Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Получение и доклинические испытания дифференцированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при остеоартрозе у животных

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Получение и доклинические испытания дифференцированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при остеоартрозе у животных"

На правах рукописи

А......^

САТТАРИ ФАРД Ханиех

Л

Получение и доклинические испытания дифференцированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при остеоартрозе у животных

06.02.02 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г я ноя 2013

Москва-2013 005540259

005540259

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ).

Научный руководитель: член-корреспондентРоссельхозакадемии,

доктор биологических наук, профессор Девришов Давудай Абдулсемедович

Официальные оппоненты:

Букова Наталья Константиновна - доктор биологических, ФБГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», ученый секретарь.

Еремец Владимир Иванович - доктор биологических наук, профессор, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский технологический институт биологической промышленности», заместитель директора по науке.

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко».

диссертационного сов< , , ВПО «Московская

государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Телефон: 8(495)-377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Автореферат разослан «/^ »НоЛ^ года

Защита состоится

часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Остеоартроз (ОА) является гетерогенной группой заболеваний суставов различной этиологии со сходными биологическими, морфологическими и клиническими признаками. ОА характеризуется дегенерацией суставного хряща и структурными изменениями субхондральной кости, а также явно или скрыто протекающим умеренно выраженным синовитом. ОА — одно из распространенных заболеваний у людей старше 45 лет, проживающих в северных регионах, и у человека и животных, подвергающих физическим нагрузкам опорно-двигательный аппарат на фоне нарушений обмена веществ.

Развитие иммунологии и клеточной биологии за последние годы позволяет разработать новые подходы в лечении различных заболеваний и дефектов тканей и органов организма человека и животных. Особую перспективу в биомедицине приобрели методы лечения и замещения крупных повреждений тканей стволовыми клетками, характеризующиеся способностью высокой пролиферативной активностью.

Потенции к регенерации тканей мезенхимного происхождения и доступность ММСК позволили ученым рассматривать этот материал как наиболее перспективный в регенерационной и заместительной терапии, что и является актуальной задачей в клеточной терапии.

Преимущество клеточной терапии в ее терапевтической эффективности и относительно высокой толерантности организма к клеточному материалу по сравнению с трансплантацией тканей и органов.

Важной составляющей тканевой инженерии является матрикс, с помощью которого осуществляется доставка клеток в область дефекта и их пролиферация в месте патологического поражения. В качестве матрикса для мягких тканей используются гидрогели различного происхождения, характеризующиеся инъектабельностью и высокой эффективностью загрузки ММСК.

Цель исследований. Целью исследований является создание скаффолда с мультипотентными мезенхимальными стромапьными клетками (ММСК) на

основе фибринового гидрогеля, изучение его влияния при внутрисуставном введении животным и оценка терапевтического эффекта при остеоартрозе (OA).

Задачи исследований:

1. Получение и оптимизация среды культивирования клеток мезенхимального происхождения костного мозга (КМ) овец и мышей.

2. Определение морфологических характеристик, митогенной активности и кариотипа мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга клеточных культур и длительности пассирования in vitro.

3. Цитодифференцировки ММСК КМ в клетки хондрогенной линий in

vitro.

4. Усовершенствование метода получения гидрогеля in vitro для создания скаффолдов с ММСК и их внутрисуставной трансплантации при OA.

5. Экспериментальное воспроизведение OA у лабораторных и продуктивных животных.

6. Изучение терапевтической эффективности скаффолдов с дифференцированными ММСК костного мозга при OA запястного и коленного суставов у животных.

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ методов выделения ММСК из костного мозга овцы и мыши, охарактеризованы морфологические и иммунобиологические свойства мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и установлена оптимальная концентрация FBS при направленной пролифераций ММСК костного мозга в хондроциты и разработан способ получения фибринового гидрогеля для создания скаффолдов с ММСК.

Впервые разработан метод индуцирования остеоартроза запястного и коленного суставов овец и мышей путем внутрисуставного введения трипсина и способ лечения OA с использованием скаффолдов с ММСК.

Практическая значимость. Разработанный метод получения гидрогеля из фибрина плазмы крови, методика иммобилизации скаффолдов ММСК и их трансплантация представляют практический интерес для биомедицины, биотехнологии и ветеринарии, для получения новых методических подходов и

лекарственных форм для лечения поврежденных тканей. Разработанный метод получения гидрогеля из фибрина плазмы крови для трансплантации ММСК представляет практический интерес для биомедицины, биотехнологии и ветеринарии, поскольку позволяет получить эффективный натуральный носитель (скаффолд) хрящевой ткани при относительно низкой стоимости его приготовления.

Метод выделения и наращивания ММСК мышей используется на кафедре иммунологии, а способ трансплантации гидрогеля используется на кафедре хирургии ФГБОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе и в учебном процессе.

Личный вклад соискателя. Автором непосредственно выполнены исследования по получению и культивированию ММСК костного мозга, создании скаффолдов для проведения экспериментальных испытаний при OA у животных. Проведен анализ, сделаны выводы и даны рекомендации по дальнейшему применению разработанной технологии в биомедицине. В работе использованы материалы, полученные в соавторстве с заведующим кафедрой иммунологии член-корр. РАСХН Девришовым Д.А.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы обсуждались на заседаниях кафедры иммунологии и ученого совета ФГБОУ ВПО МГАВМиБ [Москва, 2010-2013].

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практического использования полученных научных результатов, рекомендаций по использованию научных выводов, списка использованной литературы (198 источников, из которых 23 отечественных и 175 иностранных). Материал изложен на 124 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 23 рисунка и 2 страницы приложений.

На защиту выносятся следующие положения и результаты.

1. Метод выделения ММСК костного мозга овец и мышей, их культурально-морфологическая характеристика и кариотип.

2. Индуцирование остеоартроза в коленных и запястных суставах лабораторных животных путем внутрисуставного введения трипсина.

3. Метод приготовления фибринового гидрогеля и иммобилизация скаффолдов ММСК КМ.

4. Доклинические испытания скаффолдов ММСК при ОА овец и мышей.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2010 по 2013 годы на кафедре иммунологии ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.

Суспензию костного мозга получали от 5 баранов методом пунктирования гребня подвздошной кости. Выделение мезенхимальных клеток из костного мозга осуществляли путём разделения аспирата костного мозга в градиенте фиколпак. Полученные клетки рассевали в концентрации 104 кл./мл в ростовой среде в культуральные флаконы и культивировали в С02-инкубаторе (37°С, 5% С02, 80% влажности) до достижения монослоя, со сменой ростовой среды каждые 3 дня.

Пассирование клеток осуществляли в ростовой среде: БМЕМ-Ьв или БМЕМ-Р12; 10%-ная фетальная телячья сыворотка; 100 ед./мл пенициллина; 100 ед./мл стрептомицина; 2 мМ глютамина; 10 нг/мл БОР. Смену среды осуществляли 2 раза в неделю. При достижении монослоя 80%-ной конфлюэнтности клетки переводили в суспензию с использованием раствора 0,25% трипсина с версеном (1:1) и рассевали в соотношении 1:3 для дифференцировки. Хондрогенная дифференцировка ММСК барана и мышей проводилась в экспоненциальной фазе роста клеточной культуры с конфлюэнтностью более 60%, после визуального контроля. Клетки рассевали малые культуральные флаконы из начальной концентрации 1><105кл./флакон и

культивировали на протяжение 3 недель с заменой среды каждые 3 сут. в дифференцировочной среде: DMEM-HG, 0,1 мкМ дексаметазона, 0,05 мМ аскорбиновой кислоты, 10 нг/мл TGF-[i, ITS (1 г/л инсулина, 0,67 мг/л селена, 0,55 г/л трансферрина) и 0,2 мМ аскорбат-2-фосфат. В экспоненциальной фазе роста с конфлюэнтностью более 60% клетки снимали с подложки с помощью трипсина/версена (1:1), после чего 15 мл взвеси переносили в пробирку с коническим дном и с помощью мягкого центрифугирования (300 g) осаждали на дно, полученную клеточную массу культивировали в среде DMEM без сыворотки, содержащей 100 Ед./мл пенициллина, 100 Ед./мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 100 нг/мл TGF-р в течение 3 недель. Через 21 сутки, культивирования из полученных микромасс готовили срезы на криотоме. Полученные срезы окрашивали 1%-ным раствором толуидинового синего (Toluidine Blue О) в 50% изопропаноле.

Иммуноцитохимическая детекция поверхностных и внутриклеточных маркёров проводилась в культуре ММСК, выращенной на покровных стёклах, которые троекратно промывали PBS и фиксировали клетки 4%-ным раствором параформальдегида в течение 15 мин. при комнатной температуре. Фиксированные клетки отмывали PBS и пермеабилизировали с помощью PBS, содержащего 1% Triton хЮО, в течение 10 мин. при комнатной температуре, после чего отмывали PBS. Неспецифическое связывание моноклональных антител (МАТ) с подложкой блокировали в течение 30 мин. при комнатной температуре в PBS, содержащем 0,5% БСА, 2%-ную нормальную сыворотку крови козы, 0,05% Tween-20, 0,01% мертиолат. Разведение МАТ против поверхностных клеточных маркёров (первичных антител) — CD34, CD 44 (Pgpl), CD54 (ICAM-1), CD 105 (эндоглин), MAT готовили на этом же буфере. Затем клетки инкубировали с первичными антителами при комнатной температуре в течение 90 мин., отмывали PBS с добавлением 0,5% БСА и 0,05% Tween-20. Инкубацию с вторичными антителами проводили при комнатной температуре в течение 60 мин., и также отмывали PBS с добавлением 0,5% БСА и 0,05% Tween-20. Ядра клеток докрашивали раствором 1 мкг/мл DAPI в PBS. Полученные

препараты заключали в среду для протектирования флуоресценции. В качестве вторичных антител применялись антивидовые антитела, меченные флуоресцентными красителями - родамином и флуоресцеин-5-изотиоцианатом (FITC - fluorescein isothyocyanate).

Хондрогенную дифференцировку проводили на среде DMEM-HG с 1% HAS, 0,1 нМ дексаметазоном, 0,2мМ аскорбат-2-фосфатом, lxITS, 10 нг/мл линолиевой кислотой, 10 нг/мл TGF-рз и 1% антибиотиком и 10 нг/мл IGF-1.

Детекция маркёров клеточной дифференцировки для подтверждения хондрогенной (аггрекан, коллаген I, II и X типов) дифференцировки ММСК проводили методом ОТ-ПЦР.

Проточная цитофлуориметрия применялась для исследования экспрессии клетками поверхностных белков. Монослойную клеточную культуру переводили в суспензию с помощью версена. Окрашивание клеток проводили МАТ, меченными FITC, в PBS, содержащем 1% FBS, с последующей фиксацией 2%-ным раствором параформальдегида. Анализ проводили с помощью проточного цитофлуориметра Beckman Coulter Epics XL и программного пакета WinMDI 2.7.

Морфологическую оценку ММСК проводили помощью фазовоконтрастной микроскопии. Для оценки пролиферации культивируемых клеток использовали метод анализа КОЕ-Ф (колониеобразующая единица фибробластов).

Для внутрисуставного индуцирования остеоартроза в запястном (1мл) и коленном (0.1мл) суставах у разных животных использовали трипсин 0,1%. Для наркоза использовали рометар, который мыши вводили внутрибрюшинно, а овце подкожно.

Фибриноген для получения гидрогеля был выделен из плазмы крови коров методом цикла замораживания-оттаивания. Сшитые фибриновые гели создавали путем смешивания равных объемов тромбина и фибриногена. После смешивания растворов фибриногена и тромбина изменение мутности измерялось на UV-VIS спектрофотометре.

С целью лечения OA мы применяли метод аллотрансплантации ММСК, иммобилизированные в гидрогель фибрина. Гистосрезы окрашивали по методу гематоксилин-эозина.

Для экспериментальных исследований были использованы 5 беспородистых овец возрастом более 7 лет, средним весом 40 кг, и 30 белых мышей в возрасте более 1 мес., средним весом 20 г.

Экспериментальные данные обрабатывали методом среднестатистического анализа и с помощью программ SPSS и программы Excel и one way ANOVA.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Получение и характеристика клеточных материалов мезенхимального происхождения из костного мозга

Особенности выделения ММСК из костного мозга определяются трудностью доступа и особенностями капиллярной сети костного мозга, что приводит к появлению существенной примеси крови в биопсийном материале, и внешне он не отличается от образца периферической крови такого же объёма, примесь крови может составлять свыше 70%.

Рисунок 1. Монослой ММСК из костного мозга овцы II пассаж: А - колонии ММСК из костного мозга овцы, 6-й день культивирования, ув.

40X; Б - 9-й день культивирования, ув. 200X.

При визуальном просмотре материала КМ I пассажа обнаруживали наличие нескольких морфологических гетерогенных популяций клеток на культуральном пластике. Выявляли два типа клеток: округлые клетки, создающие колонии и интенсивно делящиеся в течение первых 7-10 сут.

Культивирования, и ФБТ-подобные клетки. После I пассажа клеточная культура ММСК костного мозга выглядела морфологически гомогенной и содержала митотически активные веретенообразные клетки (фибробластоподобные клетки) (рис. 1).

Клетки, выделенные из костного мозга мышей, после первого пассажа также имели фибробластоподобную морфологию и способность адгезироваться к пластику при стандартных условиях культивирования. На 6-е сутки наблюдалось характерное для ММСК костного мозга образование колоний.

В течение второй недели культуры клетки обладали фибробластоподобной морфологией, высокой адгезивностью, клоногенностью, способностью многократно пролиферировать в культуре (рис. 2 - А, Б).

Рисунок 2. Монослой ММСК костного мышей II пассаж: А - количество и размер колоний на 6-е сутки культивирования; Б- ММСК на 21-й день культивирования клеток костного мозга; В- иммунонитохимнческая детекция поверхностного маркёра ММСК (СОЮ5).

Митотическая активность ММСК сохранялась до 6 пассажей, затем постепенно снижалась, и клеточный рост практически останавливался. Старые

клетки не были подвержены дифференцировке при помещении их в дифференцировочную среду.

Осуществляя визуальный контроль с учетом морфологических признаков клеток с низкой митотической активностью, для хондрогенной дифференцировки использовали митотически активные клетки с высоким уровнем пролиферации и метаболизма.

■Анализ экспрессии поверхностных маркеров полученной популяции

ММСК костного мозга Первичные клеточные культуры, полученные из костного мозга баранов и мышей, были отрицательными по экспрессии поверхностных белков-маркеров гемопоэтических стволовых и эндотелиальных клеток: CD34, CD45, OLA DQ, OLA DR. Установлена высокая экспрессия молекул клеточной адгезии: CD44, CD105 (табл. 1), играющих важную роль в процессе миграции и хоуминга, что характерно для клеток ММСК.

Таблица 1. Экспрессии поверхностных маркеров ММСК КМ

CD CD 31 CD 44 CD 45 CD 105 OLADQ OLADR

%ММСК 1 ±0,5 95,6 ± 1,0 1,1 ±0,1 87,8 ± 0,5 1,1 ±0,2 1,25 ± 0,5

Таким образом, было показано, что кариотип первичных клеточных культур, полученных из костного мозга является мезенхимального происхождения. Высокий уровень экспрессии белков, характерных для МСК, и отсутствие белков, характерных для дифференцированных клеток, делает их терапевтически значимыми при подборе трансплантируемого клеточного материала.

Дифференцировка ММСК костного мозга

Полученные популяции ММСК костного мозга были проверены на способность в условиях in vitro формировать хондроструктуры. Дифференцировку первичных клеточных культур мезенхимального происхождения в хондроциты оценивали в ОТ-ПЦР. Экспрессии генов коллаген

И, аггрекан, коллаген X и ГАФДГ образцов клеток после индукции в хондрогенном направлении подтвердил наличие стойкой экспрессии маркеров, специфичных для хрящевой ткани, начиная с 3 недели хондродифференцировки.

ММСК из костного мозга образовывали оформленные структуры, характеризующиеся наличием значительной массы экстрацеллюлярного матрикса. Анализ экспрессии кол I и II типов в культуре ММСК костного мозга показал, что при длительном культивировании в среде дифференцировки в отсутствие ТСР-р клетки синтезируют и накапливают преимущественно коллаген I типа, что характерно для фиброзного хряща. Длительное культивирование ММСК костного мозга в среде дифференцировки в хондроциты, содержащей ТвР-р, приводило к уменьшению уровня синтеза коллагена I типа и повышению уровня синтеза коллагена II типа и хондроитина, что характерно для гиалинового хряща. Эффективность хондродифференцировки ММСК костного мозга половозрелых баранов составила 80%, мышей — 75%.

Таким образом, полученные результаты показывают, что первичные клеточные культуры ММСК из костного мозга обладают способностью дифференцироваться в хрящевую ткань и являются мультипотентными МСК (ММСК).

Таблица 2. Влияние различных концентраций сыворотки на пролиферации

ММСК мышей

%, сыворотка 5% 10% 15% 20%

Клеточная пролиферация 25 35 105 100

Рост и пролиферация ММСК мышей зависят от присутствия сыворотки в культуральной среде. Для определения лучших концентраций сыворотки тестировали её различные проценты (5, 10, 15, 20%). В концентрации 15%

сыворотки пролиферация клеток была наибольшей (Р<0,05). Между флаконами с 15% и 20% сыворотками разница не была значительной.

Для оценки пролиферации культивируемых клеток был использован метод анализа КОЕ-Ф. В результате из 100 культивированных клеток на квадратный сантиметр были сформированы 70 колоний.

Приготовление фибринового гидрогеля (скаффолд)

Фибриноген был выделен из плазмы крови коров методом цикла замораживания-размораживания. Свежую плазму крови коров впервые замораживали при -20°С в течение 24 ч и затем оттаивали при 4°С в течение 18 часов. Сшитые фибриновые гели создавали путем смешивания равных объемов тромбина и фибриногена.

РасЮг XIII Саг+ |тИготЫп Рас(ог XIПа ГГгапчдЫипЫпамч

фибринового геля

Для создания скаффорлда с ММСК использовали 2x106 дифференцированных клеток, которые суспендировали в гидрогели и быстро осаждали при мягком центрифугировании (300§ в течение 30 с). Затем клетки вместе с гидрогелем инкубировали на орбитальном шейкере с тем, чтобы усилить инфильтрацию клеток в гидрогеле. Микроскопическое исследование проводили после инкубации через 48-72 часа. Эффективность заселения ММСК составляла 60%.

Результаты воспроизведения остеоартроза

Остеоартроз воспроизводили путем внутрисуставного введения 0,1% р-ра трипсина. Клинически через 7-14 суток отмечали хромоту и болезненность при принудительной движении в суставе куда вводили трипсин.

Гистопатологические изменения характеризовались разрушением суставной поверхности надкостницы, изменением структуры хряща, эрозии и фибрилляцию поверхности и снижение протеогликанов хряща.

V Г i *? <v

I *

А

Рисунок 4. Гистопатологические изменения в суставе мышей через 14 дней.

Сравнение здорового суставного хряща (А) с поврежденным (Б).

Окраска гематоксилин-эозин, у в. 100Х.

На рисунке 4 наблюдается формирование хондроцитных кластеров (признак разрушения хондроцитов). В средной зоне часть хондроцитов была гипертрофирована, в них было занято более 50% профиля цитоплазмы крупными скоплениями гранулами.

дни^^кяшкя шпшк*' ■ «1 к - вн т

т§т

\

М

шш шш

Рисунок 5. Гистопатологические изменения в суставе мышей через 28 дней. Сравнение хрящевой поверхности костей Tibia и Femur здорового (А) и поврежденого (Б) суставов. Окраска гематоксилин-эозин, ув. 40 X.

На 28 день после инъекции на хрящевой поверхности обоих костей Tibia и Femur образуются язва и фибрилляции. На рис. 5-Б часть хондроцитов в состоянии гибели и деструкции, наблюдается увеличение клеточных форм с кариолизисом. После 28 дней более глубокие части сустава подверглись разрушению.

Через 7 дней после инъекции в правом запястном суставе у всех овец наблюдались клинические признаки OA — хромота и болезненность в области сустава. Клинико-морфологическими исследованиями установлено, что остеоартроз проявляется в виде изменений в клетках и матриксе сустава, которые приводят к разволокнению, изъязвлению и уменьшению толщины суставного хряща, а также к остеосклерозу с резким утолщением и уплотнением кортикального слоя субхондральной кости, формированию остеофитов и развитию субхондральных кист (рис. 7-А), в то время как в левом запястном суставе никакого изменения не наблюдалось. Рентгенографические исследования подтвердили разрушение сустава.

Таким образом, установлено, что результатом инъекции трипсина в коленный сустав является снижение количества хондроцитов в суставе, изменение гистологической и морфологической структур сустава, которые в конечном итоге вызывают остеоартроз.

Влияние скаффолдов с ММСК на процесс восстановления при OA

С целью лечения OA ввели 0,1 мл гидрогеля с ММСК (2><106 клеток/1 мл) в левый коленный сустав 20 мышам. В то время как правый коленный сустав служил контролем, куда вводили фибриновый гидрогель без клеток. После трансплантации процесс заживления наступал на 20-30 день. Гистологический анализ извлеченных суставов подопытных мышей через 30 дней выявил уменьшение некротических процессов и субхондральных склерозов в суставе (рис. 6-Б).

Кроме того, наблюдалось очищение зоны повреждения от продуктов распада тканей. У правых коленных суставах, которым мы вводили только гидрогель, процесс выздоровления наступал на 45-60 сутки наблюдения, когда

отмечалось отсутствие у мышей клинических признаков ОА — хромоты и болезненности в области сустава.

Рисунок 6. Сравнение гистологических срезов здорового (А) и регенерируемого (Б) суставов через 30 дней после трансплантаций. Окраска гематоксилин-эозин, ув. 40 X.

Рисунок 7. Патологические изменения в суставе, вызванные трипсином: А— на левом - белая стрелка указывает поврежденную область запястного сустава овец; на правом - здоровый сустав; Б-І) образец из группы контроля, 2) после внутрисуставной инъекции 14 дней, 3) после трансплантации.

На рис. 7-Б (2) представлена фоторентгенограмма суставов мышей после индуцирования ОА. Как показано, через 14 дней после инъекций в суставном хряще наблюдалось разрушение десквамация хондроцитов и формирование кластеров. В верхних зонах хряща резко редуцировано количество хондроцитов.

На рис. 7-Б (3) после трасплантации наблюдалось очищение зоны повреждения от продуктов распада тканей.

На основании полученных данных можно сказать, что трансплантация хондроцитов в сустав овец не только ускоряет восстановление нормального

функционирования сустава, но и способствует ускорению регенеративного процесса в поврежденном суставе.

Рентгенографическое исследование сустава у овец через 30 дней после трансплантации показало отсутствие дегенеративных процессов субхонд-рального хряща в суставе.

Через 2 месяца после трансплантаций в субхондральном хряще выявлено утолщение хряща, а также уменьшение межтрабекулярных промежутков.

Таким образом, усовершенствованная методика культивирования и дифференцировки ММСК костного мозга в хондроциты, создание скаффолда с хондроцитами и их внутрисуставная трансплантация при остеоартерозе оказывает выраженный терапевтический эффект и способствует ускорению регенеративного процесса.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован метод получения и культивирования первичной культуры клеток костного мозга мезенхимального происхождения. Среда DMEM-LG с 15% FSB обеспечивает наиболее высокую степень пролиферации первичной культуры клеток.

2. В 1-м пассаже первичной культуры клеток костного мозга по морфологии выявляются два типа клеток — округлые с низкой адгезией к пластику и фибробластоподобные клетки с высокой адгезивной активностью. После многократной смены культуральной среды клеточная культура становится гомогенной, ФБТ-подобной, что характерно для ММСК. Время цитогенерации 38—45 ч.

3. Митогенная активность клеток мезенхимального происхождения in vitro возрастает на протяжении первых V-VI пассажей, после чего постепенно снижается.

4. Кариотип клеток в первичной культуре ММСК костного мозга характеризуется экспрессией поверхностных CD44 (91,85±1,06%), CD105 (87,8±0,5).

5. Уровень индукции к цитодифференцировке в клетки хондрогенной линий in vitro ММСК костного мозга овец и мышей составил 80±0,1% и 75±0,2% соответственно. ОТ-ПЦР выявлена экспрессия основных маркеров хондрогенеза, коллаген II типа и аггрекан, начиная с 3-й недели хондродифференцировки.

6. Фибриновый скаффолд обеспечивает высокую степень иммобилизации ММСК (60%; 2,0x106) с хондрогенной дифференцировкой и не оказывает местно-раздражающее действие при внутрисуставной трансплантации животным с OA.

7. Трипсин в концентрации 0,1% при внутрисуставном введении через 28 суток у животных развивается артроз сустава, проявляющийся хромотой, сужением суставной щели, остеопорозом метафиза бедра, очаговым остеосклерозом субхондральной зоны.

8. Аллогенная внутрисуставная трансплантация скаффолда с хондроцитами обеспечивает регенерацию суставной ткани на 28 день и исчезновение признаков заболевания, полное восстановление на 60-й день наблюдений.

9. Введение скаффолдов с ММСК не вызывает изменений в иммунном статусе животных.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Метод получения и культивирования ММСК костного мозга овец и мышей используется на кафедре иммунологии и хирургии ФГБОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе.

2. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при изучении курса иммунологии студентами факультетов ветеринарной медицины и ветеринарно-биологического ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Рекомендовать метод выделения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга овец и мышей для исследовательских и

экспериментально-практических целей в биомедицине.

2. Рекомендовать отработанные методологические параметры по получению скаффолдов с ММСК костного мозга для разработки методов ускорения процесса регенерации поврежденных тканей у человека и животных.

3. Рекомендовать использование результатов исследований и выводов в учебном процессе высших учебных заведений при изучении дисциплин «Иммунология», «Биотехнология», «Хирургия».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Саттари Фард X. Лечение патологии суставов с использованием мезенхимных стволовых клеток у животных как экспериментальная модель / Саттари Фард X., Девришов Д.А. // Ветеринарная медицина, 2012, № 3-4. - С. 49-51.

2. Саттари Фард X. Экспериментальное воспроизведение остеоартроза у овец / Саттари Фард X., Девришов Д.А. // Ветеринарная медицина, 2012, № 3-4. -С. 60-61.

3. Саттари Фард X. Животные модели остеоартроза / Саттари Фард X., Девришов Д.А. // Ветеринарная медицина, 2012, № 3-4. - С. 78-80.

4. Саттари Фард X. Моделирование остеоартроза коленного сустава у мышей для изучения патогенеза /Саттари Фард X. // Ветеринарная медицина, 2013, № 1-2,- С. 24-26.

5. Саттари Фард X. Инъекционные скаффолды для лечения хрящевой ткани /Саттари Фард X., Бахр Хоссейни А., Девришов Д.А. // Ветеринарная медицина, 2013, № 1-2,- С. 32-34.

6. Девришов Д.А. Применение клеточной терапии для регенерации остеоартроза в эксперименте / Девришов Д.А., Саттари Фард X., Бахр Хоссейни А. // Ветеринарная медицина, 2013, № 1-2.- С. 35-37.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Саттари Фард Ханиех, Москва

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени

К.И.Скрябина»

(ФГБОУ ВПО МГАВМиБ)

На правах рукописи 04201365613 1

Саттари Фард Ханиех Хассан

Получение и доклинические испытания дифференцированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при остеоартрозе у животных

06.02.02 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

член-корреспондент РАСХН, доктор биологических наук, профессор, Девришов Давудай Абдулсемедович

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений...................................................................................4

Введение..........................................................................................6

1 Обзор литературы.........................................................................11

1.1 Ауто-, алло- и ксенотрансплантаты.................................................11

1.2 Тканевая инженерия и скаффолды..................................................12

1.3 Клеточная терапия и стволовые клетки............................................17

1.4 Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (морфология и общие свойства)...............................................................................19

1.4.1 Иммунофенотип ММСК костного мозга........................................21

1.4.2 Иммунологические свойства ММСК костного мозга.........................25

1.4.3 Дифференцированные потенциалы ММСК костного мозга.................31

1.5 Остеоартроз................................................................................34

1.6 Животные модели и методы индуцирования ОА в них.........................35

1.7 Лечение заболевания суставов с помощью клеточной терапии...............42

1.8 Заключение................................................................................44

2 Материалы и методы исследований................................................46

2.1 Материалы исследования...........................................................47

2.1.1 Реактивы................................................................................47

2.1.2 Расходные материалы и оборудование......................................................49

2.2 Методы исследования...................................................................................50

2.2.1 Получение ММСК из костного мозга мышей и их характеристика......50

2.2.2 Получение ММСК из костного мозга овцы и их характеристика..........52

2.2.3 Анализ иммунофенотипа ММСК костного мозга.....................................54

2.2.4 Анализ дифференцированного потенциала ММСК костного мозга (хондрогенная дифференцировка).......................................................................55

2.2.5 Индуцирование ОА путем внутрисуставного введения трипсина в запястный сустав овец..........................................................................................56

2.2.6 Индуцирование ОА путем внутрисуставного введения в коленный сустав мышей.........................................................................................................57

2.2.7 Получение гидрогеля из фибрина и его характеристика в лаборатории...........................................................................................................59

2.2.8 Трансплантация гидрогеля с ММСК в сустав животных.........................61

2.2.9 Изучение влияния трансплантатов на организм животных.....................62

2.2.10 Статистическая обработка данных...........................................................62

3 Результаты исследований...............................................................................63

3.1 Характеристика ММСК костного мозга.......................................................63

3.2 Определение времени цитогенерации популяции ММСК костного мозга.......................................................................................................................66

3.3 Анализ экспрессии поверхностных маркеров полученной популяции

ММСК костного мозга..........................................................................................67

3.4 Дифференцировка ММСК костного мозга...................................................69

3.5 Приготовление гидрогеля (скаффолд) из фибрина в лаборатории............71

3.6 Индуцирование остеоартроза путем внутрисуставного введения трипсина у мышей..................................................................................................................72

3.7 Индуцирование остеоартроза путем внутрисуставного введения у овец.........................................................................................................................76

3.8 Влияние фибринового гидрогеля с ММСК на организм животных................................................................................................................78

4 Обсуждение.......................................................................................................81

5 Выводы...............................................................................................................96

6 Практическое использование результатов исследований......................98

7 Рекомендации по использованию научных выводов................................99

8 Список использованной литературы.........................................................100

Приложения......................................................................................!.................122

Список сокращений

АТ - антитела

ММСК - мультипотентные мезенхимные стромальные клетки

МСК - мезенхимные стромальные клетки

КМ - костный мозг

ФБС - фосфатно-солевой буфер

ДК - дендритные клетки

ЫК-клетки - клетки-естественные киллеры

СО - кластер дифференцировки

СБ 31 - молекула межклеточной адгезии тромбоцитов и эндотелия-1

СО 44 - трансмембранный рецептор для гиалуроновой кислоты

СБ 45 - общий АГ лейкоцитов

СБ 105 - эндоглин, гомодимерный гликопротеин

ГАФДГ - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

КОЕ-Ф - колониеобразующая единица фибробластов

Кол II - коллаген типа II

Кол X - коллаген типа X

АГГ- аггрекан

БСА - бычий сывороточный альбумин ПНР - полимеразная цепная реакция

ОТ-ПЦР - ПЦР с применением стадии обратной транскрипции

АГГ- аггрекан

ФИО - фактор некроза опухали

ОА - остеоартроз

ГИМ - гемопоэз, индуцирующий микроокружение РТПХ - реакция "трансплантат против хозяина" ТСР]3 - трансформирующий фактор роста бета РВБ - сыворотка плодов коров 1Ь - интерлейкин

BDNF - brain-derived neurotrophic factor

МНС - молекулы главного комплекса гистосоместимости

DMEM-HG - среда Игла в модификации Дульбекко с высоким содержанием

глюкозы

DMEM-LG - среда Игла в модификации Дульбекко с низким содержанием глюкозы

DMSO - диметилсульфоксид

ММР - матриксная металлопротеиназа

MAP- киназ _ митоген-активируемая протеинкиназа

CFC-F - colony-forming unit fibroblast

EGFR - рецептор эндотелиального фактора роста

ICAM - молекула межклеточной адгезии

РЕСАМ - молекула адгезии тромбоцитов (эндотелиальной клетки)

IFNy — интерферон гамма

TNF - фактор некроза опухоли

PDGF - фактор роста тромбоцитов

LFA - лимфоцитарный функционал

ALCAM - молекула адгезии активированных лейкоцитов

Sca-1 - антиген стволовых клеток-1

HLA - человеческий лейкоцитарный антиген

HGF - фактор роста гепатоцитов

PGF-2 - простагландин F-2

IGF-1 - инсулиноподобный фактор роста-1

SSEA - эмбриональный антиген специфичной стадии

ГСК - гемопоэтические стволовые клетки

FGF - фактор роста фибробластов

EGF - фактор рост эндотелия

OLA - система лейкоцитарных антигенов овец

FITC - флуоресцеинизотиоцианат

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Развитие иммунологии и клеточной биологии за последние годы позволяет разработать новые подходы в лечении различных заболеваний и дефектов тканей и органов организма человека и животных. Особую перспективу в биомедицине приобрели методы лечения и замещения крупных повреждений тканей стволовыми клетками, характеризующиеся способностью к высокой пролиферативной активности.

В настоящее время, в ведущих научно-исследовательских институтах различных стран мира изучается множество аспектов проблемы, связанной с исследованием физиологии и особенностей локализации стволовых клеток человека и животных. В научном понимании, стволовые клетки являются особой популяцией не дифференцированных клеток способных к дифферен-цировке в различные виды тканей.

В 60-х годах хх века удалось выделить клетки-предшественники костной ткани, обладающие способностью самообновления и дифферен-цировки в хондрогенные, остеогенные и адипогенные типы клеток. При этом исходным материалом служили клетки костного мозга мыши (Фриденштейн А.Я. и др., 1968). В настоящее время ведутся успешные попытки использования данного типа клеток для получения всех перечисленных типов тканей с использованием биодеградируемых носителей.

Потенции к регенерации тканей мезенхимного происхождения и доступность ММСК позволили ученым рассматривать этот материал как наиболее перспективным в регенерационной и заместительной терапии, что является актуальной задачей в клеточной терапии.

В течение последних десятилетий активно разрабатываются методы клеточной терапии, в частности трансплантации стволовых клеток, в том числе мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, с целью замещения в организме поврежденных клеток и тканевых структур. Это было вызвано

расширением знаний в относительно молодом разделе клеточной биологии -биологии стволовых клеток.

Остеоартроз является гетерогенной группой заболеваний суставов различной этиологии со сходными биологическими, морфологическими и клиническими признаками. ОА характеризуется дегенерацией суставного хряща и структурными изменениями субхондральной кости, а также явно или скрыто протекающим умеренно выраженным синовитом. ОА одно из распространенных заболеваний у людей старше 45 лет, проживающих в северных регионах, и у человека и животных, подвергающихся физическим нагрузкам опорно-двигательного аппарата на фоне нарушений обмена веществ.

Важной составляющей тканевой инженерии является матрикс, с помощью которого осуществляется доставка клеток в область дефекта и их пролиферация в месте патологического поражения. В качестве матрикса для мягких тканей использутся гидрогели различного происхождения, характеризующиеся инъектабельностыо и высокой эффективностью загрузки ММСК.

Цели и задачи исследований. Целью исследований является создание скаффолда с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК) на основе фибринового гидрогеля, изучение его влияния при внутрисуставном введении животным и оценка терапевтического эффекта при остеоартрозе (ОА).

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получение и оптимизация среды культивирования клеток мезенхи-мального происхождения костного мозга (КМ) овец и мышей.

2. Определение морфологических характеристик, митогенной активности и фенотипа мультипотентных мезенхимальных стромальных

клеток костного мозга клеточных культур и длительности пассирования in vitro.

3. Цитодифференцировки ММСК КМ в клетки хондрогенной линий in

vitro.

4. Усовершенствование метода получения гидрогеля in vitro для создания скаффолдов с ММСК и их внутрисуставной трансплантации при OA.

5. Экспериментальное воспроизведение OA у лабораторных и продуктивных животных.

6. Изучение терапевтической эффективности скаффолдов с дифференцированными ММСК костного мозга при OA запястного и коленного суставов у животных.

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ методов выделения ММСК из костного мозга овцы и мыши, охарактеризованы морфологические и иммунобиологические свойства мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), установлена оптимальная концентрация FBS при направленной пролифераций ММСК костного мозга в хондроциты и разработан способ получения фибринового гидрогеля для создания скаффолдов с ММСК.

Впервые разработан метод индуцирования остеоартроза запястного и коленного суставов овец и мышей путем внутрисуставного введения трипсина и способ лечения OA с использованием скаффолдов с ММСК.

Практическая значимость работы. Разработанный метод получения гидрогеля из фибрина плазмы крови для трансплантации ММСК представляет практический интерес для биомедицины, биотехнологии и ветеринарии, поскольку позволяет получить эффективный натуральный носитель (скаффолд) хрящевой ткани при относительно низкой стоимости его приготовления.

Метод выделения и наращивания ММСК мышей применяется на кафедре иммунологии, а способ трансплантации гидрогеля используется на кафедре хирургии ФГБОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе и в учебном процессе.

Личный вклад аспирантки. Автором непосредственно выполнены исследования по получению и культивированию ММСК костного мозга, создании скаффолдов для проведения экспериментальных испытаний при ОА у животных. Проведен анализ, сделаны выводы и даны рекомендации по дальнейшему применению разработанной технологии в биомедицине. В работе использованы материалы, полученные в соавторстве с заведующим кафедрой иммунологии член-корр. РАСХН Девришовым Д.А.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы обсуждались на заседаниях кафедры иммунологии и ученого совета ФГБОУ ВПО МГАВМиБ [Москва, 2010-2013].

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практического использования полученных научных результатов, рекомендаций по использованию научных выводов, списка использованной литературы (198 источников, из которых 23 отечественных и 175 иностранных). Материал изложен на 124 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 23 рисунка и 2 страницы приложений.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Метод выделения ММСК костного мозга овец и мышей и их культурально-морфологическая характеристика и фенотип.

2. Индуцирование остеоартроза в коленных и запястных суставах лабораторных животных путем внутрисуставного введения трипсина.

3. Метод приготовления фибринового гидрогеля и иммобилизация скаффолдов ММСК КМ.

4. Доклинические испытания скаффолдов ММСК при ОА овец и мышей.

1 Обзор литературы 1.1 Ауто-, алло- и ксенотрансплантаты

На сегодняшний день уровень науки и техники позволяет предложить несколько альтернативных путей восстановления или замены поврежденных патологией тканей и органов, в том числе трансплантацию. Каждый из потенциально возможных вариантов имеет как позитивные, так и негативные моменты.

Трансплантаты, которые можно использовать для помещения в организм (трансплантации), могут быть представлены живыми тканями, клетками, органами. Аутотрансплантация - это пересадка биологического материала внутри одного организма. Аллотрансплантация (или гомотрансплантация) - это пересадка клеток, органа или ткани от одного организма (донора) другому организму (реципиенту). Пересадка биологического материала человеку от животных (другого биологического вида) - это ксенотрансплантация.

Использование аутогенных трансплантатов (аутотрансплантатов) -биологического материала, взятого из организма пациента и предназначенного для имплантирования ему же, принято считать «золотым стандартом». Несмотря на очевидные преимущества, аутотрансплантаты обладают рядом недостатков. Нельзя не отметить, однако, что количество «собственного» материала для пересадки ограничено, и его получение связано с необходимостью хирургического вмешательства.

Количество аллотрансплантатов (или гомотрансплантатов), то есть биологического материала, взятого от другого человека, также лимитировано из-за ограниченной доступности, высокой стоимости и необходимости приема иммуносупрессоров в течение всей жизни пациента.

Ксенотрансплантаты (биологический материал, взятый от других видов) требуют генетических или химических модификаций для исключения иммунного отторжения.Органы и клетки животных (свиней, крупного рогатого скота и других млекопитающих) могут рассматриваться в качестве донорских органов и источников терапевтических клеток. Эта концепция получила название ксенотрансплантации. Главным препятствием на пути проведения ксенотрансплантаций является защитная реакция иммунной системы - гипер острое отторжение. Наиболее перспективным подходом к преодолению такого типа отторжения являются различные варианты генетической модификации.

В настоящее время широкое применение нашли синтетические скаффолды для восстановления ткани. Они сочетают в себе все положительные свойства натуральных скаффолдов, но при этом обладают рядом преимуществ. Так, например, в отличие от аутологичных трансплантатов они могут быть получены в необходимом количестве и изготовлены определенного размера и формы, которые требуются в каждом конкретном случае. При использовании трансплантатов из синтетических материалов отсутствует риск передачи болезней и инфекций, как, например, в случае аллогенных и ксеногенных материалов. Кроме того, изменяя некоторые параметры синтетических скаффолдов, можно контролировать не только их механические характеристики, но и скорость резорбции. Данное свойство является важным условием эффективного заживления дефекта.

1.2 Тканевая инженерия и скаффолды

Тканевая инженерия развилась с целью более эффективного восстановления поврежденных органов и тканей. Суть тканевой инженерии в данном случае заключается в созданий скаффолдов, которые и�