Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональная характеристика прогениторных клеток пациентов с хронической сердечной недостаточностью при интрамиокардиальной трансплантации

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональная характеристика прогениторных клеток пациентов с хронической сердечной недостаточностью при интрамиокардиальной трансплантации"

На правах рукописи

Ким Ирина Иннокентьевна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ ПРИ ИНТРАМИОКАРДИАЛЬНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2012

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте клинической и экспериментальной лимфологии Сибирского отделения РАМН (г. Новосибирск) и в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика E.H. Мешалкина» Министерства здравоохранения й социального развития Российской Федерации

Научные руководители: доктор медицинских наук, академик РАМН

Коненков Владимир Иосифович доктор медицинских наук, Повещенко Александр Федорович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Трунов Александр Николаевич

(Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения РАМН, г. Новосибирск, руководитель лаборатории иммунологии репродукции)

доктор медицинских наук, профессор Зубахин Александр Анатольевич

(Новосибирский государственный медицинский университет, профессор кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета)

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Томск)

Защита диссертации состоится « ^» 2012 г. в « -Л? » часов

на заседании диссертационного совета Д 208.062.05, созданного на базе Новосибирского государственного медицинского университета (630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52; тел: (383) 229-10-83)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского государственного медицинского университета (630091, Новосибирск, Красный проспект, д. 52)

Автореферат разослан « ^ » >^-¿^2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета

A.B. Волков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Клеточная биология и биология стволовых/прогениторных клеток считается базисом регенеративной медицины. Клеточная терапия как составная часть клеточной технологии применяется при заболеваниях сердечно-сосудистой системы [Кочегура Т.Н., 2010; Плотников У.Ю., 2009; Ярыгин К.Н., 2008]. Несмотря на имеющиеся достижения современной фармакотерапии хронической сердечной недостаточности, ежегодно в Российской Федерации от нее умирает до 986000 человек [Беленков Ю.Н., 2006, 2008]. Как правило, это больные, для которых трансплантация сердца остается единственным методом лечения [Беленков Ю. Н., 2008; Кочегура Т.Н., 2010]. Получение стволовых/прогениторных клеток мобилизацией их из костного мозга введением ростовых факторов, в том числе гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, является альтернативой аспирации клеток костного мозга из крестцовой кости [Беленков Ю.Н., 2003; Козлов В.А., 2004; Кочегура Т.Н., 2010]. Показано, что введение мобилизованных Г-КСФ стволовых/прогениторных клеток мышам с индуцированным инфарктом миокарда сопровождается уменьшением зоны инфаркта [КаБЬ-цр 1., 2006]. Недостатком экспериментальных работ на лабораторных животных является отсутствие моделирования динамического развития процессов происходящих при ИБС у человека. Имеющиеся в литературе сообщения о применении у пациентов с патологией сердечно-сосудистой системы Г-КСФ не в полной мере дают представления об эффективности, что диктует необходимость исследования сочетания мобилизации аутологичных стволовых клеток из костного мозга с их последующим локальным/интрамиокардиальным введением [Смолянинов А. Б., 2007; Каэ^ф .1., 2006]. Кроме этого, недостаточно сведений о фенотипе мобилизованных стволовых клеток и их пролиферативном потенциале, а также их функциональной активности, в частности цитокинпродуцирующей способности, у пациентов с ХСН и взаимосвязи вышеуказанных параметров стволовых/прогениторных клеток с

клинической эффективностью.

Цель исследования. Изучить морфофункциональные свойства прогемиторных клеток периферической крови, мобилизованных введением Г-КСФ пациентам с ХСН, и исследовать клиническую эффективность их применения при интрамиокардиальной трансплантации.

Задачи исследования

1. Исследовать морфологические/фенотипические свойства мононуклеарных клеток периферической крови у больных с ХСН в ходе мобилизации Г-КСФ.

2. Определить функциональные свойства мононуклеарных клеток периферической крови у больных с ХСН в ходе мобилизации Г-КСФ по их пролиферативной и секреторной активности.

3. Оценить взаимосвязь параметров морфофункциональных свойств стволовых/прогениторных клеток с показателями клинической эффективности интрамиокардиального введения мононуклеаров.

4. Разработать критерии прогнозирования клинической эффективности интрамиокардиальной трансплантации стволовых/прогениторных клеток на основе их морфофункциональных параметров.

Научная новизна работы. Впервые исследован фенотип и функциональная активность стволовых/прогениторных клеток, мобилизованных введением Г-КСФ у пациентов с тяжелой формой ХСН. Показано, что при мобилизации Г-КСФ клеток из костного мозга происходит увеличение количества различных популяций эндотелиальных прогениторных клеток.

Впервые показана высокая пролиферативная активность мобилизованных Г-КСФ МНК в сочетании с продукцией ими широкого спектра цитокинов как с провоспалительным, так и с противовоспалительным потенциалом действия, иммуиорегуляторными и ангиогенными свойствами.

Впервые установлено, что интрамиокардиальное введение мобилизованных Г-КСФ МНК пациентам с ХСН является клинически

эффективным способом лечения, при котором отмечено возрастание толерантности к физической нагрузке, снижение функционального класса сердечной недостаточности и стенокардии напряжения, увеличение ФВЛЖ, а также улучшение перфузии миокарда - данные изменения сохраняются на протяжении 12 месяцев.

Научно-практическая значимость работы. Полученные в ходе исследования мобилизации стволовых клеток Г-КСФ из костного мозга пациентов с ХСН научные данные расширяют представления о фенотипических и функциональных свойствах прогениторных клеток, используемых для терапии сердечной недостаточности. Разработаны и применяются в практике Новосибирского научно-исследовательского института патологии кровообращения им. акад. E.H. Мешалкина критерии прогнозирования клинической эффективности интрамиокардиальной трансплантации МНК мобилизованных Г-КСФ на основе их морфофункциональных параметров. Указанные критерии позволяют реализовать индивидуализированный подход в терапии социально значимой патологии не только в Новосибирском научно-исследовательском институте патологии кровообращения им. акад. E.H. Мешалкина, но могут быть рекомендованы для внедрения в практику работы специализированных высокотехнологичных центров, специализирующихся на лечении пациентов с патологией ССС.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Введение Г-КСФ приводит к мобилизации из костного мозга пациентов с хронической сердечной недостаточностью не только гемопоэтических клеток с фенотипом CD34+, но и эндотелиальных прогениторных клеток с фенотипом CD34+/CD133+ и CD34+/KDR (VEGFR2).

2. Мононуклеарные клетки периферической крови, полученные в ходе мобилизации из костного мозга введением Г-КСФ, обладают высоким пролиферативным потенциалом и секретируют проангиогенные ростовые факторы (ИЛ-lß, ЭПО, ГМ-КСФ, ФНО-а, ИЛ-6).

3. Интрамиокардиальная трансплантация мононуклеарных клеток крови, мобилизованных Г-КСФ из костного мозга, пациентам с хронической сердечной недостаточностью приводит к улучшению функции сердца.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации были представлены на иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), на международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологиии клеточной биологии» (Новосибирск, 2008), на конференции «Актуальные вопросы клинической лимфологии» (Ташкент, 2009), на конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009), на IV симпозиуме «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010), на конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010), на конференции, посвященной 20-летию Кузбасского кардиологического центра «Актуальные проблемы сердечно-сосудистой патологии» (Кемерово,

2010), на X Международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии» (Новосибирск, 2011), на IV Съезде лимфологов России (Москва,

2011), на VII научных чтениях, посвященным памяти академика РАМН E.H. Мешалкина (Новосибирск, 2011), на IV Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2011).

Внедрение. Результаты диссертационной работы используются в лечении пациентов с хронической сердечной недостаточностью в Новосибирском научно-исследовательском институте патологии кровообращения им. акад. E.H. Мешалкина, а также внедрены в учебный процесс кафедры анатомии, физиологии и безопасности жизнедеятельности Новосибирского государственного педагогического университета.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, основные результаты представлены в 11, из них 5 - в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки России для публикаций основных результатов исследования кандидатских и докторских диссертаций.

Объем и структура диссертации. Диссертация написана в традиционном

стиле и состоит из следующих глав: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, включающего 10 таблиц и 19 рисунков. Список литературы содержит 230 литературных источников, из них 177 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проведено у 72 пациентов с ИБС, ФК ХСН (NYHA) III-IV, давших информированное согласие, согласно протоколам, утвержденным этическими комитетами и учеными советами Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии Сибирского отделения РАМН (г. Новосибирск) и Новосибирского научно-исследовательского института патологии кровообращения им. акад. E.H. Мешалкина. Рекомбинантный человеческий Г-КСФ (Грасальва, Израиль) вводился подкожно в дозе 3,3-5,0 мкг/кг/сутки общим количеством 5 инъекций, на 6-е сутки пациентам проводилась процедура аппаратного цитафереза на сепараторе клеток крови (Haemonetics MCS+, США).

МНК из сепарированной крови выделяли на градиенте плотности фиколла/верографина (р = 1,078 г/л). Фенотип МНК (CD3, CD4, CD8, CD14, CD 19) (Сорбент, Россия) и CD34, CD45 CD 133, KDR (Becton Dickinson, США) исследовали на проточном цитометре FACSCantoII (Becton Dickinson, США). В популяции CD34+ клеток исследовали клеточный цикл методом двуцветной проточной цитофлюориметрии с помощью окрашивания клеток пропидиумом иодида (Becton Dickinson, США) согласно инструкции.

Пролиферативный потенциал МНК (2х 105клеток/ лунку) исследовали в спонтанном, митоген-стимулированном (КонА 5 мкг/мл и ЛПС 10 мкг/мл (США) тестах, и в присутствии: 50 Ед/мл Г-КСФ (Грасальва, Израиль) или ЮОЕд/мл ИЛ-2 (Ронколейкин, Россия) спектрофотометрически по включению 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида (МТТ).

Определение концентрации цитокинов в супернатантах от 48 часовых

культур МНК проводили методом проточной флюориметрии Bio-PlexTM 200 System (BioRad, США) и методом ИФА (Вектор-Бест, Россия).

Пациентам иитрамиокардиально под контролем навигационной системы NOGA ХР в 10 точках вводили клетки (1,5x107мл в объеме 0,2 мл/точка). Эффективность лечения оценивали через 6 и 12 месяцев по объему ФВЛЖ с помощью ЭХО-КГ и по изменению перфузии миокарда по данным ЭКГ-синхронизированной томосцинтиграфии (SPECT) с технецием (Тс-99ш) в покое и при нагрузке, индуцированной введением аденозина, по толерантности к физической нагрузке по тесту 6 минутной ходьбы, по изменению ФК СН.

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программы Stalistica 6,0 for Windows (StatSoft, США). Полученные данные проверяли на нормальность распределения согласно критериям Колмогорова-Смирнова, меры центральной тенденции и рассеяния описаны в случае нормального распределения признаков средним их значением (М) и средним квадратичным отклонением (±о), а параметры, не имеющие нормального распределения - медианой (Me), нижним (LQ) и верхним (HQ) квартилями. Достоверность различий оценивали по критериям Манна-Уитни (в независимых группах) и Вилкоксона (в зависимых группах). Наличие связей между явлениями устанавливали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (R). Различия считали достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Гемостимулирующая активность Г-КСФ. Введение Г-КСФ пациентам с ХСН приводило к увеличению количества лейкоцитов в периферической крови в 4,9 раз с 6,39 ± 1,2 х 10у/л до 31,25 ± 6,0 х109/л к 6 суткам, в основном за счет нейтрофилов, что подтверждается наличием высокой прямой зависимости (R = 0,987; р = 0,004). Каких-либо статистически значимых различий в количестве популяции CD3+ Т-лимфоцитов и субпопуляций Т-клеток (CD4, CD8), В-лимфоцитов (CD 19), CD 14+ - клеток (моноцитов) на фоне мобилизации МНК Г-КСФ не выявлено.

Эффект мобилизации МНК Г-КСФ у больных с ХСН на выход СК в

периферическое русло. Необходимо отметить, что у больных с ХСН до проведения мобилизации МНК Г-КСФ количество CD34+ клеток составляло 0,01 % (0,01 %- 0,067 %). На 6-е сутки после завершения курса мобилизации МНК Г-КСФ в периферической крови количество клеток, экспрессирующих CD34+ маркер, возросло в 20,7 ± 16,8 раз и составило 0,42 % (0,25 % - 50,64 %), что зависело от исходного уровня содержания данного фенотипа клеток в периферической крови (р„ = 0,0001). Также на 6-е сутки после мобилизации Г-КСФ в периферической крови пациентов с ХСН было выявлено статистически значимое возрастание количества CD34+/CD133+ клеток (рц = 0,01) (ранние ЭПК), достигавшее 0,02% (0,01 %-0,075 %), с учетом их минимального содержания (0,001 %) в крови данных пациентов до курса мобилизации Г-КСФ. У больных с ХСН после завершения курса мобилизации Г-КСФ в периферической крови отмечена также тенденция к увеличению пула клеток с фенотипом CD34+/KDR+ - до 0,1% (0,05 %-0,2 %) (поздние ЭПК), которые практически не выявлялись в крови этих больных до проведения процедуры мобилизации (рц= 0,108).

Исходя из выше изложенного, становится очевидным, что в ходе мобилизации Г-КСФ из КМ у больных с ХСН происходит не только увеличение пула лейкоцитов, но и прогениторных клеток как гемопоэтических, так и различных популяций эндотелиальных.

Содержание CD 34+ клеток в периферической крови после мобилизации Г-КСФ в зависимости от возраста и длительности заболевания ХСН у пациентов. Пациенты, подвергшиеся процедуре мобилизации Г-КСФ, характеризовались наличием прогрессирующей сердечной недостаточности, имели длительный ишемический анамнез. Выявлено наличие обратной средней силы связи количества CD34+ клеток на 6-е сутки с количеством ИМ в анамнезе (R = -0,467, р = 0,045). Не было установлено каких-либо статистически значимых корреляционных связей количества клеток с возрастом и длительностью заболевания как до, так и после курса мобилизации Г-КСФ. В то же время в подгруппе пациентов младше 50

лет отмечено увеличение количества CD34+ клеток в периферической крови как до, так и после курса мобилизации Г-КСФ. Аналогичная картина выявлена в подгруппе пациентов с ХСН, имевших в анамнезе 1 эпизод ИМ, а именно, увеличение количества CD34+ клеток в периферической крови как до, так и после курса мобилизации Г-КСФ. Необходимо также, сказать о том факте, что чем больше времени прошло от последнего эпизода ИМ, тем больше количество CD34+ клеток в периферической крови после мобилизации Г-КСФ (р = 0,001), что также подтверждается наличием высокой прямой зависимости между количеством клеток с фенотипом CD34+, выделенных на 6-е сутки после курса мобилизации Г-КСФ, и временем, превышающим 10 лет от последнего эпизода ИМ (R = 0,77; р = 0,015).

Таким образом, на количество выхода в периферическую кровь клеток с фенотипом CD34+ после завершения курса мобилизации Г-КСФ (эффективность мобилизации) оказывает влияние возраст старше 50 лет, количество эпизодов ИМ и длительность заболевания ХСН.

Исследование функциональной активности МНК периферической крови после курса мобилизации Г-КСФ. На 6-е сутки после мобилизации Г-КСФ отмечено статистически значимое увеличение пролиферативного потенциала МНК как в спонтанном, так и стимулированном тестах (р < 0,05). При стимуляции КонА был отмечено увеличение пролиферации клеток в 1,53 ± 0,64, нейпогеном - в 1,31 ± 0,58 и ронколейкином - в 1,46 ± 0,65 раз.

Следует указать на то, что в группе пациентов с ХСН, имевших после мобилизации Г-КСФ в периферической крови количество клеток с фенотипом CD34+ свыше 0,4 % отмечено увеличение пролиферативной активности МНК по сравнению с группой пациентов с количеством CD34+ меньше 0,4 %.

Анализ клеточного цикла клеток с фенотипом CD34+ показал, что на 6-е сутки после завершения курса мобилизации Г-КСФ количество клеток, находящихся в фазе SM/G2, было равным 11,23 % ± 5,72 %, а в фазе клеточного цикла G0/G1 - 86,65 % ± 5,89%. Не смотря на то, что большинство клеток с фенотипом CD34+ находятся в стадии покоя, высок процент клеток,

находящихся в синтетическо-митотической фазе.

Известно, что для стимуляции процессов регенерации/пролиферации поврежденных тканей и органов требуется влияние биологически активных веществ, в том числе и цитокинов, и ростовых факторов, продуцируемых стволовыми/прогениторными клетками.

Было показано, что у пациентов с ХСН после курса мобилизации Г-КСФ преобладал противовоспалительный спектр продукции МНК цитокинов (ФНО-а/ИЛ-10 = 0,51 и ИФН-у/ИЛ-10 = 0,38). Кроме этого, было показано, что на 6-е сутки после мобилизации Г-КСФ МНК продуцируют в значительном количестве ИЛ-1 ß (415,9 пг/мл), ФНО-а (27,5 пг/мл), ИЛ-6 (15938,4 пг/мл), ГМ-КСФ (8,61 пг/мл) и ЭПО (18,1 мМЕ/мл), обладающие проангиогенными свойствами.

Следовательно, МНК периферической крови пациентов с ХСН после курса мобилизации Г-КСФ имеют сохраненный пролиферативный потенциал и достаточный уровень цитокинпродуцирующей функции с тенденцией к продукции противовоспалительных цитокинов, что имеет значение для ограничения силы воспалительного ответа в месте ишемизации миокарда при интрамиокардиальном введении клеточного трансплантата.

Клиническая эффективность интрамиокардиального введения МНК при мобилизации Г-КСФ больных ХСН. Эффективность интрамиокардиального введения МНК после курса мобилизации Г-КСФ у пациентов с ХСН была исследована через 6 и 12 месяцев. Установлено статистически значимое улучшение показателя теста 6-минутной ходьбы, выразившегося в увеличении проходимой за этот промежуток времени дистанции на 54 % спустя 6 месяцев и на 56 % спустя 12 месяцев в сравнении с исходным показателем (р < 0,01). Отмечено статистически значимое изменение ФК ХСН, оцениваемой по NYHA с III до II класса (2,94 ± 0,11 и 2,00 ± 0,56; соответственно, р < 0,01) через 6 месяцев после введения клеток и ее стойкая сохранность через 12 месяцев (2,00 ± 0,33; р < 0,01). Показано, что через 6 месяцев у пациентов происходит статистически значимое снижение ФК

стенокардии напряжения с 3,01 ± 0,17 до 1,84 ± 0,32 (р < 0,01), а также до 1,69 ± 0,43 (р <0,01) через 12 месяцев наблюдения. Установлено статистически значимое увеличение ФВЛЖ на 4 % через 6 месяцев после проведения данной процедуры (с 42,59 ± 13,84 до 46,02 ± 12,84; р < 0,01) и на 5 % через 12 месяцев (46,44 ± 12,06; р < 0,01) по сравнению с исходными данными.

Анализ данных сцинтиграфии миокарда у пациентов, получивших лечение интрамиокардиальным введением МНК, мобилизованных Г-КСФ как в покое, так и при нагрузке аденозином, выявил статистически значимое снижение зоны гипоперфузии миокарда через 6 месяцев после проведения данной процедуры с 20,31 ±10,13 до 16,83 ±9,27 и с 24,07 ±10,28 до 19,42 ±8,99 баллов, соответственно (р<0,01). В тоже время спустя 12 месяцев после проведенной процедуры отмечено увеличение зоны гипоперфузии в миокарде пациентов, получивших лечение интрамиокардиальным введением МНК, мобилизованных Г-КСФ, но они не достигали первоначальных значений.

Таким образом, терапия интрамиокардиальным введением МНК, мобилизованных Г-КСФ, у пациентов с ХСН приводила к улучшению клинических показателей, в частности, улучшению толерантности к физической нагрузке, оцениваемой по тесту 6-минутной ходьбы, снижению показателей ФК ХСН и стенокардии напряжения, а также возрастанию ФВЛЖ и уменьшению зоны гипоперфузии миокарда как в покое, так и при нагрузке аденозином.

Изучение взаимосвязей морфофункциональных свойств аутологичных МНК мобилизованных Г-КСФ с параметрами клинической эффективности интрамиокардиального введения. Показана прямая сильная связь между количеством клеток с фенотипом СБ34+ в периферической крови после мобилизации Г-КСФ и зоной гипоперфузии миокарда спустя 6 месяцев после интрамиокардиального введения аутологичных СК в состоянии покоя у пациентов спустя 12 месяцев после процедуры клеточной трансплантации (Я = 0,079, р = 0,049). Между количеством СБ34+/С0133+ клеток и показателем гипоперфузии миокарда при нагрузке аденозином спустя 12 месяцев после

клеточной трансплантации и ФВЛЖ выявлена прямая сильная взаимосвязь (Я = 0,67, р = 0,018). Выявлены некоторые взаимосвязи между уровнями проангиогенных цитокинов с клинической эффективностью интрамиокардиального введения МНК: между показателями гипоперфузии в покое и ФВЛЖ на 6 месяц после введения с уровнем ИЛ-10 (Я = 0,71; р = 0,015 и Я = 0,64; р = 0,020; соответственно); между ФВЛЖ на 6 месяц и уровнями ФНО-а и ГМ-КСФ (Я = -0,67; р = 0,018 и Я = -0,63; р = 0,021; соответственно).

Таким образом, имеющиеся сопряженности между показателями содержания в периферической крови пула клеток с прогениторной активностью, показателями продукции цитокинов МНК мобилизованными Г-КСФ у пациентов с ХСН с параметрами клинической эффективности после интрамиокардиального введения указывают на вовлеченность вводимых клеток в процесс регенерации и возможно неоангиогенеза в зоне ишемизации.

Изучение взаимосвязи продукции МНК цитокинов с проангиогенной активностью после мобилизации Г-КСФ и клинической эффективности клеточной терапии показало, что у пациентов с положительными результатами перфузии МНК при культивировании продуцируют в более высоких концентрациях ЭПО (МЕ/мл), ГМ-КСФ (пг/мл), ФНО-а (пг/мл) (17,6 ±1,7; 46,2 ±16 и 1343 ± 857; соответственно), чем у пациентов с ухудшением перфузии (15,8 ± 1,8, 10,3 ± 2,5 и 560 ± 60, соответственно).

Следовательно, клиническая эффективность интрамиокардиального введения аутологичных МНК, полученных мобилизацией Г-КСФ у пациентов с ХСН, зависит от способности продуцировать проангиогенные факторы.

ВЫВОДЫ

1. Мобилизация выхода прогениторных клеток из костного мозга под воздействием Г-КСФ у пациентов с тяжелой формой хронической сердечной недостаточности приводит к возрастанию содержания в кровеносном русле мононуклеарных клеток с фенотипом СБ34+, СБ34+/СВ133+ и СВ34+/УЕОЯГ2+, что свидетельствует о выходе в кровоток как гемопоэтических, так и эндотелиальных прогениторных клеток.

2. Мононуклеарные клетки крови после мобилизации из костного мозга Г-КСФ пациентов с хронической сердечной недостаточностью, входящие в состав клеточного трансплантата, проявляют высокий потенциал пролиферативной активности. На 6-е сутки после курса мобилизации Г-КСФ, происходит увеличение пролиферативного потенциала при различных стимулах (митоген КонА, цитокины Г-КСФ и ИЛ-2) по сравнению с исходной пролиферативной активностью до курса мобилизации.

3. Мобилизованные введением Г-КСФ из костного мозга мононуклеарные клетки крови пациентов с хронической сердечной недостаточностью проявляют способность к продукции широкого спектра цитокинов как провоспалительных (ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-12), так и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-13), и цитокинов, обладающих проангиогенным действием (ИЛ-1Р, ЭПО, ГМ-КСФ, ФНО-а, ИЛ-6).

4. Интрамиокардиальное введение собственных мононуклеарных клеток крови, обогащенных клетками с фенотипом С034+, С034+/С0133+ и С034+Л/ЕСИР2+, пациентам с хронической сердечной недостаточностью, приводит к увеличению толерантности к физической нагрузке, снижению класса сердечной недостаточности и, по данным эхокардиографии и ЭКГ-синхронизированной томосцинтиграфии, к увеличению фракции выброса из левого желудочка сердца и к улучшению перфузии миокарда спустя 6 и 12 месяцев после лечения.

5. Высокая концентрация клеток с фенотипом С034+ и СБ34+/С0133+ в клеточном трансплантате и повышенный уровень продукции мононуклеарными клетками крови, мобилизованными из костного мозга таких цитокинов, как ИФН-у, ИЛ-10, ФНО-а и ГМ-КСФ, могут служить прогностически благоприятными признаками высокой эффективности клеточной терапии пациентов.

6. Одним из механизмов репарации поврежденного миокарда у пациентов с хронической сердечной недостаточностью при интрамиокардиальном введении клеточного трансплантата, обогащенного предщественниками

собственных гемопоэтических и эндотелиальных клеток, может являтся стимуляции неоангиогенеза в миокарде.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коненков В.И., Повещенко О.В., Ким И.И., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Гульева H.A., Бернвальд В.В., Шевченко A.B., Голованова О.В., Янкайте Е.В., Повещенко А.Ф., Караськов A.M. Влияние G-CSF на проангиогенные свойства мобилизованных клеток периферической крови у больных с хронической сердечной недостаточностью // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011. T. VI, №3. С.71-75, автора -0,06 п.л.

2. Коненков В.И., Покушалов Е.А., Повещенко О.В., Ким И.И., Романов А.Б., Гульева H.A., Бернвальд В.В., Соловьева А.О., Янкайте Е.В., Повещенко А.Ф., Караськов A.M. Характеристика фенотипа мобилизованных гранулоцитарным колониестимулирующим фактором клеток периферической крови у больных с хронической сердечной недостаточностью // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012. № 1. С.9-14, автора - 0,06 п л.

3. Ким И.И., Повещенко О.В., Коненков В.И., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Бондаренко H.A., Повещенко А.Ф., Сергеевичев Д.С., Караськов A.M. Эффективность мобилизации CD 34+ прогениторных клеток препаратом G-CSF в зависимости от ишемического анамнеза и возраста больных с хронической сердечной недостаточностью // Патология кровообращения и кардиохирургия. 2012. № 1. С.75-78, автора - 0,06 п л.

4. Повещенко О.В., Ким И.И., Бондаренко H.A., Хабаров Д.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Повещенко А.Ф., Коненков В.И.. IL-10 и TNF-a после мобилизации гранулоцитарным колониестимулирующим фактором у пациентов с ишемической болезнью сердца // Вестник уральской медицинской академической науки. 2012. № 4. С.148-149, автора - 0,03 п.л.

5. Бондаренко H.A., Повещенко О.В., Ким И.И., Хабаров Д.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Повещенко А.Ф., Коненков В.И.. Влияние криоконсервирования на количество эндотелиальных прогениторных клеток

периферической крови после мобилизации гранулоцитарным колониестимулируюицим фактором у пациентов с ишемической болезнью сердца // Вестник уральской медицинской академической науки. 2012. №4. С. 18-19, автора-0,03 п.л.

6. Ким И.И., Повещенко О.В., Колесников А.П., Мозжерина А.Н., Ульянов Е.В., Янкайте Е.В., Гертер Т.В., Хабаров Д.В., Романов А.Б., Покушалов Е.А., Коненков В.И. Фенотипические и функциональные характеристики мононуклеарных клеток периферической крови больных ИБС при мобилизации стволовых клеток из костного мозга // Лимфология. 2009. № 1-2. С. 239-240, автора - 0,02 п.л.

7. Повещенко О.В., Повещенко А.Ф., Ким И.И., Янкайте Е.В., Хабаров Д.В., Смагин A.A., Комбанцев Е. А., Романов А.Б., Покушалов Е.А., Коненков В.И. Эффективность интрамиокардиальной трансплантации аутогенных стволовых у пациентов с ишемической болезнью сердца // Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии : сборник тезисов IV Всероссийского симпозиума с международным участием. Санкт-Петербург, 2010. С. 177-178, автора-0,03 п.л.

8. Гульева H.A., Ким И.И., ПовещенкоО.В., Бернвальд В.В., Повещенко А.Ф.,Колесников А.П., Янкайте Е.В. ,Хабаров Д.В., Комбанцев Е.А., Смагин A.A., Романов А.Б., Покушалов Е.А., Коненков В.И. Возможности аутологичной клеточной терапии ишемической сердечной недостаточности // Стволовые клетки и регенеративная медицина : сборник тезисов Всероссийской научной школы-конференции. Москва, 2010. С.24-25, автора - 0,02 п.л.

9. Коненков В.И., Повещенко О.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Ким И.И., Любарский М.С., Повещенко А.Ф., Гульева H.A., Бернвальд В.В., Хабаров Д.В., Смагин A.A., Караськов A.M. Эффективность интрамиокардиального введения аутологичных прогениторных клеток периферической крови у пациентов с хронической сердечной недостаточностью // VII научные чтения, посвященные памяти академика РАМН Е.Н.Мешалкина : материалы научно-практической конференции с

международным участием. Новосибирск, 2011. С.213-214, автора - 0,02 п.л.

10. Повещенко О.В., Ким И.И., Бондаренко H.A., Яикайте Е.В., Хабаров Д.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Сергеевичев Д.С., Повещенко А.Ф., Коненков В.И. Проангиогенные свойства мобилизованных клеток периферической крови у пациентов с ишемической болезнью сердца // Стволовые клетки и регенеративная медицина: сборник тезисов IV Всероссийской научной школы-конференции. Москва, 2011. С.64-65, автора - 0,03 п.л.

11. Коненков В.И., Повещенко О.В., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Ким И.И., Королев М.А., Хмельницкий Г.А., Повещенко А.Ф., Хабаров Д.В., Смагин A.A., Караськов A.M. Эффективность интрамиокардиальной терапии ишемической сердечной недостаточности аутологичными мобилизованными G-CSF клетками периферической крови // Актуальные проблемы сердечнососудистой патологии : материалы научно-практической конференции, посвященной 20-летию Кузбасского кардиологического центра. Кемерово, 2010. С. 145-147, автора-0,03 п.л.

ГПК

ИЛ

Г/ГМ-КСФ

ИБС

КМ

ИМ

ИФА

ИФНу

КМ

КонА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

гранулоцитарный/гранулоцитарномакрофагальный-

колониестимулирующий фактор

гемопоэтические стволовые/прогениторные клетки

ишемическая болезнь сердца

интерлейкин

инфаркт миокарда

иммуноферментный анализ

интерферона-гамма

костный мозг

конканавалин А

костный мозг

лпс

липополисахарид

МНК

мононуклеарные клетки крови

мтт тест оксидоредукции нитросинего тетразоля

ск стволовые/прогениторные клетки

сн сердечная недостаточность

ссс сердечно-сосудистая система

ФК функциональный класс

ФВЛЖ фракции выброса левого желудочка

ФНО-а фактор некроза опухоли

ХСН хронической сердечной недостаточности

эпк эндотелиальные прогениторные клетки

эпо эритропоэтин

СБ кластер дифференцировки

КУНА Нью-Йоркская классификация класса

Отпечатано в типографии Новосибирского Государственного технического университета 630092, г.Новосибирск, пр. К. Маркса, 20, Тел./факс (383) 346-08-57 Формат 60 х 84/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 586. Подписано в печать 31.08.2012 г.

2012280673

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Ким, Ирина Иннокентьевна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1.1. Характеристика и свойства стволовых /прогениторных клеток

Глава 1.2. Мобилизация стволовых/прогениторных клеток из костного мозга

Глава 1.3. Результаты лечения пациентов с ХСН аутологичными стволовыми/прогениторными клетками

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 2.1. Характеристика пациентов

Глава 2.2. Мобилизация мононуклеаров периферической крови

Глава 2.3. Фенотип МНК периферической крови и мобилизованных МНК

Глава 2.4. Иммунноцитохимическое исследование популяции клеток с фенотипом СЭ34+ в периферической крови, мобилизованных введением Г-КСФ из костного мозга

Глава 2.5. Световая микроскопия мононуклеарных клеток периферической крови, мобилизованных из костного мозга введением Г-КСФ

Глава 2.6. Клеточный цикл и апоптоз С034+ клеток

Глава 2.7. Оценка пролиферативной активности МНК МТТ-тестом

Глава 2.8. Исследование уровней цитокинов в супернатантах МНК

Глава 2.9. Интрамиокардиальное введение мобилизованных МНК и оценка ее эффективности

Глава 2.10. Статистическая обработка полученных результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3.1. Гемостимулирующая активность Г-КСФ

Глава 3.2. Эффект введения Г-КСФ на выход стволовых/прогениторных клеток в периферическое русло у больных с ХСН

Глава 3.3. Содержание СБ 34+ клеток в периферической крови после мобилизации Г-КСФ в зависимости от возраста и длительности заболевания ХСН у пациентов

Глава 3.4. Исследование функциональной активности МНК периферической крови после курса мобилизации Г-КСФ

Глава 3.5. Клиническая эффективность интрамиокардиального введения МНК при мобилизации Г-КСФ больных ХСН

Глава 3.6. Изучение взаимосвязей морфофункциональных свойств аутологичных МНК мобилизованных Г-КСФ с параметрами клинической эффективности интрамиокардиального введения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфофункциональная характеристика прогениторных клеток пациентов с хронической сердечной недостаточностью при интрамиокардиальной трансплантации"

Клеточная биология и биология стволовых/прогениторных клеток является одной из самых активно развивающихся областей науки и в настоящее время по праву считается базисом регенеративной медицины. Стволовые клетки, в силу своей способности к самоподдержанию, могут с успехом применяться для восстановления и/или замещения клеток утраченных организмом при повреждении тканей и органов. Клеточная терапия, как составная часть клеточной технологии, находит свое применение, в том числе, и при заболеваниях сердечно-сосудистой системы (Кочегура Т.Н., 2010; Плотников У.Ю., 2009; Ярыгин К.Н., 2008).

Несмотря на имеющиеся достижения современной фармакотерапии хронической сердечной недостаточности ежегодно в Российской Федерации от ХСН умирает до 986000 человек (Беленков Ю.Н., 2006, 2008). Как правило, это больные с рефрактерной стенокардией, с дистальным типом атеросклеротического поражения миокарда, с обширными осложненными инфарктами миокарда в анамнезе (ишемическая кардиомиопатия) или пациенты, которым уже проводились различные варианты реваскуляризации миокарда (чрезкожная баллонная ангиопластика, стентирование, аортокоронарное шунтирование), для которых трансплантация сердца остается единственным методом лечения (Беленков Ю.Н., 2008; Кочегура Т.Н., 2010).

Одним из современных высокотехнологичных методов лечения таких пациентов на сегодняшний день является клеточная кардиомиопластика, подразумевающая введение стволовых клеток в миокард (Беленков Ю.Н., 2008; Кочегура Т.Н., 2010; Куртова A.B., 2006; Herrmann J.L., 2009).

При терапии стволовыми клетками, в том числе, клеточной кардиомиопластике, отмечена не только стимуляция неоангиогенеза, но и активация дифференцировки в кардиомиоциты как собственных стволовых клеток сердца, так и введенных в организм стволовых клеток. Клеточная кардиомиопластика представляет собой постоянно расширяющуюся клиническую и научную область, которая изучает влияние применения различных видов малодифференцированных мультипотентных клеток в терапии сердечно-сосудистых заболеваний, главным образом ИБС и ХСН (Беленков Ю.Н., 2008; Herrmann J.L., 2009).

Традиционным способом получения стволовых клеток у человека из костного мозга является аспирация его из крестцовой кости. Альтернативным, менее инвазивным способом получения стволовых клеток является мобилизация кроветворных клеток из костного мозга введением ростовых факторов гемопоэза, в частности, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Беленков Ю.Н., 2003; Козлов В.А., 2004; Кочегура Т.Н., 2010).

Показано, что введение мобилизованных Г-КСФ стволовых клеток мышам, с индуцированным инфарктом миокарда, сопровождается уменьшением зоны инфаркта (Kastrup J., 2006). При этом не происходит развития реакции «трансплантат против хозяина», а также снижен риск инфицирования. Недостатком экспериментальных работ на лабораторных животных является отсутствие моделирования динамического развития процессов происходящих при ИБС у человека. Имеющиеся в литературе сообщения о применение у пациентов с патологией сердечно-сосудистой системы Г-КСФ не в полной мере дают представления об эффективности, что диктует необходимость исследования сочетания мобилизации аутологичных стволовых клеток из костного мозга с их последующим локальным/интрамиокардиальным введением (Смолянинов А.Б., 2007; Kastrup J., 2006). Кроме этого, недостаточно сведений о фенотипе мобилизованных стволовых клеток их пролиферативном потенциале, а также их функциональной активности, и в частности, цитокинпродуцирующая способность, у пациентов с ХСН и взаимосвязи вышеуказанных параметров стволовых клеток с клинической эффективностью.

Следовательно, углубление и накопление знаний о морфофункциональных свойствах, мобилизованных из костного мозга, аутологичных стволовых клеток для трансплантации и механизмах влияния их введения на функцию ишемизированного миокарда, позволит найти новые подходы к лечению хронической сердечной недостаточности.

Целью исследования стало изучение морфофункциональных свойств прогениторных клеток периферической крови, мобилизованных введением Г-КСФ пациентам с ХСН, с данными клинической эффективности интрамиокардиального трансплантации стволовых клеток.

Задачи исследования:

1.Оценить морфологические/фенотипические свойства мононуклеарных клеток периферической крови у больных с ХСН в ходе мобилизации Г-КСФ.

2.Определить функциональные свойства мононуклеарных клеток периферической крови у больных с ХСН в ходе мобилизации Г-КСФ по их пролиферативной и секреторной активности.

3.Исследовать взаимосвязь параметров морфофункциональных свойств стволовых клеток с показателями клинической эффективности интрамиокардиального введения мононуклеаров.

4.Разработать критерии прогнозирования клинической эффективности интрамиокардиальной трансплантации стволовых клеток на основе морфофункциональных параметров.

Научная новизна работы.

Впервые исследован фенотип и функциональная активность стволовых/прогениторных клеток, мобилизованных введением Г-КСФ у пациентов с тяжелой формой ХСН. Показано, что при мобилизации Г-КСФ клеток из костного мозга происходит увеличение количества различных популяций эндотелиальных прогениторных клеток.

Впервые показано, что у мобилизованных Г-КСФ мононуклеарных клеток (МНК) отмечена высокая пролиферативная активность, которая сочетается с широким спектром продуцируемых при культивировании 8 данными клетками цитокинов, как с провоспалительным, так и с противовоспалительным потенциалом действия, иммунорегуляторными и ангиогенными свойствами.

Впервые установлено, что интрамиокардиальное введение мобилизованных Г-КСФ МНК пациентам с ХСН является клинически эффективным способом лечения, при котором отмечено возрастание толерантности к физической нагрузке, снижение функционального класса сердечной недостаточности и стенокардии напряжения, увеличение фракции выброса левого желудочка (ФВЛЖ), а также улучшение перфузии миокарда - данные изменения сохраняются на протяжении 12 месяцев.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные в ходе исследования мобилизации стволовых клеток Г-КСФ из костного мозга пациентов с ХСН научные данные расширяют представления о фенотипических и функциональных свойствах прогениторных клеток, используемых для терапии сердечной недостаточности, и используются в курсе лекций по современным высокотехнологичным методам терапии пациентов с ХСН, а также рекомендованы для внедрения в практике работы специализированных высокотехнологичных центров, специализирующихся на лечение, пациентов с сердечно-сосудистой патологией.

Внедрение. Результаты диссертационной работы используются в лечении пациентов в НИИ ПК с хронической сердечной недостаточностью. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры анатомии, физиологии и валеологии НГПУ, а также Медицинского факультета НГУ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Введение Г-КСФ приводит к мобилизации из костного мозга пациентов с хронической сердечной недостаточностью не только гемопоэтических СБ34+, но и эндотелиальных прогениторных клеток, коэкспрессирующих с СБ34 маркеры СБ 133 и КБИ. (УЕвИ^).

2. Мононуклеарные клетки периферической крови, полученные в ходе мобилизации из костного мозга введением Г-КСФ, обладают высоким пролиферативным потенциалом и секретируют проангиогенные ростовые факторы.

3. Интрамиокардиальная трансплантация мононуклеарных клеток крови, мобилизованных Г-КСФ из костного мозга, пациентам с хронической сердечной недостаточностью приводит к улучшению функции сердца.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации были представлены на иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологиии клеточной биологии» (Новосибирск, 2008); конференции «Актуальные вопросы клинической лимфологии» (Ташкент, 2009); конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009); IV симпозиуме «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010); конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010); конференции, посвященной 20-летию Кузбасского кардиологического центра «Актуальные проблемы сердечнососудистой патологии» (Кемерово, 2010); X Международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии» (Новосибирск, 2011); IV Съезде лимфологов России (Москва, 2011); VII научных чтениях, посвященным памяти академика РАМН Е.Н.Мешалкина (Новосибирск, 2011); IV Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 работ, из них 5 в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК России для публикаций основных результатов исследования кандидатских и докторских диссертаций.

Объем и структура диссертации.

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из следующих глав: введения, обзора литературы, описания материалов и методик исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, включающего 10 таблиц и 19 рисунков. Список литературы содержит 230 литературных источников, из них 177 зарубежных.

Работа выполнена в лаборатории лимфотропной терапии и лимфодиагностики ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН, г. Новосибирск (руководитель лаборатории - к.м.н. Повещенко О.В.) и на базе центра хирургической аритмологии ФГБУ «НИИ патологии кровообращения им. ак. Е.Н Мешалкина Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи», г. Новосибирска (руководитель центра - д.м.н. Покушалов Е.А.).

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Ким, Ирина Иннокентьевна

Результаты исследования зон гипоперфузии миокарда у пациентов с ХСН, получивших лечение интрамиокардиальным введением МНК мобилизованных Г-КСФ по данным сцинтиграфии представлены на рисунке

37 до введения б мес 12 мес

Рисунок 18. Показатели фракции выброса левого желудочка у пациентов с ХСН, получивших лечение интрамиокардиальным введением МНК мобилизованных Г-КСФ.

Примечание: * - достоверность различий по сравнению с показателями до введения МНК, р<0,01.

Анализ данных сцинтиграфии миокарда у пациентов, получивших лечение интрамиокардиальным введением МНК мобилизованных Г-КСФ, как в покое, так и при нагрузке аденозином выявил статистически значимое снижение зоны гипоперфузии миокарда через 6 месяцев после проведения данной процедуры с 20,31 ±10,13 до 16,83±9,27 и с 24,07± 10,28 до 19,42±8,99 баллов, соответственно (р<0,01) (Рис. 19). В тоже время, спустя 12 месяцев после проведенной процедуры отмечено увеличение зоны гипоперфузии в миокарде пациентов, получивших лечение интрамиокардиальным введением МНК мобилизованных Г-КСФ, но они не достигали первоначальных значений. до введения бмес 12мес

Рисунок 19. Показатели перфузии миокарда в покое (А) и при нагрузке аденозином (Б), оцениваемых по данным ЭКГ-синхронизированной томосцинтиграфии, у пациентов с ХСН, получивших лечение интрамиокардиальным введением МНК мобилизованных Г-КСФ.

Примечание: по оси абсцисс - значения участков гипоперфузии; * -достоверность различий по сравнению с показателями до введения МНК, р<0,01.

Таким образом, терапия интрамиокардиальным введением МНК мобилизованных Г-КСФ у пациентов с ХСН приводила к улучшению клинических показателей, в частности, улучшению толерантности к физическеой нагрузке, оцениваемой по тесту 6 минутной ходьбы, снижению показателей функционального класса сердечной недостаточности, оцениваемым по ЫУНА и функционального класса стенокардии напряжения, а также возрастанию фракции выброса левого желудочка сердца и уменьшению зоны гипоперфузии миокарда, как в покое, так и при нагрузке аденозином.

Известно, что клинический эффект трансплантации клеток может зависеть от типа водимых клеток и их дозы (Беленков Ю.Н., 2008; ЫаБакл Н., 2006). Поэтому, логичным продолжением данного исследования стало изучение возможных связей клинической эффективности с морфофункциональными особенностями аутологичных СК мобилизованных Г-КСФ у пациентов с ХСН.

Глава 3.6. Изучение взаимосвязей морфофункциоиальиых свойств аутологичных МНК мобилизованных Г-КСФ с параметрами клинической эффективности интрамиокардиального введения

Раннее было показано, что клинический эффект трансплантации клеток в поврежденный миокард зависит от количества и типа вводимых клеток в трансплантате (Perin Е.С., 2003; Steinhoff G., 2006; Yaoita H., 2005).

Проведенный в настоящем исследовании анализ взаимосвязей исследуемых параметров морфофункциональных особенностей прогениторных клеток мобилизованных Г-КСФ с показателями клинической эффективности интрамиокардиального введения аутологичных МНК мобилизованных Г-КСФ выявил наличие между ними связей, той или иной направленности и силы (Табл. 8, 9). Показана прямая сильная связь между количеством клеток с фенотипом CD34+ в периферической крови после мобилизации Г-КСФ и зоной гипоперфузии миокарда спустя 6 месяцев после интрамиокардиального введения аутологичных СК в состоянии покоя, что косвенно указывает на вероятность неоангиогенеза в зоне ишимизации у пациентов с ХСН после проведенной процедуры. Более того, эта связь возрастала с учетом количества клеток с фенотипом CD34+ в периферической крови более 0,42% пациентов спустя 12 месяцев после процедуры клеточной трансплантации. Также, спустя 6 месяцев у пациентов перенесших интрамиокардиальное введение МНК отмечно наличие средней силы прямой зависимости количества клеток с фенотипом CD34+ в периферической крови с показателем фракции выброса левого желудочка сердца, что также может свидетельствовать в пользу участия данного пула клеток в нормализации функциональной активности ишемизированного миокарда.

Заключение

Клетки периферической крови, обогащенные СК, мобилизованными из костного мозга ввведением Г-КСФ, у пациентов с тяжелой формой ХСН являются доступным источником СК для трансплантации в поврежденный миокард. Процесс мобилизации СК у таких пациентов является эффективным, так как приводит к увеличению количества различных популяций циркулирующих СК и ЭПК, количество которых зависит от возраста пациентов и ишемического анамнеза.

Клеточный трансплантант, вводимый интрамиокардиально с использованием системы ЖЮА ХР, обладает функциональным потенциалом (пролиферативной и цитокинпродуцирующей активностью) достаточным для стимуляции репаративных процессов в миокарде. Одним из эффектов интрамиокардиального введения клеток является улучшение перфузии, следовательно, васкуляризации миокарда, и стимуляции неоангиогенеза путем паракринного воздействия продуцируемых цитокинов и ростовых факторов. Введенные в миокард клетки могут способствовать не только неоваскуляризации миокарда, но и уменьшать воспаление, воздействовать на ремоделирование миокарда и в итоге способствовать улучшению функционального состояния сердечной мышцы. Использование в качестве источника аутологичных СК периферической крови пациентов с ХСН обладает явными технологическими преимуществами перед другими тканевыми источниками их получения.

Глава 5. Выводы

1. Мобилизация выхода прогениторных клеток из костного мозга под воздействием Г-КСФ у пациентов с тяжелой формой хронической сердечной недостаточности приводит к возрастанию содержания в кровеносном русле мононуклеарных клеток с фенотипом С034+, СБ34+/СШЗЗ+ и СБ34+/УЕОКГ2+, что свидетельствует о выходе в кровоток как гемопоэтических, так и эндотелиальных клеток предшественников.

2. Мононуклеарные клетки крови после мобилизации из костного мозга Г-КСФ пациентов с хронической сердечной недостаточностью, входящие в состав клеточного трансплантата, проявляют высокий потенциал пролиферативной активности. На 6 сутки после курса мобилизации Г-КСФ, происходит увеличение пролиферативного потенциала при различных стимулах (митоген КонА, цитокины Г-КСФ и ИЛ-2) по сравнению с исходной пролиферативной активностью до курса мобилизации.

3. Мобилизованные введением Г-КСФ из костного мозга мононуклеарные клетки крови пациентов с хронической сердечной недостаточностью проявляют способность к продукции широкого спектра цитокинов, как провоспалительных (ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-12), так и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-13), и цитокинов, обладающих проангиогенным действием (ИЛ-1(3, ЭПО, ГМ-КСФ, ФНО-а, ИЛ-6).

4. Интрамиокардиальное введение собственных мононуклеарных клеток крови, обогощенных клетками с фенотипом С034+, СВ34+/СБ133+ и СВ34+/УЕОЯГ2+, пациентам с хронической сердечной недостаточностью, приводит к увеличению толерантности к физической нагрузке, снижению класса сердечной недостаточности и, по данным эхокардиографии и ЭКГ-синхронизированной томосцинтиграфии, к увеличению фракции выброса из левого желудочка сердца и к улучшению перфузии миокарда спустя 6 и 12 месяцев после лечения.

5. Высокая концентрация клеток с фенотипом СЭ34+ и СБ34+/С0133+ в клеточном трансплантате и повышенный уровень продукции мононуклеарными клетками крови, мобилизованными из костного мозга, таких цитокинов, как ИФН-у, ИЛ-10, ФНО-а и ГМ-КСФ, могут служить прогностически благоприятными признаками высокой эффективности клеточной терапии пациентов.

6. Одним из механизмов репарации поврежденного миокарда у пациентов с хронической сердечной недостаточностью при интрамиокардиальном введении клеточного трансплантата, обогащенного предщественниками собственных гемопоэтических и эндотелиальных клеток, может являтся стимуляции неоангиогенеза в миокарде.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Ким, Ирина Иннокентьевна, Новосибирск

1. Афанасьев С.А., Роговская Ю.В., РябовВ.В., др. Оценка эффективности применения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора для лечения экспериментальной деструкции миокарда мышей // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2010. - №1. - С.23-26.

2. Ахмедов Ш.Д., Бабокин В.Е., Дьякова М.Л., др. Клеточные технологии пригибридных операциях лечения хронической сердечной недостаточности // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2009. - Том IV. - № 1. - С.74-77.

3. Байкова Ю.П., Фатхудинов Т.Х., Большакова Г.Б., др. Репарация миокарда при трансплантации мононуклеарных клеток костного мозга // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2010. - №4. - С.203-210.

4. Белевитин А.Б., Никитин А.Э., Цыган В.Н., др. // Клеточная терапия патологии миокарда (обзор литературы) // Вестник российской военно-медицинской академии. 2010. - Том 2. - №10. - С.194-200.

5. Беленков Ю.Н., Агеев Ф.Т., Мареев В.Ю. Парадоксы сердечной недостаточности: взгляд на проблему на рубеже веков // URL: http://old.consilium-medicum.com/media/heart. 2000.

6. Беленков Ю.Н., Мареев В.Ю., Агеев Ф.Т. Хроническая сердечная недостаточность. М: ГЭОТAP-Медиа. - 2006. - 432с.

7. Беленков Ю.Н., Привалова Е.В., Чекнева И.С. Клеточная терапия в лечении хронической сердечной недостаточности: виды применяемых стволовых клеток, результаты последних клинических исследований // Kardiol serdecno-sosud hir. 2008. - № 5. - С.4-18.

8. Белявская Т.М., Акчурин P.C. Интрамиокардиальная трансплантация стволовых клеток костного мозга: современное состояние проблемы // URL: http://www.evrika.ru/article/289. 2011.

9. Бокерия Л.А., Бузиашвили Ю.И., Мацкеплишвили С.Т., др. Первый опыт применения стволовых клеток костного мозга для регенерационной терапии ишемической болезни сердца // Кардиология. 2004. - Т. 44. - №9. - С. 16-22.

10. Воробьев А.И., Атауллаханов Ф., Емельяненко В. Анализ пространственной динамики свертывания // Современные медицинские технологии. 2010. - С.32-37.

11. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М: Практика. - 1999. -459с.

12. Дыгай A.M., Жданов B.B. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические аспекты. М.: Издательство РАМН. - 2010. -138с.

13. Еремеева М.В. Возможности применения стволовых клеток и клеток-предшественников для стимуляции реваскуляризации и регенерации органов //Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2010. - Том XII. - № 1. - С.86-93.

14. Кескинов A.A., Еремин И.И., Щербюк А.Н., др. Биологические свойства эндотелиальных клеток-предшественниц и их репаративный потенциал для клеточной терапии // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2008. Том III. - № 4. С.36-40.

15. Ким Л.Б., Куликов В.Ю., Минина Н.Г. Постинфарктное ремоделирование левого желудочка и фазы репаративного фиброза // Атеросклероз.-2010.-Т. 6. №1. - С.25-33.

16. Козлов В.А. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор: физиологическая активность, патофизиологические и терапевтические проблемы // Цитокины и воспаление. 2004. - № 2. - С.3-15.

17. Кочегура Т.Н., Ефименко А.Ю., Акопян Ж.А., Парфенова Е.В. Клеточная терапия сердечной недостаточности: клинический опыт, проблемы и перспективы // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010. - Том V. - № 2. - С. 11-18.

18. Кремнева Л.В., Абатурова О.В. Молекулярно-клеточные механизмы ремоделирования миокарда при сердечной недостаточности // Клиническая медицина. 2003.-Т. 81. - №2. - С.4-7.

19. Куртова A.B., Зуева Е.Е., Немков A.C. Постинфарктная клеточная регенерационная терапия сердечной мышцы // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2006. - № 2. - С.35-43.

20. Мареев В. Ю., Агеев Ф. Т., Арутюнов Г. П., др. Российские национальные рекомендации ВНОК и ОССН по диагностике и лечению ХСН (второй пересмотр) // Журнал Сердечная Недостаточность. 2007. - Том №10. - С.64-103.

21. Маслюков А.К., Сугачевская Е.В. Стволовые клетки и их применение в практической медицине // URL: http://www.transplantology.com. 2004.

22. Нестеров Ю.И., Ласточкина Л.А. Хроническая сердечная недостаточность: диагностика и лечение. Кемерово, 2006. - 95с.

23. Патофизиология / Под ред. А.Д. Адо. М.: Триада X, 2000.- 574с.

24. Патофизиология / Под ред. В.В. Новицкого и Е.Д. Гольдберга. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006. - 716с.

25. Патофизиология заболеваний сердечно-сосудистой системы / Под ред. Л. Лилли / М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2003—598с.

26. Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Стволовые клетки в регенеративной терапии сердечных заболеваний: роль межклеточных взаимодействий // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2009. Том IV. - № 1. - С.43-49.

27. Покровская О.С. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор: механизмы мобилизации гемопоэтических стволовых клеток периферической крови и системные эффекты применения // Терапевтический архив. 2007. - № 7. - С.83-87

28. Райкина Е.В., Румянцев С.А. Экспрессия рецепторов к Г-КСФ и IL-8 на клетказ крови в динамике терапии Г-КСФ // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007. - Том II. - № 2. - С.81-83.

29. Рубина К.А., Мелихова B.C., Парфенова Е.В. Резидентные клетки-предшественники в сердце и регенерация миокарда // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007. - Том II. - № 1. - С.29-35.

30. Румянцев С.А., Балашов Д.Н., Румянцев А.Г. Механизмы мобилизации гемопоэтических предшественников гранулоцитарным колониестимулирующим фактором // Современная онкология. 2010. - № 3. - С.84-88.

31. Румянцев С.А., Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г. Механизмы Г-КСФ-индуцированной мобилизации гемопоэтических стволовых клеток // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2003. - Том 2. - № 4. - С.5-9.

32. Семченко В.В., Барашкова С.А., Ноздрин В.И., Артемьев В.Н. Гистологическая техника: учебное пособие. О.: Омская областная типография. - 2006. - 209с.

33. Смолянинов А.Б., Козлов В.А., Кириллов Д.А., Печенгская A.B. Клинические особенности течения инфаркта миокарда при терапии мобилизированными аутологичными стволовыми клетками // URL: http://stemcellbank.spb.ru/kliniceskie-osobennosti-.html. 2007.

34. Фатхудинов Т.Х., Байкова Ю.П., Большакова Г.Б., др. Влияние трансплантации мононуклеаров красного костного мозга на ангиогенез у крыс // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2011. - №3. - С. 132135.

35. Фатхудинов Т.Х., Слащева Г.А., Большакова Г.Б., др. Направление миграции мононуклеаров костного мозга при интракоронарном трансвентрикулярном введении // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2009. - №4. - С.222-228.

36. Шевченко О.П., Орлова О.В., Макарова JI.B. Предикторы и маркеры эффективности трансплантации клеток костного мозга больным сердечной недостаточностью // Клиническая лабораторная диагностика. 2008. - №9. -С.18-18.

37. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Гуреев С.В., др. Клеточная трансплантология // Вестник трансплантологии и искусственных органов.2006. -№4.-С.94-102.

38. Шумаков В.П., Сускова B.C., Онищенко Н.А., др. Трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга у кардиологических больных // URL: http://www.cmbt.su/rus/science/sciencel6.html. 2005.

39. Ярыгин К.Н., Лупатов А.Ю. Клеточная биология и введение в клеточную терапию // Программа курса для студентов медико-биологического факультета. 2008. - 6с.

40. Abdel-Latif A., Bolli R., Tleyjeh I.M., et al. Adult bone marrow-derived cells for cardiac repair: a systematic review and meta-analysis // Arch. Intern. Med.2007. Vol. 167. - P.989-997.

41. Alvarez-Dolado M., Pardal R., Garcia-Verdugo J.M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes // Nature. 2003. - Vol. 425. - P.968-973.

42. Amado L.C., Saliaris A.P., Schuleri K.H., et al. Cardiac repair with intramyocardial injection of allogeneic mesenchymal stem cells after myocardial infarction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - Vol. 102. - P. 11474-11479.

43. Anderlini P., Champlin R.E. Biologic and molecular effects of granulocyte colony-stimulating factor in healthy individuals: recent findings and current challenges // Blood. 2008. - Vol. 111. - P. 1767-1772.

44. Ang K.-L., Shenje L.T., Srinivasan L., Galinanes M. Repair of the Damaged Heart by Bone Marrow Cells: From Experimental Evidence to Clinical Hope // Ann. Thorac. Surg. 2006. - Vol. 82. - P.1549-1558.

45. Ang K.-L., Chin D., Leyva F., et al. Randomized, controlled trial of intramuscular or intracoronary injection of autologous bone marrow cells into scarred myocardium during CABG versus CABG alone // Cardiovasc. Med. -2008.-Vol. 5. P.663-670.

46. Asahara T., Masuda H., Takahashi T., et al. Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization // Circ. Res. 1999. - Vol. 85. -P.221-228.

47. Asahara T., Murohara T., Sullivan A., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis // Science. 1997. - Vol. 275. - P.964-967.

48. Assmus B., Schachinger V., Teupe C., et al. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI) // Circulation. 2002. - Vol. 106. - P.3009-3017.

49. Aviles F.F., San Roman J.A., Garcia F.J., et al. Intracoronary stem cell transplantation in acute myocardial infarction // Rev. Esp. Cardiol. 2004. - Vol. 57. - P.201-208.

50. Badorff C., Brandes R.P., Popp R., et al. Transdifferentiation of blood-derived human adult endothelial progenitor cells into functionally active cardiomyocytes // Circulation. 2003. Vol. 107. - P. 1024-1032.

51. Bailen K.K., King R.J., Chitphakdithai P., et al. The National Marrow Donor Program 20 years of unrelated donor hematopoietic cell transplantation // Biol. Blood Marrow Transplant. 2008. - Vol. 14. - P.2-7.

52. Balsam L.B.,Wagers A.J., Christensen J.L., et al. Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischaemic myocardium // Nature. 2004. -Vol. 428. - P.668-673.

53. Barbash I.M., Chouraqui P., Baron J., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infracted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution // Circulation. 2003. - Vol. 108. - P.863-868.

54. Beeres S.L., Bax J.J., Dibbets P., et al. Effect of intramyocardial injections of autologous bone marrow derived cells on perfusion, function, and viability in patients with drug-refractory chronic ischemia // J. Nucl. Med. 2006. - Vol. 47. -P.574-580.

55. Beltrami A.P., Barlucchi L., Torella D. et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration // Cell. 2003. - Vol. 114. -P.763—776.

56. Bernstein H.S., Srivastava D. Stem cell therapy for cardiac disease // Pediatr. Res.-2012.-Vol. 71. P.491-499.

57. Bersenev A. CD34 as a surrogate marker for hematopoietic stem and progenitor cells //URL: http://stemcellassays.com/2011/07/cd34-as-a-surrogate-marker-for-hematopoietic-stem-and-progenitor-cells/ 2011.

58. Burchfield J. S., Iwasaki M., Koyanagi M., et al. Interleukin-10 From Transplanted Bone Marrow Mononuclear Cells Contributes to Cardiac Protection After Myocardial Infarction // Circ. Res. 2008. Vol. 103. - P.203-211.

59. Capobianco S., Chennamaneni V., Mittal M., et al. Endothelial progenitor cells as factors in neovascularization and endothelial repair // World J. Cardiol. -2010,-Vol. 26.-P.411-420.

60. Caspi O., Huber I., Kehat I., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts // J. of the Am. Coll. of Cardiology. 2007. - Vol. 50. - P. 1884-1893.

61. Chachques J.C., Herreros J., Trainini J., et al. Autologous human serum for cell culture avoids the implantation of cardioverter-defibrillators in cellular cardiomyoplasty // Int. J. Cardiol. 2004. - Vol. 95. - P.29-33.

62. Chen S.L., Fang W.W., Ye F., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction // Am. J. Cardiol. 2004. - Vol. 94. -P.92—95.

63. Cottier-Fox M.H., Lapidot T., Petit I., et al. Stem Cell Mobilization // Hematology. 2003. - P.419-437.

64. Deindl E., Zaruba M.M., Brunner S., et al. G-CSF administration after myocardial infarction in mice attenuates late ischaemic cardiomyopathy by enhanced arteriogenesis // FASEB J. 2006. - Vol. 20. - P.956-958.

65. Dimarakis I., Habib N.A., Gordon M.Y.A. Adult bone marrow-derived stem cells and the injured heart: just the beginning? // Eur. J. Cardiothorac. Surg. -2005. Vol. 28. - P.665-676.

66. Dimmeler S., Burchfield J., Zeiher A.M. Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2008. - Vol. 28. - P.208-216.

67. Dimmeler S., Leri A. Aging and Disease as Modifiers of Efficacy of Cell Therapy // Circ. Res. 2008. - Vol. 102. - P. 1319-1330.

68. Egashira T., Yuasa S., Fukuda K. Induced Pluripotent Stem Cells in CardiovascularMedicine // Stem Cells International. 2011. - Vol. 2011. - Article ID 348960, 7 p.

69. Erbs S., Linke A., Adams V., et al. Transplantation of blood-derived progenitor cells after recanalization of chronic coronary artery occlusion // Circ. Res. 2005. - Vol. 97. - P.756 -762.

70. Fernandez-Aviles F., San Roman J.A., Garcia-Frade J., et al. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction // Circ. Res. 2004. - Vol. 95. - P.742—748.

71. Fuchs S., Baffour R., Zhou F., et al. Transendocardial delivery of autologous bone marrow enhances collateral perfusion and regional function in Pigs with chronic experimental myocardial ischemia // J. Am. Coll. Cardiol. 2003. - Vol. 41. - P.1721-1724.

72. Fuchs S., Kornowski R., Weisz G., et al. Safety and feasibility of transendocardial autologous bone marrow cell transplantation in patients with advanced heart disease // Am. J. Cardiol. 2006. - Vol. 97. - P.823-829.

73. Fukuda K., Yuasa S. Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes // Circulation Research. 2006. - Vol. 98. - P. 1002-1013.

74. Fukuhara S., Tomita S., Nakatani T., et al. G-CSF promotes bone marrow cells to migrate into infarcted mice heart, and differentiate into cardiomyocytes // Cell Transplant. 2004. - Vol. 13. - P.741-748.

75. Galinanes M., Loubani M., Davies J., et al. Autotransplantation of unmanipulated bone marrow into scarred myocardium is safe and enhanced cardiac function in humans // Cell traplantation. 2004. - Vol. 13. - P.7-13.

76. Gascon P., Fuhr U., Sorgel F., et al. Development of a new G-CSF productbased on biosimilarity assessment // Ann. One. 2010. - Vol. 21. - P. 1419 - 1429.104

77. Gimble J.M., Katz A.J., Bunnell B.A. Adipose-Derived Stem Cells for Regenerative Medicine // Circ. Res. 2007. - Vol. 100. - P. 1249-1260.

78. Gnecchi M., He H., Noiseux N., et al. Evidence supporting paracrine hypothesis for Akt-modified mesenchymal stem cell-mediated cardiac protection and functional improvement // FASEB J. 2006. - Vol. 20. - P. 661-669.

79. Gnecchi M., Zhang Z., Ni A., Dzau V.J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy // Circ. Res. 2008. - Vol. 103. - P. 1204-1219.

80. Grines C.L., Watkins M.W., Helmer G., et al. Angiogenic Gene Therapy (AGENT) trial in patients with stable angina pectoris // Circulation. 2002. - Vol. 105. - P.1291-1297.

81. Gyongyosi M., Lang I., Dettke M., et al. Combined delivery approach of bone marrow mononuclear stem cells early and late after myocardial infarction: the MYSTAR prospective randomized study // Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. -2009.-Vol. 6. P.70-81.

82. Haider H. Kh., Ashraf M. Bone marrow stem cell transplantation for cardiac repair // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2005. - Vol. 288. - H2557-H2567.

83. Hao J., Daleo M. A., Murphy C. K., et al. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells // URL: http://www.plosone.Org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0002904.-2008.

84. Harada M., Qin Y., Takano H., et all. G-CSF prevents cardiac remodeling after myocardial infarction by activating the Jak-Stat pathway in cardiomyocytes // Nat. Med. 2005. - Vol. 11.- P.305-311.

85. Heeschen C., Lehman R., Yjgold J., et al. Profoundly reduced neovascularization capacity of bone marrow mononuclear cells derived frompatients with chronic ischemic heart disease // Circulation. 2004. - Vol. 109. -P.1615-1622.

86. Heissig B., Hattori K., Dias S., et al. Recruitment of stem and progenitor cells from the bone marrow niche requires mmp-9 mediated release of kit-ligand // Cell.- 2002. Vol. 109. - P.625-637.

87. Hendrikx M., Hensen K., Clijsters C., et al. Recovery of regional but not global contractile function by the direct intramyocardial autologous bone marrow transplantation // Circulation. 2006. - Vol. 114 (Suppl. I). -1-101-107.

88. Henry T.D., Annex B.H., McKendall G.R., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis // Circulation. -2003.-Vol. 107. P.1359-1365.

89. Herrmann J.L., Abarbanell A.M., Weil B.R., Wang Y., Cell-Based Therapy for Ischemic Heart Disease: A Clinical Update // Ann. Thorac. Surg. 2009. - Vol. 88. - P.1714-1722.

90. Hill JM, Zalos G, Halcox JP, et all Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 2003;348:593- 600.

91. Hiraumi Y, Iwai-Kanai E, Baba S, et al. Granulocyte colony-stimulating factor protects cardiac mitochondria in the early phase of cardiac injury // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2009. - Vol. 296. - H823-H832.

92. Hristov M., Erl W., Weber P.C. Endothelial progenitor cells: isolation and characterization // Trends Cardiovasc. Med. 2003. - Vol. 13. - P.201—206.

93. Inoue T., Sata M., Hikichi Y., et al. Mobilization of CD34-positive bone marrow-derived cells after coronary stent implantation // Circulation. 2007. -Vol. 115,- P.553-561.

94. Jackson K.A., Majka S.M., Wulf G.G., et al. Stem cells: a minireview // J .Cell Biochem. 2002. - Suppl. 38. - P.l-6.

95. Herrmann J.L., Abarbanell A.M., Weil B.R., et al. Cell-Based Therapy for Ischemic Heart Disease: A Clinical Update // Ann. Thorac. Surg. 2009. - Vol. 88. - P.1714-1722.

96. Jiang Y., Jahagirdar B.N., Reinhardt R.L., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow // Nature. 2002. - Vol. 418. - P.41^9.

97. Katritsis D.G., Sotiropoulou P.A., Karvouni E. Transcoronary transplantation of autologous mesenchymal stem cells and endothelial progenitors into infarcted human myocardium // Catheter Cardiovasc. Interv. 2005. - Vol. 65. - P.321-329.

98. Kinnaird T., Stabile E., Burnett M.S., et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms // Circulation. 2004. - Vol. 109. - P. 1543-9.

99. Kollet O., Petit I., Kahn J., et al. Human CD34(+)CXCR4(-) sorted cells harbor intracellular CXCR4, which can be functionally expressed and provide NOD/SCID repopulation // Blood. 2002. - Vol. 100. - P.2778-2786.

100. Kollet O., Shivtiel S., Chen Y.Q., et al. HGF, SDF-1, and MMP-9 are involved in stress-induced human CD34+ stem cell recruitment to the liver // J. Clin. Invest. 2003. - Vol. 112. - P.160-169.

101. Kondo T., Shintani S., Maeda K., et al. The number and function of circulating CD34+CD133+ progenitor cells decreased in stable coronary artery disease but not in acute myocardial infarction // Heart Asia. 2010. - Vol. 2. -P.20-23.

102. Kubal C., Sheth K., Nadal-Ginard B., Galinanes M. Bone marrow cells have a potent anti ischemic effect against myocardial cell death in man // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2006. - Vol. 132. - P.l 112-1118.

103. Kucia M., Dawn B., Hunt G., et al. Cells expressing early cardiac markers reside in the bone marrow and are mobilized into the peripheral blood after myocardial infarction // Circ. Res. 2004. - Vol. 95. - P.l 191-1199.

104. Kuethe F., Richartz B.M., Kasper C., et al. Autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in chronic ischemic cardiomyopathy in humans // Int. J. Cardiol. 2005. - Vol. 100. - P.485^91.

105. Laflamme M.A., Gold J., Xu C., et al. Formation of human myocardium in the rat heart from human embryonic stem cells // Am. J. Pathol. 2005. - Vol. 167. - P.663-671.

106. Lafontaine L., Chaudhry P., Lafleur M.-J., et al. Transforming Growth Factor Beta Regulates Proliferation and Invasion of Rat Placental Cell Lines // Biology of reproduction. 2011. - Vol. 84. - P.553-559.

107. Lapidot T., Petit I. Current understanding of stem cell mobilization: the roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells // Exp. Hematol. 2002. - Vol. 30. - P.973- 981.

108. Laugwitz K.L., Moretti A., Lam J., et al. Postnatal isll-cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages // Nature. 2005. - Vol. 433. - P.647-653.

109. Lee J., Terracciano C.M. Cell therapy for cardiac repair // British Medical Bulletin. 2010. - Vol. 94. - P.65-80.

110. Leitman F., Finkel T., Richard O. Cannon I.I.I., et al. Progenitor Cells in Patients With Coronary Artery Disease Granulocyte Colony-Stimulating Factor Mobilizes Functional Endothelial // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2005. -Vol. 25. - P.296-301.

111. Lemoli R.M., Tafiiri A., Fortuna A., et al. Cycling Status of CD34 Cells Mobilized Into Peripheral Blood of Healthy // Blood. 1997. - Vol. 89. - P.l 18996.

112. Lemoli R.M., D'Addio A. Hematopoietic stem cell mobilization // Haematologica. 2008. - Vol. 93. - P.347-355

113. Leone A.M., Rutella S., Bonanno G., et al. Mobilization of bone marrow-derived stem cells after myocardial infarction and left ventricular function // Eur. Heart J. 2005. - Vol. 26. - P.l 196-1204.

114. Li T.S., Hayashi M., Ito H., et al. Regeneration of infracted myocardium by intramyocardial implantation of ex vivo transforming growth factor-(3-preprogrammed bone marrow stem cells // Circulation. 2005. - Vol. 111. -P.243 8-2445.

115. Li Y., Takemura G., Okada H., et al. Treatment with granulocyte colony-stimulating factor ameliorates chronic heart failure // Lab. Invest. 2006. - Vol. 86. - P.32-44.

116. Limbourg F.P., Ringes-Lichtenberg S., Schaefer A., et al. Haematopoietic stem cells improve cardiac function after infarction without permanent cardiac engraftment // Eur. J. Heart Fail. 2005. - Vol. 7. - P.722-729.

117. Madonna R., Geng Y.-J., De Caterina R. Adipose Tissue-Derived Stem Cells Characterization and Potential for Cardiovascular Repair // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2009. - Vol. 29. - P.1723-1729.

118. Majolino I., Cavallaro A.M., Bacigalupo A., et al. Mobilization and collection of pbsc in healthy donors: a retrospective analysis of the italian bone marrow transplantation group (GITMO) // Haematologica. 1997. - Vol. 82. -P.47-52.

119. Majumdar M.K., Keane-Moore M., Buyaner D., et al. / Characterization and functionality of cell surface molecules on human mesenchymal stem cells / J Biomed Sci, 2003 10 - p.228—241.

120. Martin-Rendon E., Brunskill S.J., Hyde C.J., et al. Autologous bone marrow stem cells to treat acute myocardial infarction: a systematic review // Eur. Heart J. -2008.-Vol. 29. P.1807-1818.

121. Martinez C., Urbano-Ispizua A.C., Marin R.P., et al. Effects of G-CSF administration and peripheral blood progenitor cell collection in 20 healthy donors // Ann. Hematol. 1996. - Vol. 72. - P.269-272.

122. Matsuura K., Wada H., Nagai T., et al. Cardiomyocytes fuse with surrounding noncardiomyocytes and reenter the cell cycle // J. Cell Biol. 2004. -Vol. 167. - P.351-363.

123. Miura K., Okada Y., Aoi T., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines // Nature Biotechnology. 2009. - Vol. 27. - P.743-745.

124. Mocini D., Staibano M., Mele L. et al. Autologous bone marrow mononuclear cell transplantation in patients undergoing coronary artery bypass grafting // Am. Heart J. 2006. - Vol. 151. - P. 192-197.

125. Mogili S., Chen R., Becker M., et al. Blood CD34 levels as a predictor of successful peripheral blood stem cell mobilization in consecutive autologous stem cell apheresis patient from a single transplant center // Blood. 2010. - Vol. 116.-P. 4440

126. Muller-Ehmsen J., Peterson K.L., Kedes L., et al. Rebuilding a damaged heart: Long-term survival of transplanted neonatal rat cardiomyocytes after myocardial infarction and effect on cardiac function // Circulation. 2002. - Vol. 105. - P.1720-1726.

127. Murry C.E., Soonpaa M.H., Reinecke H., et al. Haematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts // Nature. -2004. Vol. 428. - P.664-668.

128. Murtuza B., Suzuki K., Bou-Gharios G., et al. Transplantation of skeletal myoblasts secreting an IL-1 inhibitor modulates adverse remodeling in infarcted murine myocardium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. -Vol. 101. - P.4216-4221.

129. Nagamine H., Watanabe G., Shiobara S., et al. Intramyocardial CD34 cell transplantation combined with off-pump coronary artery bypass grafting // Heart Surg. Forum. 2004. - Vol. 7. - E285-E287.

130. Nelson T. J., Martinez-Fernandez A., Yamada S., et al. Repair of acute myocardial infarction with induced pluripotent stem cells induced by human sternness factors // Circulation. 2009. - Vol. 120. - P.408-416.

131. Orlic D., Hill J.M., Arai A.E. Stem cells for myocardial regeneration // Circ. Res. 2002. - Vol. 91P. 1092-1102.

132. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium // Nature. 2001. - Vol. 410. - P.701-705.

133. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol. 98. - P. 10344 -10349.

134. Ozbaran M., Omay S.B., Nalbantgil S., et al. Autologous peripheral stem cell transplantation in patients with congestive heart failure due to ischemic heart disease // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2004. - Vol. 25. - P.342-350.

135. Patel A., Geffner L., Vina R.F. et al. Surgical treatment for congestive heart failure with autologous adult stem cell transplantation: a prospective randomize study//J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2005. - Vol. 130. - P. 1631-1638.

136. Perin E.C. Transendocardial injection of autologous mononuclear bone marrow cells in end-stage ischemic heart failure patients: one-year follow-up // Int. J. Cardiol. 2004. - Vol. 95 (Suppl. 1). - P.45-46.

137. Perin E.C., Geng Y.J., Willerson J.T. Adult stem cell therapy in perspective // Circulation. 2003. - Vol. 107. - P.935-938.

138. Perin E.C., Dohmann H.F.R., Borojevic R., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure // Circulation. 2003. - Vol. 107. - P.2294-2302.

139. Pesce M., Orlandi A., Iachininoto M.G., et al. Myoendothelial differentiation of human umbilical cord blood-derived stem cells in ischemic limb tissues // Circ. Res.-2003.-Vol. 93.-P.51-62.

140. Piao H., Youn T.J., Kwon J.S., et al. Effects of bone marrow derived mesenchymal stem cells transplantation in acutely infarcting myocardium // Eur. J. Heart Fail. 2005. - Vol. 7. - P.730-738.

141. Peichev M., Naiyer A.J., Pereira D., et al. Expression of VEGFR-2 and AC 133 by circulating human CD34(+) cells identifies a population of functional endothelial precursors // Blood. 2000. - Vol. 95. - P.952-958.

142. Pittenger M.F., Martin B.J. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics // Circ. Res. 2004. - Vol. 95. - P.9-20.

143. Pompilio G., Cannata A., Peccatori F., et al. Autologous peripheral blood stem cell transplantation for myocardial regeneration: a novel strategy for cell collection and surgical injection // Ann. Thorac. Surg. 2005. - Vol. 78. - P. 18081812.

144. Powell T.M., Paul J.D., Hill J.M., et al. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Mobilizes Functional Endothelial Progenitor Cells in Patients With Coronary Artery Disease // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2005. - Vol. 25. -P.296-301.

145. Ptaszek L.M., Mansour M., Ruskin J.N., Chien K.R. Towards regenerative therapy for cardiac disease // Lancet. 2012. - Vol. 379. - P.933-942.

146. Pusic I., DiPersio J.F. The use of clinical factors in hematopoietic stem cell transplantation // Current Pharmaceutical Design. 2008. - Vol. 14. - P. 19501961.

147. Reffelmann T., Dow J.S., Dai W., et al. Transplantation of neonatal cardiomyocytes after permanent coronary artery occlusion increases regional blood flow of infarcted myocardium // J. Mol. Cell Cardiol. 2003. - Vol. 35. - P.607— 613.

148. Rehman J., Li J., Orschell C.M., March K.L. Peripheral blood "endothelial progenitor cells" are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors // Circulation. 2003. - Vol. 107. - P.l 164 -1169.

149. Reinecke H., Poppa V., Murry C.E. Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes after cardiac grafting // J. Mol. Cell Cardiol. 2002. - Vol. 34. - P.241—249.

150. Reyes M., Dudek A., Jahagirdar B., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow // J. Clin. Invest. 2002. - Vol.109. - P.337- 346.

151. Ripa R.S. Granulocyte-colony stimulating factor therapy to induce neovascularization in ischemic heart disease // Dan. Med. J. 2012. - Vol. 59. -B4411.

152. Rivas-Plata A., Castillo J., Pariona M., Chunga A. Bypass grafts and cell transplant in heart failure with low ejection fraction // Asian Cardiovasc.Thorac. Ann. 2010. - Vol. 18. - P.425^129.

153. Schachinger V., Assmus B., Britten M.B., et al. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction Final one-year results of the TOPCARE-AMI Trial // J. Am. Coll. Cardiol. 2004. - Vol. 44. -P. 1690-1699.

154. Schuster M.D., Kocher A.A., Seki T., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2004. - Vol. 287. - P.525-532.

155. Shim W., Mehta A., Lim S.Y., et al. G-CSF for stem cell therapy in acute myocardial infarction: friend or foe? // Cardiovascular Research. 2011. - Vol. 89. - P.20-30.

156. Shintani S., Murohara T., Ikeda H., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction // Circulation. 2001. -Vol. 103.-P.2776-2779.

157. Silva G.V., Perin E.C., Dohmann H.F., et al. Catheter-based transendocardial delivery of autologous bone-marrow derived mononuclear cells in patients listed for heart transplantation // Tex. Heart Inst. J. 2004. - Vol. 31.- P.214—219.

158. Simons M., Annex B.H., Laham R.J., et al. Pharmacological treatment of coronary artery disease with recombinant fibroblast growth factor-2: double-blind, randomized, controlled clinical trial // Circulation. 2002. - Vol. 105. - P.788 -793.

159. Stamm C., Westphal B., Kleine H.-D., et al. Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration // Lancet. 2003. - Vol. 361. -P.45-46.

160. Steinhoff G., Choi Y.-H., Stamm C. Intramyocardial bone marrow stem cell treatment for mypcardial regeneration // Eur. Heart J. Supp. 2006. - Vol. 8. -H32-39.

161. Strauer B.E., Brehm M., Zeus T., et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans // Circulation. 2002. - Vol. 106. - P.1913-1918.

162. Suzuki S., Yoshimura M., Nakayama M., et al. Plasma level of B-type natriuretic peptide as a prognostic marker after acute myocardial infarction: a long-term follow-up analysis // Circulation. 2004. - Vol. 110. - P. 1387-1391.

163. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors // Cell. 2007. - Vol. 131. -P.861-872.

164. Takano H., Qin Y., Hasegawa H., et al. Effects of G-CSF on left ventricular remodeling and heart failure after acute myocardial infarction // J. Mol. Med. -2006.-Vol. 84. P.185-193.

165. Tambara K., Sakakibara Y., Sakaguchi G., et al. Transplanted skeletal myoblasts can fully replace the infarcted myocardium when they survive in the host in large numbers // Circulation. 2003. - Vol. 108. - P.259—263.

166. Tang G.H.L., Fedak P.W.M., Yau T.M., et al. Cell transplantation to improve ventricular function in the failing heart // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2003. - Vol. 23. - P.907-916.

167. Tse H.-F., Kwong Y.-L., Chan J.K.F., et al. Angiogenesis in ischemic myocardium by intracardial autologous bone marrow mononuclear cell implantation // Lancet. 2003. - Vol. 361. - P.47^9.

168. Witko-Sarsat V., Canteloup S., Durant S., et al. Cleavage of p21wafl by proteinase-3, a myeloid-specific serine protease, potentiates cell proliferation // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P.47338-47347.

169. Wollert K.C., Meyer G.P, Lotz J., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial // Lancet. 2004. - Vol. 364. - P. 141-148.

170. Xu M., Wani M., Dai Y.S., et al. Differentiation of bone marrow stromal cells into the cardiac phenotype requires intercellular communication with myocytes // Circulation. 2004. - Vol. 110. - P.2658-2665.

171. Xu X., Xu Z., Xu Y., et al. Effects of mesenchymal stem cell transplantation on extracellular matrix after myocardial infarction in rats // Coron. Artery Dis. -2005-Vol. 16. P.245-255.

172. Yao K., Huang R., Qian J., et al. Administration of intracoronary bone marrow mononuclear cells on chronic myocardial infarction improved diastolic function // Heart. 2008. - Vol. 94. - P. 1147-1153.

173. Yeh E.T.H., Zhang S., Wu H.D., et al. Transdifferentiation of human peripheral blood CD34+-enriched cell population into cardiomyocytes, endothelial cells, and smooth muscle cells in vivo // Circulation. 2003. - Vol. 108. - P.2070-2073.

174. Yerebakan C., Kaminsky A., Westphal B., et al. Autologous bone marrow stem cell therapy for the ischemic myocardium during coronary artery bypass grafting // Minimally Invasive Therapy. 2008. - Vol. 17. - P. 143-148.

175. Yoo K.-J., Kim H.-O., Kwak Y.-L., et al. Autologous bone marrow cell transplantation combined with off-pump coronary artery bypass grafting in patients with ischemic cardiomyopathy // Can. J. Surg. 2008. - Vol. 51.- P.269-275.

176. Yoon Y.S., Wecker A., Heyd L., et al. Clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow regenerate myocardium after myocardial infarction // J. Clin. Invest. 2005. - Vol. 115. - P.326 -338.

177. Yu J., Vodyanik M. A., Smuga-Otto K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells // Science. 2007. - Vol. 318. - P.1917-1920.

178. Yuasa S., Fukuda K., et al. Recent advances in cardiovascular regenerative medicine: the induced pluripotent stem cell era // Expert Review of Cardiovascular Therapy. 2008. - Vol. 6. - P.803-810.

179. Zhao Q., Sun Y., Xia L., et al. Randomized study of mononuclear bone marrow cell ransplantation in patients with coronary surgery // Ann. Thorac. Surg. -2008.-Vol. 86. P.1833-1840.

180. Ziegelhoeffer T., Fernandez B., Kostin S., et al. Bone marrow derived cells do not incorporate into the adult growing vasculature // Circ. Res. 2004. - Vol. 94. -P.230-238.