.Ну926 получали от 72 часовой культуры, хранили при -70°С до использования.

Пролиферативную и миграционную активность культуры ЭПК и клеток ЕА.Ну926 изучали на аппарате xCELLigence System (Roche, США). Оценивали уровень пролиферативной активности: 1) культур ЭПК при добавлении КС (30% от общего объема лунки) от клеток ЕА.Ну926, G-CSF (Грасальва, Израиль; 300 мкг/мл), VEGF (BioVision, США; 10 нг/мл), Еро (Рекормон, Германия; 33,4 МЕ/мл); 2) клеток ЕА.Ну926 при добавлении КС от культур ЭПК и Еро. В двухуровневых камерах изучали миграцию культур ЭПК при добавлении КС от клеток ЕА.Ну926; и клеток ЕА.Ну926 под влиянием КС от культур ЭПК, Еро, VEGF, TNF-a (Sigma-Aldrich, США; 5 нг/мл).

Горизонтальную миграцию клеток ЕА.Ну926 изучали при добавлении КС от культуры ЭПК путем десквамации конфлюэнтного монослоя клеток с помощью прибора Cell-IQ (CM Technologies Ltd., Финляндия). Изображения фиксировались каждые 15 минут в течение 24 часов.

Продукцию NO в КС определяли с помощью реактива Грисса, измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при 540 нм.

Полученные результаты исследования статистически обрабатывали с использованием программы Statistica 6,0 for Windows (StatSoft, США). Полученные данные проверяли на нормальность распределения согласно критериям Колмогорова-Смирнова, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Me), нижним (LQ) и верхним (HQ) квартилями. Достоверность различий оценивали по критериям Манна-Уитни (в независимых группах). Наличие взаимосвязей между явлениями устанавливали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (R). Различия считали достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Фенотипическая характеристика ЭПК, мобилизованных G-CSF от пациентов с ХСН. Нами установлено, что у пациентов с ХСН в периферической крови до проведения процедуры мобилизации G-CSF содержится незначительное количество ЭПК, за исключением циркулирующих зрелых эндотелиальных клеток с фенотипом CD34-/CD31+ и CD34-/VEGFR2+, CD 14-/VEGFR2+, а также ЭПК моноцитарного происхождения с фенотипом CD 14+/VEGFR2+ (табл. 1).

Выявлено статистически значимое возрастание количества популяций ЭПК с фенотипом CD34+, CD34+/CD133+ и CD34+/VEGFR2+. Относительное количество CD34-/CD133+ клеток, представляющих собой самую незрелую популяцию анализируемых ЭПК, статистически значимо увеличивается в 16 раз после мобилизации G-CSF по сравнению с популяцией клеток CD34+/CD133+, которые являются более зрелыми ЭПК (р<0,05). Выявлено статистически значимое увеличение пула циркулирующих зрелых эндотелиальных клеток с фенотипом CD34-/VEGFR2+ в 10 раз по сравнению с количеством зрелых ЭПК с фенотипом CD34+/VEGFR2+ (р<0,02). Показано статистически значимое увеличение количества зрелых ЭПК с фенотипом CD34+/CD31+ и циркулирующих зрелых эндотелиальных клеток с фенотипом CD34-/CD31+ после мобилизации G-CSF. В процессе мобилизации статистически значимо возрастает количество ЭПК моноцитарного происхождения с фенотипом CD14+/VEGFR2+.

Иммуноцитохимическое исследование показало наличие экспрессии на поверхности клеточной мембраны CD34 МНК после мобилизации G-CSF.

Таким образом, у пациентов с хронической сердечной недостаточностью в процессе мобилизации отмечено увеличение количества различных популяций ЭПК разной степени зрелости.

Фенотип ЭПК Количество клеток (в %; Ме; Ь<3-НС>)

в периферической крови до мобилизации в-СБР в периферической крови после мобилизации СЗ-СБР

1. СБ34+ 0,01 (0,01-0,07) 0,425 (0,25-0,64) р„= 0,000024

2. С034+/СБ133+ 0,01 (0,01-0,01) 0,025 (0,01-0,04) р„=0,01

3. С034-/С0133+ 0,1 (0,05-0,1) 0,4 (0,05-0,6) р„=0,0039

4. СБЗ4+/УЕОРН2+ 0,01 (0,01-0,02) 0,095 (0,08-0,1) р„=0,004

5. СБ34-/УЕСРК,+ 0,275 (0,175-0,6) 0,95 (0,85-1,1) р,=0,004

6. С034+/СБЗ1+ 0,1 (0,05-0,28) 0,28 (0,04-0,3) Р„=0,02

7. СБ34-/С031+ 15,9 (12,3-30,0) 18,0(13-32) р„=0,04

8. С014-/УЕСРЯ,+ 0,615(0,415-2,425) 2,9(1,35-5,35)

9. С014+/УЕСР112+ 0,7 (0,1-3,9) 3,8 (0,13-6,3) р„=0,003

Исследование функциональной активности МНК, содержащих обогащенную фракцию ЭПК, полученных в ходе процедуры мобилизации С-СБГ от пациентов с хронической сердечной недостаточностью.

Изучение пролиферативной активности показало, что после процедуры мобилизации в-СЗБ как в спонтанных условиях, так и при стимуляции митогенами и цитокинами, происходит увеличение пролиферации МНК по сравнению с аналогичными показателями до процедуры мобилизации О-СБР (р<0,05). Причем с увеличением количества сЬ34+ ЭПК возрастает пролиферативная активность МНК, что говорит о вовлечении в пролиферативный ответ данной популяции клеток. Кроме того, проли-феративный потенциал подтверждает увеличение колониеобразующей активности МНК, обогащенных ЭПК, пациентов с ХСН после процедуры мобилизации в-СБР в виде увеличение количества КОЕ в 63 раза (р<0,01).

Выявлено, что у пациентов с ХСН после курса мобилизации в-СБР увеличивается количество ЭПК с фенотипом СЮ34+, экспрессирующих на своей поверхности хоуминг-рецептор СХС!^, с 132х103/л, до 1,06х106/л (р=0,04), что отражает способность данной популяции ЭПК к миграции в места ишемии и вероятность встраивания клеток в поврежденный миокард.

Цитокиновый профиль МИК, обогащенных ЭПК, в ходе мобилизации С-С8Р от пациентов с ХСН. Было выявлено, что МНК после мобилизации С-СБР продуцируют регуляторные цитокины и ростовые факторы как спонтанно, так и в ответ на различные стимулы (табл. 2).Установлено статистически значимое увеличение спонтанной продукции 1Ь-18, УЕСБ, Еро и сохранность продукции 1Ь-10,1Ь-8 в процессе мобилизации. С другой стороны, уровень ТКР-а и в-СБР статистически значимо снизился по сравнению с продукцией до введения в-СЗР. Ранее нами показана сопряженность секреторного уровня МНК ТЫР-а, Еро и вМ-СБР и перфузии миокарда у пациентов с ХСН (Коненков В.И., 2011).

Таблица 2. Показатели уровней цитокинов и ростовых факторов в кондиционных средах от МНК, обогащенных ЭПК, до и после завершения процедуры мобилизации С-СвР у пациентов с ХСН (п=35)

Уровни продукции (Ме; ь<3-нд) Тип продукции

Спонтанная Кон А ЛПС й-СЗР Еро

ЮТ-а (пг/мл) до 102 (100-175,6) 420 (172-1376) 644 (405-900) 80,5 (55-110) 100 (99-101)

после 33 (23-85) р„ =0,0003 278 (188-738) ри=0,59 240 (130-370) ри=0,14 425 (208-888) р„=0,002 990 (792-1298) р„=0,0007

1Ь-10 (пг/мл) до 67,7 (57,1-101) 570,6 (101-745,9) 534,7 (345-694) 525 (338-650) 294,5 (189-300)

после 72 (22-102) Ри =0,72 484,6 (101748,3) Ри =0,47 680,3 (102-119,6) ри=0,75 1294 (990-1520) ри=0,001 895 (790-1190) ри=0,001

11.-18 (пг/мл) до 33 (18-102) 58 (50-64,5) 39,2 (36-40) 181 (167-198) 399 (212-415)

после 103 (67-135,5) р„=0,034 197 (102-374,8) Р„ =0,017 147,2 (102-256) рИ=0,0004 235 (113-274) ри=0,4 190,5 (104-227,8) рИ=0,05

1Ь-8 (пг/мл) до 732,9 (103-965) 1550 (147-4450) 1425 (120-4000) 3115 (2980-3345) 3840 (2890-4160)

после 735,7 (103-822,5) Ри=0,31 740,2 (420-4805) р =0,09 735 (350-4065) ри=0,14 1729 (357-3586) Ри =0,17 1578 (348-3100) ри=0,008

Еро (МЕ/ мл) до 27 (17,8-101) 215,7 (161,4-277) 234,8 (171,9-240) 90 (80-101) 2085 (237-2350)

после 102 (35,6-306,5) р„=0,008 213,5 (130-289) р„=0,67 162,5 (129-222,6) ри =0,63 176,5 (132-201) р„=0,05 1671,5 (1267-1896) ри=0,4

С-СБР (пг/мл) до 13 (10-101) 135,5 (127-165) 16,1 (15-18) 9,5 (8,5-11) 8,5 (7,8-10,5)

после 11 (10-30,2) Ри=0,3 967 (769-1010) ри=0,0007 940 (763-3332) р„=0,0007 986 (815-3680) ра=0,006 865,5 (586-3660) р„=0,0007

УЕвР (пг/мл) до 256 (102-450) 293,5 (256-300) 448 (432,7-458,4) 172,9 (156,3-180) 253,4 (219,6-270)

после 298 (113-340) р„=0,03 300 (287,5-339,5) р„=0,01 386,7 (211,5-470) рц=0,09 298 (240,5-389) р„=0,001 327 (278-492) рц=0,03

Примечание: рц - достоверность различий по сравнению с показателями продукции цитокинов и ростовых факторов до введения 0-С5Р (и- критерий Ман-на-Уитни).

В то же время обнаружено статистически значимое увеличение продукции IL-8, VEGF и G-CSF в ответ на митогенный стимул КонА и снижение продукции IL-8, по сравнению с показателями продукции до проведения мобилизации. В ответ на ЛПС наблюдается статистически значимое увеличение продукции МНКIL-18 и G-CSF и снижение продукции TNF-a по сравнению с уровнем продукции до мобилизации G-CSF.

Кроме того, добавление в культуру проангиогенных цитокинов G-CSF или Еро приводит к статистически значимому увеличению продукции TNF-a, IL-10, VEGF и G-CSF. Это свидетельствует не только о возможных паракринных воздействиях, но и аутокринном влиянии указанных цитокинов, продуцируемых МНК. ЭПК вносят вклад в продукцию указанных цитокинов. Так, нами показано, что введение G-CSF приводит к мобилизации в периферическую кровь различных популяций стволовых клеток - гемопоэтических, эндотелиальных, мультипотентных мезенхимальных, функциональная активность которых обусловлена секрецией цитокинов (Коненков В.И., 2011).

Таким образом, установлено, что МНК, обогащенные ЭПК, обладают высокой пролиферативной активностью, способны к осуществлению хоуминга и продуцируют широкий спектр цитокинов, в том числе с про-ангиогенным действием, которые могут вносить существенный вклад в аутокринный и паракринный эффекты ЭПК на процессы

Изучение взаимосвязей количества циркулирующих ЭПК, мобилизованных G-CSF, с продукцией цитокинов и ростовых факторов. Нами установлено наличие высокой и прямой взаимосвязи между количеством в периферической крови у пациентов с ХСН после мобилизации G-CSF ЭПК с фенотипом CD34-/CD133+ и уровнем TNF-a (R=0,729; р=0,02); между количеством CD34+/VEGFR2- и CD34+/VEGFR2 ЭПК и продукцией IL-18 (R=0,7; р=0,03 и R=0,82; р=0,01; соответственно). Уровень секреции Еро имел высокую и прямую сопряженность с количеством ЭПК с фенотипом CD34-/VEGFR2+, а продукция VEGF взаимосвязана с количеством ЭПК с фенотипом CD34+/CD31+. Также установлена высокая и прямая сопряженность количества ЭПК с фенотипом CD34-/CD31+ с продукцией IL-10 (R=0,9; р=0,03). Таким образом, можно предположить, что клетки практически всех анализируемых фенотипов (CD34-/CD133+, CD34+/ VEGFR2-, CD34+/VEGFR2, CD34-/VEGFR2+, CD34+/CD31+, CD34-/CD31) принимают активное участие в продукции цитокинов, обладающих выраженной проангиогенной активностью.

Многими авторами показано, что циркулирующие в периферической крови ЭПК способны дифференцироваться in vitro в два типа ЭПК («ранние» и «поздние») (Hill J., 2003; Yoder М.С., 2007; Timmermans F., 2009). В связи с этим необходимо было исследовать способность ЭПК пациентов с ХСН образовывать культуры эндотелиальных клеток in vitro.

Получение культуры ЭПК из МНК после мобилизации G-CSF от пациентов с ХСН. Показана способность МНК, с учетом предобработки

Рис. 1. Морфология адгезировавшей фракции МНК, полученных от пациентов с ХСН после курса мобилизации G-CSF (х10) (п=6).

а - монослой клеток на 14 сутки; б - кластеры ЭПК; в - выстраивание ЭПК в тубу-лоподобные линии на 21 сутки; г - активно пролиферирующие ЭПК на 21 сутки; д- морфология ЭПК на 27 сутки культивирования in vitro"

культуральных флаконов адгезионными белками межклеточного матрикса фибронектином и желатином, дифференцироваться в те или иные типы ЭПК.

Установлено, что до 10-го дня культивирования МНК адгезируют к поверхности флакона и к 14 дню формируют монослой, преимущественно состоящий из мелких округлых и слабо пролиферирующих клеток (рис. 1, а). Кроме этого, к 14-м суткам отмечено появление кластеров ЭПК, а затем и колоний (рис. 1, б). Затем к 21-м суткам культивирования ЭПК приобретают веретенообразную форму и выстраиваются в тубулоподоб-ные структуры, что свидетельствует о способности данных клеток к со-судообразованию (рис. 1, в).

Далее при культивировании МНК отмечается увеличение плотности клеток, что свидетельствует об активном высоком пролиферативном потенциале данных клеток (рис. 1, г). В период на 30 - 60 сут культивирования ЭПК сохраняли высокий пролиферативный потенциал. В эти сроки ЭПК претерпевали морфолог ические изменения, становились распластанными и приобретали вид «глыбчатой мостовой», что является морфологической характеристикой принадлежности такого типа клеток к ЭПК (рис. 1, д).

Таким образом, в периферической крови пациентов с ХСН по завершению курса мобилизации G-CSF подтверждено наличие МНК, дающих начало росту ЭПК.

Рис. 2. Показатели пролиферативного потенциала: а) культуры ЭПК, мобилизованных в-СБР от пациентов с ХСН; б) клеток эндотелиальной линии ЕА.Ну926 (п=8). а: красная линия (1) — спонтанная пролиферация; зеленая линия (2) — пролиферация в присутствии УЕвР; синяя линия (3)- пролиферация в присутствии розовая

линия (4) - пролиферация в присутствии ЭПО; голубая линия (5) - пролиферация в присутствии 30% КС от эндотелиальной линии ЕА.Ну926; по оси абсцисс - клеточный индекс; по оси ординат - время (в часах), б: красная линия (1) - спонтанная пролиферация; зеленая линия (2) - пролиферации в присутствии Еро; синяя линия (3) - пролиферации в присутствии 30% кондиционной среды от ЭПК мобилизованных С-С8 Р.

Исследование функциональной активности культуры ЭПК периферической крови после курса мобилизации С-С8К от пациентов с ХСН. Показано, что пролиферация ЭПК культуры, полученной после мобилизации О-СВР от пациентов с ХСН, статистически значимо увеличивается к 4-му часу эксперимента в присутствии КС от клеток ЕА.Ну926 (КИ-0,26; р=0,01) по сравнению со спонтанной пролиферацией ЭПК (КИ=0,19). Надо отметить, что КС от клеток ЕА.Ну926 оказывает большее стимулирующее воздействие на пролиферацию, чем такие известные ангиогенные факторы, как У БОР. 0-С8Р, Еро (КИ=0,22; 0,24; 0,25 соответственно).

На более длительных сроках наблюдения установлено, что наибольшим стимулирующим эффектом на пролиферацию ЭПК обладали КС клеток ЕА.Ну926 (КИ=0,3; р=0,02) и Еро (КИ=0,28; р=0,03) (рис. 2, а). С другой стороны, КС, содержащая продукты секреции ЭПК от пациентов с ХСН, также статистически значимо увеличивает пролиферацию клеток эндотелиальной линии ЕА.Ну926 (КИ=0,7; р=0,01) в сравнении со спонтанной пролиферацией (КИ=0,1), что сопоставимо с влиянием на пролиферацию Еро (КИ=0,8; р=0,02) (рис. 2, б).

Помимо пролиферации, важной функциональной характеристикой ЭПК является способность к миграции, в том числе в ишемизированные ткани. Поэтому следующим этапом стало изучение миграции ЭПК куль-.тур пациентов и клеток эндотелиальной линии ЕА.Ну926 под влиянием цитокинов и ростовых факторов.

Так, установлено, что КС от клеток эндотелиальной линии ЕА.Ну926 увеличивает миграционную активность культуры ЭПК к 4 часу экспери-

41 1—'—»—>—-—■—.—!—1—.—<—_,_. I ... ; ... I

Н " М Я1 М Я» X» ю и ад № XI ю

Рис. 3. Показатели миграционной активности: а) культуры ЭПК, мобилизованных О-СЗр от пациентов с ХСН; б) клеток эндотелиальной линии Еа.Ну926 (п=8). а: красная линия - спонтанная миграция; зеленая линия - миграция в присутствии 30% КС от эндотелиальной линии ЕА.Ну926; по оси абсцисс - клеточный индекс; по оси ординат - время (в часах), б: красная линия - спонтанная миграция; зеленая линия - миграция в присутствии УЕСР: синяя линия - миграция в присутствии ™ Р-а; розовая линия - миграция в присутствии Еро; голубая линия - миграция в присутствии 30% КС от ЭПК мобилизованных С-С8Р.

мента (КИ=0,05; р=0,01) по сравнению со спонтанной активностью ЭПК (КИ=0,001) (рис. 3, а). Максимального уровня миграционная активность ЭПК достигает к 12 часам эксперимента. Клетки эндотелиальной линии ЕА.Ну926 к 4-му часу эксперимента статистически значимо быстрее мигрируют в присутствии КС от культуры ЭПК (КИ=0,56; р=0,01) по сравнению со спонтанной миграцией (КИ=0,26). В данном случае Еро и \ТЮР не оказывают влияния на миграцию ЕА.Ну926 (КИ=0,3 и КИ=0,27 соответственно) (рис. 3, б). На последующих сроках эксперимента отмечено статистически значимое увеличение миграции клеток ЕА.Ну926 в присутствии КС от ЭПК (КИ=1,4; р=0,01) и Еро (КИ=1,3; р=0,02), достигавшее максимального стимулирующего эффекта этих веществ к 24 часам эксперимента.

Нами исследован паракринный эффект биологически активных веществ, содержащихся в КС ЭПК от пациентов с ХСН, на горизонтальную миграцию клеток эндотелиальной линии ЕА.Ну926 в режиме реального времени. Выявлено, что клетки эндотелиальной линии ЕА.Ну926 к 48 часам эксперимента закрывают бесклеточную поверхность до 70% от исходных значений. В то же время, площадь закрытия бесклеточной поверхности в присутствии 30% КС от ЭПК пациентов с ХСН достигает 90%. Причем под действием КС от культуры ЭПК клетки ЕА.Ну926 более активно мигрируют в зону повреждения уже в первые часы эксперимента и к 6-му часу эксперимента покрывают до 45% площади бесклеточной поверхности.

Таким образом, ЭПК стимулируют пролиферацию и миграцию зрелых эндотелиальных клеток (на примере эндотелиальной линии ЕА.Ну926), и в свою очередь зрелые эндотелиальные клетки способствуют пролиферации и миграции ЭПК путем паракринного механизма.

Исследование цитокинового профиля культур «ранних» и «поздних» ЭПК периферической крови после курса мобилизации G-CSF от пациентов с ХСН. Исследования ряда авторов показали, что два вида ЭПК («ранние» и «поздние») различаются как морфологически, так и функционально, в частности, по продукции цитокинов и ростовых факторов, и тем самым вносят различный вклад в развитие сосудистой сети (Hur J., 2003; Urbich С., 2005; Sugiyama T., 2006).

Нами показано, что ЭПК от пациентов с ХСН в культуре продуцируют ряд цитокинов и ростовых факторов с учетом культивирования на разных адгезионных белках внеклеточного матрикса и сроках культивирования.

Так, ЭПК при культивировании на фибронектине к 8-м суткам (культура представлена «ранними» ЭПК) продуцируют широкий спектр цитокинов и ростовых факторов, таких как TNF-a (10 пг/мл), IL-10, (668,7 пг/мл), IL-18 (612 пг/мл), IL-8 (4442 пг/мл), Еро (132,5 мМЕ), G-CSF (10 пг/мл), VEGF (536,7 пг/мл) (рис. 4, а). На более поздних сроках культивирования, когда в культуре ЭПК появляются «поздние» ЭПК (16 сутки) отмечено, что продукция большинства цитокинов и ростовых факторов, принимающих участие на разных этапах ангиогенеза, статистически значимо снижается IL-10 (320 пг/мл; р=0,05), IL-18 (95 пг/мл; р=0,003), IL-8 (1040 пг/мл; р=0,003), Еро (5 мМЕ; р=0,003), VEGF (255 пг/мл; р=0,004), но в тоже время продукция провоспалительного цитокина TNF-a (10,5 пг/мл) и G-CSF (10 пг/мл) остается на том же уровне. Что же касается культуры ЭПК, культивировавшихся на желатиновой основе, то к 8 суткам (культура представлена «ранними» ЭПК) продукция цитокинов и ростовых факторов ими составила TNF-a (297 пг/мл) и Еро (900 мМЕ), что выше по сравнению с культурой ЭПК, культивировавшихся на фибронектине (рис. 4, б).

В то же время продукция таких цитокинов и ростовых факторов, как IL-10 (11 пг/мл), IL-18 (7,5 пг/мл) IL-8 (520 пг/мл), G-CSF (10 пг/мл), VEGF (107 пг/мл), была снижена по сравнению с продукцией аналогичных биоактивных веществ культурой ЭПК, культивировавшихся на фибронектине. С увеличением срока культивирования к 16-м суткам на желатине и появлением в культуре «поздних» ЭПК отмечается снижение продукции TNF-a (66 пг/мл; р=0,004), IL-8 (205 пг/мл; р=0,003), Еро (155,5 пг/мл; р=0,004), при этом сохраняется на прежнем уровне продукция G-CSF ( 10 пг/мл). В то же время, статистически значимо увеличивается продукция IL-10 ( 147,5 пг/ мл; р=0,01), IL-18 (178 пг/мл; р=0,04) и VEGF (171 пг/мл; р=0,02) по сравнению с продукцией данных цитокинов и ростовых факторов «ранними» ЭПК (рис. 4, б). «Ранние» и «поздние» ЭПК способствуют неоангиогенезу за счет синергичного взаимодействия между собой, обеспечивая сосудоо-бразование и перфузию в ишемизированной ткани (Yoon С.Н., 2005).

Кроме того, эндотелиальные клетки характеризуются продукцией стойких метаболитов NO- вазодилататора, который повышает проницаемость эндотелия сосудов, способствуя тем самым миграции клеток из кровеносного русла в ткани, что необходимо для ангиогенеза.

4000

3500 3000

2500

2000

I a

с

4500

* 8 сутки сутки

1500

1000 500 0

52 8 СУТКИ

■ 16 сутки

Рис. 4. Уровни продукции цитокинов и ростовых факторов ЭПК в разные сроки (п=8): а) культивированные нафибронектине, б) культивированные на желатине.

Примечание: * - достоверность различия параметров на 8- и 16-е сутки культивирования ЭПК (U - критерий Манна-Уитни).

Показано, что ЭПК, культивировавшиеся на фибронектине, к 16-м суткам статистически значимо снижают уровень продукции NO (р<0,01). В то время как для ЭПК, культивированных на желатине, характерно увеличение уровня продукции NO к 16-м суткам (р<0,01). Полученные данные свидетельствуют о том, что на желатине культура в большей степени представлена «поздними» ЭПК, которые за счет увеличенной продукции NO лучше мигрируют в ткани и напрямую участвуют в анги-огенезе (Hamed S., 2011).

Так, спектр продукции биологически активных веществ, в том числе цитокинов и ростовых факторов, зависит от сроков и условий культивирования ЭПК.

Подводя итог; можно сделать вывод о том, что МНК, полученные от пациентов с ХСН после мобилизации G-CSF, характеризуются высокой функциональной активностью, способны in vitro давать начало культуре ЭПК, клетки которой также активно пролиферируют, мигрируют и продуцируют спектр биологически активных веществ. Таким образом, и циркулирующие ЭПК и ЭПК, выращенные in vitro, можно использовать для трансплантации пациентам с ХСН в целях регенерации поврежденного миокарда.

ВЫВОДЫ

1. У пациентов с хронической сердечной недостаточностью введение гранулоцитарного колониестимулирующего фактора приводит к увеличению количества клеток с фенотипами CD34+/CD45+, CD34+/CD133+ CD34+/VEGFR,+, CD1 33+/CD34-, CD34+/CD3 1+, VEGFR-,+/CD34-' CD31+/CD34-, CD 14+/VEGFR2+, VEGFR2+/CD14-, что свидетельствует о

выходе в периферическое русло эндотелиальных прогениторных клеток, находящихся на различных этапах дифференцировки и созревания.

2. Эндотелиальные прогениторные клетки, мобилизованные грануло-цитарным колониестимулирующим фактором в периферическое русло у пациентов с хронической сердечной недостаточностью, характеризуются увеличением пролиферативного потенциала, на различные стимулы, ко-лониеобразующей активности, миграции и продукции широкого спектра цитокинов и ростовых факторов по сравнению с исходными показателями их функциональной активности.

3. Эндотелиальные прогениторные клетки, мобилизованные грануло-цитарным колониестимулирующим фактором в периферическое русло у пациентов с хронической сердечной недостаточностью, при культивировании in vitro на адгезионных белках с увеличением срока культивирования имеют различный функциональный потенциал по продукции цитокинов и ростовых факторов, что позволяет условно разделить их на популяции «ранних» и «поздних» эндотелиальных прогениторных клеток.

4. Продукты секреции эндотелиальных прогениторных клеток статистически значимо стимулируют пролиферативный и миграционный потенциал клеток эндотелиальной линии человека ЕА.Ну926, а продуцируемые клетками эндотелиальной линии ЕА.Ну926 биоактивные вещества, в свою очередь, статистически значимо увеличивают пролиферацию и миграцию эндотелиальных прогениторных клеток, что свидетельствует о наличии аутокринного и паракринного эффектов в регуляции в этих клеточных популяциях.

5. Эндотелиальные прогениторные клетки, мобилизованные грану-лоцитарным колониестимулирующим фактором в периферическое русло у пациентов с хронической сердечной недостаточностью, представляют собой гетерогенную популяцию клеток, находящихся на разных стадиях дифференцировки, характеризующихся высокой пролиферативной, миграционной и цитокинпродуцирующей активностью, и потенциально могут использоваться для стимуляции репарации и регенерации поврежденных сосудов.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Кон А - конканавалин А

КС - кондиционная среда

ЛПС - липополисахарид

МНК - мононуклеарные клетки

ХСН - хроническая сердечная недостаточность

ЭПК — эндотелиальная прогениторная клетка

CXCR4 - хемокиновый рецептор 4 типа к SDF-1

Еро — эритропоэтин

G-CSF - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

NO — оксид азота

SDF-1 - стромальный фактор роста-1

TNF-a - фактор некроза опухоли

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

VEGFR2 - рецептор к фактору роста эндотелия сосудов

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коненков В.И., Повещенко О.В., Ким И.И., Покушалов Е. А., Романов А.Б., Гульева H.A. (Бондаренко H.A.), Бернвальд В.В., Шевченко A.B., Голованова О.В., Янкайте Е.В., Повещенко А.Ф., Караськов A.M. Влияние G-CSF на проангиогенные свойства мобилизированных клеток периферической крови у больных с хронической сердечной недостаточностью // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2011. - Т. 6, № 3. - С. 71-75.

2. Коненков В.И., Покушалов Е.А., Повещенко О.В., Ким И.И., Романов А.Б., Гульева H.A. (Бондаренко H.A.), Бернвальд В.В., Соловьева А.О., Янкайте Е.В., Повещенко А.Ф., Караськов A.M. Характеристика фенотипа мобилизованных гранулоцитарным колониестимулирующим фактором периферической крови у больных с хронической сердечной недостаточностью // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2012.-№ 1.-С. 9-13.

3. Гульева H.A. (Бондаренко H.A.), Повещенко О.В., Ким И.И., Бернвальд В.В., Янкайте Е.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Повещенко А.Ф., Коненков В.И. Характеристика проангиогенных свойств мононуклеарных клеток периферической крови после введения гранулоцитарного колони-естимулирующего фактора у пациентов с ишемической болезнью сердца // Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии: X Международная конференция. - Новосибирск, 2011. - С. 125-126.

4. Ким И.И., Повещенко О.В., Коненков В.И., Покушалов Е. А., Романов А.Б., Бондаренко H.A., Повещенко А.Ф., Сергеевичев Д.С., Караськов A.M. Эффективность мобилизации CD34+ прогениторных клеток препаратом g-G-CSF в зависимости от ишемического анамнеза и возраста больных с хронической сердечной недостаточностью // Патология кровообращения и кардиохирургия. - 2012. - № 1. - С. 75-78.

5. Бондаренко H.A., Повещенко О.В., Ким Н.И., Хабаров Д.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Повещенко А.Ф., Коненков В.И. Влияние криоконсервирования на количество эндотелиальных прогениторных клеток периферической крови после мобилизации гранулоцитарным колониестимулирующим фактором у пациентов с ишемической болезнью сердца // Вестник Уральской медицинской академической науки. -2012.-№4(41).-С. 18-19.

6. Повещенко О.В., Ким И.И., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Бондарен-ко H.A., Повещенко А.Ф., Караськов A.M., Коненков В.И. Клеточные лим-фотропные технологии реабилитации пациентов с хронической сердечной недостаточностью // Профилактическая и восстановительная медицина: Материалы научных советов ЦЭЭР. - Новосибирск, 2012. - С. 43-58.

7. Повещенко О.В., Ким И.И., Бондаренко H.A., Хабаров Д.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Повещенко А.Ф., Коненков В.И. IL-10 и TNF-a после мобилизации гранулоцитарным колониестимулирующим фактором у пациентов с ишемической болезнью сердца // Вестник Уральской медицинской академической науки. -2012. - № 4 (41). - С. 148-149.

8. Лыков А.П., Повещенко О.В., Бондаренко H.A., Повещенко А.Ф., Ким И.И., Миллер Т.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Коненков В.И.Оценка эффекта проангиогенных факторов на пролиферативную и миграционную активность клеток эндотелиальной линии ЕА.Ну926 // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. - 2013. -Т. 33, № 4. - С. 23-29.

9. Гульева H.A. (Бондаренко Н.А,), Ким И.И., Повещенко О.В., Берн-вальд В.В., Повещенко А.Ф., Колесников А.П., Янкайте Е.В., Хабаров Д.В., Комбанцев Е.А., Смагин A.A., Романов А.Б., Покушалов Е.А., Коненков В.И. Возможности аутологичной клеточной терапии ишемической сердечной недостаточности II Стволовые клетки и регенеративная медицина: Сборник тезисов Всероссийской научной школы-конференции. — Москва, 2010.-С. 24-25.

10. Повещенко О.В., Ким И.И., Бондаренко H.A., Янкайте Е.В., Хабаров Д.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Сергеевичев Д.С., Повещенко А.Ф., Коненков В.И. Проангиогенные свойства мобилизованных клеток периферической крови у пациентов с ишемической болезнью сердца // Стволовые клетки и регенеративная медицина: сборник тезисов IV Всероссийской научной школы-конференции. — Москва, 2011. - С.64-65.

11. Бондаренко H.A., Повещенко О.В., Ким И.И., Повещенко А.Ф., Хабаров Д.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Караськов A.M., Коненков В.И. Влияние криоконсервации на фенотип прогениторных клеток периферической крови после мобилизации гранулоцитарным колониестимулирующим фактором у пациентов с ишемической болезнью сердца // Актуальные вопросы клеточной и тканевой трансплантологии: Сборник тезисов V Всероссийского симпозиума с международным участием. -Уфа, 2012.-С. 228-229.

12. Бондаренко H.A., Лыков А.П., Ким И.И., Повещенко О.В., Повещенко А.Ф., Коненков В.И. Изучение пролиферативного потенциала стволовых/прогениторных клеток, мобилизованных введением Г-КСФ, у больных с ИБС в режиме реального времени на приборе XCelligence // Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: Сборник тезисов III международной научно-практической конференции. - Казань, 2012. - С. 198-199.

13. Бондаренко H.A., Лыков А.П., Ким И.И., Повещенко О.В., Пове-щенко А.Ф., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Коненков В.И. Исследование пролиферации и миграции стволовых/прогениторных клеток, мобилизованных введением Г-КСФ, от больных с ишемической болезнью сердца // Технологии оптимизации процесса репаративной регенерации в травматологии, ортопедии и нейрохирургии: Сборник тезисов Всероссийской научно практической конференции. - Саратов, 2013. - С. 74.

14. Бондаренко H.A., Лыков А.П., Ким И.И., Повещенко О.В., Повещенко А.Ф., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Коненков В.И. Исследование пролиферации и миграции стволовых/прогениторных клеток, мобилизованных введением Г-КСФ больных с ишемической болезнью сердца и клеток эндотелиальной линии ЕА.Ну926 // Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии: Сборник тезисов XI международной конференции. - Новосибирск, 2013. - С. 50-53.

15. Лыков А.П., Бондаренко H.A., Ким И.И., Повещенко О.В., Повещенко А.Ф., Янкайте Е.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Коненков В.И. Сравнительная оценка цитокинпродуцирующей активности эндотелиаль-ных прогениторных клеток и зрелых эндотелиальных клеток человека // Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии: Сборник тезисов XI международной конференции. - Новосибирск, 2013. - С.

Подписано в печать 25.10.2013. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 1,0.

_Тираж 100 экз. Заказ № 80.

Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 306-67-39

181-184.

Соискатель

Н.А.Бондаренко

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бондаренко, Наталья Анатольевна, Новосибирск

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

04201451433 На правах рукописи

БОНДАРЕНКО Наталья Анатольевна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.И. Коненков

доктор медицинских наук А.Ф. Повещенко

Новосибирск - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава I. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ

ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТКАХ...........14

1.1. Васкулогенез и ангиогенез, как механизмы образования

новой сосудистой сети......................................................14

1.2. Фенотипическая характеристика популяций циркулирующих эндотелиальных прогениторных клеток...............................16

1.3. Источники эндотелиальных прогениторных клеток.................19

1.4. Участие эндотелиальных прогениторных клеток в процессах неоваску ляризации..........................................................20

1.5. Функциональные свойства эндотелиальных прогениторных клеток..........................................................................24

1.5.1. Мобилизация эндотелиальных прогениторных клеток в периферическую кровь

1.5.2. Миграция и хоуминг эндотелиальных прогениторных

клеток из периферической крови в ткани...........................29

1.5.3. Цитокинпродуцирующая активность эндотелиальных прогениторных клеток...................................................30

1.6. Морфологическая характеристика «ранних» и «поздних» эндотелиальных прогениторных клеток in vitro.......................32

1.7. Изучение функциональных свойств эндотелиальных прогениторных клеток и эндотелиальных клеток in vitro...........33

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................39

2.1. Характеристика пациентов.................................................39

2.2. Мобилизация МНК периферической крови............................39

2.3. Фенотип мобилизованных МНК, обогащенных ЭПК................40

2.4. Иммунноцитохимическое исследование МНК, обогащенных ЭПК, мобилизованных введением G-CSF из костного мозга......40

2.5. Оценка пролиферативной активности МНК МТТ-тестом.........41

2.6. Исследование уровней цитокинов в кондиционных средах от

МНК, обогащенных ЭПК, и культур ЭПК после мобилизации....41

2.7. Получение культуры ЭПК из МНК после мобилизации G-CSF

от пациентов с ХСН.........................................................42

2.8. Культура клеток эндотелиальной линии ЕА.Ну926 человека......42

2.9. Оценка пролиферативной активности культуры

ЭПК, мобилизованной G-CSF, и клеток эндотелиальной линии ЕА.Ну926 на аппарате xCELLigence System.................43

2.10. Оценка миграционной способности культуры ЭПК, мобилизованной G-CSF, и клеток эндотелиальной линии ЕА.Ну926 на аппарате xCELLigence System.........................44

2.11. Оценка миграционной способности клеток эндотелиальной линии ЕА.Ну926 на аппарате Cell-IQ..................................44

2.12. Исследование продукции стойких метаболитов оксида азота

в кондиционной среде от культуры ЭПК..............................45

2.13. Статистическая обработка полученных результатов...............45

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Фенотипическая характеристика циркулирующих ЭПК, мобилизованных G-CSF, от пациентов с ХСН........................46

3.2. Исследование функциональной активности МНК, обогащенных ЭПК, полученных в ходе процедуры мобилизации G-CSF от пациентов с ХСН..............................52

3.2.1. Изучение пролиферативной активности МНК, обогащенных ЭПК, в ходе мобилизации G-CSF от пациентов с ХСН............52

3.2.2. Изучение экспрессии рецептора хоуминга CXCR4 на ЭПК

в ходе мобилизации G-CSF от пациентов с ХСН..................55

3.2.3. Цитокиновый профиль МНК, обогащенных ЭПК, в ходе мобилизации G-CSF от пациентов с ХСН...........................56

3.3. Изучение взаимосвязей количества циркулирующих ЭПК, мобилизованных G-CSF, с продукцией цитокинов и ростовых факторов.......................................................................58

3.4. Оценка способности МНК, мобилизованных G-CSF,

от пациентов с ХСН дифференцироваться в ЭПК in vitro.........61

3.5. Исследование функциональной активности культуры ЭПК периферической крови после курса мобилизации G-CSF от пациентов с ХСН............................................................65

3.6. Исследование цитокинового профиля культур «ранних» и «поздних» ЭПК периферической крови после курса мобилизации G-CSF от пациентов с ХСН..............................71

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.............................................................76

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................90

ВЫВОДЫ.........................................................................91

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................92

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

ГСК - гемопоэтическая стволовая клетка

ЗФР - забуференный физраствор

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИМ - инфаркт миокарда

КИ - клеточный индекс

КОЕ - колониеобразующая единица

Кон А - конканавалин А

КС - кондиционная среда

ЛПС - липополисахарид

ММП - матриксная металлопротеиназа

МНК - мононуклеарные клетки

мРНК- матричная рибонуклеиновая кислота

МТТ- 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид

ППС - полная посадочная среда

СПК - стволовая/прогениторная клетка

ХСН - хроническая сердечная недостаточность

ЭПК - эндотелиальная прогениторная клетка

CD - кластер дифференцировки

CXCR4 - хемокиновый рецептор 4 типа к SDF-1

eNOS - эндотелиальная синтаза оксида азота

Еро - эритропоэтин

FCS - фетальная телячья сыворотка

FGF- фактор роста фибробластов

G-CSF - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

HGF - фактор роста гепатоцитов

HIF-1- индуцированный гипоксией фактор-1

IGF-1 - инсулиновый фактор роста

IL - интерлейкин

LDL - липопротеины низкой плотности MCP - белок хемоаттрактант моноцитов N0 - оксид азота

NYHA - функциональная классификация хронической сердечной

недостаточности Нью-Йоркской ассоциации кардиологов

PSGL-1 - (Р-селектин лиганд гликопротеин-1)

SDF-1 - стромальный фактор роста-1

SCF-1 - фактор стволовых клеток-1

TGF-ß - трансформирующий фактор роста-ß

TNF-a - фактор некроза опухоли -а

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

VEGFR2 - рецептор к фактору роста эндотелия сосудов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Эндотелиальные прогениторные клетки (ЭПК) представляют собой уникальную популяцию клеток, которые, как и эмбриональные ангиобласты, способствуют формированию сосудов в постнатальном периоде как за счет ангиогенеза, так и путем васкулогенеза, когда в ответ на ангиогенные ростовые факторы ЭПК мигрируют из ниши костного мозга в кровеносное русло, циркулируют и трансформируются в тканях в локальные адгезивные ЭПК (Kawamoto А., 2003; Кескинов A.A., 2008; Плотников Е.Ю., 2009; Fadini G., 2008; Jiga J., 2013). Доступным источником аутологичных ЭПК является периферическая кровь после фармакологической мобилизации клеток костного мозга человеческим рекомбинантным гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (G-CSF) (Дыгай A.M., 2010; Румянцев С.А., 2010).

Участие ЭПК в неоваскуляризации обусловлено не только их способностью дифференцироваться в эндотелиальные клетки, участвуя в формировании новых сосудов, но и способностью продуцировать различные регуляторные ростовые факторы и цитокины, стимулирующие васкулогенез и ангиогенез (Kinnaird Т., 2004; Kim WS., 2013).

На сегодняшний день изучение ангиогенных свойств ЭПК осуществляется с использованием клеточных линий. Так, эндотелиальные клетки человека линии ЕА.Ну926 как морфологически, так и функционально отражают свойства зрелых эндотелиальных клеток, что позволяет оценить как влияние ЭПК на зрелые эндотелиальные клетки, так и влияние зрелых эндотелиальных клеток на ЭПК, моделируя взаимодействие различных популяций клеток в организме (Bauer J., Edgell С.J., 1992).

В экспериментальных моделях ишемии тканей показано стимулирующее действие ЭПК на формирование сосудистой сети как in vitro, так и in vivo (Rafíi S., 2003). Хотя ЭПК уже используются в клеточной терапии хронической сердечной недостаточности (ХСН), их свойства у

пациентов практически не изучены. В связи с этим необходимо более полное понимание биологических свойств используемых клеток у пациентов с ХСН.

Таким образом, представляется актуальным изучение функциональных свойств, таких как пролиферация, миграция, продукция проангиогенных факторов и способность стимулировать ангиогенез, различных популяций ЭПК пациентов с ХСН.

Цель исследования. Охарактеризовать морфологические и функциональные свойства циркулирующих эндотелиальных прогениторных клеток пациентов с ХСН, мобилизованных в периферическое русло введением G-CSF, и эндотелиальных клеток, выращенных in vitro.

Задачи исследования:

1. Оценить фенотип и морфологию циркулирующих и культивируемых ЭПК при ХСН.

2. Изучить спектр продукции цитокинов и ростовых факторов ЭПК до и после мобилизации в периферическое русло введением G-CSF и с учетом условий культивирования на различных адгезионных белках и сроках культивирования.

3. Выявить тип влияния биоактивных веществ, продуцируемых ЭПК, на функциональную активность (пролиферация, миграция) клеток эндотелиальной линии человека ЕА.Ну926.

4. Изучить влияние биоактивных веществ, продуцируемых клетками эндотелиальной линии человека ЕА.Ну926, на функциональную активность (пролиферация, миграция) ЭПК пациентов с ХСН.

Научная новизна. Впервые исследован популяционный состав и функциональная активность циркулирующих ЭПК, мобилизованных введением G-CSF, пациентов с тяжелой формой ХСН. Показано, что при мобилизации G-CSF клеток из костного мозга происходит увеличение количества различных популяций ЭПК, находящихся на разных стадиях дифференцировки.

Впервые показано, что у мобилизованных G-CSF мононуклеарных клеток (МНК), обогащенных ЭПК, отмечена высокая пролиферативная активность, способность к хоумингу, продукция широкого спектра цитокинов и ростовых факторов. Показано, что циркулирующие ЭПК различной степени зрелости пациентов с ХСН сопряжены с продукцией цитокинов и ростовых факторов, продуцируемых МНК.

Впервые установлено, что культура ЭПК, полученная из МНК, мобилизованных введением G-CSF при ХСН, характеризуется пролиферативной и миграционной активность. Показано, что «ранние» и «поздние» ЭПК in vitro обладают различной продуцирующей активностью цитокинов, ростовых факторов и оксида азота (N0). Впервые выявлены аутокринные и паракрин-ные взаимодействия ЭПК и зрелых эндотелиальных клеток.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты, полученные в ходе исследования влияния G-CSF на мобилизацию ЭПК из костного мозга пациентов с ХСН, расширяют представления о фенотипиче-ских и таких функциональных свойствах стволовых/прогениторных клеток (СПК), как пролиферация, миграция, продукция цитокинов и ростовых факторов.

Результаты диссертационной работы учитываются при комплексной терапии пациентов с ХСН в ФГБУ «ННИИ патологии кровообращения имени академика E.H. Мешалкина» МЗ РФ (Новосибирск). Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры анатомии, физиологии и безопасности жизнедеятельности ФГБОУ ВПО НГПУ (Новосибирск).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Введение G-CSF приводит к мобилизации из костного мозга пациентов с ХСН различных популяций ЭПК, находящихся на различных этапах дифференцировки.

2. МНК, обогащенные ЭПК, периферической крови и ЭПК, полученные in vitro, обладают высоким пролиферативным потенциалом и в процессе

дифференцировки секретируют целый ряд проангиогенных цитокинов и ростовых факторов.

3. ЭПК обладают аутокринным и паракринным регуляторным потенциалом.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010); X Международной конференции «Фундаментальные проблемы лим-фологии» (Новосибирск, 2011); VII научных чтениях, посвященных памяти академика РАМН Е.Н.Мешалкина (Новосибирск, 2011); IV Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2011); III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012); V Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы клеточной и тканевой трансплантологии» (Уфа, 2012); Всероссийской научно-практической конференции «Технологии оптимизации процесса репаративной регенерации в травматологии, ортопедии и нейрохирургии» (Саратов, 2013); XI Международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии» (Новосибирск, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 6

- в рецензируемых журналах по списку ВАК.

1. Коненков В.И., Повещенко О.В., Ким И.И., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Гульева H.A. (Бондаренко H.A.), Бернвальд В.В., Шевченко A.B., Голованова О.В., Янкайте Е.В., Повещенко А.Ф., Караськов A.M. Влияние G-CSF на проангиогенные свойства мобилизированных клеток периферической крови у больных с хронической сердечной недостаточностью // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.

- 2011. - Т. 6. - № 3. - С. 71-75.

2. Коненков В.И., Покушалов Е.А., Повещенко О.В., Ким И.И., Романов А.Б., Гульева H.A. (Бондаренко H.A.), Бернвальд В.В., Соловьева

А.О., Янкайте Е.В., Повещенко А.Ф., Караськов A.M. Характеристика фенотипа мобилизованных гранулоцитарным колониестимулирующим фактором периферической крови у больных с хронической сердечной недостаточностью // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2012. -№1.- С. 9-13.

3. Гульева H.A. (Бондаренко H.A.), Повещенко О.В., Ким И.И., Бернвальд В.В., Янкайте Е.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Повещенко А.Ф., Коненков В.И.Характеристика проангиогенных свойств мононуклеарных клеток периферической крови после введения гранулоцитарного колоние-стимулирующего фактора у пациентов с ишемической болезнью сердца // В книге: Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии X Международная конференция. Новосибирск,-2011.-С. 125-126.

4. Ким И.И., Повещенко О.В., Коненков В.И., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Бондаренко H.A., Повещенко А.Ф., Сергеевичев Д.С., Караськов A.M. Эффективность мобилизации CD34+ прогениторных клеток препаратом g- G-CSF в зависимости от ишемического анамнеза и возраста больных с хронической сердечной недостаточностью // Патология кровообращения и кардиохирургия. — 2012. - № 1. - С. 75-78.

5. Бондаренко H.A., Повещенко О.В., Ким И.И., Хабаров Д.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Повещенко А.Ф., Коненков В.И. Влияние криоконсервирования на количество эндотелиальных прогениторных клеток периферической крови после мобилизации гранулоцитарным колониестимулирующим фактором у пациентов с ишемической болезнью сердца // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2012. -№ 4 (41). - С. 18-19.

6. Повещенко О.В., Ким И.И., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Бондаренко H.A., Повещенко А.Ф., Караськов A.M., Коненков В.И. Клеточные лимфотропные технологии реабилитации пациентов с хронической сердечной недостаточностью // В сборнике: Профилактическая

и восстановительная медицина Материалы научных советов ЦЭЭР, Новосибирск. - 2012. - С. 43-58.

7. Повещенко О.В., Ким И.И., Бондаренко H.A., Хабаров Д.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Повещенко А.Ф., Коненков В.И. IL-10 и TNF-а после мобилизации гранулоцитарным колониестимулирующим фактором у пациентов с ишемической болезнью сердца // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2012. - № 4(41). - С. 148-149.

8. Лыков А.П., Повещенко О.В., Бондаренко H.A., Повещенко А.Ф., Ким И.И., Миллер Т.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Коненков В.И.Оценка эффекта проангиогенных факторов на пролиферативную и миграционную активность клеток эндотелиальной линии ЕА.Ну926 // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. - 2013. -Т. 33. - № 4. - С. 23-29.

9. Гульева H.A. (Бондаренко Н.А,), Ким И.И., Повещенко О.В., Берн-вальд В.В., Повещенко А.Ф., Колесников А.П., Янкайте Е.В., Хабаров Д.В., Комбанцев Е.А., Смагин A.A., Романов А.Б., Покушалов Е.А., Коненков В.И. Возможности аутологичной клеточной терапии ишемической сердечной недостаточности // Стволовые клетки и регенеративная медицина: сборник тезисов Всероссийской научной школы-конференции. Москва, 2010. С.24-25.

10. Повещенко О.В., Ким И.И., Бондаренко H.A., Янкайте Е.В., Хабаров Д.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Сергеевичев Д.С., Повещенко А.Ф., Коненков В.И. Проангиогенные свойства мобилизованных клеток периферической крови у пациентов с ишемической болезнью сердца // Стволовые клетки и регенеративная медицина: сборник тезисов IV Всероссийской научной школы-конференции. Москва, 2011. С.64-65.

11. Бондаренко H.A., Повещенко О.В., Ким И.И., Повещенко А.Ф., Хабаров Д.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Караськов A.M., Коненков В.И. Влияние криоконсервации на фенотип прогениторных клеток периферической крови после мобилизации гранулоцитарным колоние-стимулирующим фактором у пациентов с ишемической болезнью сердца // Актуальные вопро-

сы клеточ�