Введение гена каталитического компонента теломеразы (hTERT) в клетки с различным дифференцировочным потенциалом

Дашинимаев, Эрдэм Баирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Введение гена каталитического компонента теломеразы (hTERT) в клетки с различным дифференцировочным потенциалом
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Введение гена каталитического компонента теломеразы (hTERT) в клетки с различным дифференцировочным потенциалом"

На правах рукописи

1111111111111111111II

□□3462824

ДАШИНИМАЕВ ЭРДЭМ БАИРОВИЧ

Введение гена каталитического компонента теломеразы (ИТЕЯТ) в клетки с различным дифференцировочным потенциалом

Специальность 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена в лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Егоров Егор Евгеньевич Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Кузин Борис Александрович кандидат биологических наук Лупатов Алексей Юрьевич

Ведущая организация:

Биологический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится с? 5~ _2009 г. в_ /Г часов.

на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им Н.К. Кольцова РАН по адресу 119334, Москва ул. Вавилова, д. 26 |1Ир://1с1Ьга5. comcor.ru/ idbras@bk.ru

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.) и на сайте института http://idbras.comcor.ru/

Автореферат разослан « » _ 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук cle0806@yandex.ru

Е.Б. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время одними из наиболее бурно развивающихся направлений в медицине являются клеточнозамещающие технологии - клеточные трансплантации и тканевая инженерия. Эти технологии применяются для лечения заболеваний, связанных с повреждением или дегенерацией различных типов тканей. Предполагается, что в качестве замещающего материала наиболее оптимальным будет использование стволовых клеток, то есть клеток способных дифференцироваться в клетки различных типов тканей.

Во избежание иммунных конфликтов для подобного рода трансплантаций наиболее целесообразно использовать аутологичные стволовые клетки человека. Поэтому в настоящий момент во всем мире проводится большое количество исследований по поиску способов выделения, культивирования и наращивания аутологичного донорского клеточного материала in vitro, а также ведется изучение механизмов дифференцировки стволовых клеток и способов создания тканевых трансплантатов для дальнейшего использования в медицине.

Одной из главных проблем, связанных с культивированием и наращиванием стволовых клеток in vitro, является то, что практически все первичные культуры клеток, получаемые из тканей взрослого человека, имеют ограниченный пролиферативный потенциал и быстро теряют способность к дифференцировке. В то же время во множестве работ было показано, чго введение в культивируемые клетки гена каталитического компонента теломеразы (hTERT), восстанавливает теломеразную активность внутри клетки, стабилизирует теломерные участки хромосом и значительно увеличивает время жизни клеток в культуре, позволяя получать иммортализованные клеточные линии.

Цели и задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в исследовании возможности получения иммортализованных культур стволовых клеток человека при помощи введения гена каталитического компонента теломеразы, а также в изучении характера влияния экспрессии гена hTERT на способность клеток к дифференцировке.

В ходе работы предполагалось решить три основные задачи:

1) Определить на каком этапе происходит остановка пролиферации клеточных культур с введенным геном hTERT и интактных клеточных культур.

2) Охарактеризовать влияние экспрессии гена hTERT на способность стволовых клеток, выделенных из различных тканей, к разным типам дифференцировок.

3) Определить, сохраняется ли теломеразная активность в иммортализованных клетках и не приобретают ли они признаков, характерных для злокачественно-трансформированных культур.

Научная новизна и практическая значимость

Ген НТЕЯТ в составе лентивирусной конструкции был трансфицирован в три различные первичные культуры мезенхимальных клеток человека: а) мезенхимальные стромальные клетки (МСК) костного мозга, б) клетки стромы губчатой кости, в) МСК жировой ткани. Было показано, что во всех трех случаях введение гена ИТЕЯТ позволяет получить иммортализованные линии клеток или, по крайне мере, значительно увеличить их пролиферативный потенциал. Также впервые была получена и охарактеризована иммортализованнная культура нейральных стволовых клеток (НСК) человека. Пролиферация иммортализованых НСК была прослежена до уровня свыше 100 удвоений популяций (УП), (500 дней непрерывного культивирования). Нами было показано, что после прохождения предела Хэйфлика трансфицированные клетки не изменяли морфологию, сохраняли прежнюю скорость роста и не теряли способность к дифференцировкам. Также трансфицированные клетки сохраняли нормальную способность переходить в состояние покоя в результате сывороточного голодания, способность к контактному торможению и нормальный диплоидный кариотип.

Результаты данной работы способствуют расширению знаний о функциях ИТЕКТ и его роли в процессе иммортализации клеточной культуры. Практическая значимость данной работы заключается в отработке методов получения иммортализованных культур стволовых клеток человека, не отличающихся по своим свойствам от первичных культур стволовых клеток, что может найти применение в клеточной терапии.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006); на 50-й научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Долгопрудный, 2007); на V-ой Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008); и на научных коллоквиумах лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им В.А.Энгельгардта (2004-2008).

По материалам диссертации опубликовано три статьи в рецензируемых журналах.

Личное участие автора

Автор освоил все экспериментальные методы, используемые в данной работе, основные результаты исследования были получены им лично.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Список литературы содержит 207 наименований,

из них 198 иностранных источников. Работа изложена на 119 страницах, и содержит 33 рисунка и 2 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Культуры клеток

Первичная культура мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека (XI), была получена из мононуклеарной фракции аспирата костного мозга подвздошной кости человека. Клетки культивировали на среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 0,32 мг/мл глутамина, 40 ед/мл гентамицина.

Первичная культура клеток стромы губчатой кости человека (BMSCS'), полученная из трепаната верхней челюсти, была любезно предоставлена С.М. Тереховым (МГНЦ РАМН). Клетки культивировали на среде DMEM с добавлением 10% FBS, 0,32 мг/мл глутамина, 40 ед/мл гентамицина.

Первичная культура мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека (LA) была любезно предоставлена С.М. Тереховым. Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 15% FBS и 0,32 мг/мл глутамина, 40 ед/мл гентамицина.

Первичная культура фетальных нейральных стволовых клеток человека (NSC) была любезно предоставлена И.Н. Сабуриной (ИБГ РАН). Клетки культивировали на среде DMEM/F12 с добавлением 2% Fetal Clone III, Ю нг/мл FGF-2, 10 нг/мл EGF, 0,11 мг/мл пирувата натрия, N2 Supplement, 0,32 мг/мл глутамина, 40 ед/мл гентамицина,.

Клетки линии ТК-164 (почечная карцинома человека) были любезно предоставлены М.Кост-Алимовой (Каролинский институт, Швеция). Клетки ТК-164 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,32мг/мл глутамина и 40ед/мл гентамицина. .

Все типы клеток культивировали в СОг-инкубаторе с пониженным содержанием кислорода, в условиях +37°С, 5%С02, 3%02.

Трансфекция гена каталитического компонента теломеразы

Лентивирусная конструкция,

содержащая ген hTERT под CMV промотором была любезно предоставлена П.М. Чумаковым (ИМБ РАН) (Рис. 1).

Введение гена осуществляли в растущие клетки. После удаления культуральной среды к растущим во флаконах клеткам на стадии половины монослоя добавляли вирусный концентрат (1 мл с титром 108/мл), разведенный полной ростовой средой с сывороткой в соотношении 1:2. Эта смесь содержала также 5 мкг/мл полибрена. Клетки инкубировали в течение ночи,

RSVLTR HIV LTR

hTERT

Рис.1. Лентивирусная конструкция pLA-CMV-hTERT

после чего среду меняли на полную ростовую среду. Эффективность лентивирусной трансфекции (по введению конструкции с зеленым флуоресцирующим белком) составляла не менее 80%.

Анализ дифференцировки клеток и иммуноцитохимические методы

Для индукции клеток к дифференцировке в адипогенном направлении, использовали полную ростовую среду (DMEM, 10%FBS) с добавлением 1 мкМ дексаметазона, 0,5 мМ З-изобутил-1-метилксантина и 1 мкг/мл инсулина. Среду меняли через каждые 3-4 дня. Образование характерных жировых клеток начиналось через 7-10 дней от начала дифференцировки. После 21 дня культивирования с индукционной средой клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), фиксировали 4% формальдегидом 10 мин при комнатной температуре, после чего опять промывали PBS и окрашивали Суданом-IV 10 мин при комнатной температуре.

Для индукции клеток к дифференцировке в остеогенном направлении мы использовали полную ростовую среду (DMEM, 10%FBS) с добавлением 0,1 мкМ дексаметазона, 10 мМ ß-глицерофосфата, 100 мкМ фосфата аскорбиновой кислоты. Среду меняли каждые 3-4 дня. После 14 дней культивирования с индукционной средой клетки промывали PBS, фиксировали 4%-ым формальдегидом 10 мин при комнатной температуре, промывали PBS и окрашивали 2% Ализариновым красным (pH 4.2) 10 мин при комнатной температуре.

Анализировали клетки при помощи инвертированного фазово-контрастного микроскопа Diaphot ("Nikon", Япония) и цифрового фотоаппарата Nikon D70.

Иммуноцитохимия. Клетки высаживали на покровные стекла в 6-луночных или 24-луночных планшетах (Costar, США). Перед фиксацией стекла с клетками дважды промывали PBS, фиксировали 4% формальдегидом в течение 30 минут при комнатной температуре, затем дважды промывали PBS. Перед окрашиванием антителами стекла в течение 2 часов при комнатной температуре обрабатывали блокирующим раствором (PBS с добавлением 10% FBS, 0,1% Triton-X-100, 0,01% Tween-20). Наносили первые моноклональные антитела (разведенные в концентрации 1/100-1/500 от стоковой), инкубировали 2 часа при +37°С и промывали 3 раза PBS. Затем наносили вторые антитела с флуоресцентным красителем (разведенными в концентрации 1/500-1/1000 от стоковой), инкубировали 1 час при +37°С и отмывали 3 раза PBS. Далее препараты с клетками окрашивали раствором Хехста 33258 (3 мкг/мл на PBS) или DAPI (1,5 мкг/мл на PBS) 15 мин при комнатной температуре, промывали дистиллированной водой и заключали в 85% глицерин на PBS. Фотографировали препараты с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus ВХ61 и инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus СКХ41.

Выявление белкового компонента теломеразы in situ. Для иммунохимического анализа клеток на экспрессию белка каталитического компонента теломеразы использовали моноклональные мышиные IgM антитела

ab5181 фирмы Abeam (Англия). Процедуру окрашивания антителами проводили в соответствии с инструкцией производителя.

Изучение кариотипа

Для приготовления хромосомных препаратов из митотических клеток человека использовали культуры клеток с наибольшим количеством митозов (обычно на 2-ой день после пересева). В начале процедуры клетки инкубировали в присутствии 0,1 мкг/мл колцемида в течение 2 часов, затем клетки снимали при помощи раствора трипсин-Версена, осаждали центрифугированием, промывали PBS и инкубировали в гипотоническом растворе 60 мМ KCl при +37°С в течение 1 часа с последующим осаждением на центрифуге. Далее клетки фиксировали в охлажденном до +4°С фиксирующем растворе (ледяная уксусная кислота/метиловый спирт, 1:3) в течение 10 мин и меняли фиксирующий раствор на свежий. Полученную суспензию раскапывали на охлажденные до -20°С предметные стекла с высоты 30 см, с последующим поджиганием фиксатора на стекле. Эта методика позволяет добиться оптимального распластывания митотических пластинок на поверхности предметного стекла. Полученные хромосомные препараты хранили сухими при комнатной температуре.

Дифференциальное R-окрашивание хромосом. Хромосомные препараты были окрашены при помощи флуоресцентных красителей: 4,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) и 7-амино-актиномицина D (7-AAD). Для окрашивания хромосомных препаратов использовали рабочий раствор 7-AAD концентрацией 5 мкг/мл на PBS без кальция и магния, окрашивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем окрашивали раствором DAPI (5 мкг/мл на PBS) в течение 15 мин при комнатной температуре. Далее препараты промывали дистиллированной водой и заключали под покровные стекла в 85% глицерин на PBS. Окрашенные препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Olympus ВХ61. Полученная флуоресцентная окраска соответствует стандартному дифференциальному R-окрашиванию хромосом.

Определение экспрессии генов, методом ОТ-ПЦР

Выделение РНК. Для выделения РНК использовали коммерческий набор Invisorb®Spin Cell RNA Mini Kit, фирмы Invitek (Германия). На выходе данной процедуры получали выделенную и очищенную от ДНК тотальную РНК клеток в количестве 1-2 мкг/1 млн клеток.

Обратная транскрипция. Обратную транскрипцию мРНК осуществляли при помощи набора для синтеза первой цепи кДНК (олиго(с1Т) 15) фирмы ЗАО «Силекс» (Россия, Москва).

ПЦР. Для проведения ПЦР исследуемых генов использовали коммерческий набор JumpStart Taq Ready Mix, D#7440, фирмы Sigma (США). Смесь полученного амплификата хранили при -20°С и в дальнейшем анализировали при помощи стандартного агарозного гель-электрофореза.

Интернет-адреса банков праймеров, где были подобраны последовательности:

http://pga.mgh.harvard.edu/prirnerbank/index.html

http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/

Идентификационные номера использованных праймеров: GAPDH (Primer Bank ID: 7669492а2), Nestin (PrimerBank ID: 35019a2), NSE (Primer Bank ID: 580301 Ia2), TH (RTPrimerDB ID: 3510), CHAT (RTPrimerDB ID: 3502), GFAP (PrimerBank ID: 4503979al), PLP (Primer Bank ID: 19923104al).

Определение теломеразпой активности.

Для определения теломеразной активности использовали коммерческий набор «Trapeze Gel-Based Telomerase Detection Kit Assay» фирмы Chemicon, (CIIIA). Данный набор использует стандартный метод выявления теломеразной активности TRAP (telomeric repeat amplification protocol). Результаты реакции TRAP выявляли при помощи вертикального 10% ПААГ-электрофореза, в стандартном TBE буфере. Гель окрашивали бромистым этидием 0,5 мкг/мл - в течение 30 мин при покачивании, фотографировали через красный интерференционный светофильтр, с помощью цифровой камеры Nikon D70. Источником возбуждающего света УФ служил транс-иллюминатор.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) теломерного повтора на хромосомах человека. Хромосомные препараты получали по ранее описанной методике. Олигонуклеотиды (СССТАА)4 меченные биотином, были заказаны в фирме «Силекс» (Россия). Хромосомные препараты обрабатывали раствором РНКазы А (10 мкг/мл) в течении 1 часа при 37°С, после чего отмывали в PBS и высушивали на воздухе. Гибридизационный буфер с биотинилированными олигонуклеотидами (10-25 нг/мл меченых олигонуклеотидов, 50% формамида и 10% декстрансульфата в 2Х буфере SSC) наносили на препараты в количестве 20мкл и накрывали покровным стеклом. Затем препараты нагревали до +80°С 4 мин (этап денатурации) и инкубировали ночь при +37°С (этап гибридизации) во влажной камере. После этого препараты промывали 3 раза в гибридизационном буфере при 42°С. Для выявления биотина использовали коньюгат стрептавидина с флуоресцентным красителем Су-3. Хромосомы окрашивали DAPI по описанной ранее методике.

Тест на наличие контактного торможения пролиферации и реакции на сывороточное голодание.

Тест на контактное торможение пролиферации клеток проводили следующим образом: клетки высевали в 9 флаконов площадью 25 см2, в количестве 100 тыс. клеток на флакон и культивировали в обычной полной ростовой среде, меняя среду через 3-4 суток. В процессе культивирования через каждые 2-3 суток (в зависимости от скорости роста культуры) из эксперимента выводили один флакон и подсчитывали количество клеток. Результатом теста является график роста культуры в зависимости от времени. Рост культуры клеток со способностью к контактному торможению имеет вид кривой «выходящей на плато».

Тест на наличие способности перехода в покой в условиях сывороточного голодания проводили следующим образом: клетки высевали в 7 чашек Петри диаметром 3 см, в количестве 10 тыс. клеток на чашку в полной ростовой среде. На следующий день три чашки Петри (опытная группа) промывали 2 раза PBS и заливали средой DMEM с 0,2% FBS, три чашки Петри (контрольная группа) промывали 2 раза PBS и заливали полную ростовую среду (с 10% FBS). Оставшуюся одну чашку Петри выводили из эксперимента и фиксировали клетки 4% формальдегидом. Далее выводили из эксперимента по одной чашке Петри в день из опытной и контрольной группы и фиксировали клетки 4% формальдегидом, смены среды в эти дни не проводили. Иммуноцитохимическим методом выявляли долю клеток экспрессирующих Ki-67, т.е. активно пролиферирующих клеток. Результатом теста является график, показывающий долю Ki-67+ клеток, в контрольной и опытной группах в зависимости от времени.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Введение гена ItTERT в стромальные клетки человека, полученные из различных типов тканей, исследование свойств полученных клеток.

1.1 Мезенхимальные стромальные клетки костного мозга человека, культуры XI иXl-lenti-hTERT.

Полученная первичная культура МСК из аспирата костного мозга человека (XI) после 2-х пересевов была гомогенна, клетки имели ярко выраженную фибробластоподобную морфологию, хорошо прикреплялись и распластывались на пластиковой подложке культуральных флаконов. Трансфекцию геном hTERT при помощи лентивирусного вектора провели на третьем пассаже культивирования (Xl-lenti-/?r£7?7). Трансфицированные клетки не отличались от контрольных клеток морфологически, сохраняли прежнюю фибробластоподобную форму и скорость пролиферации. Через 20 дней субкультивирования обеих культур на уровне 3 УП контрольные клетки в культуре приобрели ярко выраженную морфологию стареющих клеток (уменьшенное ядерно-цитоплазматическое отношение, усиленный цитоскелет) и прекратили деление. Клетки Xl-lenti-hTERT прошли в культуре более 35 УП, пролиферируя с постоянной скоростью (Рис. 2А), и не изменяясь морфологически во время культивирования.

Была исследована способность клеток X\-\mi\-hTERT к дифференцировке. При помощи специальных индукционных сред клетки были простимулированы к дифференцировке в адипо- и остеогенном направлениях. Клетки, инкубировавшиеся в среде, индуцирующей адипогенную дифференцировку, замедляли пролиферацию и начинали накапливать жировые гранулы внутри цитоплазмы. Жировые гранулы интенсивно окрашивались липофильной краской Судан-IV (Рис. 4А). Клетки, инкубировавшиеся в среде, вызывающей остеогенную дифференцировку, замедляли пролиферацию, и начинали синтез внеклеточного матрикса, который интенсивно окрашивался Ализариновым красным (Рис. 4Б).

1.2 Клетки стромы губчатой кости человека, культуры BMSCS и BMSCS-lenti-hTERT.

Полученная первичная культура клеток стромы губчатой кости (BMSCS), была фенотипически гомогенна, клетки имели фибробластоподобную морфологию, хорошо прикреплялись к пластиковой подложке. Лентивирусную трансфекцию hTERT провели на 2-ом пассаже. Трансфицированная культура BMSCS-lenti-AZfiTJr практически не отличались от контрольной морфологически. Спустя 150 дней одновременного культивирования обеих культур клеток (на уровне 24 УП) контрольные клетки BMSCS приобрели ярко выраженный фенотип стареющих клеток и прекратили делиться (Рис.2Б).

Полученная иммортализованная культура BMSCS-lenti-Ar^r в течение 320 дней прошла более 55 циклов УП. За время наблюдения клетки не изменяли свой фенотип, сохраняли способность к контактному торможению и не изменяли скорость роста.

Было проведено сравнение способности клеток BMSCS и BMSCS-lenti-hTERT к дифференцировкам. Мы выяснили, что при индукции соответствующими средами клетки обеих культур не были способны к дифференцировке в адипогенном направлении, и, в то же время, обе культуры были способны к остеогенной дифференцировке: клетки, образовывали видимые в фазовом контрасте отложения внеклеточного матрикса, окрашиваемые Ализариновым красным (Рис. 4В, 4Г).

1.3 Стромальные клетки жировой ткани человека, культуры LA и LA-lenti-hTERT

Полученная первичная культура стромальных клеток жировой ткани человека (LA) была гомогенна, клетки имели фибробластоподобную морфологию, хорошо прикреплялись в пластиковой подложке. Трансфекцию геном hTERT провели на 3-м пассаже культивирования. Клетки после трансфекции (LA-lenti-hTERT) не изменяли морфологию, сохраняли способность к контактному торможению, а также прежнюю скорость роста. После 100 дней параллельного культивирования обеих культур на уровне 25 УП контрольные клетки LA замедлили пролиферацию и вскоре перестали делиться, приобретя стандартный фенотип стареющий культуры. Трансфицированная культура LA-lenti-/;TERТ в течение 160 дней прошла более 40 УП (Рис. 2В).

Была проверена способность клеток LA и LAAenti-hTERT к дифференцировке по адипо- и остеогенным направлениям. Так же как и контрольные клетки, клетки LA-\enti-hTERT показали ярко выраженную способность к дифференцировкам (Рис.4Д, 4Е).

1.4 Тест на контактное торможение и реакция на сывороточное голодание клеток BMSCS-len ti-h TER Т.

Поскольку иммортализация клеток может сопровождаться их злокачественной трансформацией, мы решили проверить на одной из трансфицированных культур клеток, обладают ли они качествами, присущими опухолевым клеткам, а именно: отсутствием контактного торможения при культивировании и отсутствием реакции на сывороточное голодание.

•fti.....г!......

/ i !

Tfr Г"Т.....! • • ИТГ'П

. J. \1

90 100 150 200 250

Нрсч*. i.

! LAtlenti-hTE

1 ! Jr^

ВведеникиТЕЯТ

SO IX

150 200

Время, сут.

ЬЬСЧшп-ЬТГК?

... -

Введение hTERT "V*"^

NSC' ■

0 100 200 300 400 500 BOO Прсмя, сут.

Рис. 2. Кривые роста культур клеток: А - XI и X l-lenti-^7"£/?7", Б - BMSCS и BMSCS-lenti-hTERT, В - LA и LA-lenti-hTERT, Г - NSC и NSC-lenti-/ir£«7

i ..........1......... 70'

! П Я ■

А- BMSCS-k с 30 - iin-hTfRT s

^д \ В -

:04FBS-

i^jBs

»5 ? 25 3 3.5 i «5

15 J а э 3,i

Рис. 3. А - Результаты теста на способность клеток к контактному торможению. Культуры клеток ТК-164 и ВМ8С8-1еШ\-hTERT. Б, В - Результаты теста на сывороточное голодание. Культуры клеток ВМ5С5-1сп1|-ЛГ£ЙГ (Б) и ТК-164 (В)

Рис. 4. Дифференцировка клеток в культуре. Фазовый контраст. А - Адипогенная дифференцировка клеток культуры Х1-1епй-ЬТЕСТ, окраска Суданом-1У. Б - Остеогенная дифференцировка клеток культуры ХХАепИ-ИТЕЯТ, окраска Ализариновым красным. В, Г -Остеогенная дифференцировка клеток культуры ВМБСБ-Ьп й-ИТЕЯТ, окраска Ализариновым красным. Д - Адипогенная дифференцировка клеток культуры ЬА-1епй-ИТЕЯТ, окраска Суданом-1У. Е - Остеогенная дифференцировка клеток культур ЬА-1епП-ИТЕЯТ, окраска Ализариновым красным.

Рис. 5. Первичная культура фетальных нейральных стволовых клеток человека NSC

Рис. 6. Иммуноцитохимический анализ клеток Ы5С-1епй-йГ£У?7' : А - экспрессия Р-Ш-тубулина (су-3, красный), ядра окрашены Хехст 33258 (синий), Б- экспрессия Р-Ш-тубулина (су-3, красный) и глиального фибриллярного кислого белка (А1еха 488, зеленый), ядра окрашены Хехст 33258 (синий), В - экспрессия нестина (су-3, красный), ядра окрашена Хехст 33258 (синий).

N N

е s

S Е

Рис. 7. Экспрессия мРНК в клетках NSC и NSC-\enti-hTERTклетках. Стрелками обозначены различия в экспрессии мРНК между NSC и NSC-lenti-Z/r^r

А Б В

Рис. 8. А - культура нейросфер клеток NSC -\enti-hTERT, фазовый контраст. Б -Прикрепившаяся нейросфера в среде с содержанием 10%FBS, фазовый контраст. В - край расползания сферы, окраска на p-III-тубулин (су-3, красный), ядра клеток Хехст 33258 (синий)

I I I I I I I

А Б В Г Д Е Ж

Рис 9. Продукты реакции TRAP с экстрактами клеток NSC и NSC-lenti-ZfTET??'. А - Маркер , Б - NSC -HI (термоинактивированный экстракт), В - экстракт NSC , Г - NSC -lenti-hTERT-HI (термоинактивированный экстракт), Д - экстракт NSC -\enti-hTERT, Е - негативный контроль, Ж - позитивный контроль (экстракт HeLa)

А Б

Рис. 10. А- Гибридизация (FISH) с теломерным повтором хромосом клеток NSC -lenti-hTERT. Теломерные повторы окрашены су-3 (красный), хромосомы окрашены DAPI (синий). Б - Окрашивание антителами против теломеразы, a,b,c,d - высокий уровень сигнала hTERT внутри отдельных ядер, е - сигнал hTERT внутри цитоплазмы. Величина шкалы -25мкм

: (Г ¿ill и и«

i ? з *

■ * iu * -

ЫлЛ* . ;

# * Яд л Л

Рис. 11. Митотическая пластинка культуры NSC-lent-/;TERT{&) и кариотип (Ь)

В качестве контроля использовали линию опухолевых клеток почечной карциномы TK-I64.

Нами было показано, что трансфицированные клетки SMSCS-lenti-An^r обладают способностью к контактному торможению при культивировании (Рис. ЗА) в отличие от клеток ТК-164, которые пролиферируют вне зависимости от плотности клеток в культуре. Тест на сывороточное голодание показал, что (Рис. ЗБ) клетки BMSCS-lenti-^r^T1 чувствительны к присутствию сыворотки в среде. Так, после удаления сыворотки доля Ki-67+-клеток SMSCS-lenti-ATTi^r заметно упала по сравнению с долей Кл-67+-клеток, культивируемых на полной ростовой среде с 10%FBS. Клетки линии ТК-164 (Рис. ЗВ) оказались нечувствительны к сывороточному голоданию: доля клеток, экспрессирующих Ki-67 в бессывороточных условиях, не снижалась, т.е. клетки продолжали пролиферировать с такой же скоростью.

2. Введение гена liTERT в нейральные стволовые клетки человека и исследование свойств полученных клеток.

2.1 Нейральные стволовые клетки человека, культуры NSC и NSC-lenti-hTERT.

Полученная первичная культура НСК человека (NSC), выделенная из

фетальной ткани, была гетерогенна, внутри культуры наблюдались несколько типов клеток, различающихся морфологически. Можно было выделить как минимум три доминирующих типа клеток: распластанные эпителиоподобные клетки, вытянутые клетки с конденсированным ядром и длинными отростками и шарообразные маленькие клетки (Рис. 5). Лентивирусную трансфекцию геном hTERT провели на 3-м пассаже культивирования. Трансфицированные клетки t\SC-\eriU-hTERT не отличались от контрольных клеток NSC морфологически, не изменяли темпа пролиферации. После 240 дней культивирования, на уровне 43 УП контрольные клетки NSC приобрели морфологию стареющей клеточной культуры и перестали делиться (Рис. 2Г). Трансфицированные клетки NSC-lenti-Arii/Jr наблюдали более 560 дней в культуре, за это время они прошли более 105 циклов У П. За все это время культивирования клетки не изменяли морфологию, сохраняли гетерогенность популяции и прежнюю скорость роста.

2.2 Дифференцировка NSC и NSC-lenti-hTERT

Причиной гетерогенности культур НСК является постоянная спонтанная дифференцировка в нейрональном и глиальном направлениях. Иммунохимическими методами нами были показано, что клетки культур NSC и NSC4-lenti-/j7,£,^r экспрессируют маркеры дифференцировки: ß-111-тубулин (маркер ранней нейрональной дифференцировки), глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP - маркер глиальной дифференцировки) и нестин (маркер нейральных стволовых клеток человека) (Рис. 6А, 6Б, 6В).

Экспрессия генов-маркеров дифференцировки в контрольной NSC и теломеризованной NSC-lenti-/27*£7?r культурах изучалась нами также при помощи метода ОТ-ПЦР. В ходе исследования было установлено (Рис. 7), что в обеих культурах клеток одинаково экспрессируются гены нестина (NEST), нейронспецифической енолазы (NSE), GFAP и белка-предшественника

миелина (PLP). Небольшие различия наблюдались лишь по степени экспрессии генов ферментов тирозингидроксилазы (ТН) и ацетилхолинтрансферазы (CHAT) - мы наблюдали снижение экспрессии этих генов в клетках культуры NSC-lenti-/i7jE7?r.

2.3. Нейросферы NSC и NSC-lenti-hTERT

Одной из характеристик НСК является способность этих клеток образовывать нейросферы - суспензионные культуры свободноплавающих сферических конгломератов. Культивируя клетки на бессывороточных средах, нам удалось получить нейросферы в обеих исследуемых культурах - NSC и NSC-lenti-ArEifr. Образование нейросфер происходило из единичных клеток, которые переживали циклы пассирования при помощи трипсин-Версена (Рис. 8А). При добавлении в бессывороточную среду 10% FBS нейросферы прикреплялись в пластиковой подложке, клетки начинали распластывание и центробежную миграцию от центра прикрепления. Клетки на пластиковой подложке были способны экспрессировать ß-III-тубулин и GFAP (Рис. 8Б, 8В)

2.4. Определение теломеразной активности в клетках NSC и NSC-lenti-hTERT.

Для проверки экспрессии введенного гена hTERT мы определяли

теломеразную активность в исследуемых культурах клеток NSC и NSC-lenti-hTERT методом TRAP. Экстракты были выделены из клеток NSC на уровне 38 УП, NSC-lenti-Anr/Jr на уровне 100 УП. В качестве положительного контроля нами использовался экстракт теломеразопозитивных опухолевых клеток HeLa.

Сильный и различимый сигнал, свидетельствующий о наличии продукта TRAP-реакции, был обнаружен только в экстракте теломеризованной культуры NSC-lenti-hTERT (Рис. 9). В экстракте контрольной культуры NSC продуктов реакции удлинения теломерных повторов не наблюдалось.

Экспрессию гена hTERT в клетках NSC и NSC-lenti-Ar£7?r мы детектировали также при помощи иммуноцитохимического метода, используя моноклональные антитела против каталитического компонента теломеразы. Было обнаружено, что небольшая доля (порядка 5%) клеток NSC-lenti-hTERT экспрессировала каталитический компонент теломеразы на более высоком уровне, чем средний уровень сигнала в клетках NSC или в обычных фибробластах кожи человека, которые использовались в качестве контроля (Рис. 10Б). Интересен тот факт, что некоторые клетки в культуре содержали сигнал hTERT в цитоплазме. Обычно эти клетки напоминали стареющие фибробласты.

Методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) была проведена качественная оценка величины теломер клеток l^SC^enti-AreT??1 (Рис. ПА). Полученные сигналы были яркими и располагались на большинстве хромосом, что может свидетельствовать о том, что укорачивания теломерных повторов за время культивирования не происходило.

2.5. Кариотипическая характеристика культуры NSC-lenti-hTERT.

Хромосомные аберрации являются одним из основных признаков злокачественной трансформации клеточной культуры. Для проверки влияния лентивирусного введения гена hTERT на стабильность набора хромосом мы провели анализ кариотипа культуры NSC-lenti-An^r. Количество хромосом

было просчитано в более чем 20 метафазных пластинках, ни в одном из них не было обнаружено ни одного случая гипердиплоидного набора хромосом, также никакой закономерности в отсутствии отдельных хромосом выявлено не было. Препараты для кариотипирования были окрашены DAPI и 7-амино-актиномицином D, что соответствовало дифференциальному R-окрашиванию хромосом. Анализ десяти дифференциально окрашенных пластинок позволил нам сделать вывод о том, что клетки культуры NSC-\enti-hTERT имеют нормальный диплоидный кариотип (Рис. 11)

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Фермент теломераза и его функции внутри живой клетки являются объектом пристального внимания со стороны исследователей вот уже много лет. С момента открытия теломеразы в 1985 году (Greider, Blackborn 1985), было проведено много экспериментальных работ, направленных на изучение этого фермента, его функций и взаимосвязи с процессами клеточного старения. В 1997 году впервые in vitro, в лизате клеток была реконструирована теломеразная активность и было установлено, что для этого необходимо присутствие всего двух компонентов - белкового каталитического и РНК-компонента (Weinreich et al, 2007). Примерно в это же время, появляются работы, доказывающие, что РНК компонент теломеразы экспрессируется в большинстве клеток человека вне зависимости от теломеразной активности (Feng et al., 1995; Avilion et al., 1996, Yashima et al 1998) и в 1998 году появились первые данные, что введение лишь одного гена hTERТ приводит к появлению в клетках теломеразной активности, которая способна поддерживать длину теломер и иммортализовать такие культуры клеток как фибробласты и клетки пигментного эпителия сетчатки. (Bodnar et al., 1998; Vaziri, Benchimol, 1998). И сразу же возникло множество предложений по применению теломеразы и теломеризованных клеток в медицине. И, хотя до сих пор не до конца выяснено, каким образом влияет репликативное старение клеток на общее старение тканей и всего организма в целом, было предложено использовать теломеризованные фибробласты для омолаживания кожи, а также и клетки сетчатки для лечения старческой слепоты (Bodnar et al., 1998). В то же время, в печати появлялись данные, указывающие на участие теломеразы в процессах канцерогенеза. Например, с 1994г. известно, что примерно 85% опухолевых клеток приобретает теломеразную активность в процессе онкогенеза (Kim et al., 1994), к 2000 г. появились работы, указывающие, что в опухолевых линиях ген hTERT может быть амплифицирован и присутствовать в геноме в нескольких копиях (от 3-х до 11-и) (Bryce et al., 2000) в отличие от единственной копии в нормальных клетках (Kilian et al., 1997; Meyerson et al., 1997). Теперь уже о теломеразе заговорили, как о возможной молекулярной мишени для антираковой терапии.

На сегодняшний день единственно подтвержденной известной функцией теломеразы является поддержание длины теломер, однако могут существовать и другие функции или регуляторные пути, в которых теломераза играет важную роль. Например, есть данные о том, что в клетках с введенной

теломеразой, также как и в исходных, могут укорачиваться теломеры, но клетки все равно пролиферируют (Ouellette et al., 2000). Это может быть связано с дополнительными, неизвестными пока возможностями теломеразы, такими как, например способность hTERT защищать митохондрии от оксидативного стресса (Ahmed et al., 2008). Также существуют данные о том, что конформация теломер и экспрессия теломеразы возможно влияют на дифференцировку в процессе развития макрофагов мыши (Kazimirchuk et al., 2005).

В нашей работе мы старались пополнить знания о свойствах иммортализованных при помощи теломеразы клетках человека. Мы выбрали объектом исследования стволовые клетки человека с различным дифференцировочным потенциалом, потому что это относительно новая и развивающаяся область знаний, с большими перспективами в плане практического применения в области клеточнозамещающей терапии в клинике. Прежде всего, интересно было посмотреть, удастся ли при помощи лентивирусной трансфекции гена hTERT получить иммортализованные линии стволовых клеток из первичных культур, не повлияет ли активация гена каталитического компонента теломеразы на механизмы дифференцировки и не приобретут ли стволовые клетки качества, характерные для злокачественных клеток.

1. Образование иммортализованных культур стволовых клеток in vitro при помощи введения гена каталитического компонента теломеразы человека.

Нами было проведено четыре группы экспериментов по введению гена hTERT при помощи лентивирусной конструкции, в четыре разных типа стволовых (прогениторных) клеток человека, выделенных из различных тканей человека и обладающих различными потенциями к пролиферации и дифференцировке.

В результате каждой из серии экспериментов по трансфекции гена hTERT нам удалось обнаружить значительные отличия в пролиферативном потенциале между контрольными и трансфицированными клетками. Контрольные клетки в ходе каждого из экспериментов исчерпывали потенциал роста, переходя в длительное неделящееся состояние. Каждый раз остановка пролиферации проходила по одному и тому же сценарию: количество митозов в культуре постепенно падало, клетки приобретали стареющий фенотип. В культуральных флаконах со стареющими культурами часто наблюдался рост отдельно расположенных колоний, которые со временем также прекращали пролиферацию, что может свидетельствовать о гетерогенном распределении внутри популяции клеток по длине теломер и пролиферативному потенциалу. Культуры клеток с введенным геном теломеразы тем временем, продолжали пролиферировать, не изменяя своей морфологии и сохраняя прежнюю скорость роста.

В каждом эксперименте точка разделения кривых пролиферации теломеризованной культуры и контрольной культуры на графике удвоений популяции наступала на разных уровнях. Например, для культуры XI и XI-

\exA\-hTERT разделение кривых произошло на уровне 3 УП, для BMSCS и BMSCS-lenti-/i7'£/J7' на уровне 23 УП, для LA и LA-lenti-A^r на уровне 26 УП и для NSC и NSC-lenti-ATT^r на уровне 43 УП. Объяснение столь явных отличий в пределе пролиферативного потенциала, мы склонны искать в источнике наших исследуемых первичных культур. Поскольку донорами тканей для выделения были люди разного возраста, а в случае с нейральными стволовыми клетками источником послужила фетальная ткань, то этот результат вполне объясним, и даже наоборот, может служить некой проверкой метода - контрольные клетки из наиболее молодой ткани (NSC) прошли наибольшее количество удвоений популяции.

В каждом случае эксперимент длился более 200 дней, трансфицированные геном hTERT клетки оказались способны при пролиферации превышать предел Хэйфлика как минимум в два раза. Нами не было зафиксировано ни одного случая старения и остановки пролиферации теломеризованной культуры. Таким образом, можно говорить о том, что трансфекция гена hTERT вызвала иммортализацию клеток или, по крайне мере, весьма значительно увеличила их пролиферативный потенциал.

Похожие в целом результаты были получены в работах других исследователей, в которых авторы вводили hTERT в культуры различных клеток человека, в том числе и стволовых клеток (Hirofumu, 2005, Eun Sook Jun, 2004, Yun Bai, 2004.) Во всех работах авторы также приходят к выводу о том, что введение hTERT вызывает иммортализацию культур стволовых клеток человека, как и в случае с культурами дермальных фибробластов (Bodnar et al., 1998; Vaziri, Benchimol, 1998).

2. Сохранение механизмов дифференцировки в иммортализованных культурах клеток.

Одной из задач нашего исследования, являлось изучение возможного влияния экспрессии гена hTERT и иммортализации культуры на такие важные характеристики стволовых клеток как способность к дифференцировке в клетки различных типов. Утрата таких способностей явилась бы важным результатом, свидетельствующим о прямой взаимосвязи функций теломеразы и состояния теломер с механизмами пластичности стволовых клеток. Результаты опытов по дифференцировкам теломеризованных культур МСК показали, что клетки не меняют характеристик дифференцировочного потенциала по адипо-и остеогенным направлениям развития, и, по всей видимости, сохраняют свои способности в течение долгого времени. Эффективности дифференцировки, такие как, например, доля адипоцитов в культуре или плотность минерализованных отложений теломеризованных клеток визуально при фазовоконтрастном микроскопировании не отличались от эффективности дифференцировки контрольных клеток ни в одном случае. Таким образом, мы можем сделать вывод о том, что экспрессия гена hTERT никаким образом не влияет на механизмы дифференцировок МСК, по крайне мере, в поставленных условиях.

Для НСК основными типами дифференцировок, по которым предполагалось проследить возможные отличия, были дифференцировки по нейрональному и глиальному пути, являющиеся основными для нейральных стволовых клеток и отслеживаемые по экспрессии маркеров ß-III-тубулина и GFAP, соответственно. В нашем случае при культивировании первичной культуры дифференцировка по обоим направлениям шла самопроизвольно, приводя к гетерогенности популяции. Результаты подсчета доли клеток уходящих в дифференцировку в обеих культурах NSC и NSC-lenti-/?7ï7?r показали, что экспрессия теломеразы не нарушила механизмов дифференцировки. Изменения доли дифференцированных клеток внутри культур клеток в зависимости от времени, возможно, объясняются факторами неучтенными во время проведения опыта, например, незначительным изменением плотности клеток в культуре. Кроме этого факта, доказательством того, что теломеризация не повлияла на механизмы дифференцировки, также может служить факт образования колоний различной морфологии клетками NSC-lenti-/i7'.£7?7'' в результате теста на колониеобразование. Общая гетерогенность культуры и образование клонов клеток с различной морфологии, в том числе и гетерогенной, иммортализоваными клетками NSC-lenti-/ir£7?rHa уровне 70 УП свидетельствует о сохранении процессов самопроизвольной дифференцировки и о сохраняющемся потенциале стволовых клеток внутри культуры. Помимо всего прочего, теломеризованные клетки ~NSC-lcnti-hTERT были способны образовывать перевиваемую культуру нейросфер, что является одной из характеристик нейральных стволовых клеток.

Результаты исследования экспрессии маркеров дифференцировки методом ОТ-ПЦР, также выявили сохранение способностей иммортализованных клеток в дифференцировке в обоих направлениях и сохранение экспрессии нестина -маркера нейральных стволовых клеток. Небольшие отличия в экспрессии генов ТН и CHAT можно объяснить тем, что эти гены кодируют белки участвующие в синаптической передаче сигнала, т.е. являются маркерами зрелых нейронов, устанавливающих специфические межклеточные контакты. Для образования таких белков внутри культуры нужно определенное время, необходимое для формирования межклеточных связей. Контрольные клетки NSC, взятые для выделения и анализа РНК на уровне 38 УП, отличались от теломеризованных клеток более медленными темпами роста и соответственно, имели больше возможностей для образования и CHAT - клеток. Несмотря на это,

экспрессию гена CHAT в обеих культурах, можно расценить как признак сохранения потенциальной способности к образованию зрелых клеток-нейронов.

Схожие результаты были получены и в работах других исследователей (Hirofumu, 2005, Eun Sook Jun, 2004, Yun Bai, 2004). Авторы этих работ также пришли к.выводу о том, что трансфицированные hTERT культуры обладают свойствами исходных клеток, не теряя способностей к дифференцировкам. Более того, существуют данные о том, что теломеризованные клетки не только сохраняют, но и приобретают более выраженную способность к остеогенной

дифференцировке, по сравнению с контрольными клетками (Jun et al., 2004; Kang et al., 2004).

3. Сохранение теломеразной активности.

Важной характеристикой иммортализованной культуры является сохранение теломеразной активности в трансфицированных клетках на протяжении длительного времени. Одной из проблем, связанных с экспериментами, в которых используется ретровирусная трансфекция генов, является то, что очень часто клетки через некоторое время после селекции и отбора подавляют экспрессию введенного гена.

Эксперимент с использованием метода TRAP, показал, что даже на момент 100 УП после начала эксперимента иммортализованная культура NSC-lenti-hTERT сохранила экспрессию гена hTERT на достаточно высоком уровне в отличие от контрольной культуры NSC, находившейся на уровне 38 УП, и показавшей полное отсутствие теломеразной активности. Данный результат может свидетельствовать в пользу того, что клетки с экспрессирующейся теломеразой получают преимущество в росте и могут в результате собственной положительной селекции занять доминирующее положение внутри первичной культуры после трансфекции геном. Этим же можно объяснить и сохранение экспрессии на протяжении всего времени культивирования (560 дней в культуре).

4. Стабильность кариотипа, сохранение способностей к контактному торможению и способности к остановке пролиферации в условиях сывороточного голодания.

Сохранение стабильного диплоидного кариотипа является важной характеристикой нормальных, незлокачественных клеток человека. Наличие хромосомных аберраций являются одной из черт раковой прогрессии, поскольку процессы онкотрансформации вынуждают раковые клетки перестраивать геном. Если предположить, что введенная теломераза вызывает злокачественные изменения, то такие клетки должны иметь геномные перестройки или находится в процессе изменения кариотипа. Чтобы проверить, не имеют ли иммортализованные клетки NSC-lenti-AJ'£'/?7' хромосомных аберраций, мы провели кариотипический анализ.

Результаты анализа показали, что экспрессия теломеразы не вызвала появления хромосомных аберраций, свойственных раковым клеткам. Учитывая тот факт, что одним из распространенных сценариев хромосомных перестроек является теломерные слияния и что многие авторы полагают, что одними из функций нормальных теломер со стандартной конфигурацией является защита от слияния (Zakian et al., 1989, Counter et al., 1992), то можно говорить о том, что экспрессия теломеразы стабилизирует и укрепляет геном.

Клетки NSC-Ienti-A7,£7?7'в нашем эксперименте прошли более 100 УП, что в 2,5 раза превысило пролиферативный потенциал исходных клеток. Сохранение скорости роста за этот период, также служит доказательством отсутствия наследуемых генетических изменений в этих клетках, так как

трансформированные клетки, склонные к накоплению мутаций, обычно ускоряют рост по мере деления в культуре (Vogelstein and Kinzler, 1993).

Одним из основных признаков злокачественно трансформированных клеток в культуре является потеря у них способности к контактному торможению пролиферации (Rifkin, 1979) и переходу в состояние покоя в условиях сывороточного голодания. Эксперименты, проведенные с клетками теломеризованной культуры BMSCS-lenti-ArfiTir и опухолевыми клетками ТК-164 показали, что теломеризованные клетки в отличие от опухолевых клеток сохраняют способность к контактному торможению и способность переходить в покой при сывороточном голодании. Эти факты хорошо сочетается опубликованными нами ранее сведениями об усиленном контроле пролиферации в теломеризованных клетках (Егоров и др., 2007).

ВЫВОДЫ

1. С помощью введения гена каталитического компонента теломеразы человека (ЬТЕИТ) был иммортализован ряд культур стволовых и прогениторных клеток человека:

а) нейральные стволовые клетки

б) мезенхимальные стромальиые клетки из костного мозга

в) мезенхимальные стромальиые клетки из губчатой кости

г) мезенхимальные стромальиые клетки из жировой ткани

2. Иммортализованные нейральные стволовые клетки сохраняют экспрессию нестина, способны образовывать нейросферы и дифференцироваться в нейрональном и глиальном направлениях. На уровне 100 УП эти клетки сохраняют теломеразную активность и нормальный диплоидный кариотип.

3. Иммортализованные мезенхимальные стромальиые клетки сохраняют способность к дифференцировке в остеогенном и адипогенном направлениях также как и исходные клетки.

4. Иммортализованные введением гена ЬТЕИТ мезенхимальные стромальиые клетки из губчатой кости сохраняют способность к контактному торможению и переходу в покой в условиях сывороточного голодания.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи:

1. Dashinimaev Е.В., Vishnyakova K.S., Popov K.V., Yegorov Y.E. Stable culture of hTERT-transduced human embryonic neural stem cells holds all the features of primary Culture // Electronic Journal of Biology. 2008. vol.4, no.2: 93-96.

2. Молдавер M.B, Дашинимаев Э.Б., П.М.Чумаков, Х.С. Вишнякова, Е.Е. Егоров. Влияние кислорода на теломеризованные клетки разного типа, полученные от одного донора // Биомембраны. 2007. Т. 24, №5. С. 388-398.

3. Егоров Е.Е., Молдавер М.В., Вишнякова Х.С., Терехов С.М., Дашинимаев Э.Б., Чеглаков И.Б., Торопыгин И.Ю., Ярыгин К.Н., Чумаков П.М., Корочкин Л.И., Антонова Г.А., Рыбалкина Е.Ю., Сабурина И.Н., Бурнаевский Н.С., Зеленин A.B. Усиление контроля пролиферации в теломеризованых клетках // Онтогенез. 2007. Т.38, №2. С 105-19.

Тезисы конференций:

1. Егоров Е.Е., Дашинимаев Э.Б., Молдавер М.В., Вишнякова Х.С, Терехов С.М, Чеглаков И.Б., Ярыгин К.Н., Антонова Г.А,, Корочкин Л.И., Зеленин A.B. Иммортализация различных клеток человека с помощью введения гена каталитического компонента теломеразы // Всероссийская конференция «Перспективы фундаментальной геронтологии». Санкт-Петербург, 2006. Тезисы докладов. С. 38-39.

2) Дашинимаев Э.Б., Егоров Е.Е., Сабурина И.Н., Вишнякова Х.С. Иммортализация эмбриональных нейральных стволовых клеток человека с помощью введения гена каталитического компонента теломеразы // 50-ая научная конференция МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук». Москва-Долгопрудный, 2007. Тезисы докладов. С. 56 -57.

3) Дашинимаев Э.Б., Егоров Е.Е., Вишнякова Х.С. Иммортализация нейральных стволовых клеток человека с помощью введения гена каталитического компонента теломеразы // V-ая Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Вестник Российской академии медицинских наук. 2008. Т№6. С.125.

Заказ № 36/12/2008 Подписано в печать 25.12.2008 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (499) 794-23-19; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дашинимаев, Эрдэм Баирович

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Культуры клеток.

1.1 Мезенхимальные стромальные клетки костного мозга человека, культура XI.

1.2 Клетки стромы губчатой кости человека, культура BMSCS.

1.3 Мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека, культура LA.

1.4 Фетальные нейральные стволовые клетки человека, культура NSC

1.5 Клетки линии ТК

2. Введение гена каталитического компонента теломеразы при помощи лентивирусного вектора.

3. Дифференцировка клеток и методы регистрации.

3.1 Дифференцировка в адипогенном направлении и специфическое окрашивание.

3.2 Дифференциовка в остеогенном направлении и специфическое окрашивание.

3.3 Иммуноцитохимия.

3.4 Выявление белкового компонента теломеразы in situ

3.5 Доверительные интервалы (погрешности)

4. Изучение кариотипа.

4.1 Приготовление хромосомных препаратов из митотических клеток человека

4.2 Дифференциальное R-окрашивание хромосом.

5. Определение экспрессии генов методом ОТ-ПЦР.

5.1 Выделение РНК

5.2 Реакция обратной транскрипции и ПЦР.

5.3 Использованные в работе праймеры

6. Определение теломеразной активности.

6.1 Приготовление клеточного экстракта

6.2 Реакция TRAP и PAG-электрофорез

7. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) теломерного повтора на хромосомах человека.

8. Тест на наличие контактного торможения пролиферации и реакции на сывороточное голодание.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Введение гена hTERT в мезенхимальные стволовые клетки (МСК) человека, полученные из различных типов тканей и исследование их дифференцировочного потенциала.

1.1 Стромальные клетки костного мозга человека, культуры XI и Xl-lenti-hTERT

1.2 Клетки стромы губчатой кости человека, культуры BMSCS и BMSCS-lenti-hTERT.

1.3 Стромальные клетки жировой ткани человека, культуры LA и LA-lenti-hTERT

1.4 Тест на наличие контактного торможения и реакцию на сывороточное голодание, клеток BMSCS-lenti-hTERT.

2. Введение гена hTERT в нейральные стволовые клетки человека (НСК) и исследование свойств полученной линии.

2.1 Клетки NSC и NSC-lenti-hTERT.

2.2 Иммуногистохимическое исследование экспрессии маркеров дифференцировки.

2.3 Определение экспрессии маркеров дифференцировки методом ОТ-ПЦР.

2.4 Нейросферы, полученные из NSC и NSC-lenti-hTERT

2.5 Образование колоний разной морфологии.

2.6 Кариотипирование культуры NSC-lenti-hTERT.

2.7 Определение теломеразной активности методом TRAP.

2.8 Качественный анализ величины теломер клеток NSC4-lenti-hTERT.

2.9 Определение теломеразной активности иммуногистохимическим методом.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

2. Сохранение механизмов дифференцировки в иммортализованных культурах клеток.

3. Сохранение теломеразной активности.

4. Стабильность кариотипа, сохранение способностей к контактному торможению и сохранение способности к переходу в пролиферативный покой в условиях сывороточного голодания.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Введение гена каталитического компонента теломеразы (hTERT) в клетки с различным дифференцировочным потенциалом"

В настоящее время одним из самых перспективных и развивающихся направлений в медицине являются клеточно-замещающие технологии -клеточные трансплантации и тканевая инженерия. Эти технологии применяются для лечения заболеваний связанных с повреждением или дегенерацией различных типов тканей, например ожоги, инсульты, ишемии, травмы спинного мозга, нейродегенеративные болезни -синдромы Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Предполагается, что в качестве замещающего материала наиболее оптимальным будет использование стволовых клеток, то есть клеток способных дифференцироваться в клетки различных типов тканей.

Во избежание иммунных конфликтов для подобного рода трансплантаций наиболее целесообразно использовать аутологичные стволовые клетки человека. Поэтому в настоящий момент во всем мире проводится очень много исследований, связанных с поиском способов получения, культивирования и наращивания аутологичного донорского клеточного материала in vitro, изучением механизмов дифференцировки, способов создания специфичных тканевых трансплантатов для их дальнейшего использования в медицине.

Одной из главных проблем, связанных с культивированием стволовых клеток in vitro является то, что практически все первичные культуры клеток, получаемые из тканей взрослого человека имеют ограниченный пролиферативный потенциал и быстро теряют способность к дифференцировке.

В то же время, множество работ во всем мире, в том числе и в нашей лаборатории, показали, что введение в культивируемые клетки гена каталитического компонента теломеразы hTERT, восстанавливает теломеразную активность внутри клетки, стабилизирует теломерные участки хромосом и увеличивает время жизни клеток в культуре, позволяя получать иммортализованные клеточные линии. Полученные при этом теломеризованные клетки, как правило, сохраняют нормальные механизмы регуляции пролиферации.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании возможности получения иммортализованных линий стволовых клеток при помощи введения гена каталитического компонента теломеразы и проследить каким образом может влиять экспрессия гена hTERT на способности теломеризованных клеток к дифференцировке.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Проблема концевой недорепликации, структура и функции теломер

С начала XX века в биологии доминировало мнение, что клетки многоклеточных организмов иммортальны, то есть способны к бесконечно долгой пролиферации. Этому способствовали успешные работы, авторы которых доказывали бессмертие клеток, культивируя их в течении долгого периода времени. Например, Каррель и его сотрудники (Carrel, 1912) культивировали фибробласты из сердца куриного эмбриона в течение 34 лет. Клетки асцитной опухоли культивировали в перитонеальных полостях крыс в течение многих лет (Вильсон, 1936).

Однако, наряду с такими успешными опытами, появлялось все больше и больше работ, сделанных в основном на клетках человека, авторы которых наблюдали плавное угасание пролиферации клеток в культуре. В 1961 г. Хейфлик опубликовал результаты своих многолетних наблюдений, указывавшие на закономерности ограничения пролиферации в его опытах (Hayflick and Moorhead, 1961). Оказалось, что культуры диплоидных фибробластов человека (ДФЧ) способны расти только более или менее определенное количество пересевов, порядка 50, после чего клетки дегенерируют.

Жизнь клеток в культуре была разделена Хейфликом на три фазы (рис.1) : фаза I представляет собой становление популяции in vitro, фаза II - период последовательных пассажей и экспоненциального роста числа клеток, фаза III - фаза истощения пролиферативного потенциала. Длительность фазы I — это время, необходимое для образования первого сомкнутого монослоя, т.е. до первого субкультивирования. Продолжительность фазы II в течение, которого клетки стабильно делятся, определяется не временем, которое клетки провели в культуре, а числом произведенных удвоений популяции (УП). Для клеток человека, как было указано выше, это число составляет около 50УП. Максимально число УП, которое большинство соматических клеток может проделать в культуре, было названо «пределом Хейфлика». Важно иметь в виду, что приведенная цифра 50+/- 10 относится не к максимальному числу делений клетки в культуре, а к усредненному числу УП культивируемых клеток. Это число обычно определяет следующим простым, но далеко не точным способом. После того как клетки образуют монослой на дне культурального флакона, их рассаживают в два таких же флакона, когда дно этих флаконов заполнится, проводят следующий пересев также с уменьшением плотности клеток и так далее (Михельсон, 1984). Таким образом, между каждыми двумя пересевами (пассажами) число клеток удваивается, то есть в среднем каждая клетка делится при этом один раз. Между тем известно, что часть клеток гибнет при каждом пересеве; кроме того, не все клетки, пережившие пересев, делятся при каждом субкультивировании.

О Z 4- fi # /0 72 Яремя, /утес

Рис. 1. Графическое изображение фаз пролиферации ЭФЧв культуре (согласно

Hayflick, Moorhead, 1961)

Лассажи

0 ГО 20 30 40 SO

1-1-1-1 Г~р г

Фаза Ж 1

В конце фазы II время, необходимое для образования сомкнутого монослоя после каждого субкультивирования, постепенно увеличивается, митозов становится меньше, в клетках начинаются дегенеративные процессы.

Главным критерием вступления культуры клеток в фазу III является исчезновение митозов. Кроме того, наступление фазы III сопровождается накоплением цитоплазматических включений, укрупнением клеток и увеличением степени их распластывания. Следует отметить, что уменьшение числа митозов и вышеназванные дегенеративные изменения клеток в культуре происходят не вдруг, а нарастают постепенно, с течением времени. После прекращения делений, клетки еще некоторое время остаются метаболически активными, после чего неделящиеся клетки спонтанно дегенерируют, переживая в стационарных культурах, длительное время (Matsumura et al., 1979). Все попытки избежать фазы III путем изменения состава культуральной среды или условий культивирования не увенчались успехом.

Таким образом, после появления работ Хейфлика все клеточные культуры можно было разделить на две группы: с ограниченным пролиферативным потенциалом (смертные или мортальные) и бессмертные (иммортальные).

Помимо ограниченного пролиферативного потенциала, опыты Хейфлика показали, что в ряде клеток существует некий счетчик, обуславливающий верхний предел для количества деления для данной клетки. После того, как в общих чертах стали ясны механизмы синтеза ДНК, появилась гипотеза, предлагающая механизм работы такого счетчика. В 1971 г. А. М. Оловников предположил, что ДНК-полимераза не в состоянии полностью реплицировать линейную матрицу, поэтому реплика получается всегда короче в начальной ее части (Оловников, 1971), (рис. 2). Постепенное укорачивание ДНК (недорепликация) ограничивает пролиферативный потенциал клеток и может служить основой "счетчика" клеточных делений.

1т

3'7 5

I Л

3 lm „»

Рис. 2. Схема маргипотомической редупликации ДНК (по Оловникову, 1971, с изменениями). а — молекула полимеразы, зачернен каталитический центр, 1т —длина маргинотомии, т.е. расстояние от конца молекулы фермента до его активного центра; Ь - матричная цепь, с — реплика. Стадии репликации: I — "посадка" фермента на край матрицы, II— дочерняя цепь со стороны 5 '-конца оказывается короче матрицы на 1т.

Гипотеза Оловникова оставалась умозрительной, пока в 1985 г. Грейдер и Блекборн не обнаружили теломеразу. Выяснилось, что концы линейных хромосом простейшего Tetrahymena, образованы короткой, тандемно повторяющейся последовательностью ДНК (TTGGGG), которую синтезирует специальная РНК-зависимая обратная транскриптаза (теломераза), имеющая постоянно ассоциированную с ней РНК-матрицу (Greider and Blackburn, 1985).

Подавляющее большинство изученных на сегодня хромосом имеют на конце многократно повторяющуюся монотонную последовательность. Это так называемый теломерный повтор. Субъединицей повтора обычно бывает последовательность длиной от 5 до 8 нуклеотидов. Теломерный повтор - удивительно консервативная в эволюции структура (см. таблицу

1). Хромосомы всех позвоночных оканчиваются последовательностью TTAGGG, повторенной сотни и тысячи раз (Meyne et al., 1990). Удивительно, но теломерная последовательность TTAGGG встречается также у некоторых представителей членистоногих, червей и даже трипаносом (см. таблицу 1). Очень похожие теломерные последовательности имеются у большинства растений TTTAGGG, у части насекомых TTAGG и нематод TTAGGC.

У многих видов теломерные последовательности встречаются не только на концах хромосом, но могут быть расположены и во внутренних областях хромосомы. Например, у китайского хомячка (Cricetulus griseus) в геноме имеется 18 районов теломерных повторов внутри хромосом. Они расположены перицентромерно, по длине значительно превосходя теломерные повторы на концах хромосом (Slijpcevic and Hande, 1999). Хотя обычно внутренние теломерные повторы локализованы в перицентромерных областях (Slijpcevic and Hande, 1999; Meyne et al., 1990, de la Sena et al., 1995), в некоторых случаях они локализуются в областях ядрышкового организатора или около него (Meyne et al., 1990, de la Sena et al., 1995; Salvadori et al., 1995; Abuin et al., 1996). Происхождение и функции внутренних повторов не ясны. Наиболее распространено мнение, что их появление связано с хромосомными перестройками и поэтому отражает эволюцию кариотипа (Ijdo et al., 1991; Vermeesch et al., 1996).

Длина теломерных повторов широко варьируется у различных организмов. У человека она составляет 10-15 T.n.H.(de Lange et al., 1990), у мышей длина теломер различна у разных видов: у вида Mus musculus она примерно равна 50 т.п.н, в то время как у вида Mus spretus - около 5 т.п.н. (de Lange, 1996).

Особые теломерные повторы, состоящие из очень крупных субъединиц (сотни и тысячи нуклеотидов) имеются у хирономид

Chironomus), у некоторых лилейных (лук) и у ряда двукрылых (дрозофила).

Таблица 1. Разнообразие теломерной ДНК.

Структура субъединицы теломерного повтора Организм Ссылки

TTAGGG Все позвоночные Physarum polycephalum Didimium iridis Trypanosoma brucei Два вида класса Polychaeta Некоторые муравьи Ракообразное Asellus aquaticus Meyne et al., 1989 Coren et al., 1991 Forney etal., 1987, Van der Ploeg et al., 1984 Jhaetal., 1995 Meyne et al., 1995 Pelliccia et al., 1994

TTTAGGG Большинство растений: Arabidopsis thaliana, рожь, Кукуруза, ячмень, пшеница Werner etal., 1992

TTAGG Большинство насекомых некоторые ракообразные Okasaki et al., 1993 Sahara et al., 1999

TTAGGC Нематоды Caenorhabditis elegans Magnenat et al., 1999 Wicky etal., 1996

TT(T/A)AGGG Томат Ganal etal., 1991

TT(C/T)AGGG Plasmodium falciparum Blackburn, 1991

TTGGGG Tetrahymena thermophila Blackburn, 1991

TTTTGGGG Euplotes crassus Blackburn, 1991

TTGCA Parascaris univalens Teschke et al., 1991

G,.gA Dictyostelium discoideum Blackburn, 1991

TG2.3(TG),.6 Saccharomyces cerevisiae Shampay et al., 1984

TCTGGGTG и TCTGGG(TG) Saccharomyces castellii Cohn and Blackburn, 1995

Повтор 26 нуклеотидов Saccharomyces kluyveri Cohn and Blackburn, 1995

Повтор 53 нуклеотида Tetrahymena thermophila (митохондриальная ДНК) Morin and Cech, 1986

Повтор 340 нуклеотидов Chironomus pallidivittatus Kamnert et al., 1998

Повтор 350 нуклеотидов Chironomus tentans Kamnert et al., 1998

Повтор 375 нуклеотидов Лук (Allium сера) и некоторые лилейные Pich and Schubert, 1998

Повторы ретротранспозонов НеТ-А (~6 kb) и TART (-10 kb) Drosophila melanogaster Biessmanet al., 1990 Levis et al., 1993

Теломеры играют важную роль в жизнедеятельности клеток: 1) Теломеры выполняю защитную функцию: они кэпируют концы линейных эукариотических хромосом и стабилизируют их. Когда хромосома разорвана или лишена полноценной теломеры, бестеломерные концы хромосом претерпевают либо слияние, либо деградацию (McClintock, 1941). Клетки реагируют на разорванные хромосомы или на укороченные теломеры как на поврежденную ДНК (McEachern and Blackburn, 1996). Таким образом, теломеры защищают концы хромосом от деградации, слияний и рекомбинационных процессов (McClintock, 1941). 2) Теломеры участвуют в процессе старения, связанной с проблемой недорепликации. У большинства прокариотических организмов не существуют проблемы недорепликации, так как их хромосомы кольцевые. Эукариоты выработали новое решение проблемы концевой недорепликации, при которой специализированные концевые структуры хромосом - теломеры -содержат повторы, некоторые из которых теряются при каждом цикле репликации. Потеря этих последовательностей, в которой нет информации, содержащейся в генах, расположенных ниже, работает как буфер, защищающий эти гены, от потери при каждой репликации ДНК.

Особый интерес в структуре теломер представляет их самая дистальная часть. Двойная спираль ДНК не доходит до самого конца, 5'-цепь обрывается и остается одноцепочечный G-богатый участок. Это свойственно всем теломерам, содержащим теломерные повторы, начиная от простейших и до человека. Длина одноцепочечного 3' конца варьирует от 10-16 нуклеотидов у простейших (Oka et al., 1980; Klobutcher et al., 1981; Henderson and Blackburn, 1989), до нескольких сотен нуклеотидов у человека (Makarov et al., 1997). Стоит отметить, что свободный З'-конец имеется как в клетках с функционирующей теломеразой, так и без нее (Makarov et al., 1997). Поэтому его наличие невозможно объяснить деятельностью теломеразы.

Наличие одноцепочечного фрагмента на каждой теломере означает, что его формирование идет путем деградации 5'-конца. Совсем недавно показано, что длина одноцепочечного участка коррелирует со скоростью недорепликации (Huffman et al., 2000), что свидетельствует в пользу того, что деградация 5' конца не вносит заметного вклада в укорачивание теломер. И, наконец, показано, что длина З'-конца может меняться в процессе развития у растений: его длина различна в разных тканях (Riha et al., 2000).

Конформация одноцепочечного 3'-конца привлекает внимание исследователей, исходя из термодинамических особенностей последовательности, содержащей повторяющиеся кластеры GGG. Расчеты показывают, что такая последовательность может легко образовывать неканонические структуры (триплексы, квадруплексы). Реальным подтверждением возможности существования такой структуры явились опыты Де Ланж и сотр. (Griffith et al., 1999).

На основании анализа вероятности появления ковалентных сшивок между нитями ДНК была создана модель теломерных петель, (рис. 3).

ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЙ З'-КОНЕЦ ДНК

3' 5

ИЗБЫТОК TRF1 и TRF2

СВЯЗЫВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ БЕЛКОВ

СВЯЗЫВАНИЕ TRF2

Рис. 3. Схема строения теломеры согласно Griffith et al. (1999).

По этой модели свободный 3'-конец, в комплексе с белками вступает во взаимодействие с двойной спиралью теломерной ДНК и вытесняет одну из цепей (образуется тройной комплекс цепей ДНК). Вытесненная цепь образует D-loop (вытесненную петлю (D - displace)), а сама теломера при этом образует теломерную петлю (t-loop). По данным авторов, длина теломерной петли коррелирует с длиной теломер, измеренной I независимыми методами. Модель оставляет необъясненным, каким образом D-loop образуется именно в начале теломерной последовательности.

Одноцепочечная G-богатая теломерная последовательность способна образовывать внутрицепочечные и межмолекулярные квадруплексы. Разнообразные соединения, взаимодействующие с квадруплексами in vitro, стабилизирующие их, подавляют теломеразную активность (Mergny et al., 1999; Han and Hurley, 2000; Kerwin, 2000; Hurley et al., 2000), в том числе и в клетках (Izbicka et al., 1999). Обнаружен фермент гираза, специфически разрушающий квадруплексы (Sun et al., 1998). Мутации этой гиразы вызывают заболевание, носящее название синдром Блюма, характеризующееся целым спектром изменений, начиная от специфических хромосомных перестроек и заканчивая внешним видом больных. Существование таких белков доказывает, что ДНК в теломерах может иметь самую необычную конформацию и эта конформация существенным образом влияет на функционирование всей клетки.

II. Фермент теломераза, и ее функция в клетке

Теломераза - это рибонуклеиновый фермент. РНК-компонент теломеразы содержит короткую матрицу, комплементарную одному повтору (часто матрица бывает длинней, чем один повтор) G-богатой цепи теломерной ДНК (Blasco et al., 1995).

Механизм действия теломеразы - повторное копирование матрицы, включающее этап элонгации, когда дезоксирибонуклеотиды последовательно добавляются к З'-концу G-богатой цепи теломеры и транслокации фермента на конец новообразованной цепи (рис. 4.) В результате действия теломеразы образуется достаточно длинный 3-конец, по которому затем достраивается комплементарная цепь. В итоге теломера становится длиннее. теломера этап присоединения нуклеотидов показаны желтым) к З'-концу тепомерной ДНК (показан синим)

5* в соответствии с матрицей (показана красным) hTR (ЭЛОНГАЦИЯ)

3' одноцепочечный G-богатый конец ДНК перемещение теломеразы иненный З'-конец теломерной ДНК ТРАНСЛОКАЦИЯ) повтор элонгации

Рис. 4. Схема действия теломеразы, hTERT- белковый компонент, hTR —РНКкомпонент.

РНК-компонент теломеразы человека составляет 430 н. в длину, и экспрессируется в большинстве клеток человека, независимо от теломеразной активности (Feng et al., 1995, Avilion et al., 1996, Chen et al., 2000) (рис. 5.) . Интересным фактом является то что, матричный район в мышиной РНК составляет всего 8 нуклеотидов, а в РНК человека 11 нуклеотидов, несмотря на то, что обе они кодируют одну и ту же последовательность. Таким образом, было выяснено, что матрица длинее чем один теломерный повтор (Blasco et al., 1995).

РНК-компоненты теломеразы из разных организмов довольно сильно отличаются, как по первичной структуре, таки по длине. Даже у таких эволюционно близких видов как мышь и человек гомология составляет всего 65% (Blasco et al., 1995). Тем не менее консервативность РНК довольно высока на уровне вторичной структуры (Romero and Blackburn, 1991). Относительно хорошо изучены вторичные структуры РНК теломеразы простейших (в основном тетрахимен) и позвоночных (Romero and Blackburn, 1991, Chen et al., 2000). На основе сравнительного филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей и компьютерного моделирования укладки цепи этих РНК, была предложена схема их эволюции (Chen et al., 2000). Основными элементами этой структуры являются несколько шпилек и довольно протяженный одноцепочечный участок, содержащий матрицу для синтеза РНК.

Рис. 5. Вторичная структура РНК-компонента теломеразы человека (согласно

Теломераза была обнаружена в большинстве исследованных видов эукариот, имеющих линейные хромосомы. В 1997 году были клонированы гены РНК-компонента теломеразы (Feng et al., 1997) и ген каталитической белковой субъединицы теломеразы человека (Nakamura et al., 1997, Meyerson et al., 1997). В конце этого же года удалось реконструировать теломеразную активность в лизате клеток. Оказалось, что для этого

Chen et al., 2000). достаточно присутствие двух компонентов — каталитического компонента теломеразы (hTERT) и РНК-компонента (hTR) (Weinrich et al., 1997).

В соответствии с теорией Оловникова, теломеразная активность (ТАК) должна присутствовать в клетках половой линии и раковых клетках. Действительно, теломераза активна в половых и в ряде стволовых клеток, но не активна в большинстве соматических клеток (Harley, 1991, Harley et al., 1990). На определенной стадии развития, приходящейся на ранний эмбриогенез, происходит выключение гена, теломеразы в подавляющем большинстве соматических клеток человека. Выключение теломеразного гена есть этап онтогенеза, совершающийся в определенный момент жизни организма и не во всех типах клеток. ТАК была обнаружена в некоторых соматических клетках костного мозга, лейкоцитах периферической крови, в Т- и В- лимфоцитах (Zhang et al., 1996, Weng et al., 1996., Igarashi and Sakaguchi, 1996), в семенниках, эпидермисе кожи и эпидермисе шейки матки (Pao et al., 1997, Kyo et al., 1997) в клетках нижней части крипт толстой кишки (Kuniyasu, 1997), в клетках эндометрия матки (Kyo et al., 1997, Saito et al., 1997). Все эти ткани характеризуются высокими темпами обновления. Важно отметить, что ТАК в пересчете на одну клетку в этих нормальных популяциях существенно ниже, чем в популяциях раковых клеток (Wright et al., 1996). Теломеразная активность детектируется у многих иммортальных клеточных культур, например, ТАК была обнаружена в экстрактах опухолевых иммортальных клеток человека линии HeLa (Morin, 1989), и затем еще в других опухолевых культурах. Было примерно подсчитано, что ТАК присутствует в 85% различных опухолевых клеток (Kim et al., 1994). Кроме того, оказалось, что в большинстве раковых клеток теломеры довольно короткие, обычно короче тех, которые имеют место в клетках тех тканей, из которых они возникли (Counter et al., 1992, Shay and Wright, 1996, Hastie et al., 1990).

Поскольку примерно 85% опухолей человека обладают теломеразной активностью, то можно утверждать, что активация теломеразы участвует в онкогенезе. Следовательно, увеличение надежности репрессии этого фермента должно резко уменьшать вероятность развития опухоли. Можно предположить, что особенности регуляции теломеразы у человека связаны с тем, что репрессия теломеразы имеет еще одну функцию - защиту от опухолей.

Если полагать, что клетки человека способны в среднем на 50 удвоений, то из одной клетки может образоваться 2-1050 клеток, которые будут весить около 1000 кг. Очевидно, что при весе опухоли в 1т говорить о защите организма поздно. Однако, на самом деле, такой расчет неверен. Эпидемиологическая статистика позволила рассчитать, что в среднем для превращения нормальной клетки в опухолевую требуется от трех до семи независимых случайных событий (Альберте, 1994). Таким образом, при развитии опухоли происходит несколько этапов клонирования. Если положить, что в среднем частота мутаций 1 на 106 клеток, то каждое такое событие потребует примерно 20 генераций (220 ~ 106). Значит, для образования опухоли потребуется в среднем от 60 до 140 генераций. Как видно, ограничения в 50 удвоений вполне достаточно для остановки роста большинства опухолей на еще не диагностируемых стадиях. Кроме того, посылка о том, что клетка организма способна в среднем на 50 делений, сомнительна, поскольку к такому количеству делений способна только малая доля клеток. К сожалению, трудно установить пролиферативный потенциал отдельных клеток в составе организма. Опыты, проведенные в культуре клеток, свидетельствуют, что даже внутри одного клона клеток существует огромная гетерогенность клеток по пролиферативному потенциалу.

Частота спонтанной реактивации теломеразы в диплоидных фибробластах человека, трансформированных вирусом SV40, после прохождения ими дополнительных раундов репликации, составляет 3*10"7-5*10"8 (Shay and Wright, 1996). В нормальных ^трансформированных фибробластах человека спонтанная реактивация теломеразы (иммортализация) настолько редка, что, подобные случаи невоспроизводимы. Столь низкая вероятность указывает на то, что, скорее всего, реактивация теломеразы требует как минимум двух мутационных событий.

Все воспроизводимые случаи иммортализации фибробластов человека в культуре происходят после того, как клетки пройдут дополнительные раунды репликации, а это значит, что реактивации теломеразы предшествует чрезмерное укорачивание теломер.

Возможной причиной увеличения вероятности реактивации теломеразы при чрезмерном укорачивании теломер является резкое увеличение генетической нестабильности хромосом с короткими теломерами.

Учитывая все вышесказанное, можно предположить (Егоров, 1997), что, в большинстве случаев, первым шагом при канцерогенезе является не реактивация теломеразы, но другие события, позволяющие клетке, прежде всего, получить селективное преимущество в росте. В пользу этой возможности свидетельствует также тот факт, что теломеры опухолевых клеток с реактивированной теломеразой почти всегда короче, чем теломеры из окружающей опухоль нормальной ткани.

Была показана возможность моделирования процесса опухолеобразования, при котором активация теломеразы не является первым событием. В присутствии азидотимидина или карбовира (ингибиторы обратных транскриптаз, воздействующие также и на теломеразу) спонтанная трансформация эмбриональных фибробластов мыши ведет к образованию клонов клеток без теломеразной активности (Yegorov et al., 1996).

Как уже указывалось выше, без активации теломеразы большинство опухолей не могло бы достигать стадий, опасных для здоровья. Можно поэтому полагать, что подавление теломеразной активности, начатое вовремя, могло бы помочь большинству онкологических больных.

В зависимости от вида опухоли можно ожидать, по крайней мере, два типа реакций опухолевых клеток на угнетение функции теломеразы. Если в клетках сохранены механизмы, способные останавливать пролиферацию при достижении теломерами некой малой длины, можно ожидать замедления пролиферации, укрупнения клеток, их перехода в состояние покоя и длительного переживания в этом состоянии. Если в клетках отсутствуют такие механизмы (исчезли в процессе онкогенеза), то действие препарата вызовет чрезмерное укорачивание теломер, за которым последует массированная гибель и многократное увеличение изменчивости оставшихся клеток. Повышенная изменчивость клеток может оказаться причиной появления устойчивости к препарату и увеличения злокачественности (Егоров, 1997). Это может ограничить применение таких препаратов.

Другим серьезным минусом антителомеразной терапии является относительно большой латентный период от момента начала лечения до наступления эффекта. Опыты по подавлению теломеразы в культуре клеток почти однозначно подтверждают это. Постоянная экспрессия антисмысловой конструкции против РНК-вого компонента теломеразы приводит к гибели клетки HeLa примерно через 25 удвоений популяции (УП) (Feng et al., 1995). Такая же процедура, проведенная с клетками злокачественной глиомы, приводит к частичной дифференцировке или апоптозу через 30 УП. Катехины зеленого чая, которые подавляют теломеразную активность в опухолевых клетках человека U-937 и НТ-29 в культуре, вызывали их старение через 35 и 60 УП, соответственно (Naasani et al., 1998). В работе Кондо и др. (Kondo et al., 1998b) был получен быстрый эффект: путем специфической активации РНКазы L вызывали деградацию теломеразной РНК в клетках злокачественной глиомы человека; при этом происходила быстрая индукция апоптоза.

Учитывая запаздывающую диагностику опухолей, эффект может быть менее значителен. Однако, принимая во внимание короткие опухолевые теломеры, можно ожидать, что подавление теломеразной активности окажет относительно быстрое действие.

III. Иммортализация клеток.

В конце 1997 г. после того как удалось реконструировать теломеразную активность в лизате клеток, следующим шагом было введение hTERT в клетки человека. Уже давно известно, что РНК-компонент экспрессируется в большинстве клеток человека независимо от теломеразной активности (Feng et al., 1995; Avilion et al., 1996). Поэтому после трансфекции клеток человека геном hTERT в них появилась теломеразная активность (Bodnar et al., 1998; Vaziri andBenchimol, 1998).

Введенная теломераза обладала способностью поддерживать длину теломер, пролиферация клеток перестала угасать со временем и, по всей видимости, клетки стали иммортальными. Опыты, проведенные другими группами ученых, подтвердили эти результаты (Nakayama et al., 1998). Полученные данные можно суммировать следующим образом. Введение теломеразы - "теломеризация" клеток - может приводить: к стабилизации длины теломер (результат должен зависеть, по крайней мере, от эффективности работы промотора - возможна частичная компенсация недорепликации, полная компенсация и даже удлинение теломер) и к приобретению клетками способности к неограниченному размножению. В результате "теломеризации" клетки не приобретают никаких признаков злокачественной трансформации (независимость роста от прикрепления к субстрату, от наличия сыворотки, от клеточной плотности, способность к росту в полужидком агаре), а кариотип клеток остается стабильным, как в культурах диплоидных фибробластов человека.

Таким образом, теломерная теория старения клеток получила всестороннее признание.

Для объяснения процессов иммортализации клеток человека в процессе канцерогенеза была предложена М1-М2 гипотеза (Wrigh et al., 1989; Shay et al., 1993) (рис. 6). Согласно этой гипотезе, для иммортализации клеткам необходимо преодолеть два различных механизма, ограничивающих пролиферацию. Первый механизм (Ml) включается, когда длина теломер достигает некоего минимума. Именно Ml ответственен за старение клеток в культуре (предел Хейфлика). иммортализация репрессия теломеразы] нормальный рост клеток| стабилизиция теломер г'' теломеразная активность опухоль

Рис. 6. М1-М2 теория иммортализации клеток человека.

До сих пор не ясно, каким образом запускается Ml, поскольку длина теломер при этом составляет несколько тысяч нуклеотидов (Shay et al., 1993). По одной гипотезе, относительно короткие теломеры способны служить в качестве сигнала повреждения ДНК (Levy et al., 1992). По другой, - укорачивание теломер изменяет экспрессию регуляторных генов, локализованных в субтеломерном гетерохроматине (Wright and Shay, 1992а).

Белки различных опухолевых ДНК-содержащих вирусов способны увеличивать пролиферативный потенциал клеток человека, и тем самым, обходить (отменять) Ml. Этими свойствами обладают Т-антиген SV40, антигены Е6/Е7 вируса папилломы человека типа 16, антигены Е1а/Е1в аденовируса типа 5 (Wright and Shay, 1992b).

Различными способами показано, что в реализации Ml участвуют белки р53 и pRb или pRb-подобная активность (Нага et al., 1991; Shay et al., 1991). В эпителиальных клетках человека Ml менее надежен, чем в фибробластах; в его реализации не участвует pRb (Shay et al., 1993; Gollahon and Shay, 1996). Вероятно, пролиферативный блок при Ml опосредуется факторами типа р21, которые подавляют активность комплексов циклин/cdK (Sherr and Roberts, 1995).

Отмена Ml позволяет клеткам пролиферировать дополнительное время (для фибробластов человека - около 30-40 удвоений популяции), пока второй механизм (М2) не вызовет состояние кризиса. Кризис характеризуется процессом пролиферации, сопровождающимся массовой гибелью клеток. При этом размер популяции какое-то время может быть стабильным. С низкой вероятностью после кризиса могут возникнуть иммортальные клетки. Полагают, что кризис вызывается чрезмерным укорачиванием теломер, приводящим к их физическому исчезновению (Shay et al., 1993; Shay and Wright, 1996). В большинстве случаев единственным путем выхода из кризиса является реактивация теломеразы.

IV. Стволовые клетки в организме человека а) Понятие стволовости, стволовые клетки, мезенхималъные стволовые клетки.

Термин «стволовая клетка» (СК) был впервые введен в биологию А.А.Максимовым в 1908 году на съезде гематологического общества в Берлине. Исследуя процессы кроветворения, Максимов пришел к выводу, что во взрослом организме пожизненно сохраняются недифференцированные клетки способные превращаться в лимфоциты и другие специализированные клетки крови и соединительной ткани. Позже Максимов назвал открытые им клетки «стволовыми». Они получили название «стволовых», так как находятся в стволе воображаемого генеалогического дерева развития клетки, которое венчает крона из различных специализированных клеток.

Клетки называемые стволовыми, характеризуются рядом важных свойств, отвечающих их от остальных клеток организма. Прежде всего, стволовые клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом, как правило, большим, чем у любой другой дифференцированной клетки. Обычно, деление стволовых клеток происходит ассиметрично (Терских и др., 2007а), когда одна из дочерних клеток сохраняет свои стволовые свойства, оставаясь в недифференцированном состоянии и тем самым, обеспечивая самоподдержание пула стволовых клеток, а другая дочерняя клетка способна к дифференцировке в с образованием более комитированных предшественником, прогениторных и прекурсорных клеток, а также дифференцированных клеток. Термин стволовая клетка, применяют чаще всего к клеткам способным к различным направлениям дифференцировки, то есть к клеткам в той или иной мере обладающим свойством пластичности. Тотипотентность — способность давать все возможные клеточные типы - характерно только для зиготы. Эмбриональные стволовые клетки, направления возможной дифференцировки которых неограниченно клеточными типами одного зародышевого листка или одной ткани, - плюрипотентны. Мультипотентность - возможность дифференцироваться в различные клеточные типы, характерные для одного зародышевого листка или одной ткани. Дальнейшие ограничения возможных направлений дифференцировки в пределах одной ткани, имеет место у более комитированных олиго три- и бипотетных клеток-предшественников. Полагают, что стволовые клетки взрослого организма мультипотентны, они находятся в различных тканях и их мультипотентность в определенных условиях обеспечивает восполнение дифференцированных клеток, свойственных данной ткани и обуславливающих должное функционирование.

Основным вместилищем стволовых клеток взрослого организма является костный мозг. В нем различают два основных пула стволовых клеток, гемопоэтические и мезенхимальные стволовые клетки. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) являются клетками предшественниками для клеточных элементов крови, образование которых происходит в костном мозге. Источниками гемопоэтических стволовых клеток, являются костный мозг, периферическая и пуповинная кровь, а также ряд пренатальных органов. Наряду с гемопоэтическими стволовыми клетками, костный мозг также содержит большое количество клеток, окружающих гемопоэтические клетки. К ним относятся эндотелиальные клетки, фибробласты, адипоциты, стромальные клетки костного мозга. Все эти клеточные элементы создают микроокружение для гемопоэтических клеток, оказывающее регуляторные эффекты на пролиферацию и дифференцировку ГСК (Терских и др., 2007b). В свою очередь, среди клеток стромы костного мозга выделяют немногочисленную популяцию клеток, которые не только играют важную роль в гемопоэзе, но и в определенных условиях способны к дифференцировке в различные клеточные типы. Они являются самообновляющейся популяцией клеток, поддерживающих свое недифференцированное состояние, а также обладают высоким пролиферативным потенциалом, то есть обладают всеми характеристиками стволовых клеток. Эти клетки называются мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), или костно-мозговыми стромальными клетками, а также — в некоторых источниках — мезенхимальными прогениторными клетками (Minguell et al., 2001). MCK впервые были выделены А .Я. Фриденштейном и описаны как колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕ-Ф), способные к дифференцировке в остеобласты, хондробласты и адипоциты (Friedenstein et al., 1976). Позже для MCK были показаны другие возможные направления дифференцировки. Ключевым этапом выделения популяции МСК является их адгезия к субстрату. В многочисленных работах показано, что локализация МСК не ограничивается костных мозгом (Minguell et al., 2001; Fibbe, 2002; Roufosse et al., 2004; Wagner et al., 2005; Da Silva Meirelles et al., 2006), и они могут быть выделены из стромы различных органов и из периферической крови (Zvaifler et al., 2000; Kuznetsov et al., 2001). Следует отметить, что помимо ГСК и МСК во взрослом организме существуют специализированные и согласно ряду исследователей - более ограниченые в своем дифференцировочном потенциале, тканеспецифичные стволовые клетки, обладающие различным дифференцировочным потенциалом. Так, нейральные стволовые клетки, фактически мультипотентны, а дифференцировочный потенциал некоторых тканеспецифичных «стволовых клеток» ограничиваются только одним-двумя направлениями дифференцировки. Вопрос об ограниченных тканеспецифических стволовых клеток не является однозначным и согласно ряду работ, эти клетки способны к дифференцировке не только в клеточные типы характерные для ткани в которой они локализуются, но и к так называемой транс-дифференцировке (Clarke and Frisen, 2001).

Одним из нерешенных вопросов биологии МСК является их иммунофенотипическая характеристика, поскольку на сегодняшний день не определен маркер или набор маркеров, который бы наиболее полно и специфически характеризовал мезенхимальные стромальные клетки предшественники, в том числе костно-мозгового происхождения, и коррелировал бы с их способностью к длительной пролиферации и самоподдержанию, а также к определенной степени пластичности. Так, охарактеризованные по широкому списку маркеров, очищенные популяции МСК не отличались от культур клеток полученных простой адгезией из более чем одной колонии, а мультипотентные линии МСК, каждая из которых была получена из одной клетки, тем не менее характеризовались неодинаковыми паттернами экспрессируемых маркеров, которые к тому же изменялись в течение времени культивирования МСК (Fibbe, 2002; Bianco et al., 2001). Таким образом, в дополнении к неспецифичности фенотипических характеристик МСК, они также могут изменяться в ответ на сигналы, получаемые от их микроокружения in vitro и in vivo (Bianco et al., 2001). В настоящее время, разными лабораториями проведен большой объем работы по определению спектра маркеров, присутствующих на МСК.

В большинстве исследований показано, что для мезенхимальных стволовых клеток человека, мышей и крыс не характерна экспрессия маркеров, свойственных гемопоэтическим стволовым клеткам. Это относится к маркерам CD4 (экспрессируется на тимоцитах и Т-хелперах, корецептор Т-хелперов и лиганд МНС II) , CDllb (экспрессируется на моноцитах, макрофагах и естественных киллерах, лиганд ICAM-I и iC3b) , CD34 (ранний маркер гемопоэтических стволовых клеток, может обнаруживаться на эндотелии капилляров), CD43 (экспрессируется лейкоцитами, за исключением В-лимфоцитов, лиганд ICAM-I), CD45 (тирозинфосфатаза участвующая в передаче сигнала от Т-клеточного рецептора , панлейкоцитарный антиген), CD117 (c-kit, рецептор фактора стволовых клеток является маркером кроветворных предшественников), CD31 (также называемый RECAM-1, обнаруживается на моноцитах, гранулоцитах, тромбоцитах и эндотелии) (Zuk et al., 2002; Lee et al., 2003; Wagner et al., 2005; Wexler et al., 2002; Minguell et al., 2001; Fibbe, 2002;

Pittenger et al., 1999; Conget and Minguell, 1999; Javazon et al., 2001; Da Silva Meirelles et al., 2006; Kolf et al., 2007).

Обычно на негемопоэтических прогениторных клетках из костного мозга, обладающих клоногенностью, идентифицируется маркер Stro-1 (Bianco et al., 2001, Minguell et al., 2001; Fibbe, 2002). Экспрессия этого маркера может теряться при длительном культивировании, однако неизвестно каким образом эта потеря сказывается на МСК с точки зрения сохранения их свойств (Kolf et al., 2007). Также, характеристикой МСК является взаимодействие их с антителами к SH-2 — одному из эпитопов рецептора ТФР-[3 эндоглина (CD105), а также с антителами к SH-3 и SH-4 -различным эпитопам мембран-связанной экто-5'-нуклеотидазы (CD-73), - не реагирующими с гемопоэтическими клетками, остеобластами и остеоцитами (Barry and Murphy, 2004; Kolf et al., 2007). Маркеры CD105 и CD73 используются для идентификации МСК в большом количестве работ (Zuk et al., 2002; Wagner et al., 2005; Wexler et al., 2002; Minguell et al., 2001; Fibbe, 2002,; Pittenger et al., 1999; Conget and Minguell, 1999).

Также в ряде исследований на МСК определялись: CD71 (рецептор к трансферрину, экспрессируется активированными лейкоцитами), CD90 (Thy-1, экспрессируется тимоцитами и предшественниками Т-лимфоцитов, участвует в рециркуляции и адгезии), CD13 (металлопротеиназа, экспрессируется на макрофагах и моноцитах), CD44 (выполняет селектиноподобные функции и взаимодействует с межклеточным матриксом и эндотелием сосудов) (Zuk et al., 2002; Wagner et al., 2005; Wexler et al., 2002, Minguell et al., 2001; Fibbe, 2002; Lee et al., 2003; Pittenger et al., 1999; Kolf et al., 2007; Da Silva Meirelles, et al., 2006).

Таким образом, МСК экспрессируют большое количество молекул адгезии, обуславливающих их способность к связыванию с белками внеклеточного матрикса и рядом клеток, что указывает на функциональную вовлеченность МСК в межклеточные взаимодействия.

Эти функции соответствуют костномозговой локализации, возможной миграции и последующему хоумингу этих клеток в ряд органов и тканей.

Известно, что МСК обладают рядом черт фибробластов, а также имеют некоторые характеристики, свойственные миобластам и эндотелиальным клеткам. Так, они экспрессируют белки внеклеточного матрикса, некоторые из которых характерны для фибробластов, например коллагены I, III, IV, V, VI типов, фибронектин, ламинин, а также протеогликаны (Prockop, 1997; Minguell et al., 2001; Conget and Minguell, 1999).

Изучение пластичности мезенхимальных стволовых клеток взрослого организма представляет собой огромный интерес. В большом количестве работ показана способность костномозговых МСК направляться по наиболее очевидным, учитывая их проихсождение, путям дифференцировки - остеобластном и хондробластном как in vitro, так и in vivo (Caplan , 1994; Prockop, 1997). Доказательством способности этих клеток к остеогенной дифференцировке in vitro является увеличение степени экспрессии щелочной фосфатазы, образование клеточных агрегатов — узелков и минерализации внеклеточного матрикса в среде, что было показано для МСК человека и многих видов животных (Jaiswal et al., 1997.; Pittenger et al., 1999.; Kadiyala et al., 1997; Fibbe 2002; Bariy and Murphy, 2004; Панюхин и др., 2008). Также предсказуемым направлением дифференцировки МСК является их способность формировать адипоциты, что было продемонстрировано в большом количестве работы. Наиболее очевидным доказательством адипогенеза, является накопление в МСК липидных капель, сливающихся с течением времени в более крупные капли (Pittenger et al., 1999; Barry and Murphy, 2004; Fibbe, 2002; Bianco et al., 2001; Dennis et al., 1999).

Также, в ряде экспериментов была показана возможность дифференцировки МСК человека в эндотелий, в миогенном направлении, в кардиомиоциты in vitro (Oswald et al., 2004; Wakitani et al., 1995; Makino et al., 1999). б) Стволовые клетки жировой ткани

Впервые метод выделения клеток из жировой ткани был описан в 1960-х годах: используя комбинацию протеолитического расщепления и дифференциального центрифугирования удалось разделить зрелые адипоциты от более плотной клеточной фракции, которую назвали стромально-сосудистая фракция (ССФ) (Rodbell, 1966; Rodbell and Jones, 1966). ССФ гетерогенна и представлена клетками крови, фибробластами, перицитами, эндотелиальными клетками и преадипоцитами. На конечном этапе выделения проводили селекцию клеток по адгезии к пластику. Позднее получили культуры из ССФ и показали, что клетки ССФ способны дифференцироваться в зрелые адипоциты (Hauner et al., 1989; Hauner et al., 1988; Poznanski et al., 1973; Van Den Berg et al., 1998). В 2001r в работе Zuk с соавторами было показано, что клетки, полученные из жировой ткани человека, обладают множественными потенциями дифференцировки и способны дифференцироваться в адипогенном, хондрогенном, остеогенном и миогенном направлениях in vitro, что предполагает наличие в ССФ жировой ткани не только преадипоцитов, но и мультипотентных стволовых клеток (СК) (Zuk et al., 2006; Zuk et al., 2002; Zuk et al., 2001).

Морфологически свежевыделенная фракция стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ) гетерогенна и содержит фибробластоподобные, эндотелиальные, гладкомышечные клетки и макрофаги. С использованием проточной цитометрии было показано, что содержание контаминирующих клеток (эндотелиальные и гладкомышечные клетки) составляет 5-20% от всей популяции СКЖТ. При культивировании количество этих клеток уменьшается, при этом остается гомогенная фибробластоподобная популяция СКЖТ, также как и в случае культивирования мезенхимных стволовых клеток (МСК) костного мозга. Остальные 80% популяции СКЖТ, как и МСК, экспрессируют виментин и маркер AS02 (Zuk et al., 2006)

При культивировании в стандартных условиях СКЖТ имеют фибробластоподобную морфологию. Состав среды культивирования и плотность посева культуры влияют на дифференцировку СКЖТ. Так, большее количество адипоцитов можно получить при культивировании в среде DMEM и при низкой плотности посева, по сравнению со средой а-МЕМ, однако среда а-МЕМ наиболее эффективна для остеогенной дифференцировки (Lee et al., 2004). Более того, была показана дифференциальная экспрессия 441 гена в зависимости от среды культивирования (Dicker et al., 2005). Контакт с пластиком и время посева на пластик также может влиять на экспрессию генов поверхностных молекул (Nakagami et al., 2006).

В настоящее время иммунофенотип поверхности СКЖТ исследован разными независимыми лабораторными группами (Aust et al., 2004; Case et al., 2005; De Ugarte et al., 2003; Gronthos et al., 2001; Katz et al., 2005; Mcintosh et al., 2006; Mitchell et al., 2006; Nakagami et al., 2005; Safford and Rice, 2005; Williams et al., 1994; Yoshimura et al., 2006; Young et al., 1992; Zuk et al., 2002). В ряде работы было показано, что профиль экспрессии поверхностных молекул зависит от состояния клеток в культуре (Gimble et al., 2007; Katz et al., 2005; Mcintosh et al., 2006; Mitchell et al., 2006; Schaffler and Bushier, 2007).

В культуре СКЖТ экспрессируют белки адгезии, рецепторные молекулы, белки цитоскелета и внеклеточного матрикса, белки, связанные с фенотипом стромальных клеток. Классические стромальные маркеры (CD13, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166) присутствуют только на 0.8%-54% клеток ССФ. При пассировании происходит селекция клеток, и стромальные маркеры присутствуют уже на 98% клеток. Такие изменения паттерна экспрессии характерны также и для МСК (Pittenger et al., 1999; Zuk et al., 2002).

Сравнительный анализ профилей экспрессии поверхностных маркеров в культурах клеток, выделенных из жировой ткани и костного мозга, показал их схожесть. Обе популяции экспрессируют CD 13, CD29, CD4, CD58, CD90 (Thyl), CD105, CD166, CD73 (SH3), STRO-1. Не выявлена экспрессия CD3, CD4, CDllc, CD14, CD15, CD16, CD19, CD31, CD33, CD38, CD45, CD56, CD62P, CD104, CD144 (Aust et al., 2004; Case et al., 2005; De Ugarte et al., 2003; Gronthos et al., 2001; Katz et al., 2005; Mcintosh et al., 2006; Mitchell et al., 2006; Nakagami et al., 2005; Safford and Rice, 2005; Williams et al., 1994; Yoshimura et al., 2006; Young et al., 1992; Zuk et al., 2002).

Стволовые клетки жировой ткани способны дифференцироваться в адипоциты, миоциты, остеоциты, хонроциты (Dicker et al., 2005; Zuk et al., 2002; Zuk et al., 2001; Shi et al., 2005; Owen et al., 1990; Cheng et al., 1994; Erickson et al., 2002; Huang et al., 2004; Lin et al., 2005; Mizuno et al., 2002; Rodriguez et al., 2005; Parker and Katz, 2006; Cao et al., 2005). Кроме того, в некоторых работах было показана возможность СКЖТ дифференцироваться не только в клетки мезодермального происхождения, но и например, в нейроны, кардиомиоциты, гепатоциты, эндокринные панкреатические и эндотелиальные клетки (Zuk et al., 2006; Lin et al., 2006; Betre et al., 2006). в) Нейралъные стволовые клетки

Представления о том, что в зрелом мозге млекопитающих на протяжении всей жизни происходит нейрогенез с образованием новых нервных клеток, только недавно приобрели широкое распространение, хотя экспериментальные данные, подтверждающие генерацию новых нейронов, накапливались на протяжении всего XX столетия. С развитием авторадиографического метода появилась возможность выявлять пролиферирующие клетки, а также исследовать миграцию и судьбу их потомков. Таким образом, исследования с использованием авторадиографического метода помогли подтвердить существование областей мозга, в которых в норме сохраняется пролиферативная активность клеток и происходит генерация новых нейронов на протяжении всей жизни млекопитающих (Altman, 1962; Altman, 1963; Altman, 1969; Altman and Das, 1965; Bayer, 1983; Kaplan and Hinds, 1977; Kaplan and Bell, 1983). В дальнейшем эти исследования были подтверждены и развиты с применением новых методов выявления делящихся клеток, таких как мечение бромодезоксиуридином — маркером S-фазы клеточного цикла, с последующим выявлением его методами иммуногистохимии (Corotto et al., 1993; Doetsch et al., 1999; Palmer et al., 2000).

Первоначально были получены и в дальнейшем неоднократно подтверждены данные о том, что в боковой стенке, а именно в передней части субвентрикулярной зоны (СВЗ), боковых желудочков зрелого мозга крыс существует популяция пролиферирующих клеток, и происходит постоянная генерация клеток нейральных предшественников, которые затем мигрируют по ростральному миграционному пути, образованному клетками продольно ориентированной глии, в обонятельную луковицу, где они дифференцируются во вставочные нейроны (Altman, 1969; Bayer et al., 1983; Corotto et al., 1993, Lois and Alvarez-Buylla, 1994, Thomas et al., 1996). Другой областью постнатального нейрогенеза является зубчатая извилина гиппокампа как у грызунов (Altman and Das, 1965; Kaplan and Bell, 1983; Bayer et al., 1982; Cameron et al., 1993a), так и у приматов (Kornack and Rakic, 1999), включая человека (Eriksson et al., 1998). Нейральные клетки-предшественники зубчатой извилины гиппокампа взрослого мозга локализованы в субгранулярной зоне, мигрируют и дифференцируются в нейроны и глию гранулярного слоя (Cameron et al., 1993а).

Данные о том, что нейрогенез происходит на протяжении всей жизни млекопитающих, ставят вопрос о существовании популяции специализированных - так называемых стволовых клеток мозга или нейральных стволовых клеток (НСК), которые по аналогии со стволовыми клетками, поддерживающими гематопоэз, способны к самовоспроизведению (т.е. к поддержанию своей популяции на протяжении всей жизни животного) и обладают мультипотентным статусом (т.е. их потомки дифференцируются во все клеточные фенотипы ЦНС).

Одним из подходов к решению данного вопроса служило культивирование клеток, выделенных из различных областей зрелого мозга. Так впервые, клетки взрослого мозга, способные генерировать три основных клеточных фенотипа ЦНС, были выделены из образцов тканей стриатума мыши (Reynolds and Weiss, 1992). Однако эти клетки были названы прогениторными клетками (progenitor cells) или клетками-предшественниками, поскольку для них не было показано свойство самовоспроизведения, характерное для стволовых клеток. Такие клетки-предшественники, дающие начало трем основным клеточным фенотипам ЦНС, были выделены из различных отделов зрелого головного, а также спинного мозга: из СВЗ мыши (Lois and Alvarez-Buylla, 1993), крысы (Palmer et al., 1995) и человека (Kukekov et al,, 1999); из зубчатой извилины гиппокампа крысы (Palmer et al., 1995) и человека (Kukekov et al., 1999); из обонятельной луковицы человека (Pagano et al., 2000) и мыши (Gritti et al., 2002); из спинного мозга мыши (Weiss et al., 1996). Кроме этого клетки-предшественники были выделены из тканей уже мертвого мозга. Так в нескольких работах культивировали клетки, выделенные спустя несколько часов после смерти: из СВЗ и спинного мозга мыши (Laywell et al., 1999), из обонятельной луковицы человека (Roisen et al., 2001), из СВЗ и гиппокампа человека (Palmer et al., 2001).

Показанная в этих работах мультипотентность выделенных клеток, а также возможность долгого культивирования с наращиванием общего количества клеток позволила авторам полагать, что среди популяции клеток-предшественников существуют стволовые клетки. Кроме того, в этих работах было установлено, что клетки, дающие начало нейронам, глии и олигодендроглии, экспрессируют белок промежуточных филаментов - нестин. Ранее его экспрессия была показа для нейроэктодермальных стволовых клеток (Lendahl et al., 1990), отсюда и название белка: NeuroEctodermal STem cells - NESTIN. Впоследствии нестин стал служить основным молекулярным маркером НСК, хотя позже было показано, что он также экспрессируется в стволовых клетках некоторых других тканей (Alvarez-Buylla and Garcia-Verdugo, 2002).

Признание факта существования стволовых клеток ЦНС, поддерживающих нейрогенез на протяжении всей жизни млекопитающих, имеет не только фундаментально-научное значение, но и потенциальную перспективу практического применения стволовых клеток и знаний, полученных при исследовании их свойств, в разработке подходов к лечению нейродегенеративных заболеваний и травм головного и спинного мозга. С одной стороны, возможность сохранения и размножения стволовых клеток в культуре in vitro может быть использована для получения клеточного материала пригодного для нейротрансплантации. С другой стороны, выяснение механизмов, контролирующих нейрогенез, может обеспечить разработку подходов для манипуляции эндогенными стволовыми клетками ЦНС с целью использования их потенций для восстановления поврежденных участков мозга вследствие патологии или травмы. г) Индуцировано-плюрипотентные стволовые клетки человека (iPS-клетки).

В настоящее время активно ведутся исследования в области получения плюрипотентных соматических клеток животных и человека. Описаны два принципиально разных пути получения подобных клеток: использование методов клонирования (например, клеточного слияния, переноса ядер соматических клеток в овоцит второго делений мейоза (somatic cell nuclear transfer, SCNT)) (Wakayama et al., 1998; Campbell et al., 1996; Byrne et al., 2007) и индукция репрограммирования с получением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (induced pluripotent stem cells, iPS cells), сходных с ЭСК (Wernig et al., 2007; Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007; Takahashi and Yamanaka, 2006). К настоящему времени уже получены iPS клетки мышей (Takahashi et al., 2006), а методом SCNT клонированы клетки целого ряда животных (Wakayama et al., 1998; Campbell et al., 1996; Byrne et al., 2007).

Концентрирование интересов клеточных технологов вокруг исследований, связанных с выделением совместимых плюрипотентных клеток, обусловлено возможностью использования их в моделировании и изучении заболеваний человека, разработке, тестировании и совершенствовании лекарственных препаратов, а также терапевтического применения при большом спектре заболеваний (Takahashi et al., 2007).

В 2007 году, двумя группами исследователей практически одновременно были опубликованы материалы исследований по получению iPS клеток человека. В этих работах индукцию плюрипотентности проводили используя разные виды клеток (кожные фибробласты взрослого человека, веретеновидные синовиоциты, фетальные и неонатальные фибробласты) и сравнивали полученные клетки между собой и с контролем - ЭСК человека. (Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007)

Схема репрограммирования предполагает внедрение в клетки генов плюрипотентности, сверхэкспрессия которых способна вернуть дифференцированную клеточную популяцию к плюрипотентному статусу. В качестве индукторов репрограммирования K.Takahashi и S.Yamanaka в 2006 году предложили 4 транскрипционных фактора, выявленных ими из 24 претендентов: Oct4, Sox2, с-Мус, Klf4 (Takahashi and Yamanaka, 2006), которые и были использованы в их работе 2007-го года. Oct4 и Sox2 являются ключевыми факторами регуляции пролиферации и полипотентности стволовых клеток и характеризуются высоким уровнем экспрессии в ЭСК снижающимся в процессе пролиферации (Boyer et al., 2005). Вовлечение Klf4 и с-Мус в процессы репрограммирования может быть связано с их ролью в качестве модификаторов хроматина, способствующих активации Oct4 и Sox2. В группе Томпсона (Yu et al., 2007), на начальном этапе исследований выбирали гены из 14 кандидатов, и в результате была осуществлена замена Klf4 и с-Мус, входящих в стандартный набор транскрипционных факторов стволовости на Nanog и Lin28. Роль Nanog, наряду с Oct4 и Sox2 общепризнана в индукции плюрипотентности соматических клеток (Boyer et al., 2005; Chambers et al., 2003), тогда как существенная значимость Lin28 в репрограммировании подтверждена еще не была. Необходимость замены с-Мус представляется вполне целесообразной, поскольку в ряде работ выявлена его негативная роль, заключающаяся в индукции апоптоза ЭСК человека (Sumi et al., 2007), а также стимуляции в 20% случаев опухолевой трансформации iPS клеток мышей (Okita et al., 2007).

В обоих исследованиях (групп Takahashi и Thomson) селекцию культур iPS клеток проводили на основании морфологического соответствия ЭСК человека (компактность колоний, высокое ядерно-фитоплазматическое соотношение, четкая визуализация ядер). Иммунофенотип полученных клеток, в обеих работах соответствовал фенотипу ЭСК человека - были показаны экспрессия SSEA-3, SSEA-4, Тга-1-60 и Тга-1-81. Методом RT-PCR в iPS клетках показан характерный для ЭСК высокий уровень экспрессии эндогенных Oct4 и Nanog. Высокая экспрессия других генов маркеров ЭСК человека - REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4, hTERT, также указывает на дополнительное соответствие полученных в работе культур ЭСК. Также было показано деметилирование цитозингуаниндинуклеотидных последовательностей промоторных областей генов Nanog и Oct4 в подтверждении их высокой функциональной активности. В контроле (исходные культуры фибробластов) данные области были метилированы.

Для определения дифференцировочного потенциала iPS клеток, их культивировали в условиях, необходимых для формирования эмбриоидных тел, нейронов или кардиомиоцитов. Клетки были способны экспрессированы маркеры, характерные для клеток эктодермального (b-III-tubulin, GFAP), мезодермального (a-SMA, desmin) и эндодермального (AFP) происхождения. Для подтверждения полипотентного статуса iPS клеток, в работах проводили подкожную трансплантацию iPS клеток. В местах инъекции развивались «тератомы», состоящие из комплекса тканей, морфологически сходных с производными всех трех зародышевых листков.

Несмотря на ряд различий в материалах, методиках и обоснованиях полученных данных, глобальным результатом исследований нескольких независимых групп ученых явилось получение iPS клеток человека, сходных по морфологическим, иммуногистохимическим и генетическим критериям с ЭСК человека. Это является первым значимым достижением в области получения аутогенных плюрипотентных клеток путем репрограммирования соматических клеток человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

I. Культуры клеток

1.1 Мезенхималъные стромалъные клетки костного мозга человека, культура XI.

Первичная культура мононуклеарной фракции клеток костного мозга человека, была получена из аспирата костного мозга подвздошной кости человека, любезно предоставленого К.Н.Ярыгиным (Лаборатория клеточных технологий в здравоохранении, Российского государственного медицинского университета). Аспират костного мозга разбавили 1:1 раствором PBS, осторожно, не допуская перемешивания наслоили сверху на равный объем Ficoll-Paque (Sigma, США) в 50 мл центрифужной пробирке, и центрифугировали в течение 10 минут, 800 об/мин (1000g), при +4°С. Мононуклеарные клетки остались на разделе фаз двух растворов, тяжелая эритроцитарная масса выпала в осадок. Отобрав нужную фракцию, клетки два раза отмывали от Ficoll-Paque при помощи PBS и осаждения на центрифуге. В конце клетки ресуспендировали в ростовой среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), (Hyclone, США), 0,32мг/мл глутамина и 40ед/мл гентамицина и высевали на пластиковую 10см чашку Петри (Corning-Costar, США). Клетки инкубировали в течение 7 дней без смены среды, к этому времени в чашке образовывались колонии фибробластоподобных пластик-адгезивных клеток по 50-500 клеток в каждой. После достижения монослоя клетки пересевали в разведении 1/2-1/4 используя растворы Версена и трипсин-Версена

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Дашинимаев, Эрдэм Баирович

ВЫВОДЫ

1. С помощью введения гена каталитического компонента теломеразы человека (JiTERT) был иммортализован ряд культур стволовых и прогениторных клеток человека: а) нейральные стволовые клетки б) мезенхимальные стромальные клетки из костного мозга в) мезенхимальные стромальные клетки из губчатой кости г) мезенхимальные стромальные клетки из жировой ткани

2. Иммортализованные нейральные стволовые клетки сохраняют экспрессию нестина, способны образовывать нейросферы и дифференцироваться в нейрональном и глиальном направлениях. На уровне 100 удвоений популяции эти клетки сохраняют теломеразную активность и нормальный диплоидный кариотип.

3. Иммортализованные мезенхимальные стромальные клетки сохраняют способность к дифференцировке в остеогенном и адипогенном направлениях также как и исходные клетки.

4. Иммортализованные введением гена hTERT мезенхимальные стромальные клетки из губчатой кости сохраняют способность к контактному торможению и переходу в покой в условиях сывороточного голодания.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарит своего научного руководителя Е.Е.Егорова за предложенную тему диссертации, помощь в проведении экспериментов и обработке результатов, общие ценные замечания по работе.

Автор выражает искреннюю благодарность Х.С.Вишняковой за помощь в проведении экспериментов с флуоресцентной гибридизацией in situ и исследованием кариотипа, М.В.Молдавер за помощь в проведении экспериментов со стромальными клетками жировой ткани человека.

Автор выражает благодарность всему коллективу Лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терпаии ИМБ РАН и всему коллективу Лаборатории проблем клеточной пролиферации ИБР РАН за моральную поддержку и за проявленный интерес к работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дашинимаев, Эрдэм Баирович, Москва

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Д., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Д. Молекулярная биология клетки. Москва, Мир, 1994, Т. 3, С. 452.

2. Вильсон Э. Клетка и ее роль в развитии и наследственности. М.-Л., ГИБМЛ, 1936, 1, С.211-212.

3. Егоров Е.Е.Теломераза, старение, рак. Молекулярная биология, 1997, Т. 31, С. 16-25.

4. Михельсон В.М. Старение клеточных культур. 1984, Ленинград, Издательство «Наука», Книга «Биологии клетки в культуре» под редакцией Трошина А.С., с. 236-237.

5. Оловников A.M. Принцип маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. Доклады Академии Наук, 1971, Т. 201, С. 14961499.

6. Панюхин Н.В., Егоров Е.Е., Вишнякова Х.С. Влияние парцального давления кислорода на выживаемость, пролиферацию и дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга мыши. Биологические мембраны, 2008, Т. 25, С. 352-359

7. Терских В.В., Васильев А.В, Воротеляк Е.А. Ниши стволовых клеток. Известия РАН, серия Биологическая, 2007b, Т. 3, С. 261-272.

8. Терских В.В., Васильев А.В, Воротеляк Е.А. Поляризация и асимметричное деление стволовых клеток. Цитология, 2007а, Т. 49, С. 933-938

9. Abuin M., Martinez P., Sanchez L. Localization of repetitive telomeric sequence (TTAGGG)n in four salmonid species. Genome, 1996, V. 39, P. 1035-1038.

10. Altman J. Are neurons formed in the brains of adult mammals?. Science, 1962, V. 135, P. 1127-1128.

11. Altman J. Autoradiographic investigation of cell proliferation in the brains of rats and cats. The Anatomical Record, 1963, V. 145, P. 573-591.

12. Altman J., Das G.D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. J. Comparative Neurol., 1965, V. 124 (3), P. 319-335.

13. Alvarez-Buylla A., Garcia-Verdugo J.M. Neurogenesis in adult subventricular zone. J. Neuroscience, 2002, V. 22 (3), P. 629-634.

14. Aust L., Devlin В., Foster^S. J., Halvorsen Y.D., Hicok K., du Laney Т., Sen A., Willingmyre G.D., Gimble J.M. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy, 2004, V. 6, P. 7-14.

15. Avilion A.A., Piatyszek M.A., Gupta J., Shay J.W., Bacchetti S., Greider C.W. Human telomerase RNA and telomerase activity in immortal cell lines and tumor tissues. Cancer Res., 1996, V. 56, P. 645-650.

16. Bai Y., Hu Q., Li X., Wang Y., Lin C., Shen L., Li L. Telomerase immortalization of human neural progenitor cells. Neuroreport, 2004, V. 15 (2), P 245-249.

17. Barry F.P., Murphy J.M. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization. Int. J. Biochem. Cell. Biol., 2004, V. 36(4), P. 568-584.

18. Bayer S.A. 3H-thymidine-radiographic studies of neurogenesis in the rat olfactory bulb. Exper. Brain Res., 1983, V. 50, P. 329-340.

19. Bayer S.A., Yackel J.W., Puri P.S. Neurons in the rat dentate gyrus granular layer substantially increase during juvenile and adult life. Science, 1982, V. 216, P. 890-892.

20. Bear A., Clayman R.V., Elbers J., Limas C., Wang N., Stone K., Gebhard R., Prigge W., Palmer J. Characterization of two human cell lines (TK-10, TK-164) of renal cell cancer. Cancer Res., 1987, V. 47(14), P. 3856-62.

21. Betre H., Ong S.R., Guilak F., Chilkoti A., Fermor В., Setton L.A. Chondrocytic differentiation of human adipose-derived adult stem cells in elastin-like polypeptide. Biomaterials, 2006, V. 27, P. 91-99.

22. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P.G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells, 2001, V. 19(3), P. 180-192.

23. Biessman H., Mason J.M., Ferry K., d'Hulst M., Valgeirsdottir K., Traverse K.L., Pardue M.L. Addition of telomere-associated HeT DNA sequences "heals" broken chromosome ends in Drosophila. Cell, 1990, V. 61, P. 663673.

24. Blackburn E.H. Structure and function of telomeres. Nature, 1991, V. 350, P. 569-573.

25. Blasco M.A., Funk W., Villeponteau В., Greider C.W. Functional characterization and developmental regulation of mouse telomerase RNA. Science, 1995, V. 269, P. 1267-1270.

26. Bodnar A.G., Ouellette M., Frolkis M., Holt S.E., Chiu C.P., Morin G.B., Harley C.B., Shay J.W., Lichtsteiner S., Wright W. E. Extension of lifespan by introduction of telomerase into normal human cells. Science., 1998, V. 279, P. 349-352.

27. Boyer L.A., LeeT.I., Cole M.F., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell 2005, V. 122, P. 947-956.

28. Byrne J.A., Pedersen D.A., Clepper L.L. et al. Producing primate embryonic stemm cells by somatic cell nuclear transfer. Nature, 2007, V. 450 (7169), P. 497-502.

29. Cameron H.A., Wolley C.S., McEwen B.S., Gould E. Differentiation of newly born neurons and glia in the dentate gyrus of the adult rat. Neuroscience, 1993a, V. 56, P. 337-344.

30. Campbell K.H., McWhir J., Ritchie W.A. et al. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature, 1996, V. 380, P. 64-66.

31. Сао Y., Sun Z., Liao L. et al. Human adipose tissue-derived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improve postnatal neovascularization in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, V. 332, P. 370-379.

32. Caplan A.I. The mesengenic process. Clin. Plast. Surg., 1994, V. 21(3), P. 429-435.

33. Carrel A. Artificial activation of growth in vitro of connective tissue. J.Exp. Med., 1913, V. 17, P. 14-19.

34. Case J., Horvath T.L., Howell J.C., Yoder M.C., March K.L., Srour E.F. Clonal multilineage differentiation of murine common pluripotent stem cells isolated from skeletal muscle and adipose stromal cells. Ann. N Y Acad. Sci., 2005, V. 1044., P. 183-200.

35. Chambers I., Colby D., Robertson M., et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotentcy sustaining factor in embryonic stem cells. Cell, 2003, V. 113, P. 643-655.

36. Chen J.L., Blasco M.A., Greider C.W. Secondary structure of vertebrate telomerase RNA. Cell, 2000, V. 100, P. 503-514.

37. Cheng S.L., Yang J.W., Rifas L., Zhang S.F., Avioli L.V. Differentiation of human bone marrow osteogenic stromal cells in vitro: induction of the osteoblast phenotype by dexamethasone. Endocrinol., 1994, V. 134, P. 277286.

38. Clarke D, Frisen J. Differentiation potential of adult stem cells. Curr. Opin. Genet. Dev., 2001, V. 11(5), P. 575-80.

39. Cohn M., Blackburn E.H. Telomerase in yeast. Science, 1995, V. 269, P. 396-400.

40. Conget P.A., Minguell J.J. Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells. J. Cell Physiol., 1999, V. 181(1), P. 67-73.

41. Coren J.S., Epstein E.M., Vogt V.M. Characterization of a telomere-binding protein from Physarum polycephalum. Mol. Cell. Biol., 1991, V. 11, P. 2282-2290.

42. Corotto F.S., Henegar J.A., Maruniak J.A. Neurogenesis persists in the subependymal layer of the adult mouse brain. Neuroscience Letters, 1993, V. 149, P. 111-114.

43. De Ugarte D.A., Morizono K., Elbarbary A. et al. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow. Cells Tissues Organs, 2003, V. 174, P. 101-109.

44. Dennis J.E., Merriam A., Awadallah A., Yoo J.U., Johnstone В., Caplan A.I. A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adult mouse. J. Bone Miner. Res., 1999, V. 14(5), P. 700-709

45. Dicker A., Le Blanc K., Astrom G. et al. Functional studies of mesenchymal stem cells derived from adult human adipose tissue. Exp. Cell Res., 2005, V. 308, P. 283-290.

46. Doetsch F., Caile I., Lim D.A., Garcia-Verdugo J.M., Alvarez-Buylla A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell, 1999, V. 97, P. 703-716.

47. Erickson G.R., Gimble J.M., Franklin D.M., Rice H.E., Awad H., Guilak F. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, V. 290, P. 763-769.

48. Eriksson P.S., Perfilieva E., Bjork-Eriksson Т., Alborn A.M., Nordborg C., Peterson D.A., Gage F.H. Neurogenesis in the adult human hippocampus, Nature Med., 1998, V. 4, P. 1313-1307.

49. Fibbe W.F. Mesenchymal stem cells. A potential source for skeletal repair. Ann. Rheum. Dis., 2002, V. 61(2), P. 29-31.

50. Forney J., Henderson E.R., Blackburn E.H. Identification of the telomeric sequence of the acellular slime moulds Didimium iridis and Physarum polycephalum. Nucleic Acids Res., 1987, V. 15, P. 9143-9152.

51. Friedenstein A.J., Gorskaja J.F., Kulagina N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Exp.Hematol., 1976, V. 4(5), P. 267-74

52. Ganal M.W., Lapitan N.L., Tanksley S.D. Macrostructure of the tomato telomeres. Plant Cell, 1991, V. 3, P. 87-94.

53. Gimble J.M., Katz A.J., Bunnell B.A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ. Res., 2007, V. 100, P. 1249-1260.

54. Gollahon L.S., Shay J.W. Immortalization of human mammary epithelial cells transfected with mutant p53 (273his). Oncogene, 1996, V. 12, P. 715725.

55. Greider C.W., Blackburn E. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell, 1985, V.43, P. 405-413.

56. Griffith J.D., Comeau L., Rosenfield S., Stansel R.M., Bianchi A., Moss H., de Lange T. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell, 1999, V. 97, P. 503-514.

57. Gronthos S., Franklin D.M., Leddy H.A., Robey P.G., Storms R.W., Gimble J.M. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells. J. Cell Physiol., 2001, V. 189, P. 54-63.

58. Haiflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp.Cell Res., 1961, V.25, P. 585-621

59. Hamada H., Kobune M., Nakamura K., Kawano Y., Kato K., Honmou O., Houkin K., Matsunaga Т., Niitsu Y. Mesenchymal stem cells (MSC) as therapeutic cytoreagents for gene therapy. Cancer Sci., 2005, V. 96(3), P.149-56.

60. Han Н., Hurley L.H. G-quadruplex DNA: a potential target for anti-cancer drug design. Trend in Pharmacol. Sciences, 2000, V. 21, P. 136-142.

61. Hara E., Tsurui H., Shinozaki A., Nakada S., Oda K. Cooperative effect of antisense-Rb and antisense-p53 oligomers on the extension of life span in human diploid fibroblasts, TIG-1. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, V. 179, P. 528-534.

62. Harley C.B. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb? Mutation Res., 1991, V. 256, P. 271-282.

63. Harley C.B., Futcher A.B., Greider C.W. Telomeres shorten during aging of human fibroblasts. Nature, 1990, V. 345, P. 458-460.

64. Hastie N.D., Dempster M., Dunlop M.G., Thompson A.M., Green D.K., Allshire R.C. Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with ageing. Nature, 1990, V. 346, P. 866-868.

65. Hauner H., Wabitsch M., Pfeiffer E.F. Differentiation of adipocyte precursor cells from obese and nonobese adult women and from different adipose tissue sites. Horm. Metab. Res. Suppl., 1988, V. 19, P. 35-39.

66. Henderson E.R., Blackburn E.H. An overhanging 3' terminus is a conserved feature of telomeres. Mol. Cell. Biol., 1989, V. 9, P. 345-348.

67. Huang J.I., Zuk P.A., Jones N.F., Zhu M., Lorenz H.P., Hedrick M.H., Benhaim P. Chondrogenic potential of multipotential cells from human adipose tissue. Plast. Reconstr. Surg., 2004, V. 113, P. 585-594.

68. Huffman K.E., Levene S.D., Tesmer V.M., Shay J.W., Wright W.E. Telomere shortening is proportional to the size of the G-rich telomeric 3'-overhang. J. Biol. Chem., 2000, V. 275, P. 19719-19722.

69. Ijdo J.W., Baldini A., Ward D.C., Reeders S.T., Wells R.A. Origin of human chromosome 2: an ancestral telomere-telomere fusion. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1991, V. 88, P. 9051-9055.

70. Jaiswal N., Haynesworth S.E., Caplan A.I., Bruder S.P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J. Cell Biochem. 1997, V. 64(2), P. 295-312

71. Javazon E.H., Colter D.C., Schwarz E.J., Prockop D.J. Rat marrow stromal cells are more sensitive to plating density and expand more rapidly from single-cell-derived colonies than human marrow stromal cells. Stem Cells, 2001, V. 19(3), P. 219-25.

72. Kadiyala S., Young R.G., Thiede M.A., Bruder S.P. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro. Cell Transplant., 1997, V. 6(2), P. 125-34.

73. Kamnert I., Nielsen L., Edstrom J.-E. A conceitedly evolving region in Chironomus, unique within the telomere. J. Mol. Evol, 1998, V. 46, P. 562570.

74. Kang S.K., Putnam L., Dufour J., Ylostalo J., Jung J.S., Bunnell B.A. Expression of telomerase extends the lifespan and enhances osteogenic differentiation of adipose tissue-derived stromal cells. Stem Cells, 2004, V. 22(7), P. 1356-1372.

75. Kaplan M.S., Bell D.H. Neuronal proliferation in the 9-month-old rodent-radioautographic study of granule cells in the hippocampus, Exp. Brain Res., 1983, V. 52, P. 1-5.

76. Kaplan M.S., Hinds J.W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science, 1977, V. 197, P. 1092-1094.

77. Katz A.J., Tholpady A., Tholpady S.S., Shang H., Ogle R.C. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hadas) cells. Stem Cells, 2005, V. 23, P. 412-423.

78. Kavoussi L.R., Ruesing R.A., Hudson M.A., Catalona W.J., Ratliff T.L. Effect of tumor necrosis factor and interferon gamma on human renal carcinoma cell line growth. J. Urol., 1989, V. 142(3) P. 875-878.

79. Kerwin S.M. G-quadrupex DNA as a target for drug design. Current Pharmaceut. Design., 2000, V. 6, P. 441-471.

80. Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R., Harley C.B., West M.D., Ho P.L.C., Coviello G.M., Wright W.E., Wewrich S.L., Shay J.W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, V. 266, P. 2011-2014.

81. Klobutcher L.A., Swanton M.T., Donini P., Prescott D.M. All gene-sized DNA molecules in four species of hypotrichs have the same terminal sequence and an unusual 3' terminus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1981, V. 78, P. 3015-3019.

82. Kolf C.M., Cho E., Tuan R.S., Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation. Arthritis Res. Ther., 2007, V. 9(1), P. 204

83. Kondo S., Kondo Y., Li G., Silverman R.H., Cowell J.K. Targeted therapy of human malignant glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomerase RNA. Oncogene, 1998b, V. 16, P. 3323-3330.

84. Kornack D.R., Rakic P. Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey. Proceed. Nation. Acad. Sciences USA, 1999, V. 96, P. 5768-5773.

85. Kuniyasi H., Domen Т., Hamamoto Т., Yokozaki H., Yasui W., Tahara H., Tahara E. Expression of human telomerase RNA is an early event of stomach carcinogenesis. Cancer Res. 1997, V. 88(2), P. 103-107.

86. Kuznetsov S.A, Mankani M.H., Gronthos S., Satomura K., Bianco P., Robey P.G. Circulating skeletal stem cells. J.Cell. Biol., 2001, V. 53(5), P. 1133-1140.

87. Kyo S., Takakura M., Ishikawa H., Sasagawa Т., Satake S., Tateno M., Inoue M. Application of telomerase assay for the screening of cervical lesions. Cancer Res., 1997, V. 57, P. 1863-1867

88. Laywell E.D., Kukekov V.G., Steindler D.A. Multipotent neurospheres can be derived from forebrain subependymal zone and spinal cord of adultmice after protracted postmortem intervals. Exp. Neurol., 1999, V. 156, P. 430-433.

89. Lee R.H., Kim В., Choi I., Kim H., Choi H.S., Suh K., Bae Y.C., Jung J.S. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol. Biochem., 2004, V. 14, P. 311-324.

90. Lendahl U., Zimmerman L.B., McKay R.D. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell, 1990, V. 60(4), P. 585-595.

91. Levis R.W., Ganesan R., Houtchens K., Tolar L.A., Sheen F.-M. Transposons in place of telomeric repeats at a Drosophila telomere. Cell, 1993, V.75,P. 1083-1093.

92. Levy M.A., Allsopp R.C., Futcher A.B., Greider C.W., Harley C.B. Telomere end-replication problem and cell aging. J. Mol. Biol., 1992, V. 225, P. 951-960.

93. O.Lois C., Alvarez-Buylla A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science, 1994, V. 264, P. 1145-1148.

94. Lois C., Alvarez-Buylla A. Proliferating subventricular zone cells in the adult mammalian forebrain can differentiate into neurons and glia. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1993, V. 90, P. 2074-2077.

95. Luskin M.B. Restricted proliferation and migration of postnatally penetrated neurons derived from the forebrain subventricular zone. Neuron, 1993, V. 11, P. 173-189.

96. Magnenat L., Tobler H., Muller F. Developmental^ regulated telomerase activity is correlated with chromosomal healing during chromatin diminution in Ascaris suum. Mol. Cell. Biol., 1999, V.19, P. 3457-3465.

97. Makarov V.L., Hirose Y., Langmore J.P. Long G tails at both ends of human chromosomes suggest а С strand degradation mechanism for telomere shortening. Cell, 1997, V. 88, P. 657-666.

98. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S, Konishi F., Kodama H., Pan J., Sano M., Takahashi Т., Hori S., Abe H., Hata J., Umezawa A., Ogawa S., Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J. Clin. Invest, 1999, V. 103(5), P. 697-705.

99. Matsumura T, Zerrudo Z, Hayflick L. Senescent human diploid cells in culture: survival, DNA synthesis and morphology. J. Gerontol, 1979, V. 34, P. 328-334.

100. McClintock B. The Stability of broken ends in zea mays. Genetics, 1941, V. 26, P. 234-282.

101. McEachern M.L, Blackburn E.H, Cap-prevented recombination between terminal telomeric repeat arrays (telomere CPR) maintains telomeres in Kluyveromyces lactis lacking telomerase. Genes Dev., 1996, V.10, P. 1822-1834.

102. Mergny J.-L, Mailliet P, Lavelle F, Riou J.-F, Laoui A, Helene C. The development of telomerase inhibitors: the G-quartet. Anti-Cancer Drug Design, 1999, V. 14, P. 327-339

103. Meyne J., Hirai H., Imai H.T. FISH analysis of the telomere sequences of bulldog ants (Myrmecia: Formicidae). Chromosoma, 1995, Y.104, P. 14-18.

104. Minguell J.J., Erices A., Conget P. Mesenchymal stem cells. Exp. Biol. Med., 2001, V. 226(6), P. 507-520.

105. Mizuno H., Zuk P.A., Zhu M., Lorenz H.P., Benhaim P., Hedrick M.H. Myogenic differentiation by human processed lipoaspirate cells. Plast. Reconstr. Surg., 2002, V. 109, P. 199-209.

106. Morin G.B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell, 1989, V. 59, P. 521-529.

107. Morin G.B., Cech T.R. Mitochondrial telomeres: suprising diversity of repeated telomeric DNA sequences among six species of Tetrahymena. Cell, 1988, V. 52, P. 367-374.

108. Naasani I., Seimiya H., Tsuruo T. Telomerase inhibition, telomere shortening, and senescence of cancer cells by tea catechins. Biochem. Biophys. Res. Commun, 1998, V. 249, P. 391-396.

109. Nakagami H., Morishita R., Maeda K. et al. Adipose tissue-derived stromal cells as a novel option for regenerative cell therapy. J. Atheroscler, Thromb., 2006, V. 13, P. 77-81.

110. Nakamura T.M., Morin G.B., Chapman K.B., Weinrich S.L., Andrews W.H., Lingner J., Harley C.B., Cech T.R. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science, 1997, V. 277, P. 955959.

111. Nakayama J., Tahara H., Tahara E., Saito M., Ito K., Nakamura H., Nakanishi Т., Ide Т., Ishikawa F. Telomerase activation by hTRT in human normal fibroblasts and hepatocellular carcinomas. Nature Genet., 1998, V. 18, P. 65-68.

112. Oswald J., Boxberger S., J0rgensen В., Feldmann S., Ehninger G., Bornhauser M., Werner C. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. Stem Cells, 2004, V. 22(3), P. 377-384

113. Palmer T.D., Ray J., Gage F.H. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Molec. Cell. Neuroscience, 1995, V. 6, P. 474-486.

114. Palmer T.D., Schwartz P.H., Taupin P., Kaspar В., Stein S.A., Gage F.H. Cell culture: progenitor cells from human brain after death. Nature, 2001, V. 411, P. 42-43.

115. Palmer T.D., Willhoite A.R., Gage F.H. Vascular niche for adult hippocampal neurogenesis. J. Comparat. Neurol., 2000, V. 425, P. 479-494.

116. Pao C.C., Tseng C.J., Lin C.Y., Yang F.P., Hor J.J., Yao D.S., Hsueh S. Differential expression of telomerase activity in human cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia lesions. Clin. Oncol., 1997, V. 15(5), P. 1932-1937

117. Parker A.M., Katz A.J. Adipose-derived stem cells for the regeneration of damaged tissues. Expert Opin. Biol. Ther., 2006, V. 6, P. 567-578.

118. Pelliccia F., Volpi E.V., Lanza V., Gaddini L., Baldini A., Rocchi A. Telomeric sequences of Asellus aquaticus (Crustacea: Isopoda). Heredity, 1994, V. 72, P. 78-80.

119. Pich U., Schubert I. Terminal heterochromatin and alternative telomeric sequences in Allium сера. Chrom. Res., 1998, V. 6, P. 315-321.

120. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 1999, V. 284, P. 143-147.

121. Poznanski W.J., Waheed I., Van R. Human fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab. Invest,, 1973, V. 29, P. 570-576.

122. Prockop D.J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science, 1997, V. 276, P. 71-74.

123. Reynolds B.A., Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science, 1992, V. 255, P. 1707-1710.

124. Rifkin J.J. Tumor promoters induce changes in the chick embryo fibroblast cytoskeleton. Cell, 1979, V. 18, P. 361-369.

125. Riha K., McKnight T.D., Fajkus J., Vyskot В., Shippen D.E. Analysis of the G-overhang structures on plant telomeres: evidence for two distinct telomere architectures. Plant J., 2000, V. 23, P. 633-641.

126. Rodbell M. Metabolism of isolated fat cells. 2. The similar effects of phospholipase с (Clostridium perfringens alpha toxin) and of insulin on glucose and amino acid metabolism. J. Biol. Chem., 1966, V. 241, P. 130— 139.

127. Rodriguez A.M., Pisani D., Dechesne C.A. et al. Transplantation of a multipotent cell population from human adipose tissue induces dystrophin expression in the immunocompetent mdx mouse. J. Exp. Med., 2005, V. 201, P. 1397-1405.

128. Roisen F.J., Klueber K.M., Lu C.L., Hatcher L.M., Dozier A., Shields C.B., Maguire S. Adult human olfactory stem cells. Brain Res., 2001, V. 890, P. 11-22.

129. Romero D.P., Blackburn E.H. A conserved secondary structure for telomerase RNA. Cell, 1991, V. 67, P. 343-353.

130. Roufosse C.A., Direkze N.C., Otto W.R., Wright N.A. Circulating mesenchymal stem cells. Int. J. Biochem. Cell. Biol., 2004, V. 36(4), P. 585-97;

131. Safford K.M., Rice H.E. Stem cell therapy for neurologic disorders: therapeutic potential of adipose-derived stem cells. Curr. Drug Targets, 2005, V. 6, P. 57-62.

132. Sahara K., Marec F., Traut W. TTAGG telomeric repeats in chromosomes of some insects and other arthropods. Chrom. Res., 1999, V. 7, P. 449-460.

133. Salvadori S., Deiana A.M., Elisabetta C., Floridia G., Rossi E., Zuffardi O. Colocalization of (TTAGGG)n telomeric sequences and ribosomal genes in Atlantic eels. Chrom. Res, 1995, V. 3, P. 54-58.

134. Schaffler A., Biichler C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells—basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells, 2007, V. 25, P. 818-827.

135. Shampay J., Szostak J.W., Blacburn E.H. DNA sequences of telomeres maintained in yeast. Nature, 1984, V. 310, P. 154-157.

136. Shay J.W., Pereira-Smith O.M., Wright W.E. A role for both RB and p53 in the regulation of human cellular senescence. Exp. Cell Res., 1991, V. 196, P. 33-39.

137. Shay J.W., Wright W.E. The reactivation of telomerase activity in cancer progression. Trends Genet., 1996, V. 12, P. 129-131.

138. Shay J.W, Wright W.E, Brasiskyte D, Van der Haegen B.A. E6 of human papillomavirus type 16 can overcome the Ml stage of immortalization in human mammary epithelial cells but not in human fibroblasts. Oncogene, 1993, V. 8, P. 1407-1413.

139. Sherr C.J, Roberts J.M. Inhibitors of mammalian G1 cyclin-dependent kinases. Genes Dev., 1995, V. 9, P. 1149-1163.

140. Shi Y.Y, Nacamuli R.P, Salim A. et al. The osteogenic potential of adipose-derived mesenchymal cells is maintained with aging. Plast. Reconstr. Surg, 2005, V. 116, P. 1686-1696.

141. Slijpcevic P, Hande M.P. Chinese hamster telomeres are comparable in size to mouse telomeres. Cytogenet. Cell. Genet, 1999, V. 85, P. 196 — 199.

142. Sumi T, Tsuneyoshi N, Nakatsuji N. et al. Apoptosis and differentiation of human embryonic stem cells induced by sustained activation of c-Myc. Oncogene, 2007, V. 26(38), P. 5564-5576.

143. Sun H, Karow J.K, Hickson I.D, Maizels N. The Bloom's syndrome helicase unwinds G4 DNA. J. Biol. Chem, 1998, V. 273, P. 27587-27592.

144. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006, V. 126, P. 663-676.

145. Takahashi K, Yamanaka S, Tanable K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 2007, V. 131, P. 861 -872.

146. Teschke C, Solleder G, Moritz K.B. The highly variable pentameric repeats of the AT-rich germline limited DNA in Parascaris univalens are the telomeric repeats of somatic chromosomes. Nucl. Acids Res, 1991, V. 19, P. 2677-2684.

147. Thomas L.B., Gates M.A., Steindler D.A. Young neurons from the adult subependymal zone proliferate and migrate along an astrocyte, extracellular matrix-rich pathway. Glia, 1996, V. 17, P. 1-14.

148. Van Den Berg D.J., Sharma A.K., Bruno E., and Hoffman R. Role of members of the Wnt gene family in human hematopoiesis. Blood, 1998, V. 92, P. 3189-3193.

149. Van der Ploeg L.H.T., Lin A.Y.C., Borst P. Structure of the growing telomeres of trypanosomes. Cell, 1984, V. 36, P. 459-468.

150. Van Praag H., Schinder A.F., Cristie B.R., Toni N., Palmer T.D., Gage F.H. Functional neurogenesis in the adult hippocampus. Nature, 2002, V. 415, P. 1030-1034.

151. Vaziri H., Benchimol S. Reconstitution of telomerase activity in normal human cells leads to elongation of telomeres and extended replicative life span. Current Biol., 1998, V. 8, P. 279-282.

152. Vogelstein B, Kinzler K.W. The multistep nature of cancer. Trends Genet., 1993, V. 9(4), P. 138-41.

153. Wakayama Т., Perry A., Zuccotti M., et al. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature, 1998, V. 394, P. 369-374.

154. Wakitani S., Saito Т., Caplan A.I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995, V. 18(12), P. 1417-1426.

155. Weiss S., Dunne C., Hewson J., Wohl C., Wheatley M., Peterson A.C., Reynolds B.A. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J. Neuroscience, 1996, V.16, P. 7599-7609.

156. Weng N.P., Levine B.L., June C.H., Hodes R.J. Regulated expression of telomerase activity in human T lymphocyte development and activation. Exp Med., 1996, V. 183(6), P. 2471-2479.

157. Werner J.E., Kota R.S., Gill B.S., Endo T.R. Distribution of telomeric repeats and their role in the healing of broken chromosome ends in wheat. Genome, 1992, V. 35, P. 844-848.

158. Wernig M., Meissner A., Foreman R. et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature, 2007, V. 448 (7151), P. 260-262.

159. Wexler, Donaldson, Denning -Kendall et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Brit. J. Haematol., 2003, V. 121(2), P. 368374

160. Wicky С., Villeneuve A.M., Lauper N., Codourey L., Tobler H., Muller F. Telomeric repeats (TTAGGG)n are sufficient for chromosome capping function in Caenorhabditis elegans. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1996, V. 93, P. 8983-8988.

161. Williams S.K., Wang T.F., Castrillo R., Jarrell B.E. Liposuction-derived human fat used for vascular graft sodding contains endothelial cells and not mesothelial cells as the major cell type. J. Vase. Surg., 1994, V. 19, P. 916923.

162. Wright W.E., Pereira-Smith O.M., Shay J.W. Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. Mol. Cell. Biol., 1989, V. 9, P. 3068-3092.

163. Wright W.E., Piatyszek M.A., Rainey W.E., Byrd W., Shay J.W. Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells. Dev. Genet., 1996, V. 18, P. 173-179.

164. Wright W.E., Shay J.W. Telomere positional effects and the regulation of cellular senescence. Trends Genet., 1992a, V. 8, P. 193-197.

165. Wright W.E., Shay J.W. The two-stage mechanism controlling cellular senescence and immortalization. Exp. Gerontol., 1992b, V. 27, P. 383-389.

166. Yegorov Y.E., Chernov D.N., Akimov S.S., Zelenin A.V. Reverse transcriptase inhibitors suppress telomerase activity and induce senescencelike processes in cultured mouse fibroblasts. Molec. Biol. Cell, 1996, V. 389(2), P. 115-118.

167. Young С., Jarrell B.E., Hoying J.B., Williams S.K. A porcine model for adipose tissue-derived endothelial cell transplantation. Cell Transplant., 1992, V. 1, P. 293-298.

168. Yu J., Vodyanik M.A., Thomson J.A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007, V. 318 (5858), P. 19171920.

169. Zakian VA. Structure and function of telomeres. Ann. Rev. Genet., 1989, V. 23, P. 579-604.

170. Zuk P.A., Benhaim P. and Hedrick M.H. Stem Cells from Adipose Tissue. Handbook of stem cells, 2006, V. 2, P. 425-447.

171. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P., De Ugarte D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H., Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell, 2002, V. 13(12), P. 4279-4295.

172. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng., 2001, V. 7, P. 211-228.

173. Zvaifler N.J., Marinova-Mutafchieva L., Adams G., Edwards C.J., Moss J., Burger J.A., Maini R.N. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals. Arthritis Res., 2000, V. 2(6), P. 477-488.

Информация о работе

Дашинимаев, Эрдэм Баирович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.25

Диссертация

Введение гена каталитического компонента теломеразы (hTERT) в клетки с различным дифференцировочным потенциалом - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы