Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Межклеточные взаимодействия мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток и дифференцированных клеток сердца и почки

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Межклеточные взаимодействия мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток и дифференцированных клеток сердца и почки"

904612025

На правах рукописи

Хряпенкова Татьяна Геннадьевна

Межклеточные взаимодействия мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток и дифференцированных клеток сердца и почки

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 но Я 2010

МОСКВА

2010

004612025

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, на факультете биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научные руководители Доктор биологических наук, профессор

Зоров Дмитрии Борисович

Доктор биологических наук Плотников Егор Юрьевич

Официальные оппоненты Доктор биологических наук, профессор

Воробьёв Иван Андреевич, биологический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, кафедра клеточной биологии и гистологии

Кандидат биологических наук Белоусов Всеволод Вадимович, Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии имени академика М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, отдел геномики и постгеномных технологий, лаборатория молекулярных технологий

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Ин-

ститут биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита состоится «у¿т» // 2010 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан «/3» /О_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук У Е.Н.Калистратова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Регенеративная клеточная терапия - современное направление медицины, вызывающее немалый интерес как врачей, так и учёных, и получившее большое развитие в последние годы. Сегодня клеточная терапия имеет весьма широкое применение в самых различных областях современной клинической практики. Особенно оправданным является использование этой терапии в борьбе с ишеми-ческой болезнью сердца (ИБС), последствиями инфаркта миокарда (ИМ) и другими функциональными и структурными изменениями сердечной ткани, так как па-томорфология миокарда человека не сопровождается органной регенерацией. Обычно при этих патологиях происходит гипертрофия кардиомиоцитов при минимальной пролиферативной способности миокарда. Часто единственным способом сохранить больному жизнь является трансплантация сердца - дорогостоящая и опасная операция, вынужденно применяемая на сегодняшний день достаточно широко (Taylor et al., 2009). Сердечно-сосудистые заболевания занимают, в настоящее время, ведущее место среди причин смертности больных в развитых странах. Аналогичные проблемы существуют и для почки, содержащей в основном постмитотические клетки (Humes et al., 2004; Amiel et al., 1999). Для этого органа проблемой также является поиск подходов к лечению острой почечной недостаточности (ОПН) и терминальных стадий хронической почечной недостаточности (ХПН). На сегодняшний день диализ (Чупрасов, 2001) и трансплантация -единственно возможные варианты борьбы с этими патологиями. Оба эти подхода сложны для реализации и имеют массу осложнений и противопоказаний. Несмотря на значительный прогресс в лечении ХПН, по-прежнему регистрируется высокая смертность от этого заболевания. Диализ распространен в большей степени, чем трансплантация, но он продлевает жизнь, не восстанавливая функцию почек у больных с терминальными стадиями ХПН, и не дает шансов на выздоровление. Трансплантация может дать полное восстановление функций почки, но связана с массой сложностей из-за дефицита доноров и реакций иммунологической несовместимости, а также высокой стоимости операции.

В приведённых выше случаях заместительная клеточная терапия могла бы стать самым оптимальным способом восстановления утраченных функций органа. Но прежде чем начинать применение заместительной клеточной терапии в клинической практике, необходимо убедиться в её безопасности, а также определить механизмы положительных эффектов на клеточном уровне. К сожалению, на сегодняшний день клиническое использование в этой области наверно серьезно превышает количество фундаментальных исследований возможностей клеточных технологий. В данной работе предпринята попытка восполнить этот пробел и расширить знание фундаментальных основ клеточной терапии. В современной литературе идет противоборство двух взглядов на взаимодействие донорских стволовых клеток с организмом реципиента. Согласно одной концепции основу эффекта вводимых клеток составляет их направленная дифференцировка в клетки органа-мишени, согласно второй - положительное действие связано, в первую

очередь, с выделением стволовыми клетками неких паракринных факторов, которые оказывают стимулирующее воздействие на окружающую ткань. Кроме того, особое внимание к себе привлекают некоторые типы межклеточных взаимодействий, характерные, в частности, для стволовых клеток. В первую очередь, это контакты, описанные совсем недавно и названные туннельными нанотрубочками (Rustom et al., 2004). Эти структуры способны осуществлять передачу различных внутриклеточных компонентов между клетками, расположенными на достаточном удалении друг от друга, что отличает их от всех известных клеточных контактов (Onfelt et al., 2004).

В работе были исследованы механизмы, которые могут обеспечивать терапевтические эффекты клеточной трансплантации, наблюдаемые в клинической практике. В частности, изучено поведение стволовых клеток при взаимодействии с дифференцированными соматическими клетками: кардиомиоцитами и клетками эпителия почечных канальцев. Исследованы межклеточные взаимодействия этих клеток, в частности, межклеточные контакты и межклеточный транспорт.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось исследование механизмов интеграции мезенхи-мальных мультипотентных стромальных клеток (ММСК) с дифференцированными соматическими клетками (кардиомиоцитами, эпителиоцитами почки крысы); изучение влияния межклеточных контактов на определение пути дифференци-ровки ММСК.

Задачи

1. Исследовать образование межклеточных контактов при совместном культивировании ММСК человека с эмбриональными кардиомиоцитами или эпителиоцитами почки крысы.

2. Определить возможность межклеточного транспорта клеточных ком-партментов между сокультивируемыми клетками.

3. Исследовать возможность дифференцировки ММСК человека в кар-диомиоциты или эпителиоциты почки в условиях сокультивирования.

4. Исследовать возможность интеграции ММСК в орган in vivo при различных патологиях, приводящих к структурно-функциональным изменениям.

Научная новизна работы

Было показано, что в совместной культуре между ММСК человека и дифференцированными соматическими клетками крысы образуются межклеточные контакты, в частности щелевые контакты и туннельные нанотрубочки. По этим контактам осуществляется межклеточный перенос цитоплазматических и мембранных компонентов и органелл, в частности митохондрий. В ММСК в условиях сокультивирования с соматическими клетками запускается дифференцировка по кардио- или нефроспецифическому пути, и эта дифференцировка в значительной мере зависит от наличия специфических контактов между клетками.

Научно-практическое значение работы

Данные, полученные в настоящем исследовании, расширяют представление о возможностях заместительной терапии повреждений почки и сердца. Получены новые данные о механизмах взаимодействия донорских клеток с клетками организма реципиента (на уровне культуры клеток и на уровне организма). Полученный материал может использоваться для дальнейшего клинического внедрения клеточных технологий для предотвращения патологических изменений при почечной недостаточности или патологиях сердца и улучшения терапевтических эффектов заместительной клеточной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. ММСК человека могут при совместном культивировании образовывать контакты с дифференцированными соматическими клетками крысы, такими как кардиомиоциты и клетки почечного эпителия.

2. Между контактирующими клетками происходит обмен клеточным содержимым.

3. Следствием образования межклеточных контактов в совместной культуре клеток становится дифференцировка ММСК по ткане-специфичному пути.

4. ММСК человека при введении животным способствуют уменьшению выраженности повреждения почек при острой почечной недостаточности.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на теоретических семинарах отдела биоэнергетики НИИ Физико-Химической Биологии им. А.Н. Белозерского. Отдельные аспекты работы представлялись на Международной Пироговской Студенческой научной конференции (Москва, 2007); конференции «Биология — наука 21-го века» (Пущино, 2007); международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007, 2009); Международном молодежном медицинском конгрессе (Санкт-Петербург, 2007); XV Международной конференции «Ломоносов» (Москва, 2008, 2010); 15-ой Европейской Биоэнергетической Конференции ЕВЕС (Дублин, 2008); Международном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2008); Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных "Актуальные вопросы медицинской науки" (Ярославль, 2009); Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации

Основные положения диссертации опубликованы в 18 печатных работах. Из них 6 - в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объём работы

Диссертация написана на 120 страницах, состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Благодарности» и «Список литературы». Список литературы включает 9 отечественных и 202 иностранных источника.

Материалы и методы исследования

Первичная культура кардиомиоцитов была получена из сердца эмбрионов крыс 15-17 дней гестации. Сердечная ткань подвергалась механическому измельчению (до кусочков размером приблизительно 1-1,5 мм). Кусочки ткани помещали в раствор Хенкса, отмывали от крови. После этого ткань подвергали воздействию 0,1% коллагеназы 2 типа. После ферментативной обработки суспензия центрифугировались при 100g в течение 1 мин. Раствор, содержащий фермент, отбирался. Осадок клеток ресуспендировали в среде DMEM-F12(4:1) с 15% содержанием сыворотки крупного рогатого скота. Аналогичным образом выделялись эпи-телиоциты почек 1-3-дневных крысят. Клетки ресуспендировали в среде DMEM-F12(l,i) с 10% содержанием эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки культивировали в инкубатор при температуре 37°С и 5% С02. Культура ММСК, полученная из аутопсийного материала плодов 11-13 недель гестации, была предоставлена НЦ Акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова. Фенотип ММСК был подтвержден позитивной окраской на маркеры CD90 и CD 105, и отрицательной на маркеры CD34, CD45.

Митохондриальный трансмембранный потенциал оценивали при помощи этилового эфира тетраметилродамина (TMRE, Invitrogen, США).

Для оценки транспорта цитоплазматического содержимого клетки окрашивались 2,5 мкМ Calcein AM (Invitrogen, США). Для оценки транспорта митохондрий клетки окрашивались 1 мкМ Mitotracker Green FM или Mitotracker Red (Invitrogen,США). Для оценки транспорта липидов мембран клетки окрашивались 2,5 мкМ DiO, DiD или DiL (Vybrant, Invitrogen, США).

Микроскопическое изучение клеток почки производилось на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе LSM510 (Carl Zeiss, Германия). Изображения обрабатывались программным пакетом ImageJ.

Проточная цитофлуориметрия проводилась с помощью проточного цито-метра CyFlow (Partee GmbH, Германия).

Опыты по моделированию ишемии/реперфузии (И/Р) почки проводились на самцах белых беспородных крыс массой тела 180-200 г, содержавшихся в условиях вивария. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977. На проведение экспериментального исследования было получено разрешение Комиссии по биоэтике НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского. Для моделирования И/Р у животных под хлоралгидрат-ным наркозом выделяли и пережимали сосудистую ножку почки сосудистым зажимом на различные периоды времени. После снятия зажимов отсчитывали время реперфузии. После окончания периода реперфузии либо удаляли почку для дальнейшего анализа, либо накладывали швы и выводили животное из наркоза.

Иммуноцитохимия. Клетки фиксировали 4% раствором формалина; пер-меабилизировали 0,2% Triton Х-100. Организация цитоскелета клеток оценивалась при помощи флуоресцентного красителя ТРИТЦ-фаллоидин (Sigma, США), а также моноклональных антител против тяжелой цепи кардиоспецифического ß-миозина человека, после чего клетки инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с ФИТЦ. Для визуализации митохондрий использовали антитела к цитохромС-оксидазе человека. Также в работе использовались антитела к ядрам человеческих клеток (Human Nuclei); к белку Тамма Хорсфаля (THF) -специфическому белку почечных канальцев.

Вестерн-блоттинг. Содержание белка определяли с помощью бицинхонино-вой кислоты. Электрофорез белков проводили по Лэммли (Laemmli, 1970). Для проведения электрофореза использовали 12,5% разделяющий гель и Трис-глициновый электродный буфер. По окончании электрофореза белки переносили на PVDF мембрану (Amersham Pharmacia Biotech, Rainham, UK) согласно методике, описанной ранее (Towbin et al., 1992). Мембраны обрабатывали 5% раствором обезжиренного сухого молока, инкубировали с первичными антителами, промывали три раза по 15 мин, и инкубировали 1 ч со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Искомые белковые локусы на мембране детектировали с помощью хемилюминесцентного субстрата ECL (Enhanced chemiluminescence system, Amersham Pharmacia Biotech) с последующей детекцией хемилюминесценции на фотопленке Kodak (США). Изображение оцифровывали и анализировали с помощью программы ImageJ.

Магнитно-резонансная томография (МРТ). Для исследования методом МРТ животных анестезировали хлоралгидратом и помещали в устройство позиционирования с системой стереотаксиса и терморегуляции томографа BioSpec 70/30. Трансплантируемые клетки для данного метода предварительно инкубировали с препаратом железа (Мальтофер, Vifor, Швейцария) в течение 12 часов. После этого клетки промывали, трипсинизировали и отмывали от диссоциирующих агентов. Полученный осадок клеток разводили физиологическим раствором до концентрации, необходимой для введения животным и вводили непосредственно в почку. Во время МРТ проводился мониторинг с помощью прибора для контроля жизнедеятельности Small Animal Monitoring and Gating System, (SA Instruments Inc., USA). Анализ MP-изображений проводился в программе ImageJ.

Результаты и обсуждение

Характеристика культуры клеток сердца эмбрионов крысы. Гетерогенность культуры

Тщательной отработкой методов выделения и подбором оптимальных условий для содержания данной культуры было достигнуто образование клеточных ассоциатов, способных к самопроизвольному сокращению и обладающих признаками сердечной ткани уже через 24 часа. В зависимости от плотности культуры сокращались как отдельные прикреплённые к пластику клетки, так и многоклеточные островки, сокращение клеток в которых было согласованным и периодичным. Выделенная культура являлась гетерогенной - помимо клеток, способных к

сокращению, она содержала также и высокий процент недифференцированных кардиофибробластов. Данная культура была охарактеризована по ряду признаков:

1. Дифференцированные кардиомиоциты способны к самопроизвольному сокращению.

2. Флуоресценция ТМЯЕ в этих клетках почти в 4 раза превышает данный показатель в кардиофибробластах.

3. Миофибриллы расположены в этих клетках упорядоченно и имеют поперечную исчерченность.

4. Дифференцированные кардиомиоциты имеют повышенное содержание внутриклеточного кальция; способны к циклическим колебаниям концентрации ионов кальция во внутриклеточных депо.

5. Таких клеток в культуре около 50%.

В дальнейшем эти признаки использовались для наблюдения только за кар-диомиоцитами в экспериментах по сокультивированию их с мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками (ММСК), поскольку нас интересовало взаимодействие ММСК именно с сократительными элементами миокарда.

Формирование межклеточных контактов в смешанной культуре клеток различного происхождения

В работе использовалась модель совместного культивирования двух различных типов клеток с целью изучения поведения стволовых клеток в

почечного эпителия в обоих типах клеток наблюдается образование множества протяженных межклеточных структур, причем длина таких цитоплазмати-ческих выростов в ряде случаев была сопоставима с размерами клетки (рис.1). Первоот-

Рис.1. Образование нанотрубочек при сокультивировании ММСК и других типов клеток. А, фазовый контраст, видны нанотрубочки различной толщины, соединяющие кардиомиоциты и ММСК. Шкала 20 мкм. Б, сканирующая электронная микроскопия, нанотрубочки соединяющие клетки. Шкала 3 мкм. В,Г, трансмиссионная микроскопия; нанотрубочки, соединяющие кардиомиоциты и ММСК (указаны маленькими чёрными стрелками); наличие в нанотрубочках визикулярных структур (большая чёрная стрелка); структура концевого участка нанотрубочки (длинная чёрная стрелка). Шкала 5 мкм.

ткани после трансплантации. Нами выявлено, что в процессе культивирования ММСК с кардиомиоцита-ми или клетками

крыватели этих структур назвали их туннельными нанотрубочками, ТНТ (Rustom et al., 2004). В данной работе было показано, что нанотрубочки и более крупные по диаметру тяжи цитоплазмы достаточно активно образуются в культуре кар-диомиоцитов и при культивировании их в монокультуре без соседствующих ММСК. Вероятно, это отражает фенотипическую предрасположенность кардио-миоцитов к образованию единого многоклеточного синцития, как это происходит в ткани сердца. Напротив, в монокультуре клеток почечного эпителия такие контакты практически не наблюдались. Однако в условиях сокультивирования образование нанотрубочек значительно усиливалось, причем как со стороны ММСК, так и клеток сердца (и, возможно, почки, так как в ряде случаев сложно определить, какая из контактирующих клеток являлась ТНТ-образующей). ММСК в условиях монокультуры также образовывали ТНТ. Причём, если сравнивать количество ТНТ-образующих клеток в монокультурах ММСК и кардиомиоцитов, оно будет сопоставимым; тогда как в монокультуре клеток почки таких клеток крайне мало. Полученные данные подтвердили образование между клетками совместной культуры межклеточных контактов по типу ТНТ 0,1 мкм в диаметре) наряду с другими типами цитоплазматических тяжей, соединяющих клетки (~ 3 мкм). На электронных микрофотографиях видно, что клетки образуют множество выростов цитоплазмы по типу филлоподий, которые могут как перемещаться вдоль субстрата так и выпячиваться перпендикулярно клеточной мембране (рисЛВ). Образовавшиеся ТНТ, соединяющие клетки, имеют вид натянутых нитей и не имеют контактов с подложкой (рис.1 А,Б), что является признаком, отличающим их от обычных филлоподий. Из данных просвечивающей микроскопии следует, что

ТНТ представляют собой достаточно эластичные структуры, способные растягиваться в поперечнике в 2-4 раза, что может обеспечить транспорт объемных структур - везикул, митохондрий (рис.1Г).

Помимо ТНТ в совместной культуре клеток наблюдается формирование и щелевых контактов. Их наличие подтвердилось рядом экспериментов. В частности, фиксированные клетки окрашивали антителами к коннексину 43 - маркеру щелевых контактов. Также культуру подвергали окраске антителами на Human Nuclei, чтобы визуализировать популяцию человеческих клеток. На изображении (рис.2) хорошо видно, что

А Б

Рис.2. Образование щелевых контактов между клетками различного происхождения - человеческих ММСК и крысиных клеток почки. Конфокальная микроскопия; А, иммуноцитохимическое окрашивание. Зелёная флуоресценция - AT на Human Nuclei -маркер человеческих клеток; красная флуоресценция - AT на коннексин 43 - маркер щелевых контактов. Коннексин обнаруживается в том числе в области контакта ММСК и клеток почки. Б, фазовый контраст. Шкала 20 мкм.

клетки различного происхождения (человеческие ММСК с зеленым ядром; соседние клетки почки крысы - с неокрашенными ядрами) находятся в плотном контакте друг с другом. В зоне их непосредственного контакта наблюдаются частицы с красной флуоресценцией - коннексин 43, что свидетельствует о наличии между этими клетками щелевых контактов. Оценка функциональности таких контактов показала, что в режиме реального времени посредством щелевых контактов происходит межклеточная передача цитоплазматического содержимого.

7 Исследование возможности раз-

личных клеток образовывать контакты по типу туннельных нанотрубочек в условиях моно- и совместной культуры

Было замечено, что в условиях монокультуры практически все ММСК в полумонослойной культуре образуют ТНТ. В культуре кар-диомиоцитов и ММСК число клеток, образующих ТНТ, возрастало в условиях совместного культивирования (относительно монокультуры кардиомиоцитов). В условиях монокультуры кардиомиоцитов таких клеток было на 12% меньше. В случае ММСК процент ТНТ-образующих клеток, напротив, несколько снижался в совместной культуре относительно монокультуры ММСК. Однако более объективным является подсчет количества ТНТ на клетку. Оценив количество ТНТ на ТНТ-образующую клетку, мы обнаружили, что число ТНТ значимо увеличивается в совместной культуре (относительно монокультуры) (рис.3). Увеличение ТНТ-образующих клеток в совместной культуре, в сочетании с данными о меньшем проценте таких клеток в монокультуре кардиомиоцитов и большим проценте их в монокультуре ММСК, позволяет предположить, что основной вклад в формирование ТНТ в совместной культуре делают именно ММСК. Аналогично проводили исследования совмест-

Кард-ы ММСК Кард-Ы + ММСК

Рис.3. Количество ТНТ на клетку в чистой культуре клеток сердца эмбрионов крыс, чистой культуре ММСК и смешанной культуре кардиомиоцитов и ММСК; наблюдается увеличение количества ТНТ на клетку в смешанной культуре.

Эпителий ММСК + вА

ММСК + ММСК + эпителий эпителий + вА

Рис.4. Количество ТНТ на клетку в чистой культуре ММСК, чистой культуре почечных эпителиоцитов крыс и смешанной культуре почечных клеток и ММСК; а также в культурах, инкубированных с ингибитором щелевых контактов 18-рОА - монокультуре ММСК и смешанной культуре эпителиоцитов и ММСК. Среднее количество ТНТ на клетку больше в смешанной культуре и уменьшается в присутствии 18-|ЮА.

ной культуры, в состав которой входили клетки почечного эпителия. Было отмечено, что в условиях монокультуры практически все ММСК в полумонослойной культуре образуют ТНТ, а в монокультуре почечного эпителия процент клеток, образующих ТНТ, составлял около 10%. В то же время, в совместной культуре число клеток, имеющих ТНТ, составляло около 30%. В экспериментах с клетками почки, сокультивируемыми с ММСК, мы также оценивали влияние на формирование ТНТ ингибитора щелевых контактов - 18-(3 глицирретиновой кислоты (18-|3 GA). Было показано, что в ее присутствии процент ТНТ-образующих клеток уменьшается практически в 2 раза как в монокультуре ММСК, так и в совместной культуре ММСК и клеток почечного эпителия, по отношению к аналогичным опытам без добавления ингибитора. Также нами было обнаружено, что число ТНТ на клетку значительно возрастает в условиях совместной культуры и снижается в присутствии 18-Р GA, как в монокультуре ММСК, так и в совместной культуре ММСК и клеток почки (рис.4).

Обмен цитоплазмой в смешанной культуре мезенхимальных мультипотент-ных стромальных и соматических клеток

Контактирование клеток, описанное выше, открывает потенциальные возможности межклеточного обмена. Для выявления транспорта цитоплазмы использовали флуоресцентный краситель Calcein-Green АМ. ММСК костного мозга или соматические клетки окрашивали Calce in и пересаживали на чашки с неокрашенными клетками. Клетки были проанализированы на конфокальном микроскопе через 24 часа сокультивирова-ния. Было обнаружено образование многочисленных нанотрубо-чек, однако из-за увеличения плотности культуры в результате пролиферации многие клетки контактировали уже поверхностями плазматических мембран, с возможным образованием щелевых контактов. Во многих кардиомиоцитах, контактирующих с ММСК, нагруженных Cal-cein-AM (с высокой интенсивностью флуоресценции Calcein в цитоплазме), также наблюдалась зеленая флуоресценция, однако более низкой интенсивности. Это свидетельствует о миграции цитоплазматического содержимого ММСК в ци-

А Б

Рис.5. Транспорт цитоплазматического содержимого из ММСК в клетки почечного эпителия после 24 часов сокультивирования. А, конфокальное изображение. Перед сокультивировани-ем ММСК окрашены флуоресцентным зондом Calcein-AM - зелёная флуоресценция; клетки почечного эпителия окрашены флуоресцентным мембранным красителем Dil - красная флуоресценция. Через 24 часа флуоресценция Calcein наблюдается не только в ММСК, но и в контактирующих с ними эпителиоцитах, а в ММСК обнаруживается флуоресценция Dil. Передача красителей наблюдается в клетках, несущих на-нотрубочки или имеющих щелевые контакты с гетерологическими клетками. Б, фазовый контраст. Шкала 50 мкм.

тозоль соседних кардиомицитов. В части клеток-реципиентов наблюдалось появление окрашенных клеточных компартментов. Исходя из природы красителя, было сделано предположение, что эти окрашенные Са1сет компартменты являются

органеллами из клеток-доноров

Зч

А {

! Ы\

24ч

á / i

Calccm fluoroiccuc

С jkoin Аиомкопсо

Зч

24ч

L ¡l , К

\ к V \

Cale« i» liuoiMC«nc6

C»lc*mntioí*s<ei»c*

Д 24Ч, в условиях вибрации

Сй1с«1л Пиогмсмк»

Рис.6. Передача между кардиомиоцитами и ММСК цитоплазматического красителя Са1сет, исследованная по изменению соотношения окрашенной и неокрашенной популяций клеток в совместной культуре. Цитофлуориметрия. Окрашена культура ММСК (А,Б,Д); или культура кардиомио-цитов (В,Г). Показано образование единой популяции через 24 часа совместного культивирования (Б,Г); а также отсутствие объединения популяций в условиях вибрации (Д), препятствующей образованию ТНТ.

(ММСК), окрашенных Calcein. Аналогично исследовали передачу цитоплазматического содержимого в смешанной культуре клеток почки и ММСК. В данном случае клетки почки предварительно окрашивали мембранным красителем Dil - красная флуоресценция (рис.5). В экспериментах было отмечено, что обмен является ненаправленным - в культуре обнаруживались клетки с двойным окрашиванием с преимущественным содержанием как цитоплазматического, так и мембранного красителя (рис.5).

Образование межклеточных контактов и обмен содержимым цитоплазмы между клетками были также проанализированы с помощью проточной цитометрии. В одной серии экспериментов Calcein-AM окрашивали ММСК, которые затем пересевали на культуральные флаконы с неокрашенными кардиомиоцитами. Во второй серии Calcein-AM окрашивали кардиомиоциты крысы, а затем к ним подсаживали неокрашенные ММСК. Было обнаружено, что через 3 часа смешанная культура клеток в обеих сериях опытов четко разделялась на 2 субпопуляции по интенсивности флуоресценции Cal-

cein (рис.6А,В). После 24 часов сокультивирования деление клеток на 2 субпопуляции исчезало. В клеточной суспензии наблюдалось равномерное распределение по интенсивности с одним пиком (рис.бБ). Во второй серии экспериментов при сокультивировании кардиомиоцитов, окрашенных Са1сеш-АМ, и неокрашенных ММСК деление клеток на 2 субпопуляции, наблюдавшееся через 3 часа совместного культивирования (рис.бВ), также исчезало через 24 часа (рис.бГ). В качестве контроля смешанную культуру клеток содержали в условиях вибрации в течение 24 часов: сразу после прикрепления клеток флакон с культурой помещали на шейкер (50 колебаний в минуту). В данном случае сохранялось разделение клеток

на окрашенные и неокрашенные, то есть физическое препятствие формирования межклеточных контактов предотвращало межклеточный обмен.

Аналогичное исследование проводили и с клетками почки в составе совместной культуры. Также было показано образование между сокультивируемыми клетками контактов, по которым часть окрашенного Са1сеш цитоплазматического содержимого была передана в неокрашенные клетки почки. При контрольном со-культивировании в одной культуральной чашке, но на отдельных покровных стеклах, клетки разделялись на две популяции даже через 48 часов, как в случае предварительного окрашивания клеток почки, так и в случае предварительной окраски ММСК. Чтобы оценить вклад щелевых контактов в обмен, мы инкубировали совместную культуру с ингибитором щелевых контактов - 18-Р ОА - и также не наблюдали слияния пиков; происходило незначительное сближение пиков и образование небольшой промежуточной популяции.

Транспорт митохондрий из мезенхимальных мультипотентных стромалъ-ных клеток в клетки сердца или почки

При окраске смешанной культуры митохондриальным красителем ТМЯЕ

■■- зэ внутри ТНТ, образую-

* щихся между клетками,

обнаруживались структуры окрашенные этим I В зондом. В смешанной

саг* . культуре клеток почки

_ и ММСК мы восполь-

'•й?«жались другим митохондриальным красите-V лем - 1С-1 и также по-

казали наличие окрашенных им митохондрий внутри ТНТ (рис.7А).

Также мы подтвердили наличие митохондрий внутри ТНТ посредством электронной трансмиссионной микроскопии. Было показано, что в ТНТ находятся двумембран-ные образования, которые по размерам и морфологическим осо-

Рис.7. Наличие в туннельных нанотрубочках митохондрий и других везикулярных структур. А, наложение фазового контраста и флуоресцентного изображения; совместная культура эпителиальных клеток почки и ММСК. Красная флуоресценция - .ГС-1 - визуализация митохондрий. Шкала 10 мкм. Б-Д, электронная трансмиссионная микроскопия; совместная культура кардиомиоцитов и ММСК; большими стрелками показаны структуры с 2-мя мембранами - митохондрии, а также одномембранные везикулы - длинными стрелками; шкала 0,5 мкм.

бенностям соответствовали именно митохондриям (рис.7Б-Д).

Обмен митохондриями в смешанной культуре клеток почки и ММСК был

также исследован с помощью проточной цитофлуориметрии (рис.8). При исследовании на разных сроках сокультивирова-ния было обнаружено, что сразу после смешивания культура разделяется на две популяции с разной интенсивностью флуоресценции митохондриального зонда (рис.8А). Уже через 3 часа наблюдался сдвиг популяции, нагруженной Mitotracker, в сторону уменьшения интенсивности флуоресценции. Эта тенденция продолжала развиваться к 24 часам (рис.8Б); к 48 часам сокуль-тивирования пики обеих популяций практически сливались (рис.8В). Таким образом, происходит транспорт митохондриального красителя, то есть ММСК передают окрашенные Mitotracker митохондрии в клетки почки. При сокультивирова-нии окрашенных почечных эпи-телиоцитов и неокрашенных ММСК деление клеток на 2 субпопуляции, наблюдавшееся сразу после смешивания, исчезало уже через 24 часа (рис.8Д), что указывает на более эффективный транспорт митохондрий из почечных клеток в ММСК.

Ещё одним методом, подтверждающим обмен митохондриями между клетками в совместной культуре, стала иммуно-цитохимия. Фиксированные клетки окрашивали антителами к цитохром С-оксидазе человека, а также к ядрам человеческих клеток (Human Nuclei). Было показано, что человеческие ММСК имеют положительную окраску

Рис.8 Передача между почечными клетками и ММСК митохондриального красителя Mitotracker, исследованная по изменению соотношения окрашенной и неокрашенной популяций клеток в совместной культуре. Цитофлуо-риметрия. А-Г, ММСК окрашены Mitotracker Green; Д, клетки почки окрашены Mitotracker Green. Показано, что со временем пики в совместной культуре заметно сближаются (Б,В), или даже сливаются (Д); тогда как при культивировании на разных культуральных стёклах сближение значимо слабее, а слияния пиков не наблюдается даже через 48 часов (Г).

------А

Б

Рис.9. Обмен митохондриями в совместной культуре клеток почечного эпителия и ММСК. А, иммуноцитохимическое окрашивание антителами к цитохром С-оксидазе человека (зелёная флуоресценция); красная флуоресценция - ядра человеческих ММСК. Показано, что в клетке почки (стрелка), находящейся в контакте с ММСК (окрашенное ядро), выявляются митохондрии из ММСК. Б, фазовый контраст. Шкала - 20 мкм.

на цитохром С-оксидазу и Human Nuclei, а клетки почки крысы - отрицательны по обоим маркерам. Почечные клетки, лежащие в зоне непосредственного контакта с ММСК имеют положительную окраску на цитохром С-оксидазу, но отрицательную по Human Nuclei. Очевидно, что это клетки эпителия почки, получившие митохондрии от ММСК (рис.9). Такие клетки появляются уже через 1 сут совместного культивирования, а через 4 сут их количество возрастает.

Обмен мембранными компонентами в совместной культуре клеток почки и мезенхималъными мультипотентными стромальными клетками

Для исследования обмена между клетками мембранными компонентами мы также использовали проточную цитометрию. Предварительно, липофильным красителем окрашивалась одна из культур - либо культура ММСК, либо клеток почки (рис.10). Было обнаружено, что сразу после смешивания в культуре выделяются две популяции с разной интенсивностью флуоресценции DiO (липидный краситель) (рис.ЮА). При сокультивировании происходит уменьшение обеих начальных популяций и появление большого числа клеток с промежуточными значениями интенсивности флуоресценции, то есть клеток почки, в которые транслоцировался зонд из ММСК (рис.10Б,В). При сокультивировании почечных эпителиоцитов, окрашенных DiO, и неокрашенных ММСК также происходила передача мембранного красителя из эпителиоцитов в неокрашенные ММСК (рис.ЮД). При сокультивировании в одной культуральной

инкубация с 18-GA

l. It

Рис.10. Передача между клетками почечного эпителия и ММСК мембранного флуоресцентного красителя ОЮ, исследованная по изменению соотношения окрашенной и неокрашенной популяций клеток в совместной культуре. Цитофлуориметрия. А-Г,Ж, окрашена культура ММСК; Д,Е, окрашена культура эпителиоцитов. Ж, смешання культура инкубировалась с ингибитором щелевых контактов 18-|3 ОА. Наблюдается заметное сближение пиков или даже их слияние через 24 - 48 часа совместного культивирования (Б,В,Д), а также отсутствие объединения популяций в условиях культивирования на раздельных стёклах даже через 48 часов (Г,Е). Показано также, что в условиях инкубирования с 18-Р йА (Ж) сохраняется разделение культуры на 2 популяции.

чашке, но на отдельных

покровных стеклах, что предотвращает контактирование, клетки оставались разделенными на две популяции даже через 48 часов, как в случае предварительного окрашивания клеток почки, так и в случае предварительной окраски ММСК (рис.ЮГ,Е). Можно заключить, что именно непосредственный контакт клеток в совместной культуре является обязательным условием передачи клеточных ком-партментов. Как уже показано выше, основными контактами, участвующими в

таком транспорте, являются ТНТ и щелевые контакты. Чтобы оценить вклад щелевых контактов в обмен, мы инкубировали совместную культуру с ингибитором щелевых контактов, 18-Р GA, что приводило к уменьшению эффективности передачи красителя, но не отменяло его полностью (рис.ЮЖ).

Дифференцировка мезенхимальных мулыпипотентных стромальных клеток по ткане-специфичному пути

Особенно важным результатом сокультивирования является запуск диффе-ренцировки стромальных клеток по специфическому пути после их контактирования с дифференцированными соматическими клетками. В данной работе было

показано, что уже через 1 сут после сокультивирования ММСК человека и кардиомиоцитов крысы, в ММСК выявляются гранулы, положительно окрашивающиеся антителами на кардиоспецифический Р-миозин человека. При использовании антител в чистой культуре ММСК подобной окраски на Р-миозин в клетках обнаружено не было, то есть сами по себе стволовые клетки не экспрессируют кардиоспецифический р-миозин. Нами использовались высокоспецифичные антитела к тяжелой цепи человеческого Р-миозина, что исключает возможность транспорта донорского миозина из кардиомиоцитов в ММСК, а также окраску миозина в кардиомиоцитах крысы, что было подтверждено отдельными экспериментами.

Что касается смешанной культуры клеток почки и ММСК, то в данном случае для оценки дифференцировки использовались антитела к цитокератину (при им-муноблотгинге), специфичному для эпителиальных клеток почки или к белку Тамма Хорсфаля (THF) - специфическому белку почечных канальцев (при иммуноцитохимии) (рис.11). В первом случае мы наблюдали высокий процент содержания цитокератина в контрольных образцах человеческой почки, а также отсутствие его в чистых ММСК человека. Образцы крысиной почки также не окрашивались антителами к цитокератину в виду высокой видоспецифичности этих антител к человеческому белку. В образцах сокультвированых клеток уже через 3 сут мы наблюдали появление полосы

А Б В

Почка Почка ММСК 7сут Зсут человека крысы

Сокультивирование

Г

Рис.11. Появление специфичных для почки белков в ММСК на разных сроках сокультивирования ММСК и клеток почечного эпителия. А-В, конфокальная микроскопия. Им-муноцитохимическое окрашивание антителами к THF - красная флуоресценция; к Human Nuclei - зелёная флуоресценция. А, чистая культура ММСК; Б, смешанная культура на 4 сутки совместного культивирования; В, смешанная культура на 4 сутки совместного культивирования в условиях, препятствующим контактированию клеток. Шкала 50 мкм. Г, иммуноблотинг. Антитела к цитокератину 5,6,18.

цитокератина, которая через 7 суг становится более интенсивной. Это говорит о том, что в смешанной культуре клеток ММСК начинали синтезировать видоспе-цифичный человеческий цитокератин, то есть человеческие ММСК начали дифференцироваться в эпителий. С увеличением срока совместного культивирования увеличивалось число дифференцировавшихся клеток и/или концентрация данного белка в клетках. О том, что ММСК начинали дифференцироваться именно в эпителий почечных канальцев, говорят и эксперименты по выявлению в этих же ММСК почечного белка THF, вырабатывающегося в почечных канальцах. Мы использовали антитела к THF, не обладающие видоспецифичностью, поэтому этот белок выявляется и в клетках крысиной почки. В этом случае для визуализации ММСК мы дополнительно окрашивали смешанную культуру антителами к Human Nuclei. Было обнаружено, что в чистой культуре ММСК данный белок не синтезируется, тогда как на четвёртые сутки сокультиврования появлялись клетки с положительной окраской и на Human Nuclei, и на THF - то есть человеческие ММСК, в которых появился специфический почечный белок. Также мы обнаружили, что в условиях, препятствующих возникновению межклеточных контактов, синтез THF в ММСК на четвёртые сутки практически отсутствовал. Это позволяет сделать вывод, что для запуска дифференцировки ММСК в клетки того же типа, с которыми они сокультивируются, необходимо наличие непосредственных физических контактов между этими клетками.

Влияние мезенхимальных мулыпипотентных стромальных клеток при введении в почку in vivo

Для того чтобы оценить физиологические последствия введения ММСК на уровне целого организма, был проведён ряд экспериментов на животных с использованием модели острой почечной недостаточности (ОПН). Крысе, после 90-минутной тепловой ишемии левой почки, в повреждённую почку интрапаренхи-матозно вводили суспензию ММСК. После этого оценивались биохимические показатели: креатинин, мочевина, клиренс креатинина, реабсорбция натрия. Все животные, не получившие лечения после 90-минутной тепловой ишемии единственной почки, погибли от ОПН (на 2-4 сутки). После введения ММСК от ОПН не погибла ни одна крыса. Показатели функции почки у выживших крыс восстанавливались до нормальных значений через 1-2 месяца, за исключением канальцевой реабсорбции натрия, которая нормализовалась уже через 2 недели.

Для уточнения вопроса, связано ли терапевтическое действие ММСК при постишемической ОПН с встраиванием пересаженных клеток в почечные структуры, или же оно обусловлено их паракринным влиянием, в части опытов мы инъецировали в почку ММСК, меченые флуоресцентным красителем Calcein. При исследовании срезов почки через 1 сут выявляли наличие меченых ММСК в месте инъекции и в прилежащих областях (рис.12А), однако только в интерстициальном пространстве ткани почки. Двойное окрашивание прижизненных срезов почки митохондриальным красителем TMRE и Calcein-AM показало, что введенные ММСК сохраняют митохондриальный трансмембранный потенциал, то есть большая часть трансплантированных клеток остается неповрежденной и функционально активной (рис.12Б).

Учитывая приведённые данные, можно полагать, что встраивания ММСК в

эпителиальную выстилку поврежденных канальцев не происходит, по крайней мере, на ранних сроках после введения, и что основной терапевтический эффект достигается, вероятно, за счет паракринного действия. При анализе распределения меченых ММСК в почке в более отдаленные сроки (7 сут) после трансплантации, число клеток выявляемых на одном срезе было значительно меньше, чем в первые сутки, что может объясняться возможной гибелью клеток. Одновременно с этим происходила миграция единичных ММСК на большие расстояния от места инъекции практически по всей паренхиме почки, что подтверждалось серийными срезами почки. Было также показано, что при окраске фиксированных срезов почки антителами к Human Nuclei через 7 сут после трансплантации клетки в основном локализуются

в интерстиции.

Чтобы обнаружить трансплантированные клетки в почке на отдалённых

сроках мы использовали метод МРТ для отслеживания меченных препаратом железа клеток. На МР-изображении клетки были видны в виде затемнённой области (рис.13). Эта область практически не изменяет своих размеров и положения в течение двух недель. Это может говорить о том, что основная масса трансплантированных клеток если и мигрирует в ткани почки, то на незначительное

А Б

Рис.12. Распределение ММСК, введенных в почку, по ткани. Конфокальная микроскопия витальных срезов почки после 90-минутной тепловой ишемии почки и интрапаренхима-тозного введения ММСК, меченых Са1сеш-АМ; дополнительная окраска срезов флуоресцентным зондом ТМЛЕ. А, флуоресцентная микроскопия витальных срезов почки через 1 сутки после введения ММСК. Видно распространение введенных клеток (зеленая флуоресценция) по интерстицию почки между почечными канальцами (красная флуоресценция). Большой стрелкой указано место введения клеток. Шкала - 50 мкм. Б, окраска жизнеспособных ММСК обоими красителями дает желтую окраска (клетки помечены стрелками). Шкала - 20 мкм.

А rt '' лг ■ А

if f.' Г. TV M г г ' 5

А Б В

Рис.13. ММСК, введённые в почку. МР-изображения почек крыс после 90-минутной тепловой ишемии почки и интрапаренхиматозного введения ММСК, меченых препаратом железа. Клетки, меченные железом, видны в виде затемнённой области (стрелка). А, 3 суток после введения; Б, 2 недели после введения; В, интактные почки.

расстояние; высокая элиминационная способность почечной ткани исключает возможность накопления препарата железа в клетках почечного эпителия.

Выводы

1. Показана возможность образования межклеточных контактов между человеческими мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками и кардиомиоцитами или клетками почки крысы. Клетки разного происхождения контактируют как через щелевые контакты, так и через туннельные на-нотрубочки.

2. После сокультивирования с кардиомиоцитами в мезенхимальных мультипо-тентных стромальных клетках наблюдаются признаки дифференцировки в кардиомиоциты: экспрессия человеческого кардиоспецифического Р-миозина.

3. После сокультивирования с клетками почки в мезенхимальных мультипо-тентных стромальных клетках наблюдаются признаки дифференцировки в почечный эпителий: синтез цитокератина и белка Тамма Хорсфаля.

4. Показана возможность межклеточного транспорта различных клеточных компартментов в совместной культуре; показана зависимость этого транспорта от щелевых контактов и туннельных нанотрубочек.

5. При введении мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток в поврежденную почку показана интеграция клеток в ткань почки, сохранение их жизнеспособности. При этом отмечено улучшение показателей функции почки после ишемии/реперфузии.

Список публикаций по теме диссертации

1. Khrvapenkova TG. Plotnikov EY, Galkina SI, Sukhikh GT, Zorov DB, Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. FEBS J, 2010, 277(S1), 136

2. Plotnikov E.Y., Khrvapenkova T.G., Galkina S.I., Sukhikh G.T., Zorov D.B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromalcells and renal tubular cells in co-culture. Experimental Cell Research, 2010, 316, p2447 - 2455

3. Хряпенкова Т.Г. Механизмы взаимодействия мультпотентных мезенхи-мальных стромальных клеток с клетками почечных канальцев в условиях совместного культивирования. Материалы Международной конференции "Ломоносов-2010", 2010, с.308

4. Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Роль туннельных нанотру-бочек в транспорте клеточных структур между мультипотентными мезен-химальными стромальными клетками и клетками эпителия почечных канальцев. Материалы Всероссийского симпозиума по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий», Цитология, 2009, 51(9), с.790-791

5. Хряпенкова Т.Г. , Плотников Е.Ю., Сухих Г.Т, Зоров Д.Б. Межклеточный транспорт клеточных структур посредством туннельных нанотрубочек в совместной культуре мультпотентных мезенхимальных стромальных клеток и клеток почечных канальцев. Материалы Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", 2009, с.105-107

6. Хряпенкова Т.Г.. Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б.. Транспорт различных клеточных структур между мультпотентными мезенхимальньши стромальными клетками и клетками почечных канальцев при совместном культивировании. Материалы Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных "Актуальные вопросы медицинской науки", 2009, с.101-102

7. Кудрявцев Ю.В., Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю., Казаченко A.B., Марей М.В., Хряпенкова Т.Г., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Морфологические изменения в почках крыс с острой постишемической почечной недостаточностью после внутрипочечного введения фетальных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2009,1, с. 3-10

8. Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Коротецкая М.В., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б. Гетерогенность митохондриального потенциала как маркер для выделения чистой популяции кардиомиобластов. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2008, 4, с.188-195

9. Казаченко A.B., Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Кудрявцев Ю.В., Хряпенкова Т.Г.. Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Восстановление функций почки при интрапаренхиматозном и внутривенном введении стволовых и прогениторных клеток при хронической и острой почечной недостаточности. Материалы международного симпозиума «От экспери-

ментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», Судак, 2008, с.68-70

lO.Khryapenkova T.G., Plotnikov E.Y., Korotetskaya M.V., Vasileva A.K., Marey M.V., Sukhikh G.T., Zorov D.B.; Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes: the role of mitochondria. Abstract Book: 15th European Bioenergetics Conference 2008, 2008, 1777, Supplement to BBA Bioenergetics. S53-54

П.Исаев H.K., E.B. Стельмашук, Е.Ю. Плотников, Т.Г. Хряпенкова, Е.Р. Лозиер, Ю.В. Долудин, Д.Н. Силачев, Д.Б. Зоров. Роль ацитода, NMDA-подтипа глутаматных рецепторров и кислоточувствительных ионных каналов (ASICla) в развитии нейрональной гибели при ишемии. Биохимия, 2008, 73(11), 1461-1466

12.Хряпенкова Т.Г.. Коротецкая М.В., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Гетерогенность митохондриального потенциала как маркер для выделения чистой популяции кардиомиобластов. Материалы XV Международной конференции «Ломоносов-2008», 2008, с. 248-249

13.Plotnikov E.Y., Khryanenkova T.G., Vasileva А.К., Marey M.V., Galkina S.I., Isaev N.K., Sheval E.V., Polyakov V.Y., Sukhikh G.T., Zorov D.B. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in coculture. J. Cell. Mol. Med., 2008, 12(5A), pp. 1622-1631

И.Плотников Е.Ю., Хряпенкова Т.Г.. Марей M.B., Сухих Г.Т. , Зоров Д.Б. Обмен цитоплазмой между мезенхимальными стволовыми клетками и кардиомиоцитами при совместном культивировании. Роль туннельных нанотрубочек. Материалы 11-ой Пущинской конференции молодых ученых "Биология — наука 21-го века", 2007, с.163-164

15.Хряпенкова Т.Г.. Плотников Е.Ю., Марей М.В., Сухих Г.Т. , Зоров Д.Б. Исследование путей взаимодействия кардиомиоцитов и мезенхимальных стволовых клеток в совместной культуре. Материалы II Международного молодежного медицинского Конгресса, Санкт-Петербург, 2007, 54-55

16.3оров Д.Б., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю., Зорова Л.Д., Стельмашук Е.В., Васильева А.К., Архангельская A.A., Хряпенкова Т.Г. Митохондрия как многоликий Янус. Биохимия, 2007, 72(10), с. 1371 - 1384

17.Хряпенкова Т.Г.. Плотников Е.Ю., Васильева А.К., Марей М.В., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б. Межклеточный транспорт цитоплазмы и органелл между мезенхимальными стволовыми клетками и кардиомиоцитами при совместном культивировании. Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 2007, с.278-279

18.Хряпенкова Т.Г.. Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю. Функциональная гетерогенность первичной культуры кардиомиоцитов крысы. Материалы второй Международной Пироговской Студенческой научной конференции. Вестник РГМУ, 2007, 2(55), с.323-324

Заказ № 48-а/10/10 Подписано в печать 11.10.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

л , ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

К «у/ www.cfr.ru ; е-таП:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хряпенкова, Татьяна Геннадьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Научная новизна работы.

Практическое значение работы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Потеря клеточных элементов как звено патогенеза почечной и сердечной недостаточности.

Консервативные методы лечения заболеваний сердца и почек медикаментозный и заместительный.

Трансплантация клеток как альтернативный подход.

Типы применяемых для терапии клеток.

Эмбриональные стволовые клетки.

Мезенхимальные стволовые клетки.

Стволовые клетки взрослой почки.

Стволовые клетки сердца.

Особенности подготовки клеток к трансплантации.

Способы трансплантации клеток.

Способы влияния: встраивание и дифференцировка; слияние; паракринные и эндокринные эффекты; иммуномодуляция; донирование органел, микровизикул, растворимых веществ.

Межклеточные взаимодействия.

Контакты.

Щелевые контакты.

Туннельные нанотрубочки.

Паракринные, эндокринные эффекты.

Слияние.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Среды и реагенты.

Получение первичной культуры кардиомиоцитов, эпителиальных клеток почки крысы.

Получение мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток.

Модель сокультивирования клеток эмбриональной сердечной ткани крысы или эпителиоцитов крысы и мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток человека.

Оценка состояния митохондрий в клетках.

Оценка организации цитоскелета клеток в культуре кардиомиоцитов.

Оценка распределения внутриклеточного кальция.

Оценка транспорта цитоплазмы.

Оценка транспорта мембранных компонентов.

Проточная цитофлуориметрия.

Электронная сканирующая и электронная трансмиссионная микроскопия

Моделирование ишемии/реперфузии почки.

Магнитно-резонансная томография.

Получение срезов корковой зоны почки.

Микроскопическое исследование клеток и срезов почек крыс.

Определение концентрации белка.

Вестерн-блот. иммуногистохимическое окрашивание срезов почки и культуры.

Статистика.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Характеристика культуры клеток сердца эмбрионов крысы. Гетерогенность культуры.

Гетерогенность клеток культуры по энергетическому аппарату.

Гетерогенность клеток культуры по сократительному аппарату.

Гетерогенность по распределению внутриклеточного кальция.

Формирование межклеточных контактов в смешанной культуре клеток различного происхождения.

Исследование возможности различных клеток образовывать контакты по типу туннельных нанотрубочек в условиях moho- и совместной культуры.

Обмен цитоплазмой в смешанной культуре мезенхимальных мультипотентных стромальных и соматических клеток.

Транспорт митохондрий из мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток в клетки сердца или почки.

Обмен мембранными компонентами в совместной культуре клеток почки и мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками дифференцировка мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по ткане-специфичному пути.

Влияние мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток при введении в почку in vivo.