Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональные свойства культивируемых клеток сердца крыс: зрелых кардиомиоцитов, стволовых клеток и клеток-предшественников

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Функциональные свойства культивируемых клеток сердца крыс: зрелых кардиомиоцитов, стволовых клеток и клеток-предшественников"

0і

На правах рукописи

Голованова Татьяна Александровна

Функциональные свойства культивируемых клеток сердца крыс: зрелых кардиомиоцитов, стволовых клеток и клеток-предшественников

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Г, п О '.'[¡''Р

Санкт-Петербург - 2012

005020119

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Белостоцкая Галина Борнсовна.

Научный консультант: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Прошева Валентина Ивановна.

Официальные оппоненты:

Проценко Юрий Леонидович, доктор биологических наук, старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук, главный научный сотрудник лаборатории биологической подвижности.

Петрова Наталья Борисовна кандидат биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО "Сыктывкарский государственный университет", доцент кафедры биологии Института естественных наук.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации.

Защита диссертации состоится «27» апреля 2012 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 004.017.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук по адресу: 167982, Республика Коми, Сыктывкар, ГСП-2, ул. Первомайская, д. 50.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Варламова Н.Г.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Утрата способности клеток сердечной мышцы млекопитающих к самообновлению, присущему костным рыбам и амфибиям, которые полностью восстанавливают объем и функцию сердца при удалении 20% миокарда (Poss, 2007), является непреодолимым препятствием для полноценной регенерации поврежденного сердца. Уже через несколько дней постнатального развития у млекопитающих наблюдается полное прекращение пролиферации и остановка клеточного цикла кардиомиоцитов (Claycomb, 1992). Установлено, что в сердце происходит переключение гиперплазии на гипертрофию между третьим и четвертым днями после рождения животного (McGill, Brooks, 1995; Li et al., 1996). Долгое время существовало мнение, что дальнейший рост сердечной мышцы идет за счет увеличения объема кардиомиоцитов (гипертрофии), а не их числа, и сердце рассматривалось как окончательно дифференцированный орган, не способный к самообновлению (MacLellan, Schneider, 2000; Di Felice et al., 2009).

Однако в последние годы появились данные о наличии в сердце млекопитающих рсгенсрационного потенциала. Так, в поврежденном миокарде человека было обнаружено присутствие незрелых пролиферирующих клеток, показана репликация миоцитов, кариокинез, цитокинез и очаги спонтанных миокардиальных регенераций (Beltrami et al., 2001). Установлено, что миокард однодневной мыши способен к полному восстановлению структуры и функции после 15% резекции левого желудочка, но эта способность утрачивается уже к концу первой недели жизни (Porrello et al., 2011). Более того, в литературе описано существование нескольких типов сердечных стволовых клеток (CK) и клеток-предшественников кардиомиоцитов (ПК), способных к самообновлению и дифференцировке в кардиомиоциты: Sca-1 CK (Oh et al., 2003), c-kit CK (Beltrami et al., 2003), Isll+ резидентные ПК (Laugwitz et al., 2005) и SP клетки (Side population cells) (Pfister et al., 2005). Выявлено также образование клеточных кластеров в культуре, или «кардиосфер», из тканей взрослого сердца мыши и человека (Messina et al., 2004).

Дальнейший поиск и изучение свойств сердечных стволовых клеток является одной из самых актуальных проблем физиологии миокарда. Имеющиеся в настоящее время данные о морфофункциональных свойствах CK сердца, факторах, регулирующих их самообновление и направленную кардиодифференцировку, фрагментарны и недостаточны (Parmacek, Epstein, 2005; Anversa et al., 2006). Более того, получение чистых популяций сердечных

стволовых клеток, применяемое в работах других авторов, приводит к изолированию СК из их естественного микроокружения и к потере необходимых сигналов и факторов, ответственных за самообновление и дифференцировку СК.

Проблема разработки клеточных технологий для регенерации сердца до сих пор остается нерешенной (ВеЬГаг « а1., 2010; МаШагаБ, МагЬап, 2011). В связи с этим существует острая необходимость создания новых клеточных моделей миокарда, которые позволили бы детально изучить все этапы пролиферации и дифференцировки сердечных СК и ПК в условиях, приближенных к их нативному микроокружению. Использование таких моделей будет способствовать развитию представлений о физиологии сердечных стволовых клеток и позволит расширить клинические подходы к лечению заболеваний сердца.

Решение проблемы регенерации сердечной ткани также связано с поиском путей снижения функциональных нарушений в условиях ишемии/реперфузии, когда значительно усиливается образование активных кислородных радикалов (АКР) (Литвицкий и др., 1994). Одной из наиболее действенных мер является введение экзогенных соединений, которые ингибируют либо сами АКР, либо источники их генерации. В этой связи создание клеточных тест-систем, позволяющих проводить скрининг антиоксидантных препаратов, способствовало бы наиболее быстрому подбору оптимальных кардиопротекторов.

Цель диссертационной работы - функциональная характеристика зрелых кардиомиоцитов, а также резидентных стволовых клеток и клеток предшественников кардиомиоцитов сердца новорожденных и взрослых крыс в первичной культуре.

Задачи:

1. Изучить морфофункциональные свойства клеток миокарда неонатальных крыс.

2. Выявить резидентные стволовые клетки и клетки-предшественники в культуре клеток миокарда новорожденных крыс и охарактеризовать их пролиферацию и дифференцировку.

3. Оценить степень зрелости популяции клеток, развивающихся в кардиомиоцитарном направлении, по формированию у них электромеханического сопряжения.

4. Установить способность стволовых клеток и клеток-предшественников кардиомноцитов к пролиферации, кардиодифференцировке и спонтанному сокращению у взрослых крыс в условиях первичной культуры.

5. Изучить антиоксидантную активность макромолекулярной системы, синтезированной на основе декстрана и феноксана в условиях экспериментального окислительного стресса на модели зрелых неонатальных кардиомноцитов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В первичной культуре сердечных клеток новорожденных крыс имитируются поведение и закономерности функционирования клеток миокарда, имеющие место в интактном сердце в первые дни после рождения крысы.

2. В культуре клеток сердечной мышцы новорожденных крыс происходит пролиферация резидентных стволовых клеток и клеток-предшественников с образованием клонов. Направленная кардиодифференцировка этих клеток в составе колоний приводит к формированию популяции зрелых кардиомиоцитов, способных к спонтанному сокращению.

3. В культуре клеток миокарда взрослых крыс имеет место пролиферация резидентных стволовых клеток и клеток-предшественников с формированием колоний, но полной кардиодифференцировки этих клеток не наблюдается.

4. Создана in vitro модель регенерационного кардиомиогенеза, позволяющая изучать процессы пролиферации и дифференцировки сердечных стволовых клеток и клеток-предшественников и in vitro модель зрелых неонатальных кардиомиоцитов, которая может служить в качестве тест-системы для скрининга лекарственных препаратов.

Научная новизна работы. Впервые в культуре клеток миокарда новорожденных крыс линии Wistar детально изучены физиологические свойства кардиомиоцитов на протяжении восьми-десяти дней культивирования и выявлены закономерности их функционирования. Установлено, что в культуре имитируются процессы прекращения деления и перехода от гиперплазии к гипертрофии клеток миокарда, происходящие в интактном сердце млекопитающих в первые дни после рождения. Это позволяет рассматривать ее в качестве модели для изучения прекращения пролиферации кардиомиоцитов.

Впервые in vitro охарактеризован процесс формирования спонтанно сокращающихся колоний кардиомиоцитов, образованных из резидентных стволовых клеток c-kit+- и Sca+-TiinoB и клеток-предшественников Ы1+-типа, и представлено доказательство кардиомиогенной дифференцировки резидентных кардиопредшественников в первичной культуре клеток неонатального миокарда крыс. Данный процесс имитирует регенерационный кардиомиогенез от резидентной клетки-предшественника до формирования колоний зрелых сокращающихся кардиомиоцитов.

В условиях первичной культуры клеток миокарда взрослых крыс выявлена пролиферативная активность резидентных стволовых клеток (c-kit+, Sca+, ЫГ), но установлена их сниженная способность к кардиомиогенезу.

Показана адекватность использования модели зрелых неонатальных кардиомиоцитов крыс в качестве тест-системы для скрининга антиоксидантных препаратов. Впервые выявлено кардиопротекторное действие синтезированной макромолекулярной системы (МСАО) на основе декстрана и феноксана (Д+Ф).

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные существенно расширяют представления о физиологии зрелых кардиомиоцитов и резидентных стволовых клеток сердца млекопитающих. Научно-практическая значимость работы заключается, прежде всего, в том, что модель резидентных стволовых клеток и кардиопредшественников имитирует регенерационный кардиомиогенез, а модель зрелых неонатальных кардиомиоцитов предоставляет широкие возможности для изучения физиологии зрелых кардиомиоцитов. В связи с этим предложенные клеточные модели могут быть использованы в исследованиях по проблеме регенерации сердечной мышцы, при скрининге лекарственных (кардиотропных) препаратов, а также при разработке новых методов клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на XX форуме физиологов России (Москва, 2007), II Съезде общества клеточной биологии (С.-Петербург, 2007), конференции «Focus on Microscopy 2007» (Испания, 2007), Russian-Norwegian symposium "Myocardial protection: molecular, pathophysiological and clinical aspects" (Russia, 2008), VII Европейском биофизическом конгрессе (Италия, 2009), XXI всероссийском съезде Физиологического общества (Калуга, 2010), Европейском кардиологическом конгрессе (Швеция, 2010), а также на Санкт-Петербургском

физиологическом обществе (2009), проблемной комиссии ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова (2010), III Съезде физиологов СНГ (Ялта, 2011) и др.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы, из них - две статьи в Российских рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, одна статья в сборнике работ, 20 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 141 страницах машинописного текста, иллюстрирована 38 рисунками и двумя таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы, состоящего 174 источника, из них 141 иностранных.

II. Материалы и методы исследования

Выделение н культивирование клеток миокарда. В работе использовали крыс линии Wistar, усыпленных ингаляцией СОг, согласно международным правилам работы с животными. При ферментативном разрушении сердечной мышцы использовали метод Lam et al. (2002) в нашей модификации (Белостоцкая и др., 2006). Культивирование осуществляли в питательной среде (ПС) (DMEM, 10% сыворотки эмбрионов коров (Биолот, Россия), 50 ед./мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина (Биолот, Россия)) в 40 мм чашках Петри на двух полосках покровного стекла (12x24 мм), покрытых слоем поли-Д-лизина (0,1 мг/мл, Эпидбиомед, Россия). Рассев клеток - 1-Ю5 кл/мл. Инкубацию проводили в С02-ннкубаторе (5% С02, влажность 95%, 37°С). ПС меняли дважды в неделю.

В экспериментах со свежевыделенными кардиомиоцитами использовали свойство избирательной адгезии крупных зрелых кардиомиоцитов к поли-Д-лизину (Маленьких и др., 2006).

Концентрацию свободного внутриклеточного кальция ([Са2+]0 в культивируемых клетках миокарда крыс определяли с помощью компьютерной системы анализа внутриклеточного содержания ионов (Intracellular Imaging & Photometry System, США) по методу Grynkiewicz et al. (1985) как соотношение интенсивностей флуоресценции (F340/F380) с учетом калибровочной кривой. Применяли раствор Рингера мМ: 146 NaCl, 5 КС1, 2 СаС12, 1 MgCl2> 11 глюкозы, 10 HEPES, рН 7,4; бескальциевый раствор Рингера - тот же раствор, но с добавлением хелатора Са2+ - ЭГТА (1 мМ); раствор Рингера с высоким содержанием ионов К+ - тот же раствор, но с 120 мМ КС1 и 26 мМ NaCl. Клетки инкубировали (1 ч, 26°С) в растворе Рингера с флуоресцентным красителем Фура-2АМ (Sigma, 10 мкМ).

Иммуноцитохимическое выявление стволовых клеток и клеток-предшественников в культуре. Клетки, выращенные на покровных стеклах, фиксировали (10 мин; параформальдегид, 2,5-4%), пермсабилизировали (10 мин; ФБРТ - фосфатный буферный раствор, 0,25% Тритон Х-100), блокировали сайты неспецифического связывания антител (30 мин; 1% бычий сывороточный альбумин на основе ФБРТ) и применяли два варианта окраски:

1) Использовали первичные антитела к антигенам CK c-kit (Invitrogen, 5 мкг/мл), Sca-1 (Abeam, 1:100), isll (Abeam, 1:100), а также к GATA4 (маркер кардиомиоцитов; Abeam, 1:500). Вторичными были Фикоэритрин-конъюгированные (Invitrogen, 1:100) и FITC-конъюгированные антитела (Abeam, 1:100). Аутофлуоресценцию подавляли с помощью окраски кристаллическим фиолетовым (2 мг/мл, 5 мин).

2) Согласно Zenon-технологии (Invitrogen) коныогировали первичные Isll (Abeam, 5 мкг/мл) и Sea (Abeam, 12,5 мкг/мл) антитела с флуоресцирующими красителями Alexa 405 или 594 (Invitrogen). C-kit антитела были изначально конъюгированы с FITC (Abeam, 1:70). Актиновый цитоскелет зрелых кардиомиоцитов метили Родамин-Фаллоидином (Sigma, 10 мкг/мл).

Идентификацию клеток проводили на флуоресцентном микроскопе PFM (WPI, США), об.хЮО (масл.) и конфокальных микроскопах Leica TCS SP5 (Германия), об.х40 (масл.), Leica TCS SL (Германия), об.хбЗ (масл.), Leica SP5 (Германия), об.хбО (масл.).

Моделирование окислительного стресса in vitro и оценка активности антиоксидантных препаратов. Окислительный стресс, моделирующий образование свободных радикалов во время ишемии/реперфузии, создавали с помощью пероксида водорода (Н202) в концентрациях 10"3-10"8 М на культуре свежеизолированных кардиомиоцитов. В работе изучали защитное действие известного синтетического антиоксиданта феноксана (10"4-10"8 М) и МСАО на основе декстрана (Д) и феноксана (Ф) (10"4-10"8 М) по способности сдерживать нарастание [Ca ]¡ в условиях окислительного стресса.

Уровень дифференцировки кардиомиоцитов определяли по способности рецепторов наружной мембраны и саркоплазматического ретикулума (CP) отвечать на действие следующих агентов: АТФ (Sigma, 180 мкМ) - агонист пуринэргических рецепторов; ацетилхолин (АцХ, Sigma, 20 мкМ) - лиганд АцХ рецепторов; кофеин (Кф, Sigma, 5 мМ) и 4-хлор-м-крезол (4-ХмК, Sigma, 2 мМ) - активаторы рианодиновых рецепторов (РиР) CP; изопротеренол (ИЗП, Sigma, 10 мкМ) - агонист ß-адренорецепторов и раствор

Рингера с повышенным содержанием К+ (120 мМ) в качестве деполяризующего агента.

Построение кривой роста. Концентрацию клеток, выращенных в 24-луночных планшетах (Costar, США) в 0,5 мл ПС и снятых смесью трипсин (0,25%)/версен (0,03%) (1:3) (Биолот, Россия), подсчитывали в камере Фукса-Розенталя.

Способность сердечных клеток к делению оценивали по митотическому индексу (МИ - отношение числа митотических ядер к интерфазным) и накоплению митотических клеток в присутствии колхицина (Кх, 24 часа). МИ и долю многоядерных клеток определяли на окрашенных гематоксилином препаратах путем подсчета 1000 клеток па каждый срок фиксации. Клетки выращивали на покровных стеклах и ежедневно фиксировали смесью ледяной уксусной кислоты и спирта (1:3). Кх (0,05 мкг/мл, Serva) добавляли ежедневно в очередные три лунки планшета с клетками и определяли долю к-митозов на микроизображениях, полученных через 24 ч. Морфометрические параметры клеток определяли на микроизображениях клеток, снятых с поверхности смесью трипсин/версен, с помощью программы ВидеоТестМорфология (ВидеоТест, Россия, СПб). Объем клеток вычисляли по формуле: V=3,14/6-d2 D, где d -ширина, a D -длина.

Кинетику изменении и морфологию клеток прослеживали путем прижизненного микрофотографирования растущей популяции в чашках Петри на инвертированном микроскопе PIM-III (WPI, США) или на окрашенных гематоксилином препаратах на тринокулярном микроскопе Н605Т (WPI, США). Ролики сокращающихся колоний получали с помощью аналоговой камеры Panasonic WV-GL920 (Япония) и камеры Leica DFC300 FX (Германия).

Апоптозные тела в первичной культуре клеток миокарда крыс получали согласно методу Hristov et al. (2004) в нашей модификации путем замены среды DMEM с 10% эмбриональной сыворотки на DMEM без сыворотки. Концентрированную суспензию апоптозных тел получали путем двукратного центрифугирования супернатанта (800 g и 16000 g). Апоптозные тела нормировали по белку (0,1 мкг/мл) согласно методу Брэдфорд.

Статистическую обработку результатов производили в программах Microsoft Excel 7.0 и SPSS Statistics. Для оценки значимости полученных результатов применяли регрессионный анализ. Статистические решения принимались на 5%-ном уровне значимости. Данные представлены в виде: среднее арифметическое ± стандартная ошибка.

III. Результаты исследований

3.1. Морфофункциональные характеристики культивируемых кардиомиоцитов новорожденных крыс

В первые пять суток in vitro количество клеток увеличивалось более чем в четыре раза (4,8±1,8 отн. ед., р=0,023). Данные по накоплению к-митозов демонстрируют всплеск митотической активности со 2-го по 4-й дни in vitro (рис. 1, а). Установлено, что около 70% клеток сердца вступает в деление на протяжении первых 2-5 суток, а МИ в этот период колеблется в диапазоне от 1,6 до 0,4 %. После 4-х суток доля делящихся кардиомиоцитов значительно падала (рис. 1, а). Параллельно этим процессам было зарегистрировано нарастание среднего объема кардиомиоцитов от 819±68 мкм3 (1-ые сут), до 1532±212 мкм3 (3-й сут) и до 3246±190 мкм3 (6-е сут) (рис. 1, б). Процесс гипертрофии сопровождался появлением полиплоидных и многоядерных, в основном двуядерных кардиомицитов, которые регистрировались со 2-го дня (около 1%), доходя до 9,5% к 8-м суткам in vitro.

Время культивирования, сутки

Рис. 1. Деление и гипертрофия клеток в первичной культуре клеток миокарда новорожденных крыс, (а) Доля митотических клеток (к-митозов) (колхицин, 0,05 мкг/мл). (б) Нарастание объема кардиомиоцитов in vitro, р<0,001.

3.2. Выявление и характеристика клеток неонатального миокарда, способных к пролиферации и дифференцировке

В культуре клеток неонатального миокарда крыс помимо гипертрофии и остановки деления кардиомиоцитов впервые было выявлено присутствие клеток, способных к пролиферации и образованию незначительного количества колоний, потомков одной клетки, (1-2 клона на 105 клеток), которые увеличивались по мере культивирования (рис. 2). Через сутки после посева пролиферирующие клетки, формирующие колонии, имели малые размеры с

dmax Ср=б,9±0,6 мкм и dm¡n ср=5,4±0,4 мкм (Vcp=141±6 мкм') в отличие от зрелых кардиомиоцитов с dmaxcp=12,3±0,4 мкм и dminср=11,0±0,3 мкм (Vcp=8I9±68 мкм3).

Рис. 2. Колонии, сформированные в первичной культуре клеток миокарда новорожденных крыс линии Wistar, на 7-е (а, б) и 8-е (в, г) сутки культивирования. Окраска гематоксилином. Цифровая камера Leica DFC 300 FX, тринокулярный микроскоп Н605Т (WPI, США), об.х40.

На 8-й день in vitro были зарегистрированы редкие, спонтанные пульсации в центре колоний. Регистрация [Ca2+]¡ на 10-й день in vitro в отдельных клетках слабо сокращающейся колонии (2-3 уд/мин) показала самопроизвольные слабые, разрозненные, асинхронные колебания [Ca2+]¡. Часть клеток этой колонии отвечали повышением [Са2+], на все предложенные воздействия - АцХ, Кф, К" и АТФ. В то же время у другой части клеток была снижена амплитуда ответа на К' и АТФ, а выброс Ca2' из CP при активации РиР с помощью Кф полностью отсутствовал. Это, по-видимому, свидетельствует о незрелости РиР или о недостаточном количестве Ca" в цистернах СР. Однако по мере культивирования сокращения колоний становились высокоамплитудными и синхронными, объединяя клетки колонии в едином ритме пульсаций. При этом все кардиомиоциты в составе колоний синхронно отвечали повышением [Ca2+]¡ не только на действие АцХ, К", но и Кф и 4-ХмК. демонстрируя формирование электромеханического сопряжения (ЭМС). При более длительном развитии in vitro регистрировалось увеличение частоты сокращений колоний вплоть до 58-60 уд/мин (26-30-е сут). Наблюдаемые эффекты представляют доказательства того, что в процессе культивирования происходит направленная кардиодифференцировка клеток в составе колоний.

Идентификация клеток, формирующих колонии сокращающихся кардиомиоцитов in vitro

На 13-й день in vitro были обнаружены колонии разного размера, содержащие CK c-kit - и Sea -типов и Isll ПК. Самыми крупными, объемными

и дифференцированными были Isll+ клоны, которые почти полностью состояли из дифференцированных кардиомиоцитов (рис. 3, а). По размеру Lsll колонии были сопоставимы с сокращающимися колониями. В отличие от Isll+ клонов, на 13-ый день in vitro экспрессию Sca-1 антигена проявляли небольшие плоские колонии (рис. 3, б). C-kit+ клоны были крупнее Sca-1+ колоний (рис. 3, в) и по размеру сопоставимы с клонами Ы1+-типа. Видно, что в c-kit' колониях большое количество недифференцированных клеток (c-kit+) располагается внутри клона, а зрелые кардиомиоциты (GATA+) - по периферии. По-видимому, из-за незавершившейся пролиферации c-kit+ СК, колонии были неспособны к сокращению на этот срок in vitro.

Рис. 3. Иммуноцитохимическое выявление резидентных ПК и СК в колониях кардиомиоцитов новорожденных крыс на 13-й день развития, а) ПК ЫГ-типа (FITC, белый); б) СК Sea'-типа (FITC, белый); в) СК c-kit+-THna (Родамин-Фикоэритрин, серый), GATA4 (FITC, белый). Флуоресцентный микроскоп PFM (WPI, США), об.хЮО (масл.).

С помощью конфокальной микроскопии показано, что колонии на начальных этапах развития состоят из одиночных мелких клеток (d=5-7 мкм), которые затем претерпевают многократное деление, образуя объемные многоклеточные клоны. Проведенное сканирование оптических срезов позволило установить, что толщина колоний на протяжении 10-17 суток in vitro варьируется от 13 до 97 мкм. При этом на 11-13-е сутки размеры по Z-оси ЫГ и c-kit+ клонов были вполне сопоставимы, в то время как Sca-1T колонии были гораздо меньше. Из рис. 4 (а) видно, что Isll+ клетки (12-й срез из 24) локализуются компактно в центре колонии (толщина 36 мкм) среди как исходно зрелых, так и дифференцированных из ПК кардиомиоцитов (актин, Родамин-Фаллоидин). В c-kif клоне (рис. 4, б) зона СК (12-й срез из 24) значительно больше (толщина 35 мкм), а зрелые кардиомиоциты расположены снизу (в основании клона) и по периферии. Плоская Sca-1+ колония (19 мкм) также содержит СК в центре (рис. 4, в), а также отдельные

дифференцированные из CK кардиомиоциты.

Рис. 4. Иммуноцитохимическое выявление резидентных ПК и CK в колониях кардиомиоцитов новорожденных крыс на 11-й день развития.

а) ПК IslT-типа (Alexa 405, белый), актин (Родамин-Фаллоидин, серый).

б) CK с-кіГ-типа (FITC, белый), актин (Родамин-Фаллоидин, серый).

в) CK Sca+-™na (Alexa 405, белый), актин (Родамин-Фаллоидин, серый). Конфокальный микроскоп Leica TCS SP5 (Германия), об.х40 (масл.).

В другой серии экспериментов на иммуноцитохимических препаратах была проведена оценка степени дифференцировки ПК и CK в составе колоний. Это позволило подтвердить полную кардиодифференцировку клеток в составе колоний, образованных Isll+ кардиопредшественниками, на 13-й день in vitro. Однако, в отличие от Isll ' ПК, на 13-й день in vitro CK c-kif-типа находились на стадии активной пролиферации и не выявляли признаков дифференцировки.

Факт дифференцировки клеток в составе колоний был подтвержден экспериментами по измерению активности рецепторов наружной мембраны и СР. Показано, что в недифференцированных клонах значительная часть CK активно пролиферирует и не дает Са2+-ответов на аппликацию АцХ, К+ и Кф. В то же время в дифференцированной сокращающейся колонии четко наблюдается повышение [Ca2 ], в клетках при действии АцХ, К+, АТФ и Кф. Выброс Са2+ из CP в ответ на Кф демонстрирует формирование ЭМС и кардиодифференцировку клеток колоний (рис. 5).

- Ca". ЭГТА

Рис. 5. Изменение концентра-ции внутриклеточного кальция в кардиомиоцитах сокращающейся колонии на 10-й день in vitro в ответ на действие АцХ (20 мкМ), Кф (5 мМ), К+ (120 мМ) и АТФ (180 мкМ), п=6. Бескальциевый раствор Рингера, ЭГТА (1 мМ).

АцХ Кф _К_ АТФ Кф К

Эксперименты в бескальциевой среде, позволили показать, что клетки не дают Са"-ответов при действии Кф (рис. 5). Это свидетельствует в пользу того, что по мере созревания колоний резидентные ПК и СК делятся и дифференцируются в кардиомиоциты с формированием типичного для сердечной мышцы, кальций зависимого высвобождения кальция из СР.

Таким образом, формирование колоний представляет собой модель регенерационного кардиомиогенеза, то есть процесс развития резидентной стволовой клетки или клетки-предшественника до колоний зрелых сокращающихся кардиомиоцитов.

3.3. Способность стволовых клеток и клеток-предшественников миокарда взрослых крыс к пролиферации и дифференцировке in vitro

Существует представление, что регенерационный потенциал клеток миокарда ослабевает с возрастом (Charville, Rando, 2011; Beltrami et al., 2011). Нами была исследована способность СК и ПК сердца 20- и 40-дневных крыс образовывать сокращающиеся колонии в культуре. У крыс обеих возрастных групп были выявлены колонии разного размера и объема in vitro. С помощью конфокальной микроскопии показано, что колонии также образованы СК и ПК трех типов: c-kit', Sca+ и Isl 1 (рис. 6). Но, в отличие от новорожденных животных, в культуре клеток взрослого сердца клоны, способные к сокращениям, встречались намного реже. Регистрируемые в этих случаях спонтанные пульсации колоний были слабыми и аритмичными, что говорит о их неполноценной кардиодифференцировке.

Замечено, что малочисленные слабо сокращающиеся колонии располагались рядом или на зрелых сердечных клетках, подтверждая мысль о

Рис. 6. Иммуноцитохимическое выявление резидентных ПК и СК в колониях кардиомиоцитов 20-дневных крыс на 11-й день развития.

а) ПК ЫГ-типа (Alexa 405, белый), актин (Родамин-Фаллоидин, серый).

б) CK c-kit+-THna (FITC, белый), актин (Родамин-Фаллоидин, серый).

в) CK Sca"-rana (Alexa 405, белый), актин (Родамин-Фаллоидин, серый). Конфокальный микроскоп Leica TCS SP5 (Германия), об.х40 (масл.).

том, что для запуска дифференцировки СК и ПК нужен непосредственный контакт этих клеток со зрелыми кардиомиоцитами.

3.4. Оценка функциональной активности свежевыделенных клеток миокарда новорожденных крыс

В другой серии экспериментов мы получали культуру свежевыделенных клеток миокарда новорожденных крыс, избирательно прикрепляющихся к поли-Д-лизину в течение 3-5 мин. При действии активаторов рецепторов наружной мембраны и СР кардиомиоциты активно реагировали повышением

Рис. 7. Изменение кон-

кардиомиоцитах новорожденных крыс в ответ на действие: а) ИЗП (10 мкМ), Кф (5 мМ), АцХ (20 мкМ), п=9; б) АцХ (20 мкМ); 4-ХмК (2 мМ) и АТФ (180 П^П ЕЛ мкМ), п=4.

иМ

центрации внутриклеточного кальция в свежевыделенных

[Са2+]1 (рис. 7), подтверждая то, что эти клетки функционально активны. Это дает основания использовать полученную культуру в качестве модели зрелых кардиомиоцитов.

3.5. Применение разработанных клеточных моделей миокарда новорожденных крыс

Результатом проведенных исследований стало создание двух моделей клеток миокарда новорожденных крыс в первичной культуре: первая - модель зрелых кардиомиоцитов и вторая модель - процесс формирования колоний зрелых сокращающихся кардиомиоцитов из резидентного кардиопредшественника, предположительно Ы1+-типа, имитирующий регенерационный кардиомиогенез.

Неонатальные кардиомиоциты как тест-система для скрининга антиоксидантных препаратов

АКР при ишемии/реперфузии инициируют перекисное окисление мембранных липидов, что приводит к повышению проницаемости клеточных мембран и нарастанием [Са2+]|. С использованием свежеизолированных зрелых кардиомиоцитов новорожденных крыс нами была разработана тест-система, позволяющая оценивать антиоксидантное действие препаратов по их способности удерживать [Са2+]; на исходном уровне в условиях

экспериментального окислительного стресса, имитирующего образование АКР. В основу создания этой модели положены сведения о повышении [Са2+]1 под влиянием свободнорадикальных процессов при действии Н202 (Долгих, 2005; Ескунов, 2005). Подбор концентраций показал, что при действии Н202 в концентрации 3-10"4 М (10 мин) четко регистрируются последствия окислительного стресса, выражающиеся в нарастании [Са2+]; до 1,72±0,19 отн. ед., но при этом сохраняется функциональная активность рецепторов.

Модель окислительного стресса позволила провести сравнительное изучение применяемого в медицине антиоксиданта феноксана и вновь синтезированной макромолекулярной системы с антиоксидантными свойствами (МСАО) на основе декстрана (Д) и фрагмента феноксана (Ф). Было установлено, что концентрация МСАО (Д+Ф), позволяющая в течение длительного воздействия Н202 (3-10"4М, 1 ч) поддерживать исходный уровень Са2+, составляет 10"7 М, а концентрации феноксана, предотвращающие значительное нарастание [Са2+]; составляют 10"5 - 10"6 М (рис. 8, а, б). Это демонстрирует, что МСАО на один-два порядка эффективнее ее аналога феноксана. Также установлено, что феноксан в концентрациях выше 10"5 М, а МСАО (Д+Ф) - выше 10"6 М при самостоятельном применении (без Н202) ведут себя как прооксиданты, провоцирующие накопление [Са2+];. Однако большая

5 4 3 2 1

0 10 20 30 40 50 Время, мин

_Н2Ог + Ф__]

10 20 30 40 50 60 Время, мин

1- Ю-6 М

Рис. 8. Влияние на внутриклеточную концентрацию кальция ([Са2+]0 совместного действия Н202 (3-Ю'4 М) и феноксана (Ф) (а); Н202 (3-Ю"4 М) и МСАО (Д+Ф) (б). Линейный регрессионный анализ показал отсутствие значимого нарастания [Са2+]; для варианта МСАО (10*7 М) + Н202, (угол наклона кривой значимо не отличается от нуля, р>0,05). Аппроксимирование линейной функцией кривых на начальном участке показало отсутствие значимого роста для Ф (Ю-5 М) + Н202 (р>0,05), тенденцию к росту [Са2+], для Ф (10"6 М) + Н202 (р=0,082). В то же время подтверждено значимое нарастание [Са2+]; в вариантах МСАО (10"8М) + Н202 (р=0,002), МСАО (10"6М) + Н202 (р=0,034), а также Ф (Ю"7М) + Н202 (р<0,001).

широта терапевтического действия MC АО (10"5 М - Ю"7 М) делает её более

привлекательной в плане терапевтического применения.

Изучение влияния продуктов апоптоза на клетки-предшественники кардиомиоцитов

Существует гипотеза, что апоптозные тела могут являться биологическими стимуляторами активности клеток в тканях (Тюкавин и др., 2005; НпбЬу е1 а1., 2004; ВИа^айекаг й а1., 2009). В связи с этим нами были начаты исследования по изучению влияния апоптозных тел на пролиферацию и дифференцировку ПК (Тюкавин и др., 2011). Показано, что внесение в культуру клеток миокарда новорожденных крыс суспензии апоптозных тел приводит к усилению пролиферации резидентных ПК с образованием более объемных колоний (рис. 9), частота сокращений которых доходила до 99 уд/мин. Это более чем в полтора раза превышало скорость сокращений в контрольных

Рис. 9. Колонии, сформированные в первичной культуре клеток неонатального миокарда крыс на 10-й день развития в контроле (а) и при трех суточном воздействии апоптозных тел (б). Цифровая камера Leica DFC 300 FX, инвертированный микроскоп PIM-III (WPI, США), об.х40.

вариантах. Таким образом, проведенные эксперименты представляют доказательства влияния продуктов апоптоза на поведение резидентных CK и ПК в культуре, что будет предметом дальнейшего изучения.

В настоящее время разработка клеточных моделей миокарда, позволяющих изучать процессы регенерации поврежденного сердца является актуальной проблемой. Наши исследования показали, что в культуре клеток миокарда неонатальных крыс линии Wistar имитируются процессы прекращения деления и перехода от гиперплазии к гипертрофии кардиомиоцитов, происходящие в интактном сердце в первые дни после рождения млекопитающих. Наблюдаемое сходство с ситуацией in vivo

Заключение

позволяет рассматривать полученную культуру в качестве адекватной модели для решения проблемы прекращения пролиферации кардиомиоцитов в постнатальном периоде.

Одной из причин низкого регенеративного потенциала миокарда считается то, что кардиомиоциты постнатального сердца не способны к делению. В наших экспериментах на культуре клеток миокарда новорожденных крыс на фоне гипертрофии основной популяции кардиомиоцитов было впервые выявлено присутствие мелких клеток (резидентные СК c-kit+- и Sca+- типов и Isll+ ПК), способных к пролиферации с образованием колоний. Показано, что в составе колоний происходит направленная кардиодифференцировка клеток с приобретением способности к сокращению. При этом процесс дифференцировки запускается самопроизвольно, без дополнительных внешних воздействий. Кардиодифференцировка сопровождается формированием ЭМС, типичного для клеток миокарда. На основании приведенных данных мы заключаем, что в ходе работы получена клеточная модель, которая представляет собой модель регенерационного кардиомиогенеза от незрелой клетки-предшественника до функционально активных кардиомиоцитов и позволяет изучать все этапы пролиферации и дифференцировки сердечных СК.

Миокард взрослых крыс также содержит резидентные СК и ПК выше обозначенных типов, которые сходным образом формируют клоны разного размера. Однако, несмотря на активную пролиферацию СК и ПК, было установлено, что в культуре затруднен процесс кардиодифференцировки клеток с формированием сокращающихся колоний.

На in vitro модели зрелых кардиомиоцитов неонатальных крыс нами была разработана клеточная тест-система для скрининга лекарственных препаратов. Модель окислительного стресса позволила протестировать антиоксидантное действие как известного антиоксиданта феноксана, так и вновь синтезированной МСАО на основе декстрана и феноксана, выявив значительную антиоксидантную активность последней.

Таким образом, нами созданы две клеточные модели: модель зрелых кардиомиоцитов и модель регенерационного кардиомиогенеза. Показана адекватность применения модели зрелых кардиомиоцитов в исследованиях в качестве тест-системы для скрининга антиоксидантных препаратов, а модели кардиомиогенеза для изучения физиологии резидентных сердечных СК и ПК, а также возможности влияния на процессы пролиферации и дифференцировки

этих клеток различных физических факторов, естественных физиологических или биохимических модуляторов (апоптоз, продукты апоптоза).

Выводы

1. Показано, что в первичной культуре сердечных клеток новорожденных крыс имитируются процессы прекращения деления и перехода от гиперплазии к гипертрофии клеток миокарда, происходящие в интактном сердце млекопитающих в первые дни после рождения. Переход от гиперплазии к гипертрофии происходит на четвертые-пятые сутки in vitro. Количество делящихся клеток достигает 60-70%. Объем гипертрофированных кардиомиоцитов на шестые сутки in vitro составляет 3246±190 мкм3.

2. Выявлено образование незначительного количества колоний (1-2 клона на 100 тыс. клеток) в культуре клеток неонатального миокарда, которые увеличиваются в размерах и приобретают способность к сокращению. Установлено, что колонии образованы резидентными стволовыми клетками c-kit+- и Sca+-THnoB и предшественниками кардиомиоцитов Ы1+-типа, различающимися по морфологии и срокам кардиодифференцировки.

3. Показано, что в течение трех недель в клетках колоний формируется

п 2+

электромеханическое сопряжение с типичным для клеток миокарда ьа -зависимым выходом Са2+ из саркоплазматического ретикулума. Представлено доказательство полной кардиомиогенной дифференцировки резидентных стволовых клеток сердца при ко-культивировании со зрелыми кардиомиоцитами.

4. Стволовые клетки и клетки-предшественники (c-kit+, Sea , Isll ) кардиомиоцитов сердца 20- и 40- дневных крыс сохраняют способность к пролиферации и образуют колонии, не проявляющие сократительной

активности in vitro.

5. Создана клеточная модель регенерационного кардиомиогенеза, позволяющая изучать все этапы пролиферации и дифференцировки сердечных стволовых клеток.

6. На модели зрелых неонатальных кардиомиоцитов выявлена значительная антиоксидантная активность макромолекулярной системы, синтезированной на основе декстрана и феноксана.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК:

1. Белостоцкая Г.Б., Дарашина И.В., Голованова Т.А., Хрусталева Р.С., Цырлин В.А. Оценка функционального состояния свежевыделенных кардиомиоцитов крыс в условиях окислительного стресса // Per. кровообр. и микроцирк. 2008. Т. 26, № 2. С. 85-92.

2. Голованова Т.А. и Белостоцкая Г.Б. Способность миокарда крыс к самообновлению в экспериментах от vitro: пролиферативная активность неонатальных кардиомиоцитов // Клет. Транспл. Ткан. Инж. 2011. Т. 6, № 4. С. 74-78.

Статья в сборнике:

3. Белостоцкая Г.Б., Голованова Т.А., Елдашев И.С., Захаров Е.А., Домнина Н.С., Сурма С.В. Уровень внутриклеточного кальция как показатель физиологического состояния мышечных клеток // "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" Т. 3: сборник трудов Первой международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине". 23-26.11.2010, Санкт-Петербург, Россия (Под ред. А.П. Кудинова, Б.В. Крылова). - СПб.: Изд-во Политехи, ун-та. 2010. С. 191198.

Тезисы докладов на конференциях:

4. Белостоцкая Г.Б., Захаров Е.А., Голованова Т.А. Пролиферация и дифференцировка кардиомиоцитов крысы в культуре // Цитология. 2006. Т. 48, №9. С. 743-744.

5. Белостоцкая Г.Б., Голованова Т.А., Васильева Н.А. Колонии сокращающихся кардиомиоцитов в культуре клеток сердца новорожденной крысы // Цитология. 2007. Т. 49, № 9. С. 715.

6. Golovanova Т., Belostotskaya G. Spontaneously proliferating and differentiating cells in the culture of new born rat cardiomyocytes // Eur. Biophys. J. 2009. Vol. 38 (Suppl 1), 0-229. P. 93.

7. Golovanova T.A., Belostotskaya G.B. Identification of cells forming the contractile colonies in the culture of rat cardiomyocytes // Eur. Heart J. 2010. Vol. 31 (Abstract Supplement): 400.

8. Belostotskaya G.B., Golovanova T.A., Vasilieva N.A. Cell proliferation, differentiation and contractile colony formation within neonatal rat heart cell culture

// Focus on Microscopy 2007. Valencia, Spain, 2007. URL: http://www.focusonmicroscopy.org/2007/PDF/300_Belostotskaya.pdf.

9. Белостоцкая Г.Б., Голованова T.A. Формирование колоний сокращающихся кардиомиоцитов в культуре клеток миокарда новорожденной крысы как модель регенерационного кардиомиогенеза // Научные труды III Съезда физиологов СНГ. - Под ред. А.И. Григорьева, O.A. Крышталя, Ю.В. Наточина, Р.И. Сепиашвили. - М.: Медицина-Здоровье, 2011. - 336 с. С. 145.

10. Тюкавин А.И., Белостоцкая Г.Б., Галагудза М.М., Голованова Т.А., Захаров Е.А., Буркова Н.В., Ивкин Д.Ю. Влияние продуктов апоптоза на клетки-предшественники кардиомиоцитов и сократимость миокарда // Научные труды III Съезда физиологов СНГ. - Под ред. А.И. Григорьева, O.A. Крышталя, Ю.В. Наточина, Р.И. Сепиашвили. - М.: Медицина-Здоровье, 2011. - 336 с. С. 200.

Работа Головановой Т.А. поддержана грантом «ФН-медицине» 2007 г., грантами РФФИ № 09-04-00954 и № 11-04-00993, грантами Правительства Санкт-Петербурга № 090114 (2009) и № 10233 (2010), а также премией конкурса «Авангард знаний» (Сколково, 2011).

Выражаю искреннюю благодарность научному руководителю кандидату биологических наук Г.Б. Белостоцкой и научному консультанту доктору биологических наук В.И. Прошевой за ценные советы и консультации, коллективу ИЭФБ РАН, коллегам из ФГБУ "ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова" Минздравсоцразвития России и ГБОУ ВПО СПХФА Минздавсоцразвития России, сотрудникам ИФ Коми НЦ УрО РАН за плодотворное сотрудничество и участие в обсуждении данной работы, а также Е.А. Вершининой за помощь в проведении статистической обработки результатов.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 2530.

Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМА"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д. 24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Голованова, Татьяна Александровна, Санкт-Петербург

61 12-3/962

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова

Российской академии наук

На правах рукописи

Голованова Татьяна Александровна

Функциональные свойства культивируемых клеток сердца крыс: зрелых кардиомиоцитов, стволовых клеток и клеток-предшественников

03.03.01 - Физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н., с.н.с., Г.Б. Белостоцкая Научный консультант: д.б.н., с.н.с., В.И. Прошева

Санкт-Петербург - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СОКРАЩЕНИЯ....................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................5

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................11

1.1. Структурно-функциональная организация сердечной мышцы.. 11

1.1.1. Структура сердечной мышцы.............................. .................................................11

1.1.2. Роль Са2+ в мышечном сокращении и Са2+ как внутриклеточный регулятор.............................................. .................................................................................13

1.1.3. Патогенные и адаптивные изменения в сердце при ишемии/реперфузии... 19

1.2. История открытия, терминология и современные представления о стволовых клетках........................................................................................22

1.3. Сравнительные аспекты регенерации миокарда............................28

1.3.1. Регенеративная способность сердца Zebrafish...................................................30

1.3.2. Регенеративная способность сердца амфибий...................................................33

1.3.3. Регенеративная способность сердца млекопитающих.....................................37

1.4. Стволовые клетки миокарда млекопитающих...............................41

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................................54

2.1. Выделение и культивирование клеток миокарда крыс................54

2.2. Определение [Са ]j в культивируемых клетках миокарда крыс....................................................................................................................56

2.3. Иммуноцитохимическое выявление стволовых клеток и клеток-предшественников в культуре.......................................................................59

2.4. Моделирование окислительного стресса in vitro и оценка активности антиоксидантных препаратов.................................................60

2.5. Получение апоптозных тел в первичной культуре клеток миокарда крыс..................................................................................................62

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..........................................................64

3.1. Морфофункциональные характеристики культивируемых кардиомиоцитов новорожденных крыс.......................................................64

3.2. Выявление и характеристика клеток неонатального миокарда, способных к пролиферации и дифференцировке......................................70

3.2.1. Колонии сокращающихся кардиомиоцитов в первичной культуре.............70

3.2.2. Идентификация клеток, формирующих колонии сокращающихся кардиомиоцитов in vitro.....................................................................................................73

3.3. Способность стволовых клеток и кардиопредшественников сердца взрослых крыс к пролиферации и дифференцировке in vitro.... 80

3.4. Оценка функциональной активности свежевыделенных клеток миокарда новорожденных крыс....................................................................85

3.5. Применение разработанных клеточных моделей миокарда новорожденных крыс.......................................................................................87

3.5.1. Неонатальные кардиомиоциты как тест-система для скрининга антиоксидантных препаратов..........................................................................................88

3.5.2. Изучение влияния продуктов апоптоза на клетки-предшественники кардиомиоцитов..................................................................................................................95

ОБСУЖДЕНИЕ...................................................................................................98

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................118

ВЫВОДЫ............................................................................................................121

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................122

СОКРАЩЕНИЯ

[Ca2+]i Внутриклеточная концентрация свободных ионов кальция

CICR Кальций зависимый выброс кальция из саркоплазматического

ретикулума 4-ХмК 4-хлор-м-крезол

SP Side population cells

АКР Активные кислородные радикалы

АцХ Ацетилхолин

ДГПР Дигидропиридиновые рецепторы

ИЗП Изопротеренол

Кф Кофеин

Кх Колхицин

МСАО (Д+Ф) Макромолекулярная система с антиоксидантными свойствами

на основе декстрана (Д) и феноксана (Ф) МИ Митотический индекс

ПК Предшественники кардиомиоцитов

РиР Рианодиновые рецепторы

СК Стволовые клетки

CP Саркоплазматический ретикулум

ЭМС Электромеханическое сопряжение

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Утрата способности клеток сердечной мышцы млекопитающих к самообновлению, присущему костным рыбам и амфибиям, которые полностью восстанавливают объем и функцию сердца при удалении 20% миокарда [Poss, 2007], является непреодолимым препятствием для полноценной регенерации поврежденного сердца. Уже через несколько дней постнатального развития у млекопитающих наблюдается полное прекращение пролиферации и остановка клеточного цикла кардиомиоцитов [Claycomb, 1992]. Установлено, что в сердце происходит переключение гиперплазии на гипертрофию между третьим и четвертым днями после рождения животного [McGill, Brooks, 1995; Li et al., 1996]. Долгое время существовало мнение, что дальнейший рост сердечной мышцы идет за счет увеличения объема кардиомиоцитов (гипертрофии), а не их числа, и сердце рассматривалось как окончательно дифференцированный орган, не способный к самообновлению [MacLellan, Schneider, 2000; Di Felice et al., 2009].

Однако в последние годы появились данные о наличии в сердце млекопитающих регенерационного потенциала. Так, в поврежденном миокарде человека было обнаружено присутствие незрелых пролиферирующих клеток, показана репликация миоцитов, кариокинез, цитокинез и очаги спонтанных миокардиальных регенераций [Beltrami et al., 2001]. Установлено, что миокард однодневной мыши способен к полному восстановлению структуры и функции после 15% резекции левого желудочка, но эта способность утрачивается уже к концу первой недели жизни [Porrello et al., 2011]. Более того, в литературе описано существование нескольких типов сердечных стволовых клеток (CK) и клеток-предшественников кардиомиоцитов (ПК), способных к самообновлению и дифференцировке в кардиомиоциты: Sea-Г CK [Oh et al., 2003], c-kit+ CK [Beltrami et al., 2003], Isll+ резидентные ПК [Laugwitz et al., 2005] и SP клетки (Side population cells) [Pfister et al., 2005]. Выявлено также образование

клеточных кластеров в культуре, или «кардиосфер», из тканей взрослого сердца мыши и человека [Messina et al., 2004].

Дальнейший поиск и изучение свойств сердечных стволовых клеток является одной из самых актуальных проблем физиологии миокарда. Имеющиеся в настоящее время данные о морфофункциональных свойствах CK сердца, факторах, регулирующих их самообновление и направленную кардиодифференцировку, фрагментарны и недостаточны [Parmacek, Epstein, 2005; Anversa et al., 2006]. Более того, получение чистых популяций сердечных стволовых клеток, применяемое в работах многих авторов, приводит к изолированию CK из их естественного микроокружения и к потере необходимых сигналов и факторов, ответственных за самообновление и дифференцировку CK.

Проблема разработки клеточных технологий для регенерации сердца до сих пор остается нерешенной [Behfar et al., 2010; Malliaras, Marbän, 2011]. В связи с этим существует острая необходимость создания новых клеточных моделей миокарда, которые позволили бы детально изучить все этапы пролиферации и дифференцировки сердечных CK и ПК в условиях, приближенных к их нативному микроокружению. Использование таких моделей будет способствовать развитию представлений о физиологии сердечных стволовых клеток и позволит расширить клинические подходы к лечению заболеваний сердца.

Решение проблемы регенерации сердечной ткани также связано с поиском путей снижения функциональных нарушений в условиях ишемии/реперфузии, когда значительно усиливается образование активных кислородных радикалов (АКР) [Литвицкий и др., 1994]. Одной из наиболее действенных мер является введение экзогенных соединений, которые ингибируют либо сами АКР, либо источники их генерации. В этой связи создание клеточных тест-систем, позволяющих проводить скрининг

антиоксидантных препаратов, способствовало бы наиболее быстрому подбору оптимальных кардиопротекторов.

Цель диссертационной работы - функциональная характеристика зрелых кардиомиоцитов, а также резидентных стволовых клеток и клеток-предшественников кардиомиоцитов сердца новорожденных и взрослых крыс в первичной культуре.

Задачи:

1. Изучить морфофункциональные свойства клеток миокарда неонатальных крыс.

2. Выявить резидентные стволовые клетки и клетки-предшественники в культуре клеток миокарда новорожденных крыс и охарактеризовать их пролиферацию и дифференцировку.

3. Оценить степень зрелости популяции клеток, развивающихся в кардиомиоцитарном направлении, по формированию у них электромеханического сопряжения.

4. Установить способность стволовых клеток и клеток-предшественников кардиомиоцитов к пролиферации, кардиодифференцировке и спонтанному сокращению у взрослых крыс в условиях первичной культуры.

5. Изучить антиоксидантную активность макромолекулярной системы, синтезированной на основе декстрана и феноксана в условиях экспериментального окислительного стресса на модели зрелых неонатальных кардиомиоцитов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В первичной культуре сердечных клеток новорожденных крыс имитируются поведение и закономерности функционирования клеток миокарда, имеющие место в интактном сердце в первые дни после рождения крысы.

2. В культуре клеток сердечной мышцы новорожденных крыс происходит пролиферация резидентных стволовых клеток и клеток-

предшественников с образованием клонов. Направленная кардиодифференцировка этих клеток в составе колоний приводит к формированию популяции зрелых кардиомиоцитов, способных к спонтанному сокращению.

3. В культуре клеток миокарда взрослых крыс имеет место пролиферация резидентных стволовых клеток и клеток-предшественников с формированием колоний, но полной кардиодифференцировки этих клеток не наблюдается.

4. Создана in vitro модель регенерационного кардиомиогенеза, позволяющая изучать процессы пролиферации и дифференцировки сердечных стволовых клеток и клеток-предшественников и in vitro модель зрелых неонатальных кардиомиоцитов, которая может служить в качестве тест-системы для скрининга лекарственных препаратов.

Научная новизна работы. Впервые в культуре клеток миокарда новорожденных крыс линии Wistar детально изучены физиологические свойства кардиомиоцитов на протяжении восьми-десяти дней культивирования и выявлены закономерности их функционирования. Установлено, что в культуре имитируются процессы прекращения деления и перехода от гиперплазии к гипертрофии клеток миокарда, происходящие в интактном сердце млекопитающих в первые дни после рождения. Это позволяет рассматривать ее в качестве модели для изучения прекращения пролиферации кардиомиоцитов.

Впервые in vitro охарактеризован процесс формирования спонтанно сокращающихся колоний кардиомиоцитов, образованных из резидентных стволовых клеток c-kit+- и Sea -типов и клеток-предшественников Ы1+-типа, и представлено доказательство кардиомиогенной дифференцировки резидентных кардиопредшественников в первичной культуре клеток неонатального миокарда крыс. Данный процесс имитирует регенерационный кардиомиогенез

от резидентной клетки-предшественника до формирования колоний зрелых сокращающихся кардиомиоцитов.

В условиях первичной культуры клеток миокарда взрослых крыс выявлена пролиферативная активность резидентных стволовых клеток (c-kit+, Sca+, Isll+), но установлена их сниженная способность к кардиомиогенезу.

Показана адекватность использования модели зрелых неонатальных кардиомиоцитов крыс в качестве тест-системы для скрининга антиоксидантных препаратов. Впервые выявлено кардиопротекторное действие синтезированной макромолекулярной системы (МСАО) на основе декстрана и феноксана (Д+Ф).

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные существенно расширяют представления о физиологии зрелых кардиомиоцитов и резидентных стволовых клеток сердца млекопитающих. Научно-практическая значимость работы заключается, прежде всего, в том, что модель резидентных стволовых клеток и кардиопредшественников имитирует регенерационный кардиомиогенез, а модель зрелых неонатальных кардиомиоцитов предоставляет широкие возможности для изучения физиологии зрелых кардиомиоцитов. В связи с этим предложенные клеточные модели могут быть использованы в исследованиях по проблеме регенерации сердечной мышцы, при скрининге лекарственных (кардиотропных) препаратов, а также при разработке новых методов клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на Всероссийском Симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006), на Политехническом симпозиуме «Молодые ученые - промышленности северо-западного региона» (Санкт-Петербург, 2006), на XX форуме физиологов России (Москва, 2007), II Съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), конференции «Фундаментальные науки-медицине» (Москва, 2007), международной конференции «Focus on Microscopy 2007» (Валенсия, Испания, 2007), Russian-Norwegian symposium «Myocardial

protection: molecular, pathophysiological and clinical aspects» (Санкт-Петербург, 2008), VII Европейском биофизическом конгрессе (Генуя, Италия, 2009), XXI всероссийском съезде Физиологического общества (Калуга, 2010), Европейском кардиологическом конгрессе (Стокгольм, Швеция, 2010), Первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010), а также на рабочих совещаниях и заседаниях международной организации «ScanBalt» (Рига, Латвия, 2009), Санкт-Петербургского физиологического общества (2009), проблемной комиссии ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова (Санкт-Петербург, 2010), III Съезде физиологов СНГ (Ялта, 2011), XIV Международном совещании и VII школе по эволюционной физиологии, посвященных памяти академика Л.А.Орбели (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья в сборнике работ, 20 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста, иллюстрирована 38 рисунками и 2 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 174 источников, из них 141 иностранных.

Работа поддержана грантом «ФН-медицине» 2007 г., грантами РФФИ № 09-04-00954 и № 11-04-00993, грантами Правительства Санкт-Петербурга № 090114 (2009) и № 10233 (2010), а также премией конкурса «Авангард знаний» (Сколково, 2011).

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурно-функциональная организация сердечной мышцы

В этом разделе диссертации дано краткое описание морфофункциональной организации сердечной мышцы. Особое внимание уделено электромеханическому сопряжению (ЭМС), а также вопросам внутриклеточной регуляции ионов кальция.

1.1.1. Структура сердечной мышцы

У высших позвоночных различают сердечные миоциты предсердий и желудочков, которые называют сократительными (рабочими) миоцитами, а также пейсмекерные и проводящие миоциты [Прошева, 1998].

Кардиомиоциты рабочего миокарда желудочков представляют собой вытянутые, плотно упакованные клетки, которые сгруппированы в мышечные волокна. Для них характерно продольное расположение большинства внутриклеточных компонентов, включая миофибриллы, митохондрии и ядра. Миофибриллы - пучки нитей сократительных белков - являются основными внутриклеточными органеллами. Несколько реже встречаются митохондрии, расположенные правильными рядами в межмиофибриллярном пространстве и образующие беспорядочные скопления в субсарколеммальном и околоядерном пространствах. В кардиомиоцитах желудочков хорошо развиты система Т-трубочек и саркоплазматический ретикулум (СР), часто содержатся два и более ядер [Форбс, Сперелакис, 1988]. Вместе с Т-каналами цистерны СР образуют преимущественно диады, а не триады. Они, вероятно, имеют характер не трубок, а глубоких поперечных складок. Объем Т-системы в желудочковых миоцитах составляет 27-36 % от объема цитоплазмы. По каналам Т-системы не только распространяется импульс, но и поступают в клетку метаболиты. Мембраны СР содержат в своем составе Са -активируемую транспортную

'У А-

АТФазу, обеспечивающую накопление ионов Са внутри цистерн СР. При релаксации миофиламентов ионы

Са2+ всасываются в СР, достигая по его И

каналам терминальных цистерн. Кардиомиоциты предсердий по своим характеристикам напоминают клетки рабочего миокарда желудочков, но они имеют существенно меньший диаметр. У взрослых млекопитающих рабочие миоц