Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика ckit позитивных резидентных стволовых клеток миокарда у больных ишемической болезнью сердца

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика ckit позитивных резидентных стволовых клеток миокарда у больных ишемической болезнью сердца"

На правах рукописи

ДЕРГИЛЕВ КОНСТАНТИН ВЛАДИМИРОВИЧ

ХАРАКТЕРИСТИКА С-КГГ ПОЗИТИВНЫХ РЕЗИДЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МИОКАРДА У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА

03.01.04 - Биохимия 14.01.05 - Кардиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва —2011 г.

' 1 СЕН 2011

4852475

Работа выполнена на кафедре биологической химии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины Московского Государствешюго Университета имени М. В. Ломоносова, в лаборатории ангиогенеза НИИ экспериментальной кардиологии и отделе сердечно-сосудистой хирургии Института клинической кардиологии им. А. Л. Мясникова ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Парфенова Елена Викторовна Рубина Ксения Андреевна

Терентьев Александр Александрович Смоленский Андрей Вадимович

Ведущая организация:

Научный центр сердечно-сосудистой хирургии имени А. Н. Бакулева

Защита диссертации состоится 23 сентября 2011 г в 14-00 на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов (117198, г Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, Медицинский факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан ¡Ьй^С^УТ^г011

года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор г' Е. В. Лукашева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) в подавляющем большинстве случаев, возникающая в результате перенесенного инфаркта миокарда (ИМ), представляет собой важную медицинскую, социальную и экономическую проблему. Около 1% взрослого населения развитых стран страдает сердечной недостаточностью, а у людей старше 70 лет частота ХСН на порядок выше (около 10%). При этом, в российской популяции частота ХСН выше, чем в развитых странах и достигает 6% [Агеев и соавт., 2010]. Несмотря на то, что эффективность лечения ХСН возросла за последние двадцать лет, возможности современных методов восстановления функции сердца остаются весьма ограниченными. Это обусловлено, в значительной степени, отсутствием эффективных средств, позволяющих восстановить необратимо утраченный миокард. В последние годы большие надежды на решение этой проблемы возлагают на развитие методов клеточной терапии [Агеев и соавт., 2010], в частности, с использованием мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, для которых была продемонстрирована возможность кардиомиоцитарной дифференцировки как in vitro, так и in vivo [Povsic et al., 2010; Fukuda et al., 2001; Kajstura et al., 2005; Kawada et al., 2004]. Однако, проведенные экспериментальные и клинические исследования, не показали достаточно высокой эффективности клеточной терапии ХСН и не подтвердили возможность замещения утраченного миокарда за счет дифференцировки трансплантированных клеток [Lipinski et al., 2007; Rubart et al., 2008; Murry et al., 2005]. Эффекты, наблюдаемые при трансплантации клеток костного мозга, были обусловлены, в основном, их паракринной активностью, подавляющей апоптоз кардиомиоцитов и стимулирующей ангиогенез и активность собственных резидентных клеток сердца [Satija et al., 2009; Hatzistergos et al., 2010]. На сегодняшний день ученые заняты поиском новых источников прогениторных клеток для терапии ХСН. В этом аспекте большой интерес вызывают недавно открытые резидентные стволовые клетки сердца (СКС) [Beltrami et al., 2003; Matsuura et al., 2004; Hierlihy et al., 2002; Messina et al., 2004; Laugwitz et al., 2005]. Термином «резидентная СКС» обозначается неоднородная популяция незрелых клеток, обнаруживаемых в миокарде, способных к самообновлению и дифференцировке в клетки сердца (кардиомиоциты, эндотелиальные и гладкомышечные клетки сосудов). Описано несколько популяций СКС, различающихся методами выделения и набором поверхностных антигенов (с-kit, sca-1, MDR-1). Общим для большинства из описанных популяций является экспрессия на поверхности клеток рецептора с—kit к фактору стволовых клеток. Получены данные, указывающие на участие СКС в процессах регенерации и обновления миокарда [Urbanek et al., 2005]. Показана возможность получения и экспансии в культуре ex vivo аутологичных СКС из биоптатов миокарда человека [Dawn et al., 2005], аневризмы левого желудочка (JDK) [Рубина, Акчурин, Парфенова, 2009; Дергилев и соавторы, 2010], ушка правого предсердия (ПП) сердца [van Vliet et al., 2008; Dergilev et al., 2010]. На моделях ИМ у иммунодефицитных животных продемонстрировано эффективное восстановление сократительной функции сердца при трансплантации СКС человека [Beltrami et al., 2003; Dawn et al., 2005; Bearzi et al., 2007]. Существование резидентных СКС, участвующих в репаративных процессах, делает особенно актуальной разработку подходов к активации эндогенного механизма регенерации сердца. Помимо этого, применение собственных прогениторных клеток сердца для лечения сердечно-сосудистых заболеваний

представляется перспективным, так как не требует проведения иммуносупрессивной терапии и исключает возможность переноса инфекционных агентов от донора. Однако для разработки клинически приемлемой технологии как стимуляции, так и использования аутологичных резидентных СКС для клеточной кардиомиопластики, необходимо детальное изучение свойств этих клеток, в том числе, и у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Для этого необходимо выбрать оптимальные источники получения СКС из сердца человека, разработать методы их культивирования и направленной дифференцировки, изучить функциональные характеристики этих клеток, что требует проведения дополнительных исследований.

Цель данной работы: охарактеризовать с-кИ позитивные резидентные СКС в миокарде больных ишемической болезнью сердца (ИБС), отработать методику их выделения и культивирования, оценить способность к направленной дифференцировке в клетки сердца.

Для достижения этой цели необходимо решить следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить характер распределения, иммунофенотип и пролиферативный статус с-к^+ клеток в миокарде больных ИБС (ушко правого предсердия, аневризма левого желудочка) и в неповрежденном миокарде (аутопсийный материал).

2. Исследовать влияние возраста, пола, факторов риска ИБС, выраженности атеросклероза коронарных артерий, наличия сердечной недостаточности на количество с-кк+ клеток в образцах миокарда больных ИБС.

3. Отработать методики выделения и экспансии в культуре популяции с—кк+ клеток сердца.

4. Оценить пролиферативный и клоногенный потенциал, экспрессию генов плюрипотентности в культуре с-кк+ клеток миокарда человека.

5. Оценить способность с-кЬ+ клеток миокарда человека секретировать ангиогенные факторы роста.

6. Изучить способность культивируемых с-кИ+ клеток сердца к дифференцировке в кардиомиоцитарном, эндотелиальном и гладкомышечном направлениях. Научная новизна. В представленной работе впервые выполнена комплексная

оценка свойств с—кИ+ СКС с использованием современных научных методов на уникальном операционном материале (ушко ПП, аневризма сердца), полученном от больных ИБС. Охарактеризована локализация, иммунофенотип, пролиферативный статус, наличие клеток-предшественников разных направлений дифференцировки в миокарде ушка ПП и аневризмы ЛЖ у пациентов с ИБС. Впервые установлено, что ткань аневризмы ЛЖ содержит СКС. Выполнено сопоставление количества с-кк+ клеток в миокарде больных ИБС с факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний, выраженностью коронарного атеросклероза, показателями сократительной функции сердца и обнаружена связь между количеством СКС и полом, возрастом пациентов, выраженностью коронарного атеросклероза и размером левого предсердия. Впервые показано, что СКС, полученные из разных источников (ушко ПП и аневризма ЛЖ) отличаются по пролиферативным и дифференцировочным свойствам. Получены данные об экспрессии генов плюрипотентности в СКС больных ИБС.

Практическая значимость работы. Разработана методика получения с—кк+ СКС из ткани ушка ПП и аневризмы ЛЖ. Это обеспечивает возможность углубленного изучения свойств этих клеток у больных ИБС, что необходимо для разработки методов стимуляции эндогенных механизмов регенерации миокарда.

Результаты диссертации могут служить основой для создания клинически пригодного метода получения СКС из фрагментов ткани ушка ПП, отсекаемых при постановке шунтов во время операции АКШ. Эти методики важны для дальнейшей разработки протоколов для клеточной терапии или создания банка стволовых клеток.

Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу факультета фундаментальной медицины МГУ имени М. В. Ломоносова и ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития РФ и используются в педагогической деятельности факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова.

Работа выполнена при поддержке Государственного контракта № 16.512.11.2084 в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2013 годы».

Апробация диссертации состоялась 31 мая 2011 года на совместном заседании кафедры биохимии и молекулярной медицины, научно-исследовательской лаборатории генных и клеточных технологий факультета фундаментальной медицины МГУ имени М. В. Ломоносова и лаборатории ангиогенеза Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК МЗ СР РФ, а также на заседании кафедры биохимии медицинского факультета РУДЫ (2 июня 2011 года). Результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях: ISSCR 7th Annual Meeting (Barcelona, Spain, 2009), 5th Stern Cell Research & Therapeutics (Boston, USA, 2009), World conference on regenerative medicine (Leipzig, Germany, 2009).

Публикации. Результаты работы представлены в 4 статьях и в 10 тезисах докладов. /л/.

Структура работы. Диссертация представлена на'-'Остраницах; состоит из введения, обзора литературных данных, описания методов и материалов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, клинических примеров и списка цитируемой литерату ры. Работа содержит 46 рисунков и 3 таблицы. Список литературы включает^^источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика пациентов, включенных в исследование. Исследование проведено на материале, полученном от пациентов с ИБС, прошедших обследование и плановое хирургическое лечение в отделе сердечно-сосудистой хирургии (руководитель - академик РАМН Р. С. Акчурин) Института клинической кардиологии им. А. Л. Мясникова ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ СР РФ. Исследование состояло из двух основных этапов. На первом этапе проводилась характеристика СКС в образцах миокарда взрослого человека (80 образцов ушка ПП и 22 образца ткани хронической постинфарктной аневризмы сердца). Иссечение ушка ПП проводилось при канюляции IUI для подключения к аппарату искусственного кровообращения в ходе стандартного этапа операции аорто-коронарного шунтирования (АКШ). Иссечение аневризмы сердца проводилось в ходе операции аневризмэктомии в сочетании с вентрикулопластикой. Характеристика СКС проводилась с использованием методов иммунофлуоресцентного окрашивания криосрезов миокарда и проточной цитофлуориметрии.

Перед операциями АКШ и аневризмэктомии всем пациентам было проведено стандартное обследование (опрос и физикальное обследование пациента; общий

клинический, биохимический (включающий липидный спектр и высокочувствительный С-реактивный белок), коагулогический анализы крови; общий анализ мочи и анализ мочи по Нечипоренко; ЭКГ в 12 отведениях, суточное мониторирование ЭКГ по Холтеру, трансторакальная двухмерная эхо-кардиография, коронарная ангиография). При необходимости - определение концентрации инсулина, С-пептида, гормонов щитовидной железы в плазме крови. Части пациентов были проведены синхронизированная однофотонная эмиссионная компьютерная томосцинтиграфия миокарда и магнитно-резонансная томография сердца.

У больных ИБС проведено сопоставление количества с-Ы1+ СКС в ткани ушка ПП (50 образцов) и аневризмы сердца (15 образцов) с возрастом, полом, факторами риска ИБС, выраженностью атеросклероза коронарных артерий, сократительной функцией сердца по данным ЭХО-КГ. Клиническая характеристика этих пациентов представлена в таблице 1 и 2. В 65 образцах выполнялось исследование иммунофенотипа СКС, их пролиферативного статуса (50 образцов ткани ушка ПП и 15 образцов аневризмы ЛЖ). На втором этапе исследования были использованы образцы миокарда (22 образца, полученных от пациентов с аневризмой ЛЖ и 100 образцов ушка 1111) для отработки протоколов выделения, культивирования и дифференцировки с-кйн- клеток.

Для характеристики с-кц+ СКС в здоровом миокарде было также проанализировано 16 аутопсийных образцов миокарда, полученных не более чем через 4 часа от момента смерти лиц, погибших в результате несчастного случая. Результаты патологоанатомического исследования указывают на отсутствие выраженного коронарного атеросклероза, гипертрофии и дилатации полостей сердца, а также признаков инфекционных заболеваний у этих людей. Эти данные позволяют рассматривать образцы миокарда людей, погибших в результате несчастного случая, в качестве здорового (неповрежденного) миокарда, то есть, не имевшего морфологических изменений, связанных с заболеваниями сердца. Образцы здорового миокарда были взяты из разных анатомических отделов сердца (ЛП, ПП, ЛЖ, ПЖ и верхушки сердца) у людей разного возраста (5 месяцев, 1 год, 2, 3, 7 (2 человека), 8, 9, 17, 22, 25, 30, 35, 36, 40 и 45 лет).

Таблица 1. Характеристика больных ИБС, у которых проводилось сопоставление количества с-кН+ клеток ушка ПП с клиническими

параметрами.

Пациенты

Возраст, годы 61,8+10,2

Мужчины 40 (80%)

Женщины 10 (20%)

Курящие 26 (52%)

Артериальная гипертония 45 (90%)

Сахарный диабет 2 типа 19 (38%)

Сердечная недостаточность 15 (30%)

ИМ в анамнезе 31 (62%)

Гиперхолестеринемия 16 (32%)

Индекс массы тела, кг/м2 28,8+3,5

Фракция выброса левого желудочка 55,0+9,4

Гемодинамически значимые стенозы брахиоцефальных артерий или артерий подвздошно-бедренного сегмента 24 (48%)

Глюкоза, ммоль/л 5,8+1,4

СОЭ, мм/час 12,1+2,8

Креатинин. мкмоль/л 102,9+18,2

1/2/3-сосудистое поражение 1/22/27

Значимое поражение ствола ЛКА/ПНАЮА/ПКА 13/41/31/27

Заболевания органов дыхания 15 (30%)

Заболевания желудочно-кишечного тракта 35 (70%)

Болезни почек 21 (42%)

Медикаментозная терапия:

р-адреноблокаторы 43 (86%)

Ингибиторы АПФ 7(14%)

Диуретики 11 (22%)

Антагонисты кальция 1 (2%)

Блокатор 1Г каналов синусового узла 3 (6%)

Антиагреганты 50(100%)

Статины 47 (94%)

Таблица 2. Характеристика больных ИБС, у которых проводилось сопоставление количества с-кк+ клеток аневризмы сердца с клиническими

Пациенты

Возраст, годы 54,6+11

Мужчины 14 (93%)

Женщины 1 (7%)

Курящие 10(67%)

Артериальная гипертония 10 (67%)

Сахарный диабет 2 типа 2(13%)

Сердечная недостаточность 15(100%)

ИМ в анамнезе 15 (100%)

Дислипидемия 13 (87%)

Индекс массы тела, кг/м 30+4,4

Фракция выброса левого желудочка 33,2+7,4

Гемодинамически значимые стенозы

брахиоцефальных артерий или артерий 3 (20%)

подвздошно-бедренного сегмента

Глюкоза, ммоль/л 5,1+0,7

СОЭ. мм/час 15,2+8,8

Креатинин. мкмоль/л 109,8+28,4

1/2/3-сосудистое поражение 8/3/4

Значимое поражение ствола ЛКА/ПНА/ОА/ПКА 3/13/6/6

Заболевания органов дыхания 5 (33%)

Заболевания желудочно-кишечного тракта 10 (67%)

Болезни почек 2 (13%)

Медикаментозная терапия:

Р-адреноблокаторы 11 (73%)

Ингибиторы АПФ 9 (60%)

Диуретики 5 (33%)

Антагонисты рецепторов ангиотеизина II 3 (20%)

Блокатор If каналов синусового узла 1 (7%)

Антиагреганты 15 (100%)

Статины 13 (87%)

Биохимические методы.

Иммуноблоттинг. Белки разделяли с помощью SDS-электрофореза в полиакриламидном геле по методике Леммли [Laemmli, 1970]. Электроперенос осуществляли на PVDF-мембрану в приборе Semy-dry transfer cell Trans-blot («BioRad Laboratories», США). После переноса мембрану инкубировали в блокирующем буфере (2% ECL Advance Blocking Reagent («Amersham Biosciences», США) в TBST (20mM Tris-HCl; pH 7,6; 150mM NaCl; 0,1% Tween-20)). В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела к человеческому VEGF («АЬсаш», США), HGF («АЬсаш», США) и вторичные антитела козы к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена AffiniPure (Н + L) («Jackson ImmunoResearch», США). Детекцию белков осуществляли с помощью хемилюминесцентного субстрата ECL™, Western Blotting Detection Reagents («Amersham Biosciences», США). Полученное на пленке изображение сканировали с помощью сканера Epson («Seiko Epson», Япония) и обсчитывали с помощью программы Scion image («Adobe», США).

Иммуноферментный анализ (ИФА). Анализ VEGF и HGF в среде культивирования c-kit+ клеток проводили с помощью ИФА с использованием соответствующих наборов реагентов Human VEGF and HGF Quantikine Kit («R&D Systems», США) в соответствии с руководством по использованию компании производителя.

Выделение РНК. Выделение РНК осуществлялось с использованием коммерческих реагентов «RNeasy Miny Kit (50)» («QIAGEN», США) согласно протоколу фирмы изготовителя. Количество РНК измеряли спектрофотометром («Eppendorf», США). Качество оценивали электрофоретически в агарозном геле, образец считался подходящим для ПЦР, если на форезе были отчетливо видны две полосы, соответствующие 28 и 18 S РНК.

Реакция обратной транскрипции. Синтез первых цепей кДНК проводили согласно стандартному протоколу фирмы «Fermentas», используя олиго-dT-праймеры и фермент РНК-зависимую ДНК полимеразу RevertAid™ M-MuLV Reverse Transcriptase («Fermentas», Латвия). Реакцию проводили в ПЦР — амплификаторе («Eppendorf», США). Все манипуляции проводили в стерильных условиях под ламинарным потоком воздуха, во избежание контаминации.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени. Для количественного анализа экспрессии генов проводили ПЦР в реальном времени с интеркалирующим красителем Sybr Green («Синтол», Россия) в амплификаторе «BIO-RAD iQ5. Multicolor Real-time PCR detection system» («Bio-Rad», США). В качестве праймеров использовали уникальные комплементарные пары олигодезоксинуклеотидов к анализируемым генам (Oct4, Sox2, Klf4, C-myc, Nanog, ß-actin, GAPDH) («Синтол», Россия). Стандартизацию результатов ПЦР проводили по уровню сигнала ß-actin и GAPDH.

Цитологические и гистологические методы.

Выделение клеток и проточная цнтофлуориметрия. Ткань миокарда измельчали ножницами до получения консистенции суспензии. Далее кусочки ткани смешивали с раствором фермента (1 мг/мл) коллагеназы A («Roche diagnostics», США) и инкубировали около 60 минут при 37НС и постоянном помешивании на

шейкере. Полученную клеточную суспензию фильтровали через нейлоновые мембраны («BD Pharmingen», США) с размером пор 40 микрон и использовали для цитофлуориметрического анализа. Окрашивание клеток для анализа проводилось по протоколу компании Abeam [vvww.abcam.com]. Анализ иммунофенотипа клеток проводили на клеточном сортере MoFlo («DakoCytomation», Дания) и на проточном цитофлуориметре BD FACS Canto™ II («BD Pharmingen», США).

Культнвнрованне клеток методом эксплантной культуры и получение кардносфер. Ткань миокарда измельчали ножницами до размера кусочков 2-3 мм3, затем промывали раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ) 3 раза. Далее проводили обработку ткани раствором ферментов (0,1% коллагеназы A («Roche diagnostics», США) и 0,2% трипсина («Invitrogen», США) в ФСБ) при 37 °С в течение 15 минут при постоянном покачивании на шейкере. После инкубации к раствору ферментов с кусочками ткани добавляли тройной объем среды IMDM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) («Hyclone», США) и центрифугировали 10 минут со скоростью 1000 оборотов в минуту. Затем кусочки ткани миокарда промывали 3 раза раствором ФСБ помещали на пластиковые культуральные чашки, предварительно покрытые 1% желатином или фибронектином, в среду культивирования (IMDM («Invitrogen», США), содержащей 10% ФБС, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина). Каждые три дня производили частичную замену среды. Экспланты культивировали до момента появления округлых клеток, располагающихся на слое фибробластов (14-21 день). С помощью среды для открепления клеток Accutase («ICT», США) клетки снимали с чашки, фильтровали через нейлоновые мембраны («BD Pharmingen», США) с размером пор 40 мкм и, далее, использовали для анализа иммунофенотипа методом проточной цитофлуориметрии, иммуномагнитной селекции или получения кардиосфер. Для получения кардиосфер клетки эксплантной культуры высаживали на чашки, покрытые полилизином в среду для формирования кардиосфер (35% среды IMDM/65% среды DMEM F12 («Invitrogen», США) с добавлением 2% В27, 10 нг/мл EGF, 20 нг/мл bFGF, 40 нМ Кардиотрофина-1, 40 нМ тромбина, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ L—глутамина).

Сортировка клеток эксплантной культуры методом иммуномагнитной селекции. Для иммуномагнитной селекции с—kit клеток применялся набор для иммуномагнитной селекции c-kit+ клеток («Miltenyi Biotec», США) или использовались первичные моноклональные антитела к антигену с—kit человека («Biolegend», США) и вторичные антитела к Fc-фрагменту мышиных IgG («Dynal Biotech», Норвегия), конъюгированные с магнитными бусинами. Иммуномагнитная селекция клеток проводилась в соответствии с рекомендациями фирм изготовителей. Полученные c-kit+ клетки культивировали в среде Myelocult («Stem cell Technologies», США), содержащей 40 нМ кардиотрофина-1 или Cardiac Cellulation Media («DV Biologies», США) на чашках, покрытых фибронектином.

Клональный анализ c-kit+ клеток. Оценку клоногенного потенциала c-kit+ клеток проводили в среде (35% среды IMDM/65% среды DMEM F12 с добавлением 2% В27, 10 нг/мл EGF, 20 нг/мл bFGF, 40 нМ Кардиотрофина-1, 40 нМ тромбина, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина) по протоколу, описанному ранее [Messina et al.. 2004; Smith et al., 2007].

Оценка пролиферации c-kit+ клеток. Культивирование c-kit+ клеток проводили на чашках, покрытых фибронектином, в среде Cardiac Cellulation Media

(«DV Biologies», США) по протоколу, описанному ранее в литературе [Widera et al., 2009].

Оценка способности c-kit+ клеток образовывать капнлляроподобные структуры in vitro. Оценку способности c-kit+клеток ушка ПП образовывать капнлляроподобные структуры in vitro проводили с использованием чашек, покрытых Matrigel («BD Pharmingen», США) по протоколу, описанному ранее [Rubina et.al., 2009].

Культивирование с—kit+ клеток в условиях гипоксии. Использовали с—kit+ клетки ушка ПП (20000/см2) 3-го пассажа, культивированные в среде без сыворотки (аМЕМ, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ L—глутамина), помещали либо в стандартные условия культивирования (21% 02), либо в условия гипоксии (1% 02). Через 48 часов проводили забор среды культивирования, которую использовали в дальнейшем для проведения ИФА. Среду культивирования хранили при температуре -70° С. Количество клеток на момент окончания эксперимента подсчитывали в камере Горяева.

Исследование дифференцировочного потенциала с—kit+ клеток миокарда. Для индукции кардиомиоцитарной и эндотелиальной дифференцировки c-kit+ клетки, полученные методом иммуномагнитной селекции, высаживали на стекла (20000 клеток/см2) в среду Cardiomyocyte Cellutions'™ Differentiation Media («DV Biologies», США) с добавлением 5-азацитидина 10 мкМ. Культивирование клеток в присутствие 5-азацитидина проводили в течение 72 часов с заменой среды каждые 24 часа. Далее клетки культивировали в среде Cardiomyocyte Cellutions1™ Differentiation Media с добавлением 10 нг/мл TGI p в течение 21 дня. В качестве отрицательного контроля, фибробласты сердца взрослого человека культивировали в тех же условиях, что и c-kit+ клетки. Для контроля дифференцировки c-kit клетки культивировали в среде Cardiomyocyte Cellutions"" Differentiation Media без добавок в течение 21 дня.

Для индукции дифференцировки с—kit+ клеток аневризмы в кардиомиоцитарном направлении был подобран другой протокол, согласно которому c-kit+ клетки аневризмы, полученные методом иммуномагнитной селекции, высаживали на стекла (20000 клеток/см2) в среду аМЕМ («Invitrogen», США) с добавлением 1% ФБС, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 10~8 M дексаметазона («Sigma», США) и 10 нг/мл TGF0 и культивировали в течение 21 дня. Замена среды культивирования проводилась каждые 24 часа. В качестве отрицательного контроля фибробласты сердца взрослого человека культивировали в тех же условиях, что и c-kit+ клетки аневризмы. Для контроля дифференцировки с-kit клетки культивировали в среде аМЕМ без добавок в течение 21 дня.

В работе также был использован другой метод индукции кардиомиоцитарной дифференцировки — со-культивирование с—kit+ клеток человека с неонатальными кардиомиоцитами крысы. Выделение и культивирование неонатальных кардиомиоцитов крысы проводили по протоколу, описанному ранее [Rubina et.al., 2009; Zaruba et al., 2010]. Со-культивирование неонатальных кардиомиоцитов крысы, меченных липофильным красителем CellTracker CM-Dil («Molecular Probes», США), и c-kit+ клеток человека проводили в среде (аМЕМ с 5% ФБС, Insulin-Transferrin-Selenium («Gibco», США), 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина) в течение 120 часов. В качестве контроля выполнено со-культивирование неонатальных кардиомиоцитов крысы с фибробластами человека.

Иммунофлуоресцентиое окрашивание. Фиксацию, окрашивание клеток и криосрезов миокарда проводили по протоколу иммунофлуоресцентного окрашивания

компании Abeam [www.abcam.com] с использованием специфических антител к соответствующим антигенам. Препараты анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа Axiovert 200М («Zeiss», Германия). Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Axiocam HRC («Zeiss», Германия) и обработки изображения в программах Axiovision 3.1 («Zeiss», Германия) и Adobe PhotoShop CS («Adobe Systems», США).

Статистический анализ.

Данные в работе представлены как среднее значение + ошибка среднего. Статистический анализ данных осуществлялся с использованием программы Statistica 6,0 («Statsoft», США). Для проверки распределений применялись статистические критерии — Шапиро-Уилкса и Колмогорова-Смирнова. Для сравнения выборок при наличии нормального распределения использовался t-критерий Стьюдента, в остальных случаях использовался U-критерий Манна-Уитни. Различия считались достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

Распределение с—kit+ клеток в миокарде и влияиие возраста человека на их количество. На первом этапе исследования с помощью метода иммунофлуоресцентного окрашивания срезов был выполнен поиск СКС в образцах миокарда, полученных от людей, погибших в результате несчастного случая и пациентов, страдающих ИБС (ушко ПП, аневризма сердца). В качестве маркера СКС был использован с—kit (рецептор фактора стволовых клеток (SCF)) [Bearzi et al., 2007; Beltrami et al., 2001; Linke et al., 2005; Urbanek et al., 2006]. Поскольку этот рецептор также экспрессируют тучные клетки и некоторые гематопоэтические клетки, к стволовым клеткам сердца относили только c-kit+ клетки, не несущие характерного для гематопоэтических/тучных клеток панлейкоцитарного маркера CD45 и триптазы. Все подсчеты проводились только для c-kit+CD45- клеток. В исследованных образцах неповрежденного миокарда и ушка ПП, с—kit рецептор локализовался на поверхности единичных клеток, имеющих округлую или вытянутую форму, и расположенных в интерстициальном пространстве между кардиомиоцитами (Рис. 1). C-kit+ клетки аневризмы сердца имели сходную морфологию и определялись как в виде единичных клеток, так и в составе кластеров «клеточных ниш», локализованных в мышечной, фиброзной, жировой и смешанной частях аневризмы.

Количество c-kit+ клеток в неповрежденном миокарде (аутопсийный материал) обратно коррелировало с возрастом (г = -0,78, р<0,05, п = 16). Максимальное количество c-kit+ клеток было обнаружено в миокарде ребенка в возрасте 1 года, которое составляло =160000 клеток на 1 см3 ткани. Среднее число таких клеток в 1 см3 ткани миокарда детей в группе до 3 лет составляло 97332 ± 33651 (п= 4), в группе 7-9 лет составляло в среднем 44268±10097 (п= 4), в группах от 17 до 30 и от 35 до 45 лет — 11353+9031 (п= 4) и 8518+2643 (п= 4) клеток соответственно (Рис. 2). Среднее количество c-kit+ клеток в ткани хронической постинфарктной аневризмы составляло 3327+1234 клеток в см3 ткани (п=15), что было почти в три раза меньше количества с-kit+ клеток в неповрежденном миокарде ЛЖ людей близкой возрастной группы (8518 ± 2643 клеток в см3 ткани).

Выявленные нами изменения содержания с—kit+ клеток в миокарде ЛЖ согласуются с описанной динамикой развития сердца. В нашем исследовании максимальное количество c-kit+ клеток было обнаружено в детской возрастной

группе от 5 месяцев до 3 лет, когда процессы постнатального онтогенеза сердца протекают с максимальной скоростью. Именно в этот период происходит увеличение массы органа и значительные изменения в его внутренней структуре. В дальнейшем сердце достигает дефинитивного состояния, происходит снижение количества c-kit+ клеток параллельно снижению скорости роста миокарда. Таким образом, максимальное количество c-kit+ клеток в миокарде приходится на период активного роста, что может указывать на их участие в процессах роста и развития сердца. Уменьшение количества c-kit+ клеток с возрастом может быть связано с естественными процессами старения миокарда и самих СКС. Старение СКС характеризуется снижением их пролиферативного потенциала, укорочением теломер и экспрессией проапоптотических белков и ингибиторов клеточного цикла [Chimenti et al., 2003, Kajstura et al. 2000; Torella et al., 2004, Rota et al. 2006].

Анализ иммунофенотнпа с—kit+ клеток миокарда. С помощью методов иммунофлуоресцентного окрашивания показано, что c-kit+ клетки как в миокарде людей, не имеющих заболеваний сердца, так и у людей, больных ИБС, несли на своей поверхности белок множественной лекарственной устойчивости (MDR1). Выявленные в ткани сердца человека с—kit+ клетки, несли на своей поверхности с— met (рецептор HGF - фактора роста гепатоцитов), а также IGF-1R (рецептор IGF—1 -инсулиноподобного фактора роста). Оба рецептора характерны для СКС и других типов стволовых/прогениторных клеток [Urbanek et al., 2005, D'Amario et al., 2011]. Показано, что HGF при связывании с с—met активирует миграцию, клеточный рост и выживаемость стволовых клеток [Linke et al., 2005]. Через связывание со своим рецептором IGF-1 регулирует пролиферацию, выживаемость и дифференцировку клеток [Padin-Iruegas et al., 2009; Linke et al., 2005]. Предполагается, что системы с-met/HGF и IGF-1R/IGF-1 действуют сообща, регулируя уровень пролиферации, апоптоза, выживаемость и направленную миграцию в зоны повреждения СКС [Urbanek et al., 2005].

C-kit+ клетки экспрессировали белок межклеточных контактов N-кадгерин, также характерный для резидентных СКС [Fuchs et al., 2004; Leri et al., 2005] и необходимый для их взаимодействия с окружающими клетками в составе «клеточной ниши».

Известно, что рецептор с—kit могут экспрессировать гематопоэтические клетки-предшественники костного мозга, которые при повреждении сердца мигрируют в миокард и, по данным некоторых исследователей, дифференцируются в специализированные клетки сердца [Kajstura et al., 2005; Rota et al., 2007; Scherchel et al., 2008]. Учитывая это, мы провели двойное иммунофлуоресцентное окрашивание срезов миокарда антителами к c-kit+ и к маркеру гематопоэтических клеток CD34 и не обнаружили ни одной c-kit+ клетки, ко-экспрессирующей CD34.

Сопоставление количества с—kit+ клеток в миокарде с клиническими характеристиками больных ИБС. С помощью проточной цитофлуориметрии мы сопоставили количество c-kit+CD45- СКС в 50 образцах миокарда ушка ПП и 15 образцах аневризмы JDK с факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний, данными лабораторного и инструментального обследования пациентов.

Выполнено сравнение количества СКС в образцах ушка 1111 сердца в зависимости от пола в двух возрастных группах - до 60 лет и после 60 лет. Количество c-kit+ СКС в образцах, полученных от женщин в возрасте до 60 лет, было достоверно выше, чем у женщин более старшего возраста и мужчин обеих возрастных групп (Рис. 3). Обнаруженный в нашем исследовании характер

Г " / - 4 щ Й л^В ч А . . -. ч Б

ч В - т» ■ . \ , V ч Г> —

Рисунок 1. Локализация c-kit+ клеток в ткани аневризмы, ушке правого предсердия и миокарде левого желудочка сердца здоровых людей. Двойное

иммунофлуоресцентное окрашивание ткани

миокарда антителами к c-kit (зеленый) и саркомерному альфа-актинину (красный). А—ткань аневризмы; Б-ушко правого предсердия; В— неповрежденный миокард ребенка 3 лет; Г -неповрежденный миокард взрослого человека 45 лет. Стрелки указывают на с—kit позитивные клетки.

Масштабный отрезок 20 мкм.

5 *

U 03

о 5"

eg

si

p<0.001

|><0.Q0i

Рисунок 2. Количество с-кИ+ клеток в миокарде левого желудочка людей разного возраста без сердечно-сосудистых заболеваний и в ткани аневризмы сердца.

■ 0-5-3 гола «17-9 пет ■ 17-30 пет ■ 35-45 пет ИАневоилма

Р=0,ю

■ Ж до 60 пет

11-5 п=М

■ М до 60 пет ■ Ж после 60 лет

Рисунок 3. Распределение с-кМ+ СКС в образцах ушка правого предсердия

мужчин и женщин разных возрастов.

п-26

> М после 60 лет

n=22 n=27 ^ 2 сосуда ■ 3 и более

с с

<0

— э

* %

о *

£ S gS

i§ с о

й о

р=0,000001

II

п=26 п=24

Рисунок 4. Распределение с-кй+ СКС в образцах ушка правого предсердия в зависимости от количества пораженных коронарных артерий.

■ ■ЛП в норме иЛПболее4см

Рисунок 5. Распределение c-kit+ СКС в образцах ушка правого предсердия пациентов с

нормальным и увеличенным передне-задним размером левого предсердия.

Рисунок 6. Экспрессия саркомерного а-актинина в c-kit+ клетках ткани ушка правого предсердия сердца человека.

Двойное иммунофлуоресцентное

окрашивание ткани ушка правого предсердия на маркеры с—kit (зеленый), саркомерный а-актинин (красный); Стрелка указывает на окрашенную c-kit+ клетку. Масштабный отрезок 10 мкм.

Рисунок 7. C-kit+ клетки ушка правого предсердия, полученные методом иммуномагнитной селекции.

А- через 24 часа после селекции; Б- через 5 суток после селекции; В- монослой с—kit клеток (14 дней); Г-иммунофлуоресцентное окрашивание клеток антителами к с—kit (зеленый). Ядра клеток покрашены DAP1 (синий). Масштабный отрезок 50мкм.

Рисунок 8. Шарообразные клеточные скопления — кардносферы, получаемые из клеток эксплантной культуры ушка правого предсердия.

А, Б — сформированные кардиосферы. Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов кардиосфер антителами к c-kit (В; зеленый) и CD105 (Г; красный). Масштабный отрезок 50 мкм.

3

■ с-*1г+ клетки ушка ПП □ Клетки поют эмбриона человека т ш Клетки лепгаго эмв^иона^еловега н Фи'вровласты кожи человека <т Я Фибр оС лас ты сердца человека __|

t

1 -

ОсМ Sox2 KLF4 C-myc Nanog

Рисунок 9. Экспрессия генов плюрипотентности в с-кк+ клетках ушка правого предсердия (красный), клетках почки (оранжевый) и легкого (голубой) эмбриона человека, фибробластах кожи (зеленый) и сердца (фиолетовый) взрослого человека.

А

VEGF 21%02 1%02

mm

GAPDH GAPDH'

I»- (МИ

р-0,01

güVEGF21%02 BVEGF 1%02 HGf 21%02 Ш HGf 1%02

Рисунок 10. Секреция VEGF и HGF c-kit+ клетками ушка правого предсердия в стандартных условиях и при гипоксии in vitro. А — анализ содержания VEGF и HGF в среде культивирования c—kit+ клеток, выполненный методом иммуноблотинга; Б — анализ содержания VEGF и HGF в среде культивирования c—kit+ клеток, выполненный методом ИФА.

Рисунок 11. Маркеры кардиомиоцитарной дифференцировки в культуре c-kit+ клеток ушка ПП после культивирования в

дифференцировочной среде. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание ткани ушка ПП на маркеры Nkx 2,5 (А; красный) и тропонин I (Б; зеленый). Ядра клеток покрашены DAPI (синий). Масштабный отрезок 20 мкм.

Рисунок 12. Кардиомиоцитарная дифференцировка c-kit+

клеток сердца человека при со-культивировании с

неонатальными кардиомиоцитами крысы. А, Б- неонатальные

кардиомиоциты крысы с красителем cell tracker CM-Dil (Molecular Probes) (красный). Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток

антителами к тропонину I (А; зеленый), саркомерному а— актинину (Б; зеленый). Ядра клеток покрашены DAPI (синий). Масштабный отрезок 50 мкм.

распределения СКС в зависимости от пола и возраста совпадает с данными Каджстуры [Kajstura et al., 2010], который показал высокую функциональную активность СКС у женщин, особенно в молодом возрасте. Различия в способности к самоподцержанию и в функциональных свойствах СКС у женщин и мужчин могут быть связаны с особенностями гормонального фона женщин. Эстрогены способны стимулировать рецепторы IGF-1 [Richards et al., 1996] и активировать фосфатидилинозитол-3 —киназный путь [Rote et al., 2005], а также связываться с промотерной областью теломеразы, запуская ее транскрипцию [Kyo et al., 1999]. Все эти эффекты стимулируют рост, выживание и пролиферацию СКС у женщин, особенно в гормонально активном возрасте [Gonzales et al., 2008; Torella et al., 2007].

При сопоставлении количества СКС с выраженностью атеросклеротического поражения коронарных артерий, по данным коронароангиографии, была выявлена положительная корреляция между количеством c-kit+ СКС в ушке ПП и количеством пораженных коронарных артерий (г=0,46; р=0,001; п=50). Количество СКС в ушке ПП у пациентов с многососудистым поражением коронарных артерий (3 и более сосудов) было достоверно выше, чем у пациентов с 2-сосудистым поражением (Рис. 4). Подобные корреляции уже были выявлены для циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток [Kunz et al., 2006; Schmidt-Lucke et al., 2005], что позволило рассматривать их количество в периферической крови как показатель тяжести поражения коронарных артерий и, следовательно, тяжести ишемического поражения. Выявленная нами корреляция может отражать более выраженную активацию пролиферации СКС в миокарде больных с тяжелым поражением коронарных артерий и, вероятно, большей ишемией миокарда. В работе Тиллмэнс [Tillmans et al., 2008] показано участие с—kit+ СКС в васкулогенезе и построении новых коронарных артерий, артериол и капилляров в миокарде in vivo.

Количество c-kit+ СКС в ушке ПП у больных ИБС коррелировало с передне-задним размером левого предсердия, определенным с помощью ЭХО-КГ(г=0,39; р=0,04; п=50). У больных с передне-задним размером ЛП 40 мм и более количество СКС было достоверно больше, чем у больных с размером ЛП меньше 40 мм (Рис. 5). Поскольку, у включенных в это исследование больных не было выявлено митрального стеноза, митральной недостаточности и мерцательной аритмии, увеличение размера ЛП может свидетельствовать о наличии диастолической дисфункции, о повышении давления наполнения ЛЖ и риска застойных явлений в малом круге кровообращения. Вероятно, это патологическое состояние может служить фактором активации СКС в клеточных «нишах» обоих предсердий и их повышенной пролиферации.

Многофакторный анализ не выявил каких-либо связей между количеством СКС в миокарде ушка ПП больных ИБС и массой тела, курением, наличием артериальной гипертонии, сахарного диабета, сердечной недостаточности, нарушений липидного обмена, гипергликемией, фракцией выброса ЛЖ.

Сопоставление количества СКС в ткани аневризмы ЛЖ с клиническими характеристиками больных ИБС не выявило каких-либо зависимостей, что, возможно, обусловлено небольшим размером выборки (15 больных).

Анализ маркеров кардиомноцитарнон, эндотелналыюй н гладкомышечной дифференцировки в c-kit+ клетках миокарда. По данным нескольких работ c-kit+ СКС способны дифференцироваться в кардиомиоциты, гладкомышечные и эндотелиальные клетки in vitro и in vivo [Bearzi et al., 2007; Beltrami et al., 2003]. Мы проанализировали экспрессию маркеров кардиомиоцитарной, эндотелиалыюй и

гладкомышечной дифференцировки на c-kit+ клетках в ткани ушка ПП и аневризмы с помощью двойного иммунофлуоресцентного окрашивания. В качестве маркеров эндотелиальной дифференцировки использовали Ets 1 — транскрипционный фактор, характерный для предшественников эндотелиальных клеток, CD31 —маркер зрелого эндотелия, маркер активированного эндотелия или эндотелиальных клеток-предшественников - VEGFR2 (рецептор к фактору роста эндотелия 2 типа). Для оценки гладкомышечной дифференцировки использовали транскрипционный фактор Gata 6, гладкомышечный а-актин - маркер зрелых гладкомышечных клеток и/или перицитов и NG2 — маркер перицитов. В качестве маркеров кардиомиоцитарной дифференцировки использовали Nkx 2,5, Gata 4 и саркомерный а-актинин.

В c-kit+ клетках ушка ПП была выявлена экспрессия транскрипционного фактора Gata 4, характерного для ранних этапов кардиомиоцитарной дифференцировки, а также саркомерного а-актинина — белка сократительного аппарата кардиомиоцитов, характеризующего более поздние этапы этого типа дифференцировки (Рис. 6). Анализ экспрессии маркеров гладкомышечных и эндотелиальных клеток в ткани ушка ПП показал, что c-kit+ клетки, локализованные вблизи крупных сосудов, экспрессируют белок гладкомышечных клеток -гладкомышечный a-актин и маркер перицитов NG2, но не экспрессируют маркеры эндотелиальной дифференцировки. Следовательно, в ткани ушка ПП наряду с недифференцированными c-kit+ СКС присутствует значительное количество прогениторных клеток/клеток-предшественников, приступивших к дифференцировке в кардиомиоциты и гладкомышечные клетки. В тоже время, в ткани аневризмы нами не обнаружено ни одной c-k¡t+ клетки, ко-экспрессирующей маркеры кардиомиоцитов и клеток сосудов, что указывает на отсутствие клеток, приступивших к дифференцировке.

Анализ пролиферации с—kit+ СКС в миокарде больных ИБС. Для выявления пролиферирующих СКС было проведено двойное иммунофлуоресцентное окрашивание срезов миокарда ушка ПП и аневризмы ЛЖ на c-kit и маркер пролиферации Ki-67. Наши данные указывают, что часть c-kit+ клеток ушка ПП экспрессировала Ki-67, тогда как c-kit+ клетки аневризмы не пролиферировали и находились в G0, так как в них не было выявлено экспрессии Ki-67. Причиной подавления пролиферации этих клеток могла быть экспрессия в них ингибиторов циклинзависимых киназ, регулирующих переход клетками рестрикционной точки в Gi фазе клеточного цикла. С помощью специфического окрашивания антителами к ингибитору клеточного цикла p21Clp/Wafl установлено, что 20% c-kit+ клеток аневризмы экспрессируют этот белок, что может являться причиной подавления пролиферации СКС в аневризме.

Таким образом c-kit+ СКС ушка ПП пролиферируют и экспрессируют транскрипционные факторы и структурные белки кардиомиоцитов и клеток сосудов, что характеризует их как прогениторные клетки и клетки—предшественники. C-kit+ СКС аневризмы, напротив, не пролиферируют и не экспрессируют маркеры дифференцировки в кардиомиоциты и клетки сосудов, что может свидетельствовать о снижении их регенеративного потенциала. Возможно, нарушение функции СКС у больных ИБС с постинфарктной аневризмой является одним из факторов, уменьшающих регенеративный потенциал сердца и способствующим развитию аневризмы. Это предположение нуждается в подтверждении в дальнейших исследованиях.

Отработка метода выделения п экспансии c-kit+ клеток миокарда в культуре. В данном исследовании был отработан собственный протокол выделения с—kit+ СКС из ткани ушка ПП и аневризмы сердца, сочетающий методы эксплантной культуры и иммуномагнитной селекции. Образцы ткани, полученной в ходе операций (0,3-0,5 см3 миокарда ушка ПП или аневризмы ЛЖ), измельчали и после ферментативной обработки культивировали на чашках, покрытых фибронектином. Через 7-10 дней с момента начала культивирования вокруг экспланта появлялись клетки фибробластоподобной морфологии. На 14-21 день культивирования вокруг эксплантов образовывался монослой клеток, поверх которых располагались округлые клетки с узким ободком цитоплазмы. Они экспрессировали c-kit+ и могли быть получены с помощью метода иммуномагнитной селекции. Последовательное проведение в 2-3 этапа иммуномагнитной селекции с использованием антител к с—kit рецептору позволило получить культуру, состоящую более чем на 90% из c-kit+ клеток (Рис. 7). Полученные этим методом c-kit+ клетки экспрессировали маркер Ki-67, что подтверждает их способность к пролиферации in vitro. Эти клетки не несли маркеров CD45, CD34, Linl и триптазы, что указывает на отсутствие гематопоэтических клеток в культуре c-kit+ клеток, выделенных из эксплантной культуры. Свежевыделенные c-kit+ клетки не окрашивались специфическими антителами на маркеры кардиомиоцитов, гладкомышечных, эндотелиальных клеток и фибробластов, что свидетельствует об отсутствии спонтанной дифференцировки в выбранных условиях культивирования эксплантов. Было обнаружено, что культивирование клеток ушка ПП и аневризмы в эксплантной культуре способствует сохранению экспрессии с—kit на клеточной поверхности.

Пролиферативпый потенциал, клопогепность и экспрессия генов плюрипотентности культивируемыми c-kit+ клетками миокарда. Характерной особенностью всех стволовых клеток является способность образовывать клоны из одной клетки. С помощью клонального анализа было показано, что 2,1% c-kit+ ушка ПП обладают клоногенностью, что сопоставимо с клоногенным потенциалом мезенхимальных клеток костного мозга [Koninckx et al., 2010]. Ни один из полученных клонов не экспрессировал маркеры гематопоэтических, гладкомышечных, эндотелиальных клеток, а также кардиомиоцитов и фибробластов. Подобно эмбриональным стволовым клеткам, c-kit+ клетки экспрессировали гены плюрипотентности Oct4, Sox2, Klf4, C-myc и Nanog (Рис. 9). Следовательно, культивируемые c-kit+ клетки способны к пролиферации и поддержанию недифференцированного состояния в определенных условиях in vitro.

Были выявлены различия в пролиферативной способности c-kit+ клеток, полученных методом эксплантной культуры из ткани ушка ПП и аневризмы ЛЖ. Время удвоения популяции c-kit+ клеток было меньше в клетках ушка предсердия, чем в клетках аневризмы (38,3+4,5 и 46,4+6,8 часов, соответственно; р=0,005), что указывает на более высокий пролиферативпый потенциал клеток, получаемых из ушка ПП.

Таким образом, разработанный нами метод выделения и культивирования c-kit+ СКС с помощью эксплантной культуры с последующей иммуномагнитной селекцией, позволяет получить c-kit+ обогащенную популяцию недифференцированных СКС человека, обладающих клоногенностью, способных к пролиферации и не несущих маркеров гематопоэтических, эндотелиальных, гладкомышечных клеток и кардиомиоцитов. Клетки, получаемые из аневризмы, обладают меньшим пролиферативным потенциалом, чем клетки ушка ПП.

Секреция ангиогениых факторов роста c-kit+ клетками миокарда. Недавно было показано, что СКС экспрессируют и секретируют ростовые факторы [Chimenti et al., 2010; Stastna et al., 2010], а, следовательно, способны оказывать паракринное влияние на окружающие клетки и аутокринно регулировать собственные функции. Поскольку ишемическое повреждение миокарда является важным стимулом для активации СКС, мы исследовали влияние гипоксии на секрецию основных ангиогенных факторов роста (VEGF и HGF) c-kit+ клетками эксплантной культуры ушка ПП. Для этого клетки культивировались при содержании кислорода 21% и при 1%, то есть в условиях, приближенных к состоянию ишемии миокарда. Анализ содержания в среде культивирования VEGF и HGF методом иммуноблотинга показал, что c-kit+ клетки миокарда секретируют VEGF и HGF в норме и их секреция повышается в условиях гипоксии (Рис. 10). Эти результаты были подтверждены с помощью ИФА: уровень секреции VEGF и HGF повышается в 3-3,5 раза в условиях гипоксии.

Диффереицировочный потенциал с—kit+ клеток миокарда больных ИБС.

Для изучения дифференцировочной способности c-kit+ клеток миокарда было использовано два подхода: культивирование в специальной среде, включающей фактор эмбриональной кардиомиоцитарной дифференцировки TGF0 и синтетический нуклеозид 5-азацитидин, который обычно применяется как ингибитор метилирования ДНК [Smith et al., 2009], и со-культивирование СКС со свежевыделенными неонатальными кардиомиоцитами крысы [Bearzi et al., 2007]. Культивирование с—kit+ клеток, полученных из ушка ПП в дифференцировочной среде способствовало появлению клеток, содержащих транскрипционный фактор, характерный для ранних этапов кардиомиоцитарной дифференцировки — Nkx 2,5, структурный белок кардиомиоцитов Тропонин I и белок щелевых контактов коннексин^З (Рис. 11). Однако появления сокращающихся структур в культуре не наблюдалось. Со-культивирование c-kit+ клеток с неонатальными кардиомиоцитами крысы, меченными CellTracker CM-Dil, способствовало появлению клеток, которые положительно окрашивались антителами к структурным белкам кардиомиоцитов -саркомерному а-актинину и тропонину I (Рис. 12), но при этом не являлись кардиомиоцитами крысы. Эти клетки образовывали контакты с кардиомиоцитами крысы, о чем свидетельствует окрашивание на коннексин-43. Однако, как и в случае с дифференцировочной средой, появления сокращающихся структур в культуре не наблюдалось.

При культивировании c-kit+ клеток ушка 1111 в среде, содержащей TGFji и 5-азацитидин образовывались капилляроподобные структуры, содержащие клетки, экспрессирующие маркеры эндотелия CD31 и vWF. Таким образом, обработка с—kit+ клеток ткани ушка 1111 человека 5-азацитидином и TGFfi вызывала появление в культуре клеток с признаками кардиомиоцитарной и эндотелиальной дифференцировки. Учитывая способность с—kit+ клеток ушка ПП к эндотелиальной дифференцировке, был выполнен функциональный тест по оценке их способности к формированию капилляроподобных структур in vitro. Было установлено, что с—kit+ клетки ушка 1111, как и эндотелиальные клетки пуповины человека (HUVEC), способны образовывать на поверхности матригеля капилляроподобные структуры, то есть, в соответствующих условиях, проявляют способность дифференцироваться в эндотелиальном направлении. Однако при подсчете количества и средней длины капилляроподобных структур, образованных c-kit+клетками сердца, оказалось, что их способность к ангиогенезу in vitro хуже, чем у зрелых эндотелиальных клеток.

С—kit+ клетки аневризмы не проявляли признаков кардиомиоцитарной или сосудистой дифференцировки в условиях, подобранных для клеток ушка ПП. После тщательного подбора условий культивирования и индукторов дифференцировки, в специальной среде с дексаметазоном и TGFp нам удалось получить единичные клетки, содержащие транскрипционный фактор Nkx 2,5 и тропонин I. Признаков дифференцировки в гладкомышечные и эндотелиальные клетки обнаружено не было, что указывает на ограниченный дифференцировочный потенциал c-kit+ клеток аневризмы.

Следовательно, культивируемые c-kit+ клетки ушка ПП и аневризмы, способны к начальным этапам кардиомиоцитарной дифференцировки in vitro, а клетки ушка ПП способны также дифференцироваться в эндотелиальном направлении и формировать капилляроподобные структуры in vitro.

Получение и анализ кардиосфер. Как было описано выше, с—kit+ клетки имеют рецепторы к факторам роста, взаимодействуют с окружающими клетками путем формирования межклеточных контактов и секретируют ростовые факторы. Все это указывает на необходимость их взаимодействия с клетками микроокружения для поддержания их функции. Моделью для изучения этих взаимодействий могут служить кардиосферы. Следующей задачей нашего исследования была отработка методики получения кардиосфер и характеристика их клеточного состава. Гетерогенные клетки эксплантной культуры при посадке на чашки, покрытые поли-D-лизином, способны формировать трехмерные клеточные структуры, в которых сохраняются взаимодействия СКС с клетками микроокружения. После формирования кардиосферы увеличивались в размере, достигая 50-200 мкм в диаметре. Некоторые из них теряли контакт с поверхностью и свободно плавали в среде культивирования. Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов кардиосфер показало, что внутри них располагаются клетки, несущие маркеры стволовых (c-kit+) и мезенхимальных (CD 105+) клеток (Рис. 8). При ферментативном разрушении кардиосфер выявлено, что в их состав входят также клетки с фенотипом мезенхимальных (CD105+, CD90+), эндотелиальных (CD31+, vW+) и миогенных (десмин+) клеток—предшественников.

Таким образом, нами отработана методика получения кардиосфер, которые могут служить моделью клеточной «ниши» ex vivo и могут быть использованы для поддержания СКС в недифференцированном состоянии in vitro, для изучения взаимодействий СКС с клетками микроокружения, что необходимо для разработки подходов к активации резидентных СКС при различных сердечно-сосудистых заболеваниях с целью повышения эндогенного регенеративного потенциала миокарда.

выводы

1. В миокарде ушка правого предсердия, аневризмы у больных ИБС и в неповрежденном миокарде присутствуют c-kit+ клетки, характеризующиеся экспрессией маркеров стволовых клеток (MDR1, C-met, IgflR, N-кадгерин) и отсутствием гематопоэтических маркеров (CD34, CD45); количество этих клеток в неповрежденном миокарде обратно коррелирует с возрастом.

2. В миокарде ушка правого предсердия больных ИБС и в неповрежденном миокарде часть c-kit+ СКС пролиферирует и дифференцируется в клетки-предшественники кардиомиоцитов и гладкомышечных клеток; в ткани аневризмы ЛЖ c-kit+ клетки не пролиферируют, не экспрессируют маркеров дифференцировки в кардиомиоциты и клетки сосудов и экспрессируют ингибитор клеточного цикла p2Ic,p/Wan.

3. Количество c-kit+ клеток в миокарде ушка правого предсердия наибольшее у женщин моложе 60 лет, оно положительно коррелирует с выраженностью атеросклероза коронарных артерий и дилатацией левого предсердия, но не зависит от наличия факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний (артериальной гипертонии, сахарного диабета, гиперлипидемии, ожирения, курения) и инфаркта миокарда в анамнезе.

4. Разработанная методика, сочетающая использование метода эксплантной культуры и последующей иммуномагнитной селекцией, позволяет получить обогащенную культуру c-kit+ СКС из операционных образцов миокарда человека.

5. Пролиферативный потенциал культивируемых c-kit+ клеток, получаемых из ткани ушка правого предсердия, выше, чем у клеток, получаемых из ткани аневризмы; культивируемые c-kit+ клетки ушка правого предсердия обладают клоногенностью и экспрессируют гены плюрипотентности (Oct4, Sox2, Klf4, C-myc, Nanog).

6. Культивируемые c-kit+ клетки ушка правого предсердия могут быть индуцированы к начальным этапам кардиомиоцитарной дифференцировки и к эндотелиальной дифференцировке, способны формировать капилляроподобные структуры in vitro и секретируют ангиогенные факторы роста (VEGF и HGF); c-kit+ клетки, полученные из аневризмы, способны только к начальным этапам кардиомиоцитарной дифференцировки.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты настоящего исследования рекомендуется использовать при проведении научно-исследовательских работ, направленных на изучение свойств резидентных СКС и разработку методов стимуляции эндогенных механизмов регенерации миокарда.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Стопим:

• Дергилев. К.В. Аневризма левого желудочка - возможный источник резидентных стволовых клеток сердца / К. В. Дергилев, К. А. Рубина, 3. И. Цоколаева, В. Ю. Сысоева, А. И. Гмызина, Н. И. Калинина, Т. М. Билявская, Р. С. Акчурин, Е. В. Парфенова, В. А. Ткачук // Цитология. - 2010. - 52(11). - Р. 31-10.

• Дергилев К. В. Резидентные стволовые клетки сердца / К. В. Дергилев, А. И. Гмызина, К. А. Рубина, 3. И. Цоколаева, Т. М. Рахмат-Заде, Р. С. Акчурин, В. А. Ткачук, Е. В. Парфенова // Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные исследования и перспективы научного применения. - под редакцией В.А.Ткачука. — М : Литтерра, 2009. - С. 383—128.

• Дергилев К. В. Характеристика с—kit позитивных клеток в миокарде больных ишемической болезнью сердца / К. В. Дергилев, А. И. Гмызина, К. А. Рубина, 3. И. Цоколаева, Т, М. Рахмат-Заде, Р. С. Акчурин, В. А. Ткачук, Е. В. Парфенова // Стволовые клетки и регенеративная медицина. - под редакцией В. А. Ткачука. - М : «Макс Пресс», 2011. - С. 22-52.

• Dergilev. К. Left ventricular heart aneurism as a new source of resident cardiac stem cells / K. Dergilev, K. Rubina, A. Gmyzina, Z. Tsokolaeva, V. Sysoeva, T. RahmatZade, R. Akchurin, V. Tkachuk, Ye. Parfyonova // Cell and Tissue Biology. - 2010. -4(6).-P. 1-10.

Тезисы конференций:

• Дергилев К. В. Выделение с—kit позитивных клеток из ткани аневризмы левого желудочка человека / К. В. Дергилев, А. И. Гмызина, В. С. Мелихова, К. А. Рубина, Е. В. Парфенова // Всероссийская научная школа-конференция для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования». Москва, Россия. 2008. — С.36- 37.

• Дергилев К. В. Аневризма левого желудочка человека как новый источник с—kit - позитивных клеток / К. В. Дергилев, А. И. Гмызина, К. А. Рубина, Е. В. Парфенова, 3. И. Цоколаева, Т. М. Рахмат-Заде, Р. С. Акчурин, В. А. Ткачук // Всероссийская научная школа-конференция для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования». Москва, Россия. 21-26 сентября 2009. - С. 18.

• Dergilev К. Human left ventricular aneurism tissue is a new source of c-kit positive cells / K. Dergilev, K. Rubina, A. Gmyzina, Z. Tsokolaeva, V. Sysoeva, T. RahmatZade, R. Akchurin, V. Tkachuk, Ye. Parfyonova // ISSCR 7th Annual Meeting. Barcelona, Spain. July 8-11, 2009. - P. 240.

• Dergilev K. Left ventricular aneurism tissue is a perspective source of cardiac stem/progenitor cells for cell therapy / K. Dergilev, K. Rubina, A. Gmyzina, Z. Tsokolaeva, V. Sysoeva, T. Rahmat-Zade, R. Akchurin, V. Tkachuk, Ye. Parfyonova // 5th Stem Cell Research & Therapeutics. Boston, USA. March 9-10, 2009.-P. 132.

• Dergilev K. Left ventricular aneurism is a perspective source of cardiac stem/progenitor cells for cell therapy / K. Dergilev, K. Rubina, A. Gmyzina, Z. Tsokolaeva, V. Sysoeva, T. Rahmat-Zade, R. Akchurin, V. Tkachuk, Ye. Parfyonova // World conference on regenerative medicine. Leipzig, Germany. October29-31, 2009.-P. 170.

Dergilev К. Human left ventricular aneurysm tissue contains c-kit positive cardiac stem cells / K. Dergilev, K. Rubina, A. Gmyzina, Z. Tsokolaeva, V. Sysoeva, T. Rahmat-Zade, R. Akchurin, V. Tkachuk, Ye. Parfyonova // Combined Meeting of the ESGCT, GSZ, DG-GT and ISCT. Hannover, Germany. November 20-25. 2009. -P. 1451.

Dergilev K. C-kit positive cells of the heart contain mast cells and cardiac progenitor cell populations / K. Dergilev, K. Rubina, A. Gmyzina, Z. Tsokolaeva, V. Sysoeva, T. Rahmat-Zade, R. Akchurin, V. Tkachuk, Ye. Parfyonova // 5th Annual Meeting of the German Society for Stem Cell Research. Libeck, Germany. September 30-2 october, 2010.-P. 192.

Дергилев К. В. Тканеспецифичные стволовые клетки: регуляция восстановления тканей / К. В. Дергилев, А. И. Гмызина, К. А. Рубина. 3. И. Цоколаева, Т. М. Рахмат-Заде, Р. С. Акчурин, В. А. Ткачук, Е. В. Парфенова // XXI съезд физиологического общества имени И. П. Пирогова. Калуга, Россия. 19-25 сентября 2010. - С. 469.

Дергилев К. В. C-kit-позитивные клетки сердца человека. Характеристика, культивирование и дифференцировочный потенциал / К. В. Дергилев, А. И. Гмызина, К. А. Рубина, 3. И. Цоколаева, Т. М. Рахмат-Заде, Р. С. Акчурин, В. А. Ткачук, Е. В. Парфенова // «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Москва, Россия. 17—19 ноября 2010. -С. 34.

Дергилев К. В. Характеристика c-kit позитивных клеток в миокарде больных ишемической болезнью сердца / К. В. Дергилев, А. И. Гмызина, К. А. Рубина, 3. И. Цоколаева, Т. М. Рахмат-Заде, Р. С. Акчурин, В. А. Ткачук, Е. В. Парфенова // Всероссийской научной школы-конференции для молодежи «Стволовые клетки и регенеративная медицина». Москва, Россия. 25—28 октября 2010.-С. 39.

Подписано в печать:

08.08.2011

Заказ № 5770 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Дергилев, Константин Владимирович, Москва

ФАКУЛЬТЕТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ МОСКОВСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА ИМЕНИ М. В. ЛОМОНОСОВА

„ .„„пс- На правах рукописи

0/, 2.01 1 6337 6

Дергилев Константин Владимирович

ХАРАКТЕРИСТИКА С-К1Т ПОЗИТИВНЫХ РЕЗИДЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МИОКАРДА У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ

БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА

03.01.04 — Биохимия 14.01.05 — Кардиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители: доктор медицинских наук Е. В. Парфенова кандидат биологических наук К. А. Рубина

Москва — 2011

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ 6

НАУЧНАЯ НОВИЗНА 9

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ 9

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ 10

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

Регенеративный потенциал сердца 10

Применение стволовых клеток для лечения болезней сердечно- 12

сосудистой системы

Клеточная терапия инфаркта миокарда 16

Клеточная терапия хронической ИБС и постинфарктной сердечной 25

недостаточности

Резидентные стволовые клетки сердца 30

Islet-1 клетки 32

Sp-популяция 34

С—kit позитивные клетки 36

Клетки, образующие кардиосферы 39

Sca-1 клетки 41

Клеточная ниша 44

Активация стволовых клеток сердца 47

Перспективы примения стволовых клеток сердца для регенерации 50

миокарда

Стволовые клетки сердца при патологии миокарда и старении 54

Стволовые клетки сердца при остром инфаркте миокарда и 54

отдаленном постинфарктном периоде

Стволовые клетки сердца при диабетической кардиомиопатии 56

Старение миокарда и стволовые клетки сердца 60

Заключение 63

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 64

Характеристика пациентов, включенных в исследование 64

Методы обследования в клинике 71

Лабораторное обследование 71

Инструментальное обследование 72

Биохимические методы 75

Иммуноблоттинг 75

Иммуноферментный анализ 75

Выделение РНК 75

Реакция обратной транскрипции 76

Полимеразная цепная реакция в реальном времени 76

Электрофорез ампликонов 77

Цитологические и гистологические методы 77

Иммунофлуоресцентное окрашивание ткани миокарда 77

80

Получение первичной культуры клеток сердца 78

Иммунофлуоресцентное окрашивание выделенных клеток и ^ проточная цитофлуориметрия

Культивирование клеток методом эксплантной культуры и получение кардиосфер

Сортировка клеток эксплантной культуры методом ^^ иммуномагнитной селекции с использованием антител к c-kit.

Клональный анализ c-kit+ клеток ушка правого предсердия 82"

Оценкапролиферации c-kit+ клеток ушка правого предсердия 82

Оценка способности c-kit+ клеток образовывать капилляроподобные 00

OZ

структуры in vitro

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток 83 *

Культивирование c-kit+клеток в условиях гипоксии 84

Исследование способности к дифференцировке стволовых клеток ос

OJ

сердца

Дифференцировка c-kit+ клеток в кардиомиоцитарном и ^ эндотелиальном направлениях

Дифференцировка c-kit+ клеток в адипогенном и остеогенном ^ направлениях

Статистический анализ 88

РЕЗУЛЬТАТЫ 88-

Распределение c-kit+ клеток в миокарде и влияние возраста человека ^ на их количество

Анализ иммуно фенотипа c-kit+ клеток миокарда 92

Сопоставление количества с—kit+ клеток в миокарде с клиническими ^ характеристиками больных ИБС

Отработка методики выделения и экспансии c-kit+ клеток миокарда ^^ в культуре

Анализ экспрессии генов плюрипотентности в клетках эксплантной ^^ культуры

Получение и анализ кардиосфер 110

Получение c-kit+ клеток из эксплантной культуры с помощью ^^ иммуномагнитной селекции

Клональный анализ c-kit+ клеток миокарда 113

Секреция ангиогенных факторов роста c-kit+ клетками миокарда 115

Дифференцировочный потенциал c-kit+ клеток миокарда человека- 116

ОБСУЖДЕНИЕ 124

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 144

КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИМЕРЫ 147

ВЫВОДЫ 164

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 166

4 /

I

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

18-фтор дезоксиглюкоза

ЬБОБ основный фактор роста фибробластов

ВМР морфогенетические белки костной ткани

с-кк рецептор к фактору стволовых клеток

С-те1 рецептор кофактору роста гепатоцитов

СХСЯ4 рецептор к 8БР—1 (фактору стромальных клеток)

ЕОБ эпидермальный фактор роста

в-СБР гранулоцитарный колониестимулирующий фактор роста

ОБР зеленый флуоресцентный белок

НвБ фактор роста гепатоцитов

Н8Р белки теплового шока

НЦУЕС эндотелиальные клетки пупочной вены человека

ГСЯМ инсулиноподобный фактор роста 1

КНМЯ рецептор инсулиноподобного фактора роста 1

1з1е1—1 популяция недифференцированных прогениторных

X клеток

КЛЖ/Р1к-1 рецептор к фактору роста эндотелия сосудов

ив лейкемический ингибиторный фактор

МОЮ белок множественной лекарственной устойчивости1

ШР белок, ингибирующий эритропоэз

ЫУНА Нью-Йоркская кардиологическая ассоциация

8са-1 рецептор гематопоэтических и резидентных стволовых

клеток мыши

БСБ фактор роста стволовых клеток

8БР-1 фактор стромальных клеток

88ЕА1 антиген эмбриональных стволовых клеток

ТОБ (3 трансформирующий фактор роста р

УЕОБ фактор роста эндотелия сосудов

фактор фон Виллибранда

АКШ аортокоронарное шунтирование

АПФ ангиотензинпревращающий фермент

АТ, рецептор к ангиотензину 1 типа

АТФ аденозинтрифосфат

АФК активные формы кислорода

ДА диагональная коронарная артерия

дкмп дилатационная кардиомиопатия

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖЕЛ жизненная емкость легких

ИБС ишемическая болезнь сердца

ИМ инфаркт миокарда

ИФА иммуноферментный анализ

кдд конечно-диастолическое давление

кДНК комплиментарная ДНК

кдр конечно-диастолический размер

ксо конечно-систолический объем левого желудочка

лж левый желудочек сердца

ЛКА левая коронарная артерия

лп левое предсердие сердца

лпвп липопротеиды высокой плотности

лпнп липопротеиды низкой плотности

МРТ магнитно-резонансная томография

мск мезенхимальные стволовые клетки

мскжт мультипотентные стромальные клетки жировой ткани

МФККМ мононуклеарная фракция клеток костного мозга

ОА огибающая коронарная артерия

пж правый желудочек сердца

ПКА правая коронарная артерия

ГШ А передняя нисходящая артерия

пп правое предсердие сердца

ПЦР полимеразная цепная реакция

пэк клетки—предшественники эндотелия сосудов

РАС ренин-ангиотензин-альдостероновая система

РНК рибонуклеиновая кислота

СД сахарный диабет

скжт стромальные клетки жировой ткани

скс стволовые клетки сердца

тг триглицериды

тзслж толщина задней стенки левого желудочка

тмжп толщина межжелудочковой перегородки

УЗДГ ультразвуковая допплерография

УЗИ ультразвуковое исследование

ФБС фетальная бычья сыворотка

ФВ фракция выброса левого желудочка

ФВД функция внешнего дыхания

ФСБ фосфатно-солевой буфер

хсн хроническая сердечная недостаточность

чсс частота сердечных сокращений

ЭКГ электрокардиография

эмп эпителиально-мезенхимальный переход

эхокг эхокардиография

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Хроническая сердечная недостаточность в подавляющем большинстве случаев, возникающая в результате перенесенного ИМ, представляет собой важную' медицинскую, социальную и экономическую проблему. Около 1 % взрослого населения развитых стран страдает сердечной недостаточностью, а у людей старше 70 лет частота ХСН на порядок выше (около 10%). При этом, в российской популяции частота ХСН выше, чем в развитых странах и достигает 6% [7]. Несмотря на то, что эффективность лечения ХСН возросла за последние двадцать лет, возможности современных методов восстановления функции сердца остаются весьма ограниченными. Это обусловлено, в значительной степени, отсутствием эффективных средств, позволяющих восстановить необратимо утраченный миокард. В последние годы большие надежды на решение этой проблемы возлагают на развитие методов клеточной терапии [7], в частности, на использование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, для которых была продемонстрирована возможность кардиомиоцитарной дифференцировки как in vitro, так и in vivo [91, 135, 144, 237]. Однако, в результате проведенных экспериментальных и клинических исследований, не было показано достаточно высокой эффективности клеточной терапии ХСН и не была подтверждена возможность замещения утраченного миокарда за счет дифференцировки трансплантированных клеток [180, 207, 253]. Эффекты, наблюдаемые при трансплантации клеток костного мозга, были обусловлены, в основном, их паракринной активностью, подавляющей апоптоз кардиомиоцитов и стимулирующей ангиогенез и активность собственных резидентных клеток сердца [115, 258]. На сегодняшний день ученые заняты поиском новых источников прогениторных клеток для терапии ХСН. В этом аспекте большой интерес вызывают недавно открытые резидентные СКС [40, 118, 166, 191, 196]. Термином «резидентная СКС» обозначается неоднородная популяция незрелых клеток, обнаруживаемых в миокарде,

способных к самообновлению и дифференцировке в клетки сердца

(кардиомиоциты, эндотелиальные и гладкомышечные клетки сосудов).

Выделяют несколько популяций СКС: 1) клетки, несущие на поверхности

рецептор к фактору стволовых клеток (c-kit+ клетки); 2) клетки, несущие на

поверхности антиген sca-1, характеризующий стволовые клетки мыши (sea—

1+ клетки); 3) клетки, экспрессирующие транскрипционный фактор Islet—1,

присутствующий в эмбриональных клетках, формирующих сердце в

эмбриогенезе (Islet—1+ клетки). Также, заслуживают особого внимания СКС,

способные образовывать кардиосферы - шарообразные клеточные

скопления, состоящие из стволовых и прогениторных клеток (клетки из

кардиосфер), а также клетки, способные выкачивать наружу ДНК-

связывающий краситель Хекст 333342 (клетки sp-популяции). Свойство

поддерживать низкое содержание Хекст 333342 внутри клетки характерно

для стволовых клеток и не характерно для дифференцированных клеток

взрослого организма. Получены данные, указывающие на участие СКС в

процессах регенерации и обновления миокарда [309]. Показана возможность

получения и экспансии в культуре ex vivo аутологичных СКС из биоптатов

миокарда человека [71], аневризмы ЛЖ [3], ушка ПП сердца [73, 314]. На

моделях ИМ у иммунодефицитных животных продемонстрировано

эффективное восстановление сократительной функции сердца при

трансплантации СКС человека [37, 40, 71]. Существование резидентных

СКС, участвующих в репаративных процессах, делает особенно актуальной

разработку подходов к активации эндогенного механизма регенерации

сердца. Помимо этого, применение собственных прогениторных клеток

сердца для лечения сердечно-сосудистых заболеваний представляется

перспективным, так как не требует проведения иммуносупрессивной терапии

и исключает возможность переноса инфекционных агентов от донора.

Однако для разработки клинически приемлемой технологии как стимуляции

стволовых клеток, так и использования аутологичных резидентных СКС для

клеточной кардиомиопластики, необходимо детальное изучение свойств этих

7

клеток, в том числе, и у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Для этого необходимо выбрать оптимальные источники получения СКС из сердца человека, разработать методы их культивирования и направленной дифференцировки, изучить функциональные характеристики этих клеток, что требует проведения дополнительных исследований.

Цель данной работы: охарактеризовать с-кй позитивные резидентные СКС в миокарде больных ИБС, отработать методику их выделения и культивирования, оценить способность к направленной дифференцировке в клетки сердца.

Для достижения этой цели необходимо решить следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить характер распределения, иммунофенотип и пролиферативный статус с-кй+ клеток в миокарде больных ИБС (ушко 1111, аневризма ЛЖ) и в неповрежденном миокарде (аутопсийный материал)

2. Исследовать влияние возраста, пола, факторов риска ИБС, выраженности атеросклероза коронарных артерий, наличия сердечной недостаточности на количество с-кк+ клеток в образцах миокарда больных ИБС.

3. Отработать методики выделения и экспансии в культуре популяции с-кк+ клеток сердца.

4. Оценить пролиферативный и клоногенный потенциал, экспрессию генов плюрипотентности в культуре с-кй+ клеток миокарда человека.

5. Оценить способность с-кк+ клеток миокарда человека секретировать ангиогенные факторы роста.

6. Изучить способность культивируемых с-кй+ клеток сердца к дифференцировке в кардиомиоцитарном, эндотелиальном и гладкомышечном направлениях.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В представленной работе впервые выполнена комплексная оценка свойств с-кк+ СКС с использованием современных научных методов на уникальном операционном материале (ушко ПП, аневризма сердца), полученном от больных ИБС Охарактеризована локализация, иммунофенотип, пролиферативный статус, наличие клеток-предшественников разных направлений дифференцировки в миокарде ушка ПП и аневризмы сердца. Впервые установлено, что ткань аневризмы ЛЖ содержит СКС. Выполнено сопоставление количества с—кЬ:+ клеток в миокарде больных ИБС с факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний, выраженностью коронарного атеросклероза и показателями сократительной функции сердца и обнаружена связь между количеством СКС и полом, возрастом пациентов, выраженностью коронарного атеросклероза и размером левого предсердия Впервые показано, что СКС, полученные из разных источников (ушко ПП и аневризма ЛЖ), отличаются по пролиферативным и дифференцировочным свойствам. Получены данные об экспрессии генов плюрипотентности в СКС больных ИБС.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработана методика получения с-кк+ СКС из ткани ушка ПП и аневризмы ЛЖ Это дает возможность углубленного изучения свойств этих клеток у больных ИБС, что необходимо для разработки методов стимуляции эндогенных механизмов регенерации миокарда. Результаты диссертации могут служить основой для создания клинически пригодного метода получения СКС из фрагментов ткани ушка ПП, отсекаемых при постановке шунтов во время операции АКШ Эти методики важны для дальнейшей разработки протоколов для клеточной терапии или создания банка стволовых клеток

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Результаты исследования внедрены в научно—исследовательскую работу факультета фундаментальной5 медицины^ МГУ имени М. В! Ломоносова- и ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития РФ и используются в педагогической деятельности факультета фундаментальной медицины МГУ им М.В. Ломоносова1

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Регенеративный потенциал сердца

Многие годы считалось, что сердце является терминально дифференцированным органом, а зрелые кардиомиоциты не способны вступать в митоз [49, 104, 231], хотя возможность пролиферации других клеток миокарда, таких как фибробласты, гладкомышечные и эндотелиальные клетки, не отрицалась Предполагалось, что, дифференцируясь вскоре после рождения, кардиомиоциты сохраняются на протяжении всей жизни, не пролиферируют и не синтезируют ДНК.

Развитие авторадиографических методов исследования позволило

изменить эти представления, так как были обнаружены отдельные

кардиомиоциты, способные вступать в клеточный цикл и пролиферировать.

Было показано, что среди желудочковых миоцитов мышей, которым Н°—

тимидин вводился дважды в сутки в течение 2 недель, выявляется

0,012+0,0034% меченых ядер [5]. При непрерывном введении Н3-тимидина

взрослым крысам в течение 10 суток обнаруживалось 0,07+0,00% меченых

ядер кардиомиоцитов [282]. Такой же низкий уровень мечения ядер

кардиомиоцитов наблюдали в сердце крысы в другой работе [254].

Впоследствии, Капассо (СараББо) [55] выявил активацию синтеза ДНК" в

кардиомиоцитах после моделирования ИМ у животных. В более поздних

исследованиях группы П Анверза (Апуегэа) [135] показано, что в.образцах

миокарда людей, погибших по причинам, не связанным с кардиологическими

заболеваниями, 14 кардиомиоцитов из 1000000 экспрессировали маркеры

10

клеточного цикла, то есть были способны вступать в митоз. В последующих работах, выполненных на образцах миокарда пациентов, погибших от последствий ИМ или конечной стадии ХСН, количество кардиомиоцитов в митозе составляло 0,015-0,08%, что было в 10-60 раз выше, чем в здоровом миокарде [41, 135].

В физиологических условиях в сердце млекопитающих подавляющее большинство кардиомиоцитов не способно к клеточному делению и отвечает гипертрофией на гемодинамическую нагрузку. Пролиферация кардиомиоцитов останавливается у мышей вскоре после рождения, у крыс -на 3-4 день, а у человека - не позднее 7-го месяца после рождения [46, 172, 277]. Менее чем 0,01% взрослых кардиомиоцитов человека способно вступать в клеточный цикл после ИМ. По данным проточной цитометрии около 85% ядер кардиомиоцитов крысы не находятся в клеточном цикле, а заблокированы в воЛ-Л фазе, остальные - в 02/М фазе [235].

Уникальная работа по изучению физиологического обновления клеток сердца человека была опубликована в 2009 году [42]. Авторам удалось установить возраст кардиомиоцитов человека, используя углерод—14. Оказалось, что около 1% клеток взрослого сердца обновляется в течение года и 45% кар