Роль кислорода в межклеточном взаимодействии гемопоэтических стволовых и мезенхимальных стромальных клеток in vitro

Маслова, Елена Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль кислорода в межклеточном взаимодействии гемопоэтических стволовых и мезенхимальных стромальных клеток in vitro
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль кислорода в межклеточном взаимодействии гемопоэтических стволовых и мезенхимальных стромальных клеток in vitro"

Па правах рукописи

МАСЛОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

РОЛЬ КИСЛОРОДА В МЕЖКЛЕТОЧНОМ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ И МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК IN VITRO

03.03.01 - физиология 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г е ноя т

Москва-2013

005540035

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государсгвенном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Романов Юрий Аскольдович

кандидат биологических наук Андреева Елена Ромуальдовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией клеточной иммунопатологии и биотехнологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН

доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией протеомики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико биологических проблем Российской академии наук

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится « » 2013 г. в 10 часов на заседании

диссертационного совета Д 002.111.01, созданного на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации -Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе д.7ба.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации -Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу (123007, г. Москва, Хорошевское шоссе д.76а).

Автореферат разослан « ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Болтовская Марина Ннколаевиа

Ларина Ирина Михайловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Идея ниши, как специфического микроокружения, модулирующего поведение стволовых клеток, была предложена Шофилдом в 1978 году, что дало начало бурно развивающейся сегодня области исследования - ниш стволовых клеток (Schofield et al., 1978). Судьбу гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) определяет кроветворная ниша, расположенная в костном мозге. Клеточные и неклеточные компоненты микроокружения поддерживают состояние покоя, деления, самообновления или дифференцировки ГСК. Известно, что в костном мозге более примитивные гемопоэтические клетки находятся при 12% кислорода в окружении остеобластов и клеток стромы, в то время как более зрелые предшественники расположены в сосудистой нише, где уровень кислорода выше (Parmar et al., 2007). Показано, что в условиях in vitro содержание кислорода может влиять на гемопоэтические клетки, оказывая существенный эффект на предшественников одного уровня иерархии и оставаясь индифферентным для других (Cipolleschi et al., 1993).

Известно, что свойства стромальных клеток - основного клеточного компонента костномозговой ниши, также зависят от уровня кислорода. В опытах in vitro показано, что при гипоксии увеличивается их пролиферативная активность и число КОЕ-Ф, замедляется дифференцировка в остео- и адипогенном направлении, а в хондрогенном усиливается (Буравкова и др., 2009; Grayson et al., 2007; Fehrer et al., 2007; Nekanti et al., 2010). К сожалению, влиянию концентрации кислорода на взаимодействие гемопоэтических и стромальных клеток до сих пор уделяется недостаточно внимания. В нашей лаборатории впервые было показано, что при совместном культивировании мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и ГСК происходит увеличение продукции медаторов, опосредующих взаимодействие гемопоэтичеких и стромальных клеток (Жамбапова и др., 2009). В более поздних работах других авторов продемонстрировано, что, в отличие от стандартных условий культивирования, низкие концентрации кислорода способствуют поддержанию ранних гемопоэтических клеток, находящихся в состоянии покоя (Hammoud et al., 2011; Jing et al., 2012).

коммитированных и малодифференцированных предшественников, обеспечивающих длительное восстановление кроветворения (Петрова и др., 2006; Moore et al., 1997; Punzel et al., 2003; McNiece et al., 2004; Freund et al., 2006; Hofmeister et al., 2007; Wagner et al., 2007). MMCK из жировой ткани человека (жтММСК), также как и ММСК из костного мозга могут поддерживать гемопоэз in vitro (Corre et а!., 2006). Однако, несмотря на близкое родство, ММСК из жировой ткани с меньшей эффективностью, чем ММСК из других источников способствуют пролиферации примитивных гемопоэтических предшественников (Wagner et al., 2007). Аналогичные результаты получены и в других работах, где показано, что при сокультивировании ГСК и ММСК из жировой ткани образуется меньшее количество CD34+ клеток, чем при сокультивировании с костномозговыми ММСК (Kirloy et al., 2007; de Toni et al., 2011). С другой стороны, ММСК из жировой ткани способствуют дифференцировке ГСК и более эффективно поддерживают дифференцированные гемопоэтические предшественники (Nakao et al., 2010).

Как альтернативу гемопоэтическим клеткам костного мозга все чаше используют мононуклеары пуповинной крови (пкМНК) (Maniani et al., 1998). Несмотря на то, что это перспективный и легкодоступный источник ГСК, существенным недостатком применения является ограниченное количество стволовых клеток. С целью обогащения ранними гемопоэтическими предшественниками используют различные варианты культивирования клеток пуповинной крови (Bridell et al., 1997, Mayani et al., 1998, McNiece et al., 2004). Основное внимание исследователей при этом сосредоточено на подборе компонентов ростовых сред и методов изоляции малодифференцированных клеток. Между тем, в большинстве существующих моделей культивирования ГСК из пуповинной крови остается недооцененной роль локального микроокружения: взаимодействия со стромальными элементами, паракринной регуляции и концентрации кислорода.

Несмотря на проведение большого количества исследований, направленных на изучение межклеточных взаимодействий в тканевой нише гемопоэтических клеток, конкретные пути реализации влияния ниши на стволовые клетки до сих пор остаются нераскрытыми. Изучение особенностей взаимодействия гемопоэтических и стромапьных клеток в условиях тканевых концентраций кислорода позволит расширить представления о влиянии факторов микроокружения на регуляцию гемопоэза, а также может использоваться в дальнейшем при разработке методик обогащения стволовыми и прогениторными клетками трансплантатов кроветворной ткани.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось сравнительное изучение особенностей межклеточного взаимодействия мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и гемопоэтических стволовых клеток в условиях различного содержания кислорода.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:

1) разработать экспериментальную модель для получения адгезирующих малодифференцированных предшественников пкМНК с использованием жтММСК;

2) оценить влияние сокультивирования с жтММСК при различном содержании кислорода на адгезирующую и суспензионную фракции пкМНК;

3) охарактеризовать функциональные и фенотипические особенности гемопоэтических клеток, образующихся из адгезирующей к жтММСК фракции пкМНК;

4) оценить влияние сокультивирования с жтММСК и различных концентраций кислорода на продукцию паракринных медиаторов пкМНК и полученными из них малодифференцированными гемопоэтическими предшественниками.

Научная новизна

Разработана и апробирована модель совместного культивирования жтММСК и пкМНК, в которой способность адгезирующей фракции пкМНК к экспансии оценивается при культивировании в отсутствие суспензионной фракции.

Впервые показано, что жтММСК в диапазоне концентраций кислорода 1-5-20% в среде при совместном культивировании могут эффективно поддерживать жизнеспособность пкМНК, в том числе малодифференцированных предшественников.

Впервые показано, что адгезирующая к жтММСК фракция пкМНК способна генерировать популяцию клеток, обогащенную гемопоэтическими предшественниками разной степени коммитированности.

Установлено, что в условиях пониженного содержания кислорода из пкМНК образуется большее количество гемопоэтических колоний, а также изменяется соотношение колониеобразующих единиц (КОЕ): увеличивается доля унипотентных (КОЕ-Г и КОЕ-М) и уменьшается доля мульти- и бипотентных (КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ). После кратковременного сокультивирования пкМНК с жтММСК этот эффект более выражен.

Получены новые данные, свидетельствующие о том, что при сокультивировании пкМНК и жтММСК происходит изменение профиля продуцируемых хемокинов 1Ь-8, М1Р-1р

и МСР-1, опосредующих взаимодействие клеток. Показано, что степень этого изменения может зависеть от уровня кислорода в среде культивирования.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты вносят значительный вклад в существующие представления о влиянии факторов микроокружения на гемопоэтические клетки. Было показано, что жтММСК эффективно поддерживают экспансию гемопоэтических предшественников из пкМНК различной степени коммитированности в пределах 1-20% кислорода. При тканевых концентрациях кислорода среди пкМНК выявлялось больше КОЕ и изменялся их субпопуляционный состав, что приводило к увеличению доли унипотентных (КОЕ-Г и КОЕМ) и уменьшению доли мульти- и бипотентных (КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ).

Впервые для исследования роли кислорода во взаимодействии гемопоэтических и стромальных клеток был использован методический подход, основанный на сокультивировании пкМНК и жтММСК. Проведенное исследование позволило продемонстрировать, что использование жтММСК в качестве стромального подслоя и варьирование содержания кислорода в среде культивирования пкМНК могут быть использованы как факторы, модулирующие свойства гемопоэтических клеток, получаемых при экспансии. Заявка на патент №2013112801 от 22.03.2013 «Способ экспансии мононуклеарных клеток пуповинной крови (пкМНК) ex vivo в присутствии мультипотентных стромальных мезенхимальных клеток (ММСК)».

Положения, выносимые на защиту

1. Разработан методический подход, в котором адгезировавшие к жтММСК пкМНК в отсутствие суспензионной фракции способны генерировать популяцию предшественников разной степени коммитированности.

2. При пониженном содержании кислорода (1% и 5%) в сокультуре пкМНК и жтММСК увеличивается общее количество КОЕ и изменяется их субпопуляционный состав, приводя к увеличению доли унипотентных (КОЕ-Г и КОЕ-М) и уменьшению доли мульти- и бипотентных (КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ).

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на III съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012), the 7th Fraunhofer Life Science Symposium (Germany, Leipzig, 2012), XI и XII Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики (Москва, 2012, 2013), XXII Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013), XIV Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине с международным участием, посвящйнной 50-летию создания ИМБП (Москва, 2013).

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах из перечня ВАК РФ, 1 статья в сборнике «Стволовые клетки и регенеративная медицина», 7 тезисов докладов.

Диссертация апробирована на заседании секции «Космическая физиология и биология» Ученого совета Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук» 16.10.2013 г.

Связь работы с научными программами Работа выполнена при поддержке программ ОБН РАН и РФФИ №10-04-01158-а, 13-0400791.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследований», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 126 страницах, содержит 29 рисунков и 10 таблиц. Список литературы состоит из 202 цитируемых источников, из которых 18 - на русском и 184 - на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Мезенхимальные клетки (жтММСК) выделяли из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека по стандартной методике (Zuk Р. et al. 2001) с нашими модификациями (Буравкова J1. Б. и др., 2009) и культивировали в среде а-МЕМ (Gibco, США), с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, HyClone, США) и 1%

пенициллина/стрептомицина (ОШсо, США) в условиях 5% С02, 37°С, 100% влажности при 1%, 5% и 20% кислорода. Для экспериментов использовали клетки 3-4 пассажей. Перед проведением эксперимента клетки инкубировали ночь в присутствии митомицина С (1.5 мкг/мл, Sigma-Aldпch, США) с целью остановки деления, а затем проводили пересев с плотностью, позволяющей получить 70-80% монослой.

Криоконсервированные образцы мононуклеаров пуповинной крови (пкМНК) были предоставлены Банком стволовых клеток «КриоЦентр» (Москва). В день эксперимента клетки размораживали на водяной бане при +37 °С и отмывали от криопротектора в избытке среды культивирования ЯРМ1 1640 (ХЛЬсо, США), содержащей 2 мМ Ь-глутамина (ПанЭко, Россия), 10% ЭТС и 1% пенициллина/стрептомицина (ИЬсо, США). После оценки жизнеспособности в тесте с трипановым синим концентрацию клеток доводили до 1.5-2.5х10б клеток/мл и использовали в течение 30 минут.

Исх. пкМНК

жтММСК Одень

Удаление неадгезированных клеток

Образование суспензии клеток

щр

Культура 2 7 день

Рис. 1. Схема эксперимента.

Суспензию пкМНК добавляли к жтММСК в концентрации 1.5—2.5х106 клеток/мл и культивировали совместно в условиях 1%, 5% и 20% кислорода (37°С, 5% СОг, влажная атмосфера) в течение 72 часов. После этого суспензию клеток отбирали, а адгезировавшую фракцию культивировали в течение 96 часов. За это время происходило образование суспензии клеток. Сокультура полной популяции пкМНК и жтММСК была обозначена как культура 1, адгезирующая фракция пкМНК и вновь образованная популяция клеток -культура 2. Схема эксперимента представлена на рис. 1. В культурах 1 и 2 был проведен сравнительный анализ влияния 1%, 5% и 20% Ог на ряд параметров, определяющих фенотипические и функциональные особенности гемопоэтических предшественники.

Жизнеспособность и количество адгезированных клеток определяли с помощью одновременного окрашивания флуоресцеин-диацетатом (Sigma, США) и пропидий-йодидом

(Invitrogen, США). Живые клетки выявляли по наличию свечения флуоресцеина, а мертвые -по окрашиванию пропидий-йодидом. Анализировали не менее 5 рандомически выбранных полей зрения площадью 0,6 мм2. Анализ изображений проводили в программах NIS-elements (Япония) и Sigma Scan (США).

Мазки или стекла с клетками фиксировали ледяным метанолом в течение 5 минут и окрашивали по Гимзе в соответствии с инструкцией производителя. После окрашивания и высушивания стекла заключали в среду Poly-Mount (Polysciences, Inc., США). Дня идентификации гемопоэтических клеток использовали гематологический атлас (Абрамов М.В., 1985). Препараты анализировали на микроскопе Nikon Eclipse TiU (Nikon, Япония).

Субпопуляционный состав, активацию и жизнеспособность пкМНК до и после сокультивирования с жтММСК определяли с помощью проточной цитометрии на приборе EPICS XL (Beckman Coulter, США). В работе использовали ФИТЦ-, фикоэритрин- и РегСР-конъюгированные антитела к CD45, CD34, CD133, CD90, CD105, CD3, CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD19, CD3/CD( 16+56), CD3/CD25, CD3/HLA-DR, CD3/CD69 (BD Pharmingen, США; Miltenyi Biotec, Германия) и набор AnnexinV-FITC/PI (Immunotec, Франция) в концентрации, рекомендованной изготовителем.

Наличие колониеобразующих единиц (КОЕ) оценивали по образованию колоний в полужидкой среде MethoCult Н4034 Optimum (STEMCELL Technologies, Канада), содержащей коктейль цитокинов и факторов роста. Суспензию клеток вносили в среду согласно инструкции производителя, число и состав колоний оценивали на 14 сутки.

Наличие клеток, образующих области «булыжника» (КООБ), регистрировали по появлению в культуре областей «булыжной мостовой», которые обнаруживались с помощью фазово-контрастной микроскопии и визуально представляли плотные скопления клеток, располагающиеся под слоем ММСК.

Содержание хемокинов в среде культивирования оценивали на приборе FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с использованим набора FlowCytomix human 6-plex (Bender Medsystems, Австрия), который позволяет выявлять в образцах содержание 6 хемокинов (IL-8, MIP-lß, МСР-1, MlP-la, G-CSF и МЮ) одновременно.

Статистический анализ проводили с использованием критерия Манна-Уитни в программах «Microsoft Excel 2000» и «Statistica 7.0». Различия считали достоверными при р<0.05.

Результаты исследования и их обсуждение Анализ исходной популяции пкМНК

В данной работе была использована криоконсервированная популяция пкМНК, не подвергшаяся селекции. В исходной популяции пкМНК ГСК с фенотипом С045+/С034+ обладали высокой жизнеспособностью, однако их количество составляло менее 0,5%. Согласно как полученным нами, так и литературным данным (с1е \Vynter е1 а1., 1998), большая часть гемопоэтических клеток популяции пкМНК представлена поздними предшественниками с фенотипом С034+С0133\ в меньшей степени средними -СЭ34+С0133+ и совсем небольшой долей ранних - С034"С0133+. Результаты анализа субпопуляционного состава и жизнеспособности исходной популяции пкМНК представлены в табл. 1.

Таблица 1. Характеристика пкМНК после выделения и криогенного хранения (n=10, М±т)

Популяция Доля, % Жизнеспособность, %

После выделения После размораживания

лимфоциты 27.6+5.2 99.8+0.4 98.2+1.3

моноциты 9.1+0.5 99.8+0.1 98.5+1.2

гранулоциты 44.2+5.3 98.9+1.1 80.1+8.5

ГСК (С045+/С034+) 0.48+0.21 99.8+0.2 97.1+1.8

в том числе (% от всех ГСЮ:

поздние (С045+/СЭ34 /С0133") 80.7+4.5 - -

средние (С0457С0347С0133;) 14.3+3.8 - -

ранние (С045+/С034"/С0133+) 3.8+2.3 - -

Морфологический анализ показал присутствие в исходной популяции пкМНК гемопоэтических предшественников, способных к делению: промиелоцитов, миелоцитов, базофильных и полихроматофильных эритробластов, а также зрелых форменных элементов (рис. 2). Помимо этого выявлялись незрелые формы клеток: оксифильные эритробласты, метамиелоциты и палочкоядерные гранулоциты, а также клетки, относящиеся к лимфоидному и моноцитарному росткам, степень зрелости которых невозможно установить с помощью световой микроскопии (рис. 2).

• А $ "Г] _ • т

»f д # | и Ф пп

Рис. 2. Мононуклеары пуповинной крови. А -базофильный эритробласт; Б - полихроматофильный эритробласт; В

оксифильный эритробласт; Г - моноцит; Д - нейтрофильный промиелоцит; Е -нейтрофильный миелоцит; Ж - палочкоядерные гранулоциты; 3

базофильный гранулоцит (Окрашивание по Гимзе, масштабный отрезок 1 мкм).

Монокультура пкМНК

Прикрепившиеся к поверхности культуральной чашки мононуклеары

морфологически были сходны с клетками моноцитарного ряда и на более поздних сроках

культивирования - с макрофагами (рис. 3). В монокультуре пкМНК без стромального

подслоя жизнеспособность и пролиферация гемопоэтических клеток не поддерживались, что

свидетельствует о недостатке поддерживающего влияния клеток микроокружения.

Рис. 3. Мононуклеары пуповинной крови. А - 11 суток культивирования

(стрелкой отмечена

метафазная пластинка); Б - иммуноцитохимическое выявление ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) (черные стрелки указывают на окрашенные ядра, красные - на неокрашенные ядра); В, Г - выявление маркеров моноцитов/макрофагов CD 14 и CD9, соответственно (А -окрашивание по Гимзе, масштабный отрезок 50 мкм).

Взаимодействие пкМНК с жтММСК при концентрациях кислорода, близких к

тканевым

Модель совместного культивирования гемопоэтических и стромальных клеток была предложена еще в 1977 году в работах Декстера и соавторов (Dexter et al., 1977). Было

•л* '¿I' ■:■• fb*чГ» * * * * • * . Л 1

вИрЩИИИИЯДщ Г^Н^ЦЯНКЕЯ

показано, что в совместных культурах гемопоэтических и стромальных клеток часть клеток прикрепляется к подложке, а часть - находятся в суспензии. Позднее две независимые группы исследователей продемонстрировали, что гемопоэтические клетки адгезирующей фракции являются наиболее пролиферативно активными (Wagner et al., 2007; Jing et al., 2010). Мы использовали этот факт в данной работе, для того чтобы оценить влияние кислорода на адгезировавшие к жтММСК пролиферативно активные пкМНК.

После 72 часов сокультивирования в условиях различного содержания кислорода часть пкМНК адгезировала к жтММСК, а часть оставалась в суспензии над ними (рис. 4).

Рис. 4. Количество клеток суспензионной и адгезируюшей фракций пкМНК в культуре 1 (М±т, п=4).

В суспензионной и адгезирующей фракциях клетки обладали высокой жизнеспособностью, среди адгезированных пкМНК были преимущественно предшественники гранулоцитов, а также клетки, относящиеся к моноцитарному, лимфоидному и эритроидному росткам (рис. 5). В суспензионной фракции клеток состав был аналогичен.

Рис. 5. пкМНК, адгезирующие к ММСК, в культуре 1 (окрашивание по Гимзе, масштабный отрезок 50 мкм).

Популяционный состав лимфоцитов среди неадгезирующих пкМНК после 72 часов сокультивирования с жтММСК изменился за счет двукратного уменьшения доли В- и ЕК-клеток (рис. 6). Среди Т-клеток значительно уменьшилась доля Т-ЕК-клеток (рис. 6). При оценке экспрессии молекул, характеризующих активацию Т-клеток (CD69, CD25 и HLA-DR) оказалось, что доля CD69+ и CD25" уменьшалась, a HLA-DR+ - не изменилась (рис. 6), что свидетельствует об отсутствии активации зрелых иммуноцитов при взаимодействии с аллогенными жтММСК.

Популяцнонный состав лимфоцитов пуповинной крови

Субпопуляции Т-клеток пуповинной крови

Г*1 1 ■

J 1 В ^ j ^ * * г

Экспрессия маркеров активации Т-клетками пуповинной крови

Т-хелперы цитотоксические Т- Т-ЕК-клепси

Рис. 6. Иммунофенотип пкМНК: белые столбцы - исходные пкМНК; серые столбцы - культура 1 при 5% СЬ; черные столбцы -культура 1 при 20% Сь (М ± т, п=5, * -достоверное отличие от значения исх. пкМНК, р<0,05).

СОЗ+/ЩА4Ж+ (ЮЗ+/СШ5+ ст+сгйу.

Для функциональной характеристики пкМНК был использован тест на способность образовывать колонии в полужидкой среде Ме&оСиИ Н4034. Клетки культивировали в полужидкой среде, используя концентрацию кислорода, при которой проводили сокультивирование с жтММСК. При той же концентрации кислорода определяли число КОЕ среди исходных пкМНК.

Исходные пкМНК, культивируемые в полужидкой среде при 1% и 5% кислорода образовывали большее количество колоний, чем при 20% Оз. После сокультивирования этот эффект сохранялся, но был менее выражен (рис. 7).

Культура I

20% 02; М±т, п=3-7,

[% 5% 20%

■ достоверное отличие от 20% Оз,р<0,05).

Рис. 7. Выявление КОЕ среди пкМНК при различном содержании кислорода (Данные представлены как кратность отличий от значения при

В зависимости от концентрации кислорода изменялось соотношение КОЕ различных кроветворных ростков: увеличивалось содержание более коммитированных предшественников - КОЕ-Г и КОЕ-М, а мульти- и бипотентных - КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ -уменьшалось (табл. 2). После сокультивирования пкМНК с жтММСК этот эффект был более выражен (табл. 2).

Таблица 2. Количество гемопоэтических колоний различного типа среди исходных пкМНК и

суспензии клеток культуры 1 при различном содержании кислорода

% от общего 1% 02 5% 02 20% Oi

Исходные пкМНК

КОЕ-ГЭММ 1,2±0,6 2,1±0,7 4,1±1,5

КОЕ-Г 16,6±6,1 18,7±4,5 18,3±2,7

КОЕ-М |20,1±4,2* 7,5±1,8 8,3±2,9

КОЕ-ГМ 4,6±1,7 5,1 ±0,7 8,0±2,0

БОЕ-Э 57,5±5,6 66,7±4,8 61,4±2,8

Культура 1

КОЕ-ГЭММ 1,0±1,0 2,9±0,6 2,4±0,8

КОЕ-Г 30,0±9,5 |24,9±5,0* 11,6±3,2

КОЕ-М Т17,5±2,4* 9,1±2,4 6,5±2,1

КОЕ-ГМ |2,3±0,7* J.3,4±l,0* 7,0±1,2

БОЕ-Э 49,2±10,4 59,7±7,5 72,5±4,3

* - достоверное отличие от значения при 20% 02, р<0,05, М ± т, п=3-7.

Доля БОЕ-Э достоверно не отличалась, однако, было отмечено, что при понижении

содержания кислорода размер клона в поликлональных колониях уменьшался (рис. 8).

Рис. 8. Колонии бурстобразующих единиц пкМНК в зависимости от концентрации кислорода.

Таким образом, после сокультивирования пкМНК с жтММСК при пониженной концентрации кислорода было выявлено большее количество КОЕ и наблюдалось изменение содержания колоний различных гемопоэтических ростков, по сравнению с сокультурой при 20% кислорода. Наличие этого эффекта, возможно, объясняется уменьшением

окислительного повреждения и увеличением восприимчивости к ростовым факторам, таким как Еро и M-CSF, при низких значениях концентрации кислорода (Noll et al., 2002).

Паракринная регуляция представляет собой один из основных механизмов, определяющих развитие клеток крови. Гемопоэтические клетки в костном мозге постоянно подвергаются действию стимулирующих или подавляющих их активность биологически активных молекул. В исследованиях in vitro показано, что стромальные клетки костного мозга спонтанно или индуцированно продуцируют целый ряд медиаторов, которые участвуют в регуляции гемопоэза (Haynesworth et al., 1996; Majumdar et al., 1998; Majumdar et al., 2000). В кондиционированной среде жтММСК нами были обнаружены 1L-8 и МСР-1. Эти хемокины, но в количестве на порядок большем, а также М1Р-1р продуцировали пкМНК из всех образцов, использованных в работе. Сокультивирование приводило к изменению продукции хемокинов в зависимости от уровня кислорода. Так, в сравнении с монокультурой пкМНК в сокультуре происходило увеличение содержания МСР-1 при 1% и 5% кислорода, уменьшение содержания IL-8 при 1% и 20% кислорода и снижение М1Р-1р при всех вариантах содержания кислорода (рис. 9).

Рис. 9. Концентрация хемокинов в кондиционированной среде монокультур пкМНК и жтММСК и культуры 1 (М±ш, п=3-4, * -достоверное отличие от значения монокультуры пкМНК, р<0,05). Белые столбцы - жтММСК; серые столбцы - пкМНК; черные столбцы -культура 1

Таким образом, совместное культивирование с ММСК влияло на продукцию хемокинов пкМНК, при этом, в большинстве случаев степень этого воздействия определялась содержанием кислорода.

Экспансия гемопоэтических клеток пуповинной крови на подслое из жтММСК в

условия тканевых концентраций кислорода Культура 2 состояла из адгезирующей фракции пкМНК и образованной ими популяции клеток (рис. 10).

Рис. 10. Суспензия клеток культуры 2 (масштабный отрезок 50 мкм).

В культуре 2 было меньше адгезированных пкМНК в сравнении с культурой 1, жизнеспособность уменьшалась незначительно. Морфология клеток и клеточный состав существенно не менялись. Клеток в суспензионной фракции было больше, чем адгезированных пкМНК (рис. 11).

Культура 2

Рис. И. Количество клеток суспензионной и адгезируюшей фракций пкМНК в культуре 2 (М±т, п=4).

Для анализа полученной популяции, в качестве маркеров для выявления малодифференцированных клеток были выбраны: СОЭ4 - наиболее часто используемый маркер в клинической практике для характеристики кроветворных трансплантатов, и СЭ133 — маркер ранних гемопоэтических клеток. Доля СБ34+ клеток суспензионной фракции клеток культуры 2 была в 170-250 раз выше, чем среди исходных пкМНК, при этом наибольший процент этих клеток был при 5% кислорода. Также были обнаружены С0133+ клетки, что свидетельствует о присутствии ранних ГСК (рис. 12).

Гемопоэтическ'ие предшественники

Рис. 12. Иммунофенотипический профиль клеток суспензионной фракции культуры 2 (М±т, п=4).

Полученные данные наглядно подтверждают возможность существенного увеличения доли малодифференцированных гемопоэтических предшественников по сравнению с исходной популяцией пкМНК при выбранном нами способе экспансии.

Пуповинная кровь содержит гетерогенную популяцию гемопоэтических клеток, для оценки свойств которой нельзя использовать только данные иммунофенотипирования, а необходимо проведение тестов, позволяющих выявить функциональный потенциал. В данной работе кроме идентификации ранних предшественников суспезионной фракции культуры 2, также были проведены функциональные тесты по выявлению КОЕ и КООБ, позволяющие обнаружить прогениторные клетки разной степени зрелости, что является важным критерием для оценки эффектов факторов микроокружения на гемопоэтические клетки.

Было показано, что количество КОЕ среди суспензии клеток культуры 2 при тканевых значениях содержания кислорода было больше, чем при 20% (рис. 13).

х 2,0 -

5 '-5 |

0 ш

л 1,0 —I

5 I

1 W В

Я II

£ о,о

Культура 2 *

-—I—

Рис. 13. Количество КОЕ в суспензии пкМНК культуры 2 (Данные представлены как кратность отличий от значения при 20% 02; М±ш, п=3-5, * -достоверное отличие от 20% Ог,р<0,05).

20%

Данные о содержании КОЕ различных гемопоэтических ростков представлены в табл. 3. В условиях 20% Ог доля КОЕ-ГМ в 1,5-2 раза превышала значение, полученное при тканевых концентрациях кислорода. Доля смешанных колоний (КОЕ-ГЕММ) в культуре 2, наоборот, была выше при пониженной концентрации кислорода, однако эти отличия в

субпопуляционном составе колоний в зависимости от концентрации кислорода в среде

культивирования имели характер тенденции и были статистически незначимыми. Таблица 3. Доля КОЕ различных гемопоэтических ростков в суспензии клеток культуры 2 (М±гп, п=3-5)

% от общего 1% о2 5% 02 20% 02

КОЕ-ГЭММ 3,6±1,9 2,1±1,0 1,7±0,7

КОЕ-Г 25,3±3,7 22,1 ±6,0 18,3±4,6

КОЕ-М 11,7±5,4 8,ОН,2 18,6±6,4

КОЕ-ГМ 3,7±1,8 3,4±1,7 6,0±1,4

БОЕ-Э 55,7±9,1 64,3±7,6 55,4±9,0

Клетки адгезирующей фракции культуры 2 содержали на два порядка меньше КОЕ, и колонии, образованные этими клетками, были меньшего размера и плотности (рис. 14).

КОЕ/см2

1800 —---------------------------------

1200 -r~|Jf...................................................

-Ш.....—

Суспензионные Адгезирующие клетки клетки

Рис. 14. Гемопоэтические колонии, образованные клетками адгезирующей фракции пкМНК культуры 2. Белые столбцы - 1% 02; серые столбцы - 5% 02; черные столбцы - 20% 02 (М±ш, п=3-5, * - достоверное отличие от значения при 20% Oj, р<0,05).

В культуре 2 на 7-11 сутки от начала эксперимента вне зависимости от концентрации

кислорода формировались области «булыжной мостовой», что свидетельствовало о наличии КООБ (рис. 15).

щж ¿л-'. .■■■'...

TrfWT'rn

Рис. 15. Области «булыжной мостовой» в культуре 2 (масштабный отрезок 50 мкм).

Выявление этих клеток в гемопоэтических культурах - распространенная методика,

позволяющая оценить содержание активно пролиферирующих ранних гемопоэтических

предшественников in vitro. По пролиферативной активности КООБ, формирующие области «булыжной мостовой» в культуре через 7-11 дней, соответствуют КОЕ-С 12, образующие колонии в селезенке через 12-14 дней после трансплантации облученным мышам (Ploemacher et al., 1989). Интересно, что при пересеве на новую подложку клеток суспензионной фракции культуры 2 эти области можно было обнаружить уже после 3 суток субкультивирования.

Как было отмечено, формирование областей «булыжной мостовой» не зависело от содержания кислорода в среде культивирования. Это наблюдение совпадает с данными, полученными Andrade и соавторами при изучении методом предельных разведений экспансии пкМНК на подслое ММСК из костного мозга (Andrade et al., 2013). Было показано, что количество областей «булыжной мостовой», образованных в условиях 2%, 5%, 10%, 20% Ог, существенно не отличалось. Зависимость количества КОЕ от содержания кислорода в среде культивирования и отсутствие эффекта на КООБ, подтверждают ранее полученные данные о том, что кислород может влиять на гемопоэтические предшественники одного из уровней иерархии, тогда как клетки другого - будут к нему индифферентны (Cipoileschi et al., 1993).

Содержание хемокинов в культуре 2 зависело от концентрации кислорода. При ее понижении происходило уменьшение концентрации хемокинов МСР-1, 1L-8 и увеличение MIP-ip (рис. 16).

МПМЬ МСР-1

250 200

ШЕ

Рис. 16. Концентрация хемокинов в кондиционированной среде культур 1 и 2 в условиях различного содержания кислорода (М±т, п=3-4). Белые столбцы - культура 1; черные столбцы - культура 2.

Несмотря на то, что в культуре 2 количество гемопоэтических клеток было на порядок меньше, чем в культуре 1, уровень продукции хемокинов MIP-ip, МСР-1 и IL-8 был практически таким же, как и в исходной сокультуре (рис. 16), что указывает на высокую паракринную активность клеток культуры 2.

Таким образом, в настоящей работе для исследования роли кислорода в межклеточном взаимодействии гемопоэтических стволовых и мезенхимальных стромапьных клеток in vitro был разработан методический подход, где жтММСК использовались как компонент, соответствующий стромальным клеткам микроокружения костного мозга, а содержание кислорода соответствовало тканевым значениям. ММСК из жировой ткани эффективно поддерживали экспансию гемопоэтических предшественников различной степени коммитированности вне зависимости от содержания кислорода. При тканевых концентрациях кислорода среди пкМНК выявлялось больше КОЕ и изменялся их субпопуляционный состав, приводя к увеличению доли унипотентных (КОЕ-Г и КОЕ-М) и уменьшению доли мульти- и бипотенгных (КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ). Концентрация кислорода определяла продукцию хемокинов пкМНК, а также степень ее изменения при сокультивировании. Важной особенностью явилось то, что в культуре, образованной адгезирующей фракцией пкМНК, клетки имели высокий уровень паракринной активности.

Полученные в настоящей работе данные позволяют значительно расширить представления о влиянии факторов микроокружения на гемопоэтические клетки и могут быть использованными в дальнейших экспериментальных и клинических исследованиях.

ВЫВОДЫ

1. Разработан методический подход на основе использования жтММСК и пкМНК, в котором адгезировавшие гемопоэтические клетки в отсутствие суспензионной фракции способны генерировать популяции предшественников разной степени коммитированности.

2. жтММСК способны поддерживать жизнеспособность пкМНК, в том числе малодифференцированных гемопоэтических предшественников, при различном содержании кислорода (1%, 5% и 20%).

3. Гемопоэтические предшественники, адгезирующие из пкМНК на жтММСК, способны образовывать популяцию, где доля CD34+ клеток в 170-250 раз выше, чем в исходных пкМНК. Наибольший процент этих клеток обнаружен при 5% кислорода.

4. В условиях 1% и 5% кислорода, в сравнении с 20%, среди пкМНК выявляется большее количество гемопоэтических колоний и изменяется соотношение КОЕ различных кроветворных ростков: увеличивается содержание более коммитированных предшественников - КОЕ-Г и КОЕ-М, а мульти- и бипотентных -КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ - уменьшается. После сокультивирования пкМНК с жгММСК этот эффект более выражен.

5. Формирование «областей булыжной мостовой» при сокультивировании пкМНК с жтММСК происходит на 7-11-е сутки, а при субкультивировании гемопоэтических предшественников, образованных адгезирующей фракцией пкМНК, - на 3-й сутки.

6. В монокультуре пкМНК продукция хемокинов МСР-1, М1Р1-Р и П.-8 выше при атмосферной концентрации кислорода. Сокультивирование приводит к еще большему увеличению МСР-1 при 1% и 5% кислорода, снижению 1Ь-8 при 1% и 20% кислорода, а также уменьшению содержания М1Р1-Р при всех исследуемых концентрациях кислорода.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Е.Р.Андреева, И.В. Андрианова, П.И. Бобылева, Л.Б. Буравкова, Е.В. Маслова, Ю.А. Романов. Взаимодействие стромапьных клеток и мононукпеарных клеток человека в условиях измененной газовой среды. Ч. И. Гемопоэз-подцерживающие свойства // Технологии живых систем, 2012, т. 9, №2, стр. 19-24.

2. Маслова Е.В., Андреева Е.Р., Андрианова И.В., Бобылева П.И., Романов Ю.А., Кабаева Н.В., Балашова Е.Е., Ряскина С.С., Дугина Т.Н., Буравкова Л.Б. Обогащение мононуклеаров пуповинной крови гемопоэтическими клетками-предшественниками в совместной культуре с мезенхимальными стромальными клетками жировой ткани человека// Клеточные технологии в биологии и медицине, 2013, №4, стр. 238-243.

3. Бобылева П.И., Андрианова Е.В., Горностаева А.Н., Маслова Е.В., Андреева Е.Р. Взаимодействие ММСК из жировой ткани и мононуклеаров из пуповинной крови при пониженном содержании 02 в среде культивирования // Стволовые клетки и регенеративная медицина: Сб статей/ под ред. В.А. Ткачука. - М.: МАКС Пресс, 2012, стр. 48-61.

4. Е.В.Маслова, Е.Р.Андреева, Ю.А.Романов, Л.Б. Буравкова. Культивирование прогениторных клеток пуповинной крови на стромальном подслое в условиях различного содержания кислорода // Цитология, 2012, т. 54, №9, стр. 692-693.

5. Maslova EV, Bobyleva PI, Andrianova IV, Andreeva ER, Buravkova LB. CFC activity of cord blood hematopoietic cells is modified after expansion on multipotient mesenchymal stromal cells under hypoxia//Abstracts of the 7th Fraunhofer Life Science Symposium, 2930 November, 2012, Leipzig, Germany, P. 71-72.

6. Маслова E.B. Экспансия прогениторных клеток пуповинной крови при различном содержании кислорода в среде культивирования // Сборник тезисов XI конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики. Москва, 2012, стр. 34-35.

7. Маслова Е.В. Обогащение мононуклеаров пуповинной крови недифференцированными гемопоэтическими клетками-предшественниками с использованием мезенхимальных стромальиых клеток из жировой ткани человека при гипоксии // Сборник тезисов XII конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики, Москва, 2013, стр. 34-35.

8. Е.В. Маслова, П.И. Бобылева, Е.Р. Андреева, Л.Б. Буравкова. Влияние физиологических факторов микроокружения на экспансию гемопоэтических клеток in vitro // XXII Съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. Волгоград, 2013, стр. 334-335.

9. Маслова Е.В., Андреева Е.Р., Романов Ю.А., Буравкова Л.Б. Особенности экспансии мононуклеаров пуповинной крови при гипоксии с использованием мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани // Авиационная и космическая медицина, 2013, т. 47, №4, стр. 21-22.

10. Бобылева П.И., Андрианова Е.В., Маслова Е.В., Андреева Е.Р. Буравкова Л.Б. Жизнеспособность и экспрессия молекул адгезии ММСК на ранних этапах взаимодействия с мононуклеарами пуповинной крови in vitro// Авиационная и космическая медицина, 2013, т. 47, № 4, стр. 96-97.

Список используемых сокращений:

CD - cluster of differentiation - кластер дифференцировки G-CSF - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор 1L-8 - интерлейкин 8;

аМЕМ - минимальная среда Игла (альфа модификация) MIG - монокин, индуцированный интерфероном-у М1Р-1а- макрофагальный белок воспаления а MIP-ip - макрофагальный белок воспаления [5 МСР-1 - моношгтарный хемотаксический фактор-1 PCNA - ядерный антиген иролиферирующих клеток БОЕ-Э - бурстобразующая единица эритроцитов ГСК - гемопоэтическне стволовые клетки

жтММСК - мультипотентные мезенхимальные сгромальные клетки, выделенные из стромалыю-васкулярной фракции жировой ткани КОЕ - колониеобразующая единица КОЕ-Г - КОЕ гранулоцитов

КОЕ-ГМ - КОЕ гранулоцитов и моноцитов/макрофатов

КОЕ-ГЭММ - КОЕ гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов/макрофатов и

мегакариоцитов

КОЕ-М - КОЕ моноцитов/макрофатов КООБ - клетка, образующая области «булыжника» пкМИК- моноиуклеары пуповинной крови ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

Подписано в печать: 13.11.2013

Заказ Л'а 9083 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. au toreferat. ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маслова, Елена Викторовна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации -Институт медико-биологических проблем Российской академии наук

На правах рукописи

04201451758

Маслова Елена Викторовна

03.03.01 - Физиология 03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук Романов Юрий Аскольдович, кандидат биологических наук Андреева Елена Ромуальдовна

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 7

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1.1. Понятие ниши стволовых клеток 11

1.2. Факторы микроокружения в нише гемопоэтических стволовых клеток 11

1.2.1. Клеточные факторы 12

1.2.2. Неклеточные факторы 18

1.3. Влияния факторов микроокружения на гемопоэтические клетки in 22 vitro

1.3.1. Пуповинная кровь, как источник гемопоэтических клеток, 23 применяемых в клинических и лабораторных исследованиях

1.3.2. Идентификация и функциональная характеристика гемопоэтических 27 клеток

1.3.3. Методические подходы к культивированию гемопоэтических клеток 31

1.3.3.1. Гемопоэтические клетки в суспензионной культуре 31

1.3.3.2. Культивирование гемопоэтических клеток с использованием 36 стромального подслоя. Источники стромальных клеток

1.3.4. Пониженное содержание кислорода как фактор локального 38 микроокружения in vitro

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 43

2.1. Оборудование, материалы и реактивы 43

2.1.1. Химические реагенты и материалы 43

2.1.2. Антитела 44

2.1.3. Оборудование 45

2.2. Среды для культивирования клеток 46

2.2.1. Среда для криоконсервации клеток 46

2.2.2. Полная среда для культивирования жтММСК 46

2.2.3. Среда для культивирования пкМНК и сокультивирования пкМНК и 46 жтММСК

2.3. Выделение и культивирование клеток 46

2.3.1. МНК из пуповинной крови человека 46

2.3.2. ММСК из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека 47

2.3.3. Криоконсервация жтММСК 48

2.3.4. Культивирование клеток при пониженном содержании кислорода 48

2.3.5. Пассирование жтММСК 48

2.3.6 Подготовка стромального подслоя для сокультивирования с пкМНК 49

2.3.7 Первичная культура пкМНК 49

2.3.8. Культивирование гемопоэтических клеток в полужидкой среде 49 MethoCult Н4034

2.3.9. Совместное культивирование пкМНК и жтММСК 50

2.4. Схема исследования 50

2.5. Методы исследования 52

2.5.1. Микроскопия 52

2.5.2. Проточная цитофлуориметрия 52

2.5.3. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток 53

2.5.4. Выявление апоптотических и некротических клеток 54

2.5.5. Определение жизнеспособности методом Live/Dead 54

2.5.6. Окрашивание по Гимзе 54

2.5.7. Выявление КОЕ 55

2.5.8. Выявление КООБ 56

2.5.9. Определение количества хемокинов в среде культивирования 57

2.6. Статистическая обработка результатов 58

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 59

3.1 Разработка методических подходов для обогащения мононуклеарной 59

фракции пкМНК ранними недифференцированными предшественниками гемопоэза

3.1.1. Характеристика исходной популяции пкМНК 59

3.1.2. Культивирование пкМНК без стромального подслоя 61

3.1.3. Использование жтММСК в качестве стромального подслоя для 64 культивирования пкМНК

3.1.4. Экспансия пкМНК в совместной культуре с жтММСК 66

3.2. Взаимодействие пкМНК с жтММСК при концентрациях кислорода, 69

близких к тканевым

3.2.1. Динамика прикрепления, жизнеспособность и механизмы клеточной 69

гибели пкМНК

3.2.2. Морфологическая характеристика пкМНК, сокультивируемых с 72 жтММСК

3.2.3. Субиопуляционный состав неприкрепленных пкМНК после 74 сокультивирования с жтММСК

3.2.4. Выявление КОЕ среди пкМНК после сокультивирования с жтММСК 75

3.2.5. Хемокиновый профиль монокультур пкМНК и жтММСК в 80 зависимости от концентрации кислорода

3.2.6. Влияние сокультивирования пкМНК и жтММСК при различном 81 содержании кислорода на концентрацию хемокинов в кондиционированной среде

3.3. Экспансия гемопоэтических клеток пуповинной крови на подслое из 83

жтММСК при различном содержании кислорода

3.3.1. Культура, образованная адгезирующей фракцией пкМНК: 84 жизнеспособность и морфологическая характеристика

3.3.2. Иммунофенотипический анализ суспензионной фракции клеток, 86 образованной адгезирующей фракцией пкМНК

3.3.3. Колониеобразующая способность суспензионной и адгезированной к 87 подслою жтММСК фракции клеток пкМНК

3.3.4. Выявление клеток, способных формировать области «булыжной 89 мостовой» (КООБ), при совместном культивировании пкМНК с жтММСК

3.3.5. Хемокиновый профиль монокультур пкМНК и жтММСК 92

3.3.6. Сравнительный анализ продукции хемокинов в культуре, 94 образованной адгезирующей фракцией пкМНК в условиях различного содержания кислорода

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ 97

ВЫВОДЫ 105

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 106

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CD (cluster of differentiation) - кластер дифференцировки FITC (fluorescein isothyocyanate) - флуоресцеин-изотиоцианат

G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor) - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

HIF (hypoxia-inducible factors) - гипоксия-индуцибельный фактор ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1) - молекула межклеточной адгезии-1 IFN-y (interferon- у) - интерферон-у IL-8 (interleukin-8) - интерлейкин 8

LTC-IC (long-term culture-initiating cells) - клетки, способные длительно поддерживать гемопоэз в культуре

MIG (monokine induced by interferon у) - монокин, индуцированный интерфероном-у MIP-la (macrophage inflammatory protein-1а) - макрофагальный белок воспаления а MIP-lp (macrophage inflammatory protein- lp) - макрофагальный белок воспаления р МСР-1 (macrophage chemotactic protein-1) - моноцитарный хемотаксический фактор-1 PCNA (proliferating cell nuclear antigen) - ядерный антиген пролиферирующих клеток РЕ (phycoerythrin) - фикоэритрин

TGF-P (transforming growth factor Р) - трансформирующий фактор роста-р

VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1) - молекула адгезии клеток сосудов-1

аМЕМ (Minimum Essential Medium Eagle Alpha) - минимальная среда Игла (альфа

модификация)

БОЕ-Э - бурстобразующая единица эритроцитов

БСА - бычий сыворотный альбумин

ГСК - гемопоэтические стволовые клетки

ДМСО - диметилсульфоксид

ЕК-клетки - естественные клетки-киллеры

жтММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из стромально-васкулярной фракции жировой ткани КМ - костный мозг

кмММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из костного мозга

КОЕ - колониеобразующая единица КОЕ-Г - КОЕ гранулоцитов

КОЕ-ГМ - КОЕ гранулоцитов и моноцитов/макрофагов

КОЕ-ГЭММ - КОЕ гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов/макрофагов и мегакариоцитов

КОЕ-М - КОЕ моноцитов/макрофагов

КООБ - клетка, образующая области «булыжника»

КРКМ - клетки репопулирующие костный мозг

ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

МНК - мононуклеарные клетки

НССК - недифференцированные соматические стволовые клетки

ПИ - пропидия йодид

ПК - пуповинная кровь

пкМНК - мононуклеары пуповинной крови

ФБ - фосфатно-солевой буфер

ФДА - диацетат флуоресцеина

ЭПК - эндотелиальные прогениторные клетки

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

ВВЕДЕНИЕ

Судьбу гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) определяет кроветворная ниша, расположенная в костном мозге (Schofield et al., 1978). Клеточные и неклеточные компоненты микроокружения поддерживают состояние покоя, деления, самообновления или дифференцировки ГСК. Известно, что в костном мозге более примитивные гемопоэтические клетки находятся при 1-2% кислорода в окружении остеобластов и клеток стромы, в то время как более зрелые предшественники расположены в сосудистой нише, где уровень кислорода выше (Parmar et al., 2007). Показано, что в условиях in vitro содержание кислорода может влиять на гемопоэтические клетки, оказывая существенный эффект на предшественников одного уровня иерархии и оставаясь индифферентным для других (Cipolleschi et al., 1993).

Известно, что свойства стромальных клеток - основного клеточного компонента костномозговой ниши, также зависят от уровня кислорода. В опытах in vitro показано, что при гипоксии увеличивается их пролиферативная активность и число КОЕ-Ф, замедляется дифференцировка в остео- и адипогенном направлении, а в хондрогенном усиливается (Буравкова и др., 2009; Grayson et al., 2007; Fehrer et al., 2007). К сожалению, влиянию концентрации кислорода на взаимодействие гемопоэтических и стромальных клеток до сих пор уделяется недостаточно внимания. В нашей лаборатории впервые было показано, что при совместном культивировании мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) из костного мозга и ГСК происходит увеличение продукции медиаторов, опосредующих взаимодействие гемопоэтичеких и стромальных клеток (Жамбалова и др., 2009). В более поздних работах других авторов продемонстрировано, что, в отличие от стандартных условий культивирования, низкие концентрации кислорода способствуют поддержанию ранних гемопоэтических клеток, находящихся в состоянии покоя (Hammoud et al., 2011; Jing et al., 2012).

Большая часть исследований по взаимодействию ММСК и ГСК до недавнего времени проводилась на стромальных и гемопоэтических предшественниках, выделенных из костного мозга (Arai & Suda, 2007; Valtieri & Sorrentino, 2008). В результате было показано, что ММСК, использованные в качестве фидерного подслоя, могут существенным образом влиять на сокультивируемые с ними ГСК, в частности, изменяя соотношение коммитированных и малодифференцированных предшественников, обеспечивающих длительное восстановление кроветворения (Петрова и др., 2006; Moore et al., 1997; Punzel et al., 2003; McNiece et al., 2004; Freund et al., 2006; Hofmeister et al., 2007; Wagner et al., 2007). ММСК из жировой ткани человека (жтММСК), также как и

ММСК из костного мозга (кмММСК) могут поддерживать гемопоэз in vitro (Corre et al., 2006). Однако, несмотря на близкое сходство, ММСК из жировой ткани с меньшей эффективностью, чем ММСК из других источников способствуют пролиферации примитивных гемопоэтических предшественников (Wagner et al., 2007). Аналогичные результаты получены и в других работах, где показано, что при сокультивировании ГСК и ММСК из жировой ткани образуется меньшее количество CD34+ клеток, чем при сокультивировании с костномозговыми ММСК (Kirloy et al., 2007; de Toni et al., 2011). С другой стороны, ММСК из жировой ткани способствуют дифференцировке ГСК и более эффективно поддерживают дифференцированные гемопоэтические предшественники (Nakao et al., 2010).

Как альтернативу гемопоэтическим клеткам костного мозга в последнее время все чаще используют мононуклеары пуповинной крови (пкМНК) (Maniani et al., 1998). Несмотря на то, что это перспективный и легкодоступный источник ГСК, существенным недостатком применения в клинике является ограниченное количество стволовых клеток. С целью обогащения ранними гемопоэтическими предшественниками используют различные варианты культивирования клеток пуповинной крови (Bridell et al., 1997, Mayani et al., 1998, McNiece et al., 2004). Основное внимание исследователей при этом сосредоточено на подборе компонентов ростовых сред и методов изоляции малодифференцированных клеток. Между тем, в большинстве существующих моделей культивирования ГСК из пуповинной крови остается недооцененной роль локального микроокружения: взаимодействия со стромальными элементами, паракринной регуляции и концентрации кислорода.

Несмотря на проведение большого количества исследований, направленных на изучение межклеточных взаимодействий в тканевой нише гемопоэтических клеток, конкретные пути реализации влияния ниши на стволовые клетки до сих пор остаются нераскрытыми. Изучение особенностей взаимодействия гемопоэтических и стромальных клеток в условиях тканевых концентраций кислорода позволит расширить представления о влиянии факторов микроокружения на регуляцию гемопоэза, а также может использоваться в дальнейшем при разработке методик обогащения стволовыми и прогениторными клетками трансплантатов кроветворной ткани.

Цель работы: Сравнительное изучение особенностей межклеточного взаимодействия мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и гемопоэтических стволовых клеток в условиях различного содержания кислорода.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи

исследования:

Научная новизна

Получены новые данные, свидетельствующие о том, что при сокультивировании пкМНК и жтММСК происходит изменение профиля продуцируемых хемокинов 1Ь-8,

MIP-lp и MCP-1, опосредующих взаимодействие клеток. Показано, что степень этого изменения может зависеть от уровня кислорода в среде культивирования.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты вносят значительный вклад в существующие представления о влиянии факторов микроокружения на гемопоэтические клетки. Было показано, что жтММСК эффективно поддерживают экспансию гемопоэтических предшественников из пкМНК различной степени коммитированности в пределах 1-20% кислорода. При тканевых концентрациях кислорода среди пкМНК выявлялось больше КОЕ и изменялся их субпопуляционный состав, что приводило к увеличению доли унипотентных (КОЕ-Г и КОЕ-М) и уменьшению доли мульти- и бипотентных (КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ).

Положения, выносимые на защиту

2. При пониженном содержании кислорода (1% и 5%) в сокультуре пкМНК и жтММСК увеличивается общее количество КОЕ и изменяется их субпопуляционный состав, что проявляется в увеличении доли унипотентных (КОЕ-Г и КОЕ-М) и уменьшению доли мульти- и бипотентных (КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ).

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Понятие ниши стволовых клеток

Концепция ниши, как специфического микроокружения, модулирующего поведение стволовых клеток, была предложена Шофилдом в 1978 году, что дало начало бурно развивающейся сегодня области исследования ниш стволовых клеток (Schofield et al., 1978). Нишу принято рассматривать как анатомическую субъединицу тканевого компартмента, состоящую из взаимосвязанных клеточных и неклеточных компонентов, регулирующих биологию стволовых клеток (Li & Xie, 2005; Scadden et al., 2006; Yin & Li, 2006; Jones & Wagers, 2008). Различные типы клеток, кровеносные сосуды, тканевой матрикс формируют трехмерное пространство, обеспечивающие специфическую архитектуру, все это создает уникальное микроокружение для стволовых клеток (Scadden et al., 2006). Контакт и взаимодействие между всеми элементами играет важную роль в поддержании самообновления и мультипотентности стволовых клеток.

В костном мозге располагается кроветворная ниша, где образуются все типы клеток крови, проходя поэтапное развитие. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), способные к самоподдержанию, находятся на первом уровне в иерархии и дают начало всем кл�

Информация о работе

Маслова, Елена Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.03.01

Диссертация

Роль кислорода в межклеточном взаимодействии гемопоэтических стволовых и мезенхимальных стромальных клеток in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы